CN111596067B

CN111596067B - Zc3h8在pop早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品

Info

Publication number: CN111596067B
Application number: CN202010493125.8A
Authority: CN
Inventors: 牛晓宇; 王涛; 高林波; 梅玲; 崔陶; 陈悦悦; 魏冬梅; 张月婷; 张晓莉
Original assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2040-06-03
Also published as: CN111596067A

Abstract

本发明公开了ZC3H8在POP早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品，首次将检测ZC3H8水平的物质用于制备POP早期预警、诊断、预后评估的产品，操作方法简单，以血液为检测样品，可实现快速、批量的检测，ZC3H8水平的表达可通过现有免疫荧光分析法、ELISA、生物芯片法、电化学发光法等方法实现，具有高灵敏度、高特异性、高准确度以及高精确度的特点。

Description

ZC3H8在POP早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体的说，是ZC3H8在POP早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品。

背景技术

女性盆底器官脱垂（Pelvic Organ Prolapse，POP）是女性盆底功能障碍性疾病（Pelvic Floor Dysfunction，PFD）中最为常见、危害面最广的类型，常伴盆腔支持组织的结构和功能缺陷，全球发病率高达20%且呈逐年升高趋势。POP的早发现早治疗，能够改善成年女性生命质量和身心健康，对于提高POP流行病学防控效果具有重要的指导意义，是切实践行健康中国2030规划纲要目标的重要举措之一。

目前POP的诊断主要通过临床表型、病史和相关功能性检查，缺乏能反映长期病理过程的功能分子作为早期识别、干预和评价指标和标靶。王凤玫等在“骨形态发生蛋白-1在盆底器官脱垂患者阴道组织中的表达及意义”，《实用妇科杂质》2012年11月第28卷第11期，954-956，中通过手术中获取患者阴道前壁组织，采用免疫印迹方法检测BMP-1的蛋白表达，可以推测出盆底器官脱垂患者阴道组织中BMP-1的含量降低，对前胶原蛋白的剪切能力降低，引起细胞外基质代谢障碍，从而使盆底组织中胶原含量降低，最终引起盆底器官脱垂。但该研究仍存在补足之处，如所取标本仅来源于阴道组织，标本数量较少，还需进一步实验结果验证，另外，标本需进行手术才能获取，无法实现快速判断。我们知道，盆底器官脱垂与多种因素有关，为实现POP的预判和快速诊断，势必需要找一种快速准确的检测指标。

CCCH型锌指蛋白ZC3H8（Zinc finger CCCH-type containing 8, ZC3H8），与器官退化性疾病有关，ZC3H8功能障碍导致多个器官退化。秦智慧等在“CCCH型锌指蛋白研究进展”《生物技术通报》2010年第8期，中记载了ZC3H8（也称为胎儿肝脏锌指蛋白1，Flizl）直接结合到GATA-3基因，并强烈抑制GATA-3的转录，但并未有研究报告ZC3H8在POP及其相关产品中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供ZC3H8在POP早期预警、诊断、预后评估中的应用，首次将ZC3H8的检测指标用于辅助诊断POP及早期预警和预后评估，可实现高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度的检测和判断。

本发明的另一目的在于提供一种用于POP早期预警、诊断、预后评估的产品，通过用于检测ZC3H8水平的物质实现POP的批量、快速检测。

本发明通过下述技术方案实现：ZC3H8在POP早期预警、诊断、预后评估中的应用，用于检测ZC3H8水平的物质在制备POP早期预警、诊断、预后评估产品中的应用。

所述检测是针对受试者的生物样本进行，生物样本选自全血或血浆。

所述用于检测ZC3H8水平的物质是用于在蛋白水平上检测ZC3H8的物质。

所述物质在蛋白水平上检测ZC3H8的方法包括：免疫荧光分析法、ELISA、生物芯片法、电化学发光法。

所述POP早期预警、诊断、预后评估产品包括试剂盒、试纸或其他医学上可实现的产品。

一种用于POP早期预警、诊断、预后评估的产品，包括用于检测ZC3H8水平的物质。

设置检测限为标准值，当检测到的ZC3H8水平高于或等于标准值时，判断为阳性，表明患有POP；当检测到的ZC3H8水平低于标准值时，判断为阴性，表明未患有POP。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明通过研究首次发现，由于POP患者的盆腔肌组织功能障碍，导致女性POP患者血浆中ZC3H8水平显著高于健康对照女性，因此，基于这一研究基础，首次将ZC3H8作为POP的诊断与预测指标。目前尚未发现以血液样本中的ZC3H8含量作为盆底器官脱垂的检测指标的报道，也未发现以血液样本中的ZC3H8含量为检测指标的盆底器官脱垂检测试剂盒及其制备方法的相关报道。

