CN112394177B - ApoF蛋白在制备或筛选精神分裂症诊断产品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及精神分裂症诊断产品，特别是涉及ApoF蛋白在制备或筛选精神分裂症诊断产品中的用途，所述ApoF蛋白还可以与年龄、性别、BMI联合，或者与ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白中的一种或多种联合作为指标用于制备或筛选精神分裂症诊断产品中。本发明首次揭示ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白或它们的特有肽段作为生物标志物用于诊断精神分裂症，利用各生物标志物构建的模型表现非常稳定、诊断效力很高，这为各种诊断产品的制备和筛选提供了研究基础。

Description

ApoF蛋白在制备或筛选精神分裂症诊断产品中的用途
技术领域
本发明涉及精神分裂症诊断产品，特别是涉及ApoF蛋白在制备或筛选精神分裂症诊断 产品中的用途。
背景技术
精神分裂症是一种常见精神疾病，患病率在1％左右。精神分裂症患者在感知、思维、情 感、行为等多方面存在障碍和异常，且多数患者长期反复发作，为患者本人和家人带来极大 的痛苦，为社会造成沉重的负担。
目前，临床上对精神分裂症的诊断主要是医生根据病人的病史和精神症状进行综合判断， 这个过程过度依赖医生的经验，诊断结果往往因人而异。这种主观的诊断方式带来较高的误 诊率，并会引起病人的治疗延误。因此，基于精神分裂症发病机制的临床诊断标志物的开发 是十分紧迫的需求，也是巨大的挑战。
精神分裂症的能量代谢异常引起了科学界越来越多的关注，特别是糖脂类物质的代谢。 近年来的研究结果表明，精神分裂症与糖尿病、肥胖、心脑血管疾病和代谢综合征的共病率 普遍较高。精神分裂症患者脑组织和外周组织中能量代谢相关蛋白质和代谢物水平与正常人 相比存在显著差异，如脂肪酸等。目前尚没有基于患者体内的脂代谢异常来诊断精神分裂症 的研究。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供ApoF蛋白在制备或筛选精神分 裂症诊断产品中的用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供ApoF蛋白或其特有肽段在制备或筛选精 神分裂症诊断产品中的用途。
本发明还提供一种能特异性识别ApoF蛋白或其特有肽段的产品在制备或筛选精神分裂 症诊断试剂盒中的用途。
本发明还提供一种精神分裂症诊断试剂盒，所述试剂盒中包括能特异性识别ApoF蛋白或 其特有肽段的试剂。
本发明还提供一种用于诊断精神分裂症的装置，所述装置包括：
数据模块，用于提供待测者的ApoF蛋白或其特有肽段的丰度数据；
计算模块，用于根据数据模块提供的数据计算并判断待测者是否患精神分裂症。
如上所述，本发明的ApoF蛋白在制备或筛选精神分裂症诊断产品中的用途，具有以下 有益效果：首次揭示ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白和它们的特有肽段作为生物标志物用于诊断精神分裂症，且利用各生物标志物构建的模型表现非常稳定、诊断效 力很高，这为各种诊断产品的制备和筛选提供了研究基础。
附图说明
图1显示为本发明的实施例1中获得特异性肽段过程中的一级图谱，图中箭头所指为目 的肽段的一级峰图，峰强度高，包含全部5个子离子套峰。
图2显示为本发明的实施例1中获得特异性肽段过程中的二级质谱，图中方框标注的为 5个子离子的二级峰图，质荷比和保留时间与预测一致。
图3显示为本发明的四种蛋白质在精神分裂症和正常对照血清中的含量存在显著差异结 果图。
图4-1至4-7显示为本发明的各血清载脂蛋白组合模型的ROC曲线，其中图4-1至4-7 分别为第一模型方程至第七模型方程的ROC曲线。
具体实施方式
本发明提供ApoF蛋白或其特有肽段在制备或筛选精神分裂症诊断产品中的用途。
所述ApoF蛋白为ApoF基因编码的蛋白，所述ApoF蛋白亦称Apolipoprotein F。
在一种实施方式中，所述ApoF特有肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述将ApoF蛋白或其特有肽段在制备或筛选精神分裂症诊断产品具体是指：将ApoF蛋 白或其特有肽段作为一项精神分裂症诊断指标应用于精神分裂症诊断产品的制备。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白或其特有肽段作为生物标志物在制备或筛选精神分 裂症诊断产品中的用途。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白或其特有肽段作为血液生物标志物在制备或筛选精 神分裂症诊断产品中的用途。血液检测取材方便，操作简单，便于复查，患者易于接受。
基于ApoF蛋白或其特有肽段作为血液生物标志物可以用于鉴别诊断精神分裂症、评估 相关治疗药物的疗效、患者的预后以及选择合适的治疗方法。
