CN112946255A - 一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用 - Google Patents

一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112946255A
CN112946255A CN202110165268.0A CN202110165268A CN112946255A CN 112946255 A CN112946255 A CN 112946255A CN 202110165268 A CN202110165268 A CN 202110165268A CN 112946255 A CN112946255 A CN 112946255A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reagent
concentration
magnetic particle
antibody
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110165268.0A
Other languages
English (en)
Inventor
刘健
沈林
陈汝彬
靳启航
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Yonghe Sunshine Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hunan Yonghe Sunshine Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Yonghe Sunshine Biotechnology Co ltd filed Critical Hunan Yonghe Sunshine Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110165268.0A priority Critical patent/CN112946255A/zh
Publication of CN112946255A publication Critical patent/CN112946255A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明提供了一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用，属于体外诊断试剂技术领域。所述试剂包括由2～8μg/ml磁微粒标记KL‑6抗体1、20％～30％初生牛血清、0.01％～0.1％防腐剂、20％～30％甘油、0.01％～0.1％吐温20、0.1％～1％BSA和50％～70％PBS缓冲液组成的磁微粒试剂和6～10μg/ml吖啶酯标记KL‑6抗体2、10％～40％的甘油、0.5％～5％的BSA和60％～90％PBS缓冲液组成的吖啶酯试剂。KL‑6检测试剂盒具有灵敏度高、精密度好、准确度高的特点，有优秀抗干扰能力，且在40000IU/mL高浓度样本下未出现明显的HOOK效应。

Description

一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及 其应用
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用。
背景技术
Kohno于1985年发现，利用人肺腺癌细胞系(VMRC-LCR)免疫小鼠制备了多株单克隆抗体，将其中的第6号抗体识别的涎液化糖链抗原命名为KL-6。KL-6属于分类为Cluster9的上皮性粘蛋白1(MUC1)，表达于Ⅱ型肺泡上皮细胞表面，在正常肺组织和终末细支气管上皮细胞只有极少量表达，在退变的Ⅱ型肺泡上皮细胞表达增强。
KL-6对判断Ⅱ型肺泡上皮细胞的功能具有特异性。若肺部基底膜的损害，可致血管通透性增加，使KL-6入血。血清KL-6可反映肺泡损伤，II型肺泡细胞再生和多种间质性肺疾病的活动度。KL-6水平能敏感地反映肺泡上皮和间质的损伤程度。近年来多项研究报道，KL-6高水平表达可能与间质性肺疾病(ILD)、急性肺损伤、放射性肺炎、病毒性肺炎、药物相关性间质性肺炎、肿瘤等疾病相关联，其作用可能是促进成纤维细胞增殖和迁徙，从而影响纤维化的发生和发展。
目前，临床或实验室对于KL-6检测的方法有免疫比浊法和酶促化学发光法。免疫比浊有检测灵敏度低、高浓度样本容易发生HOOK效应等缺陷，而酶促化学发光法虽解决了灵敏度问题，但反应时间较长，需要开放一种反应时间短的快速检验方法来测定KL-6。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂，以化学发光效率较高的吖啶酯为化学发光试剂实现快速检测涎液化糖链抗原的目的。
本发明提供了一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂，包括磁微粒试剂和吖啶酯试剂；