（2）本发明方法将检测ZC3H8水平的物质用于制备POP早期预警、诊断、预后评估的产品，如检测试剂盒等，操作方法简单，以血液为检测样品，可实现快速、批量的检测，ZC3H8水平的表达可通过现有免疫荧光分析法、ELISA、生物芯片法、电化学发光法等方法实现，具有高灵敏度、高特异性、高准确度以及高精确度的特点。

附图说明

图1为实施例2中涉及的A450值- ZC3H8浓度标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本实施例是以ZC3H8为检测指标的盆底器官脱垂检测试剂盒。主要是将检测ZC3H8水平的物质用于制备盆底器官脱垂检测试剂盒，以辅助POP诊断、早期预警和/或预后评估。

具体制备工艺步骤如下：

（1）制备包被有鼠抗人ZC3H8单克隆抗体（购自： Invitrogen公司，货号 MA5-26969）的多孔板。

用pH＝9的碳酸盐缓冲液将鼠抗人ZC3H8单克隆抗体稀释为浓度10 μg /mL的稀释液，在抗体稀释液中加入无水甲醇，无水甲醇的加入量以其浓度达到3 mL/100 mL为限，然后将所述含甲醇的鼠抗人ZC3H8单克隆抗体稀释液按100 μL/孔的量加入96孔板的各孔内，在4℃包被12小时；包被时间届满后，将浓度1 g/100 mL的牛血清白蛋白溶液按120 μL/孔的量加入多孔板上的各孔并在37℃进行封闭反应，反应时间为1小时；封闭反应结束后，用pH＝7.2、浓度为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有鼠抗人ZC3H8单克隆抗体的多孔板，然后将其置于4℃冰箱中保存备用；

（2）制备生物素标记的兔抗人ZC3H8多克隆抗体（购自： Abcam公司，货号ab97821）（Biotin-ZC3H8Ab）检测液。

以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度为50μg/μL的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以pH＝9.6、浓度为1 mol/L的碳酸盐缓冲液为溶剂、兔抗人ZC3H8多克隆抗体为溶质配制浓度为24 mg/mL的兔抗人ZC3H8多克隆抗体溶液，按酰-N羟基丁二酰亚胺酯与兔抗人ZC3H8多克隆抗体的质量比＝1∶7量取所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述兔抗人ZC3H8多克隆抗体溶液形成混合液，将所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述兔抗人ZC3H8多克隆抗体溶液的混合液在搅拌下（磁力搅拌器，搅拌速度200 转/分）于室温反应4小时，即获得生物素标记的兔抗人ZC3H8多克隆抗体（Biotin-ZC3H8Ab）；反应结束后，将含生物素标记的兔抗人ZC3H8多克隆抗体（Biotin-ZC3H8Ab）的反应液装入透析袋中，用pH＝9.2、浓度为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液在4℃进行透析，透析时间为12小时，其间更换透析液3次；继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到4 g/100 mL为限。

将上述过程制备的含生物素标记的兔抗人ZC3H8多克隆抗体（Biotin-ZC3H8Ab）和牛血清白蛋白的透析后反应液与甘油按体积比1∶1计量，在室温下混合均匀即形成生物素标记的兔抗人ZC3H8多克隆抗体（Biotin-ZC3H8Ab）检测液,其保存温度为－20℃。

（3）每个试剂盒配备亲和素-辣根过氧化物酶12 mL、显色底物3',3',5,5'-四甲基联苯胺12 mL、ZC3H8蛋白标准品（ZC3H8的浓度为10 ng/mL）1 mL和样本稀释液30 mL，样本稀释液是在浓度0.02 mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液，TBS）中加入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到2 g/100 mL为限；所述亲和素-辣根过氧化物酶与生物素标记的兔抗人ZC3H8多克隆抗体检测液的体积比为1∶1。