具体的，所述诊断产品是指用于在分析物中检测ApoF蛋白或其特有肽段的存在与否以 及表达情况的产品。在一种实施方式中，所述诊断产品为能够特异性识别ApoF蛋白或其特 有肽段的抗体；检测的方法可采用各种本领域已知的技术，例如Western Blot、ELISA。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白或其特有肽段与年龄、性别数据、BMI联合作为指 标用于制备或筛选精神分裂症诊断产品。
所述BMI是指身体质量指数(身体质量指数，简称体质指数)，是目前国际上常用的衡量 人体胖瘦程度以及是否健康的一个标准。计算公式为：BMI＝体重(千克)除以身高(米)的 平方。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白或其特有肽段与年龄、性别数据、BMI联合作为指 标用于诊断精神分裂症。
在一种实施方式中，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白或其特有肽段的丰度， 将检测得到的丰度以及患者的年龄、性别数据代入下述模型方程中根据P值可诊断患者得病 与否，P值在0-1之间，0表示不患病，1表示患病。
ln[P/(1-P)]＝-2.34+0.004×年龄+0.004×性别数据+0.11×BMI+1.92×c(ApoF)
公式的性别数据中，男性为1，女性为2；“c(ApoF)”表示ApoF蛋白或其特有肽段的丰度。 在一种实施方式中，所述丰度为质谱检测的丰度。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白与ApoA4蛋白，或二者的特有肽段联合作为指标用 于制备或筛选精神分裂症诊断产品。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白与ApoA4蛋白，或二者的特有肽段联合作为指标用 于诊断精神分裂症。
在一种实施方式中，所述ApoA4特有肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2和/或SEQID NO.3所示。
在一种实施方式中，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白、ApoA4蛋白或二者的 特有肽段的丰度，将检测得到的丰度代入下述模型方程中根据P值可诊断患者得病与否，P 值在0-1之间，0表示不患病，1表示患病。
ln[P/(1-P)]＝1.09-4.44×c(ApoA4)+3.42×c(ApoF)
公式中，“c(ApoF)”表示ApoF蛋白或其特有肽段的丰度、c(ApoA4)表示ApoA4蛋白或 其特有肽段的丰度。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白或其特有肽段与ApoA4蛋白或其特有肽段，以及年 龄、性别数据、BMI联合作为指标用于制备或筛选精神分裂症诊断产品。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白或其特有肽段与ApoA4蛋白或其特有肽段，以及年 龄、性别数据、BMI联合作为指标用于诊断精神分裂症。
在一种实施方式中，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白、ApoA4蛋白或二者的 特有肽段的丰度，将检测得到的丰度以及患者的年龄、性别数据代入下述模型方程中根据P 值可诊断患者得病与否，P值在0-1之间，0表示不患病，1表示患病。
ln[P/(1-P)]＝-1.52+0.042×年龄-0.09×性别数据-0.66×BMI-4.88×c(ApoA4)+3.96×c(ApoF)
公式的性别数据项中，男性为1，女性为2。“c(ApoF)”表示ApoF或其特有肽段的丰度、 c(ApoA4)表示ApoA4或其特有肽段的丰度。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白与ApoA4蛋白、AACT蛋白或三者的特有肽段联合作为指标用于制备或筛选精神分裂症诊断产品。
AACT蛋白亦称为SERPINA3蛋白。
在一种实施方式中，所述AACT肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白与ApoA4蛋白、AACT蛋白或三者的特有肽段联合作为指标用于诊断精神分裂症。
在一种实施方式中，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AACT蛋白或三者的特有肽段的丰度，将检测得到的丰度代入下述模型方程中根据P值可诊断患者 得病与否，P值在0-1之间，0表示不患病，1表示患病。
ln[P/(1-P)]＝-0.077-5.09×c(ApoA4)+2.31×c(ApoF)+2.95×c(AACT)