所述磁微粒试剂包括2～8μg/ml磁微粒标记的KL-6抗体1、体积浓度20％～30％初生牛血清、质量浓度0.01％～0.1％的Proclin300、体积浓度20％～30％甘油、体积浓度0.01％～0.1％吐温20、质量浓度0.1％～1％BSA和体积浓度50％～70％pH值为7.4的PBS缓冲液；
所述吖啶酯试剂包括6～10μg/ml吖啶酯标记的KL-6抗体2、体积浓度10％～40％的甘油、质量浓度0.5％～5％的BSA和60％～90％、pH值为7.4的PBS缓冲液。
优选的，所述磁微粒标记的KL-6抗体1中KL-6抗体1为北京博尔迈生物技术有限公司生产的货号为8MKL-61SA的KL-6单克隆抗体。
优选的，所述吖啶酯标记的KL-6抗体2中KL-6抗体2为北京博尔迈生物技术有限公司生产的货号为8MKL-62SA的KL-6单克隆抗体。
优选的，还包括磁珠清洗液、化学发光试剂和KL-6标准品。
优选的，所述磁珠清洗液包括含体积浓度0.01％～0.1％Proclin300、0.2M的2-(N-吗啉代)乙磺酸的水溶液。
本发明提供了一种所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂盒，包括所述试剂。
本发明提供了所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或所述试剂盒在非诊断目的的检测血液样本中KL-6含量的应用。
本发明提供了所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂在制备检测血液样本中KL-6的试剂盒中的应用。
优选的，所述血液样本包括血清或血浆；
所述血液样本中KL-6浓度不高于40000IU/mL。
优选的，在所述血液样本中，甘油三酯的浓度不高于1000mg/dL，胆红素的浓度不高于40mg/dL，血红蛋白的浓度不高于500mg/dL。
本发明提供的涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂，包括磁微粒试剂和吖啶酯试剂。本发明以吖啶酯作为化学发光试剂标记抗体，具有发光系统简单，不需要催化剂、发光效率高且强度大等特点，吖啶酯化学发光为闪光型，在化学发光免疫分析领域与其它技术相比具有优势，吖啶酯化学发光在加入启动剂0.4s后发射光强度达到最大，半衰期为0.9s，2s内发光基本结束，可以实现快速检测，吖啶酯具有较高的量子产率，其化学发光效率较高，通常是鲁米诺的五倍或五倍以上。因此，吖啶酯化学发光免疫技术是一种非常精确的定量检测，使检测正确率更高更快速方便。
同时，本发明提供的检测用试剂还具有以下特点：
1)准确度高：测试企业参考品控制品，相对偏差不超过±10％；
2)最低检出限：不高于50IU/mL；
3)线性范围广泛：在(50～5000.0)IU/mL的测量范围内，试剂的相关系数≥0.9900；
4)重复性好：测试高低两个浓度样本，所得结果的变异系数(CV)不大于10％；
5)批间差小：测试高低两个浓度样本，所得结果的批间变异系数(CV)不大于15％。
进一步的，本发明具体限定了所述试剂中用于与KL-6特异性结合的两种单克隆抗体的来源。与其他厂家提供的KL-6抗体相比，北京博尔迈生物技术有限公司提供的KL-6抗体利用夹心法原理检测KL-6时，最低检测限显著降低，最低检测限仅为40IU/mL。
本发明提供了所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂在非诊断目的的检测血液样本中KL-6含量或在制备检测血液样本中KL-6的试剂盒中的应用。所述试剂能够在体外定量检测人血浆或血清中的涎液化糖链抗原KL-6的含量，可用于临床上间质性肺疾病的辅助诊断和病情监测，填补了市场上磁微粒化学发光检测KL-6类体外检测试剂的空白。
进一步的，本发明提供的应用具体限定了适于血液样本中KL-6最高含量。由于检测体系中抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。本发明实验证明，当血液样品的KL-6浓度上升至40000IU/mL时，未出现明显钩状效应；当样本浓度在KL-6浓度上升至80000IU/mL时，才出现明显的钩状效应。由此可见，本发明提供的检测方法能够检测样本KL-640000IU/mL高浓度样本。
进一步的，本发明提供的应用具体限定了血液样本中甘油三酯、胆红素和血红蛋白的干扰浓度，得到本发明检测血液样本中KL-6含量对高血脂样本以及黄疸样本具有较强的抗干扰能力。血脂是指体内脂肪在血液中脂质的总称，包括总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(极低密度脂蛋白)、高密度脂蛋白等。为了检验高血脂样本对本试剂的影响，采用两个不同浓度的血清样本，然后加入不同浓度的甘油三酯，以评估高血脂样品对检测结果的影响，结果表明甘油三酯浓度≤1000mg/dL，干扰相对偏差小于10％，未发现有干扰。引起黄疸的物质叫胆红素，呈橙黄色，当待检样本中的胆红素浓度超出一定的值时，它会影响样本测定效果，从而影响检测的性能。为了检验黄疸样本对本试剂的影响，采用两个不同浓度的血清样本，然后加入不同浓度的胆红素，以评估黄疸样品对检测结果的影响，结果表明胆红素浓度≤40mg/dL，干扰相对偏差小于10％，未发现有干扰。溶血样本中血红蛋白浓度≤500mg/dL，干扰相对偏差小于10％，未发现有干扰。
具体实施方式
本发明提供了一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂，包括磁微粒试剂和吖啶酯试剂；
所述磁微粒试剂包括2～8μg/ml磁微粒标记的KL-6抗体1、体积浓度20％～30％初生牛血清、质量浓度0.01％～0.1％的Proclin300、体积浓度20％～30％甘油、体积浓度0.01％～0.1％吐温20、质量浓度0.1％～1％BSA和体积浓度50％～70％pH值为7.4的PBS缓冲液；
所述吖啶酯试剂包括6～10μg/ml吖啶酯标记的KL-6抗体2、体积浓度10％～40％的甘油、质量浓度0.5％～5％的BSA和60％～90％、pH值为7.4的PBS缓冲液。
本发明提供的试剂中磁微粒试剂包括2～8μg/ml磁微粒标记的KL-6抗体1。所述磁微粒标记的KL-6抗体1的浓度优选3～6μg/ml，最优选5μg/ml。所述吖啶酯试剂中吖啶酯标记的KL-6抗体2的浓度优选为7～9μg/ml，最优选为8μg/ml。KL-6抗体1和KL-6抗体2与抗原的特异性亲和性是影响检测灵敏度的关键因素，本发明通过验证不同来源的抗体及组合对KL-6的最低检测限，得到所述磁微粒标记的KL-6抗体1中KL-6抗体1优选为北京博尔迈生物技术有限公司生产的货号为8MKL-61SA的KL-6单克隆抗体。所述吖啶酯标记的KL-6抗体2中KL-6抗体2优选为北京博尔迈生物技术有限公司生产的货号为8MKL-62SA的KL-6单克隆抗体。
在本发明中，所述磁微粒标记的KL-6抗体1的制备方法，优选包括以下步骤：
1)用磁珠清洗液清洗磁珠后，用EDC和NHS进行活化，得到活化后的磁珠；
2)将活化后的磁珠与KL-6抗体1进行振荡反应，清洗，封闭，去上清，得到磁微粒标记的KL-6抗体1。
在本发明中，所述所述磁珠清洗液优选包括含体积浓度0.01％～0.1％Proclin300、0.2M的2-(N-吗啉代)乙磺酸的水溶液，更优选为含体积浓度0.02％Proclin300、0.2M的2-(N-吗啉代)乙磺酸的水溶液。所述磁珠、EDC和NHS的体积比优选为1～3:1～2:1～2，更优选为2:1.5:1.5。EDC的溶液浓度优选为50mg/ml。NHS的溶液浓度优选为50mg/ml。所述活化优选伴随搅拌。所述搅拌的时间优选为20～40min，更优选为30min。活化后，优选进行清洗。所述清洗优选采用磁珠清洗液进行。所述磁珠和KL-6抗体1溶液的体积比为1:(1～3)，更优选为1:2。所述KL-6抗体1溶液的浓度为60～240μg/ml，更优选为120～200μg/ml，最优选为180μg/ml。所述封闭用溶剂优选为体积百分含量98％～99.8％0.01M磷酸盐缓冲液和体积百分含量0.1％～1％吐温20，还包括BSA；所述BSA的质量占吐温20和磷酸盐缓冲液总质量的0.1％～1％，更优选为体积百分含量99.4％0.01M磷酸盐缓冲液和体积百分含量0.6％吐温20，所述BSA的质量占吐温20和磷酸盐缓冲液总质量的0.5％。得到的磁微粒标记的KL-6抗体1优选置于磁珠保存液中保存。所述磁珠保存液包括以下体积百分含量的组分：0.01M磷酸盐缓冲液60％～80％；初生牛血清10％～30％；甘油10％～20％；Proclin3000.01％～0.1％；吐温200.01％～0.1％，更优选为0.01M磷酸盐缓冲液70％；初生牛血清20％；甘油15％；Proclin3000.05％；吐温200.05％。
在本发明中，所述吖啶酯标记抗体的制备方法优选包括以下步骤：
A.将200～400μg的KL-6抗体2溶液与吖啶酯混合，补加CB缓冲液使KL-6抗体2的终浓度至2mg/ml，在20℃～30℃恒温震荡反应2～3h，然后加入赖氨酸进行封闭，震荡条件下封闭20～40min；
B.用50KD～100KD透析袋对封闭后抗体进行透析，共透析3～4次，每次透析2～3h；补加同体积甘油待用。
在本发明中，所述KL-6抗体2和吖啶酯的摩尔比优选为1：(5～20)，更优选为1:10。所述封闭时，吖啶酯和赖氨酸的质量比为1：(100～200)，更优选为1:(120～180)，最优选为1:150。所述CB缓冲液优选为0.01M碳酸盐缓冲液。透析缓冲液优选为0.01M磷酸缓冲液。吖啶酯保存液优选包括以下体积百分含量的组分：0.01M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)70％～90％和甘油10％～30％；BSA的质量占磷酸盐缓冲液和甘油总质量的1％～2％；更优选为0.01M磷酸盐缓冲液80％和甘油20％。使用时用吖啶酯保存液稀释至抗体浓度优选为6～10μg/ml，更优选为8μg/ml。
在本发明中，所述磁微粒试剂还优选包括体积浓度25初生牛血清、质量浓度0.05的Proclin300、体积浓度25％甘油、体积浓度0.051％吐温20、质量浓度0.5％BSA和体积浓度60％pH值为7.4的PBS缓冲液。所述磁微粒试剂中初生牛血清具有稳定抗体的作用，Proclin300发挥防腐剂的作用，甘油发挥调整试剂粘度的作用，吐温20起分散的作用，BSA发挥稳定抗体的作用。
