KR101806136B1 - 대사체 분석을 이용한 베체트병 관절염의 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대사체 분석을 이용한 베체트병 관절염 진단방법에 관한 것으로, 대사체학을 이용하여 다양한 혈청음성 염증관절염으로부터 베체트병 관절염을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하며, 이는 베체트병 관절염 치료제 개발에도 적용할 수 있다.

Description

대사체 분석을 이용한 베체트병 관절염의 진단방법{Method for diagnosing Behcet's disease with arthritis by using metabolomics}

본 발명은 대사체 분석을 통해 혈청음성 염증관절염으로부터 베체트병 관절염을 진단하는 방법에 관한 것이다.

베체트병은 반복적인 구강 궤양, 성기 및 항문의 궤양, 포도막염, 관절염과 함께 위장관, 혈관 및 중추 신경계 등의 중요 장기의 침범을 특징으로 하는, 원인이 밝혀져 있지 않은 전신적인 혈관염이다 (Sakane T et al (1999) N Engl J Med 341 1284-91). 베체트병의 유병율은 지역에 따라 다양한데 지중해 연안부터 극동 아시아에 이르는 지역, 특히 한국, 중국, 일본 그리고 터키 지역에서 발병 빈도가 높게 보고되고 있다.

베체트병의 임상 양상은 매우 다양하며, 반복적인 구강 궤양과 같은 경미한 증상부터 안구, 위장관, 혈관 및 중추 신경계 등을 침범하여 실명, 장궤양 및 천공, 동맥류로 인한 객혈, 심부 정맥 혈전증, 편측 마비와 같은 치명적인 후유증을 남길 수 있다. 베체트병의 다양한 증상은 가장 왕성한 사회생활을 해야 하는 시기인 20대에서 40대에서 가장 심한 질병의 활성도를 보여서 경제적, 사회적 손실이 매우 클 것으로 예상되는 질병이다.

베체트병에서 발생하는 관절염/관절통은 베체트병 환자의 40-70%에서 발생할 정도로 매우 흔한 증후이다 (Bicer A (2012) Pathology Res Int 2012 653806). 베체트병에서 관절염이 다른 증상에 선행하여 나타나는 경우 다른 염증관절염과의 감별진단이 매우 어렵게 된다 (Bicer A (2012) Pathology Res Int 2012 653806, Yurdakul S et al (1983) Ann Rheum Dis 42 505-15). 특히, 베체트병에서 나타나는 관절염은 혈청음성 염증관절염(혈청음성 척추관절염과 혈청음성 류마티스관절염)과 임상 양상이 매우 비슷하며 이들 질환에서 특이적인 바이오마커가 없다. 베체트병에서의 관절염과 혈청음성 척추관절염은 구강 궤양, 홍반경결과 같은 피부 점막 이상이 나타날 뿐만 아니라 비대칭적으로 무릎관절이나 손목 관절과 같이 큰 관절을 침범하는 공통점을 가지고 있다. 또한, 조기 류마티스관절염과 베체트병 관절염은 관절의 침범 양상이 비슷할 뿐 아니라 두 질환의 활막 조직이나 관절액을 비교한 연구에서 감별 진단에 이용할 수 바이오마커를 찾을 수 없었다 (Gibson T et al (1981) Ann Rheum Dis 40 376-81). 또한 혈청음성 류마티스관절염은 최근 발표된 2010 ACR/EULAR 분류 기준으로 류마티스관절염으로 진단되지 못할 가능성이 상당한 것으로 알려져 있다. 종합하면 현재까지 혈청음성 척추관절염이나 혈청음성 류마티스관절염과 같은 혈청음성 염증관절염과 베체트병에서의 나타난 관절염과는 특이적인 바이오마커가 없어 임상적으로 감별하는 것은 상당히 어려울 뿐만 아니라 이로 인해 환자 진료에 어려움이 따르고 있는 것이 현실이다. 혈청음성 염증관절염의 경우 상당히 고가이긴 하지만 종양궤사인자 억제제 등의 조기 사용으로 인해 상당히 좋은 치료 성적을 보이고 있다. 혈청음성 염증관절염의 경우 조기에 적극적인 치료를 받지 못하게 되면 비가역적인 관절 손상을 가져올 수 있는 반면 베체트병에서 나타나는 관절염의 경우 혈청음성 염증관절염에 비해 심한 관절 손상이 오지 않으며 가역적이다. 베체트병에서 나타난 관절염을 혈청음성 염증관절염과 정확한 감별진단을 하게 되면 고가의 불필요한 치료를 피하고 환자에게 맞춤형 치료 그리고 질환과 관련한 예후에 관한 정확한 정보를 제공함으로써 더 좋은 치료 성적을 거둘 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, 베체트병에서 나타난 관절염과 혈청음성 염증관절염과의 감별진단을 위해 신뢰할 수 있는 바이오마커의 개발이 중요하다. 최근 류마티스관절염, 골관절염, 건선관절염, 전신홍반루푸스와 같은 류마티스 질환에서 바이오마커 발굴을 위해 메타볼로믹스 기술이 많은 각광을 받고 있다 (Madsen RK et al (2011) Ann Rheum Dis 13 R19, Kapoor et al (2013) Arthritis Rheum 65 1448-65, Kim s et al (2014) PLos one 9 e97501). 그러나 현재까지 문헌 보고를 조사한 바에 따르면 바이오마커를 찾기 위해 활막액을 이용하여 대사체학적 접근법을 시도한 연구들이 발표되고 있지만 연구자들이 아는 한 베체트병에서 나타난 관절염과 혈청음성 염증관절염의 감별 진단을 위해 대사체학적 접근법을 시도한 연구는 없었다.

