CN115343483A - 一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115343483A CN115343483A CN202210969050.5A CN202210969050A CN115343483A CN 115343483 A CN115343483 A CN 115343483A CN 202210969050 A CN202210969050 A CN 202210969050A CN 115343483 A CN115343483 A CN 115343483A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tmb
- quality control
- solution
- kit
- control band
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
Abstract
本发明属生物医药领域,具体公开了一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒,包括反应膜条、封闭液、显色系统、洗涤缓冲液、样本稀释液和终止液,所述显色系统包括酶结合物、显色底物,所述显色底物为自制TMB显色液,所述自制TMB显色液包括吐温80、乳酸钠。通过加入优化配比后的非离子表面活性剂吐温80、乳酸钠,促进TMB的溶解和稳定,使单相TMB显色液可以长期稳定保存,性能极其优异,说明本发明所公开的TMB显色液具有高效稳定的特点。本试剂盒通过重复性试验、阴阳性符合率试验,证实了重复性良好,准确度较高,为自身免疫性糖尿病的临床诊断提供血清学依据,为自身免疫性糖尿病患者的病程检测及治疗后提供全面指导。
Description
技术领域
本发明属生物医药领域,涉及一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒及其制备方法。
背景技术
正常机体的免疫系统具有区别“自己”和“非己”的能力,对非己抗原能够发生免疫应答,对自身抗原则处于无应答或微弱应答状态,称为免疫耐受。自身免疫病是在某些内因和外因诱发下,自身免疫耐受状态被打破,持续迁延的自身免疫对自身抗原产生异常的免疫应答,造成了自身细胞破坏、组织损伤或功能异常,导致的临床病症。自身免疫性疾病突出表现为血清中多种自身抗体的形成及全身多脏器损伤。在自身免疫性疾病中,1型糖尿病较常见。
自身免疫介导的1型糖尿病一般是由于自体免疫系统破坏产生胰岛素的β细胞导致的,目前,1、2型糖尿病尚不能完全治愈,但是自从1921年医用胰岛素发现以来,糖尿病得到了很好的治疗和控制。在1型糖尿病患者血清中存在多种自身抗体,主要有胰岛细胞抗体(ICA)、谷氨酸脱羟酶抗体(GADA)、胰岛素自身抗体(IAA)、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)、锌转运蛋白8抗体(Znt-8A)等。
胰岛细胞抗体(ICA)为抗胰岛β细胞所有抗体的总称。目前认为,ICA阳性预示β细胞的自身免疫损害,只能作为糖尿病的高危指标。在儿童阳性或高水平持续阳性,对l型糖尿病才具有较高的预测率。
谷氨酸脱羧酶(GAD)是人及动物体内抑制神经递质γ-氨基丁酸的合成酶。1型糖尿病是遗传易感个体通过自身抗原介导的免疫反应所引起胰岛β细胞破坏的自身免疫性疾病,GAD是此免疫反应关键的始动靶抗原,因此GAD-Ab是糖尿病前期个体较特异的免疫指标。GAD-Ab的测定意义为:①可作为1型糖尿病的预测;②从2型糖尿病患者中鉴别迟发型1型糖尿病,此类患者常可出现GAD-Ab的高水平,并稳定维持,可考虑早期干预治疗;③可作为普查手段,以发现1型糖尿病的高危人群和个体。
胰岛素自身抗体(IAA)出现在未使用过外源性胰岛素或使用时间不超过7-10天的个体中产生针对内源性胰岛素的自身抗体,与年龄呈负相关,随着增龄,IAA阳性率呈现下降趋势,被认为是持续时间最短的抗体。IAA单独测定意义不大,但与ICA、GAD等联合检测,可增加对1型糖尿病的预测程度。
蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)特异性较强,在不伴有1型糖尿病的自身免疫患者中较少发现。可作为1型糖尿病高危人群筛查指标。
锌转运蛋白8抗体(Znt-8A)具有高度的β细胞特异性,锌转运蛋白8(Znt-8)抗原是通过影响锌离子浓度而在胰岛素合成和分泌中发挥重要作用,对糖尿病自身抗体免疫介导的1型糖尿病有着重要的诊断和预测价值。特别是其他自身抗体阴性的患者有着重要的诊断价值。
本申请针对自身免疫性1型糖尿病的多种抗体同时进行检测(采用免疫印迹法),利于对患者进行及时的诊断和正确的治疗,减少和延缓糖尿病并发症的发生和发展。