在本发明中，所述吖啶酯试剂还优选包括体积浓度20％～30％的甘油、质量浓度1％～4％的BSA和70％～80％、pH值为7.2的PBS缓冲液。所述吖啶酯试剂中甘油发挥稳定吖啶酯的作用，BSA发挥稳定抗体的作用。
在本发明中，所述试剂优选还包括磁珠清洗液、化学发光试剂和KL-6标准品。所述磁珠清洗液优选包括体积浓度99.9％～99.99％的0.2M的2-(N-吗啉代)乙磺酸水溶液和体积浓度0.01％～0.1％Proclin300的水溶液。所述化学发光试剂包括双氧水和氢氧化钠溶液。所述双氧水的体积浓度有选为0.25％～1％，更优选为0.65％；所述氢氧化钠溶液的浓度优选为0.1～2M，更优选为0.25M。
本发明提供了一种所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂盒，包括上述试剂。
本发明提供了所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或所述试剂盒在非诊断目的的检测血液样本中KL-6含量的应用。
本发明提供了所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂在制备检测血液样本中KL-6的试剂盒中的应用。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法，优选如下：
将待检血液样本与磁珠标记的KL-6抗体1混合，孵育，清洗，得到复合物1；
将所述复合物1和吖啶酯标记的KL-6抗体2混合，孵育，得到复合物2；
向所述复合物2中加入双氧水和氢氧化钠溶液，检测光信号值，根据标准曲线绘制的回归方程，计算血液样本中KL-6的浓度。
在本发明中，所述血液样本优选包括血清或血浆。所述血液样本中KL-6浓度不高于40000IU/mL。所述血液样本中，甘油三酯的浓度优选不高于1000mg/dL，胆红素的浓度优选不高于40mg/dL，血红蛋白的浓度优选不高于500mg/dL。本发明制备了一种灵敏度高、精密度好、准确度高的涎液化糖链抗原(KL-6)试剂盒，该试剂盒有优秀的抗血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰能力，且在40000IU/mL高浓度样本下，未出现明显的HOOK效应。
下面结合实施例对本发明提供的涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.涎液化糖链抗原(KL-6)测定试剂盒(磁微粒化学发光法)基础溶液配制
1.1磁珠保存液配制：0.01M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)80％、小牛血清10％、甘油10％、Proclin3000.1％、吐温200.1％；
1.2吖啶酯保存液配制：0.01M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)70％、甘油30％、BSA 1％。
2.涎液化糖链抗原(KL-6)测定试剂盒(磁微粒化学发光法)磁珠包被抗体的制备
2.1取200μL的磁珠加入2mL的离心管中，磁分离3min，然后去上清。
2.2向离心管中加入400μL的磁珠清洗液，震荡混匀，磁分离去上清，清洗2次。
2.3称取一定量的EDC，加入一定体积MES缓冲液，配制成50mg/ml的溶液；称取一定量的NHS，加入一定体积MES缓冲液，配制成50mg/ml溶液。
2.4向离心管中加入100μL的50mg/mL EDC，加入100μL的50mg/mL NHS震荡混匀。
2.5将两个离心管置于混匀器上活化30min。适当调整转速，使液体在倒置的时候能稳定下流。
2.6活化完成后，使用2倍体积的0.02M MES清洗两次，去上清。
2.7分别在离心管中加入120μg KL-6抗体1定容至300μL，做好标记。偶联2～3h。磁分离后保存上清用作后续偶联效率的初步确认。
2.8用600μL体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。
2.9再向离心管中加入600μL体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min。去上清。
2.10用600ul体积的磁珠保存液清洗两次，去上清，然后移至30mL的磁珠保存液中。
3.涎液化糖链抗原(KL-6)测定试剂盒(磁微粒化学发光法)吖啶酯标记抗体
3.1取200ug的KL-6抗体2，以抗体与吖啶酯的比例1:10加入一定量的吖啶酯，补加抗体的终浓度为2mg/mL；
3.2在恒温摇床上，25℃反应2～3h；
3.3加入赖氨酸(吖啶酯：赖氨酸＝1：140，摩尔浓度比)进行封闭，反应20min。
3.4反应结束后，使用50KD的透析袋进行缓冲液置换，共透析4次，每次透析2～3小时。
3.5透析完成后，补加甘油至抗体终浓度为0.5mg/mL，待用。
3.6吖啶酯使用吖啶酯保存液稀释液至抗体终浓度8μg/mL。