베체트병은 전신성 혈관염이기 때문에 혈관이 있는 곳은 어디든지 발생할 수 있다. 따라서 다양한 임상 증상과 다양한 중증도의 증상을 보인다. 베체트병이 가장 흔한 지역으로 알려진 터키의 보고에 따르면, 환자 1인당 매년 약 3,300 달러의 경비가 소요되며, 특히 신경학적 증상이 있는 베체트병 환자는 약 5,000 달러의 경비가 소요되는 것으로 보고되고 있다. 약 42%의 환자가 약 120일 가량을 일을 하지 못하는 것으로 조사되었다 (N Suit et al 2007 Rheumatology 46 678-682). 왕성한 사회생활을 해야 하는 젊은 연령층에서 높은 발생율과 심한 합병율을 보이는 것으로 알려져 있다. 이를 감안하면 우리나라에서 직접적인 의료비뿐만 아니라 사회적으로 지출해야 하는 경비는 터키의 보고보다 훨씬 클 것으로 예측되고 있다. 특히 관절통/관절염은 베체트병의 반수 이상에서 나타나는 흔한 증상이다. 베체트병에서 흔한 이런 근골격계 증상은 환자가 직접적으로 느끼는 불편감은 클 것으로 생각되며 혈청음성 척추관절염이나 혈청음성 류마티스관절염으로 오인되어 사용되는 사회경제적 비용 또한 상당할 것임을 짐작해 볼 수 있을 것이다. 따라서 베체트병에서 나타난 관절염을 다른 비슷한 양상을 보이는 질환과 비교하여 신속 정확하게 감별 진단할 수 있는 바이오마커의 발굴은 학문적으로뿐만 아니라 사회경제적으로 매우 중요하다 할 것이다.

최근에 류마티스 질환에서 대사체학을 이용하여 진단, 치료 반응 평가, 그리고 예후 예측 등을 위한 바이오마커 발굴이 활발하게 이루어지고 있지만 아직 미비한 실정이다 (비특허문헌 1~5). 베체트병에서 바이오마커 발굴을 위해 현재까지 보고된 기술들은 유전체학 또는 단백질체학을 사용한 연구가 주로 보고 되고 있으나 아직까지는 만족할만한 결과를 보여주고 있지 않을 뿐만 아니라(비특허문헌 6, 7), 베체트병에서 대사체학을 이용한 진단 및 예후 예측에 적당한 바이오마커 발굴을 위한 연구는 거의 없다. 더구나 베체트병의 여러 임상군 중의 하나인 베체트병에서 동반된 관절염과 비슷한 임상 양상을 보이는 혈청음성 염증관절염과 비교하여 바이오마커를 발굴하고자 한 연구는 없었다.

Madsen RK, Lundstedt T, Gabrielsson J, Sennbro CJ, Alenius GM, et al. (2011) Diagnostic properties of metabolic perturbations in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 13:R19 Hugle T, Kovacs H, Heijnen IA, Daikeler T, Baisch U, et al. (2012) Synovial fluid metabolomics in different forms of arthritis assessed by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Clin Exp Rheumatol30 240-5 Kapoor SR, Filer A, Fitzpatrick MA, Fisher BA, Taylor PC, et al (2013) Metabolic profiling predicts response to anti-tumor necrosis factor α therapy in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 65;1448-65 Kim S, Hwang J, Xuan J, Jung YH, Cha HS, et al. (2014) Global metabolite profiling of synovial fluid for the specific diagnosis of rheumatoid arthritis from other inflammatory arthritis. PLOS ONE 9: e97501. Guma M, Sanchez-Lopez E, Lodi A, Garcia-Carbonell R, Tiziani S, et al (2014) Choline kinase inhibition in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis Eup ahead of print Yuko et al (2007) Proteomic surveillance of autoimmunity in Behcet's disease with uveitis: Selenium binding protein is a novel autoantigen in Behcet's disease. Experimental Eye Research 84;823-831 Ooka S, Nakano H, Matsuda T, Okamoto K, Suematsu N, et al (2010) Proteomic surveillance of autoantigens in patients with Behcet's disease by a proteomic approach. Microbiol Immunol 54 354-361