公式中，“c(ApoF)”表示ApoF蛋白或其特有肽段的丰度、c(ApoA4)表示ApoA4蛋白或 其特有肽段的丰度；c(AACT)表示AACT蛋白或其特有肽段的丰度。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白与ApoA4蛋白、AGT蛋白或三者的特有肽段联合作 为指标用于制备或筛选精神分裂症诊断产品。
在一种实施方式中，所述AGT特有肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5和/或SEQ IDNO.6。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白与ApoA4蛋白、AGT蛋白或三者的特有肽段联合作 为指标用于诊断精神分裂症。
在一种实施方式中，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白或三者的特有肽段的丰度，将检测得到的丰度代入下述模型方程中根据P值可诊断患者得 病与否，P值在0-1之间，0表示不患病，1表示患病。
ln[P/(1-P)]＝0.16-4.81×c(ApoA4)+2.80×c(ApoF)+2.12×c(AGT)
公式中，“c(ApoF)”表示ApoF或其特有肽段的丰度、c(ApoA4)表示ApoA4或其特有肽 段的丰度；c(AGT)表示AGT或其特有肽段的丰度。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白与ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白联合作为指标用于制备或筛选精神分裂症诊断产品。
在一种实施方式中，所述ApoF蛋白与ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白或四者的特有肽段联合作为指标用于诊断精神分裂症。
在一种实施方式中，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白或四者的特有肽段的丰度，将检测得到的丰度代入下述模型方程中根据P值可诊断患者得病与否，P值在0-1之间，0表示不患病，1表示患病。
ln[P/(1-P)]＝-0.38-5.19×c(ApoA4)+2.16×c(ApoF)+2.51×c(AACT)+1.10×c(AGT)
公式中，“c(ApoF)”表示ApoF或其特有肽段的丰度、c(ApoA4)表示ApoA4或其特有肽 段的丰度；c(AGT)表示AGT或其特有肽段的丰度，c(AACT)表示AACT或其特有肽段的 丰度。
在一种实施方式中，以上各指标中所述ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白或它们的特有肽段均作为生物标志物在制备或筛选精神分裂症诊断产品中的用途。
在一种实施方式中，以上各指标中所述ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白或它们的特有肽段均作为血液生物标志物在制备或筛选精神分裂症诊断产品中的用途。
具体的，所述血液生物标志物包括血浆生物标志物和血清生物标志物。
本发明还提供能特异性识别ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白中的一种或几种蛋白或它们的特有肽段的产品在制备或筛选精神分裂症诊断试剂盒中的用途。
在一种实施方式中，所述能特异性识别ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋 白或它们的特有肽段中的一种或几种的试剂选自抗体或配体。
所述ApoF特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示；
所述ApoA4特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3所示；
所述AACT特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.4所示；
所述AGT特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供一种精神分裂症诊断试剂盒，所述试剂盒中包括能特异性识别ApoF蛋白、 ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白或它们的特有肽段中的一种或几种的试剂。
所述ApoF特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示；
所述ApoA4特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3所示；
所述AACT特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.4所示；
所述AGT特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示。
在一种实施方式中，所述能特异性识别ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋 白或它们的特有肽段中的一种或几种的试剂选自抗体或配体。
在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括酶联免疫检测(ELISA)试剂。
本发明还提供ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白或它们的特有肽段中的一种或几种作为精神分裂症生物标志物的用途。
所述ApoF特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示；
所述ApoA4特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3所示；
所述AACT特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.4所示；
所述AGT特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供一种诊断精神分裂症的方法，所述方法包括检测血液中ApoF蛋白、ApoA4 蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白或它们的特有肽段中的一种或几种的水平。
本发明还提供一种用于诊断精神分裂症的产品，所述产品包括数据模块、计算模块，所 述数据模块用于提供待测者的ApoF蛋白或其特有肽段的丰度数据，所述计算模块用于根据 数据模块提供的数据计算并判断待测者是否患精神分裂症。
在一种实施方式中，所述数据模块还提供以下数据中的一种或几种：待测者的年龄数据、 性别数据、BMI数据、ApoA4蛋白或其特有肽段的丰度、AGT蛋白或其特有肽段的丰度、 AACT蛋白或其特有肽段的丰度。
在一种实施方式中，所述数据模块还提供以下数据中的一种或几种：待测者的年龄数据、 性别数据、BMI数据、ApoA4蛋白或其特有肽段的丰度、AGT蛋白或其特有肽段的丰度、 AACT蛋白或其特有肽段的丰度。
在一种实施方式中，所述计算模块中采用有以下模型方程中的一种或几种计算并判断待 测者是否患精神分裂症：
第一模型方程：ln[P/(1-P)]＝-2.34+0.004×年龄+0.004×性别数据+0.11×BMI+1.92×c(ApoF)
第二模型方程：ln[P/(1-P)]＝-1.52+0.042×年龄-0.09×性别数据-0.66×BMI-4.88×c(ApoA4) +3.96×c(ApoF)
第三模型方程：ln[P/(1-P)]＝1.09-4.44×c(ApoA4)+3.42×c(ApoF)
第四模型方程：ln[P/(1-P)]＝-0.077-5.09×c(ApoA4)+2.31×c(ApoF)+2.95×c(AACT)
第五模型方程：ln[P/(1-P)]＝0.16-4.81×c(ApoA4)+2.80×c(ApoF)+2.12×c(AGT)
第六模型方程：ln[P/(1-P)]＝-0.38-5.19×c(ApoA4)+2.16×c(ApoF)+2.51×c(AACT)+ 1.10×c(AGT)
以上各模型方程中，性别数据中待测者为男性则数值为1，待测者为女性则数值为2。c 为各蛋白或其特有肽段的丰度；
计算的P值在0-1之间，如果0≤P<1，则判断结论为待测者不患精神分裂症；如果P＝1， 则判断结论为待测者罹患精神分裂症。其中，当0≤P<1时，P越接近0，待测者为正常人即 不患精神分裂症的概率越高，P越接近1，待测者罹患精神分裂症的概率越高。
所述特有肽段的前一个氨基酸是精氨酸(Arginine，R)或者赖氨酸(Lysine，K)，肽段 中间不含R或者K；所述特有肽段的m/z小于1000。
在一种实施方式中，所述ApoF特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示；
所述ApoA4特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3所示；
所述AACT特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.4所示；
所述AGT特有肽段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6。
在一种实施方式中，所述计算模块可以自动根据输入的数据选择合适的模型方程。在另 一种实施方式中，也可以手动选择模型方程进行计算。
以上模型方程中在考虑年龄、性别、BMI等因素对疾病的影响时第二模型方程最优。该 模型最佳诊断点的灵敏度达到85.7％，特异性82.0％，说明该诊断模型表现非常稳定、诊断 效力很高。
而在仅考虑血清中蛋白质的变化时最优模型为第六模型方程，该模型最佳诊断点的灵敏 度达到82％，特异性91.8％，说明该诊断模型表现非常稳定、诊断效力很高。
在一种实施方式中，所述产品选自计算机程序。
本发明还提供一种用于诊断精神分裂症的产品的分析方法，所述分析方法包括以下步骤：
S1：在数据模块中输入待测者的各项数据；
S2：根据数据模块提供的数据选择合适的模型方程并进行计算，根据计算结果判断待测 者是否患精神分裂症；
S3：输出计算模块的计算结果以及是否患精神分裂症的结论。
在一种实施方式中，所述数据模块能输入以下数据中的一种或几种：待测者的年龄数据、 性别数据、BMI数据、ApoF蛋白的丰度、ApoA4蛋白的丰度、AGT蛋白的丰度、AACT蛋白的丰度。
在一种实施方式中，所述计算模块中设置有第一模型方程至第七模型方程中的一种或几 种。
本发明的还提供了一种存储介质，所述存储介质上存储有所述计算机程序。
进一步的，所述存储介质包括：ROM、RAM、磁碟、U盘、存储卡或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
本发明的还提供了一种服务终端，所述服务终端包括处理器和存储器；所述存储器用于 存储所述计算机程序，所述处理器用于执行所述存储器存储的计算机程序，以使所述服务终 端执行时实现判断待测者是否患有精神分裂症。
所述存储器用于存储计算机程序。优选地，所述存储器包括：ROM、RAM、磁碟、U盘、存储卡或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
所述处理器与所述存储器相连，用于执行所述存储器存储的计算机程序，以使所述服务 终端执行上述的设计方法。
优选地，所述处理器可以是通用处理器，包括中央处理器(Central ProcessingUnit，简称 CPU)、网络处理器(Network Processor，简称NP)等；还可以是数字信号处理器(Digital Signal Processor，简称DSP)、专用集成电路(Application SpecificIntegrated Circuit，简称ASIC)、 现场可编程门阵列(Field Programmable Gate Array，简称FPGA)或者其他可编程逻辑器件、分 立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件。
根据ICD-11的定义，本申请中的精神分裂症特征在于现实检验能力受损和行为紊乱，核 心症状包括妄想、思维形式混乱、幻觉、被控制感、意志减退、情感平淡和行为紊乱、精神 运动性激越。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定 的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指 出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
1.样本收集
从安徽省芜湖市第四人民医院筛选收集了通过ICD-11诊断的精神分裂症患者110例和正 常对照109例。将病人随机分为发现集(60例)和验证集(50例)，从正常对照中再选择年 龄、性别数据、BMI匹配的61例进入发现集，其余48例进入验证集，即发现集中共含60例病人与61例健康人，验证集中共含50例病人与48例健康人。所有入组个体均无糖尿病、恶性肿瘤、发热、炎症等躯体疾病，所有女性个体均未处于妊娠期。本研究已通过芜湖市第四人民医院伦理委员会审查，实验方案符合道德原则，且通过书面方式正式告知所有入组人 员。具体纳入标准如下：
疾病组:
1)根据ICD-11标准，被诊断为精神分裂症患者；
2)性别不限，年龄18-65岁；
3)18≤BMI<25；
4)首次发病未服药或者经过一个月以上的药物清洗；
5)入组前两周内未服用任何药物；
6)无代谢性疾病或任何躯体疾病；
7)无其他精神障碍，无药物滥用史；
对照组:
1)根据ICD-11标准，排除精神疾病；
2)性别不限，年龄18-65岁；
3)18≤BMI<25；
4)入组前两周内未服用任何药物；
5)无代谢性疾病或任何躯体疾病。
2.实验检测
2.1血清蛋白质的纯化与酶解
用沉淀试剂(乙醇：丙酮：乙酸＝50:50:0.1，v/v/v)按照5：1的比例沉淀血清蛋白质。 依次经过干燥、复溶、硫化、超滤等过程，得到纯化后的血清蛋白质。具体步骤如下：
(1)Bradford法测各血清样本中的蛋白质浓度，计算200μg蛋白质对应的血清体积，量 取对应体积的血清样本到离心管，加入5倍体积的沉淀试剂(乙醇：丙酮：乙酸 ＝50:50:0.1，v/v/v)，-20℃沉淀过夜；
(2)次日，4℃，12000rpm离心1小时，弃上清液；
(3)洗涤蛋白质沉淀：加入1mL丙酮溶液，充分震荡重悬蛋白沉淀，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上层液体，重复此过程两次；
(4)30℃真空干燥蛋白沉淀(所得产物可于-80℃保存)；
(5)加入105μL还原溶液(6M盐酸胍，100mM NH4HCO3)，室温孵育约10分钟，使 蛋白质沉淀重溶，4℃，12000rpm离心20分钟，将上清液转移至新的离心管；
(6)Bradford法检测上一步所得蛋白质溶液的浓度；
(7)计算各个样本50μg蛋白质对应的液体体积，量取对应体积的蛋白溶液并加入1M 二硫苏糖醇(DTT)，调整体积使DTT终浓度为20mM，涡旋混匀，56℃孵育1 小时；
(8)加入1M吲哚乙酸(IAA)调整体积使其终浓度为90mM，涡旋混匀，室温(25℃) 下避光放置40分钟；
(9)将上一步得到的蛋白溶液放入10K超滤管，4℃，12000rpm，离心20分钟，弃掉收集管底部滤出溶液；
(10)向超滤管内加入100μL 100mM的NH4HCO3，4℃，12000rpm，离心20分钟，弃 掉收集管底部溶液，重复此步骤3次；
(11)酶解：取1μg测序级猪胰蛋白酶(每50μg蛋白质需1μg胰酶)，用100mM NH4HCO3溶液将体积定至50μL，更换新的收集管，将配置好的胰酶溶液加入到超滤管内，将 超滤管管盖密封，37℃培养箱中酶解过夜(约16-18小时)；
(12)次日，4℃，12000rpm，离心20分钟，再次向超滤管中加入50μL 100mM的NH4HCO3溶液，4℃，12000rpm，离心20分钟，两次离心所得滤出液体在收集管底部混合 并转移至新的离心管中，这便是蛋白质酶解后的肽段溶液；
(13)用甲酸调整肽段溶液的pH，使之小于3.0(甲酸用量约4μL)，真空冷冻干燥；
(14)用50μL 0.1％甲酸水溶液溶解肽段干粉，使肽段终浓度为1μg/μL，即可用于上机检 测或-20℃冰箱保存。
2.2色谱质谱条件
(1)色谱条件
取5μL纯化后的血清蛋白质用于UPLC-MRM/MS，所用仪器为Waters ACQUITY UPLC超高 效液相色谱仪，色谱柱为HSS T3(
Figure BDA0002752263380000101
1.8μm，1.0×50mm)。流动相洗脱溶剂为0.1％甲酸 水溶液(A)和0.1％甲酸乙腈溶液(B)；流速为200μL/min；梯度洗脱(表1)，总时间为20分钟。
表1流动相洗脱梯度
Figure BDA0002752263380000102
(2)质谱条件
本次实验质谱仪采用了AB Sciex Instruments的QTRAP 5500，具体运行参数如下：
表2 MRM质谱参数
Figure BDA0002752263380000103
Figure BDA0002752263380000111
2.3特异性肽段的获得
首先，在PeptideAtlas网站上(http://www.peptideatlas.org)查询每种待检测蛋白的特异性 肽段并挑选2-3个作为候选肽段。挑选特异性肽段(即特有肽段)的原则如下：
a)肽段前一个氨基酸是精氨酸(Arginine，R)或者赖氨酸(Lysine，K)，肽段中间不能有R 或者K；
b)长度适中，m/z要在1000以内；
c)在NCBI网站进行蛋白序列比对(blast-p)，结果必须是高度特异性；
d)尽量不要选择疏水性氨基酸多的肽段，避免样品制备过程中丢失；
e)如果网站上没有质谱研究已检测到的肽段，则从预测肽段中选择。
接下来进行预实验，在超高效液相色谱多反应监测质谱联用(UPLC-MRM/MS)平台上 检测候选肽段，为每个检测肽段挑选4-6个合适的子离子，以用于正式实验定量检测。子离 子的挑选过程如下(以ApoA4的SELTQQLNALFQDK肽段为例)：将质谱检测原始数据导入Skyline软件中，该软件可以对肽段断裂所得子离子进行预测并对检测信号进行处理。勾选m/z在300-1000之间的子离子，查看一级图谱(图1)。在一级图谱中，每一条折线代表一个子离子。选择峰强度最高、叠套的子离子峰最多的峰作为候选，记录保留时间(retentiontime)。 例如图1中保留时间为13.4min的峰，可以看到有5个子离子峰套峰的现象。然后用Analyst 软件查看该信号峰的二级图谱(图2)，依次确认子离子的质荷比、峰强度、信噪比等，确认能 否用于最终定量。最终获得的特异性肽段与子离子如表3所示。
表3MRM实验检测的肽段与子离子
Figure BDA0002752263380000112
Figure BDA0002752263380000121
3.表达差异
用软件MultiQuant 2.1对UPLC-MRM/MS实验的原始数据(.wiff.scan格式)进行分析处 理。首先对全部子离子峰面积积分进行检查和手动校正；然后把一个肽段的所有子离子峰面 积进行加和，以此代表该肽段的相对定量数值，用于后续统计分析。利用QC数据计算各个 肽段的变异系数(CV值)，查看仪器的稳定性。然后用QC样本的信号值对所有样本进行归 一化处理，消除系统误差。
首先用Shapiro-Wilk检验判断变量是否为正态分布并进行方差齐性检验；结果显示数据 多数呈正态分布，因此选择Student’s t-test对精神分裂症病人组和正常对照组进行蛋白含量的 差异分析；用倍数比(Fold change)表示精神分裂症患者血清中蛋白质表达水平的变化方向， FC>1代表该蛋白质在精神分裂症患者血清中含量高于正常人，FC<-1则代表在精分患者血清 中含量低；P值经过BH校正，当P值<0.05时，认为具有统计学显著性差异。
用同一蛋白质不同肽段的平均值代表该蛋白质的丰度。结果如图3所示，四种蛋白质在 精神分裂症血清中的含量均显著异于正常对照。
实施例2构建诊断模型
在构建诊断模型的过程中，实施例1中的各发现集样本作为训练组，用来构建诊断模型； 各验证集样本用来检验模型的诊断效率。首先检测血清中的发现集和验证集各单个蛋白的 AUC，结果如表4所示。
表4单个蛋白质的AUC
蛋白质 发现集AUC 验证集AUC
ApoA4 0.840 0.791
ApoF 0.709 0.708
AGT 0.646 0.763
ACT 0.676 0.710
然后将年龄、性别、BMI和各种蛋白质变量排列组合，依次构建逻辑回归模型，各组的 ROC曲线如图4-1至4-7，计算每个模型的AIC和AUC，结果如表3所示。
表5血清载脂蛋白组合构建模型
Figure BDA0002752263380000122
Figure BDA0002752263380000131
表注：在方程中，“P”表示通过该回归模型对得病与否的估计，其数值在0-1之间，0表 示不患病，1表示患病；年龄、BMI即代表年龄、BMI的数值，性别中男性为1，女性为2， “c()”表示ApoA4、ApoF、AGT、AACT特异性肽段的丰度。
在考虑年龄、性别、BMI等因素对疾病的影响时2号模型(即第二模型方程)最优。该模型最佳诊断点的灵敏度达到85.7％，特异性82.0％，说明该诊断模型表现非常稳定、诊断效力很高。
而仅考虑血清中蛋白质的变化时最优模型为6号(即第六模型方程)，该模型最佳诊断点 的灵敏度达到82％，特异性91.8％，说明该诊断模型表现非常稳定、诊断效力很高。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外， 本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本 领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进 行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述 的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> ApoF蛋白在制备或筛选精神分裂症诊断产品中的用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Gly Val Gln Gln Leu Ile Gln Tyr Tyr Gln Asp Gln Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe
1 5 10 15
Arg
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln Asp Ser Ala Ala
1 5 10 15
Ala Lys
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Val Leu Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Val Lys
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Leu Asp Phe Thr Glu Leu Asp Val Ala Ala Glu Lys
1 5 10

Claims (5)

1.ApoF蛋白或其特有肽段与以下特征中的一种或几种特征联合在制备或筛选精神分裂症诊断装置中的用途：
1)与年龄、性别数据以及BMI联合；诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白或其特有肽段的丰度，将检测得到的丰度以及患者的年龄、性别数据代入下述模型方程中：ln[P/(1-P)]＝-2.34+0.004×年龄+0.004×性别数据+0.11×BMI+1.92×c(ApoF)，其中“c(ApoF)”表示ApoF蛋白或其特有肽段的丰度；
2)与ApoA4蛋白或其特有肽段联合，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白、ApoA4蛋白或二者的特有肽段的丰度，将检测得到的丰度代入下述模型方程中：
ln[P/(1-P)]＝1.09-4.44×c(ApoA4)+3.42×c(ApoF)，其中c(ApoA4)表示ApoA4蛋白或其特有肽段的丰度；
3)与ApoA4蛋白或其特有肽段、年龄、性别数据以及BMI联合，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白、ApoA4蛋白或二者的特有肽段的丰度，将检测得到的丰度以及患者的年龄、性别数据代入下述模型方程中：
ln[P/(1-P)]＝-1.52+0.042×年龄-0.09×性别数据-0.66×BMI-4.88×c(ApoA4)+3.96×c(ApoF)；
4)与ApoA4蛋白和AACT蛋白联合，或与二者的特有肽段联合，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AACT蛋白或三者的特有肽段的丰度，将检测得到的丰度代入下述模型方程中：
ln[P/(1-P)]＝-0.077-5.09×c(ApoA4)+2.31×c(ApoF)+2.95×c(AACT)，其中c(AACT)表示AACT蛋白或其特有肽段的丰度；
5)与ApoA4蛋白和AGT蛋白联合，或与二者的特有肽段联合，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白或三者的特有肽段的丰度，将检测得到的丰度代入下述模型方程中：
ln[P/(1-P)]＝0.16-4.81×c(ApoA4)+2.80×c(ApoF)+2.12×c(AGT)，其中c(AGT)表示AGT或其特有肽段的丰度；
6)与ApoA4蛋白、AGT蛋白和AACT蛋白联合，或与三者的特有肽段联合，诊断时利用质谱检测待测样本中ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白或四者的特有肽段的丰度，将检测得到的丰度代入下述模型方程中：
ln[P/(1-P)]＝-0.38-5.19×c(ApoA4)+2.16×c(ApoF)+2.51×c(AACT)+1.10×c(AGT)以上各方程中，公式的性别数据中，男性为1，女性为2；根据P值可诊断患者得病与否，P值在0-1之间，0表示不患病，1表示患病。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ApoF蛋白、ApoA4蛋白、AGT蛋白、AACT蛋白或各蛋白的特有肽段作为生物标志物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
1)所述ApoF蛋白的特有肽段包括SEQ ID NO.1所示肽段；
2)所述ApoA4蛋白的特有肽段包括SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3所示肽段；
3)所述AACT蛋白的特有肽段包括SEQ ID NO.4所示肽段；
4)所述AGT蛋白的特有肽段包括SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示肽段。
4.一种用于诊断精神分裂症的装置，其特征在于，所述装置包括：
数据模块，用于提供待测者的ApoF蛋白或其特有肽段的丰度数据，所述数据模块还提供以下数据中的一种或几种：待测者的年龄、性别数据、BMI、ApoA4蛋白或其特有肽段的丰度、AGT蛋白或其特有肽段的丰度、AACT蛋白或其特有肽段的丰度；
计算模块，用于根据数据模块提供的数据计算并判断待测者是否患精神分裂症，所述计算模块中采用以下模型方程中的一种或几种计算并判断待测者是否患精神分裂症：
第一模型方程：ln[P/(1-P)]＝-2.34+0.004×年龄+0.004×性别数据+0.11×BMI+1.92×c(ApoF)；
第二模型方程：ln[P/(1-P)]＝-1.52+0.042×年龄-0.09×性别数据-0.66×BMI-4.88×c(ApoA4)+3.96×c(ApoF)；
第三模型方程：ln[P/(1-P)]＝1.09-4.44×c(ApoA4)+3.42×c(ApoF)；
第四模型方程：ln[P/(1-P)]＝-0.077-5.09×c(ApoA4)+2.31×c(ApoF)+2.95×c(AACT)；
第五模型方程：ln[P/(1-P)]＝0.16-4.81×c(ApoA4)+2.80×c(ApoF)+2.12×c(AGT)；
第六模型方程：ln[P/(1-P)]＝-0.38-5.19×c(ApoA4)+2.16×c(ApoF)+2.51×c(AACT)+1.10×c(AGT)；
各模型方程中，性别数据中待测者为男性则数值为1，待测者为女性则数值为2；c为各蛋白或其特有肽段的丰度；
如果0≤P<1，则判断结论为待测者不患精神分裂症；如果P＝1，则判断结论为待测者罹患精神分裂症。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于：
1)所述ApoF蛋白的特有肽段包括SEQ ID NO.1所示肽段；
2)所述ApoA4蛋白的特有肽段包括SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3所示肽段；
3)所述AACT蛋白的特有肽段包括SEQ ID NO.4所示肽段；
4)所述AGT蛋白的特有肽段包括SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示肽段。
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