实施例2：

本实施例是以实施例1制备的盆底器官脱垂检测试剂盒对待测样本进行检测。

1、待测样本

（1）标样准备

将实施例1所述试剂盒中配备的ZC3H8蛋白标准品设为含ZC3H8浓度最高的标样，命名为标样1，其ZC3H8的浓度为10 ng/mL，然后用实施例1所述试剂盒中配备的样本稀释液将所述ZC3H8蛋白标准品分别稀释成ZC3H8浓度为10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.63ng/mL、0.31ng/mL、0.16ng/mL的标样，依次命名为标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6和标样7，共计有7个标样。

（2）试样

以四川大学华西第二医院门诊及住院的女性为实验对象，根据现有诊断方法将实验对象分为盆底脱垂组和健康对照组，收集两组女性的抗凝血样本作为试样，共计40个试样，其中，试样1-20取自于盆底脱垂组，试样21-40取自于健康对照组。

（3）空白对照

实施例1所述试剂盒中配备的样本稀释液——为空白对照。

2、样本检测

（1）检测前将试剂盒的所有试剂、待测样本缓慢均衡至室温（18℃~25℃）。

（2）将步骤1所准备的标样、空白对照、试样分别加入包被有鼠抗人ZC3H8单克隆抗体的96孔板上的相应加样孔中，各标样、空白对照、试样均设复孔对照；各加样孔中的加样量为100 μL。用胶膜遮盖所述96孔板，并将所述96孔板置于振摇仪上在振摇状态下室温孵育2.5小时，振摇速度为100转/分。

（3）孵育时间届满后，吸尽各加样孔中的液体，在自动洗板机上设置清洗程序，以400 μL/孔洗液（浓度0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液或浓度为0.02 mol/L的Tris缓冲液）将每个加样孔清洗两次，每次清洗时，洗液需在孔中停留10秒～15秒；清洗完毕后，将96孔板翻转，使各加样孔孔口向下，在吸水滤纸上轻拍使各加样孔中残留的洗液完全去除。

（4）向96孔板上的各加样孔中分别加入100 μL生物素标记的鼠抗人ZC3H8单克隆抗体（Biotin-ZC3H8Ab）检测液，然后用胶膜遮盖所述96孔板，并将所述96孔板置于振摇仪上在振摇状态下室温孵育1.5小时，振摇速度为100转/分；孵育时间届满后，吸尽各加样孔中的液体，按步骤（3）所述方法清洗所述96孔板。

（5）向所述96孔板上的各加样孔中分别加入100 μL亲和素-辣根过氧化物酶，然后用胶膜遮盖所述96孔板，并将所述96孔板置于振摇仪上在振摇状态下室温孵育1.5小时，振摇速度为100转/分；孵育时间届满后，吸尽各加样孔中的液体，按步骤（3）所述方法清洗所述96孔板。

（6）向所述96孔板上的各加样孔中分别加入100 μL 3',3',5,5'-四甲基联苯胺，然后在室温避光孵育10分钟，孵育时间届满后，向各加样孔中分别加入100 μL终止液，所述终止液为硫酸和亚硫酸钠配制的水溶液，硫酸的浓度为2 mol/L，亚硫酸钠的浓度为0.1mol/L。

（7）将所述96孔板放置在酶标仪中，用酶标仪测各孔的A450值（光密度值或吸光度值），所测结果见下表（表中的A450值为两孔的加权平均值）。空白对照的A450值为0.0964。

表1：标样的A450值

表2：试样1～20的A450值

表3：试样21～40的A450值

（8）根据各标样的A450值与各标样中ZC3H8的浓度，制作A450值- ZC3H8浓度标准曲线（见图1），并得到计算公式y=((max/(x-min)-1)^(-1/Hillslope))*EC50（见表6），式中，y为被测样品的A450值，x为被测样品中ZC3H8的含量。

（9）根据所测各试样的A450值，用公式y=((max/(x-min)-1)^(-1/Hillslope))*EC50（见表6）计算各试样中ZC3H8的浓度，计算结果见下表：

表4：试样1～20的计算结果（ZC3H8浓度单位：ng/mL）

表5：试样21～40的计算结果（ZC3H8浓度单位：ng/mL）

表6四参数法的公式与参数

计算表4中试样1～20的ZC3H8平均浓度，其计算结果为5.46±4.61 ng/mL。计算表5中试样21-40的ZC3H8平均浓度，其计算结果为1.31±028 ng/mL。从计算结果可以看出，取自于盆底脱垂组的试样1～20中的ZC3H8平均浓度与取自于健康对照组的试样21～40中的ZC3H8平均浓度的差异具有统计学意义。

根据健康对照组的均数±2×标准差的计算结果设为检测限，因此，本发明所述试剂盒设置的ZC3H8检测限为1.88 ng/mL，即待测样本中 ZC3H8浓度高于或等于1.88pg/mL判定为阳性（即患有女性盆底器官脱垂）， ZC3H8浓度低于1.88pg/mL判定为阴性（即未患女性有盆底器官脱垂）。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西第二医院

<120> ZC3H8在POP早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品

<130> 2020

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 291

<212> PRT

<213> ZC3H8

<400> 1

Met Asp Phe Glu Asn Leu Phe Ser Lys Pro Pro Asn Pro Ala Leu Gly

1 5 10 15

Lys Thr Ala Thr Asp Ser Asp Glu Arg Ile Asp Asp Glu Ile Asp Thr

20 25 30

Glu Val Glu Glu Thr Gln Glu Glu Lys Ile Lys Leu Glu Cys Glu Gln

35 40 45

Ile Pro Lys Lys Phe Arg His Ser Ala Ile Ser Pro Lys Ser Ser Leu

50 55 60

His Arg Lys Ser Arg Ser Lys Asp Tyr Asp Val Tyr Ser Asp Asn Asp

65 70 75 80

Ile Cys Ser Gln Glu Ser Glu Asp Asn Phe Ala Lys Glu Leu Gln Gln

85 90 95

Tyr Ile Gln Ala Arg Glu Met Ala Asn Ala Ala Gln Pro Glu Glu Ser

100 105 110

Thr Lys Lys Glu Gly Val Lys Asp Thr Pro Gln Ala Ala Lys Gln Lys

115 120 125

Asn Lys Asn Leu Lys Ala Gly His Lys Asn Gly Lys Gln Lys Lys Met

130 135 140

Lys Arg Lys Trp Pro Gly Pro Gly Asn Lys Gly Ser Asn Ala Leu Leu

145 150 155 160

Arg Asn Ser Gly Ser Gln Glu Glu Asp Gly Lys Pro Lys Glu Lys Gln

165 170 175

Gln His Leu Ser Gln Ala Phe Ile Asn Gln His Thr Val Glu Arg Lys

180 185 190

Gly Lys Gln Ile Cys Lys Tyr Phe Leu Glu Arg Lys Cys Ile Lys Gly

195 200 205

Asp Gln Cys Lys Phe Asp His Asp Ala Glu Ile Glu Lys Lys Lys Glu

210 215 220

Met Cys Lys Phe Tyr Val Gln Gly Tyr Cys Thr Arg Gly Glu Asn Cys

225 230 235 240

Leu Tyr Leu His Asn Glu Tyr Pro Cys Lys Phe Tyr His Thr Gly Thr

245 250 255

Lys Cys Tyr Gln Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Ser His Ala Pro Leu Thr

260 265 270

Pro Glu Thr Gln Glu Leu Leu Ala Lys Val Leu Asp Thr Glu Lys Lys

275 280 285

Ser Cys Lys

290

Claims

1.用于检测ZC3H8水平的物质在制备女性盆底器官脱垂的早期预警或诊断产品中的应用，其特征在于：针对受试者的全血或血浆，在蛋白水平上检测其ZC3H8水平。

2.根据权利要求1所述的用于检测ZC3H8水平的物质在制备女性盆底器官脱垂的早期预警或诊断产品中的应用，其特征在于：所述检测的方法包括：免疫荧光分析法、ELISA、生物芯片法、电化学发光法。

3.根据权利要求1所述的用于检测ZC3H8水平的物质在制备女性盆底器官脱垂的早期预警或诊断产品中的应用，其特征在于：所述产品包括试剂盒、试纸或其他医学上可实现的产品。