CN115902243A - 一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒及其制备方法 Download PDF

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CN115902243A CN202211345233.6A CN202211345233A CN115902243A CN 115902243 A CN115902243 A CN 115902243A CN 202211345233 A CN202211345233 A CN 202211345233A CN 115902243 A CN115902243 A CN 115902243A
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景晟
姜佩
张跃建
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Fosun Diagnostic Technology Shanghai Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒及其制备方法，包括试剂R1、试剂R2及校准品和质控品，所述的试剂R1中含有抗干扰剂，该抗干扰剂包括聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠盐，质量含量为0.1％‑0.5％；乳化剂，质量含量为0.2％‑1％；曲拉通，质量含量为0.2％‑1％。与现有技术相比，本发明的试剂盒具有抗干扰能力强可适用检测不同体质病人血样，特别是能准确测定含干扰因子较多的特殊血样。

Description

一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生化技术领域，特别涉及一种灵敏度高、特异性强的胶乳免疫比浊法脂联素检测试剂盒的制备方法。
背景技术
糖尿病是一种由于胰岛素分泌不足或外周组织对胰岛素不敏感引起的代谢性疾病，以持续的高血糖状态为特征，并可能引起各种组织、脏器(如眼、肾、心脏、血管、神经等)的长期损害、功能不全或衰竭。通俗的来说，糖尿病是一种常见的代谢障碍疾病，即血糖升高，接着从尿液中流走，所以尿里有糖。具体讲，与过多摄入总热能、脂肪、碳水化合物，少运动，营养过剩有关，故被谑称为“富贵病”。若病势控制不好，日后就会引起并发症，如心血管疾病、脑血管病、视网膜血管病，肾动脉硬化、肢体动脉硬化等，这些并发症是导致糖尿病失明、肾衰竭、心脏病发作、中风和下肢截肢的主要病因。
世界卫生组织的有关资料表明，糖尿病的患病率、致残率和病死率以及对总体健康的危害程度，已居于慢性非传染性疾病的第3位。随着社会经济的发展、人们生活方式的改变等，2型糖尿病发病率在全球范围内呈逐年增高趋势。糖尿病是可以提前预测、预知、早期发现和预防的,众多研究发现，脂联素是2型糖尿病的独立风险因子，可显著提升对糖尿病的风险预测能力。
脂联素是一种主要由脂肪细胞分泌的蛋白类激素，大量存在于血液循环中，在调节胰岛素敏感性，及葡萄糖代谢的过程中扮演重要角色。血液中脂联素水平与体重、腹部肥胖、胰岛素抵抗均成负相关，是2型糖尿病的独立风险因子，可显著提升对糖尿病的风险预测能力。
脂联素检测无需空腹，只需要抽取2毫升的静脉血即可检测当下是否出现代谢异常问题从而预测患糖尿病的风险。脂联素筛查与普通的“测血糖”相比，有着无法比拟的优势：不同于血糖和糖化血红蛋白这两个糖尿病诊断指标，脂联素是糖尿病的风险预测指标。通过脂联素可筛查出血糖尚且正常，但机体生理代谢已经出现异常的糖尿病高风险人群。更重要的是，相较于年龄、性别、BMI指数、腰围等常规风险因子在估算方法粗糙、预测精度不足以及种族差异巨大等方面的局限性，脂联素可动态反映机体的胰岛素抵抗水平，与个体代谢健康息息相关。此外，脂联素在血液中含量稳定，检测不受进食与否、情绪波动、睡眠缺乏、饮食习惯改变等因素影响。而且，脂联素检测自动化程度高，操作简单、抗干扰能力强，适用于各型的生化分析仪。
脂联素检测既可应用于糖尿病早期筛查，又可用于评估药物治疗或生活方式干涉是否有效，还可用于2型糖尿病分型诊断和疗效评估，适合普查和临床诊断。
目前市场上脂联素(ADPN)检测方法有酶免疫法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、乳胶增强透射免疫比浊法等，但是ELISA和RIA检测法存在操作繁琐，检测时间长；普通透射比浊法存在灵敏度不够；而乳胶增强透射免疫比浊法也存在抗干扰能力弱，特殊血样如乳糜血样等，部分试剂盒甚至能测出负值，不能很好反应特殊体质病人肾功能情况。
专利申请CN202110426188.6公开了一种脂联素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及制备方法。其包括R1试剂、R2试剂、脂联素质控品、脂联素校准品，其中：所述R1试剂包括缓冲液、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂；所述的R2试剂包括偶联有脂联素抗体的胶乳微球、缓冲液、稳定剂、电解质、防腐剂，所述胶乳微球是含有聚苯乙烯的多聚物，表面含有羧基基团，粒径在70-200nm之间；所述的脂联素质控品包括脂联素和质控品稀释液；所述的脂联素校准品包括脂联素和校准品稀释液。该技术在一定程度上提高了检测灵敏度和线性范围宽，但是抗干扰能力差，灵敏度低，在低值3-4mg/L的样本区分度低，改试剂的参考区间为大于5mg/L，同时采用该体系的试剂的开瓶稳定性不能持久。
因此，需要在以往ADPN胶乳免疫比浊法检测试剂盒的制备基础上进行改良，以提高ADPN胶乳免疫比浊法试剂的抗干扰能力，扩大适应人群。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种抗干扰能力强的脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒及其制备方法。该试剂盒具有抗干扰能力强可适用检测不同体质病人血样，特别是能准确测定含干扰因子较多的特殊血样。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒，包括试剂R1、试剂R2及校准品和质控品，所述的试剂R1中含有抗干扰剂，该抗干扰剂包括聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠盐，质量含量为0.1％-0.5％；乳化剂，质量含量为0.2％-1％；曲拉通，质量含量为0.2％-1％。
进一步地，所述的聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠盐包括花王EMAL 20C；
所述的乳化剂包括乳化剂op-10；
所述的曲拉通包括tritonx-405。
进一步地，所述的试剂R1还包括缓冲液、增敏剂、电解质和防腐剂；
其中，缓冲液是常见缓冲液，其使用浓度为25-150mM，pH为6.5-9.0；
所述的增敏剂质量含量为0.5％-10％；
所述的电解质质量含量为0.5％-5％；
所述的防腐剂质量含量为0.02％-2％。
进一步地，试剂R1中所述的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、TRIS缓冲液或MOPSO缓冲液，pH为7.0-8.0；
所述的增敏剂包括聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或PAA中的一种或多种；
所述的电解质包括常见氯化钾；
所述的防腐剂包括叠氮化钠或Proclin300中的一种或两种。
进一步地，所述的试剂R2包括连有ADPN抗体的胶乳微球、缓冲液、稳定剂和防腐剂；
其中，连有ADPN抗体的胶乳微球的胶乳微球的直径为100-300nm，连有ADPN抗体的胶乳微粒的质量含量为2％～10％；
所述缓冲液pH值为6.5-9.0；
所述稳定剂的质量含量为0.5％-5％。
所述防腐剂的质量含量为0.02％-2％。
进一步地，试剂R2中，
所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；缓冲液pH值为7.0-8.0；
所述连有ADPN抗体的胶乳微球为ADPN单抗或多抗连接在聚苯乙烯羧基微球上；
所述稳定剂为山梨醇、牛血清白蛋白、海藻糖中的一种或多种，
所述防腐剂为叠氮化钠或Proclin300中的一种或两种。
进一步地，所述的校准品及质控品为重组或天然ADPN蛋白。
上述脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