이에, 본 발명자들은 베체트병에 동반된 관절염의 특이적인 바이오마커를 찾기 위해 환자들의 관절에서 얻은 활막액에 GC/TOF MS (gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 기법을 적용하여 베체트병에 동반된 관절염 환자들과 비슷한 임상 양상을 보이는 혈청음성 염증관절염(혈청음성 류마티스관절염, 혈청음성 척추관절병) 환자들과 감별할 수 있는 대사체 프로파일링 및 특이적 대사체들을 찾고자 연구 노력한 결과, 베체트병에 동반된 관절염과 다른 혈청음성 염증관절염의 감별 진단을 위해 새로운 오믹스 기법인 대사체학을 이용하여 신속 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 대사체 분석을 통해 혈청음성 염증관절염으로부터 베체트병 관절염을 진단하기 위한 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 혈청음성 염증관절염으로부터 베체트병 관절염을 진단하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 글루타메이트, 시트라말레이트 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 관절 활막액 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 혈청음성 염증관절염으로부터 베체트병 관절염의 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 혈청음성 염증관절염과 베체트병에 동반하는 관절염에서 얻은 관절 활막액 간의 대사체 차별성을 검출하는 방법으로,

(1) GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry)를 이용한 대사체 분석 방법;

(2) GC/TOF MS에서 동정된 대사체에 대해 직교부분최소자승판별분석(OPLS-DA)를 이용하여 대사체 프로파일의 차이를 확인하는 방법;

(3) OPLS-DA에서 도출된 대사체의 OPLS-DA 로딩 값과 VIP(Variable Importance for Projection) 값으로 구성된 V-plot를 작성하고, VIP 값이 1 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, OPLS-DA의 로딩 값을 통해 대사체 바이오마커 후보물질의 증감을 확인하는 방법;

(4) GC/TOF MS에서 분석된 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)을 수행하여 대사체의 증감을 확인하는 방법;

(5) 상기 (2), (3) 및 (4)의 방법을 통해 선정된 대사체 바이오마커 후보물질에 대해 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바(ANOVA) 분석을 통해 유의적 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 선정하는 방법; 및

(6) ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증하는 방법을 순차적으로 적용하여, 관절 활막액으로부터 대사체 바이오마커를 분석하는 것을 포함하는 혈청음성 염증관절염과 베체트병에 동반하는 관절염에서 얻은 관절 활막액 간의 대사체 차별성 분석 방법을 제공한다.

본 발명은 베체트병에 동반된 관절염과 다른 혈청음성 염증관절염의 감별 진단을 위해 새로운 오믹스 기법인 대사체학을 이용하여 신속 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하였다. GC/TOF MS를 이용하여 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염 환자의 대사체 분석을 통해 123개의 대사체를 검출하였다. 직교부분최소자승판별분석(OPLS-DA)을 포함한 다양한 통계 분석을 통해 11개의 대사체를 후보 바이오마커로 선정하였다. VIP 값, ROC(Receiver operating characteristic) curve의 AUC(area under the curve)의 값 등을 통해 최종적으로 3개(glutamate, citramalate, valine)의 바이오마커를 검증하였다. 본 발명을 통하여 대사체학을 관절 활막액 분석에 이용하여 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염과 감별할 수 있는 바이오마커를 최초로 규명하였다. 이를 통해 아직까지 완전히 밝혀져 있지 않은 베체트병의 발병 기전을 밝히고 다양한 임상 증상에 최적화된 치료제 개발에도 적용할 수 있을 것이다. 베체트병에서 나타난 관절염의 진단을 용이하게 하는 바이오마커의 발견은 환자에게 맞춤형 치료를 제공하여 더 좋은 치료 성적을 보일 것이다. 또한, 정확한 진단을 통해 혈청음성 염증관절염에서 필요한 고가의 치료를 피하고 일상생활로 복귀를 빠르게 하는 등의 사회 경제적 파급 효과도 상당할 것으로 기대된다.

도 1은 GC/TOF MS를 이용하여 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염의 대사체 분석 결과 확인된 123개 대사체의 분포 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 OPLS-DA를 이용하여 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염의 대사체 프로파일링 차이를 나타낸 결과이다[OPLS-DA를 이용한 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염의 대사체 프로파일링 분석에서 확실하게 구분됨. BD: 베체트병에 동반된 관절염, SNA: 혈청음성 염증관절염].
도 3은 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염을 구분하는데 관여하는 대사체의 로딩(loading) 값과 VIP 값으로 구성된 V-plot 결과이다[VIP 값이 1보다 크면 중요한 대사체로 간주됨; p(corr) > 0, 베체트병에 동반된 관절염 환자에서 증가하는 대사체; p(corr) < 0, 베체트병에 동반된 관절염 환자에서 감소하는 대사체임].
도 4는 베체트병 관절염과 혈청음성 염증관절염의 계층적 군집 분석 결과이다[BD: 베체트병에 동반된 관절염, SNA: 혈청음성 염증관절염].
도 5는 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염과의 감별 진단을 위한 신규 바이오마커로 선정된 대사체의 폴드 체인지(fold change) 결과이다[베체트병에 동반된 관절염에서 후보 바이오마커로 선정된 11개 대사체 모두가 혈청음성 염증관절염 보다 증가하는 결과를 보임].
도 6은 베체트병에 동반된 관절염 진단을 위한 신규 바이오마커로 선정된 3개의 대사체 조합에 대한 ROC 곡선 결과이다[3개의 대사체 조합을 이용한 경우 베체트병에 동반된 관절염의 진단에 있어 민감도 100%, 특이도 61.1%의 결과를 보임].

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 글루타메이트, 시트라말레이트 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 관절 활막액 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 혈청음성 염증관절염으로부터 베체트병 관절염을 진단하는 키트에 관한 것이다.

본 발명자들은 베체트병 관절염의 바이오마커를 찾기 위해 환자들의 관절 활막액으로부터 샘플을 채취하여 메탄올 추출하고 GC/TOF MS를 이용하여 베체트병 관절염 환자들과 혈청음성 염증관절염, 예컨대 혈청음성 염증관절염은 혈청음성 류마티스관절염 또는 혈청 음성 척추관절병 등의 환자들의 대사체 프로파일 차이를 비교 분석하고, 이 차이를 이용하여 베체트병 관절염 환자들을 진단할 수 있는 바이오마커 발굴 연구를 수행하였다.

그 결과, 아민류, 아미노산류, 지방산류, 유기산류, 인산류, 당류 등으로 구분할 수 있는 123종의 대사체를 동정하였다. 이 중 아미노산류가 가장 많이 검출되었으며, 그 다음으로 당류, 지방산류, 유기산류, 아민류, 인산류 등의 순서로 검출 되었다.

직교부분최소자승판별분석(OPLS-DA)을 통해 베체트병 관절염과 혈청음성 염증관절염의 대사체 프로파일의 명확한 차이를 확인하였으며, VIP 값이 1 이상인 37종의 대사체를 신규 바이오마커 후보 물질로 선정하였으며, OPLS-DA의 로딩 값을 통해 베체트병 관절염 환자의 증감을 확인하였다. 그 결과, 23종의 대사체가 베체트병 관절염 환자에서 증가하였고, 14종의 대사체가 감소하였다.

또한, GC/TOF MS에서 분석된 관절 활막액의 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석을 수행하여 대사체의 증감을 확인한 결과, 베체트병 관절염 환자에서 글루타메이트, 시트라말레이트, 발린, 루신, 메티오닌 설폭사이드, 글리세레이트, 포스페이트, 리신, 이소루신, 우레아, 시투룰린, 옥소프롤린, 트레오닌, 카프릭산 등이 증가하였고, 글루타민, 메티오닌, 3,6-안하이드로-D-갈락토오스 등은 감소하는 대사체로 확인되었다.

상기 후보 바이오마커로 선정된 37종의 대사체를 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바 분석을 통해 베체트병 관절염과 혈청음성 염증관절염에서 유의적 차이, 즉 폴드 체인지(fold change)가 0 을 초과하는 경우 베체트병 관절염 환자에서 증가하는 대사체, 폴드 체인지가 0 미만인 경우 베체트병 관절염 환자에서 감소하는 대사체로 간주하였다. 그 결과 유의적인 차이를 나타내는 11종 대사체(glutamate, citramalate, valine, leucine, methionine sulfoxide, glycerate, phosphate, lysine, isoleuicine, urea, citrulline)를 바이오마커로 선정하였다. 상기 11종 모두 베체트병 관절염에서 증가하는 대사체이다.

ROC 곡선을 통해 11종의 바이오마커를 검증한 결과, 3종이 AUC 값이 0.7 이상으로 높은 값을 나타내었으며, 바이오마커를 결합한 ROC 곡선에서 AUC 값은 0.870로 높은 값을 나타냈다.

이중, 새롭게 규명된 글루타메이트, 시트라말레이트 및 발린을 관절 활막액으로부터 혈청음성 염증관절염으로부터 베체트병 관절염을 진단할 수 있는 바이오마커로 선정하여 진단 외에도 베체트병 관절염 치료제 개발에도 적용 가능하도록 하였다.

나아가, 본 발명자들에 의하여 새롭게 규명된 베체트병 관절염의 지표 대사체인 글루타메이트, 시트라말레이트 및/또는 발린 외에도 루신, 메티오닌 설폭사이드, 글리세레이트, 포스페이트, 리신, 이소루신, 우레아, 시투룰린, 글루타민, 옥소프롤린, 메티오닌, 3,6-안하이드로-D-갈락토오스 및/또는 카프릭산에 대한 정량정보를 추가적으로 포함함으로써 혈청음성 염증관절염으로부터 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 정확한 베체트병 관절염의 진단이 가능하다.

본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 베체트병 관절염의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명의 진단 키트에 포함된 정량 장치는 크로마토그래피/질량분석기일 수 있다.

본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography), 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피이다. 더불어 본 발명에서 이용되는 질량분석기는 MALDI-TOF MS 또는 TOF MS이고, 보다 바람직하게는 TOF MS이다.

본 발명의 관절 활막액 대사체는 가스 크로마토그래피에서 각 성분들이 분리되며, Q-TOF MS를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 통해 구성 성분을 확인한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 글루타메이트, 시트라말레이트, 발린, 루신, 메티오닌 설폭사이드, 글리세레이트, 포스페이트, 리신, 이소루신, 우레아, 시투룰린, 옥소프롤린, 트레오닌 및 카프릭산의 농도가 증가되는 경우, 베체트병 관절염을 나타내고 글루타민, 메티오닌, 팔미트산, 3,6-안하이드로-D-갈락토오스의 농도가 감소되는 경우, 베체트병 관절염을 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 "관절 활막액 대사체 농도의 증가"는 혈청음성 염증관절염 환자에 비해 베체트병 관절염 환자의 관절 활막액 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 바람직하게는 70% 이상 증가된 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 30% 이상 증가된 것을 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "관절 활막액 대사체 농도의 감소"는 혈청음성 염증관절염 환자에 비해 베체트병 관절염 환자의 관절 활막액 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 의미하며, 바람직하게는 40% 이상 감소된 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 20% 이상 감소된 것을 의미한다.

본 발명에 따르면, 글루타메이트, 시트라말레이트, 발린, 루신, 메티오닌 설폭사이드, 글리세레이트, 포스페이트, 리신, 이소루신, 우레아, 시투룰린, 옥소프롤린, 트레오닌 및 카프릭산 은 혈청음성 염증관절염에 비해 베체트병 관절염에서 유의하게 증가된 농도를 나타내고, 글루타민, 메티오닌 및 3,6-안하이드로-D-갈락토오스 은 베체트병 관절염에서 유의하게 감소된 농도를 나타낸다(표 1).

본 발명은 또한 두 생체시료군 간의 대사체 차별성을 검출하는 방법으로서, (1) GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry)를 이용한 대사체 분석 방법; (2) GC/TOF MS에서 동정된 대사체에 대해 직교부분최소자승판별분석(OPLS-DA)를 이용하여 대사체 프로파일의 차이를 확인하는 방법; (3) OPLS-DA에서 도출된 대사체의 OPLS-DA 로딩 값과 VIP(Variable Importance for Projection) 값으로 구성된 V-plot를 작성하고, VIP 값이 1 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, OPLS-DA의 로딩 값을 통해 대사체 바이오마커 후보물질의 증감을 확인하는 방법; (4) GC/TOF MS에서 분석된 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)을 수행하여 대사체의 증감을 확인하는 방법; (5) 상기 (2), (3) 및 (4)의 방법을 통해 선정된 대사체 바이오마커 후보물질에 대해 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바(ANOVA) 분석을 통해 유의적 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 선정하는 방법; 및 (6) ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증하는 방법을 순차적으로 적용하여, 생체시료로부터 대사체 바이오마커를 분석하는 것을 포함하는 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법에 관한 것이다.

본 발명의 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법은 베체트병 관절염과 혈청음성 염증관절염에서 얻은 관절 활막액 생체시료군 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법을 예로 들어 구체적으로 설명한다.

우선, 혈청음성 염증관절염과 베체트병 관절염에서 채취한 관절 활막액을 80% 메탄올로 추출한 후 GC/TOF MS 분석에 사용할 수 있도록 공지 기술을 이용하여 유도체화 과정을 거친다.

상기 GC/TOF MS를 이용한 관절 활막액의 대사체 분석 방법은 관절 활막액 추출물을 GC/TOF MS 기기로 분석하고, 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환한 다음, 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 것을 포함한다.

GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 것은 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, GC/TOF MS 분석 결과 아민류, 아미노산류, 지방산류, 유기산류, 인산류, 당류 등으로 구분할 수 있는 123종의 대사체를 동정하였고, 이 중 아미노산류가 가장 많이 검출 되었으며, 그 다음으로 당류, 지방산류, 유기산류, 아민류, 인산류 등의 순서로 검출 되었다.

상기 GC/TOF MS 분석 결과 나온 대사체의 강도를 총 동정된 대사체의 강도 합으로 나누어 각 대사체를 표준화하고, OPLS-DA 분석을 실시한다.

대사체의 OPLS-DA 로딩 값과 VIP 값으로 구성된 V-plot를 작성하고, VIP 값이 1 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, OPLS-DA의 로딩 값의 증감을 확인하며, 이때 로딩 값이 양수인 것은 대사체의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체의 감소 경향을 나타내는 것이다.

GC/TOF MS에서 분석된 관절 활막액의 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석을 수행하여 대사체의 증감을 확인할 수 있다.

OPLS-DA, OPLS-DA 로딩 값과 VIP 값으로 구성된 V-plot 및 계층적 군집 분석을 통해 선정된 바이오마커에 대해 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바 분석을 수행하고, 베체트병 관절염과 혈청음성 염증관절염에서 유의적 차이, 즉 폴드 체인지(fold change)가 0을 초과하는 경우 베체트병 관절염 환자에서 증가하는 대사체, 폴드 체인지가 0 미만인 경우 베체트병 관절염 환자에서 감소하는 대사체로 간주하여 유의적인 차이를 나타내는 대사체를 바이오마커로 선정한다.

ROC 곡선을 통해 상기 대사체 바이오마커를 검증한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 혈청음성 염증관절염으로부터 베체트병 관절염을 진단하기 위한 바이오마커로, 글루타메이트, 시트라말레이트, 발린, 루신, 메티오닌 설폭사이드, 글리세레이트, 포스페이트, 리신, 이소루신, 우레아, 시투룰린, 글루타민, 옥소프롤린, 트레오닌, 메티오닌, 3,6-안하이드로-D-갈락토오스 및 카프릭산을 사용할 수 있다.

본 발명의 혈청음성 염증관절염과 베체트병 관절염에서 얻은 관절 활막액 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법을 통해 혈청음성 염증관절염으로부터 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 정확한 베체트병 관절염을 진단할 수 있고, 이를 치료제 개발에 적용할 수 있다. 이러한 방법은 베체트병 관절염 외에 다양한 질환에도 적용할 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: GC / TOF MS 를 이용한 대사체 동정

베체트병에서 동반된 관절염 환자들과 혈청음성 염증관절염 환자들 (혈청음성 류마티스관절염, 혈청음성 척추관절병증)에서 얻은 관절 활막액에서 80% 메탄올로 대사체를 추출하였다.

GC/TOF MS 분석을 위한 유도체화 과정은 다음과 같다.

추출한 샘플을 스피드 백으로 건조시킨 후에 5 ㎕의 40%(w/v)농도의 O-methylhydroxylamine hydrochloride in pyridine을 넣고 30 ℃ 200 rpm에서 90분간 반응을 시켰다. 그리고 45 ㎕의 N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide를 넣고 37 ℃ 200 rpm에서 30분간 반응을 실시하였다. GC/TOF MS 분석을 위한 기기 조건은 다음과 같다. 분석 시 사용한 컬럼은 RTX-5Sil MS capillary column (30 m length, 0.25 mm film thickness, and 25 mm inner diameter)이며, GC 컬럼 온도 조건은 먼저 50 ℃에서 5분간 유지시킨 후 330 ℃까지 승온시킨 후 1분간 유지하였다. 1 ㎕의 샘플을 비분할법(splitless)로 주입하였다. Transfer line 온도와 Ion source 온도는 각각 280 ℃, 250 ℃로 유지시켰다. GC/TOF MS 결과를 보유하고 있는 라이브러리에서 찾아 동정하여, 123개의 대사체를 동정하였다.

도 1에서와 같이, 각각의 대사체군별로 분류하였을 때. 아미노산 23%, 당 19%, 유기산 19%, 지방산 19%, 아민 9%, 인 8%, 기타 6%로 나타났다.

실시예 2: OPLS - DA 를 이용한 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염의 대사체 프로파일링 차이

실시예 1로부터 나온 대사체의 강도를 총 동정된 대사체의 강도의 합으로 나누어 각 대사체를 표준화하였다. 그 후 SIMCA-P+ (ver. 12.0)를 이용하여 OPLS-DA 분석을 실시하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염의 대사체 프로파일링이 명확하게 차이가 나는 것을 확인하였다.

실시예 3: 대사체의 OPLS - DA 의 로딩 값과 VIP 값으로 구성된 V- plot

실시예 2로부터 도출된 대사체 프로파일링의 차이에 영향을 미치는 대사체를 선별하기 위하여 로딩 값과 VIP 값을 이용하였다. VIP 값이 1 이상인 대사체를 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염을 구분하기 위한 중요한 대사체로 선정하였다.

VIP 값이 1 이상인 대사체는 총 37개였다. OPLS-DA의 로딩 값을 통하여 베체트병에 동반된 관절염 환자들에게 나타나는 대사체들의 증감을 확인하였다. 로딩 값이 양수인 대사체는 베체트병에 동반된 관절염 환자들에게 증가하는 경향을 나타내며, 음수인 대사체는 베체트병에 동반된 관절염 환자들에게 감소하는 경향을 나타낸다. VIP 값을 통하여 선정된 37개의 대사체 중 23개 대사체가 베체트병에 동반된 관절염 환자에서 증가하였고, 14개 대사체가 감소하였다 (도 3).

실시예 4: 계층적 군집 분석을 이용한 베체트병 관절염과 혈청음성 염증관절염의 대사체 프로파일 차이

실시예 1에서 동정된 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석을 실시하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 베체트병 관절염과 혈청음성 염증관절염의 대사체 프로파일이 명확하게 차이가 남을 확인하였으며, 글루타메이트, 시트라말레이트, 발린, 루신, 메티오닌 설폭사이드, 글리세레이트, 포스페이트, 리신, 이소루신, 우레아, 시투룰린, 옥소프롤린, 트레오닌, 카프릭산 등이 베체트병 관절염 환자에게 증가하는 대사체로 확인하였고, 글루타민, 메티오닌, 3,6-안하이드로-D-갈락토오스 등은 베체트병 관절염 환자에게 감소하는 대사체로 확인하였다.

실시예 5: 베체트병에 관련된 관절염과 혈청음성 염증관절염에서 신규 바이오마커로 선정된 대사체의 폴드 체인지

실시 예 2, 3, 4를 통해 신규 후보 바이오마커 37개를 선정하였다. 그 후 통계적 분석을 통하여 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염에서 유의적 차이를 보이는 11개 대사체를 베체트병에 동반된 관절염의 감별 진단을 위한 신규 바이오마커로 선정하였다.

11개 대사체(glutamate, citramalate, valine, leucine, methionine sulfoxide, glycerate, phosphate, lysine, isoleuicine, urea, citrulline) 모두가 베체트병에 동반된 관절염에서 증가하는 대사체였으며, 글루타메이트(glutamate), 시트라말레이트(citramalate)의 순으로 높은 폴드 체인지를 보였다 (도 5).

실시예 6:베체트병에 동반된 관절염의 진단을 위한 3개의 신규 후보 바이오마커 선정

실시예 2, 3, 4로부터 선정된 신규 바이오마커 후보 37개의 Wilcoxon-Mann-Whitney test 와 아노바 분석을 통하여 베체트병에 동반된 관절염의 진단을 위한 11개의 신규 후보 바이오마커(glutamate, citramalate, valine, leucine, methionine sulfoxide, glycerate, phosphate, lysine, isoleuicine, urea, citrulline)를 선정하였고 각각의 VIP 값, AUC 값, 그리고 p-value를 구하였다 (표1). 마찬가지로 베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 류마티스관절염 또는 혈청음성 척추관절병증 간의 대사체 분석을 통해 각각 11개(methionine sulfoxide, glutamine, oxoproline, glutamate, citramalate, threonine, methionine, glycerate, valine, 3,6-anhydro-D-galactose, and capric acid)와 5개(glutamate, citramalate, valine, lysine, and leucine)의 바이오마커를 확인하고 각각의 VIP 값, AUC 값, 그리고 p-value를 구하였다.

베체트병에 동반된 관절염과 혈청음성 염증관절염에서 선정된 11개의 후보 바이오마커 중에서 VIP 값이 높으며, 혈청음성 류마티스관절염 또는 혈청음성 척추관절병증과의 분석을 통해 공통적인 3개의 후보 바이오마커를 최종적으로 선정하였다.

실시예 7: 신규 바이오마커로 선정된 3개의 대사체 조합을 이용한 ROC 분석

실시예 2-6의 과정을 통해 선정된 신규 후보 바이오마커 3개의 검증을 위해 각각의 대사체의 ROC 곡선을 통한 AUC(area under the ROC curve) 값을 구하였다.

모든 대사체들의 AUC 값이 0.7 이상을 나타내어, 신규 바이오마커로서 적합함을 검증하였다. 3개의 신규 후보 바이오마커를 결합한 ROC curve를 통한 AUC 값은 0.870로 나타나 베체트병에 동반된 관절염의 진단을 바이오마커로서 적합함을 검증하였다 (표 1, 도 6).

[표 1]

베체트병에 동반된 관절염 진단을 위한 신규 바이오마커로 선정된 대사체의 VIP 값과 AUC 값[BD: 베체트병에 동반된 관절염, SNA: 혈청음성 염증관절염, SNRA: 혈청음성 류마티스관절염, SNSpA: 혈청음성 척추관절병증]

Claims (12)

1. 글루타메이트, 시트라말레이트 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 관절 활막액 대사체에 대한 정량 장치를 포함하되, 글루타메이트, 시트라말레이트 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체 농도가 증가되는 경우, 베체트병 관절염을 나타내는, 혈청음성 염증관절염으로부터 베체트병 관절염의 진단 키트.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   혈청음성 염증관절염은 혈청음성 류마티스관절염 또는 혈청 음성 척추관절병에서 선택된 것인 키트.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   키트는 루신, 메티오닌 설폭사이드, 글리세레이트, 포스페이트, 리신, 이소루신, 우레아, 시투룰린, 글루타민, 옥소프롤린, 트레오닌, 메티오닌, 3,6-안하이드로-D-갈락토오스 및 카프릭산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 관절 활막액 대사체에 대한 정량 장치를 추가적으로 포함하되,
   루신, 메티오닌 설폭사이드, 글리세레이트, 포스페이트, 리신, 이소루신, 우레아, 시투룰린, 옥소프롤린, 트레오닌 및 카프릭산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체 농도가 증가되는 경우; 또는 글루타민, 메티오닌 및 3,6-안하이드로-D-갈락토오스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체 농도가 감소하는 경우; 베체트병 관절염을 나타내는 것인 키트.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   정량 장치는 크로마토그래피/질량분석기인 키트.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 혈청음성 염증관절염과 베체트병 관절염에서 얻은 관절 활막액 간의 대사체 차별성을 검출하는 방법으로,
   (1) GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry)를 이용한 대사체 분석 방법;
   (2) GC/TOF MS에서 동정된 대사체에 대해 직교부분최소자승판별분석(OPLS-DA)를 이용하여 대사체 프로파일의 차이를 확인하는 방법;
   (3) OPLS-DA에서 도출된 대사체의 OPLS-DA 로딩 값과 VIP(Variable Importance for Projection) 값으로 구성된 V-plot를 작성하고, VIP 값이 1 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, OPLS-DA의 로딩 값을 통해 대사체 바이오마커 후보물질의 증감을 확인하는 방법;
   (4) GC/TOF MS에서 분석된 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)을 수행하여 대사체의 증감을 확인하는 방법;
   (5) 상기 (2), (3) 및 (4)의 방법을 통해 선정된 대사체 바이오마커 후보물질에 대해 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바(ANOVA) 분석을 통해 유의적 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 선정하는 방법; 및
   (6) ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증하는 방법을 순차적으로 적용하여, 관절 활막액으로부터 대사체 바이오마커를 분석하는 것을 포함하되,
   상기 대사체 바이오마커는 글루타메이트, 시트라말레이트, 발린, 루신, 메티오닌 설폭사이드, 글리세레이트, 포스페이트, 리신, 이소루신, 우레아, 시투룰린, 글루타민, 옥소프롤린, 트레오닌, 메티오닌, 3,6-안하이드로-D-갈락토오스 및 카프릭산으로 구성된 군으로부터 선택되는,
   혈청음성 염증관절염과 베체트병 관절염에서 얻은 관절 활막액 간의 대사체 차별성 분석 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   GC/TOF MS를 이용한 대사체 분석 방법은 생체시료를 GC/TOF MS 기기로 분석하고, 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환한 다음, 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 혈청음성 염증관절염과 베체트병 관절염에서 얻은 관절 활막액 간의 대사체의 차별성을 검증하는 것인 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서,
    GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 것은 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하는 것인 방법.
    
11. 제 8 항에 있어서,
    OPLS-DA의 로딩 값이 양수인 것은 대사체의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체의 감소 경향을 나타내는 것인 방법.
    
12. 삭제

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