公开号为CN107449904A的专利公开了一种自身免疫性糖尿病检测用反应膜条、制备和使用方法,虽然能够一次性检测9种抗体,但采用了TMB作为显色液,TMB存在两个问题,一是溶解度低,容易沉淀,干扰检测结果,二是易被空气环境中氧气及溶液中过氧化物氧化,单组分TMB存在存储时间短、显色背景高的问题。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种多项联检的自身免疫性糖尿病检测试剂盒,对显色系统进行了改进,在提高了溶解度的基础上,长时间保存也较稳定。
本发明的第二目的在于提供上述试剂盒的显色系统及其制备方法。
为解决上述技术问题,本发明特采用如下技术方案:
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种多项联检的自身免疫性糖尿病检测试剂盒,包括反应膜条、封闭液、显色系统、洗涤缓冲液、样本稀释液和终止液。
优选的,所述膜条上设有检测带、质控带。
所述检测带包括有包被ICA抗原的第一检测带,
包被GADA抗原的第二检测带,
包被IAA抗原的第三检测带,
包被IA-2A抗原的第四检测带,
包被Znt-8A抗原的第五检测带。
所述质控带包括第一质控带、第二质控带、第三质控带,所述第一质控带为强阳性质控带,第二质控带为中等阳性质控带,第三质控带为弱阳性质控带。
所述第一质控带包被浓度为30-50μg/mL的人IgG。
所述第二质控带包被浓度为11-29μg/mL的人IgG。
所述第三质控带包被浓度为1-10μg/mL的人IgG。
优选的,所述显色系统包括酶结合物、显色底物。
优选的,所述酶结合物为辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG。
优选的,所述显色底物为自制TMB显色液,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡10min,加入5mL吐温80继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L,pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入2g乳酸钠、150mg过硼酸钠,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
本发明的另一方面,本发明提供上述显色系统的制备方法,
所述显色系统包括酶结合物、显色底物,所述酶结合物为辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG。所述显色底物为自制TMB显色液。
所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡10min,加入5mL吐温80继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L,pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入2g乳酸钠、150mg过硼酸钠,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
本发明还提供了上述试剂盒的制备方法,包括:采用点样机在硝酸纤维膜上包被抗原、质控品,将硝酸纤维膜固定于PVC板上,切割成单人份反应膜条,另外准备酶结合物、显色底物、封闭液、洗涤缓冲液、样本稀释液和终止液,放置于容器内,作为试剂盒备用。
本发明还提供了上述试剂盒在1型糖尿病检测中的应用,如下:
将包被好抗原的反应膜条用洗涤缓冲液润湿,放入孵育板槽内,在室温下将孵育板置于摇床(每分钟摇摆20次,下同)上振荡孵育1至2分钟,倒出洗涤缓冲液。
在孵育板槽中加入10μl的经稀释液稀释后的待测样品,盖好孵育板,于室温下在摇床上振荡孵育过夜,在孵育板槽中加入2mL洗涤缓冲液,振荡2分钟,重复3次,倒出洗涤缓冲液;加入2mL HRP标记的鼠抗人二抗,盖好孵育板,于室温下在摇床上振荡孵育30分钟;加入5mL洗涤缓冲液,振荡2分钟,重复3次,倒出洗涤缓冲液;加2mL自制TMB显色液,盖上孵育板盖,于室温下孵育10分钟;打开孵育板盖,吸出底物液,以终止液终止反应。
根据是否出现条带进行检测结果判断。查看质控带、检测带,第一质控带、第二质控带、第三质控带条带出现,且深浅依次降低,即为检测结果有效,查看检测带,进行判读。
本发明的优点有:
本发明为TMB单相显色液,使用时无需混合,简化操作流程,方便快捷,极大的减少人为操作误差。过硼酸钠与过氧化氢、过氧化脲相比,具有更好的氧化性,采用过硼酸钠作为氧化剂,氧化效率更高,显色效果更好。此外,通过加入优化配比后的非离子表面活性剂吐温80、乳酸钠,促进TMB的溶解和稳定,使单相TMB显色液可以长期稳定保存,性能极其优异,在2-8℃条件下长时间保存。说明本发明所公开的TMB显色液具有高效稳定的特点。
本试剂盒可实现一份样本同时检测5种抗体,得到5种自身免疫性1型糖尿病检测指标的检测结果,为自身抗体免疫性糖尿病的临床诊断提供血清学依据;具有强阳、中阳、弱阳质控带,使结果判断更为直观准确,为自身免疫性1型糖尿病的病程检测及治疗后提供全面指导。通过重复性试验、阳性符合率、阴性符合率试验,证实了本试剂盒重复性良好,且阳性符合率、阴性符合率均为100%,准确度较高。