实施例2
实施例1制备的试剂盒的使用方法如下
1.将试剂从盒中取出，去掉试剂瓶盖后盖上乳胶盖，放置于设置的对应位置；
2.将KL-6校准品复溶后，对试剂进行校准。
3.校准完成后，将样本放置样本架上，仪器自动按以下顺序进行测试，磁微粒试剂50μL，样本5μL，吖啶酯试剂50μL，孵育10min后读取相应浓度。
4.本试剂盒对关键原材料进行确认
对北京博尔迈、Holmes两个厂家提供的KL-6抗体分别进行磁珠包被和吖啶酯标记，制备成不同的组分试剂，以最低检出限评估其性能，选择最佳配对的抗体。
将北京博尔迈、Holmes两个厂家提供的KL-6抗体包被至磁珠上面，抗体浓度为60μg/mL，包被完成后，将磁珠稀释至0.2mg/mL的浓度。
将北京博尔迈、Holmes两个厂家提供的KL-6抗体与吖啶酯按照摩尔比为1:5的比例，在碳酸缓冲液中标记完成后，将标记好的抗体，稀释至8μg/mL。
组装成试剂，测试结果见表1。
表1不同来源的标记抗体和包被抗体检测结果
Figure BDA0002937568010000091
四个组合检测结果说明，其中标记抗体为货号为8MKL-62SA北京博尔迈生产的抗体，包被抗体也为货号为8MKL-61SA北京博尔迈的抗体，其灵敏度最好，因此选择北京博尔迈提供的KL-6的抗体作为标记和包被抗体。
5.企业参考品的制备
以KL-6抗原为纯品做原料，以含10％的小牛血清的PBS作为基质液，梯度配制KL-6抗原，得到一系列企业参考品。
6.性能测试
6.1.准确度
对两个浓度水平的企业参考品按照实施例1的方法进行检测，检测结果与标定浓度的相对偏差在±10％范围内，测试结果见表2。
表2企业参考品的检测准确度
Figure BDA0002937568010000101
6.2最低检出限
对最低检出限参考品进行检测，测试结果不大于50IU/mL，结果见表3。
表3最低检出限参考品检测结果
Figure BDA0002937568010000102
Figure BDA0002937568010000111
6.3重复性
对两个不同浓度的企业参考品分别重复测定10次，其变异系数应不大于10％，结果见表4。
表4两个不同浓度的企业参考品重复性检测结果
Figure BDA0002937568010000112
6.4线性范围
将接近线性范围上限的高值企业参考品按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的企业参考品须接近线性范围的下限，对每一浓度的样本均重复检测3次，计算其平均值，并计算线性相关系数r，r值应大于0.99，结果见表5。
表5对梯度浓度的企业参考品检测结果
Figure BDA0002937568010000121
实施例3
对实施例1制备的试剂盒抗干扰能力进行研究
高血脂样本以及黄疸样本对检测结果产生影响，对样本中的干扰物质进行分析，确定干扰物的浓度。血脂是指体内脂肪在血液中脂质的总称，包括总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(极低密度脂蛋白)、高密度脂蛋白等。为了检验高血脂样本对本试剂的影响，本公司采用两个不同浓度的血清样本，然后加入不同浓度的甘油三酯，以评估高血脂样品对检测结果的影响；引起黄疸的物质叫胆红素，呈橙黄色，当待检样本中的胆红素浓度超出一定的值时，它会影响样本测定效果，从而影响检测的性能。为了检验黄疸样本对本试剂的影响，本公司采用两个不同浓度的血清样本，然后加入不同浓度的胆红素，以评估黄疸样品对检测结果的影响。
1.实验要求
(1)实验人员应熟悉测定方法与仪器操作。
(2)采用合适的质控品并保持仪器处于正常状态。
2.接受标准
将每个浓度梯度的干扰物样本连续测试3次，取均值，以低浓度干扰物样品的测试均值为标准，计算其它样本与它的相对偏差；当相对偏差超过±10％时，此时对应的干扰物浓度被认为是该干扰物对该试剂产生干扰的极限浓度。
3.实验材料和方法
甘油三酯：称取一定量的甘油三酯纯品，加入适量的纯水将之配制成浓度为200g/L的甘油三酯原液，按1:19加入到临床血清中，混匀即得1000mg/dL的甘油三酯高浓度干扰物样品；另取临床血清按19:1加入纯水，混匀得到低浓度干扰物样品。
胆红素：称取一定量的胆红素纯品，加入适量体积0.1mol/L的NaOH将之配制为400mg/dL的胆红素原液，然后按1:19加入到临床血清中，混匀即得20mg/dL的胆红素高浓度干扰物样品；另取临床血清按19:1加入0.1mol/L的NaOH溶液，混匀得到低浓度干扰物样品。
血红蛋白：称取一定量的血红蛋白纯品，加入适量的纯水将之配制成浓度为100g/L的血红蛋白原液，然后按1:19加入到临床血清中，混匀即得浓度为500mg/dL的血红蛋白高浓度干扰物样品；另取临床血清按19:1加入纯水，混匀得到低浓度干扰物样品。
按表6进行干扰物样本的梯度混合。
表6干扰物样本的梯度混合
Figure BDA0002937568010000131
4.实验结果见表7
表7不同浓度胆红素、甘油三酯和血红蛋白的干扰测试结果
Figure BDA0002937568010000132
Figure BDA0002937568010000141
5.实验结论
甘油三酯：浓度≤1000mg/dL，干扰相对偏差小于10％，未发现有干扰；胆红素：浓度≤40mg/dL，干扰相对偏差小于10％，未发现有干扰。血红蛋白：浓度≤500mg/dL，干扰相对偏差小于10％，未发现有干扰。
实施例4
实施例1制备的试剂盒对钩状效应的研究
钩状效应即HOOK效应，是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发现只有在两者分子比例合适时才出现最强的抗原-抗体反应。
1.试验要求及方法
检测超出线性范围外的样本(如果样本浓度不够高，即加入相应抗原)，梯度测试，从高到低进行测试，每个浓度测试3次，测试结果小于上一个梯度的测试结果时，则出现严重的钩状效应。
2.试验结果见表8。
表8高浓度KL-6样本检测结果
Figure BDA0002937568010000151
3.实验结论
由表8结果可知，KL-6浓度80000IU/mL时测试结果比40000IU/mL时检测结果反而降低，这说明当KL-6浓度上升至40000IU/mL时，未出现明显钩状效应；当样本浓度在KL-6浓度上升至80000IU/mL时，出现明显的钩状效应。
由上述实施例可知，本发明制备了一种灵敏度高、精密度好、准确度高的涎液化糖链抗原(KL-6)试剂盒，该试剂盒有优秀的抗血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰能力，且在40000IU/mL高浓度样本下，未出现明显的HOOK效应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂，其特征在于，包括磁微粒试剂和吖啶酯试剂；
所述磁微粒试剂包括2～8μg/ml磁微粒标记的KL-6抗体1、体积浓度20％～30％初生牛血清、质量浓度0.01％～0.1％的Proclin300、体积浓度20％～30％甘油、体积浓度0.01％～0.1％吐温20、质量浓度0.1％～1％BSA和体积浓度50％～70％pH值为7.4的PBS缓冲液；
所述吖啶酯试剂包括6～10μg/ml吖啶酯标记的KL-6抗体2、体积浓度10％～40％的甘油、质量浓度0.5％～5％的BSA和60％～90％、pH值为7.4的PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂，其特征在于，所述磁微粒标记的KL-6抗体1中KL-6抗体1为北京博尔迈生物技术有限公司生产的货号为8MKL-61SA的KL-6单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂，其特征在于，所述吖啶酯标记的KL-6抗体2中KL-6抗体2为北京博尔迈生物技术有限公司生产的货号为8MKL-62SA的KL-6单克隆抗体。
4.根据权利要求1～3任意一项所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂，其特征在于，还包括磁珠清洗液、化学发光试剂和KL-6标准品。
5.根据权利要求4所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂，其特征在于，所述磁珠清洗液包括含体积浓度0.01％～0.1％Proclin300、0.2M的2-(N-吗啉代)乙磺酸的水溶液。
6.一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任意一项所述试剂。
7.权利要求1～5任意一项所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂或权利要求6所述试剂盒在非诊断目的的检测血液样本中KL-6含量的应用。
8.权利要求1～5任意一项所述涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测试剂在制备检测血液样本中KL-6的试剂盒中的应用。
9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，所述血液样本包括血清或血浆；
所述血液样本中KL-6浓度不高于40000IU/mL。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，在所述血液样本中，甘油三酯的浓度不高于1000mg/dL，胆红素的浓度不高于40mg/dL，血红蛋白的浓度不高于500mg/dL。
CN202110165268.0A 2021-02-06 2021-02-06 一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用 Pending CN112946255A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110165268.0A CN112946255A (zh) 2021-02-06 2021-02-06 一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110165268.0A CN112946255A (zh) 2021-02-06 2021-02-06 一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112946255A true CN112946255A (zh) 2021-06-11

Family

ID=76242906

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110165268.0A Pending CN112946255A (zh) 2021-02-06 2021-02-06 一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112946255A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113552372A (zh) * 2021-09-18 2021-10-26 湖南永和阳光生物科技股份有限公司 一种用于saa检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒及其制备方法
CN113588949A (zh) * 2021-08-17 2021-11-02 广州艺得诺生物科技有限公司 一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备及使用方法
CN113588967A (zh) * 2021-08-03 2021-11-02 湖南永和阳光生物科技股份有限公司 一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒
CN114113581A (zh) * 2021-11-09 2022-03-01 广州呼吸健康研究院 一种外泌体上kl-6蛋白含量的检测方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090263838A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-22 Sanko Junyaku Co., Ltd. Method for determining a lung cancer treatment and method for determining the effectiveness of an agent for treatment of lung cancer
CN105759061A (zh) * 2016-02-26 2016-07-13 厦门大学附属中山医院 基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒
CN107340386A (zh) * 2017-06-09 2017-11-10 厦门大学附属中山医院 基于微粒子化学发光免疫分析的sST2检测试剂盒
CN111487419A (zh) * 2020-06-24 2020-08-04 苏州康和顺医疗技术有限公司 Kl-6在儿童新冠肺炎中的应用
CN112285359A (zh) * 2020-09-22 2021-01-29 广州市伊川生物科技有限公司 一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090263838A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-22 Sanko Junyaku Co., Ltd. Method for determining a lung cancer treatment and method for determining the effectiveness of an agent for treatment of lung cancer
CN105759061A (zh) * 2016-02-26 2016-07-13 厦门大学附属中山医院 基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒
CN107340386A (zh) * 2017-06-09 2017-11-10 厦门大学附属中山医院 基于微粒子化学发光免疫分析的sST2检测试剂盒
CN111487419A (zh) * 2020-06-24 2020-08-04 苏州康和顺医疗技术有限公司 Kl-6在儿童新冠肺炎中的应用
CN112285359A (zh) * 2020-09-22 2021-01-29 广州市伊川生物科技有限公司 一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AYSE AYZIT KILINC 等: "Serum KL‑6 level as a biomarker of interstitial lung disease in childhood connective tissue diseases: a pilot study", 《RHEUMATOLOGY INTERNATIONAL》 *
徐雪亮 等: "化学发光法检测涎液化糖链抗原KL-6的方法学评价", 《山西医药杂志》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113588967A (zh) * 2021-08-03 2021-11-02 湖南永和阳光生物科技股份有限公司 一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒
CN113588967B (zh) * 2021-08-03 2024-02-20 湖南永和阳光生物科技股份有限公司 一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒
CN113588949A (zh) * 2021-08-17 2021-11-02 广州艺得诺生物科技有限公司 一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备及使用方法
CN113552372A (zh) * 2021-09-18 2021-10-26 湖南永和阳光生物科技股份有限公司 一种用于saa检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒及其制备方法
CN114113581A (zh) * 2021-11-09 2022-03-01 广州呼吸健康研究院 一种外泌体上kl-6蛋白含量的检测方法及其应用
CN114113581B (zh) * 2021-11-09 2023-03-10 广州呼吸健康研究院 一种外泌体上kl-6蛋白含量的检测方法及其应用
WO2023082452A1 (zh) * 2021-11-09 2023-05-19 广州呼吸健康研究院 一种外泌体上kl-6蛋白含量的检测方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112946255A (zh) 一种涎液化糖链抗原磁微粒化学发光检测用试剂或试剂盒及其应用
CN109596843B (zh) 一种血清淀粉样蛋白a的测定试剂盒
CN102998445B (zh) 一种测定甘胆酸的试剂及制备方法
CN112526134A (zh) 一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒
JPS6488155A (en) Immunological inspection for detecting antibody against antigen
CN107918022B (zh) 一种cTnI检测试剂盒及其使用方法
CN106918708A (zh) 一种用于检测胰岛素的竞争法胶乳增强免疫透射比浊试剂盒
CN111057150A (zh) 一种乳胶微球及其应用以及糖化血红蛋白检测试剂盒
CN111089958A (zh) 一种基于葡聚糖信号放大的p16INK4a化学发光试剂盒
CN108459162A (zh) 检测多种炎症生物标志物的方法及其试剂盒
CN114487385A (zh) 甲胎蛋白异质体检测组合物及其制备方法和应用
CN110596405A (zh) 胶乳增强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白含量的试剂盒
CN106546729B (zh) 一种去除干式免疫荧光定量法检测中血清基质效应的新工艺方法
CN112379092A (zh) 用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒及其制备方法
CN116593709A (zh) 一种基于乳胶增强免疫比浊法测定oxLDL的试剂盒及其制备方法
CN116338163A (zh) 一步法定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的方法
CN113588967B (zh) 一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒
CN110736843A (zh) 一种胰岛素样生长因子结合蛋白3的定量检测试剂盒
CN113552372A (zh) 一种用于saa检测的磁微粒化学发光免疫试剂盒及其制备方法
CN108918888A (zh) 一种检测内皮抑素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用
CN115343483A (zh) 一种自身免疫性糖尿病检测用试剂盒及其制备方法
CN114924084A (zh) 一种糖化血红蛋白测定试剂盒、制备方法及其应用
CN113125749B (zh) 一种用于检测血清糖化白蛋白的试剂盒
CN112763731B (zh) 一种脂蛋白(a)测定试剂盒及其检测方法
CN115290897A (zh) 一种癌胚抗原（cea）化学发光免疫测定试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination