CN117590007B - 生物标志物在制备诊断白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用 - Google Patents
生物标志物在制备诊断白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117590007B CN117590007B CN202410077768.2A CN202410077768A CN117590007B CN 117590007 B CN117590007 B CN 117590007B CN 202410077768 A CN202410077768 A CN 202410077768A CN 117590007 B CN117590007 B CN 117590007B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- uveitis
- biomarker
- behcet
- disease
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 title claims abstract description 74
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 title claims abstract description 61
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 42
- 206010039705 Scleritis Diseases 0.000 claims description 22
- 201000004849 posterior scleritis Diseases 0.000 claims description 22
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 13
- 102100040658 Prolactin regulatory element-binding protein Human genes 0.000 claims description 6
- 102100029259 TELO2-interacting protein 2 Human genes 0.000 claims description 5
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 claims description 3
- 241001420836 Ophthalmitis Species 0.000 claims description 3
- 241000282485 Vulpes vulpes Species 0.000 claims description 3
- 208000010403 panophthalmitis Diseases 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 108090000877 Hydroxypyruvate isomerases Proteins 0.000 claims 2
- 102000008791 Lysozyme C Human genes 0.000 claims 2
- 108050000633 Lysozyme C Proteins 0.000 claims 2
- 101710159527 Maturation protein A Proteins 0.000 claims 2
- 101710091157 Maturation protein A2 Proteins 0.000 claims 2
- 101710123890 Prolactin regulatory element-binding protein Proteins 0.000 claims 2
- 101710145481 TELO2-interacting protein 2 Proteins 0.000 claims 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 102100032059 EMILIN-1 Human genes 0.000 abstract description 22
- 101000921280 Homo sapiens EMILIN-1 Proteins 0.000 abstract description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 24
- 101001018100 Homo sapiens Lysozyme C Proteins 0.000 description 22
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 102100021870 ATP synthase subunit O, mitochondrial Human genes 0.000 description 6
- 101000970995 Homo sapiens ATP synthase subunit O, mitochondrial Proteins 0.000 description 6
- 101000962553 Homo sapiens Putative hydroxypyruvate isomerase Proteins 0.000 description 6
- 102100039294 Putative hydroxypyruvate isomerase Human genes 0.000 description 6
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 206010054765 Anterior chamber inflammation Diseases 0.000 description 4