I、试剂R1制备：
取适量纯化水，然后依次加入缓冲液、抗干扰剂、增敏剂、电解质、防腐剂，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5-9.0，并用0.22μm滤膜进行过滤；
II、试剂R2制备：
(1)活化聚苯乙烯胶乳微球：取粒径120～250nm的胶乳微球，加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(即EDC)，20℃-25℃混合活化30min；
(2)偶联抗体：将脂联素抗体加入已活化的聚苯乙烯胶乳微球中，20℃-25℃反应2h进行共价偶联；
(3)洗涤除去未偶联成功的抗体：步骤(2)得到的胶乳微球反应液离心去掉上清，除去游离抗体和小分子杂质；
(4)封闭微球上未偶联抗体的羧基位点：步骤(3)得到的胶乳微球中加入牛血清白蛋白，封闭1h；
(5)混合与保存：使用含稳定剂、防腐剂、缓冲液的R2稀释液，将步骤(4)获得的溶液稀释3～15倍，最终得到试剂R2，于4℃保存；
III、校准品及质控品制备：将天然或重组ADPN蛋白用冻干稀释液进行稀释至目标浓度，进行冻干，于4℃保存；
VI、组成试剂盒：
将上述制备的试剂R1和试剂R2按体积比R1：R2＝4:1分装入瓶，与校准品及质控品组成试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过在试剂R1中添加抗干扰剂包括EMAL 20C、OP-10、tritonx-405，调整其用量比例，能显著提高试剂的抗干扰能力，扩大适用人群的同时保持与现有试剂良好的相关性。抗干扰的同时也是源于试剂的稳定性准确性的大幅度提升，本发明选用的这三种物质组成的抗干扰剂，在本发明体系中混合试剂的开瓶稳定性可以从开瓶20天提升为40天左右。
本发明试剂盒灵敏度高、特异性强和稳定性好，有较好的临床应用前景。本发明试剂盒制备简单，宜于工业化生产，有较大的应用价值。
附图说明
图1为试剂盒线性测试图；
图2为与进口试剂相关性测试图；
图3为血清样本抗干扰测试图；
图4为试剂稳定性测试图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不仅仅局限于以下实施例，实施例使用原料通过市售得到。
本发明提供的ADPN胶乳免疫比浊法试剂盒，由试剂R1、试剂R2及校准品和质控品组成。其中试剂R1和试剂R2的体积比为4:1。
所述试剂R1包括常规缓冲液、抗干扰剂、增敏剂、电解质、防腐剂。试剂R2包括连有ADPN抗体的胶乳微球、缓冲液、稳定剂、防腐剂。其中缓冲液可以是本研究领域常见缓冲液，如磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、TRIS缓冲液、MOPSO缓冲液等，其使用浓度为25-150mM，PH为6.5-9.0，优选地，所述缓冲液pH为7.0-8.0。增敏剂为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或PAA中的一种或多种，含量为0.5％-10％。电解质为常见氯化钾，含量为0.5％-5％。防腐剂为叠氮化钠或Proclin300中的一种或两种，含量为0.02％-2％。
抗干扰剂包括花王EMAL 20C，含量为0.1％-0.5％，及乳化剂op-10，含量为0.2％-1％，tritonx-405，含量为0.2％-1％。
所述试剂R2中连有ADPN抗体的胶乳微球为ADPN单抗或多抗连接在聚苯乙烯羧基微球上，抗体及微球均为市面常见，胶乳微球的直径为100-300nm，连接抗体的胶乳微粒的含量为2％～10％。缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6.5-9.0，优选地，所述缓冲液pH为7.0-8.0。所述稳定剂为山梨醇、牛血清白蛋白、海藻糖中的一种或多种，含量为0.5％-5％。防腐剂为叠氮化钠或Proclin300中的一种或两种，含量为0.02％-2％。
所述校准品及质控品为重组或天然ADPN蛋白。
以下是更加详细的实施案例，通过以下实施案例进一步说明本发明的技术方案以及所能够获得的技术效果。
实施例1
试剂R l的制备：取995g水，然后依次加入4.8g磷酸二氢纳、22.8g磷酸氢二纳、10.0g PAA(聚丙烯酸)、30.0g NaCl、2g EMAL 20c、2gOP-10、2gtritonx-405,0.5gProclin300，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH至7.4：用0.22μm滤膜过滤，制成lL的试剂R l。
制备试剂R2，步骤如下：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取10ml 200nm胶乳微球(100mg/mL)，加入10mL500mM pH值为7.4的HEPES溶液、1.5mL新鲜配制的浓度为20mg/mL的EDC溶液，纯化水补足至终体积100mL，充分混匀，室温(20～25℃)混合30min；
(2)偶联：按微球：抗体质量比＝18:1的比例将ADPN抗体(Medix公司生产的抗体货号:100255)加入上步反应液，室温混合偶联2h；
(3)洗涤：选择合适的中空纤维柱(mPES/500KD/790cm2，SPECTRUM公司)，用切向流过滤系统(KrosFlo research IIi TFF system，SPECTRUM公司)将步骤(2)中溶液过滤，将反应缓冲液换为保存缓冲液100mM Tris 8.0，控制剪切力值为3000-4500，过滤出5倍步骤(2)体积的100mM的Tris缓冲液洗涤后完成；
(4)封闭：在步骤(3)的体系中加入20mL 20％牛血清白蛋白溶液，于室温混合1h；
(5)混合与保存：将步骤(4)获得的胶乳微球初反应液用R2稀释液(含100mM甘氨酸缓冲液，4％牛血清白蛋白、0.5％海藻糖、0.05％叠氮化钠，pH值8.0)稀释至终体积1000mL，即得到试剂R2。
III、制备ADPN校准品：取995mL水，依次加入100mM磷酸盐缓冲剂、1％氯化钠、0.2％乙二胺四乙酸二钠、3.0％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至8.0，溶液用0.22μm滤膜之后，加入市售ADPN重组抗原(Medix公司生产的货号:710013)40mg，得到配制成终浓度为40mg/L的ADPN校准品溶液。使用市售的ADPN测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)对校准品进行赋值。
制备ADPN质控品：取995mL水，依次加入100mM磷酸盐缓冲剂、1％氯化钠、0.2％乙二胺四乙酸二钠、3.0％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至8.0，溶液用0.22μm滤膜之后，取500mL加入市售ADPN重组抗原(Medix公司生产的货号:710013)15mg，得到配制成终浓度为30mg/L的ADPN质控品溶液，另取500mL加入市售ADPN重组抗原2.5mg，得到配制成终浓度为5mg/L的ADPN质控品溶液使用市售的ADPN测定试剂盒(胶乳免疫比浊法(美国diazyme公司生产的)对校准品进行赋值。
组成试剂盒：将制备的R l试剂、R2试剂按体积比R l:R2按照4:1配套组成试剂盒，试剂盒的包装规格为：R l(4×45ml/每瓶),R2(4×12ml/每瓶)。
实施例2
试剂R l的制备：取995g水，然后依次加入4.8g磷酸二氢纳、22.8g磷酸氢二纳、10.0g聚乙二醇8000、30.0g NaCl、5g EMAL 20c、2gOP-10、2g tritonx-405,和0.5gProclin300，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH至7.4：用0.22μm滤膜过滤，制成lL的试剂R l。
制备试剂R2，步骤如下：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取10ml 200nm胶乳微球(100mg/mL)，加入10mL500mM pH值为7.4的HEPES溶液、2mL新鲜配制的浓度为20mg/mL的EDC溶液，纯化水补足至终体积100mL，充分混匀，室温(20～25℃)混合30min；
(2)偶联：按微球：抗体质量比＝15:1的比例将ADPN抗体(Medix公司生产的抗体货号:100255)加入上步反应液，室温混合偶联2h；
(3)洗涤：选择合适的中空纤维柱(mPES/500KD/790cm2，SPECTRUM公司)，用切向流过滤系统(KrosFlo research IIi TFF system，SPECTRUM公司)将步骤(2)中溶液过滤，将反应缓冲液换为保存缓冲液100mM Tris 8.0，控制剪切力值为3000-4500，过滤出5倍步骤(2)体积的100mM的Tris缓冲液洗涤后完成；
(4)封闭：在步骤(3)的体系中加入20mL 20％牛血清白蛋白溶液，于室温混合1h；
(5)混合与保存：将步骤(4)获得的胶乳微球初反应液用R2稀释液(含100mM甘氨酸缓冲液，4％牛血清白蛋白、0.5％海藻糖、0.05％叠氮化钠，pH值8.0)稀释至终体积1000mL，即得到试剂R2。
III、制备ADPN校准品：取995mL水，依次加入100mM Tris缓冲剂、1％氯化钠、0.2％乙二胺四乙酸二钠、3.0％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至8.0，溶液用0.22μm滤膜之后，加入市售ADPN重组抗原(Medix)40mg，得到配制成终浓度为40mg/mL的ADPN校准品溶液。使用市售的ADPN测定试剂盒(胶乳免疫比浊法(diazyme)对校准品进行赋值。
制备ADPN质控品：取995mL水，依次加入100mM Tris缓冲剂、1％氯化钠、0.2％乙二胺四乙酸二钠、3.0％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至8.0，溶液用0.22μm滤膜之后，取500mL加入市售ADPN重组抗原15mg，得到配制成终浓度为30mg/mL的ADPN质控品溶液，另取500mL加入市售ADPN重组抗原(Medix)2.5mg，得到配制成终浓度为5mg/mL的ADPN质控品溶液使用市售的ADPN测定试剂盒(胶乳免疫比浊法DIAZYME)对校准品进行赋值。
组成试剂盒：将制备的R l试剂、R2试剂按体积比R l:R2按照4:1配套组成试剂盒，试剂盒的包装规格为：R l(4×45ml/每瓶),R2(4×12ml/每瓶)。
实施例3
试剂R l的制备：取995g水，然后依次加入4.8g磷酸二氢纳、22.8g磷酸氢二纳、10.0g聚乙二醇8000、30.0g NaCl、5g EMAL 20c、2gOP-10、2g tritonx-405,和0.5gProclin300，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH至7.4：用0.22μm滤膜过滤，制成lL的试剂R l。
制备试剂R2，步骤如下：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取10ml 200nm胶乳微球(100mg/mL)，加入10mL500mM pH值为7.4的HEPES溶液、2mL新鲜配制的浓度为20mg/mL的EDC溶液，纯化水补足至终体积100mL，充分混匀，室温(20～25℃)混合30min；
(2)偶联：按微球：抗体质量比＝15:1的比例将ADPN抗体(Medix)加入上步反应液，室温混合偶联2h；
(3)洗涤：选择合适的中空纤维柱(mPES/500KD/790cm2，SPECTRUM公司)，用切向流过滤系统(KrosFlo research IIi TFF system，SPECTRUM公司)将步骤(2)中溶液过滤，将反应缓冲液换为保存缓冲液100mM Tris 8.0，控制剪切力值为3000-4500，过滤出5倍步骤(2)体积的100mM的Tris缓冲液洗涤后完成；
(4)封闭：在步骤(3)的体系中加入20mL 20％牛血清白蛋白溶液，于室温混合1h；
(5)混合与保存：将步骤(4)获得的胶乳微球初反应液用R2稀释液(含100mM甘氨酸缓冲液，4％牛血清白蛋白、0.5％海藻糖、0.05％叠氮化钠，pH值8.0)稀释至终体积1000mL，即得到试剂R2。
III、制备ADPN校准品：取995mL水，依次加入100mM Tris缓冲剂、1％氯化钠、0.2％乙二胺四乙酸二钠、3.0％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至8.0，溶液用0.22μm滤膜之后，加入市售ADPN重组抗原(Medix)20mg，得到配制成终浓度为40mg/L的ADPN校准品溶液。使用市售的ADPN测定试剂盒(胶乳免疫比浊法(DIAZYME)对校准品进行赋值。
制备ADPN质控品：取995mL水，依次加入100mM Tris缓冲剂、1％氯化钠、0.2％乙二胺四乙酸二钠、3.0％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至8.0，溶液用0.22μm滤膜之后，取500mL加入市售ADPN重组抗原(Medix)15mg，得到配制成终浓度为30mg/L的ADPN质控品溶液，另取500mL加入市售ADPN重组抗原(Medix)2.5mg，得到配制成终浓度为5mg/L的ADPN质控品溶液使用市售的ADPN测定试剂盒(胶乳免疫比浊法(DIAZYME)对校准品进行赋值。
组成试剂盒：将制备的R l试剂、R2试剂按体积比R l:R2按照4:1配套组成试剂盒，试剂盒的包装规格为：R l(4×45ml/每瓶),R2(4×12ml/每瓶)。
实施例4
试剂R l的制备：取995g水，然后依次加入4.8g磷酸二氢纳、22.8g磷酸氢二纳、10.0g聚乙二醇8000、30.0g NaCl、2g EMAL 20c、2g OP-10、10gtritonx-405,和0.5gProclin300，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH至7.4：用0.22μm滤膜过滤，制成lL的试剂R l。
制备试剂R2，步骤如下：
(1)聚苯乙烯胶乳微球的活化：取10ml 200nm胶乳微球(100mg/mL)，加入10mL500mM pH值为7.4的HEPES溶液、2mL新鲜配制的浓度为20mg/mL的EDC溶液，纯化水补足至终体积100mL，充分混匀，室温(20～25℃)混合30min；
(2)偶联：按微球：抗体质量比＝12:1的比例将ADPN抗体(Medix)加入上步反应液，室温混合偶联2h；
(3)洗涤：选择合适的中空纤维柱(mPES/500KD/790cm2，SPECTRUM公司)，用切向流过滤系统(KrosFlo research IIi TFF system，SPECTRUM公司)将步骤(2)中溶液过滤，将反应缓冲液换为保存缓冲液100mM Tris 8.0，控制剪切力值为3000-4500，过滤出5倍步骤(2)体积的100mM的Tris缓冲液洗涤后完成；
(4)封闭：在步骤(3)的体系中加入20mL 20％牛血清白蛋白溶液，于室温混合1h；
(5)混合与保存：将步骤(4)获得的胶乳微球初反应液用R2稀释液(含100mM甘氨酸缓冲液，4％牛血清白蛋白、0.5％海藻糖、0.05％叠氮化钠，pH值8.0)稀释至终体积1000mL，即得到试剂R2。
III、制备ADPN校准品：取995mL水，依次加入100mM Tris缓冲剂、1％氯化钠、0.2％乙二胺四乙酸二钠、3.0％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至8.0，溶液用0.22μm滤膜之后，加入市售ADPN重组抗原(Medix)40mg，得到配制成终浓度为40mg/L的ADPN校准品溶液。使用市售的ADPN测定试剂盒(胶乳免疫比浊法(DIAZYME)对校准品进行赋值。
制备ADPN质控品：取995mL水，依次加入100mM Tris缓冲剂、1％氯化钠、0.2％乙二胺四乙酸二钠、3.0％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠，每次添加物料需搅拌至完全溶解，调节pH值至8.0，溶液用0.22μm滤膜之后，取500mL加入市售ADPN重组抗原15mg，得到配制成终浓度为30mg/L的ADPN质控品溶液，另取500mL加入市售ADPN重组抗原(Medix)2.5mg，得到配制成终浓度为5mg/L的ADPN质控品溶液使用市售的ADPN测定试剂盒(胶乳免疫比浊法(DIAZYME)对校准品进行赋值。
组成试剂盒：将制备的R l试剂、R2试剂按体积比R l:R2按照4:1配套组成试剂盒，试剂盒的包装规格为：R l(4×45ml/每瓶),R2(4×12ml/每瓶)。
本发明ADPN测定试剂盒的性能试验
检测工具：迪瑞AU680型全自动生化分析仪。
分析方法：两点终点法。主波长：700nm；副波长：无。取各制得的试剂R1 160μl，加入2μl血清样本，于37℃孵育5min后加入试剂R2 40μl，延迟30秒读取吸光度A1，反应270秒后读取吸光度A2，最终反应吸光度的计算为A2与A1的差值。
校准模式：多点非线性。反应方向：上升。
计算方法：根据吸光度与校准品的不同浓度做出校准曲线。测试血清样本获得吸光度，根据校准曲线计算得到样本含量。
参考范围：≥5mg/L。
I、本发明试剂盒的线性测试
将各实施例制备的ADPN校准品用水分别稀释至0mg/mL、6.25mg/L、12.5mg/L、25mg/L、40mg/L，并用对应制备的试剂R1、试剂R2测试校准曲线。以实施例4为例，如图1所示为实施例4的试剂盒线性侧视图，图中X轴表示理论值(mg/L)，Y轴表示实测值(mg/L)，R2＝0.999，Y＝1.003X+0.056。说明本发明试剂盒在浓度0～40mg/L范围内线性关系良好。
II、本发明试剂盒与进口对照试剂盒的灵敏度与相关性试验
将各实施例试剂盒与进口对照试剂盒(胶乳免疫比浊法(DIAZYME)分别测试不同浓度校准品，吸光度对比如表1所示。说明本发明试剂盒具有较高的灵敏度。
表1
Figure BDA0003916966630000111
将实施例4试剂盒与进口对照试剂盒(胶乳免疫比浊法)分别测试校准曲线。并测试40例不同浓度临床血清样本，检测结果如图2所示，两者的线性相关系数R2＝0.999，相关性良好。
试剂1都采用的磷酸盐缓冲液，聚丙烯酸的增敏效果最好，无论低值还是高值的灵敏度有显著提升，但是20-40范围内的灵敏度区分较弱，因此需要综合判断。不同浓度的表面活性剂比例的组合比对照试剂灵敏度都有显著提升。
III、本发明试剂盒的批间差测试
依照实施例4所述的实验方法，重复制备三批次ADPN试剂盒，分别测试不同浓度校准品，吸光度对比如表2所示。结果说明本发明使用ADPN胶乳免疫比浊试剂盒批间差小，重复性好。
表2
校准品浓度(mg/L) 第一批吸光度 第二批吸光度 第三批吸光度
2.5 0.0463 0.0442 0.0469
5 0.0925 0.0936 0.0929
10 0.1859 0.1846 0.1862
20 0.3362 0.3295 0.3378
40 0.5186 0.5123 0.5198
IV、本发明试剂盒的抗干扰测试
取体检正常的健康人血液样本(样本来源于本公司员工自采的样本)15mg/L样本，分别精密量取高浓度干扰物与血清混合，制成不同干扰物浓度的混合样本(如表3所示)，每个样本重复测定3次，取其平均值。干扰度的计算方法为：
干扰度＝加干扰物样本均值/未加干扰物样本均值×100％
干扰度在90％～110％之间为可接受干扰范围。
表3
Figure BDA0003916966630000121
结果说明：如图3和图4所示，低值质控5mg/L,高值质控30mg/L,再里面添加量了上图不同浓度抗干扰物，所示与未添加干扰物样本相比，添加后测值均能控制在±5％以内，同时与之前发明相比本试剂盒可接受的干扰物更高，抗干扰能力更强。
V、本发明试剂盒的效期稳定性测试
在2～8℃储存条件下，将实施例2配制好的试剂盒分别于0月、3月、6月、9月、12月、14月对同一高值质控品(30mg/L)和血低值质控品(5mg/L)进行检测，每个样本测定5次取平均值(结果如图4所示)。结果说明本发明试剂盒可在2～8℃条件下稳定储存一年。
从上述实施例可知本发明研究制备的ADPN测定试剂盒抗干扰能力强、线性好、稳定性好、批间差小等优点，可进行大批量工业化生产，有较好的临床应用前景。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明内容及附图内容所做的直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒，包括试剂R1、试剂R2及校准品和质控品，其特征在于，所述的试剂R1中含有抗干扰剂，该抗干扰剂包括聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠盐，质量含量为0.1％-0.5％；乳化剂，质量含量为0.2％-1％；曲拉通，质量含量为0.2％-1％。
2.根据权利要求1所述的一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒，其特征在于，所述的聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠盐包括花王EMAL 20C；
所述的乳化剂包括乳化剂op-10；
所述的曲拉通包括tritonx-405。
3.根据权利要求1所述的一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1还包括缓冲液、增敏剂、电解质和防腐剂；
其中，缓冲液是常见缓冲液，其使用浓度为25-150mM，pH为6.5-9.0；
所述的增敏剂质量含量为0.5％-10％；
所述的电解质质量含量为0.5％-5％；
所述的防腐剂质量含量为0.02％-2％。
4.根据权利要求3所述的一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中所述的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、TRIS缓冲液或MOPSO缓冲液，pH为7.0-8.0；
所述的增敏剂包括聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或PAA中的一种或多种；
所述的电解质包括常见氯化钾；
所述的防腐剂包括叠氮化钠或Proclin300中的一种或两种。
5.根据权利要求1所述的一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂R2包括连有ADPN抗体的胶乳微球、缓冲液、稳定剂和防腐剂；
其中，连有ADPN抗体的胶乳微球的胶乳微球的直径为100-300nm，连有ADPN抗体的胶乳微粒的质量含量为2％～10％；
所述缓冲液pH值为6.5-9.0；
所述稳定剂的质量含量为0.5％-5％；
所述防腐剂的质量含量为0.02％-2％。
6.根据权利要求5所述的一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒，其特征在于，试剂R2中，
所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)、硼酸盐缓冲液、HEPES溶液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；缓冲液pH值为7.0-8.0；
所述连有ADPN抗体的胶乳微球为ADPN单抗或多抗连接在聚苯乙烯羧基微球上；
所述稳定剂为山梨醇、牛血清白蛋白、海藻糖中的一种或多种，
所述防腐剂为叠氮化钠或Proclin300中的一种或两种。
7.根据权利要求1所述的一种脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒，其特征在于，所述的校准品及质控品为重组或天然ADPN蛋白。
8.一种如权利要求1-7中任一所述的脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
I、试剂R1制备：
取适量纯化水，然后依次加入缓冲液、抗干扰剂、增敏剂、电解质、防腐剂，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5-9.0，过滤；
II、试剂R2制备：
取粒径120～250nm的胶乳微球，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，20℃-25℃混合活化30min，然后加入脂联素抗体于20℃-25℃反应2h进行共价偶联，得到的胶乳微球反应液洗涤后加入牛血清白蛋白封闭微球上未偶联抗体的羧基位点，使用含稳定剂、防腐剂、缓冲液的R2稀释液，稀释3～15倍，最终得到试剂R2，于4℃保存；
III、校准品及质控品制备：将天然或重组ADPN蛋白用冻干稀释液进行稀释至目标浓度，进行冻干，于4℃保存；
VI、组成试剂盒：
将上述制备的试剂R1和试剂R2按体积比R1：R2＝4:1分装入瓶，与校准品及质控品组成试剂盒。
9.根据权利要求8所述的脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒的制备方法，其特征在于，试剂R1的制备中过滤采用0.22μm滤膜。
10.根据权利要求8所述的脂联素胶乳免疫比浊测定试剂盒的制备方法，其特征在于，胶乳微球反应液的洗涤方式为离心去掉上清，除去游离抗体和小分子杂质；
封闭微球上未偶联抗体的羧基位点的时间为1h。
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