CN113009158B - 中高度近视的辅助诊断标记物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了中高度近视的辅助诊断标记物及其用途。具体地，本发明提供了一种包含角蛋白I型细胞骨架10(kerat i n type I cytoske l eta l 10,KRT10)的生物标记物及其试剂盒，其用于中高度近视的辅助诊断，以及对待测对象中高度近视的风险评估。本发明还提供了筛选预防、延缓或治疗中高度近视的候选化合物的标记物或方法。另外，本发明还提供了一种包含KRT10的用于预防、延缓或治疗中高度近视的药物组合物及其制药用途。

Description

中高度近视的辅助诊断标记物及其用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地涉及中高度近视的辅助诊断标记物及其用途。

背景技术

近视是一种全球性高发疾病，是目前我国青少年人群视力低下的首要因素，而高度近视是引起我国眼盲和视力低下的主要原因之一。高度近视的发生涉及多因素复杂过程，发病机制仍不清楚，传统的治疗方法，如激光光凝和巩膜加固手术，不能从根本上阻止高度近视眼底病变的发展，目前缺乏行之有效的高度近视的治疗措施。此外，屈光手术在一部分患者中还会出现严重的手术后并发症，例如，圆锥角膜。该并发症的发病机制尚不十分明确，也没有行之有效的预测方法和治疗方法。鉴于屈光手术存在较大不确定风险，且中高度近视患者对眼科手术存在本能的畏惧和排斥，所以一直以来科学工作者对近视的药物治疗的研究也在进行中。尽管近视治疗药物种类繁多，但疗效却不十分确切和有效，真正应用于临床的药物非常有限。如大量研究证实了阿托品能防止近视进展，但是阿托品的副作用，如畏光、视近模糊、眼压升高等限制了其临床上的广泛应用。因此，寻找更有效的方法对中高度近视患者以及高危人群进行早期检测、风险预测以及早期治疗性干预具有重要的临床意义。

疾病的分子标记物可以作为疾病早期检测和风险预测的指标，或者作为疾病诊断后的疾病分级、严重程度、进展或疾病减轻的指标。蛋白质组学从整体水平上研究细胞内蛋白质的表达情况，通过比较正常和疾病状态下蛋白表达的差异，揭示参与病理过程的蛋白网络，发现网络中的关键因素，在研究疾病的病理机制、确定有效预防和早期干预以及需找能够用于治疗近视的药物方面具有独特的优势。目前对中高度近视患者的蛋白质组学研究主要集中在考察高度近视患者眼前房水、玻璃体中蛋白质组改变的情况(参见例如，邵珺等，中华眼底病杂志，第27卷，第3期，2011年5月，第255-258页)。

发明人团队的最新研究表明，高度近视人群眼角膜生物力学要弱于低度近视眼角膜生物力学。角膜生物力学的差异已被认为是近视发生和进展的原因之一。角膜的生物力学变化会引起角膜形态改变，造成曲率变化，从而影响患者的屈光度，最终导致近视的发展。但是，目前尚无研究表明造成不同近视程度人群角膜生物力学差异的蛋白。

因此，探究不同近视程度人群角膜生物力学差异的蛋白基础，并将其开发成中高度近视的辅助诊断标记物，筛选预防、延缓或治疗中高度近视的候选化合物的标记物以及预防、延缓或治疗中高度近视的药物，对于进一步阐明中高度近视的病理机制，以及在临床上延缓中高度近视的进展具有划时代的意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明人采用质谱法考察了低度近视、中度近视和高度近视患者角膜以及血液中蛋白质组学的改变情况，并首次发现了在不同程度的近视人群中表达具有显著差异的特定蛋白角蛋白I型细胞骨架10(keratin type I cytoskeletal 10,KRT 10)，为中高度近视提供了一种新的辅助诊断、分型手段、候选药物筛选方法以及预防和治疗药物，也为进一步阐明此类疾病的病理机制奠定基础。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

在第一个方面中，本发明提供了一种用于中高度近视的辅助诊断或待测对象中高度近视风险评估的标记物，所述标记物包含角蛋白I型细胞骨架10(keratin type Icytoskeletal 10,KRT 10)，所述标记物用于通过质谱法对样品进行检测，所述样品来自血液、血浆、血清、泪液、房水或角膜基质。

在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面的标记物在制备用于中高度近视的辅助诊断或待测对象中高度近视风险评估的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含上述第一个方面所述的标记物，以及说明书，所述说明书记载了高度近视患者、中度近视患者、低度近视患者和/或健康人群样品的上述第一个方面所述的标记物水平参考数据集合。

对于上述第一个方面所述的标记物或上述第二个方面所述的用途而言，所述中高度近视的辅助诊断或对待测对象中高度近视风险评估的方法包括以下步骤：

(1)提供来源于待测对象的样品，对样品中的标记物水平进行检测，所述标记物包含KRT 10；

(2)将步骤(1)测得的标记物水平与高度近视患者、中度近患者和/或低度近视患者的相应标记物的水平参考数据集合进行比较，并将健康人群样品的相应标记物的水平作为阴性对照；以及

(3)如果所述待测对象的样品中标记物的水平在高度近视或中度近视患者样品的相应标记物水平参考数据集合范围内，且所述待测对象的屈光度≤-3.00D，则将所述待测对象判定为患有中高度近视；

如果所述待测对象的样品中标记物的水平在低度近视患者样品的相应标记物水平参考数据集合范围内，且所述待测对象的屈光度＞-3.00D，则将所述待测对象判定为患有低度近视；

如果所述待测对象的样品中标记物的水平在高度近视或中度近视患者样品的相应标记物水平参考数据集范围内，且所述待测对象的屈光度＞-3.00D，则将所述待测对象判定为有较大发展成中高度近视的风险。

在第三个方面中，本发明提供了一种用于筛选预防、延缓或治疗中高度近视的候选化合物的标记物，所述标记物包含KRT 10，所述标记物用于通过质谱法对样品进行检测，所述样品来自血液、血浆、血清、泪液、房水或角膜基质。

在第四个方面中本发明提供了一种筛选预防、延缓或治疗中高度近视的候选化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)在待测组中，向待测对象施用待测化合物，检测待测组中来源于所述对象的样品中标记物的水平L1，在对照组中，向待测对象施用空白对照或载剂对照，检测对照组中来源于所述对象的样品中标记物的水平L0，其中，所述标记物包含KRT 10；

(2)对步骤(1)中检测得到的水平L1和水平L0进行比较，如果所述水平L1在统计学上显著低于所述水平L0，则确定所述待测化合物是预防、延缓或治疗中高度近视的候选化合物，

其中，在步骤(1)和步骤(2)中，所述标记物用于通过质谱法对样品进行检测，所述样品来自血液、血浆、血清或角膜基质，所述待测对象是患有中高度近视的动物，优选地，所述动物是哺乳动物，更优选地，所述哺乳动物是人、非人灵长类动物或啮齿类动物。

在第五个方面中，本发明提供了一种用于预防、延缓或治疗中高度近视的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含KRT 10和药学上可接受的载体。

在第六个方面中，本发明提供了上述第五个方面所述的药物组合物在制备用于预防、延缓或治疗中高度近视的药物中的用途。

特别需要指出的是，在本发明中，术语“标记物”也称为“生物学标记物”是指个体的生物学状态的可测量指标。这样的生物学标记物可以是在个体中的任何物质，只要其与被检测个体的特定生物学状态(例如，疾病、病症或障碍)有关即可，例如核酸(如DNA或RNA)标记物、蛋白标记物、细胞因子标记物、趋化因子标记物、糖类标记物、抗原标记物、抗体标记物和功能性标记物等。生物学标记物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程、致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。

在本发明中，术语“血浆”指全血的液体成分。根据所使用的分离方法不同，血浆可以完全不含细胞成分，也可以含有不同量的血小板和/或少量其他细胞成分。

在本发明中，术语“待测对象”是患有高度近视的动物。优选地，所述动物是哺乳动物。更优选地，所述哺乳动物是人、非人灵长类动物或啮齿类动物。例如，医学研究中常用的高度近视动物模型，如雏鸡、树鼩、豚鼠、恒河猴等。参见例如，WO2018/164113A。

在本发明中，术语“高度近视”又称病理性近视或恶性近视，指屈光度等于或高于-6.00D，眼轴长度≥26.00mm的屈光不正。高度近视眼轴的伸长程度变大，其结果是导致视网膜、脉络膜向后方拉伸，使其负荷增强，从而导致眼底发生各种各样的异常。病理性近视是导致失明的主要原因之一，目前尚没有治疗高度近视的有效防范。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)本发明将包含KRT 10的标记物用于中高度近视的辅助早期筛查和风险预测，这种标记物具有高灵敏度和高特异性的优点，具有重要的科学研究和临床应用价值。

(2)可以将本发明的包含KRT 10的标记物用于筛选预防、延缓或治疗中高度近视的候选化合物，以便于开发在临床上用于预防、延缓或治疗中高度近视的药物。

(3)可以将本发明的包含KRT 10的药物组合物用于制备预防、延缓或治疗中高度近视的药物，以弥补临床上能够有效用于预防、延缓或治疗中高度近视的药物严重不足的缺陷。

附图说明：

图1：串联质谱标签(TMT)结果显示低度近视组、中度近视组和高度近视组患者角膜KRT 10的蛋白含量差异。

图2：平行反应监测(PRM)验证结果显示低度近视组、中度近视组和高度近视组患者角膜KRT 10的蛋白含量差异。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例

1.实验方法

本实验选取天津市眼科医院2019年5月-2019年9月行微小切口基质透镜切除术(small incision lenticule extraction，SMILE)手术的患者，共计140人，149只眼，所有患者除确诊不同程度近视外，均不伴有其他眼部及全身系统性疾病，不影响角膜基质蛋白结果分析。本研究通过天津市眼科医院伦理委员会审核批准。

所有患者患眼按照等效球镜度(SE)分为低度近视组(SE＞-3.00D)、中度近视组(-6.00D＜SE≤-3.00D)以及高度近视组(SE≤-6.00D)，并在所有入选患者中从低度、中度、高度近视组分别随机选择各10例眼，共计30例眼进行标本采集。

对上述标本的角膜基质进行串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)相对定量蛋白组学分析，对所鉴定的差异表达蛋白进行生物信息学分析，筛选有潜在研究前景的候选蛋白，每组进行三次生物学重复。

随后进行差异蛋白筛选，使用平行反应监测(Parallel reaction monitoring，PRM)技术靶向验证候选蛋白在不同度数近视眼角膜中的表达差异，每组进行三次重复实验。

2.实验结果

本研究采用TMT定量蛋白质组学技术进行分析，在角膜基质样品中共鉴定到蛋白质2472个。按照表达倍数变化1.2倍以上(上调大于1.2倍或者下调小于0.83倍)且p值<0.05的标准筛选差异表达蛋白质。结果选择KRT 10作为潜在的差异蛋白。

TMT蛋白质谱分析显示：高度近视、中度近视和低度近视眼人群角膜的KRT 10蛋白有明显差异。低度近视组KRT 10蛋白的相对表达量要显著高于中度近视组和高度近视组。

如图1所示，低度近视组KRT 10蛋白均值为1.284，中度近视组为0.919，高度近视组为0.832。中度度近视/低度近视组＝0.919/1.284＝0.715，p＝0.040；高度近视/低度近视＝0.832/1.284＝0.648，p＝0.041；高度近视/中度近视＝0.832/0.919＝0.905833，p＝0.420。

如图2所示，使用PRM进一步证实KRT 10蛋白含量有差异。PRM结果显示：低度近视组KRT 10蛋白均值为0.461，中度近视组为0.205，高度近视组为0.153。中度近视/低度近视＝0.445，p＝0.000，高度近视/低度近视＝0.332，p＝0.000，高度近视/中度近视＝0.746，p＝0.097。

PRM结果与TMT结果相比较，可见PRM验证结果与TMT相对定量结果趋势一致。高度近视组和中度近视组KRT 10蛋白的相对表达量显著低于低度近视组。

此外，在来自患者血液、血浆、血清、泪液和房水的样品中，也能够得到与上述在角膜基质样品中得到的一致结果，即低度近视组KRT 10蛋白的相对表达量要显著高于中度近视组和高度近视组。

综上所述，本发明人采用质谱法首次发现了在不同程度近视人群的角膜基质中表达具有显著差异的特定蛋白KRT 10，为中高度近视提供了一种新的辅助诊断、风险预测标记物，并提供了以该标记物为基础的候选药物筛选方法，为进一步阐明此类疾病的病理机制奠定基础。

此外，本发明人发现，在中高度近视患者人群的角膜基质中KRT 10蛋白的含量显著低于轻度近视人群和健康人群，因而通过给予中高度近视患者人群含有KRT 10的药物组合物，能够对上述人群的中高度近视起到预防、缓解和治疗的作用。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (2)

1.角蛋白I型细胞骨架10（keratin type I cytoskeletal 10, KRT 10）标记物在制备用于待测对象中高度近视风险评估以及中高度近视辅助诊断的试剂盒中的用途，其特征在于：所述标记物用于通过质谱法对样品进行检测，所述样品来自血液、血浆、血清、泪液、房水或角膜基质，所述试剂盒包含所述标记物，以及说明书，所述说明书记载了高度近视患者、中度近视患者、低度近视患者和健康人群样品的所述标记物水平参考数据集合。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：中高度近视辅助诊断或对待测对象中高度近视风险评估的方法包括以下步骤：

（1）提供来源于待测对象的样品，对样品中的标记物水平进行检测，所述标记物为KRT10；

（2）将步骤（1）测得的标记物水平与高度近视患者、中度近患者和/或低度近视患者的相应标记物的水平参考数据集合进行比较，并将健康人群样品的相应标记物的水平作为阴性对照；以及

（3）如果所述待测对象的样品中标记物的水平在高度近视或中度近视患者样品的相应标记物水平参考数据集合范围内，且所述待测对象的屈光度≤-3.00D，则将所述待测对象判定为患有中高度近视；

如果所述待测对象的样品中标记物的水平在低度近视患者样品的相应标记物水平参考数据集合范围内，且所述待测对象的屈光度＞-3.00D，则将所述待测对象判定为患有低度近视；

如果所述待测对象的样品中标记物的水平在高度近视或中度近视患者样品的相应标记物水平参考数据集范围内，且所述待测对象的屈光度＞-3.00D，则将所述待测对象判定为有较大发展成中高度近视的风险。