附图说明
图1为本发明实施例1-9中制备的显色液的灵敏度试验结果;
图2为实施例1制备的TMB显色液的稳定性试验结果;
图3为实施例1制备的TMB显色液商业化TMB显色液的显色性能进行比较的稳定性试验结果。
具体实施方式
下述实施例对本发明作更详细的说明,它们并不构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法,如无特别说明,均为常规方法。以下实施例中所用试剂如无特殊说明均为市售普通试剂。
部分原料来源列举:
名称 | 生产商 | 批号 |
吐温80 | 上海源叶 | S15020-500mL |
TMB | 长沙雁飞 | C0007-10KG |
无水乙醇 | 江苏雷恩 | LE000543-kg |
醋酸钠缓冲液 | 上海源叶 | S41791-1kg |
HRP标记小鼠抗人IgG二抗 | Southern Biotech | 9200-05 |
实施例1
本实施例提供了一种多项联检的自身免疫性糖尿病检测试剂盒,包括反应膜条、封闭液、显色系统、洗涤缓冲液、样本稀释液和终止液。
所述反应膜条上设有检测带、质控带;
所述检测带包括有包被ICA抗原的第一检测带,
包被GADA抗原的第二检测带,
包被IAA抗原的第三检测带,
包被IA-2A抗原的第四检测带,
包被Znt-8A抗原的第五检测带。
所述质控带包括第一质控带、第二质控带、第三质控带,所述第一质控带为强阳性质控带,第二质控带为中等阳性质控带,第三质控带为弱阳性质控带。
所述第一质控带包被浓度为30-50μg/mL的人IgG。
所述第二质控带包被浓度为11-29μg/mL的人IgG。
所述第三质控带包被浓度为1-10μg/mL的人IgG。
所述显色系统包括酶结合物、显色底物。
所述酶结合物为辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG。
所述显色底物为自制TMB显色液。
所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡10min,加入5mL吐温80继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L,pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入2g乳酸钠、150mg过硼酸钠,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
所述洗涤缓冲液为20×Tris缓冲液。
所述样本稀释液含封闭剂的Tris缓冲液。
所述终止液为0.05mol/L硫酸。
本实施例还提供了上述试剂盒在自身免疫性1型糖尿病检测中的应用,如下:
将包被好抗原的反应膜条用洗涤缓冲液润湿,放入孵育板槽内,在室温下将孵育板置于摇床(每分钟摇摆20次,下同)上振荡孵育1至2分钟,倒出洗涤缓冲液。
在孵育板槽中加入10μl的经稀释液稀释后的待测样品,盖好孵育板,于室温下在摇床上振荡孵育过夜,在孵育板槽中加入2mL洗涤缓冲液,振荡2分钟,重复3次,倒出洗涤缓冲液;加入2mLHRP标记的鼠抗人二抗,盖好孵育板,于室温下在摇床上振荡孵育30分钟;加入5mL洗涤缓冲液,振荡2分钟,重复3次,倒出洗涤缓冲液;加2mL自制TMB显色液,盖上孵育板盖,于室温下孵育10分钟;打开孵育板盖,吸出底物液,以终止液终止反应。
根据是否出现条带进行检测结果判断。查看质控带、检测带,第一质控带、第二质控带、第三质控带条带出现,且深浅依次降低,即为检测结果有效,查看检测带,进行判读。
实施例2
本实施例提供了另一种自制TMB显色液的制备方法,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡,混合均匀后加入5mLDMSO继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L、pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入2g乳酸钠、150mg过硼酸钠,用锡箔纸包裹住容器,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
实施例3
本实施例提供了又一种自制TMB显色液的制备方法,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡,混合均匀后加入5mLDMSO继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L、pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入150mg过硼酸钠,用锡箔纸包裹住容器,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
实施例4
本实施例提供了又一种自制TMB显色液的制备方法,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,加入2mL吐温80振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L、pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入2g乳酸钠,150mg过硼酸钠,用锡箔纸包裹住容器,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
实施例5
本实施例提供了又一种自制TMB显色液的制备方法,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡,混合均匀后加入20mL吐温80继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L、pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入2g乳酸钠,150mg过硼酸钠,用锡箔纸包裹住容器,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
实施例6
本实施例提供了又一种自制TMB显色液的制备方法,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡,混合均匀后加入60mL吐温80继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L、pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入2g乳酸钠,150mg过硼酸钠,用锡箔纸包裹住容器,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
实施例7
本实施例提供了又一种自制TMB显色液的制备方法,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡,混合均匀后加入5mL吐温80继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L、pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入10g乳酸钠,150mg过硼酸钠,用锡箔纸包裹住容器,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
实施例8
本实施例提供了又一种自制TMB显色液的制备方法,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡,混合均匀后加入60mL吐温80继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L、pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入20g乳酸钠,150mg过硼酸钠,用锡箔纸包裹住容器,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
实施例9
本实施例提供了又一种自制TMB显色液的制备方法,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡,混合均匀后加入60mL吐温80继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L、pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A。
(2)向上述混合液A中加入0.1g乳酸钠,150mg过硼酸钠,用锡箔纸包裹住容器,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
实施例10
为了对上述实施例中的显色液灵敏度进行比较。本实施例利用HRP标记鼠抗人二抗做梯度稀释(1:500、1:1000、1:2000、1:4000)后,取2μL在硝酸纤维素膜上划线,待完全吸收后,分别浸泡于上述实施例1-9所配制的TMB显色液,浸泡10分钟后用终止液终止显色。
结果如图1所示,横坐标分别代表实施例1-9,纵坐标代表稀释梯度,从图1可以看出,实施例1、4、5、9的单组分TMB显色液对全部稀释梯度的HRP标记的鼠抗人二抗均能够检出,实施例2、3、6、7、8在最大稀释梯度(1:4000)无法检出,实施例1检测效果最好,实施例4、5、9效果次之、实施例2、3、7效果更次之,实施例1与实施例2的区别仅在于实施例加入了吐温80,实施例2加入了常见的溶解剂DMSO,这表明,吐温80在本方法中具有更好的效果,对于TMB有更好的溶解性,极大程度提升了显色液的性能。实施例1、4、5、6的区别仅在于吐温80的用量有所区别,在实施例6中,当吐温80达到60mL时,反而显色效果不好,这说明吐温80的用量在2-20mL是较为合适的,其中5mL是最优的。实施例1、7、8、9的区别在于乳酸钠的用量不同,实施例8乳酸钠用量20g,显色效果较差,这说明乳酸钠较优用量介于0.1-10g,其中最佳用量为0.1-2g。综上表明,实施例1、4、6、9的显色液制备方法具有较高的灵敏度,其中实施例1的单组分TMB显色液具有最高的灵敏度。
实施例11
为了对本发明自制TMB显色液稳定性进行验证。本实施例利用HRP标记鼠抗人二抗做梯度稀释(1:500、1:1000、1:2000、1:4000)后,取2μL在硝酸纤维素膜上划线,待完全吸收后,分别浸泡于经过不同条件保存后的TMB显色液中,浸泡10分钟后用终止液终止显色。其中TMB显色液采用上述实施例1的方法配制。分别为室温存放一年、半年和新鲜配制。
结果如图2所示,横坐标分别代表实施例1配制的TMB显色液的存放时间,纵坐标代表稀释梯度,从图2中可以看出,室温存放一年的TMB显色液与新鲜配制的TMB显色液对HRP标记的鼠抗人二抗的检测灵敏度无明显差异,这表明本发明的单组分TMB显色液稳定性优越,在4℃能存放更长时间,且性能优异。
实施例12
为了比较本发明中自制TMB显色液与商业化TMB显色液的显色性能进行比较。利用HRP标记鼠抗人二抗做梯度稀释后,本实施例利用HRP标记的鼠抗人二抗做梯度稀释(1:500、1:1000、1:2000、1:4000)后,取2μL在硝酸纤维素膜上划线,待完全吸收后,分别浸泡于上述实施例1所配制的TMB显色液与商业化单组份TMB显色液(碧云天,货号P0209)中,浸泡10分钟后用终止液终止显色。
结果如图3所示,横坐标分别代表实施例1配制的TMB显色液和商业化单组份TMB显色液,纵坐标代表稀释梯度,从图3中可以看出,本产品的显色液的性能明显优于商业化的TMB显色液,尤其是在1:1000-1:4000的稀释梯度下。
实施例13
将实施例1中配制好的TMB显色液分别40℃放置90天或者24℃放置180天或者在4℃放置360天。结果如表1所示。
表1实施例1在不同温度下的稳定性
天数 | 温度 | 外观 | 沉淀情况 |
90天 | 4℃ | 无色 | 无沉淀 |
90天 | 24℃ | 无色 | 无沉淀 |
90天 | 40℃ | 无色 | 无沉淀 |
180天 | 4℃ | 无色 | 无沉淀 |
180天 | 24℃ | 无色 | 无沉淀 |
180天 | 40℃ | 无色 | 无沉淀 |
360天 | 4℃ | 无色 | 无沉淀 |
360天 | 24℃ | 无色 | 无沉淀 |
360天 | 40℃ | 无色 | 无沉淀 |
实施例14
为了验证本试剂盒的重复性,采用同样的病人血清样本进行15次检测。
准备15份实施例1中制备的反应膜条,用洗涤缓冲液润湿,放入孵育板槽内,在室温下将孵育板置于摇床上振荡孵育1至2分钟,倒出洗涤缓冲液。
在孵育板槽中加入10μl的经稀释液稀释后的待测血清,盖好孵育板,于室温下在摇床上振荡孵育过夜,在孵育板槽中加入2mL洗涤缓冲液,振荡2分钟,重复3次,倒出洗涤缓冲液;加入2mL HRP标记的鼠抗人二抗,盖好孵育板,于室温下在摇床上振荡孵育30分钟;加入5mL洗涤缓冲液,振荡2分钟,重复3次,倒出洗涤缓冲液;加2mL自制TMB显色液,盖上孵育板盖,于室温下孵育10分钟;打开孵育板盖,吸出底物液,以终止液终止反应。
根据出现条带情况进行检测结果判断。结果如表2所示,15份反应膜条结果一致,这说明了本试剂盒重复性良好。
表2本试剂盒的重复性试验结果
实施例15
为了检测本试剂盒的阳性符合率,检测50例ICA抗原阳性样本,检测结果均为阳性。即阳性符合率为100%,假阴性率为0。
实施例16
检测20例阴性样本,样本来源为临床样本,检测结果均为阴性,即阴性符合率为100%,假阳性率为0。
综上,本申请针对自身免疫性1型糖尿病的多种抗体同时进行检测(采用免疫印迹法),利于对患者进行及时的诊断和正确的治疗,减少和延缓糖尿病并发症的发生和发展。传统TMB存在两个问题,一是溶解度低,容易沉淀,干扰检测结果,二是易被空气环境中氧气及溶液中过氧化物氧化,单组分TMB存在存储时间短、显色背景高的问题。本申请对传统TMB显色液进行了改进,为TMB单相显色液,使用时无需混合,简化操作流程,方便快捷,极大的减少人为操作误差。采用过硼酸钠取代过氧化氢、过氧化脲,过硼酸钠具有更好的氧化性,氧化效率更高,显色效果更好,此外,通过实施例10的对比实验,本申请人意外发现在TMB显色液中加入吐温80和乳酸钠,可以极大提高TMB显色液的稳定性和溶解度,通过实施例10的对比实验发现最佳配比,本申请人通过加入优化配比后的非离子表面活性剂吐温80、乳酸钠,促进TMB的溶解和稳定,使单相TMB显色液可以长期稳定保存,性能极其优异,实施例11中在室温下保存了1年的显色液与新鲜配制的显色液并无差异,实施例12中与商业化显色液进行对比实验,明显优于商业化TMB显色液,这说明本发明所公开的TMB显色液具有高效稳定的特点。
本试剂盒可实现一份样本同时检测5种自身免疫性糖尿病抗体,得出5种检测指标的检测结果,为自身抗体免疫性糖尿病的临床诊断提供血清学依据;且具有强阳、中阳、弱阳质控带,使结果判断更为直观准确,为自身免疫性糖尿病的病程检测及治疗后提供全面指导。通过实施例14-16的重复性试验、阳性符合率、阴性符合率试验,证实了本试剂盒重复性良好,且阳性符合率、阴性符合率均为100%,准确度较高。
Claims (10)
1.一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒,其特征在于,包括反应膜条、封闭液、显色系统、洗涤缓冲液、样本稀释液和终止液;所述显色系统包括酶结合物、显色底物;所述显色底物为自制TMB显色液;所述自制TMB显色液包括吐温80、乳酸钠。
2.如权利要求1所述的一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒,其特征在于,所述吐温80为2-20mL,乳酸钠为0.1-10g。
3.如权利要求1所述的一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒,其特征在于,所述吐温80为5mL,乳酸钠为2g。
4.如权利要求1所述的一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒,其特征在于,所述反应膜条上设有检测带、质控带;
所述检测带包括有包被ICA抗原的第一检测带,
包被GADA抗原的第二检测带,
包被IAA抗原的第三检测带,
包被IA-2A抗原的第四检测带,
包被Znt-8A抗原的第五检测带。
5.如权利要求4所述的一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒,其特征在于,所述质控带包括第一质控带、第二质控带、第三质控带,所述第一质控带为强阳性质控带,第二质控带为中等阳性质控带,第三质控带为弱阳性质控带;
所述第一质控带包被浓度为30-50μg/mL的人IgG;
所述第二质控带包被浓度为11-29μg/mL的人IgG;
所述第三质控带包被浓度为1-10μg/mL的人IgG。
6.如权利要求1所述的一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒,其特征在于,所述显色系统包括酶结合物、显色底物;
所述酶结合物为辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG;
所述显色底物为自制TMB显色液。
7.如权利要求6所述的一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒,其特征在于,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mgTMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡10min,加入2-10mL吐温80继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L,pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A;
(2)向上述混合液A中加入0.1-10g乳酸钠、150mg过硼酸钠,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
8.如权利要求6所述的一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒,其特征在于,所述自制TMB显色液包括如下步骤:
(1)称取150mg TMB粉末,溶解于5mL无水乙醇中,充分振荡10min,加入5mL吐温80继续振荡,完全溶解后加入到浓度为0.1mol/L,pH值为5.5的醋酸钠缓冲液中,得到混合液A;
(2)向上述混合液A中加入2g乳酸钠、150mg过硼酸钠,充分混匀,0.22μm滤纸过滤,即得所述自制单组分TMB显色液,避光4℃保存。
9.一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒的制备方法,其特征在于,采用点样机在硝酸纤维膜上包被抗原、质控品,将硝酸纤维膜固定于PVC板上,切割成单人份反应膜条,另准备酶结合物、显色底物、封闭液、洗涤缓冲液、样本稀释液和终止液,共同放置于容器内,备用。
10.权利要求1中所述试剂盒在自身免疫性糖尿病检测中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210969050.5A CN115343483A (zh) | 2022-08-12 | 2022-08-12 | 一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210969050.5A CN115343483A (zh) | 2022-08-12 | 2022-08-12 | 一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115343483A true CN115343483A (zh) | 2022-11-15 |
Family
ID=83952457
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210969050.5A Pending CN115343483A (zh) | 2022-08-12 | 2022-08-12 | 一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115343483A (zh) |
-
2022
- 2022-08-12 CN CN202210969050.5A patent/CN115343483A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101377492B (zh) | 胱抑素c测定试剂盒 | |
JP5963900B2 (ja) | オートタキシン測定による悪性リンパ腫の検査方法および検査薬 | |
EP1167970B1 (en) | Method for determining a white blood cell count of a whole blood sample | |
CN109596843B (zh) | 一种血清淀粉样蛋白a的测定试剂盒 | |
Osborne et al. | Immunofluorescent monoclonal antibody detection of breast cancer in bone marrow: sensitivity in a model system | |
JP3551678B2 (ja) | ヘモグロビンA1cの測定法及びキット | |
CN112526134A (zh) | 一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒 | |
US20180100855A1 (en) | Sensitive And Rapid Methods of Using Chimeric Receptors to Identify Autoimmune Disease And Assess Disease Severity | |
CN111057150B (zh) | 一种乳胶微球及其应用以及糖化血红蛋白检测试剂盒 | |
CN110361547B (zh) | 一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途 | |
CN109917134A (zh) | 一种校准品稳定剂、测定c肽的检测试剂盒及检测方法 | |
CN112946255A (zh) | 一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用 | |
CN107045062A (zh) | 检测人ngal的胶体金免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法 | |
CN109324181B (zh) | 一种免疫层析用封闭剂组合物、用途、及免疫层析试剂盒的制备方法 | |
CN110988358A (zh) | 一种高灵敏度人尿液α2-巨球蛋白检测试剂盒 | |
EP1664775A1 (en) | Composition for the diagnosis of retinal vascular disease comprising aldolase and method for diagnosis using it | |
CN104820099A (zh) | 一种同时检测血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒及其应用 | |
CN115343483A (zh) | 一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒及其制备方法 | |
CN115097138B (zh) | 一种缓冲液在pgp 9.5检测试剂盒中的应用 | |
CN112240931B (zh) | 一种免疫比浊试剂盒 | |
CN110687285B (zh) | 诊断试剂盒及mak16在制备系统性红斑狼疮早期诊断试剂中的应用 | |
CN112485441A (zh) | 一种抗链球菌溶血素o检测试剂盒 | |
CN115873839B (zh) | 一种检测mog抗体滴度的检测材料及其制备方法 | |
CN118033148A (zh) | 一种用于检测抗mda5抗体的荧光免疫层析试纸条 | |
CN114047338B (zh) | 一种尿液转铁蛋白检测试剂盒及其检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |