CN117590006B - 生物标志物在制备诊断Vogt-小柳原田综合征的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种生物标志物在制备诊断Vogt‑小柳原田综合征的产品中的应用，所述的生物标志物包括APOH和/或STXBP1，优选还包含DNAJC13、PKHD1L1或TTYH1中的一种或两种以上，通过检测本发明所述生物标志物的有无或其蛋白的表达量，可以有效诊断Vogt‑小柳原田综合征。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种生物标志物在制备诊断Vogt-小柳原田综合征的产品中的应用。
背景技术
Vogt-小柳原田综合征（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome，VKH）是一种多系统的自身免疫性疾病，以反复发作的双侧肉芽肿性葡萄膜炎伴有眼底改变为典型特征，是常见葡萄膜炎类型之一，部分病例还可有皮肤和毛发改变、听觉异常、中枢神经系统受累等改变。目前，可以通过临床特征和眼部相关检查来诊断该疾病。然而，仍存在部分病例因病因未知或临床表现不典型，导致错过治疗的最佳时机而致盲。鉴于VKH是一个多因素疾病，开发新型生物标志物将有助于早期诊断和精准治疗。
蛋白质是执行生物体生命活动的基础，不同疾病的严重程度不同，这会导致体内蛋白质的组成和表达发生变化。蛋白质组学是涉及识别和量化细胞、组织或生物体中存在的全部蛋白质含量的技术的应用，在医学领域中，蛋白质组学技术被广泛应用于多个方面，其中包括检测诊断标记物、疾病机制研究以及药物研发与个体化治疗等。在临床上，血浆具有取材方便，非侵入性，创伤小的优点，可应用于实时动态个体化诊疗中。许多研究结果表明，血浆中含有丰富的蛋白质，可用于蛋白质组学研究。然而，在实际应用中，由于存在高丰度蛋白质且蛋白丰度的动态波动范围较大，常导致检测结果不尽如人意。随着基于质谱(MS)的蛋白质组学技术和生物信息学的发展，越来越多的生物标志物被发现，目前的技术已经可以在血浆中识别超过1,000种蛋白质，甚至可以超过5000种蛋白质。因此这一方法有助于发现患者血浆中随眼部变化发生改变的标志物，协助疾病的诊断，探究疾病的发病机制。
发明内容
本发明提供了一种通过SWATH‐MS技术对包括健康对照在内的白塞氏病葡萄膜炎、后巩膜炎和Vogt-小柳原田综合征（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome，VKH）患者的血浆中的蛋白质进行鉴定。通过生物信息学的方法筛选出潜在生物标志物，包括APOH、STXBP1、DNAJC13、PKHD1L1和TTYH1，并进一步选择另一组样本队列，示例性的使用ELISA对APOH和STXBP1进行验证，确定使用本发明所述的生物标志物可有效诊断Vogt-小柳原田综合征，AUC值可达0.765。具体的：
本发明的第一方面，提供了一种生物标志物在制备诊断和/或预后评估Vogt-小柳原田综合征的产品中的应用，所述的生物标志物包括APOH和/或STXBP1。
优选的，所述的生物标志物还包括DNAJC13、PKHD1L1或TTYH1中的一种或两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的应用为：APOH和/或STXBP1作为生物标志物在制备诊断和/或预后评估Vogt-小柳原田综合征的产品中的应用。
所述的生物标志物为血浆中的生物标志物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的应用为：血浆中的APOH和/或STXBP1作为生物标志物在制备诊断和/或预后评估Vogt-小柳原田综合征的产品中的应用。
优选的，所述的生物标志物为蛋白。
其中，各生物标志物的缩写与全称对照见表1。
表1
优选的，所述的诊断和/或预后评估Vogt-小柳原田综合征包括检测生物标志物的有无或其蛋白的表达量。
进一步优选的，所述的诊断和/或预后评估Vogt-小柳原田综合征还包括在检测生物标志物的有无或其蛋白的表达量后，将其与阈值比较，所述的阈值为前期实验获得，即通过实验及数据分析在Vogt-小柳原田综合征中与健康人或其他眼部疾病（所述的其他眼部疾病优选包括白塞氏病葡萄膜炎、后巩膜炎、强直性脊柱炎引起的葡萄膜炎、Fuchs综合征、交感性眼炎或特发性葡萄膜炎中的一种或两种以上）中，生物标志物的差异程度确定阈值。
当上述的生物标志物的蛋白表达量与阈值具有差异或显著差异（差异具有统计学意义，例如p<0.05，p<0.01，p<0.001，p<0.0001）时，则诊断为患Vogt-小柳原田综合征。例如：
1）APOH蛋白的表达量高于阈值或显著高于阈值时；
2）STXBP1蛋白的表达量低于阈值或显著低于阈值时；
3）PKHD1L1蛋白的表达量低于阈值或显著低于阈值时；
4）TTYH1蛋白的表达量高于阈值或显著高于阈值时；
5）DNAJC13蛋白的表达量高于阈值或显著高于阈值时。
优选的，所述的检测的方法包括但不限于质谱、液相或ELISA。
优选的，所述的检测包括使用试剂。
优选的，所述的产品包括检测样本中生物标志物的试剂。
优选的，所述的样本为血浆样本。
优选的，所述的产品包括但不限于生物芯片（优选为蛋白芯片）、试纸、膜条、设备或诊断试剂盒，优选的，所述的设备可以选自液相或质谱。
本发明的第二方面，提供了一种生物标志物在构建Vogt-小柳原田综合征的诊断模型中的应用，所述的生物标志物包括APOH和/或STXBP1。
优选的，所述的生物标志物还包括DNAJC13、PKHD1L1或TTYH1中的一种或两种以上。
优选的，所述的诊断模型包括检测生物标志物的试剂。
本发明的第三方面，提供了一种Vogt-小柳原田综合征的诊断模型，所述的诊断模型包括检测生物标志物的试剂。
本发明的第四方面，提供了一种诊断和/或预后评估Vogt-小柳原田综合征的方法，所述的方法包括检测受试者样本中生物标志物的有无或其蛋白的表达量，所述的生物标志物包括APOH和/或STXBP1。
优选的，所述的生物标志物还包括DNAJC13、PKHD1L1或TTYH1中一种或两种以上。
优选的，对检测的相关限定同本发明的第一方面。
本发明的第五方面，提供了一种诊断Vogt-小柳原田综合征的蛋白芯片、试纸、膜条、设备或诊断试剂盒，所述的蛋白芯片、试纸、膜条、设备或诊断试剂盒中包括检测受试者样本中生物标志物的有无或其蛋白的表达量的试剂，所述的生物标志物包括APOH和/或STXBP1。
优选的，所述的生物标志物还包括DNAJC13、PKHD1L1或TTYH1中一种或两种以上。
本发明的第六方面，提供了一种生物标志物在制备区分Vogt-小柳原田综合征与后巩膜炎或与其他葡萄膜炎的产品中的应用，所述的生物标志物包括APOH和/或STXBP1。
优选的，所述的生物标志物还包括DNAJC13、PKHD1L1或TTYH1中一种或两种以上。
其中，生物标志物在Vogt-小柳原田综合征中的表达量，与在其他葡萄膜炎和后巩膜炎中的表达量具有差异或显著差异（差异具有统计学意义，例如p<0.05，p<0.01，p<0.001，p<0.0001），例如：
与其他葡萄膜炎和后巩膜炎的患者相比，在Vogt-小柳原田综合征的患者中：
1）APOH蛋白高表达或显著高表达；和/或，
2）STXBP1蛋白低表达或显著低表达。
优选的，所述的其他葡萄膜炎包括白塞氏病葡萄膜炎、强直性脊柱炎引起的葡萄膜炎、Fuchs综合征、交感性眼炎或特发性葡萄膜炎中的一种或两种以上。
本发明的第七方面，提供了一种区分Vogt-小柳原田综合征与其他葡萄膜炎和后巩膜炎的方法，所述的方法包括检测受试者样本中生物标志物的有无或表达量。
优选的，所述的其他葡萄膜炎包括白塞氏病葡萄膜炎、强直性脊柱炎引起的葡萄膜炎、Fuchs综合征、交感性眼炎或特发性葡萄膜炎中的一种或两种以上。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明术语“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明术语“诊断”是指以查明患者是否患有疾病或病症。
本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应。
本发明所述的“受试者”包括人。
本发明的有益效果：1）本发明通过SWATH-MS技术对健康对照、白塞氏病葡萄膜炎患者、后巩膜炎患者和Vogt-小柳原田综合征患者的血浆中的蛋白质进行鉴定，结合生物信息学方法筛选出5种Vogt-小柳原田综合征的生物标志物；2）ELISA进一步对生物标志物进行验证，APOH和STXBP1在Vogt-小柳原田综合征与后巩膜炎或与其他葡萄膜炎中的表达量显著不同，可以作为区分Vogt-小柳原田综合征与后巩膜炎或与其他葡萄膜炎的生物标志物；3）本发明筛选获得的APOH和/或STXBP1作为生物标志物用于诊断Vogt-小柳原田综合征具有较高的灵敏度和特异度，具有优异的临床诊断意义。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：SWATH-MS定量结果图；
图2：PLS-DA分类结果；
图3：GSEA富集分析结果；
图4：VKH组与健康对照组的差异蛋白的火山图；
图5：VKH组与健康对照组、白塞氏病葡萄膜炎组、后巩膜炎组的差异蛋白的韦恩图，其中，C-V表示健康对照组与VKH组的差异蛋白数量，B-V表示白塞氏病葡萄膜炎组与VKH组的差异蛋白数量，S-V表示后巩膜炎组与VKH组的差异蛋白数量；
图6：血浆中APOH蛋白在VKH组、健康对照组、白塞氏病葡萄膜炎组、后巩膜炎组中的质谱定量结果；
图7：血浆中STXBP1蛋白在VKH组、健康对照组、白塞氏病葡萄膜炎组、后巩膜炎组中的质谱定量结果；
图8：血浆中APOH蛋白在VKH组、健康对照组、白塞氏病葡萄膜炎组、后巩膜炎组中的ELISA结果；
图9：血浆中STXBP1蛋白在VKH组、健康对照组、白塞氏病葡萄膜炎组、后巩膜炎组中的ELISA结果；
图10：使用APOH诊断VKH的ROC曲线；
图11：使用STXBP1诊断VKH的ROC曲线；
图12：联合使用APOH和STXBP1诊断VKH的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请中各实施例涉及的实验对象及试验方法如下：
1、实验对象
本研究得到天津医科大学眼科医院伦理委员会的批准。天津医科大学眼科医院的纳入研究患者均签署知情同意书。选择从2018年1月至2022年10月在眼科医院接受治疗的白塞氏病葡萄膜炎、VKH和后巩膜炎患者作为实验组，同时招募了另一健康队列作为对照组。
1.1实验组纳入标准：
1）患有自身免疫性葡萄膜炎患者（包括白塞氏病葡萄膜炎、Vogt-小柳原田综合征）以及伴/不伴有球壁病变的后巩膜炎；
2）年龄在16-70岁之间；
3）无糖尿病、高血压、高血脂、心血管疾病、精神疾病等，无全身器质性病变；
4）无眼球穿通伤和内眼手术史；双眼除白内障外无其他眼部病变。
1.2排除标准：
1）有严重的传染性疾病；
2）除白内障外合并有其他影响视力的眼部病变；
3）有其它全身系统疾病。
1.3疾病诊断标准：
1）确诊为Vogt-小柳原田综合征。初发活动期：眼部初次发病，眼部炎症升高（如前房细胞、玻璃体混浊），OCT显示视网膜异常改变；初发非活动期：经治疗后，前房炎症消退且视网膜结构恢复正常；复发：初次治疗停止超过3个月后再次发病；
2）确诊为白塞氏病葡萄膜炎。高度活跃期：眼部首次发病或复发，前房炎症水平升高，多数病例可伴有不同程度的眼后节病变及全身改变；低度活跃期：治疗后眼部炎症和全身改变得到控制，前房炎症等级小于1个数量级，眼后段炎症趋于稳定；
3）确诊为后巩膜炎。巩膜增厚：眼部首次发病或复发，前房炎症水平升高，B超显示球壁增厚；巩膜非增厚：B超显示球壁无明显增厚的后巩膜炎或经治疗后巩膜厚度恢复正常。
2、建立蛋白质库以及发现队列筛选实验方法
2.1 建立蛋白质库
建库队列：选取健康成人、白塞氏病葡萄膜炎患者、后巩膜炎患者和VKH患者的共26个冻存样本，使用超高速离心机（Beckman Coulter公司）提取其中的外泌体和微囊泡，与血浆样本一同混合后构建蛋白质库。
2.2 血浆提取与保存
样本收集：筛选出由健康对照、白塞氏病葡萄膜炎患者、后巩膜炎患者和VKH患者各48、46、48、48个样本组成的发现队列，采集发现队列中190个样本的外周静脉血5mL于EDTA抗凝管中。4℃，1800g，15min离心后提取2mL血浆，放置于-80℃冰箱冷存，以备后续使用。
2.3蛋白溶液内酶切，测量蛋白浓度
1）取出冻存的血浆样本，抽取2μL，加入100μL尿素裂解液（Sigma-Aldrich公司）。
2）还原：加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇DTT（Sigma-Aldrich公司），37℃孵育1h。
3）烷基化：加入终浓度40mM的碘代乙酰胺IAA（Sigma-Aldrich公司），避光常温孵育1h。
4）平衡超滤管以及样本过滤：加入300μL 50mM碳酸氢铵离心两次（14000g×5min，室温）；加入还原烷基化后的样本至平衡后的超滤管中，离心（14000g×20min，室温）；样本完全过滤后，加入300μL 50mM碳酸氢铵（Sigma-Aldrich公司）清洗三次（14000g×5min，室温）；更换收集管，加入75μL 50mM碳酸氢铵至超滤管中。
5）蛋白酶切：加入胰酶（Roche生物公司）37℃过夜酶切；孵育完成后，离心（14000g×5min，20min）；加入1%甲酸（Sigma-Aldrich公司）终止酶切，60℃真空蒸干。
6）加入0.1%甲酸重悬样本，Nanodrop（Thermo Fisher Scientific公司）测量蛋白浓度。
2.4 质谱检测与鉴定
选取2.3中蛋白酶切后获得的部分肽段通过信息依赖性获取的方式进行蛋白质检测。
2.5定量数据值的处理
对得到的蛋白定量值使用R语言进行处理，差异蛋白定义为p小于0.05，变化倍数（Fold change，FC）绝对值大于1.2倍。
2.6候选生物标志物的筛选
筛选VKH组与其它3组之间存在差异的蛋白质为疾病蛋白标志物，使用hiplot绘制韦恩图表征筛选结果。
3、另选验证队列进行候选生物标志物的ELISA验证
基于与发现队列相同的标准筛选出由健康对照、白塞氏病葡萄膜炎患者、后巩膜炎患者和VKH患者各67、65、65、65个样本组成的验证队列，对质谱筛选的候选生物标志物进行ELISA验证，其中，血浆样本的提取与保存同“2.2 血浆提取与保存”，所使用的试剂盒均来自FineTest公司。步骤如下：
1）试剂盒中的所有试剂及样本提前拿出放至室温。向试剂盒提供的标准品管中加入1mL标准品稀释液，作为0号管，取7个ep管编号1-7，分别加入300μL标准品稀释液。取混匀后的0号管300μL液体加入1号管，从1号管中取300μL加入2号管，以此类推，7号管中保持300μL标准品稀释液不变。
2）取100μL标准品稀释液和血浆稀释液加入孔板中37℃孵育90分钟。准备48mL超纯水加入2mL浓缩洗涤液配置稀释25倍的洗涤液，洗板两次。
3）配置生物素抗体工作液，每孔加入100μL抗体工作液孵育 60 分钟。洗板3次。
4）配置HRP-链霉亲和素，每孔加入100μL孵育30分钟。洗板5次。
5）添加90μL TMB显色底物，避光孵育10-20分钟。
6）添加50μL反应终止液，置于酶标仪（TECAN公司）读取450nm处吸光度值并计算。
7）使用SPSS软件进行单因素方差分析对四组之间的差异进行统计学分析，p<0.05视为差异有统计学意义。代表p<0.05，/>代表p<0.01，/>代表p<0.001，/>代表p<0.0001。
4、诊断效果验证
筛选出由健康对照、白塞氏病葡萄膜炎患者、后巩膜炎患者和VKH患者各67、65、65、65个样本组成的验证队列，进行诊断效果的验证。采用SPSS软件分别对APOH和STXBP1进行ROC曲线分析，以及采用SPSS软件通过二元logistic回归对APOH和STXBP1进行联合ROC曲线分析，得到预测值。
实施例1：蛋白质谱图
为了扩大蛋白质的鉴定数目，使用26个冻存样本中的小细胞外囊泡、大细胞外囊泡和血浆样本混合构建了有2432个蛋白质的数据库。质谱分析发现队列显示，通过SWATH-MS定量得到2028个蛋白质（图1）。在95%置信区间内对四组进行PLS-DA（偏最小二乘法判别分析）分析（图2），发现四组之间可被区分，存在一定的差异。进一步利用所有可定量的蛋白质进行了GSEA富集分析（图3），结果显示VKH所影响的生物过程和通路主要集中在补体级联、NF-kB和先天免疫反应等信号通路。
火山图展示了VKH组与健康对照组相比，上调和下调的差异蛋白（图4）。为进一步筛选在VKH中独立表达的蛋白作为特异性生物标志物，将VKH组与其它3组分别比较，最终获得5个潜在生物标志物，即APOH、STXBP1、DNAJC13、PKHD1L1和TTYH1，结果通过韦恩图展示（图5）。
实施例2使用ELISA对生物标志物进一步验证
选择另一组队列作为验证队列，根据蛋白质的功能和组间的表达情况，示例性的选择APOH和STXBP1进行验证，根据发现队列质谱得到的定量值发现这两个蛋白质在VKH患者的血浆中分别呈上升和下降趋势，相较于其它3组具有统计学差异（图6和图7）。ELISA验证的结果（图8和图9）也进一步验证了质谱数据的正确性。
实施例3诊断效果评估
以APOH和STXBP1为例，将ELISA结果进行受试者工作特征（Receiver OperationCharacteristic, ROC）曲线分析，使用APOH诊断Vogt-小柳原田综合征的AUC值达到0.652（图10），使用STXBP1诊断Vogt-小柳原田综合征的AUC值达到0.730（图11）。
进一步的，通过二元logistic回归得到两个标志物的组合值后进行ROC分析并计算曲线下面积，获得诊断模型，联合使用本申请的APOH和STXBP1诊断Vogt-小柳原田综合征的AUC值达到0.765（图12）。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (11)
1.生物标志物在制备诊断Vogt-小柳原田综合征的产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括APOH和/或STXBP1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物还包括DNAJC13、PKHD1L1或TTYH1中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物为蛋白。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断Vogt-小柳原田综合征包括检测生物标志物的有无或其蛋白的表达量。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括检测样本中生物标志物的试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的样本为血浆样本。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括诊断试剂盒、试纸、膜条或设备中的一种或两种以上。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括生物芯片。
9.生物标志物在制备区分Vogt-小柳原田综合征与后巩膜炎或与其他葡萄膜炎的产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括APOH和/或STXBP1。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物还包括DNAJC13、PKHD1L1或TTYH1中一种或两种以上。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的其他葡萄膜炎包括白塞氏病葡萄膜炎、强直性脊柱炎引起的葡萄膜炎、Fuchs综合征、交感性眼炎或特发性葡萄膜炎中的一种或两种以上。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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