- 101000611655 Homo sapiens Prolactin regulatory element-binding protein Proteins 0.000 description 4
- 241000712689 Velutina Species 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 101100315468 Glossina morsitans morsitans TTI gene Proteins 0.000 description 3
- 101000633807 Homo sapiens TELO2-interacting protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 208000013441 ocular lesion Diseases 0.000 description 3
- 238000010239 partial least squares discriminant analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 238000013456 study Methods 0.000 description 3
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 239000000091 biomarker candidate Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 206010053781 Anterior chamber cell Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 1
- 206010038903 Retinal vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034700 Vitreous opacities Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 201000004982 autoimmune uveitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 108700004389 elastin microfibril interface located Proteins 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000101 novel biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011338 personalized therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/16—Ophthalmology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/32—Cardiovascular disorders
- G01N2800/328—Vasculitis, i.e. inflammation of blood vessels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及生物标志物在制备诊断白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用。所述的生物标志物至少包括EMILIN1和/或LYZ。经实验证实，本申请的血浆蛋白质生物标志物进行白塞氏病葡萄膜炎的诊断，具有显著的灵敏度和特异度，在生物医药领域中具有非常好的应用和研究价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及生物标志物在制备诊断白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用。
背景技术
白塞氏病是慢性、复发性、多器官受累的血管炎性疾病。累及眼部时会导致白塞氏病葡萄膜炎的发生，白塞氏病葡萄膜炎是我国常见的葡萄膜炎类型之一，病因和发病机制尚未完全明确，治疗不及时可因视网膜血管闭塞、视网膜和视神经萎缩等原因致盲。早期诊断和治疗对保护患者视功能极为重要，鉴于白塞氏病葡萄膜炎是一种多因素疾病，开发新型生物标志物将有助于早期诊断和精准治疗。
蛋白质是执行生物体生命活动的基础，不同疾病的严重程度不同，这会导致体内蛋白质的组成和表达发生变化。蛋白质组学是涉及识别和量化细胞、组织或生物体中存在的全部蛋白质含量的技术的应用，在医学领域中，蛋白质组学技术被广泛应用于多个方面，其中包括检测诊断标记物、疾病机制研究以及药物研发与个体化治疗等。在临床上，血浆具有取材方便，非侵入性，创伤小的优点，可应用于实时动态个体化诊疗中。许多研究结果表明，血浆中含有丰富的蛋白质。然而，在实际应用中，由于存在高丰度蛋白质且蛋白丰度的动态波动范围较大，常导致检测结果不尽如人意。随着基于质谱（MS）的蛋白质组学技术和生物信息学的发展，越来越多的生物标志物被发现，目前的技术已经可以在血浆中识别超过1000种蛋白质，甚至可以超过5000种蛋白质。因此这一方法有助于发现患者血浆中随眼部变化发生改变的标志物，协助疾病的诊断，探究疾病的发病机制。
发明内容
本申请通过SWATH‐MS技术对包括健康对照、白塞氏病葡萄膜炎、后巩膜炎和Vogt-小柳原田综合征（VKH）患者血浆中的蛋白质进行鉴定。通过生物信息学的方法筛选出潜在疾病标志物，进一步选择另一组样本队列，使用ELISA试剂盒对其中两种标志物进行验证，SPSS构建诊断模型。结果显示，EMILIN1和/或LYZ作为生物标志物诊断白塞氏病葡萄膜炎具有较高的灵敏度和特异度。
本发明的第一方面，提供了一种生物标志物或检测生物标志物的试剂在制备诊断或预后评估白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用。
所述的生物标志物包括EMILIN1和/或LYZ。
