CN101356446A - 诊断和监测精神障碍例如精神分裂症的方法和生物标记 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诊断或监测受试者精神障碍的方法，包括提供一种来自所述受试者的测试生物样本，对所述测试生物样本进行波谱分析以提供一个或多个谱，并将所述的一个或多个谱与一个或多个对照谱进行比较。本发明还涉及诊断或检测精神障碍例如精神分裂性障碍或双相型障碍的方法，包括测量取自测试受试者的生物样本中存在的一种或多种生物标记的水平，所述生物标记选自甲状腺激素结合蛋白、ApoA1、VLDL、LDL和芳香类物质例如血浆蛋白质。本发明还涉及用于实施本发明的方法的传感器、生物传感器、多分析物面板、阵列、测定法和试剂盒。

Description

诊断和监测精神障碍例如精神分裂症的方法和生物标记
技术领域
本发明涉及诊断或监测精神障碍的方法，具体而言，例如使用生物标记诊断或监测精神分裂性障碍(和双相型障碍)的方法。所述生物标记和使用生物标记的方法可用于辅助诊断和评估精神障碍的发病和发展。本发明还涉及生物标记在临床筛选、预后评估、治疗评价、药物筛选和药物开发中的用途。
背景技术
精神病是一种重度精神疾病的症状。虽然它并不只和任何特定心理或生理状态相关，但是它特别与精神分裂性障碍、双相型障碍(躁狂忧郁)和重度临床抑郁症相关。精神病的特征为基本知觉、认知、情感和理智过程的障碍。经历精神病发作的个体可能出现幻觉(经常为听觉和视觉的幻觉)、具有偏执或妄想信念、出现人格改变和并表现出混乱思维(思想紊乱)。这有时会伴有如缺乏对其行为的反常性和古怪性的自知力、人际关系困难和进行日常生活的能力受损的特征。
精神病在脑损伤病例中并不罕见，并且可能在服用药物后出现，特别是在超剂量服用或长期服用之后出现；某些化合物可能更容易导致精神病，并且一些个体表现出的敏感性比其它个体的更强。致幻药的直接效应通常不被归为精神病，只要当药物从体内代谢时，它们的作用会减弱。还已知长期的精神压力也会压抑精神状态，然而确切的机制并不确定。没有其他任何精神疾病的情况下由压力触发的精神病被称为短暂的反应性精神病。因此，精神病是对一组复杂的行为和感受的描述性术语。精神分裂性障碍个体可能在很长的时间内不出现精神病，并且双相型障碍或抑郁症个体可能具有情绪症状而没有精神病。
幻觉被定义为在没有外界刺激的情况下的感知觉。精神病性幻觉可能出现在五种感觉中的任何一种中，并且可以以几乎任何形式发生，可能包括简单感知(例如光、颜色、味道、气味)或者更加深刻的经验，例如看到形状完整的动物和人并与之互动，听到声音和复杂的触觉。幻听，特别是听到声音的经历，是精神病常见并通常为主要的特征。由幻觉产生的声音可能是谈话，或与某人交谈，并且可能涉及几个不同角色的交谈者。当幻听是贬损的、命令式的或全神贯注的时候，它们倾向于带来特别的痛苦。
精神病可以包括妄想或偏执狂，分为原发型和继发型。原发型妄想被定义为突然出现并且就正常心理过程而言是无法理解的，而继发型妄想可以被理解为受个人所处的背景或者当时的境况影响，即表示“真实”境况的妄想性解释。
思维障碍描述了意识思维的潜在紊乱，并且主要依据其对语言和书写的内容和方式的影响进行分类。患病个人也可能出现语言促迫(连续不断快速地说话)、思维出轨(derailment)或思维奔逸(交谈中或不恰当地转换话题)、思维中断、出现音联(rhyming)和意联(punning)。
在持续时间方面，个体之间的精神病发作可能不同。在短暂的反应性精神病中，精神病的发作通常直接和特定的应激性生活事件相关，因此患者通常在两周以内自然地恢复到正常机能。在某些罕见的病例中，个体可能保持典型(full blown)的精神病状态达数年，或者可能在大部分时间出现有衰减的精神病症状(例如轻度幻觉)。
患有短暂的精神病发作的患者与(例如)精神分裂症导致的精神病个人有许多相同的症状，并且这个事实已经被用来支持这一观念：精神病主要是脑中的某些特异生物系统的故障。
精神分裂症是一种主要的精神性障碍，患病者占总人口的1％。已发现在不同性别和不同的文化和地理区域中该病的患病率基本相当。世界卫生组织发现精神分裂症是世界上造成残疾的第四大病因，它占全部DALY(失能调整寿命年)的1.1％和YLD(失能寿命损失年)的2.8％。据估计，在1991年美国因为精神分裂症造成的经济花费超过190亿美元，这超过了所有癌症的总花费。在精神分裂症早期进行诊断和有效治疗可以改善预后，并有助于降低与该疾病有关的花费。
精神分裂症的临床症状包括一些没有联系的临床特征，包括阳性症状(幻觉、妄想、思想错乱和行为怪异)；阴性症状(运动能力减退、情绪体验和表情的范围受限以及快乐程度降低)；以及各个个体之间不同程度的认知损害。没有某一症状是精神分裂症特有的，并且/或者存在于每个病例中。由于临床症状上没有统一性，所以现有的精神分裂症的诊断和分类还是基于患者表现的临床症状。这主要是因为精神分裂症的病因学还不清楚(实际上大多数精神疾病的病因学都还不清楚)，并且基于病因学的分类还不可行。精神分裂症的临床症状经常与其他神经精神障碍和神经发育障碍中观察到的症状相似。
由于精神分裂性障碍患者表现的症状波谱十分复杂，并和其他精神障碍很相似，所以目前精神分裂症的诊断还是基于繁琐的临床检查/对患者的家族病史、个人病史、当前症状(精神状态检查)和是否存在其它障碍(鉴别诊断)进行会诊来做出。这种评估可以做出“高度疑似”的诊断，从而可制定最初的治疗计划。为了确诊为精神分裂症，患者(有少数例外)应具有至少六个月的精神病的“意识丧失”症状(DSM IV)并表现出行使正常功能不断变得困难。
世界卫生组织在1992年颁布的精神和行为障碍的ICD-10分类标准是欧洲的精神科医师用于诊断精神健康状况的最常用的手册。该手册提供了对精神分裂症的详细诊断指南并定义了以下各种形式的精神分裂症：精神分裂症、偏执型精神分裂症、青春型精神分裂症(hebrephrenic schizophrenia)、紧张型精神分裂症、混合型精神分裂症、精神分裂症后精神分裂症(post-schizophrenic schizophrenia)、残留型精神分裂症和单纯型精神分裂症。
由美国精神病学学会(华盛顿特区)在1994年出版的精神障碍诊断与统计学手册第四版(DSM IV)，在英国和美国都已被证明是在精神健康问题的分类和诊断方面的卫生职业人员的权威性参考手册。这本手册描述了精神健康疾病(包括精神分裂性障碍、双相型障碍和相关的精神障碍)的诊断标准、亚型、相关特征和鉴别诊断的标准。
精神分裂症的DSM IV诊断标准：
A.特征性症状：以下症状中的两种(或多种)，每种症状均应在一月内(如果治疗成功，期限可较短)的显著时间范围内出现：妄想、幻觉、言语错乱(例如经常性的思维出轨或不连贯)、全身错乱性或紧张性行为、阴性症状，即情感冷淡、精神性失语症或意志减退(avolition)。若妄想荒谬怪异，或幻觉是由对患者的行为或思想作连续评议的声音，或由在互相对话的两个或多个声音构成，则仅需一种标准A中的症状就已足够。
B.社交/职业功能障碍：自疾病发作以来在显著时间段内，一个或多个重要方面的能力(如工作、人际关系或自我照料)明显地较发病前的水平差得多(或者如果发病于童年或青少年，则为未能达到应有的人际关系、学业、或职业水平)。
C.病期：疾病的持续性症候至少持续6个月。该6个月的时间必须包括症状(即活动期症状)符合A标准的至少1个月(如果治疗成功，期限可较短)，并且可包括前驱症状期或残留症状期。在上述前驱期或残留期期间，疾病的征候可表现为仅有阴性症状或A标准中所列2个或多个症状的轻微表现形式(例如，古怪的想法，不寻常的知觉体验)。
D.排除分裂情感性障碍及心境障碍：伴有精神病性特征的心境障碍和分裂情感性障碍均已排除，因为(1)没有重性抑郁发作、躁狂性发作或混合性发作与活动期症状同时发生；或者(2)如果活动期症状期期间出现情感发作，其总的持续时期与活动期和残留期的持续时间相比均较短。
E.物质/一般医学病症的排除：该疾病并非是由于某种物质(例如，某种药物的滥用、某种治疗药品)或由于被称为“器质性”脑障碍/综合征的一般医学病症所导致的直接生理效应。
F.与综合性精神发育障碍的关系：如有孤独症或另一种综合性精神发育障碍的病史，那么除非还出现至少一月(如果治疗成功，限期可较短)的明显妄想或幻觉，否则不另外作精神分裂症诊断。
精神分裂症亚型：
1.偏执型：满足下列标准的精神分裂症类型：带有一种或多种妄想(特别是有受迫害的内容)或频繁出现幻听。未明显出现下列症状：言语错乱、错乱性或紧张性行为、或者情感贫乏或不当。
2.紧张型：至少有下列两种临床明显表现的精神分裂症类型：表现为僵直(包括蜡样屈曲)或木僵的运动性静止(motoric immobility)，运动性活动过多(excessive motor activity)(明显无目的并且不受外部刺激影响)、极端违拗(明显无动机地违抗所有指示或者保持某种僵硬姿势对抗试图移动他的企图)或沉默，表现为作出某种姿势(主观假想不当或怪异的姿势)、刻板的运动、明显装相、明显地扮怪相等古怪随意运动，模仿言语或模仿动作。
3.错乱型：满足下列标准而且不满足紧张型标准的精神分裂症类型：下列所有症状均明显：言语错乱、行为错乱、情感贫乏或不当。
4.混合型：存在满足A标准的症状但不满足偏执型、错乱型或紧张型的标准的精神分裂症类型。
5.残留型：满足下列标准的精神分裂症类型：没有明显的妄想、幻觉、言语错乱和全身错乱性或紧张性行为。疾病持续出现，表现为仅有阴性症状或精神分裂症A标准中所列2个或多个症状的轻微表现形式(例如，古怪的想法、不寻常的知觉体验)。
精神分裂症相关特征
精神分裂症的相关特征包括：学习困难、活动减退、精神病、情绪欢快、情绪抑郁、躯体功能不全或性功能障碍、活动过度、犯罪或强迫感、性欲表现不正常、奇怪/古怪或多疑的人格、焦虑或恐惧或依赖性人格、好表现或怪异或反社会的人格。
许多障碍都与精神分裂症有着相似甚至相同的症状：由于一般的医疗病症、谵妄或痴呆造成的精神病性障碍；物质诱导的精神病性障碍；物质诱导的谵妄；物质诱导的持续痴呆；物质相关的障碍；具有精神特征的心境障碍；分裂情感性障碍；未另外指明的抑郁障碍；未另外指明的双相型障碍；具有紧张型特征的心境障碍；精神分裂症样精神障碍；短时精神病性障碍；妄想型障碍；未另外指明的精神病性障碍；综合性精神发育障碍(例如孤独症)；伴有(语言交流障碍所致)言语错乱和(注意力缺陷/多动症所致)行为错乱的儿童期表现；分裂型障碍；分裂样人格障碍和偏执型人格障碍。
对于躁狂抑郁/双相情感障碍(BD)的DSM IV诊断学分类
已被清楚地定义而足够对它们给出DSM分类的双相型疾病目前仅有两类，分别为双相I型和双相II型。
双相I型：这种障碍以躁狂性发作为特征；躁狂发作是躁狂-抑郁周期的“高”点。虽然有些双相I型个体可能不会经历重性抑郁发作，但是通常在该躁狂期之后会有一段抑郁期。双相I型患者中还经常出现混合的状态，其中躁狂或轻躁狂症状和抑郁症状同时出现(例如躁狂的思维奔逸伴随抑郁)。而且，烦躁不安性躁狂也很普遍，这是一种以易怒和易激惹为特征的躁狂。
双相II型：这种障碍以重性抑郁发作和轻躁狂发作(较轻形式的躁狂)相交替为特征。轻躁狂发作为破坏性较轻的躁狂形式，并且可能以低水平的非精神病性的躁狂症状为特征，例如以活力比平时更丰富或情绪比平时更积极为特征。这可能并不影响个体在每日生活方面的行为能力。轻躁狂和躁狂的判断标准的区别仅在于轻躁狂的持续时间较短(轻躁狂的持续时间为至少4天而不是1周)和严重程度较轻(对行为能力没有明显损害，无须住院治疗或者没有精神病特征)。
如果抑郁和躁狂症状间歇发作持续两年并且不满足重性抑郁或躁狂发作的标准，则可在诊断上归类为循环情感性障碍(Cyclothymic disorder)，这是一种较轻形式的双相情感障碍。循环情感性障碍的确诊要经过两年时间，该障碍是以中间间以稳定期的频繁短期轻躁狂和抑郁症状为特征的。
快速循环发生在个体的情绪快速连续地由抑郁波动到轻躁狂或躁狂时，其间没有或几乎没有稳定期。当个体在一定年限内出现四次或多次满足重性抑郁、躁狂、混合或轻躁狂发作标准的发作时，就被称为经历快速循环。某些经历快速循环的个体可在每月、每周或者甚至每天都经历相型转换(有时也称为超快速循环)。
如果躁狂、抑郁、混合情绪或轻躁狂的症状是直接由例如甲状腺疾病或中风的医学病症所引起的，则目前将其诊断为由于一般医学病症导致的心境障碍(Mood Disorder Due to a General Medical Condition)。
如果躁狂情绪是由抗抑郁药、ECT引起的或者由于个体使用街头药物(street drugs)而引起的，则将其诊断为具有躁狂特征的物质诱导心境障碍。
对于因服用抗抑郁药物引起而不是自发发生的躁狂性发作，已被归入双相III型诊断类别。令人疑惑的是，对于经历轻躁狂或燥郁环性气质(cyclothyrnia)(即轻度的躁狂)而没有重性抑郁的个体，也被归入了双相III型诊断类别中。
躁狂症
躁狂抑郁包括两种不同并且对立的情绪状态，由此抑郁和躁狂交替出现。DSM IV给出了必须满足的多个标准，满足这些标准的疾病才能被归类为躁狂症。首先，个体的情绪必须是兴奋的、自大的或易激惹的。该情绪必须与稳定期中该个体的正常情感状态不同。必须在显著较长的时间段内呈现明显的改变。患者必须变得相当兴奋并且有夸张的想法。他们也可能变得非常易激惹，可能在态度上明显的表现为“狂妄自大”。躁狂症的第二条主要标准强调必须以显著程度存在下述症状中的至少三种：自身重要性的夸张感觉、睡眠的需要减少、言语增多、意念飘忽或思维奔逸、容易分心、有意图的活动增加。过度沉迷于能带来快感但却有不良后果的活动(例如性生活和消费过度)。DSM IV中躁狂症的第三条标准强调情绪的改变应显著到足以影响个体的工作表现或参加常规社会活动的能力或人际关系。这第三条标准主要用于强调躁狂和轻躁狂的区别。
抑郁
DSM IV提出了临床上确定重性抑郁的多个标准。病症必须出现至少两周，并且必须具有下述症状中的五种：基本上每天的大部分时间都情绪低落；基本上每天对于几乎所有的活动都失去兴趣或乐趣；体重和食欲改变；睡眠障碍；生理活动减少；疲惫和活力减退；感觉没有价值或过度的犯罪感；注意力不集中；有自杀的念头。
在对重性抑郁进行表征的五种症状中，情绪抑郁和对日常活动失去兴趣这两个症状都必须明显。将患有躁狂抑郁个体的抑郁情绪症状和患有重性抑郁患者的症状区别开是很难的。心境恶劣(dysthymia)比单相型抑郁的症状稍轻但是会更持久。
目前获得正确诊断精神病性障碍的较长的过程可能会使适当的治疗发生延误，这可能会引起严重的具有中长期疾病后果的并发症。迫切需要开发客观的诊断方法、测试和工具，以协助辨别各种具有相似临床症状的精神病。针对精神病性障碍例如精神分裂性障碍和/或双相型障碍的客观诊断方法和测试将有助于在疾病过程中(治疗反应、顺应性等)监测个体，并且也可以被用于确定预后，而且还提供药物筛选和药物开发的工具。
不幸的是，目前针对精神病性障碍例如精神分裂症或双相型障碍并没有标准的、灵敏的、特异性的检测。
目前正在开发的一种用于精神分裂症诊断分析的生物化学检测是烟酸皮肤发红测试，该测试基于这样一个观察结果，即：由于花生四烯酸代谢异常，一些精神分裂症患者对烟酸皮肤试验没有反应。然而，不同的研究所显示的这种测试的特异性和灵敏性相当不稳定，可从23％变化到87％，表明这种测试的可靠性和有效性还需要验证。
WO 01/63295描述的方法和组合物可用于神经精神疾病或神经系统疾病(包括BAD(双相型情感障碍)、精神分裂症和血管性痴呆)的筛选、诊断和预后评定，用于对这些疾病的治疗的有效性进行监测和用于药物开发。
其他基于额叶、颞叶和基底神经节的细微改变的技术(例如磁共振成像或正电子发射断层成像)对于个体患者中精神分裂性障碍的诊断、治疗或预后价值不大，这是因为所报道的精神分裂症个体和正常比较受试者之间这些结构的差异的绝对大小通常很小，并且在两组之间还有明显的重叠。这些神经成像技术在排除其他可能伴有精神分裂性症状的疾病(例如脑部肿瘤或出血)方面受到很大程度上的局限。
代谢组学研究可以用于生成个体代谢状态的特征模式或者“指纹”。由于给定的生物体液组合物是由与该体液的组成和分泌密切相关的细胞作用所致，因此对生物液体的代谢组学研究提供了整个机体的生物化学状态的信息。
“代谢组学”传统上被定义为“活体系统对病理生理学刺激或遗传修饰的多参数代谢反应的定量测量”。代谢组学从利用1H NMR光谱法发展为研究生物液体、细胞和组织的代谢组成，并且从应用模式识别(PR)、专门的系统和其他化学信息学工具的研究发展为对NMR产生的复杂的代谢数据组进行解读和分类并提取有用的生物学信息。
生物体液和组织的1H NMR谱提供了获得该生物体液的机体的一系列在生物学上很重要的内源性代谢产物的特征代谢“指纹”或图谱。该代谢图谱随疾病、机体障碍、中毒过程或异质物(如药物成分)而发生特征性变化。对生物体液和组织中的代谢物模式的差异进行定量可以给出疾病或障碍的潜在分子机制的信息和知识。在药物作用的评估中，每种化合物或每类化合物可引起生物体液中内源性代谢物浓度和模式发生特征性变化。
该代谢变化可以用自动化计算机程序表征，所述自动化计算机程序将生物体液谱中测定的每种代谢物表示为多维空间的坐标。
代谢组学技术已经被应用于鉴定代谢、肝和肾疾病、心血管疾病、胰岛素抗性和神经变性障碍的先天性缺陷的生物标记。
现有的精神障碍例如精神分裂性障碍的诊断仍然是主观的，这不仅是因为症状的复杂范围及其与其他精神障碍的相似性，而且也因为经验性疾病标记的缺乏。在临床上极其需要诊断测试和治疗重度精神疾病的更有效的药物。
近来的功能基因组研究表明，精神分裂症综合征中可能涉及代谢因素，但人们对代谢因素对精神病的影响的认识仍然不够。已有一些证据表明，精神分裂症和情感障碍与异常的糖代谢调节、脂类代谢和线粒体功能障碍均有关8-11。但是还无法确定，这些代谢改变是导致疾病的原因还是疾病自身的作用，或者它们是否是药物治疗的结果。抗精神病药物作用与血脂障碍显著相关，但在抗精神病阶段之前就有关于葡萄糖代谢改变的报道(Haupt和Newcomer12综述)，最近，有报道关注于长期精神分裂症患者的代谢综合征比率的确定，并发现代谢综合征的患病率与抗精神病药物的日剂量呈负相关13。
目前已被广泛接受的观点是，遗传环境因素和非遗传环境因素均会影响精神分裂症的疾病发生并且/或者促进综合征的发病。多种生物应激源(接触病毒3、使用违禁药物4、围产期损伤5等)和社会应激源都被认为是可能与诱病基因型有交互作用的环境疾病组成部分。双生子研究是用于阐明复杂疾病的遗传和环境因素的特别有用的工具。先前的研究已证明，同卵双生子产生精神分裂症的可能性与近亲水平高度相关，并且可达约30-50％的同病率1，2。对于相异双生子(即其中之一患有一种疾病而另一个未患该疾病)的研究可能有助于解释这些组成部分的其中某一些的影响。由于难以从相异双生子获得足够数量的脑样本，因此目前对精神分裂症相异的同卵双生子的研究专注于脑成像。双生子研究表明，一种最常报道的精神分裂症的脑改变即侧脑室增大，可能是由于环境因素导致的6，7。
存在于容易获得的体液(例如血液、血浆、血清、尿、唾液或脑脊液(CSF))中的生物标记可证明它能用于诊断精神障碍、有助于预测并检测治疗反应和顺应性，并且帮助识别新的药物靶标。合适的生物标记还是开发用于改善结果或预防病理的新早期疗法或症状前疗法的重要工具。
生物标记的有效性对于监测和优化干预措施非常重要，所述生物标记可检测与精神障碍逆转或进程特别相关的早期改变。这些用作预测物的生物标记可帮助鉴别能用作化学干预试验目标群体的高风险个体和疾病亚组；同时，生物标记作为端点替代标识能够以一种速度来评估预防性干预措施的有效性和成本效益，这种速度对于目前将具有征候的精神障碍的发病率用作端点而言是不可能实现的。
甲状腺激素结合蛋白(transthyretin)基因编码血浆蛋白甲状腺激素结合蛋白(TTR)，它属于一组在血液中结合并转运甲状腺激素的蛋白质(包括甲状腺素结合球蛋白和甲状腺素结合白蛋白)。TTR将甲状腺素从血液转运至脑中15。它是具有127个氨基酸(14 kDa)的单链肽，在血浆中以单体间非共价结合的四聚体形式存在。TTR在脑脉络丛中高水平表达，并且从脉络丛被释放到脑脊液中(CSF)。对于外周组织，它主要在肝中表达。在脑室CSF中估计仅有3％的甲状腺激素结合蛋白来自血液，在腰椎CSF中估计仅有10％的甲状腺激素结合蛋白来自血液16。在生理条件下，所述大分子复合物在维生素A稳态中具有重要生理作用，因为它与特异地转运视黄醇的转运蛋白即脂质运载蛋白(lipocalin)视黄醇结合蛋白(RBP)结合。这样就减少了低分子量(21 kDa)转运蛋白在肾脏中的肾小球过滤。任何快速滤过的TTR或RBP分子因与表达于肾脏近端小管的腔表面的多配体受体Megalin结合而内化。因此，在生理条件下，TTR和RBP无论如何都会存在于尿中，尽管只是微量。编码甲状腺激素结合蛋白的基因TTR位于染色体上18q11.2-q12.1区域。
甲状腺激素结合蛋白与阿尔茨海默病以及抑郁症都有关17。还已表明，经氯氮平治疗的精神分裂患者表现出的甲状腺激素结合蛋白水平不同18。
载脂蛋白在脂质转运中是作为脂蛋白颗粒的结构组分、酶辅因子和细胞表面受体的配体发挥作用的。载脂蛋白主要有五种类型：ApoA(ApoA1、ApoA2)、ApoB、ApoC(ApoC1、ApoC2、ApoC3、ApoC4)、ApoD和ApoE。具体地说，ApoA1是高密度脂蛋白的主要蛋白质组分；ApoA4被认为主要在肠内脂质吸收中起作用；ApoE是通过与不同细胞受体(包括低密度脂蛋白(LDL)受体)的高亲和相互作用来调节胆固醇和脂质转运和吸收的血浆蛋白质。已知ApoA1具有心脏保护特性，并且在动脉粥样硬化和糖尿病中具有作用28，29。
Wen等人30公开了经吩塞秦治疗的患者的ApoA1水平比来自健康个体的正常对照低。
Middleton等人31分析了载脂蛋白基因家族簇的表达水平。
发明内容
本发明部分地基于1H NMR代谢组学方法的结果以识别疾病相关代谢特征，所述1H NMR代谢组学被用来分析来自精神分裂症精神障碍相异的同卵双生子(即双生子中有一个患病，另一个不患病)和来自健康双生子对照组的血浆。
一方面，本发明提供一种诊断或监测受试者精神障碍的方法，包括：
(a)提供来自所述受试者的测试生物样本，
(b)对所述测试生物样本进行波谱分析以提供一个或多个谱，和
(c)将所述的一个或多个谱与一个或多个对照谱进行比较。
本发明还提供一种诊断或监测受试者精神障碍的方法，包括
(a)提供来自受试者的测试生物样本，
(b)对所述测试生物样本以提供一个或多个谱，
(c)对所述的一个或多个谱进行分析以检测所述谱中的一种或多种生物标记的水平，和
(d)将所述的一个或多个谱中检测到的所述一种或多种生物标记的水平与对照谱中检测到的所述一个或多个检测标记的水平进行比较。
另一方面，本发明提供一种诊断或监测精神障碍或精神障碍倾向的方法，包括测量从测试受试者获取的生物样本中存在的一种或多种生物标记的水平，所述生物标记选自包括VLDL、LDL和芳香类物质例如血浆蛋白质。这类方法可用于监测一种疗法(例如，一种治疗性物质)对患有、疑似患有、易患有一种精神障碍的受试者的有效性的方法中。
再一方面，本发明提供一种能够检测一种、两种或三种选自下列的生物标记的多分析物面板或阵列：VLDL、LDL和芳香类物质例如血浆蛋白质。
一种多分析物面板能检测多种不同的分析物。一种阵列能检测多个样本中的单一分析物，或者作为一种多分析物阵列能够检测样本中多种不同的分析物。本发明的多分析物面板或多分析物阵列能检测本申请所述的一种或多种代谢生物标记，并且能够检测本申请具体所述生物标记之外的其他一种或多种生物标记。
还提供一种适于实施本发明的方法的诊断或监测测试试剂盒，任选地，同时还提供使用所述试剂盒的说明书。所述诊断或监测试剂盒可包括一个或多个本发明的生物传感器，所述试剂盒中可包括一个传感器或生物传感器或者多个传感器和/或多个生物传感器的组合。一种诊断或监测试剂盒可包括本发明的面板或阵列。一种诊断或监测试剂盒可包括本发明的一个阵列或多个阵列的组合。
还提供了一种或多种选自VLDL、LDL和芳香类物质例如血浆蛋白质的生物标记用于诊断和/或监测精神障碍的用途。
还提供了本发明的方法、传感器、生物传感器、多分析物面板、阵列或试剂盒用于识别一种能调节精神障碍的物质的用途。一种能调节精神障碍的物质可以是用于治疗精神病的抗精神病物质或者是可诱发精神病的促精神病(pro-psychotic)物质。
此外，还提供了一种识别一种能调节受试者精神障碍的物质的方法，包括一种本申请所述的监测方法；特别优选的识别方法包括给予测试受试者一种待测物质，并检测一种生物样本中的一种或多种选自VLDL、LDL和芳香类物质(例如血浆蛋白质)的生物标记的水平，所述生物样本优选地为取自所述受试者的全血、血清或血浆样本。
本发明还涉及一种包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段的甲状腺激素结合肽(transthyretin peptide)用作精神分裂性障碍的生物标记或精神分裂性障碍倾向的生物标记的用途。
本发明还提供一种用于精神分裂性障碍的甲状腺激素结合肽生物标记，包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段。
另一方面，本发明提供一种诊断或监测一种精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的方法，包括对一种取自测试受试者的生物样本中存在的甲状腺激素结合肽生物标记进行检测和/或定量，所述甲状腺激素结合肽生物标记包括SEQID NO：1的氨基酸序列或其片段。
另一方面，本发明提供了能特异性结合所述甲状腺激素结合肽生物标记的配体，例如天然存在或化学合成的化合物。本发明的配体可包括能特异性结合所述甲状腺激素结合肽生物标记的肽、抗体或其片段、或者适体或寡核苷酸。所述抗体可以是能特异性结合甲状腺激素结合肽生物标记的单克隆抗体或其片段。本发明的配体可以用可检测的标记物例如发光标记、荧光标记、酶标记或放射性标记进行标记；可选地或额外地，本发明的配体也可用亲和标签进行标记。优选地，本发明的配体包括能结合本文所述的甲状腺激素结合肽生物标记的肽、抗体或其片段、或者适体或寡核苷酸，其中所述配体不是选自表1所列的抗体或选自下列的配体：T3、T4(甲状腺激素)、维生素A(通过与血清视黄醇结合蛋白相互作用而间接作用)、载脂蛋白A1(ApoA1)、去甲肾上腺素氧化产物和蝶呤类、非甾体抗炎药(NSAID)、环境污染物例如多卤化联苯和拟甲状腺化合物、夹氧杂蒽酮衍生物或天然的以及合成的黄酮类。
本发明提供一种诊断精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的方法，包括对获自测试受试者的生物样本中的ApoA1肽生物标记进行检测和/或定量，所述ApoA1肽生物标记包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段。
精神分裂性障碍生物标记是用于发现减慢或阻止疾病进程的新靶标或药物分子的靶标。由于ApoA1肽生物标记的水平可指示病症和药物反应，因此ApoA1生物标记可用于在体外和/或体内测定中识别出新的治疗化合物。因此，本发明的ApoA1生物标记可用于筛选一种化合物的方法中，所述化合物可促进本发明的ApoA1肽生物标记的活性或刺激本发明的ApoA1肽生物标记的产生。
因此，本发明在另一方面提供了一种能刺激或促进产生ApoA1生物标记肽的物质或配体在用于制备治疗精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的药物中的用途，所述生物标记包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段。本发明还提供了一种能刺激ApoA1生物标记肽活性的物质或配体，用于制备治疗精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的药物的用途，所述生物标记包括SEQ IDNO：2的氨基酸序列或其片段。
本发明还涉及一种治疗精神分裂性障碍的方法，包括给予有需要的患者一种能刺激、促进或激发一种肽的活性或其产生的物质或配体，所述肽包括SEQID NO：2的氨基酸序列或其片段。
测试生物样本中的血浆蛋白质生物标记的水平低于正常对照水平时表示存在精神障碍，特别是精神分裂性障碍、双相型障碍或患这些疾病的倾向。
本发明的监测方法或诊断方法可用于确认是否存在一种疾病或该疾病的倾向；通过评估疾病发病和进程来监测疾病的发展，或者评估疾病的改善或恢复情况。监测方法和诊断方法也可用于临床筛选评估、预后、疗法选择、疗效评价，即用于药物筛选和药物开发。
有效的诊断和监测方法通过确立正确的诊断、快速确定最适宜的疗法(因此减少不必要遭受的有害药物副作用)、减少“机能障碍时间”和复发率来提供能够改善预后的十分有效的“患者治疗方案”。
监测治疗有效性的方法可用于监测已有的疗法和新的疗法对人类受试者和非人类动物(例如动物模型)的治疗有效性。这些监测方法可被纳入到新药物物质和物质组合的筛选中。
对肽生物标记水平的调节可用作精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向状态的标识。肽生物标记水平随时间降低可指示疾病发作或进展即疾病恶化，而肽生物标记水平升高则表明疾病改善或缓解。
对精神分裂性障碍的生物标记的识别使得可以将诊断方法和治疗方案相结合。目前在确定有效疗法方面还显著滞后，至今还不能对药物反应进行快速评估。通常，许多抗精神分裂症疗法要求对给定的治疗方法进行持续数周至数月的治疗试验。对本发明的肽生物标记的检测可用于在受试者参与临床试验前对他们进行筛选。所述生物标记提供了一种可指示治疗反应、无反应产生、不利的副作用、药物顺应性程度以及是否达到足够的血清药物水平的手段。所述生物标记可用于警示不良药物反应，不良药物反应是在使用所有精神病药物时都会出现的一个突出问题。由于对反应的评估可用来精确地调节剂量、最大程度地减少处方中的药物数目、使延迟实现有效治疗的情况减少并避免不良药物反应，因此生物标记可用于开发个人脑部疗法。因此，通过监测本发明的生物标记，可实现按照由患者的病症和药物基因组学信息所确定的需求来精确地制定患者护理方案，因此所述生物标记可用于滴定最佳剂量、预测积极的治疗反应以及识别具有严重副反应高风险的患者。
基于生物标记的测试提供了一种对“新”患者的一线评估方法，并且提供了用于准确、快速诊断的客观量度，这种客观量度的速度和准确性是使用目前的主观量度无法实现的。
此外，诊断用生物标记测试可用于识别处于“前驱症状期”的家族成员或患者，即具有发展成明显精神分裂症高风险的家族成员或患者。这就使得可以着手合适的治疗，例如低剂量的抗精神病药物，或预防性措施例如控制危险因素如应激、使用违禁药物或病毒感染。这些方法被认为可改善结果并且可预防明显的疾病发作。
监测生物标记的方法、生物传感器和试剂盒还可作为患者监测工具，以使得医师能够确定复发是否是由纯粹的疾病发作或恶化、较差的患者顺应性或药物滥用导致的这一方面也很重要。如果评价认为药物治疗不足，则可恢复治疗或加强治疗。对于纯粹的疾病发作，如果合适，可改变疗法。由于生物标记对疾病状态很敏感，因此它可指示出药物疗法或药物滥用的影响。
基于本发明的生物标记、本发明的用途和方法的高通量筛选技术(装配成阵列形式)适用于监测生物标记，所述生物标记用于识别潜在有用的治疗性化合物，例如能调节所述生物标记表达的配体例如天然化合物、合成的化合物(例如来自组合文库)、肽、单克隆或多克隆抗体或其片段。
序列列表信息
SEQ ID NO：1人甲状腺激素结合蛋白的氨基酸序列
PLMVKVLDAV RGSPAINVAV HVFDKAADDT WEPFASGKTS
ESGELHGLTT EEEFVEGIYK VEIDTKSYWK ALGISPFHEH AEVVFTANDS
GPRRYTIAAL LSPYSYSTTA VVTNPKE
SEQ ID NO：2 ApoA1
1    mkaavltlav lfltgsqarh fwqqdeppqs pwdrvkdlat vyvdvlkdsgrdyvsqfegs
61   algkqlnlkl ldnwdsvtst fsklreqlgp vtqefwdnle keteglrqemskdleevkak
121  vqpylddfqk kwqeemelyr qkveplrael qegarqklhe lqeklsplgeemrdrarahv
 181 dalrthlapy sdelrqrlaa rlealkengg arlaeyhaka tehlstlsekakpaledlrq
 241 gllpvlesfk vsflsaleey tkklntq
本申请所述的两种或多种生物标记可组合使用。本申请所述的本发明具体的生物标记的每一方面可同样地适用于本申请所述的任何其他生物标记。此外，任何提及精神分裂症的情形可同样地适用于另一种精神病。
具体实施方式
术语“生物标记”意为某种过程、事件或情况的区别性生物标志物或生物来源标志物。生物标记肽可以用于例如临床筛选的诊断方法中和预后评估中；并可用于监测治疗效果、识别对某种特定疗法最可能有反应的患者、筛选和开发药物。生物标记及其用途对于识别新型药物疗法和发现药物疗法的新靶标都是有价值的。
术语甲状腺激素结合肽生物标记包括成熟的全长人甲状腺激素结合肽。一种优选的甲状腺激素结合肽生物标记(SEQ ID NO：1)为或者来源于人甲状腺激素结合蛋白。SEQ ID NO：1的肽是不包含前体中所存在的信号(前导)序列的分泌形式。还包括甲状腺激素结合蛋白的同种型和衍生物，例如S-半胱氨酰化和S-谷胱甘肽化的甲状腺激素结合蛋白，这两者均是CSF样本中常见的TTR修饰物。SEQ ID NO：1所示的肽生物标记被发现在具有精神分裂症首次精神病发作特征的个体中以较低的水平存在，因此它被用作诊断和监测精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的标记。根据本发明，所述生物标记可包括SEQID NO：1所示的氨基酸序列或其片段。例如，所述生物标记可包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一个或多个片段(多片段)。
术语ApoA1肽生物标记包括成熟的全长人ApoA1肽。一种优选的ApoA1肽生物标记如SEQ ID NO：1所示。已发现，SEQ ID NO：2(图13)所示的肽生物标记在具有精神分裂性障碍首次精神病发作特征且未经用药的个体中的存在水平比正常对照低。因此，它可用作精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的诊断标记。
本申请中使用的术语未经用药的患者是指未用任何精神分裂症治疗物质治疗过的个体。因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种待测样本来自这样一种测试受试者的方法，其中所述测试受试者为首次发病且未经用药的个体，并且所述样本是在向所述受试者施予任何抗精神分裂症疗法之前取得。对照样本优选地为来自正常个体的样本。
待测样本中的ApoA1肽生物标记水平相对于正常对照的水平较低时，表示存在精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向。待测样本中的所述肽水平与正常对照相等或比正常对照更高时，表示不存在精神分裂性障碍或精神分裂性障碍的倾向。
本申请使用的术语“诊断”包括识别、确认和/或表征一种精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向。本申请使用的术语“倾向”是指受试者目前并不存在该病症，但易于在将来最终患上该病症。本发明的诊断方法可用于确认是否存在病症或患该病症的倾向。诊断方法还可用于临床筛选评估、预后、疗法选择、疗效评价，即用于药物筛选和药物开发。
本发明的监测方法可用于监测一种精神障碍的发病、进程、稳定、改善和/或缓解。
本申请使用的术语“精神障碍”是指这样一种障碍，在该障碍中精神病为一种可识别的症状，它包括神经精神障碍(精神病性抑郁和其他精神病发作)和神经发育障碍(特别是泛自闭症障碍(Autistic spectrum disorder))、神经变性障碍、抑郁症、躁狂症以及特别包括精神分裂性障碍(偏执型、紧张型、错乱型、混合型和残留型精神分裂症)和双相型障碍。
可用本发明的方法检测的生物样本包括全血、血清或血浆、尿、唾液、脑脊液(CSF)或其他体液(粪便、泪液、滑液、痰)、呼出气例如凝结的呼出气，或它们的提取物或纯化物，或者它们的稀释物。生物样本还包括来自受试者活体或者取自尸体的组织匀浆物、组织切片和活检标本。所述样本例如——如果合适——可进行稀释或浓缩制备，并且以常规方式储存。
根据本发明可使用多种波谱技术产生谱，包括使用NMR谱和质谱。在优选的方法中，采用NMR谱(优选1H NMR谱)进行波谱分析。可产生一个或多个谱，可测量一组谱，包括一个小分子的谱，另一个大分子的谱。获得的谱可用谱编辑技术处理。可使用一维或二维的NMR谱。
利用NMR谱来研究复杂的生物混合物的一个优势在于，通常仅用最少量的样本制备物(通常只需加入5-10％的D2O)就可进行测量，并且可以获得整个生物样本的详细分析图谱。
样本体积很小，对于标准探针通常为0.3-0.5ml，对于微探针则低至3μl。通过流动注射技术可快速高效地获得简单的NMR谱。一般有必要抑制水的NMR共振。
高分辨的NMR谱(特别是1H NMR)特别地适用。使用1H NMR谱法的主要优点是该方法的速度(在5到10分钟可以得到谱)、最少的样品制品需要量以及它可为生物体液中所有的代谢物(不管其结构类型如何)提供非选择性检测物，唯一的前提是它们存在的量高于NMR实验的检测限，并且它们包含不可交换的氢原子。
理想的是，体液的NMR研究在可获得的最高磁场下进行，以得到最大分散度和敏感度，并且大部分的1H NMR研究在400 MHz或以上例如600 MHz下进行。
通常，为了指定1H NMR谱，与真实材料的对照谱进行比较和/或通过将真实参照标准品标准地加入所述样品来进行比较。使用的对照谱可以是从正常受试者的生物学样品的谱分析获得的正常对照谱，和/或从精神障碍受试者的生物学样品的谱分析获得的精神障碍对照谱。
对指定的进一步确定通常需要使用其他的NMR方法，所述NMR方法包括例如二维(2D)NMR方法，特别是COSY(相关光谱学)、TOCSY(完全相关光谱学)、翻转探测异核相关方法(inverse-detected heteronuclear correlationmethod)，例如HMBC(异核多键相关)、HSQC(异核单量子相干)和HMQC(异核多量子相关)、二维J分辨(JRES)法、自旋回波法、驰豫编辑、分散编辑(例如一维NMR和二维NMR两者，例如分散编辑的TOCSY)和多量子过滤。
通过比较谱与正常和/或精神障碍对照谱，该测试谱可以被分类为具有正常图谱、精神障碍图谱或精神障碍倾向的图谱。
谱比较可以在整个谱或者谱的选定区域进行。谱比较可涉及到评估引起与正常谱图有偏差的谱区域的变化情况，并且特别涉及到评估这些区域内的一种或多种生物标记的变化情况。
理解生物液体(例如血浆)的一维和二维NMR谱的生物化学信息的限制因素是它们的复杂性。对这些复杂多参数数据进行比较和研究的最有效的方法是把一维和二维NMR代谢组学方法与基于计算机的“模式识别”(PR)方法和专家系统联合使用。
虽然代谢组学的方法的应用已为大家所接受，但是它的潜能还没有被完全开发出来。代谢的变化通常是细微的，并且需要用于检测具体分析物的强有力的分析方法，特别是当数据(例如NMR谱)颇为复杂的时候。
分析测试人群的数据(例如NMR谱)的代谢组学方法(它应用多变量统计分析和模式识别(PR)技术，并任选地应用数据过滤技术)形成准确的数学模型，该数学模型随后可以用来对测试样本或受试者进行分类，和/或应用在诊断中。
谱对比可能包括对该谱的一种或多种化学计量学分析。术语“化学计量学”被用来描述模式识别(PR)方法和相关多变量统计方法在化学数字数据上的应用。因此，比较可包括一种或多种模式识别分析方法，它们可以通过一种或多种有监督和/或无监督的方法实现。
模式识别(PR)方法可以被用来降低数据组的复杂性、产生科学的假设和检验假设。通常，使用模式识别算法可鉴定、并且结合某些方法解释在复杂系统中的某些非随机行为，这些行为可能由于限定该系统的参数中的噪音或随机变异而变得难以理解。而且，所使用的参数的数量可能很大，因此可能难以显示规律性和非规律性，针对人脑进行的这类显示最好不超过三个维度。
通常测量的描述符的数量远远多于三个，因此简单的散点图已不能用来观测样本间的任何相似性或差异性。模式识别方法已经被广泛应用于表征许多不同类型的问题，涵盖例如语言学、指纹学、化学和心理学。
在本文描述的方法的上下文中，模式识别是利用多变量统计(参数和非参数)来分析光谱数据，并且因此基于一系列观察到的测量值对样本分类并预测某些因变量的值。有两种主要方法。其中一组方法称为“无监督的”，它们以合理的方式简单地减少了数据复杂性并同时产生能够被人肉眼解释的显示图。另外一种方法被称为“有监督的”，藉此，类型或临床结果已知的训练集样本被用来产生数学模型，并且该模型可用独立的验证数据集评估。
无监督的技术被用来确立在一个数据集中是否存在任何固有的聚类(clustering)，该技术由映射(map)样本的方法组成，所述映射样品的方法通常根据它们的性质通过降维进行，没有参考任何其他无关知识，例如没有参考样本类别的先验知识。无监督方法的实例包括主成分分析(PCA)、非线性映射(NLM)和聚类方法例如分层聚类分析。
最有用并最容易应用的无监督PR技术之一是主成分分析(PCA)(参见例如Kowalski et al.，1986)。主成分(PC)是从有合适加权系数的初始变量的线性组合生成的新的变量。这些PC的性质如下：(i)每个PC与所有其他PC正交(不相关)，和(ii)第一个PC包含数据集(信息量)的方差(variance)的最大部分，后面的PC包含相应较小量的方差。
降维技术PCA取m个对象或样本，每个用K维的值(描述符向量)描述，并且提取一组本征向量，它们是描述符向量的线性组合。所述本征向量和本征值通过把数据的协方差矩阵对角线化获得。该本征变量可以被认为是一组新的正交图坐标轴，被称为主成分(PC)。通过对该数据矩阵的方差和协方差结构的投影和建模实现对数据中该系统变异的提取。该主坐标轴是描述数据的最大变异的单个本征向量，并且被称为主成分1(PC1)。接着的PC，以本征值的降序排序，描述连续变小的变异性。在数据中没有被PC描述的变异被称为残余方差，并表示模型与数据的拟合程度。描述符向量在PC上的投影被定义为得分值，该得分值显示样本之间或者对象之间的关系。在图解表示法(“得分图”或本征向量投影)中，具有相似的描述符向量的对象或样本会被分组在同一个聚类中。另外一种图解表示法叫做负荷图，它将PC与单个的描述符向量相连接，并且同时显示每个描述符向量对于解释一个PC以及该PC中描述符向量之间的关系的重要性。事实上，负荷值简单而言是原始描述符向量和该PC之间的角度的余弦值。
在该图中，与原始值相近的描述符向量携带的该PC的信息极少，而与原始值距离较远的描述符向量(高负荷)在解释中很重要。
因此从信息量的方面来看，PC得分值最前的两个或三个曲线分别能给出该数据集的“最好”的二维或三维表示。最前的两个主成分得分值PC1和PC2的曲线以两维形式给出所述数据的最大信息量。这些PC图谱可以被用来显现内在的聚类行为，例如对药物和毒素，根据它们的代谢反应的相似性而得出作用机制。因此，聚类信息可以存在于低的PC中，并且这些信息也可以被测定。
另外一种无监督的模式识别方法为分层聚类分析，它也可以用于将数据点分组，同一组中的数据点由于在某些多维空间中互相“临近”而相似。单个的数据点可以为例如NMR谱中具体指定的峰的信号强度。用元素ssij＝1-rij/ri jmax1构造“相似性矩阵”S，其中rij是点i和j之间的距离(例如Euclidean点间距离)，ri jmax为所有点的最大点间距离。
最远的两个点间的sij将等于0，因为此时rij等于ri jmaX。相反地，最近的两个点将有最大的sij，接近于1。扫描该相似性矩阵以寻找最近的点对。该点对用它们间的距离表示，并且然后删除这两点并用一个合并的单点代替。重复这个过程直到只剩下一个点。可以使用许多不同的方法来确定如何连接两个聚类，这些方法包括最近相邻法(也被称为单连接法)、最远相邻法、形心法(包括形心连接、增量连接、中值连接、组平均连接和可变连接变异)。
然后可将表示出的关联性(connectivity)绘制成树状图(可用于显示聚类的树状图表)，显示样本-样本关联性与间隔距离的增加之间(或者，同样地，与相似性的降低之间)的关系。在该树状图中，分枝的长度与不同聚类之间的距离成比例，因此连接一个样本和下一个样本的分枝的长度是它们之间相似性的量度。以这种方式，可以用算法识别相似的数据点。
有监督的分析方法利用给定的样品数据的训练集的类别信息来优化两个或多个样品类之间的分隔。这些技术包括相似类的软独立建模(softindependent modeling of class analogy)、偏最小二乘法(PLS)法，例如隐判别分析(latent discriminant analysis)(PLS DA)的映射；k-最近邻法分析和神经网络。神经网络是对数据建模的非线性方法。使用训练数据集来开发“学习”数据结构的算法，并且可以处理复杂的函数。有几种类型的神经网络已经被成功地用于从谱信息中预测毒性或疾病。
统计技术例如单因素方差分析法(ANOVA)也可以被应用于数据分析。
实施本发明涉及波谱分析的方法可提供在两个或多个时间点从测试受试者获得的生物样本的谱。可对在两个或多个时间点从测试受试者获得的生物样本的谱进行比较，以识别在不同时间获取的样本的谱之间的差异。方法可包括对在两个或多个时间点从测试受试者获取的生物样本的谱进行分析，以对该生物样本中存在的一种或多种生物标记的水平进行定量，并比较在两个或多个时间点获取的生物样本中存在的一种或多种生物标记的水平。
本发明的诊断和监测方法可用于评估精神障碍的预后的方法中，可用于监测一种给予的治疗物质在患有、疑似患有或易患有一种精神障碍的受试者体内的有效性的方法中，并且可用于识别抗精神病物质或促精神病物质的方法中。这类方法可包括将取自测试受试者的待测生物样本中的一种或多种生物标记的水平，与在给予所述物质前从测试受试者获取的一个或多个样本中和/或在用所述物质治疗的早期从所述测试受试者获取的一个或多个样本中存在的水平进行比较。此外，这些方法可包括对在两个或多个时间点从测试受试者获取的生物样本中的一种或多种生物标记水平的改变进行检测。
在本发明的方法中，特别是使用波谱分析的方法以及特别是生物样本为血或来源于血(例如血浆或血清)的方法中，合适地，一种或多种生物标记选自VLDL、LDL和芳香类物质例如血浆蛋白质。
在基于1H NMR的代谢组学研究中，在患有和未患精神分裂症的双生子中均识别出有血脂谱的改变。已发现在患病的女性双生子中，血脂谱与整体功能分值密切相关。
通过利用了1H NMR谱的广泛代谢图谱分析以及计算化的模式识别分析来识别这些精神障碍(特别是精神分裂性障碍)的生物标记，从而对21对精神分裂症相异的同卵双生子和8对年龄相仿的健康对照双生子的血清样本进行研究。所有的样本均在标准化条件下获得，并对其标注出详细的人口统计学信息和临床信息。
这些研究的结果表明，来自VLDL、LDL和与血浆蛋白质相关的芳香区域的信号是将精神分裂症相异双生子(患病和健康)与健康对照双生子区分开的最重要因素。与无精神分裂症的正常对照双生子相比，在精神分裂症相异双生子体内发现VLDL和LDL水平升高。在所述的相异双生子中，患病的双生子的VLDL和LDL水平比未患病的相异双生子中存在的水平更高。在女性双生子中，这些差异非常明显。在患有精神分裂症的女性双生子中，发现了VLDL/LDL信号和整体功能分值密切相关(DSM IV，第V轴)。相异双生子的血浆蛋白质水平比正常对照双生子低，并且发现患病的双生子中的血浆蛋白质降低程度最大。
在精神分裂症的相异双生子中观察到的脂质和芳香区域的改变表明了代谢紊乱和精神分裂症疾病发生学间的关系。尽管并不能完全排除抗精神病药物的作用，但健康双生子显示出推定的“患病倾向”特征这一事实暗示了这些改变跟疾病有关，而并非和人为的给药有关。VLDL、LDL的增加以及芳香区域(血浆蛋白质)的减少构成了能够区分正常个体和患有精神障碍的个体的代谢生物标记。
患病女性双生子的血脂谱还被发现与整体功能分值(GAF)高度相关。GAF分值是以精神科医师的主观评估为基础的。VLDL和LDL脂质生物标记水平的升高与GAF分值之间的相关性，为证实和验证用于诊断和监测精神疾病例如精神分裂症(和双相型障碍)的主观GAF分值提供了客观的手段。
本发明的诊断和监测方法可包括对在两个或多个时间点从测试受试者获取的生物样本中存在的一种或多种生物标记的水平进行测量。可比较在两个或多个时间点获取的样本间的生物标记水平。可对在两个或多个时间点获取的样本中的生物标记水平的任何改变进行评估。对生物标记水平的调节可用作精神障碍或精神障碍倾向状态的标识。
若生物样本(优选全血)中的VLDL或LDL的水平随时间的升高，则即表示疾病的发病或进展即恶化，而VLDL或LDL水平的降低则表示该疾病的改善或缓解。
若生物样本(优选全血、血浆或血清)中的血浆蛋白质水平随时间的降低，则表示疾病的发病或进展即恶化，而血浆蛋白质水平的升高则表示该疾病的改善或缓解。
本发明的方法可包括将从测试受试者获取的生物样本中的一种或多种生物标记的水平，与开始治疗前从所述测试受试者获取的一个或多个样本中存在的水平和/或在治疗早期从所述测试受试者获取的一个或多个样本中存在的水平相比较。这类方法可包括检测在两个或多个时间点获取的样本中的一种或多种生物标记的量变化。本发明的方法特别地用于对抗精神病治疗的评估中。
本发明的诊断或监测方法可包括对从测试受试者获取的待测生物样本中的一种或多种生物标记进行定量，并将所述测试样本中存在的一种或多种身为标记的水平与一个或多个对照进行比较。所述对照可选自正常对照和/或精神障碍对照。本发明的方法中使用的对照可以是一种或多种选自下列的对照：正常受试者的正常对照样本中存在的生物标记水平即正常生物标记水平；来自患有精神分裂性障碍、双相型障碍、相关精神障碍或确诊为具有患这些疾病倾向的受试者的样本中的生物标记水平(即正常生物标记范围)；精神分裂性障碍标记水平、双相型障碍标记水平、相关精神障碍标记水平、精神分裂性障碍标记范围、双相型障碍标记范围和相关精神障碍标记范围。
可在受试者生存期或其一部分时间内定期获取生物样本。合适地，从进行诊断或监测的受试者获取样本的时间间隔可以是3天、5天、1周、2周、1个月、2个月、3个月、6个月或12个月。样本可以在进行抗精神病治疗(例如抗精神分裂或抗双相型障碍治疗)之前，和/或在治疗期间，和/或在治疗之后取得。
可采用任何适于确定取自患者的生物样本或该样本提取物或纯化物或者它们的稀释物中的生物标记的量的方法测量生物标记的水平。对样本中存在的生物标记水平的测量包括测定样本中存在的生物标记的浓度。可以直接用这些样本进行这类定量测定，也可以用所述样本的提取物，或者也可以用它们的稀释物进行间接定量。在本发明的方法中，除了可测量的生物样本(优选地全血、血浆或血清等)中生物标记的浓度外，还可检测取自测试受试者的另一种不同生物样本中生物标记的浓度，所述不同的生物样本例如有CSF、尿、唾液或其他体液(粪便、泪液、滑液、痰)、呼出气例如凝结的呼出气、或它们的提取物或纯化物，或者它们的稀释物。生物样本还包括取自受试者活体或尸体的组织匀浆物、组织切片和活检标本。所述样本例如——如果合适——可进行稀释或浓缩制备，并且以常规方式储存。
可通过一种或多种选自下列的方法测量生物标记水平：波谱法例如NMR(核磁共振)或质谱(MS)；SELDI(-TOF)、MALDI(-TOF)、基于一维凝胶的分析、基于二维凝胶的分析、液相色谱(例如高压液相色谱(HPLC)或低压液相色谱(LPLC))、薄层色谱和基于LC-MS的技术。合适的LC MS技术包括
Figure A20068004667100291
(Applied Biosystems，CA，USA)或
Figure A20068004667100292
(Applied Biosystems，CA，USA)。
可通过直接的或间接的检测方法进行生物标记测量。可通过与一种或多种配体，例如酶、结合蛋白、受体蛋白或转运蛋白、抗体、肽、适体或寡核苷酸，或者任何能够特异性地结合生物标记的合成的化学受体或化合物相互作用，直接地或间接地检测生物标记。所述配体可含可检测的标记，例如发光标记、荧光标记或放射性标记和/或亲和标签。
本文使用的术语“抗体”包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab′)2片段、由Fab表达文库生成的片段、抗个体基因型(抗Id)抗体和前述任何一种的表位结合片段。本文使用的术语“抗体”还指免疫球蛋白分子，和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类的免疫球蛋白分子。
本申请所述的代谢物生物标记可通过常规化学或酶学方法(这些方法可以是直接的或间接并且/或者可以是不相偶联的)、电化学技术、荧光分析技术、发光分析技术、分光光度测量技术、荧光分析技术、发光分析技术、光谱测定技术、旋光技术、色谱技术(例如HPLC)或类似技术来合适地测量。
对于酶学方法，反应底物的消耗或者反应产物的产生可以作为一种测量的手段，被直接地或间接地检测。
VLDL和LDL生物标记可用各种检测系统检测并测量其水平，所述检测系统包括液相化学法(免疫分离法和利用聚阴离子型表面活性剂/洗涤剂组合物的分离法)、用于脂蛋白分离的物理方法(例如，电泳、毛细管等速电泳和色谱法)，这些方法可与酶测定(例如胆固醇酯酶-胆固醇氧化酶(过氧化物酶)酶测定)相结合；所述检测系统还包括间接的方法例如NMR。
在正常个体中，血清/血浆中的VLDL和LDL水平通常分别为85mg/dl+/-15％(VLDL)和30mg/dl+/-10％(LDL)，因此当高于该水平时，便具有患精神障碍(特别是精神分裂症、双相型障碍)或倾向患这些疾病的诊断特征。
芳香类的生物标记例如血浆蛋白质可通过下述方法检测并测量其水平，所述方法包括但不限于紫外吸收法和比色法，例如Bradford测量法、Lowry测量法和BCA测量法。
本发明的生物标记优选通过下述方法检测和测量：基于质谱法的技术、基于色谱法的技术、酶检测系统(直接或间接测量)或者利用传感器检测和测量，例如用具有电流换能器、电势换能器、电导换能器、阻抗换能器、磁换能器、光换能器、声换能器或热换能器的传感系统。
传感器可包括物理的、化学的或生物的检测系统。传感器的一个实例为生物传感器，即具有生物识别系统的传感器，例如基于一种核酸，例如寡核苷酸探针或适体；或者基于一种蛋白质，例如酶、结合蛋白、受体蛋白、转运蛋白或抗体。
所述生物传感器可包括检测生物标记的免疫学方法、电的、热的、磁的、光的(例如全息图)或声学的技术。利用这些生物传感器可检测生物样本中存在的具有预期浓度的靶生物标记。
本发明的方法适合于临床筛选、预后评估、疗效监测、识别对特定疗法最可能产生应答的患者，适合于药物筛选和开发，并且适合帮助识别用于药物治疗的新靶标。识别出特异性针对疾病的关键生物标记对于诊断方法和治疗方案的整合非常关键。
本发明的方法还可包括一种或多种对受试者精神障碍的诊断和/或监测进行评估的方法。所述评估可以是临床医生根据认可的评估方案进行的临床评估(例如整体功能评分(GAF)或SCID)，或者/并且可包括受试者的自我评估。可使用评定量表来帮助诊断和/或监测。GAF和SCID的评估基于临床访问进行。优选在从受试者收集测试生物样本的同一时间(即同一天)或邻近该时间(即距该时间的几天之内)前后进行评估，例如整体功能评分。该法作为女性受试者的诊断和监测工具特别地有用，在女性受试者中，发现VLDL和LDL水平和通过整体功能评分测得的临床评估结果呈非常紧密地负相关。
利用预测性的生物标记例如本文所述的生物标记，可以开发合适的诊断工具例如传感器和生物传感器，从而可在本发明的方法和用途中，使用传感器或生物传感器对一种或多种生物标记进行检测和定量。
本发明的传感器或生物传感器为能够对一种、两种或三种选自下列的生物标记进行定量的精神障碍传感器或生物传感器：VLDL、LDL和芳香类物质例如血浆蛋白质。
所述传感器或生物传感器可包括本文所述的用于生物标记检测的检测方法和系统。传感器或生物传感器可使用电的(例如，电流的、电势的、电导的或阻抗的检测系统)、热的(例如换能器)、磁的、光的(例如全息图)或声学技术。本发明的传感器或生物传感器可通过一种或多种选自以下的方法检测一种、两种或三种生物标记的水平：直接的、间接的或者偶联的酶学技术、分光光度技术、荧光技术、发光技术、光谱测定技术、旋光技术和色谱技术。特别优选的传感器或生物传感器包括一种或多种可直接使用的酶或者通过一种介质或通过一种与电的、光的、声的、磁的或热的换能器偶联的结合蛋白、受体蛋白或转运蛋白间接使用的酶。利用这类生物传感器可检测生物样本中存在的具有预期浓度的靶生物标记的水平。
本发明的一种或多种生物标记可以用传感器或生物传感器进行检测，所述传感器或生物传感器整合了基于“smart”全息图或高频声系统的技术，这类系统特别适合于“条形码”或阵列的构型。
在smart全息图传感器(Smart Holograms Ltd，Cambridge，UK)中，全息图存储于薄层聚合物膜中，该膜被致敏化以便能特异性地与生物标记反应。当生物标记与聚合物接触时，该生物标记与聚合物的反应导致全息图显示的图像发生改变。该测试结果的读数可为图像的光亮度、图像、颜色和/或位置的改变。在定量和半定量的应用中，传感器全息图可以用眼观察，因此省去了对检测装备的要求。当需要定量测量的时候，可以使用简单的颜色传感器来读取信号。不透明或者有颜色的样品并不影响该传感器的工作。传感器的形式允许多路地同时检测几种物质。可以设计可逆的和非可逆的传感器以满足不同的需求，并且对特定的目的生物标记的连续监测是可行的。
适当地，本发明的用于检测生物标记的生物传感器为偶联形式的，即它们将生物分子识别与适当的方法结合在一起，从而将检测到的样品中生物标记的存在或数量转换成信号。可以调整生物传感器以适用于“替代场所(alternate site)”诊断检验，例如在病房、门诊病人的公寓、诊所、家中、户外和工作地点进行诊断检验。
用于检测本发明的生物标记的生物传感器包括声学传感器、等离子体振子共振传感器、全息传感器和微工程(microengineered)传感器。可以在传感器中使用印迹识别元件、薄膜晶体管技术、磁声共振器装置以及其他新的声电系统，以用于本发明的生物标记的检测。
本发明的生物标记的检测和/或定量涉及到的方法可以在台式仪器上进行，或者可以被结合一次性的、诊断或监测平台上，所述平台可以被应用于一个非实验室的环境中，例如在医师的办公室中或者在病床旁边。适合进行本发明的方法的传感器或生物传感器包含具有光或声读数器的“信用”卡。可以配置传感器或生物传感器使收集的数据以电子的形式传递给医师进行解析，并且因此可以形成电子神经医学(e-neuromedicine)的基础。
若待测生物样本中VLDL和/或LDL生物标记水平比正常对照高，则表示存在精神障碍，特别是精神分裂性障碍、双相型障碍，或存在患这些疾病的倾向。
本发明还包括对来自测试受试者的待测生物样本中的一种甲状腺激素结合肽生物标记进行检测和/或定量，所述甲状腺激素结合肽生物标记优选地包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段；并且将所述待测样本中存在的该肽水平与一个或多个对照进行比较。
本发明还包括对来自测试受试者的待测生物样本中的一种ApoA1肽生物标记进行检测和/或定量，所述ApoA1肽生物标记包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段；并将所述待测样本中存在的该肽水平与一个或多个对照进行比较。
本发明的方法中使用的对照可以是一个或多个选自下列的对照：来自正常受试者的正常对照样本中存在的生物标记水平、正常生物标记水平或正常生物标记浓度范围。
合适地，待测样本和正常对照样本应为同一类型的样本，例如待测血清样本中的水平应与对照血清样本中的水平相比较。
诊断精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的优选方法包括：
(a)对待测生物样本中存在的一种肽生物标记进行定量，所述肽生物标记包括SEQ ID NO：1或2或者它们的片段，和
(b)将所述待测样本中的所述肽的量与来自正常受试者的正常对照生物样本中存在的量相比较。
若待测样本中该甲状腺激素结合肽生物标记的水平比正常对照中的水平低，则表示存在精神分裂性障碍或精神分裂性障碍的倾向。若待测样本中所述肽的水平与正常对照相同或比正常对照高，则表示不存在精神分裂性障碍和/或不存在精神分裂性障碍的倾向。
有效的诊断和监测方法通过确立正确的诊断、快速确定最适宜的疗法(因此减少不必要遭受的有害药物副作用)、减少“机能障碍时间”和复发率来提供能够改善预后的十分有效的“患者治疗方案”。
还提供了一种监测一种疗法对受试者精神分裂性障碍的有效性方法，所述受试者患有该障碍、疑似患有该障碍或者具有患该障碍的倾向，所述方法包括对来自所述受试者的生物样本中存在的一种甲状腺激素结合肽进行检测和/或定量，所述甲状腺激素结合肽优选地包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段。在监测方法中，可在两个或多个时间点取得待测样本。所述方法还包括将待测样本中存在的所述生物标记的水平与一个或多个对照，并且/或者与一个或多个在先待测样本进行比较，所述在先测样本是先前例如开始治疗前从同一测试受试者获取的，和/或在治疗早期从同一测试受试者获取的。所述方法可包括检测不同时间点获取的待测样本中生物标记水平的变化。
本发明提供了一种监测一种疗法对受试者精神分裂性障碍的有效性方法，包括：
(a)对来自所述受试者的生物样本中的一种甲状腺激素结合肽生物标记进行定量，所述甲状腺激素结合肽生物标记优选地包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段，和
(b)将所述待测样本中的所述肽的量，与一个或多个对照和/或一个或多个早期从同一所述测试受试者获取的前待测样本中存在的量相比较。
若待测样本中的肽生物标记的水平比早期从同一测试受试者获取的前待测样本中的水平高，则表示所述疗法对该疾病、该疑似的疾病或该疾病倾向有有益作用，例如稳定或改善。
监测一种疗法的有效性的方法可用来监测用于人类受试者和非人类动物(例如动物模型)的现有疗法和新疗法的疗效。这些监测方法可用来筛选新的药物和药物组合。
从正在经历诊断或监测过程的受试者身上取样的时间间隔，合适地可为3天、5天、1周、2周、1个月、2个月、3个月、6个月或12个月。样本可在抗精神分裂性障碍疗法之前和/或期间和/或之后取得。样本可在受试者生存期或其一部分时间内定期取得。
对样本中存在的所述生物标记的定量，可包括测定样本中存在的肽生物标记的浓度。检测和/或定量可以直接在所述样本上进行，或者在所述样本的提取物上，或者在它们的稀释物上间接进行。
可以采用任何适于检测患者生物样本、或生物样本提取物的纯化物、或它们的稀释物中是否存在特定蛋白质和/或其含量的方法来进行检测和/或定量。在本发明的方法中，可通过测量所述一个或多个样本中的所述肽生物标记的浓度来定量。可在本发明的方法中检测的生物样本包括脑脊液(CSF)、全血、血浆、尿、唾液或其他体液(粪便、泪液、滑液、痰)、呼出气例如凝结的呼出气，或者它们的提取物或纯化物，或者它们的稀释物。生物样本也可包括来自受试者活体或者取自尸体的组织匀浆物、组织切片和活检标本。所述样本优选地为CSF或血浆。所述样本例如——如果合适——可进行稀释或浓缩制备，并且以常规方式储存。
对甲状腺激素结合肽生物标记的检测和/或定量，可通过检测该肽生物标记或其片段例如C末端截短的片段和/或N末端截短的片段来完成。片段长度合适地大于4个氨基酸。优选地，片段长度为约6至约50个氨基酸长。
所述生物标记可例如通过SELDI或MALDI-TOF直接检测。或者，所述生物标记可通过与能特异性结合所述生物标记的下述物质相互作用来直接或间接检测：一种或多种配体，例如，抗体或其生物标记结合片段，或其他肽或配体，例如适体或寡核苷酸。所述配体可以含可检测标记，例如发光标记、荧光标记或放射性标记，和/或亲和标签。配体包括，例如：
(1)体内的：T3、T4(甲状腺激素)、维生素A(间接地通过与血清视黄醇结合蛋白相互作用)、载脂蛋白A1(ApoA1)、去甲肾上腺素氧化产物和蝶呤。
(2)体外的(多数为药物)：一些非甾体抗炎药(NSAID)、环境污染物例如多卤化联苯基化合物和拟甲状腺素化合物、呫吨酮衍生物以及天然的和合成的黄酮类。其他的配体还可以是表1所列的抗体。
例如，检测、监测、诊断和/或定量的方法可通过一种或多种选自下列的方法来实施：SELDI(-TOF)、MALDI(-TOF)、基于一维凝胶的分析、基于二维凝胶的分析、质谱(MS)、LC和基于LC-MS的技术。合适的LC MS技术包括(Applied Biosystems，CA，USA)或
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(Applied Biosystems，CA，USA)。也可以使用液相色谱(例如高压液相色谱(HPLC)或低压液相色谱(LPLC))、薄层色谱、NMR(核磁共振)谱。
本发明的诊断或监测方法可包括，利用质谱通过SELDI TOF、MALDI TOF等方法对生物样本(例如脑脊液(CSF)或血清)进行分析，以检测含SEQ ID NO：1或2或它们的片段的肽生物标记的存在或水平。这些技术可用于相对定量和绝对定量，也可用于评估本发明的生物标记与可能存在的其他生物标记间的比例。这些方法还适用于临床筛选、预后、监测治疗效果、识别出最有可能对特定疗法产生应答的患者，还适用于药物筛选和开发以及识别药物治疗的新靶点。
表面增强激光解析电离(SELDI)质谱是鉴定既定状况(例如药物治疗和疾病)下的体液和组织中蛋白和肽“指纹”特征的有效工具19。该技术利用蛋白芯片来捕获蛋白质/肽，利用飞行时间质谱(tof-MS)来对一些化合物进行定量和计算，这些化合物为小到1000 Da以下的小分子和肽，大到最高至500 kDa的蛋白质。可以通过自动的计算机程序对蛋白质/肽模式的定量差异进行统计学评价，这些程序将从生物体液谱测得的每种蛋白质/肽表示为多维空间坐标的形式。该方法在发现临床生物标记的领域中最为成功，因为它在不知道生物标记的身份情况下也可用作诊断工具。SELDI系统还能够在单次实验中测量几百个样本。此外，所有的SELDI质谱信号都来自天然蛋白质/肽(不像某些其他需要蛋白酶消化的蛋白质组技术)，因此可直接反映既定状况下的当前生理状态。
甲状腺激素结合肽生物标记的检测和/或定量，可通过基于免疫学、肽、适体或合成识别的任何方法来实现。例如，所述方法可包括能特异性结合甲状腺激素结合肽生物标记的抗体或抗体片段，例如，结合一种含SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列或其片段的肽，或者一种由该氨基酸序列或其片段组成的肽。合适的结合人TTR的抗体可通过商业途径购得，并列于表1中。
表1
山羊抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的Abcam
兔抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的Abcam
兔抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的Abcam
绵羊抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的Abcam
小鼠抗人TTR单克隆抗体，未缀合的，4D8Abnova Corporation
山羊抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的BIODESIGN International
绵羊抗清蛋白、前多克隆抗体，碱性磷酸酶缀合的Biogenesis
绵羊抗人清蛋白、前多克隆抗体，FITC缀合的Biogenesis
绵羊抗人清蛋白、前多克隆抗体，辣根过氧化物酶缀合的Biogenesis
绵羊抗人清蛋白、前多克隆抗体，未缀合的
Biogenesis
山羊抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的Fitzgerald Industries International
山羊抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的GeneTax
兔抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的GeneTax
绵羊抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的GeneTax
山羊抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的Novus Biologicals
兔抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的Novus Biologicals
绵羊抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的Novus Biologicals
山羊抗前清蛋白多克隆抗体，未缀合的Sigma-Aldrich
抗人前清蛋白，脱脂的多克隆抗体未缀合的United States Biological
抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体，未缀合的，克隆0.N.549United States Biological
兔抗人Dako
合适的免疫学方法包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，在该方法中使用可识别肽生物标记上的不同表位的两种抗体来检测该肽生物标记(见实施例)，还包括放射免疫测定(RIA)、直接的或竞争性的酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和任何基于颗粒的免疫测定(例如，利用金、银或胶乳颗粒，磁性颗粒或Q点)。免疫学方法可在例如微量滴定板或条带上进行。
在本发明的方法和用途中，测量来自测试受试者的待测样本中存在的具有SEQ ID NO：1或其片段的甲状腺激素结合肽生物标记的含量，若检测到待测样本中所述肽生物标记的水平低于来自正常个体的正常对照样本中存在的水平，则表示所述测试受试者患有精神分裂性障碍或具有患精神分裂性障碍倾向。例如，对于患有精神分裂性障碍或具有其倾向的测试受试者，其血清样本中检测到含有SEQ ID NO：1、其片段或其衍生物的甲状腺激素结合肽的含量，通常比正常对照样本中存在的甲状腺激素结合肽含量低至少15％。在前额皮质中，甲状腺激素结合蛋白的表达减少约40％。在CSF样本中，与正常对照样本中的TTR水平相比降低约20％。
根据本发明，还可例如采用质谱或其他合适的技术，来测评具有SEQ ID No1或其片段的TTR肽相对于对照肽或蛋白质的减少程度。该肽可以是另一种精神分裂性障碍的生物标记。
在本发明的方法和用途中，测量来自测试受试者的待测样本中存在的具有SEQ ID NO：2或其片段的ApoA1生物标记肽的含量、水平或浓度，若检测到待测样本中所述生物标记肽的水平低于来自正常个体的正常对照样本中存在的水平，则表示所述测试受试者患有精神分裂性障碍或具有患精神分裂性障碍倾向。例如，对于患有精神分裂性障碍或具有该倾向的未经给药的测试受试者，其待测生物样本中检测到的具有SEQ ID NO：2的肽的水平，通常比正常对照样本中存在的该肽的含量低至少约10％至约80％，优选地低约18％至约60％。
可以在本发明的方法中测试的样本包括脑脊液(CSF)、全血、血清、血浆、红细胞、肝细胞、尿、唾液或其他组织或体液(粪便、泪液、滑液、痰)、呼出气例如凝结的呼出气，或它们的提取物或纯化物，或者它们的稀释物。生物样本还包括来自受试者活体或者取自尸体的组织匀浆物、组织切片和活检标本。可以所述样本制备，例如如果合适可进行稀释或浓缩，并且以常规方式储存。
对于患有精神分裂性障碍或具有该倾向的未经用药的测试受试者，其血清样本中的含SEQ ID NO：2或其片段的ApoA1生物标记肽的水平根据本发明的方法来检测和/或定量，该水平应比正常对照血清样本中存在的该肽含量低约10％至约25％，优选地低约18％。
对于患有精神分裂性障碍或具有该倾向的未经用药的测试受试者，其红细胞样本中的含SEQ ID NO：2或其片段的ApoA1生物标记肽的水平根据本发明方法来检测和/或定量，该水平优选地应比正常对照红细胞样本中存在的该肽的含量低约50％至约70％，优选地低约60％。
对于患有精神分裂性障碍或具有该倾向的未经用药的测试受试者，其肝细胞样本中的含SEQ ID NO：2或其片段的ApoA1肽生物标记肽的水平根据本发明方法来检测和/或定量，该水平优选地应比正常对照肝细胞样本中存在的该肽的含量低约20％至约40％，优选地低约30％。
对于患有精神分裂性障碍或具有该倾向的未经用药的测试受试者，其CSF样本中的含SEQ ID NO：2或其片段的ApoA1肽生物标记肽的水平根据本发明方法来检测和/或定量，该水平优选地应比正常对照CSF样本中存在的该肽的含量低约20％至约40％，优选地低约30％至约35％。
对ApoA1肽生物标记的检测和/或定量，可通过检测该肽生物标记或其片段例如C末端截短的片段和/或N末端截短的片段来完成。片段长度合适地大于4个氨基酸。
所述生物标记可例如通过SELDI或MALDI-TOF直接检测。或者，所述生物标记可通过与能特异性结合所述生物标记的下述物质相互作用来直接或间接检测：任何天然存在的、生物来源的或合成的一种或多种配体，例如抗体或其生物标记结合片段，或者其他肽、或配体，例如适体或寡核苷酸，或化学合成的结合配体。本发明的方法中使用的配体可以含可检测标记，例如发光标记、有色标记、代谢标记、磁标记、荧光标记或放射性标记，和/或亲和标签(例如，Arg标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、DsbA、c-myc标签、谷胱甘肽S转移酶、FLAG标签、HAT标签、His标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、S标签、SBP标签、链霉素标签或硫氧还蛋白)。所述标记也还可包括纳米颗粒。可以使用量子点(Q点)。Q点是几个纳米大小的核/壳型CdSe/ZnS纳米晶体，它可缀合到生物分子上。
所述配体还可用上转换无机发光材料标记。上转换无机发光材料是均一的、亚微米级的上转换无机发光微球，它可合成得到，并可包被有生物活性探针例如抗体。这些材料在用近红外光激发后会发出可见光。
根据配体的性质，可采用以下方法来检测：荧光共振能量转移(FRET)、多路传输测定(channelling assay)(例如，发光氧多路传输测定，例如利用与生物分子缀合的
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胶乳颗粒)或邻近测定法。
此外，表面等离子共振技术(SPR)可作为无标记传感工具使用。
可通过一种或多种选自下列的方法进行检测和/或定量：LCUPLC、CZE、SELDI(-TOF)、MALDI(-TOF)、基于一维凝胶的分析、基于二维凝胶的分析例如差异双向凝胶电泳(2D-DIGE)、质谱(MS)和基于LC-MS的技术。合适的LC MS技术包括
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(Applied Biosystems，CA，USA)或
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(AppliedBiosystems，CA，USA)。还可采用液相色谱(例如，高压液相色谱(HPLC)或低压液相色谱(LPLC))、薄层色谱、NMR(核磁共振)谱。
本发明的诊断方法可包括，通过SELDI TOF或MALDI TOF对生物样本(例如脑脊液(CSF)、血清或血浆)进行分析，以检测具有SEQ ID NO：2或其片段的肽生物标记的存在或水平。
ApoA1肽生物标记的检测和/或定量可通过免疫学方法进行，所述免疫学方法包括能特异性结合ApoA1肽生物标记的抗体或其片段，例如针对由SEQ IDNO：2所示氨基酸序列或其片段组成的肽的抗体。合适的免疫学方法包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，在该方法中使用可识别肽生物标记上的不同表位的两种抗体来检测该肽生物标记，还包括放射免疫测定(RIA)、直接的或竞争性的酶联免疫吸附测定(ELISA)或其任何改进方案或实施方案、酶-免疫测定(EIA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和任何基于颗粒的免疫测定(例如，利用金、银或胶乳颗粒，磁性颗粒或Q点)。免疫学方法可在例如微量滴定板或条带上进行。
本发明的生物传感器可包括能特异性结合所述肽生物标记的本文所述的一种或多种配体。这些生物传感器可用于本发明的肽的检测和/或定量。
还提供了一种阵列、模式或指纹，其中包含能特异性结合肽生物标记的本文所述的配体。
提供了用来实施本发明的方法的诊断或监测试剂盒。这类试剂盒合适地可包括本文所述的用来对本文所述的肽生物标记进行检测和/或定量的配体、和/或生物传感器、和/或阵列，任选地包括该试剂盒的使用说明书。
本发明还提供了本文所述的配体、或本发明的生物传感器、或本发明的阵列、或本发明的试剂盒用于对所述肽生物标记或其片段进行检测或定量的用途，所述配体可以是天然存在的或化学合成的并且合适地为肽、抗体或其片段、适体或寡核苷酸。在该用途中，可以对生物样本进行检测和/或定量，所述生物样本例如有CSF、全血、血清、泪液、尿、唾液或其他体液、呼出气例如凝结的呼出气，或它们的提取物或纯化物，或者它们的稀释物。
因此，本发明的另一方面是提供了本文所述的配体、或本发明的生物传感器、或本发明的阵列、或本发明的试剂盒用于识别能刺激、促进或激发肽生物标记产生的物质的用途，所述配体可以是本发明的肽、抗体或其片段，或者适体或寡核苷酸。
还提供了一种识别一种在受试者体内能刺激、促进或激发肽生物标记产生的物质的方法，所述肽生物标记优选地包括SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列或其片段，所述方法包括将一种待测物质给予受试动物，并对该受试者的待测样本中存在的所述肽生物标记的水平进行检测和/或定量。
任何合适的动物均可作为非人类受试动物使用，例如非人类的灵长类、马、牛、猪、山羊、斑马鱼、绵羊、犬、猫、鱼、啮齿类(例如豚鼠、大鼠或小鼠)、昆虫(例如果蝇(Drosophila))、两栖类(例如非洲蟾蜍(Xenopus)或线虫(C.elegans)。
所述待测物质可以是已知的化学物质或药物，例如但不限于抗精神分裂性障碍治疗剂，或者所述待测物质也可以是合成的或天然的新化学实体，或者两种或多种前述物质的组合。
提供了一种识别一种在受试者体内能刺激、促进或激发肽生物标记产生的物质的方法，所述肽生物标记优选地包括SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列或其片段，所述方法包括使一种测试细胞接触一种待测物质，并监测所述测试细胞内的或者由所述测试细胞分泌的所述肽生物标记的水平。所述测试细胞可以是原核细胞，但优选在基于细胞的检测方法中使用真核细胞。所述真核细胞合适地为酵母细胞、昆虫细胞、果蝇细胞、两栖类细胞(例如来自非洲蟾蜍)、线虫细胞，或者为人、非人类灵长类、马、牛、猪、山羊、绵羊、犬、猫、鱼、啮齿类或鼠来源的细胞。
在识别具有潜在治疗作用的物质的方法中，可使用能表达人甲状腺激素结合多肽的非人类动物或细胞。
筛选方法还包括一种识别一种能结合本发明的肽生物标记的配体的方法，包括在有所述肽生物标记存在以及适于结合的条件下，孵育待测物质，并对所述肽与所述待测物质的结合进行检测和/或定量。
基于本发明的生物标记、用途和方法的高通量筛选技术(例如构建成阵列、模式或指纹的形式)适用于监测生物标记的特征，从而用于识别潜在有用的治疗化合物，例如，能结合所述生物标记的配体如天然化合物、合成的化学化合物(例如来自组合文库)、肽、单克隆或多克隆抗体或其片段。
可采用阵列、模式或指纹的方式(例如，在芯片上或以多孔阵列的形式)实施本发明的方法。也可使用上文所述的其他技术，例如质谱。方法可以被调整乘适用于单次测试或多次等同测试或多次非全同测试的平台，并且可以以高通量形式进行。本发明的方法可以包括进行一种或多种额外的不同测试来确认或排除诊断，和/或进一步表征一种病症。
本发明还提供一种物质例如一种配体，所述物质由或者可由本发明的识别或筛选方法或应用识别出。该物质可直接地或间接地刺激、促进或激发所述肽生物标记的活性，或者刺激、促进或激发所述肽生物标记产生。术语物质包括这样一类物质，所述物质不直接结合所述肽生物标记并且不直接诱导所述肽生物标记表达，或者不直接促进或激活一种功能，但可间接地诱导所述肽生物表达或者促进/或激活所述肽生物标记的一种功能。配体也可包括在术语物质之内；本发明的配体(例如，天然的或合成的化学化合物、肽、适体、寡核苷酸、抗体或抗体片段)能结合并且优选地能特异性结合一种肽生物标记。
本发明还提供本发明的物质或配体用于治疗精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的用途。
还提供了本发明的物质用作一种药物的用途。
还提供了本发明的物质用于制备一种治疗精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的药物的用途。
提供了一种诊断或监测精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的试剂盒。本发明的试剂盒合适地可含一种或多种选自下列的组分：特异性针对肽生物标记的配体、肽生物标记、对照、反应试剂和耗材，任选地还包含该试剂盒的使用说明书。
本文所用的术语“治疗”或“疗法”，在提及本发明的生物标记的治疗用途时，用来描述对患者的处理或护理以对抗疾病，它包括将活性试剂给予无症状的个体以例如防止症状或并发症的发作(即预防)。
还提供了一种识别精神分裂性障碍治疗物质的方法，其中所述物质能促进ApoA1肽生物标记的产生，所述方法包括将所述物质给予测试受试者，并对所述测试受试者体内的ApoA1肽生物标记水平进行检测和/或定量。在另一实施方案中，提供了一种识别精神分裂性障碍治疗物质的方法，其中所述物质能促进ApoA1肽生物标记的活性，所述方法包括将所述物质给予测试受试者，并对所述测试受试者体内的ApoA1肽生物标记活性进行检测和/或定量。若ApoA1生物标记肽的水平或活性升高，则表明该物质为精神分裂性障碍治疗物质。这些方法中的ApoA1肽生物标记，优选地包括SEQ ID NO：2、其片段或非人类ApoA1同源物。
本文使用的术语“治疗物质”的定义是一种具有疗效即治疗/有益特性，并可治疗精神分裂性障碍、缓解其症状或防止精神分裂性障碍发作的物质。因此，该物质可用于治疗精神分裂症。
识别精神分裂症障碍治疗物质的方法中的所述测试受试者可以是任何合适的动物，优选地为非人类动物，例如非人类灵长类、马、牛、猪、山羊、绵羊、狗、猫、鱼、啮齿类(例如豚鼠)、兔、大鼠或小鼠、昆虫(例如果蝇)、两栖类(例如非洲蟾蜍)或线虫。
所述待测物质可以是已知的化学物质或药物，例如但不限于抗精神分裂症治疗剂，或已知的抗精神病治疗剂，或者所述待测物质也可以是合成的或天然的新化学实体，或者前述两种或多种物质的组合。
本发明还提供一种识别精神分裂性障碍治疗物质的体外方法，其中所述物质能刺激或促进ApoA1肽生物标记产生，所述方法包括使测试细胞接触待测物质，并检测所述待测细胞内的或由所述待测细胞分泌的所述生物标记肽或其片段水平的升高。还提供一种识别精神分裂性障碍治疗物质的体外方法，其中所述物质能刺激或促进ApoA1肽生物标记的活性，所述方法包括使测试细胞接触待测物质，并检测所述待测细胞内的或由所述待测细胞分泌的所述生物标记肽或其片段活性的升高。上述体外方法中的ApoA1肽生物标记优选地包括SEQ IDNO：2、其片段或非人类ApoA1同源物。
所述真核细胞合适地可选自酵母细胞、昆虫细胞、果蝇细胞、两栖类细胞(例如来自非洲蟾蜍)、线虫细胞，或者为人、非人类灵长类、马、牛、猪、山羊、绵羊、犬、猫、鱼、啮齿类或鼠来源的细胞。
在识别具有潜在治疗用途的物质的方法中，可使用能表达人ApoA1多肽的非人类动物或细胞。或者，非人类细胞自身能表达内源性ApoA1。
筛选方法还包括一种识别一种能结合本发明的ApoA1肽生物标记的配体的方法，包括在有所述肽生物标记存在以及适于结合的条件下，孵育待测物质，并对所述肽与所述待测物质的结合进行检测和/或定量。
还提供了一种由本发明的方法识别的物质。
提供了用于实施本发明的方法的诊断或监测试剂盒。这类试剂盒合适地可包括本文所述的能特异性结合ApoA1肽生物标记的配体，用来对本文所述的ApoA1肽生物标记进行检测和/或定量；和/或生物传感器和/或阵列，任选地包括该试剂盒的使用说明书。另一方面，本发明提供了一种用于诊断或监测精神分裂性障碍或精神分裂性障碍倾向的试剂盒。本发明的试剂盒合适地可含有一种或多种选自下列的组分：特异性针对ApoA1肽生物标记的配体、ApoA1肽生物标记或ApoA1肽生物标记的结构/形状类似物、对照、反应试剂和耗材，任选地还包含该试剂盒的使用说明书。
本发明的方法可以以多分析物面板或阵列的方式进行，例如，芯片上或以多孔阵列的形式。方法可以被调整成适用于单次测试或多次等同测试或多次非全同测试的平台，并且可以以高通量形式进行。本发明的方法可以包括进行一种或多种额外的不同测试来确认或排除诊断，和/或进一步表征一种精神病病症。
附图说明
图1对精神分裂症相异的同卵双生子和对照双生子血浆样本的代谢组学分析。(A)来自一对精神分裂症相异的代表性双生子的血浆样本的部分1H NMR谱(患病的双生子以灰色表示，未患病的以黑色表示)示出了脂质区域-(CH2)n和CH3脂质改变。(B)和(C)为PLS-DA评分图，示出对照双生子与未患和患有精神分裂症的双生子间的差异，该差异由血浆1H NMR谱测得。未患病的双生子显示于对照和精神分裂双生子之间的位置。
图2对来自精神分裂症相异的女性双生子和对照女性双生子的血浆样本的代谢组学分析。血浆1H NMR谱测得的女性同卵双生子的PLS-DA评分图(图2A)示出了对照双生子、未患病的双生子和精神分裂双生子之间的明显差异。该输出载荷图(loading plot)证明了LDL(0.86和1.26)、VLDL(0.9和1.3)和芳香区域(～7.5)为有助于分离的关键化学位移。图1C与图2B之间高度相似。
图3整体功能分值(DSM IV，第V轴)与主要对应于女性双生子血浆LDL和VLDL水平两个关键化学位移(A 1.24-1.28ppm；B 1.28-1.32ppm)呈负相关。每个图中均示出了R2。
图4对来自精神分裂症相异的男性双生子和对照男性双生子的血浆样本的代谢组学分析。PLS-DA评分图(A)表明男性对照双生子和未患病的男性双生子之间并无差异，而精神分裂双生子显示出与男性对照双生子和男性精神分裂相异双生子之间有适当差异。根据输出载荷图(B)所示，发现葡萄糖水平(3.2-3.9ppm)和来自芳香区域(～7.9ppm)和1.04-1.06-1.12ppm区域的信号是主要的分离贡献因子。
图5利用SELDI质谱得到的、首次发病且未经用药的精神分裂症患者CSF样本的蛋白质/肽图。
A：利用阴离子交换芯片得到的典型CSF蛋白质/肽谱(Q10；50 mMTris-HCl，pH 9.0)示出了，对于健康志愿者，m/z范围为约10,000-15,000。
B：采用PCA和PLS-DA模型分析SELDI谱中蛋白质/肽峰的峰强度。3DPLS-DA评分图示出了健康志愿者的簇(黑色)和未经治疗的未经用药的精神分裂症患者的簇(灰色)。
C和D：PLS-DA评分图和输出载荷图。评分图与(B)类似，只是前两个组分是用来区分健康对照和患者的。(D)所示的输出载荷图示出了对(C)中的分离贡献最大的主要蛋白质/肽峰。
图6首次发病且未经用药的精神分裂症患者的CSF中三种不同形式的甲状腺激素结合蛋白下调。(A)示出了健康志愿者和精神分裂症患者的CSF谱(6-17kDa范围内)的实例。其中箭头所示峰簇的放大图示于(B)中。每个子峰的统计学详细信息列于下表中。室温下在芯片上用β巯基乙醇还原CSF肽/蛋白质，显示出13,741、13,875和13,923 Da处的三个峰在还原后合并为一个单峰(C)，表明它们是同一蛋白质的不同的S-半胱氨酰化衍生物。为识别其特征，将来自健康志愿者和精神分裂症患者的CSF样本加到阴离子交换柱(HyperD)上，并用pH9-pH3的缓冲液洗脱。主条带在pH3级分中的约14-15kDa处洗脱出(D，左图)。通过LC-MS/MS鉴定出该条带为甲状腺激素结合蛋白(D，右图)，并且示出了该序列覆盖。此外，通过对该条带进行蛋白质洗脱并在NP20芯片上处理以进行质谱匹配，证实该条带为谱中约13.5-14kDa处的峰簇(E)。
图7首次发病且未经用药的精神分裂症患者血清中的甲状腺激素结合蛋白水平和精神分裂症患者尸体前额皮质组织中的甲状腺激素结合蛋白水平。在本研究中包含了图5和8所测CSF蛋白图所属的相同患者的血清样本。图7表明，精神分裂症患者的血清甲状腺激素结合蛋白水平比对照受试者显著下降约15％。数据表示为平均值±SD，*p＝0.007(t检验)。图7B表明，第2组样本中血清甲状腺激素结合蛋白和一种甲状腺激素结合蛋白同种型的CSF SELDI信号(m/z＝13,741)不相关(人口统计学信息参见表5)。与CSF中的其他同种型比较后，发现结果类似(数据未示出)。图7C表明，5名精神分裂症患者和5名对照受试者的前额皮质中的甲状腺激素结合蛋白表达减少约40％。人口统计学信息参见表6。
图8对独立验证样本组的CSF蛋白质/肽谱的PLS-DA分析，该独立验证样本组包含18名首次发病且未经用药的精神分裂症患者和40名健康志愿者。该样本组的人口统计学信息列于表5。PLS-DA评分图表明患者(黑色)和健康志愿者(灰色)之间的区别。输出载荷图示出了第一次试验中13,600至14,000之间的甲状腺激素结合蛋白信号。
图9首次发病且未经用药的精神分裂症患者的CSF ApoA1水平下调。A：使用强阴离子交换(Q10)ProteinChip阵列检测CSF蛋白质和肽。典型的CSFSELDI谱示出了具有m/z 4,000至m/z 70,000质荷比的蛋白质/肽图。B：14个典型谱的凝胶图，表明精神分裂症样本中的apoA1蛋白(约28 kDa)比对照低(约35％；p＝0.00001)。其邻近的直方图示出了ApoA1水平平均值+/-SD(将41个首次发病且未经用药的精神分裂症患者的CSF样本与40个相应的对照样本相比较)。C：约28kDa的峰为凝胶纯化后的(箭头)，采用LC-MS/MS对切除的蛋白质进行测序(右图)。黑体突出表示的序列覆盖区域与公开的部分ApoA1氨基酸序列相对应。D：通过在芯片(RS-100 ProteinChip)上用抗ApoA1抗体免疫捕获CSF样本中的蛋白质，证明该条带为谱中28kDa处的峰簇。将CSF样本加于RS-100芯片上，该芯片或者偶联有抗ApoA1抗体(下图)，或者不偶联该抗体(上图)。用SELDI-TOF分析与该芯片结合的蛋白质。被捕获的ApoA1蛋白显示出28kDa的m/z。E：蛋白质印迹分析，该分析示出了8名精神分裂症患者和8名健康志愿者的前额皮质中的ApoA1表达。观察到了下调的趋势(约32％；p＝0.07，t检验)。输出载荷图示于该印迹图下方。
图10：对精神分裂症患者(n＝15)和对照(n＝15)的肝的二维DIGE分析。A：肝蛋白质提取物的典型二维凝胶图。ApoA1蛋白(相应的点由箭头标出)是其中一种显著改变的蛋白质。B：发现精神分裂症患者肝中的ApoA1水平显著下降(约30％；p＝0.017)。直方图示出了相对标准丰度的平均值+/-SD。C：对来自凝胶上斑点的、经胰蛋白酶消化的肽进行LC-MS/MS分析，表明有三种肽片段来自apoA1蛋白。Mascot评分和序列覆盖率示于表中。
图11对精神分裂患者(n＝20)和对照(n＝20)红细胞(RBC)的二维DIGE分析，显示出ApoA1蛋白表达减少。A：未分级分离的RBC蛋白质组的典型二维凝胶图，该图示出了血红蛋白的显性表达(pI约为7)。B：利用Ficoll密度梯度除去显性蛋白质(即血红蛋白)后的典型二维凝胶图。箭头和斑点标出了apoA1斑点在凝胶上的位置。C：发现精神分裂症患者的RBC中ApoA1水平显著下降(约60％；p＝0.0034)。直方图示出了相对标准丰度的平均值+/-SD。D：对来自凝胶上斑点的、经胰蛋白酶消化的肽进行LC-MS/MS分析，表明有8种肽片段来自ApoA1蛋白。Mascot评分和序列覆盖率示于表中。
图12精神分裂症中血清水平下调。A：对首次发病且未经用药的精神分裂症患者(n＝35)和健康志愿者(n＝63)的血清appA1水平进行的ELISA分析。示出了精神分裂症患者和对照的apoA1浓度的平均值+/-SD。p＝0.00039(t检验)。B：对同一个体的CSF和血清ApoA1水平的相关性分析。发现对照组和患者组的血清和CSF水平之间都没有相关性。
图13示出了，当在PCA分析中组合使用两种生物标记时，可实现约89％的高灵敏度和约73％的特异性。
实施例
可参照以下提供的实施例来进一步地理解本发明。
实施例1
Fuller Torrey博士(Stanley Medical Research Institute，Bethesda，USA)在标准条件下收集了21对精神分裂症相异的同卵双生子和16个相应对照双生子的血浆样本。所有的参与研究的人员均签署了书面知情同意书，该初始研究经由伦理委员会批准。在两名进行SCID会谈-DSM-IV-TR结构式临床问卷(Structured Clinical Interview for DSM-IV-TR，SCID)的评定人员的一致意见下，获得每个个体的GAF。SCID是为帮助临床医生、研究者和培训人员进行可靠的DSM-IV精神病诊断而设计的一种临床评定量表，该临床评定量表包括半结构化诊断问卷。在上午进行的淋巴细胞无耐受采集过程中，从成对的双生子中同时获得血浆，其中成对的双生子饮食状况相似并且一起住宿。向血浆样本(50μl)中加入D2O使终体积高达500μl，制备物用于1H NMR分析。加入含10％D2O的等渗盐溶液，将血浆样本稀释至终体积为550μl，以用于NMR场频锁定。
将双生子样本分成等分试样，并储存于-80℃中。在获取NMR谱前，所有样本均未经过超过3次的冻融过程。随机条件下盲法进行所有实验。向血浆样本(50μl)中加入D2O使终体积为500μl，准备用于1H NMR分析。加入含10％D2O的等渗盐溶液，将血浆样本稀释至终体积为550μl，以用于NMR场频锁定(field-frequency lock)。
血浆样本的1H NMR光谱学：
用预饱和脉冲顺序(脉冲顺序：弛豫延迟-90°-ti-90°-tm-90°-俘获FID；Bruker Analytische GmbH，Rheinstetten，德国)抑制水的共振，获得所有样本的标准一维600 MHz 1H NMR谱。在这个脉冲顺序中，在2s的弛豫延迟和混合阶段(tm＝100ms)过程中以水共振频率施加二级射频辐射，t1固定为3μs。在300K至32K的数据点获得典型的256个暂态，每次扫描的光谱宽度为6000Hz，采集时间为1.36s。在傅里叶变换之前，用符合0.3Hz的谱线增宽因子的一个指数加权函数乘以自由感应衰减(FID)。
数据简化和模式识别步骤：
为了有效的评估患者和对照中获得的生物体液内和生物体液之间的代谢差异，用软件程序AMIX(Analysis of MIXtures 2.5版，Bruker Rheinstetten，德国)简化谱数据，并输出到SIMCA-P(10.5版，Umetrics AB，
Figure A20068004667100481
，瑞典)中，用该程序确定多变量统计分析的范围。对该数据用初始主成分分析(PCA)以判别谱图中存在的内在相似性。当1H NMR谱的分类被外源性污染物影响时，就需要在统计分析中除去含有那些信号的光谱区。为了确认精神分裂症患者和相应对照之间的生物标记的差异，应用了潜在结构投影判别分析(PLS-DA)。如果合适，使用Statistical Package for Social Scientists(SPSS/PC+；SPSS，Chicago)对数据进行单因素方差分析(ANOVA)。当F比值得出P＜0.05时，用Dunnett T3检验比较个体组间的平均值，显著性水平设为P＝0.05。
结果
基于以下样本1H NMR谱的PLS-DA评分图可将患病和未患病的双生子与年龄相当的对照双生子区分开(图1A和图1B)，所述样本为21对精神分裂症相异的同卵双生子和16名相应对照双生子的血浆。载荷系数表明来自VLDL(0.92-0.88ppm和1.28-1.32ppm)、LDL(0.84-0.88 ppm和1.24-28ppm)和芳香基团(～δ7.5；很可能代表血浆蛋白质)的共振是导致分离的主要因素(表3，图1C)。患精神分裂症的双生子与对照双生子相比，表现出血浆VLDL信号(1.28-1.32ppm)增高23％(p＝0.015；ANOVA)。同时发现相应的未患病的双生子的1.28-1.32ppm信号也增高，但是其差异不显著(p＝0.18；ANOVA)。三个组的LDL水平表现出与VLDL信号类似的趋势，但是同样也未达到统计学上的显著性(数据未示出)。此外，精神分裂症相异的双生子的血浆蛋白质水平更低，该水平通过约7.5ppm处的芳香信号反映出(患病和未患病的双生子分别降低14％和8％；p＜0.01)。未观察到各组间HDL信号(0.6-0.7ppm)的差异。进一步的分析表明，女性双生子的差异更为显著(图2)。将各个组区分开的关键化学位移已列于表3中。值得注意的是，患病和健康的相异女性双生子之间的PLS-DA分析仅仅表明，可将相异双生子与对照双生子明显区分开的同样的评分图和输出载荷图也能将相异双生子自身之间区分开。这表明识别出的代谢改变是实际疾病相关的指纹。此外，1.24-1.28ppm间的信号(主要是LDL)与由DSM IV第V轴整体功能评分(GAF)量表获得的评分良好相关(R2＝0.62，图3)，GAF评分量表是应用最为广泛的一种评估精神病患者所受损害的方法。可以进行1-100级的等级评定，第1-10级表示严重损害，达到90或其以上的级别时表示功能良好(DSM IV；Moos et al.，2002)。女性双生子的血浆VLDL信号(1.28-1.32ppm)也表现出与GAF评分良好相关(R2＝0.54；图3)。当考虑所有双生子或单独考虑男性双生子时，未观察到相关性(数据未示出)。年龄似乎对疾病相关的化学位移没有影响。然而，对于女性双生子，抗精神病药物的接触(由氟奋乃静等同物测得)也分别与GAF评分以及代谢指纹具有相关性。
另一方面，相应的精神分裂症相异的男性双生子血浆1H NMR谱PLS-DA评分图示出，患病和未患病的双生子之间的差异并不那么显著(图4A)。与女性双生子不同，男性双生子的输出载荷系数表明，对应于血浆蛋白质的芳香区域的共振是将男性双生子区分开的主要原因(图4B)。对于男性双生子，未观察到葡萄糖与抗精神病治疗、年龄、病程、药物滥用和GAF评分之间的相关性(数据未示出)。男性对照双生子和未患病双生子之间也未发现显著差异(图4A)。
实施例1的讨论
本研究利用1H NMR检测了总共42名精神分裂症相异的同卵双生子和16名相应对照双生子的血浆代谢情况，从而研究了遗传因素和环境因素在精神分裂症中的作用。结果表明，来自VLDL、LDL和芳香区域的信号是将精神分裂症相异的双生子(患病的和健康的)与对照双生子区分开的最重要因子。值得注意的是，女性双生子在这一点上的区分要明显得多。
总地来说，对于男性和女性精神分裂双生子，观察到的代谢变化情况类似，对于女性组，在未患病的双生子中发现了潜在的患病倾向指纹。这可能表示，对于女性双生子，遗传载荷因素更为明显。精神分裂症上的显著性别差异是一个公认的事实；平均而言，女性精神分裂症患者的发病年龄更晚，预后更好。这得归功于雌激素的保护作用。已证明，急性精神病发作的女性的雌激素水平较低(Huber et al.，2005)。已知雌激素具有神经保护特性，并且可减少兴奋性毒性以及氧化应激相关的细胞死亡。
对于患有精神分裂症的女性双生子，其改变与疾病的严重性以及与常用抗精神病药物的接触高度相关，这就使得难以评价环境因素的作用和药物的作用。然而，多项证据表明，该效果并不是药物的作用结果：因为在未患病的双生子中也发现了类似的改变；而且，发现了在患病的男性双生子中抗精神病药物与整体功能评分并没有相关性。
本研究中最引人注意的一个发现是在女性受试者中，VLDL/LDL信号与整体功能评分(DSMIV，第V轴)密切相关。这显然是首次报道了，主观临床量表和客观生物标记之间有密切相关性；因此，这些生物标记可用于帮助诊断和确立临床反应。
表2同卵双生子的人口统计学详情
Figure A20068004667100501
*p＝0.04，对照双生子与精神分裂症相异双生子的比较，单因素ANOVA
#氟奋乃静等同物
& p＜0.01，与未患病的和对照的双生子的比较，单因素ANOVA
&& p＜0.05，与对照双生子的比较，单因素ANOVA
表3 在女性同卵双生子血浆中改变的主要化学位移的统计学分析
Figure A20068004667100502
数据以平均值±S.D.表示
& 基于Nicholson和Foxall14的研究的信号指定
*p＜0.05，与未患病的双生子和对照双生子的比较；单因素ANOVA
#p＜0.05，与对照双生子的比较；单因素ANOVA
实施例2
采用SELDI质谱和计算机模式识别分析，对总共139个CSF样本(80个对照和59个首次发病且未经用药的精神分裂症患者)进行全面第CSF样本蛋白质/肽谱分析。已发现，被诊断患偏执型精神分裂症的首次发病且从未用药的患者的样本与年龄相当的对照样本之间，具有可重现的高度显著性差异。
表4首次CSF SELDI实验中受试者的人口统计学详情
Figure A20068004667100511
*数据以平均值±S.D.的形式表示
表5 CSF验证样本组受试者的人口统计学详情
*数据以平均值±S.D.的形式表示
表6
图3C(尸体分析中甲状腺激素结合蛋白表达的蛋白质印迹分析)分析中的受试者的人口统计学详情
Figure A20068004667100513
*数据以平均值±S.D.的形式表示
表7
由两个独立实验计算的PLS模型的灵敏性和特异性
Figure A20068004667100514
1灵敏性定义为检测到的实际阳性数与全部阳性数的比例
2特异性定义为检测到的试剂阴性数与全部阴性数的比例
临床样本
科隆大学医学院伦理委员会检查并批准了本项研究的方案和采样及分析方法。所有研究参与人员签署了书面知情同意书。所有临床研究都是根据赫尔辛基宣言中描述的原则进行。从诊断为首次偏执型精神分裂症发作且未经用药的患者，或者由病程所致的短暂精神障碍的患者(DSM-IV 295.30或298.8，n＝59)，以及从人口统计学上匹配的健康志愿者(n＝80)(表4和5)中收集CSF和血清样本。从斯坦利神经病理学会脑样库(斯坦利医学研究院，USA)中，获得8名精神分裂症个体和8名良好匹配的对照个体的新冷冻的灰质前额皮质组织(第9大脑视区)。
用于SELDI分析的CSF样本制备
将每个CSF样本(5μl)加到在不同pH条件下具有不同化学性质的芯片上。基于分离峰的数目和分离度，选择的最佳条件为在pH9.0条件下，在强阴离子交换Q10芯片上进行。简单来说，在室温下，在振摇器(频率＝600rpm)中，用结合缓冲液(100 mM Tris-HCl，pH 9.0)预激活各阵列点两次，持续10分钟。将50μl结合缓冲组合物加到每个蛋白质点上，然后加入5μl CSF样本。室温下将蛋白质芯片在振摇器中孵育60min。芯片用结合缓冲液洗涤两次，用H2O洗涤一次，然后风干。然后用0.6μl含100％饱和的芥子酸(3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)的50％乙腈溶液和0.5％三氟乙酸依次处理两次。用Ciphergen蛋白质芯片读数器(Ciphergen ProteinChip System Series 4000)分析芯片。每个样本分析两次以确定差异表达蛋白鉴定的重现性。
SELDI-TOF-MS分析
用Ciphergen ProteinChip System Series 4000(Ciphergen Biosystems，USA)分析阵列。以1800个任意单位用平均254个激光点并的激光强度生成蛋白质质谱。为采集数据，检测大小的范围在3至200 kD。在10 kDa聚焦激光。根据外部校正标准(Ciphergen Biosystems；USA)确定阵列表面俘获的每种蛋白的质荷比(m/z)：牛胰岛素(5,733.6 Da)、人泛素(8,564.8 Da)、牛细胞色素c(12,230.9 Da)、牛超氧化物歧化酶(15,591.4 Da)、辣根过氧化物酶(43,240 Da)和BSA(66,410 Da)。用PROTEINCHIP数据分析软件(3.0版)和Ciphergen Express软件3.0(Ciphergen Biosystems；USA)分析数据。用Ciphergen Express软件3.0对所有谱进行编译和自动检测定量的质谱峰。通过质量窗为0.2％的二次峰筛选(second-pass peak selection)来标记峰，并加入估计的峰。输出所有谱的峰信息以用于进一步的统计分析。
肽和蛋白质的鉴定
通过(芯片上的)纯化步骤以及其后的C18 Zip-Tip纯化，对精神分裂症特异性肽进行鉴定。通常将对照和精神分裂症组的每个CSF样本(10μl)加到Q10蛋白质芯片(pH 9.0，50mM Tris-HCl)上。根据制造商说明书，滴加5μl洗脱缓冲液(30％乙腈、50 mM乙酸钠，pH 3.0)以洗脱结合到芯片上的蛋白质/肽，并用C18 Ziptip脱盐。用0.1％甲酸/50％乙腈水溶液(2μl)洗脱肽后，进一步用MALDI质谱检测以确证精神分裂症患者CSF样本的峰。洗脱的肽也可加到连有ESI-MS/MS(Applied Biosystems，USA)的C18纳米柱上进行从头测序。
对于蛋白质标记，通过阴离子交换色谱(HyperD F；Ciphergen Biosystems；USA)以及之后的SDS-PAGE，从混合的CSF中纯化CSF蛋白。切下质量匹配的条带，通过先前描述的方法20从1/3的切下的蛋白质条带中洗脱蛋白质，以证实谱中的该质量。余下的蛋白质条带在室温下用胰蛋白酶(1∶50；Promega，UK)在凝胶原位消化过夜。然后用LC-MS/MS(Applied Biosystems，USA)对所得的肽混合物测序。
通过对比用β巯基乙醇进行芯片上还原前后的谱，证实了蛋白质的S-半胱氨酰化或S-谷胱甘肽化的同种型(它们是体内产生的同种型)的存在。简单而言，如上文所述进行CSF蛋白质和肽结合，并在最后的步骤中用100μl 1 mMHEPES(pH 7.5)洗涤每个点。然后在室温下用1/40的β巯基乙醇(1μl)将芯片上的蛋白质和肽还原30 min。每个点加1 ml的水，并蒸发。该步骤重复两次。然后再加基质，并用ProteinChip读数器(Ciphergen ProteinChip SystemSeries 4000)采集数据。
采用酶联免疫吸附测定(ELISA)对人血清样本的甲状腺激素结合蛋白进行定量分析
在进行实验前将样本从-80℃解冻并涡旋10 min。在研究者对各样本临床状况不知情的条件下测定所有样本。在完成所有的生化分析前，所有受试者的身份也是未知的，他们仅以代码表示。
用磷酸盐缓冲盐溶液(pH 7.4，Sigma，UK)将甲状腺激素结合蛋白标准品(Sigma，UK)、对照和患者来源的人血清样本稀释1000倍，然后将甲状腺激素结合蛋白标准品和样本加到ELISA Maxisorb板(NuncTM，Denmark)上，并孵育1h。所有样本均设两个重复。用洗涤缓冲液(0.03％吐温20的PBS液)洗涤后，用5％脱脂奶粉将板封闭60min。将100μl甲状腺激素结合蛋白抗体(DakoCytomation，Denmark，用2.5％脱脂奶粉以1∶500稀释)在96孔板中孵育60min。用洗涤缓冲液将板洗涤四次后，向每个孔中加入100μl二抗(抗兔HPP连接的IgG(Cell Signalling，UK；1∶2000))，并孵育60min。用洗涤缓冲液洗涤三次，然后向每个孔中加入100μl底物(TMB One溶液，Promega)，并在室温下将混合物孵育10min。在450nm对板进行读数(BIO-RAD，Model680)。
蛋白质印迹分析
用于蛋白质印迹分析的人脑样本制备和蛋白质印迹的具体操作如先前所述21。简单而言，在10％的聚丙烯酰胺凝胶上对等量的蛋白质(每个样本30μg)进行电泳分离，然后转移至硝酸纤维素膜上，之后在4℃下与溶于3％乳-PBS中的一抗(抗甲状腺激素结合蛋白，DakoCytomation)一起孵育过夜，再在室温下与二抗(HRP缀合的抗兔二抗(Cell Signaling，1∶2500))一起孵育。采用增强的化学发光(LumiGluTM，Cell Signaling)检测印迹的信号。通过丽春红(Ponseau S)染色测定蛋白质加样和转移的一致性。
统计分析
采用多变量统计分析对Ciphergen Express输出的数据进行汇总，所述多变量统计分析包括主成份分析(PCA)、偏最小二乘判别法分析(PLS-DA)和PLS。进行三次留取交叉验证(Holdout cross-validation)，从而估计PLS模型的灵敏性和特异性。在三轮留取交叉验证的每一轮中，随机选出三分之一的样本构成验证数据，其他样本用作训练数据。用SIMCA-P+10(Umetrics AB，Sweden)进行所有的多变量分析。灵敏性被定义为检测到的实际阳性数与所有阳性数的比例，特异性被定义为被检测到的实际阴性数与所有阴性数的比例。如果合适，采用Statistical Package for Social Scientists(SPSS/PC+；SPSS，Chicago)进行t检验。
首次发病且未经用药的偏执型精神分裂症患者中的CSF蛋白质/肽谱的改变
在第一组实验中，使用SELDI质谱法检测来自41名首次发病且未经用药的偏执型精神分裂症患者和40名人口统计学上匹配的健康志愿者的CSF样本的蛋白质/肽谱图。用Q10芯片(强阴离子交换物)在pH 9.0分析CSF蛋白质和肽。健康志愿者的CSF蛋白质/肽分析图示于图5A中。在该Q10蛋白芯片结合条件下，可容易地检测到信噪比大于5的约75个峰。基于CSF样本的SELDI谱的PLS-DA评分图表明，健康志愿者和首次发病且未经用药的偏执型精神分裂症患者之间存在明显差异(图5B和C)。采用主成份分析也得到了类似的结果(数据未示出)。输出载荷图表明，13,600-14,000 Da处的峰簇明显减弱。该基于留取交叉验证的模型的灵敏性和特异性分别为80％和95％(表7)。
13.6-14kDa蛋白质簇被鉴定为甲状腺激素结合蛋白
13.6-14.1 kDa之间的蛋白质簇包括四个峰(图6B)，在首次发病且未经用药的精神分裂症患者CSF中，其中的三个峰均下调(p＜0.01；图6B，下图)。研究表明，这些峰可能来自甲状腺激素结合蛋白的S半胱氨酰化或S-谷胱甘肽化的衍生物22，23，一种将甲状腺素从血流转运至脑中的甲状腺激素结合蛋白。室温下用β巯基乙醇进行的CSF肽/蛋白质的芯片上还原表明，13,741、13,875和13,923Da这三个峰被还原合并为一个单峰(图6C)，这证明了它们是来自同一蛋白质。为鉴定该蛋白质，将来自健康志愿者和精神分裂症患者的一对CSF样本加到阴离子交换柱上(HyperD)，并用pH 9至pH 3的缓冲液洗脱。约13-15kDa的主条带在pH3级分中洗脱出(图6D，左图)。通过洗脱该条带的蛋白并在NP20芯片上操作后进行质量匹配(图66E)，证实了该条带是SELDI谱中约13.6-14 kDa的峰簇。然后用胰蛋白酶消化该蛋白质，并用LC-MS/MS测序。该蛋白质被鉴定为甲状腺激素结合蛋白(图6D，右图)。
精神分裂患者中前额皮质组织中以及相同受试者的血清样本中的甲状腺激素结合蛋白下调
据估计，脑室CSF中3％的甲状腺激素结合蛋白以及腰椎CSF中10％的甲状腺激素结合蛋白都来自血液。为了评价血液甲状腺激素结合蛋白对于精神分裂症CSF中该蛋白的变化的影响，利用ELISA研究了图5和8(人口统计学信息参见表4和5)研究的相同个体(在收集CSF的同时)的血清甲状腺激素结合蛋白水平。发现精神分裂症患者的血清甲状腺激素结合蛋白与对照相比有适当但明显的减少(减少15％，p＝0.0007，t检验)(图7A)。然而，还发现相同个体的CSF和血清甲状腺激素结合蛋白水平之间没有相关性，这表明CSF和血清中的甲状腺激素结合蛋白水平是独立地受到调控的(图7B)。CSF和血清样本中的甲状腺激素结合蛋白水平均下降。但CSF甲状腺激素结合蛋白水平与血清甲状腺激素结合蛋白水平之间没有相关性。
值得注意的是，通过蛋白质印迹发现，精神分裂症患者的尸体前额皮质中的甲状腺激素结合蛋白与对照相比下调约40％(图7C)。
独立样本组的蛋白质/肽生物标记的验证
利用独立样本组对图5的生物标记模型进行了验证，该样本组有另18名首次发病且未经用药的精神分裂症患者和40名人口统计学上匹配的健康患者构成。利用与先前所述实验中相同的条件处理这些样本。PLS-DA评分和输出载荷图显示出与图5非常相似的结果，含有13,600-14,000的蛋白簇(图8)。这表明，CSF蛋白和肽中这些识别出的改变是一个稳定的发现，因此可真实地反映出精神分裂症的早期病理生理学状况。该模型的灵敏性和特异性分别为95％和98％(表7)。
实施例2的讨论
对总共81个CSF样本(精神分裂症41个，对照40个)的SELDI谱的初步分析表明，偏执型精神分裂症首次发作且未经用药的患者的样本分布情况与健康志愿者样本不同(图5B、5C和5D)。发现偏执型精神分裂症患者中CSF的蛋白质/肽发生特征性改变，最重要的改变是约14kDa的甲状腺激素结合蛋白下调。这些精神分裂症特异性蛋白质/肽的改变，在相同条件下的独立样本组(n＝58)中可以得到重现/验证(图8)。两个实验均分别达到了相当高的特异性(95/98％，实际阴性率)和灵敏性(80/90％)(表7)。这表明对照样本几乎不具有精神分裂症组的峰簇(图5B和5C)。为了实现高诊断有效性并由此实现治疗干预，准确识别出实际患有该疾病的那些个体最为关键。
在精神分裂症首次发病的患者的CSF中观察到了适中但稳定的减少。从本研究中CSF样本所属的相同个体中收集血清样本，其ELISA结果表明血清中甲状腺激素结合蛋白水平下降约15％(p＝0.0007，t test；图7A)，但血清甲状腺激素结合蛋白的水平与来自CSF甲状腺激素结合蛋白的SELDI信号没有相关性，这表明来自肝的甲状腺激素结合蛋白对于CSF中的蛋白下调并未起作用(图7B)。分离的绵羊脑的灌注实验表明，所有新合成的甲状腺激素结合蛋白都是从脉络膜分泌到脑室中的。该蛋白质的合成需要甲状腺素的转运16。因此，精神分裂症患者CSF中的甲状腺激素结合蛋白水平降低表明脑中甲状腺素转运减少。本研究中发现的精神分裂症患者尸体脑组织中甲状腺激素结合蛋白下调的这一结果(图7C)确实也支持了上述观点。需要注意的是，甲状腺素功能障碍在精神分裂症患者24，25、实际上还在其他精神障碍患者26中相对普遍，它可能是在遗传上与这些疾病相关联。此外，患有严重的甲状腺功能减退症和甲状腺功能亢进症的患者，可能产生精神障碍症状，其临床表现常与精神分裂症相似27，这表明可能与CNS甲状腺素功能增强有关。引人注意的是，已证明对大鼠的长期氯氮平给药可诱导其海马和大脑皮质中的甲状腺激素结合蛋白表达18，根据本发明的研究结果，这表明氯氮平可增强CNS甲状腺素功能，该结果支持了在精神分裂症病理生理力学早期，甲状腺激素结合蛋白的临床意义。
SELDI质谱的应用可为偏执型精神分裂症提供有效的早期诊断手段。
实施例3
临床样本
本研究的包括样本采集和分析方法在内的研究方案获得了伦理委员会的批准。所有研究参与人员签署了书面知情同意书，所有临床研究都是根据赫尔辛基宣言中描述的原则进行。从诊断为偏执型精神分裂症的首次发作且未经用药的患者，或者由持续患病所致的短暂精神障碍的患者(DSM-IV 295.30或298.8，CSF n＝41，血清n＝35；表8)，以及从人口统计学上匹配的健康志愿者(CSF n＝80，血清n＝63；表8)中收集CSF和血清样本。
获得了新冷冻的前额皮质组织(第9大脑视区；8名精神分裂症患者，8名良好匹配的对照个体)和肝样本(15名精神分裂症患者和15名良好匹配的对照)，以进行尸体解剖研究。人口统计学详情列于表8中。
为了继续进行红细胞(RBC)实验，采用相同的样本采集方法从两个中心收集总共40个血液样本(7个首次发病且未经用药的精神分裂症患者和13个用非典型抗精神病药物治疗的精神分裂症患者，以及20个人口统计学上相匹配的健康志愿者，人口统计学详情参见表8)。
表8精神分裂症受试者和对照受试者的人口统计学详情
Figure A20068004667100581
RBC样本的制备
将血液样本收集到抗凝EDTA管中，然后分离细胞并提取蛋白质(见下文)。用40mlPBS稀释40ml新收集的血液以纯化RBC。将稀释的血液轻轻覆于半容积(half volume)的密度梯度分离介质(-1077，Sigma)上，并以750xg离心10min。然后收集管底的分离的RBC，并冷冻于-80℃。在4℃下用红细胞裂解缓冲液(Qiagen，UK)以1∶5的比例裂解红细胞15分钟。通过用100mM的醋酸铵甲醇溶液在-20℃进行沉淀来提取蛋白质，并将其重悬于含有完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Switzerland)和磷酸酶抑制剂(1mM焦磷酸钠、1mM原钒酸钠、10mM β-磷酸甘油酯和50mM氟化钠)的ASB14缓冲液(8 M尿素、2％ASB14、5 mM醋酸镁、20 mM Tris-HCl、1％Triton-X100，pH 8)中。用去污剂相容性蛋白质测定试剂盒(BioRes)测定蛋白质浓度。用
Figure A20068004667100583
IEFFractionator(Invitrogen)先将RBC蛋白组中高含量的蛋白质血红蛋白预分级分离。该方法简单方便，可根据液相等电聚焦法(IEF)利用等电点(pi)重复地对细胞裂解物分级分离。弃去含Hb的、pi在6.2-10之间的分级分离到的蛋白。混合每个患者/对照个体的余下的级分(pi 3-6.2)，用醋酸铵沉淀法再次提取蛋白质，并进行二维DIGE分析。
二维DIGE分析
用24cm、pH 4-7的IDG DryStrip对肝样本进行二维DIGE分析。详细操作过程如先前所述(18)。
通过SELDI-TOF分析法和蛋白质生物标记鉴定分析CSF蛋白
将每个CSF样本(5μl)加到在不同pH条件下具有不同化学性质的芯片上。基于分离峰的数目和分离度，选择的最佳条件为在pH9.0下，在强阴离子交换Q10芯片上进行。简单来说，在室温下，在振摇器(频率＝600rpm)上用结合缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 9.0)预激活各阵列点两次。将50μl结合缓冲液加到每个点上，然后加入5μl CSF样本。室温下将蛋白质芯片在振摇器上孵育60min，然后用结合缓冲液洗涤芯片两次，用H2O洗涤一次，然后风干。然后用0.6μl含100％饱和的芥子酸(3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)的50％乙腈溶液和0.5％三氟乙酸依次处理芯片两次。用Ciphergen ProteinChip读数器(Ciphergen ProteinChip System Series 4000)分析芯片。每个样本分析两次以确定差异表达蛋白鉴定的重现性。以1800个任意单位的激光强度用平均254个激光点生成蛋白质/肽的质谱。为采集数据，检测大小的范围在3至200kD。在10kDa聚焦激光。根据外部校正标准(Ciphergen Biosystems；USA)确定阵列表面俘获的每种蛋白的质荷比(m/z)：牛胰岛素(5,733.6Da)、人泛素(8,564.8Da)、牛细胞色素c(12,230.9Da)、牛超氧化物歧化酶(15,591.4Da)、辣根过氧化物酶(43,240Da)和BSA(66,410Da)。用PROTEINCHIP数据分析软件(3.0版)和Ciphergen Express软件3.0(Ciphergen Biosystems；USA)分析数据。用Ciphergen Express软件3.0对所有谱进行编译和自动检测定量的质谱峰。通过质量窗为0.2％的二次峰筛选来标记峰，并加入估计的峰。用Ciphergen Express Software 3.0对峰信息进行统计分析。
为鉴定蛋白质标记，通过阴离子交换色谱(HyperD F；CiphergenBiosystems；USA)以及之后的SDS-PAGE，从混合的CSF中纯化CSF蛋白。从凝胶上切下与SELDI峰相对应的预期条带，将该凝胶条带在室温下用胰蛋白酶(1∶50；Promega，UK)进行凝胶原位消化过夜。然后用LC-ESI-MS/MS(QSTAR，Applied Biosystems，USA)对所得的肽混合物分析，并用Mascot软件搜索数据库以鉴定蛋白质。为证明该凝胶带为目的蛋白质，进行了抗体俘获实验。简单而言，根据制造商说明书，将2μl抗体(0.2mg/ml)偶联到RS100反应芯片表面上，然后在室温下用2M Tris-HCl(pH8.0)进行封闭。然后将5μl的CSF样本直接加到偶联有或者未偶联抗体的点上，并孵育1小时。用10μl HEPES缓冲液(50mM，pH7.2)洗涤5次后，用Ciphergen ProteinChip System Series4000分析芯片。
蛋白质印迹
脑组织的蛋白质印迹分析如先前所述(32)。简单而言，先测定蛋白质浓度，然后用样品缓冲液(Invitrogen)稀释样本至4mg/ml的终浓度。向每个孔中加30μg蛋白质，并在4％-12％SDS预制凝胶(Invitrogen)上分离，同时以ApoA1标准品(Sigma)作为阳性对照。室温下将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。该硝酸纤维素膜与封闭溶液(5％脱脂奶粉)一起在室温下孵育60分钟，然后在4℃下与抗人ApoA1多克隆抗体(1∶1000)(CalBiochem)一起孵育过夜。用洗涤缓冲液将膜洗涤四次，再与辣根过氧化物酶缀合的二抗(Cell Signalling，1∶5000)在室温下孵育1小时。用化学发光显像法(GE Heathcare)显示信号。
ELISA
将血清样本随机化，在完成所有生物化学分析前，所有受试者的身份均未知，并以代码表示。将患者和对照受试者的人血清样本以及ApoA1标准品(Sigma，UK)用磷酸盐缓冲盐溶液(pH 7.4，Sigma，UK)以1∶1000稀释。然后将ApoA1标准品和样本加到ELISA Maxisorb板(NuncTM，Denmark)上，并孵育1h。用洗涤缓冲液(0.03％吐温20的PBS液)洗涤后，用溶于PBS的干5％脱脂奶粉将板封闭60分钟。将100μl ApoA1一抗(兔)(CalBiochem，UK；1∶1000)在96孔板中孵育60分钟。用洗涤缓冲液将板洗涤四次后，向每个孔中加入100μl抗兔二抗(Cell Signalling，UK；1∶2000)，并孵育60分钟。所有孵育过程均在振摇器(600rpm)上在室温下进行。最后，用洗涤缓冲液洗涤四次，然后向每个孔中加入100μl底物(TMB One溶液，Promega)，并在室温下将混合物孵育10min。在450nm用板读数器(BIO-RAD，Model 680)对板进行读数。用Statistical Package for Social Scientists(SPSS/PC+；SPSS，Chicago)通过t检验对血清样本统计分析。所有测量值均在独立实验中进行重复测量。
表9
精神分裂患者和对照受试者的CSF、尸体脑、肝组织、RBC和血清中ApoA1的表达情况小结
Figure A20068004667100611
*p值来自student t检验。
实施例4
最初是在首次发病且未经用药的精神分裂症患者的CSF中鉴定出ApoA1(载脂蛋白A1)和TTR(甲状腺激素结合蛋白)的改变。这两者在CSF中均被发现显著下调。
本实施例研究了血清中ApoA1和TTR的变化。因此，建立了针对这两种蛋白的ELISA测定，对27个精神分裂症(首次发病且未经用药)血清样本和48个健康志愿者血清样本进行了研究。发现在精神分裂症血清中这两种蛋白质均显著减少(apoA1：约18％，p＝0.00039；TTR：约15％，p＝0.0007)。参见图13。
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<400>1
Pro Leu Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile
1               5                   10                  15
Asn Val Ala Val His Val Phe Asp Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu
            20                   25                 30
Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu
        35                  40                  45
Thr Thr Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp
    50                  55                  60
Thr Lys Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His
65                  70                  75                  80
Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr
                85                  90                  95
Ile Ala Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val
            100                 105                 110
Thr Asn Pro Lys Glu
        115
<210>2
<211>267
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>2
Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser
1               5                   10                  15
Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp
            20                  25                  30
Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp
        35                  40                  45
Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys
    50                  55                  60
Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr
65                  70                  75                  80
Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp
                85                  90                  95
Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys
            100                 105                 110
Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe
        115                 120                 125
Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu
    130                 135                 140
Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu
145                 150                 155                 160
Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala
                165                 170                 175
Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp
            180                 185                 190
Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn
        195                 200                 205
Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu
    210                 215                 220
Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln
225                 230                 235                 240
Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala
                245                 250                 255
Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln
            260                 265

Claims (75)

1.一种诊断或监测受试者精神障碍的方法，包括：
(a)提供来自所述受试者的样本，
(b)对所述样本进行波谱分析以提供一个或多个谱，和
(c)将所述的一个或多个谱与一个或多个对照谱进行比较。
2.权利要求1的方法，其中所述波谱分析通过NMR波谱法进行。
3.权利要求1或2的方法，其中所述波谱分析通过1H NMR波谱法进行。
4.前述任一项权利要求的方法，其中所述的一个或多个对照谱包括正常对照谱。
5.前述任一项权利要求的方法，其中所述的一个或多个对照谱包括精神障碍对照谱。
6.前述任一项权利要求的方法，其中所述比较包括将样本谱归类为正常图谱、精神障碍图谱或具有精神障碍倾向的图谱。
7.前述任一项权利要求的方法，其中所述比较包括一种或多种化学计量学分析。
8.前述任一项权利要求的方法，其中所述比较包括模式识别分析。
9.权利要求8的方法，其中所述模式识别分析通过一种或多种监督的和/或非监督的方法进行。
10.权利要求9的方法，其中所述的一种或多种非监督的方法选自主成份分析(PCA)法、非线性作图(NLM)法和聚类法。
11.权利要求9或10的方法，其中所述的一种或多种监督的方法选自独立软模式分类法、偏最小二乘(PLS)法、k最近邻分析法和神经网络法。
12.前述任一项权利要求的方法，包括进行波谱分析以提供在两个或多个时间点从受试者获取的样本的谱。
13.权利要求12的方法，包括对在两个或多个时间点从受试者获取的样本的谱进行比较。
14.前述任一项权利要求的方法，其中所述比较包括对所述谱中存在的一种或多种生物标记的变化进行评估。
15.一种诊断或监测受试者精神障碍的方法，包括
(a)提供来自受试者的样本，
(b)对所述样本进行波谱分析以提供一个或多个谱，
(c)对所述的一个或多个谱进行分析以检测所述一个或多个谱中存在的一种或多种生物标记的水平，和
(d)将所述的一个或多个谱中检测到的所述一种或多种生物标记的水平与对照谱中检测到的所述一个或多个生物标记的水平进行比较。
16.权利要求15的方法，包括对在两个或多个时间点从受试者获取的样本的谱进行分析，从而对所述样本中存在的一种或多种生物标记进行定量，并比较所述样本中存在的一种或多种生物标记的水平。
17.权利要求14至16任一项的方法，还包括对在两个或多个时间点从受试者获取的样本中的所述一种或多种生物标记水平的变化进行检测。
18.前述任一项权利要求的方法，其中所述一种或多种生物标记选自包括SEQID NO：1或其片段的甲状腺激素结合肽、包括SEQ ID NO：2或其片段的ApoA1肽、VLDL、LDL和芳香类物质例如血浆蛋白质。
19.一种诊断或监测精神障碍或精神障碍倾向的方法，包括测量从受试者获取的样本中存在的一种或多种生物标记的水平，所述生物标记选自包括SEQID NO：1或其片段的甲状腺激素结合肽、包括SEQ ID NO：2或其片段的ApoA1肽、VLDL、LDL和芳香类物质例如血浆蛋白质。
20.一种监测一种疗法对患有、疑似患有或易患有一种精神障碍的受试者的有效性的方法，包括权利要求19的方法。
21.权利要求19或20的方法，包括对在两个或多个时间点从受试者获取的样本中存在的一种或多种生物标记的水平进行测量。
22.权利要求21的方法，包括对在两个或多个时间点从受试者获取的样本中存在的一种或多种生物标记的水平进行比较。
23.权利要求19-21任一项的方法，包括将从受试者获取的样本中的一种或多种生物标记水平，与开始治疗前从受试者获取的一个或多个样本中存在的水平和/或在治疗早期从受试者获取的一个或多个样本中存在的水平相比较。
24.权利要求19-23任一项的方法，包括对在两个或多个时间点获取的样本中的一种或多种生物标记的量的变化进行检测。
25.权利要求19-24任一项的方法，其中所述治疗为抗精神障碍治疗。
26.权利要求19-25任一项的方法，包括将一个样本中存在的一种或多种生物标记的量与一个或多个对照中的水平进行比较。
27.权利要求26的方法，其中所述对照为正常对照和/或精神障碍对照。
28.权利要求14-27任一项的方法，其中所述的一种或多种生物标记的水平通过NMR波谱分析检测。
29.权利要求14-28任一项的方法，其中所述的一种或多种生物标记的水平通过一种或多种选自以下的方法检测：NMR、SELDI(-TOF)、MALDI(-TOF)、基于一维凝胶的分析、基于二维凝胶的分析、质谱(MS)和基于LC-MS的技术。
30.权利要求14-28任一项的方法，其中所述的一种或多种生物标记的水平通过一种或多种选自以下的方法检测：直接的或间接的、偶联的或非偶联的酶学方法、电化学技术、分光光度技术、荧光技术、发光技术、光谱测定技术、旋光技术和色谱技术或免疫方法例如ELISA。
31.权利要求14-30任一项的方法，其中所述生物标记为VLDL和/或LDL，其水平通过一种或多种选自以下的方法检测：液相化学方法、用于脂蛋白分离的物理方法、酶法测定。
32.权利要求14-31任一项的方法，其中所述的血浆蛋白质水平通过一种或多种选自紫外吸收法和比色法的方法检测。
33.权利要求14-32任一项的方法，其中所述的一种或多种生物标记的水平通过一种传感器或生物传感器检测，所述传感器或生物传感器包括一种或多种用于直接或间接检测所述生物标记的酶、结合蛋白、受体蛋白或转运蛋白、抗体、合成受体或其他选择性结合分子，所述检测与电换能器、光换能器、声换能器、磁换能器或热换能器偶联。
34.前述任一项权利要求的方法，其中所述样本选自全血、血清、血浆或它们的提取物或纯化物，或者它们的稀释物。
35.前述任一项权利要求的方法，包括对从受试者获取的另一样本中的一种或多种生物标记进行定量。
36.权利要求35的方法，其中所述的另一生物样本选自CSF、尿、唾液或其他体液、或呼出气、呼出气凝结物，或它们的提取物或纯化物，或者它们的稀释物。
37.前述任一项权利要求的方法，其中所述受试者为未经用药的受试者。
38.前述任一项权利要求的方法，其中所述精神障碍为精神分裂性障碍。
39.权利要求38的方法，其中所述精神分裂性障碍选自偏执型精神分裂症、紧张型精神分裂症、错乱型精神分裂症、混合型精神分裂症和残留型精神分裂症。
40.权利要求1-37任一项的方法，其中所述精神障碍为双相型障碍。
41.前述任一项权利要求的方法，还包括所述受试者的临床评估或自我评估。
42.权利要求41的方法，其中所述临床评估为SCID或整体功能评分评估。
43.权利要求41或42的方法，其中所述评估在收集受试者的样本的同时或邻近收集受试者的样本时间前后进行。
44.前述任一项权利要求的方法，其中所述受试者为女性受试者。
45.一种监测一种治疗物质对患有、疑似患有或易患有精神障碍的受试者的疗效的方法，包括权利要求1-36任一项的方法的步骤。
46.一种识别一种抗精神病物质的方法，包括权利要求1-36任一项的方法的步骤。
47.一种识别一种促精神病物质的方法，包括权利要求1-36的方法的步骤。
48.权利要求45-47任一项的方法，包括将从所述受试者样本中获取的一种或多种生物标记的水平，与给予所述物质前从所述受试者获取的一个或多个样本和/或在用所述物质治疗的早期从所述受试者获取的一个或多个样本中存在的水平进行比较。
49.一种精神障碍传感器，所述精神障碍传感器能够对一种或多种选自下列的生物标记进行定量：包括SEQ ID NO：1或其片段的甲状腺激素结合肽、包括SEQ ID NO：2或其片段的ApoA1肽、VLDL、LDL和芳香类物质例如血浆蛋白质。
50.权利要求49的传感器，其中所述的一种或多种生物标记可通过一种或多种选自下列的方法定量：直接的、间接的或偶联的酶学技术、分光光度技术、荧光技术、发光技术、光谱测定技术、旋光技术和色谱技术。
51.权利要求49或50的传感器，包括一种用于直接或间接检测一种或多种生物标记的选自下列的组分：酶、结合蛋白、受体蛋白或转运蛋白、抗体或其片段、合成受体或其他选择性结合分子，所述组分与电换能器、光换能器、声换能器、磁换能器或热换能器相偶联。
52.一种阵列或多分析物面板，所述阵列或多分析物面板能够检测一种或多种权利要求49中定义的生物标记。
53.一种或多种权利要求49定义的生物标记用于诊断和/或监测精神障碍的用途。
54.一种识别一种能够调节精神障碍的物质的方法，包括将待测物质给予受试者，并检测从所述受试者获取的样本中的一种或多种权利要求49定义的生物标记的水平。
55.权利要求54的方法，其中所述样本选自：全血、血清、血浆或它们的提取物或纯化物，或者它们的稀释物。
56.一种配体，所述配体能够与权利要求49定义的肽生物标记特异性结合。
57.权利要求56的配体，所述配体包括肽或适体。
58.权利要求56的配体，所述配体为抗体。
59.权利要求58的配体，其中所述抗体为单克隆抗体。
60.权利要求56的配体，所述配体不是本申请中所列的配体。
61.权利要求56-60任一项的配体，所述配体用可直接或间接检测的标记进行标记。
62.权利要求61的配体，其中所述的可检测标记为发光标记、荧光标记、酶标记或放射性标记。
63.权利要求56-62任一项的配体，所述配体用亲和标签标记。
64.一种传感器，所述传感器包括权利要求56-63任一项的配体。
65.一种阵列，所述阵列包括权利要求56-63任一项的配体。
66.一种识别一种能够刺激、促进或激发权利要求49定义的肽生物标记产生的物质的方法，包括将一种待测物质给予受试动物，并对所述受试者中存在的所述肽生物标记进行检测和/或定量。
67.一种识别一种能够刺激、促进或激发权利要求49定义的甲状腺激素结合肽生物标记产生的物质的方法，包括使测试细胞接触待测物质，并监测所述测试细胞内的或由所述测试细胞分泌的肽的水平。
68.权利要求67的方法，其中所述测试细胞为真核细胞。
69.权利要求67或68的方法，其中所述真核细胞为酵母细胞、昆虫细胞、果蝇细胞、两栖动物细胞(来自非洲蟾蜍(Xenopus)或线虫(C.elegans)细胞，或者为人类、非人类的灵长类、马、牛、猪、山羊、绵羊、犬、猫、鱼、啮齿类或鼠来源的细胞。
70.权利要求67-69任一项的方法，其中所述动物或细胞为经过基因工程改造的能够表达所述肽的非人类动物或细胞。
71.一种识别一种能够与权利要求49定义的肽生物标记结合的配体的方法，包括在有所述肽存在且适于结合的条件下孵育待测物质，并对所述肽与所述待测物质的结合进行检测和/或定量。
72.一种识别一种能够与权利要求49定义的肽生物标记特异性结合的配体的方法，包括在有所述肽存在的条件下孵育待测物质，并对所述肽与所述待测物质的特异性结合进行检测和/或定量。
73.权利要求56-63和66-72任一项的物质或配体用于治疗精神障碍或精神障碍倾向的用途。
74.权利要求56-63和66-72任一项的物质或配体用于制备治疗精神障碍或精神障碍倾向的药物的用途。
75.前述任一权利要求的发明，其中所述生物标记被使用，并且为所述肽生物标记的组合。
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