优选的，所述的生物标志物还包括ATP5PO、HYI、PREB或TTI2中的一种或两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的应用为：EMILIN1和/或LYZ作为生物标志物在制备诊断或预后评估白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用。
所述的生物标志物为血浆中的生物标志物。
所述的生物标志物为蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的应用为：血浆中的EMILIN1和/或LYZ作为生物标志物在制备诊断或预后评估白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用。
检测生物标志物的试剂包括检测生物标志物的有无或含量的试剂。
所述的产品包括蛋白芯片、试剂盒、试纸、膜条或设备。所述的设备可以选自液相或质谱。
优选的，所述的产品包括检测生物标志物的试剂。进一步优选包括检测样本中蛋白生物标志物的有无或表达水平的试剂。
优选的，所述的样本为血浆样本。
所述的诊断或预后评估白塞氏病葡萄膜炎包括检测生物标志物的有无或含量。然后将其与阈值比较。所述的阈值为前期实验获得，即通过实验及数据分析白塞氏病葡萄膜炎与健康人或白塞氏病葡萄膜炎与其他类型眼病之间，生物标志物的差异程度确定阈值。
当本申请所述的生物标志物与阈值具有差异或显著差异（差异具有统计学意义，例如p<0.05，p<0.01，p<0.001，p<0.0001）则确定为疾病。例如：
A）EMILIN1高于阈值或显著高于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；和/或，
B）LYZ高于阈值或显著高于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；和/或，
C）ATP5PO高于阈值或显著高于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；和/或，
D）PREB高于阈值或显著高于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；和/或，
E）TTI2高于阈值或显著高于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；和/或，
F）HYI低于阈值或显著低于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生。
本发明的第二方面，提供一种生物标志物在构建白塞氏病葡萄膜炎的诊断模型中的应用。
所述的生物标志物包括EMILIN1和/或LYZ。优选的，所述的生物标志物还包括ATP5PO、HYI、PREB或TTI2中的一种或两种以上。所述的诊断模型包括检测生物标志物的试剂。
本发明的第三方面，提供一种白塞氏病葡萄膜炎的诊断模型，所述的诊断模型包括检测生物标志物的试剂。
本发明的第四方面，提供一种诊断或预后评估白塞氏病葡萄膜炎的方法，所述的方法包括检测受试者样本中的生物标志物。
优选的，检测生物标志物的有无或含量，例如蛋白的表达量。
所述的样本为血浆样本。
所述的方法还包括将检测的生物标志物的表达量与阈值比较。
当本申请所述的生物标志物与阈值具有差异或显著差异（差异具有统计学意义，例如p<0.05，p<0.01，p<0.001，p<0.0001）则确定为疾病。例如：
A）EMILIN1高于阈值或显著高于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；和/或，
B）LYZ高于阈值或显著高于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；和/或，
C）ATP5PO高于阈值或显著高于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；和/或，
D）PREB高于阈值或显著高于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；和/或，
E）TTI2高于阈值或显著高于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；和/或，
F）HYI低于阈值或显著低于阈值表示白塞氏病葡萄膜炎的发生。
优选的，所述检测的方法可以选自质谱、液相、ELISA。
本发明的第五方面，提供了一种诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒包含检测生物标志物试剂。
本发明的第六方面，提供一种生物标志物在制备区分白塞氏病葡萄膜炎与后巩膜炎或与其他葡萄膜炎的产品中的应用。
所述的生物标志物包括EMILIN1和/或LYZ。优选的，所述的生物标志物还包括ATP5PO、HYI、PREB或TTI2中的一种或两种以上。
生物标志物在白塞氏病葡萄膜炎中的表达量与在后巩膜炎或其他葡萄膜炎中的表达量具有显著差异（差异具有统计学意义，例如p<0.05，p<0.01，p<0.001，p<0.0001）。例如：
A）EMILIN1在白塞氏病葡萄膜炎中的表达量显著高于在后巩膜炎或其他葡萄膜炎中的表达量，表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；反之可能患有后巩膜炎或其他葡萄膜炎或健康，需进一步确定。和/或，
B）LYZ在白塞氏病葡萄膜炎中的表达量显著高于在后巩膜炎或其他葡萄膜炎中的表达量，表示白塞氏病葡萄膜炎的发生；反之可能患有后巩膜炎或其他葡萄膜炎或健康，需进一步确定。
所述的其他葡萄膜炎包括Vogt-小柳原田综合征、强直性脊柱炎引起的葡萄膜炎、Fuchs综合征、交感性眼炎或特发性葡萄膜炎中的一种或两种以上。
本发明的第七方面，提供一种区分白塞氏病葡萄膜炎与后巩膜炎或与其他葡萄膜炎的方法，所述的方法包括检测受试者样本中生物标志物的表达量。
所述的其他葡萄膜炎包括Vogt-小柳原田综合征、强直性脊柱炎引起的葡萄膜炎、Fuchs综合征、交感性眼炎或特发性葡萄膜炎中的一种或两种以上。
所述的样本为血浆样本。
本发明所述的“诊断”是指以查明患者是否患有疾病或病症。
本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应。
本发明所述的“受试者”为人。
本申请简写与全称对比见表1。
表1
本发明的有益效果：（1）本发明通过SWATH-MS技术对健康对照、白塞氏病葡萄膜炎、后巩膜炎和Vogt-小柳原田综合征患者血浆中蛋白质进行鉴定，结合生物信息学方法筛选出6种白塞氏病葡萄膜炎的生物标志物。（2）ELISA进一步对生物标志物验证，EMILIN1和LYZ在白塞氏病葡萄膜炎与后巩膜炎或Vogt-小柳原田综合征或未患病的表达量显著不同，可以作为区分白塞氏病葡萄膜炎与后巩膜炎或与其他葡萄膜炎的生物标志物。（3）本发明筛选获得的EMILIN1和/或LYZ作为生物标志物诊断白塞氏病葡萄膜炎具有较高的灵敏度和特异度，具有优异的临床诊断意义。
附图说明
图1：SWATH-MS定量分析结果图。
图2：PLS-DA分析结果图。
图3：GSEA富集分析结果图。
图4：白塞氏病葡萄膜炎与健康对照组相比的差异蛋白火山图。
图5：白塞氏病葡萄膜炎、Vogt-小柳原田综合征和后巩膜炎蛋白差异蛋白的Venn图，其中，C-B代表健康对照组与白塞氏病葡萄膜炎的差异蛋白数量，S-B代表后巩膜炎与白塞氏病葡萄膜炎的差异蛋白数量，V-B代表Vogt-小柳原田综合征与白塞氏病葡萄膜炎的差异蛋白数量。
图6：血浆中EMILIN1蛋白表达水平的质谱结果图。
图7：血浆中LYZ蛋白表达水平的质谱结果图。
图8：血浆中EMILIN1蛋白的ELISA结果图。
图9：血浆中LYZ蛋白的ELISA结果图。
图10：白塞氏病葡萄膜炎患者与其它三组的针对EMILIN1和LYZ的ROC曲线。
图11：白塞氏病葡萄膜炎患者与其他三组的针对EMILIN1的ROC曲线。
图12：白塞氏病葡萄膜炎患者与其他三组的针对LYZ的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中涉及的实验对象及实验方法如下：
1、实验对象
本研究得到天津医科大学眼科医院伦理委员会的批准。天津医科大学眼科医院的纳入研究患者均签署知情同意书。选择从2018年1月至2022年10月在眼科医院接受治疗的白塞氏病葡萄膜炎、VKH和后巩膜炎患者作为实验组，同时招募了另一健康队列作为对照组。
1.1实验组纳入标准：
1）患有自身免疫性葡萄膜炎患者（包括白塞氏病葡萄膜炎、Vogt-小柳原田综合征）以及伴或不伴有球壁病变的后巩膜炎；2）年龄在16-70岁之间；3）无糖尿病、高血压、高血脂、心血管疾病、精神疾病等，无全身器质性病变；4）无眼球穿通伤和内眼手术史；双眼除白内障外无其他眼部病变。
1.2排除标准：
1）有严重的传染性疾病；2）除白内障外合并有其他影响视力的眼部病变；3）有其它全身系统疾病。
1.3疾病诊断标准：
1）确诊为Vogt-小柳原田综合征。初发活动期：眼部初次发病，眼部炎症升高（如前房细胞、玻璃体混浊），OCT显示视网膜异常改变；初发非活动期：经治疗后，前房炎症消退且视网膜结构恢复正常；复发：初次治疗停止超过3个月后再次发病。
2）确诊为白塞氏病葡萄膜炎。高度活跃期：眼部首次发病或复发，前房炎症水平升高，多数病例可伴有不同程度的眼后节病变及全身改变；低度活跃期：治疗后眼部炎症和全身改变得到控制，前房炎症等级小于1个数量级，眼后段炎症趋于稳定。
3）确诊为后巩膜炎。巩膜增厚：眼部首次发病或复发，前房炎症水平升高，B超显示球壁增厚；巩膜非增厚：B超显示球壁无明显增厚的后巩膜炎或经治疗后巩膜厚度恢复正常。
2、建立蛋白质库以及发现队列筛选实验方法
2.1建立蛋白质库
建库队列：选取健康成人、白塞氏病葡萄膜炎、后巩膜炎和VKH共26个冻存样本，使用超高速离心机（Beckman Coulter公司）提取其中的外泌体和微囊泡，与血浆样本一同混合后构建蛋白质库。
2.2血浆提取与保存
样本收集：筛选出由健康对照、白塞氏病葡萄膜炎、后巩膜炎和VKH各48、46、48、48个样本组成的发现队列，采集发现队列中190个样本的外周静脉血5ml于EDTA抗凝管中。4℃，1800g，15min离心后提取2ml血浆，放置于-80℃冰箱冷存，以备后续使用。
2.3蛋白溶液内酶切，测量蛋白浓度
1）取出冻存的血浆样本，抽取2μl，加入100μl尿素裂解液（Sigma-Aldrich公司）。
2）还原：加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇DTT（Sigma-Aldrich公司），37℃孵育1h。
3）烷基化：加入终浓度40mM的碘代乙酰胺IAA（Sigma-Aldrich公司），避光常温孵育1h。
4）平衡超滤管以及样本过滤：加入300μl 50mM碳酸氢铵离心两次（14000g×5min，室温）；加入还原烷基化后的样本至平衡后的超滤管中，离心（14000g×20min，室温）；样本完全过滤后，加入300μl 50mM碳酸氢铵（Sigma-Aldrich公司）清洗三次（14000g×5min，室温）；更换收集管，加入75μl 50mM碳酸氢铵至超滤管中。
5）蛋白酶切：加入胰酶（Roche生物公司）37℃过夜酶切；孵育完成后，离心（14000g×5min，20min）；加入1%甲酸（Sigma-Aldrich公司）终止酶切，60℃真空蒸干。
6）加入0.1%甲酸重悬样本，Nanodrop（Thermo Fisher Scientific公司）测量蛋白浓度。
2.4质谱检测与鉴定
选取2.3中蛋白酶切后获得的部分肽段通过信息依赖性获取的方式进行蛋白质检测。
2.5定量数据值的处理
对得到的蛋白定量值使用R语言进行处理，差异蛋白定义为p小于0.05，变化倍数（Fold change，FC）绝对值大于1.2倍。
2.6候选生物标志物的筛选
筛选单一疾病与其它3组之间存在差异的蛋白质为疾病蛋白标志物，使用hiplot绘制韦恩图表征筛选结果。
3、另选验证队列进行候选生物标志物的ELISA验证
基于与发现队列相同的标准筛选出由健康对照、白塞氏病葡萄膜炎、后巩膜炎和VKH各67、65、65、65个样本组成的验证队列，对质谱筛选的生物标志物进行ELISA验证，其中，血浆样本的提取与保存同“2.2血浆提取与保存”，所使用的试剂盒均来自FineTest公司。步骤如下：
1）试剂盒中的所有试剂及样本提前拿出放至室温。向试剂盒提供的标准品管中加入1ml标准品稀释液，作为0号管，取7个ep管编号1-7，分别加入300μl标准品稀释液。取混匀后的0号管300μl液体加入1号管，从1号管中取300μl加入2号管，以此类推，7号管中保持300μl标准品稀释液不变。
2）取100μl标准品稀释液和血浆稀释液加入孔板中37℃孵育90分钟。准备48ml超纯水加入2ml浓缩洗涤液配置稀释25倍洗涤液，洗板两次。
3）配置生物素抗体工作液，每孔加入100μl抗体工作液孵育60分钟。洗板3次。
4）配置HRP-链霉亲和素，每孔加入100μl孵育30分钟。洗板5次。
5）添加90μl TMB显色底物，避光孵育10-20分钟。
6）添加50μl反应终止液，置于酶标仪（TECAN公司）读取450nm处吸光度值并计算。
7）使用SPSS软件进行单因素方差分析对四组之间的差异进行统计学分析，p<0.05视为差异有统计学意义。代表p<0.05，/>代表p<0.01，/>代表p<0.001，代表p<0.0001。
4、诊断效果验证
筛选出由健康对照、白塞氏病葡萄膜炎、后巩膜炎和VKH各67、65、65、65个样本组成的验证队列，进行诊断效果的评估。采用SPSS软件分别对EMILIN1和LYZ进行ROC曲线分析，以及采用SPSS软件通过二元logistic回归对EMILIN1和LYZ进行联合ROC曲线分析，得到预测值。
实施例1：蛋白质谱图
为了扩大蛋白质的鉴定数目，使用26个冻存样本中的小细胞外囊泡、大细胞外囊泡和血浆样本混合构建了有2432个蛋白质的数据库。质谱分析发现队列显示：通过SWATH-MS定量得到2028个蛋白质（图1）。在95%置信区间内对四组进行PLS-DA（偏最小二乘法判别分析）分析（图2），发现四组之间可被区分，存在一定的差异。为了全面了解白塞氏病葡萄膜炎，利用所有可定量的蛋白质进行了GSEA富集分析（图3），结果显示疾病所影响的生物过程和通路主要集中在Wnt、B细胞介导的免疫反应和TGF-β等信号通路。
火山图展示了白塞氏病葡萄膜炎与健康对照组相比的上下调差异蛋白（图4）。为进一步筛选疾病中独立表达的蛋白作为疾病标志物，将白塞氏病葡萄膜炎与其它3组分别比较，结果通过Venn图展示（图5），结合Venn图展示5个潜在蛋白标志物和火山图中上下调差异蛋白，综合确定6个蛋白标志物，即EMILIN1、LYZ、ATP5PO、HYI、PREB和TTI2，可以作为诊断白塞氏病葡萄膜炎的标志物。
实施例2：使用ELISA对蛋白标志物进一步验证
选择另一组队列作为验证队列，根据蛋白质的功能和组间的表达情况，以EMILIN1和LYZ为例进行验证，根据发现队列质谱得到的定量值发现这两个蛋白质在白塞氏病葡萄膜炎患者的血浆中均呈上升趋势（图6和图7）。ELISA验证的结果（图8和图9）也证实了前期发现的正确性。
实施例3：诊断效果评估
以EMILIN1和LYZ为例，将ELISA结果进行受试者工作特征（Receiver OperationCharacteristic, ROC）曲线分析，其中，通过二元logistic回归得到EMILIN1和LYZ两个标志物的组合值后进行ROC分析并计算曲线下面积（AUC=0.782），获得最终的诊断模型（图10），EMILIN1作为生物标志物诊断白塞氏病葡萄膜炎的ROC曲线如图11所示，AUC=0.657；LYZ作为生物标志物诊断白塞氏病葡萄膜炎的ROC曲线如图12所示，AUC=0.742。
Claims (9)
1.生物标志物在制备诊断白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括弹性微囊组装蛋白1和/或溶菌酶C。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物还包括ATP合成酶O亚单位、羟丙酮酸异构酶、催乳素调控元件结合蛋白或TELO2相互作用蛋白2中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括试剂盒、试纸或膜条。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括蛋白芯片。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括检测样本中生物标志物的有无或表达水平的试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的样本为血浆样本。
7.生物标志物在制备区分白塞氏病葡萄膜炎与后巩膜炎或与其他葡萄膜炎的产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括弹性微囊组装蛋白1和/或溶菌酶C。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物还包括ATP合成酶O亚单位、羟丙酮酸异构酶、催乳素调控元件结合蛋白或TELO2相互作用蛋白2中的一种或两种以上。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的其他葡萄膜炎包括Vogt-小柳原田综合征、强直性脊柱炎引起的葡萄膜炎、Fuchs综合征、交感性眼炎或特发性葡萄膜炎中的一种或两种以上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410077768.2A CN117590007B (zh) | 2024-01-19 | 2024-01-19 | 生物标志物在制备诊断白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410077768.2A CN117590007B (zh) | 2024-01-19 | 2024-01-19 | 生物标志物在制备诊断白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117590007A CN117590007A (zh) | 2024-02-23 |
| CN117590007B true CN117590007B (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=89920559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410077768.2A Active CN117590007B (zh) | 2024-01-19 | 2024-01-19 | 生物标志物在制备诊断白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117590007B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005328798A (ja) * | 2004-05-21 | 2005-12-02 | Toyo Kohan Co Ltd | ブドウ膜炎を診断する方法 |
| JP2007295852A (ja) * | 2006-04-28 | 2007-11-15 | Osaka Univ | 疾患マーカー、ｄｎａマイクロアレイ、薬剤スクリーニング方法及びぶどう膜炎検査方法 |
| RU2415439C1 (ru) * | 2009-12-08 | 2011-03-27 | Государственное учреждение "УФИМСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЛАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ" Академии наук Республики Башкортостан (УфНИИ ГБ АН РБ) | Способ дифференциальной диагностики увеита при ревматоидном артрите и болезни бехтерева |
| CN111279193A (zh) * | 2017-10-24 | 2020-06-12 | 高丽大学校产学协力团 | 利用尿代谢组分析诊断白塞氏病的方法 |
| CN111788487A (zh) * | 2017-12-22 | 2020-10-16 | 坦佩雷大学注册基金会 | 用于治疗眼病的预测性生物标记物 |
| CN116397018A (zh) * | 2021-12-28 | 2023-07-07 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 自身免疫性甲状腺疾病生物标志物、相关产品及应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2463659A1 (en) * | 2010-12-13 | 2012-06-13 | Université de Liège | Biomarkers for cancer diagnosis |
| US20220404373A1 (en) * | 2019-09-25 | 2022-12-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for diagnosing and treating uveitis |
| US20230152322A1 (en) * | 2020-01-31 | 2023-05-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for diagnosing and treating uveal melanoma |
-
2024
- 2024-01-19 CN CN202410077768.2A patent/CN117590007B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005328798A (ja) * | 2004-05-21 | 2005-12-02 | Toyo Kohan Co Ltd | ブドウ膜炎を診断する方法 |
| JP2007295852A (ja) * | 2006-04-28 | 2007-11-15 | Osaka Univ | 疾患マーカー、ｄｎａマイクロアレイ、薬剤スクリーニング方法及びぶどう膜炎検査方法 |
| RU2415439C1 (ru) * | 2009-12-08 | 2011-03-27 | Государственное учреждение "УФИМСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЛАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ" Академии наук Республики Башкортостан (УфНИИ ГБ АН РБ) | Способ дифференциальной диагностики увеита при ревматоидном артрите и болезни бехтерева |
| CN111279193A (zh) * | 2017-10-24 | 2020-06-12 | 高丽大学校产学协力团 | 利用尿代谢组分析诊断白塞氏病的方法 |
| CN111788487A (zh) * | 2017-12-22 | 2020-10-16 | 坦佩雷大学注册基金会 | 用于治疗眼病的预测性生物标记物 |
| CN116397018A (zh) * | 2021-12-28 | 2023-07-07 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 自身免疫性甲状腺疾病生物标志物、相关产品及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Comprehensive profling of extracellular vesicles in uveitis and scleritis enables biomarker discovery and mechanism exploration;Xiaomin Zhang et al.;《Journal of Translational Medicine》;20230615;第21卷;全文 * |
| Expression levels of miR-21, miR-146b and miR-326 as potential biomarkers in Behcet’s disease;Golamreza Jadideslam;《Biomark. Med.》;20191231;第13卷(第16期);全文 * |
| IFN-α治疗白塞氏病葡萄膜炎的新进展;高玮;《国际眼科杂志》;20110625(第06期);全文 * |
| 白塞病诊治进展;何庭艳;《中国实用儿科杂志》;20200406(第04期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117590007A (zh) | 2024-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ciardullo et al. | Prevalence of liver steatosis and fibrosis detected by transient elastography in adolescents in the 2017–2018 National Health and Nutrition Examination Survey | |
| EP2558862B1 (en) | Diagnostic methods for glaucoma | |
| EP1543036A1 (en) | Protein for diagnosing diabetic retinopathy | |
| CN112649608B (zh) | 血清中mmp19在焦虑抑郁症中的应用 | |
| CN112230003B (zh) | 三种血清脂质联合用于糖尿病肾病诊断的用途 | |
| CN113176414B (zh) | 用于高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的铁代谢相关蛋白质标记物组合物及其应用 | |
| CN117590007B (zh) | 生物标志物在制备诊断白塞氏病葡萄膜炎的产品中的应用 | |
| CN117607462B (zh) | 生物标志物在制备诊断后巩膜炎的产品中的应用 | |
| CN117590006B (zh) | 生物标志物在制备诊断Vogt-小柳原田综合征的产品中的应用 | |
| CN111856038A (zh) | Unc45a在pop早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品 | |
| Al-Moujahed et al. | Proteomic analysis of autoimmune retinopathy implicates neuronal cell adhesion molecule as a potential biomarker | |
| CN113125615B (zh) | 三种代谢标志物单独或联合在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂盒方面的应用 | |
| CN112946303B (zh) | Tag54:2-fa18:1及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用 | |
| CN113009158B (zh) | 中高度近视的辅助诊断标记物及其用途 | |
| CN112763732B (zh) | Pe(16:0/20:2)及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用 | |
| CN111596069B (zh) | Hsp10在pop早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品 | |
| CN111596068B (zh) | Utrophin在POP早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品 | |
| CN109632924B (zh) | 人黄斑新生血管性疾病的血浆脂质标记物及其应用 | |
| CN112394177B (zh) | ApoF蛋白在制备或筛选精神分裂症诊断产品中的用途 | |
| Hashida et al. | Mitochondrial DNA as a biomarker for acute central serous chorioretinopathy: a case-control study | |
| US20220196682A1 (en) | Catecholamine concentrations in a blood sample and arterial hypertension status in a subject for a differential diagnosis of neurodegenerative diseases including alzheimer's disease | |
| CN114137192B (zh) | 7-甲基黄嘌呤作为检测靶点在制备2型糖尿病高危个体筛查试剂盒中的应用 | |
| Liberek et al. | Sp151renal amyloidosis–a common cause of nephrotic syndrome in older patients | |
| JP7470842B1 (ja) | 間質性膀胱炎・膀胱痛症候群の診断方法 | |
| RU2764355C1 (ru) | Способ прогнозирования неврологического восстановления с 14-го по 90-й дни ишемического инсульта головного мозга |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |