CN114113581B - 一种外泌体上kl-6蛋白含量的检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种外泌体上KL‑6蛋白含量的检测方法及其应用，所述检测方法包括：利用免疫磁珠捕获法将磁珠与外泌体上的KL‑6蛋白结合，利用化学发光免疫法检测体系的发光强度，最后通过标准曲线法计算得到外泌体上KL‑6的蛋白含量。本发明首次提出外泌体上KL‑6蛋白含量的检测方法，所述检测方法具有较好的稳定性和可行性，在外泌体相关基础研究等领域具有重要的应用价值。本发明还首次发现外泌体上KL‑6蛋白含量与肺部患病情况有较大相关性，并提供了外泌体上KL‑6蛋白含量的参考值作为肺部患病的评价标准，并提供了一种诊断肺部疾病的试剂盒，所述试剂盒相比于传统血清检测在肺部疾病的诊断上具有更好的灵敏度，减少了诊断结果的假阴性，具有重要的应用价值。

Description

一种外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法及其应用
技术领域
本发明属于蛋白质检测技术领域，涉及一种外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法及其应用，具体涉及一种外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法以及一种诊断肺部疾病的试剂盒。
背景技术
KL-6(涎液化糖链抗原，Krebs Von den Lungen-6)，是Kohno于1985年发现的，利用人肺腺癌细胞系(VMRC-LCR)免疫小鼠制备了多株单克隆抗体，将其中的第6号抗体识别的涎液化糖链抗原命名为KL-6。KL-6主要由增殖、再生的或受损的肺泡II型上皮细胞分泌，在正常肺组织中，KL-6在II型肺泡上皮细胞、呼吸细支气管上皮细胞和支气管腺浆液细胞上表达。当肺部发生炎症尤其是与II型肺泡相关的肺炎时，II型肺泡的大量死亡和再生以及肺间质上皮细胞屏障的破损会导致KL-6大量释放到血液中。多项针对KL-6的研究显示，其作为间质性肺疾病(Interstitial Lung Diseases,ILDs)的血清学指标显示出积极的临床意义。因此测量外周血KL-6的水平可用于间质性肺炎的诊断和治疗策略的确定。其中，血清被认为是理想的测试样品，因为它可以无创地重复收集，然而，其中包含的99％以上的蛋白质是无关蛋白(如白蛋白等)，从检测角度考虑，这些蛋白质是杂质，会影响检测的准确度。
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，如血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体被视为特异性分泌的膜泡，能够参与细胞间通讯，近年来，人们对外泌体的研究兴趣日益增长。研究表明，外泌体中含有多种与各种细胞生理活动相关的蛋白质，然而外泌体上的KL-6蛋白的含量情况及其功能尚不清楚，目前有关外泌体上KL-6蛋白的检测方法也未见报道。
因此，开发一种外泌体上KL-6含量的方法将对于外泌体相关研究以及KL-6蛋白的功能研究等领域具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法及其应用，具体提供一种外泌体中KL-6蛋白含量的检测方法以及一种诊断肺部疾病的试剂盒。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将捕获抗体标记的磁珠与待测外泌体样本混合，反应，得磁珠-外泌体复合物；
(2)将步骤(1)得到的磁珠-外泌体复合物与发光物标记的检测抗体混合，反应，得磁珠-外泌体-检测抗体复合物；
(3)将步骤(2)得到的磁珠-外泌体-检测抗体复合物与发光底物混合，反应，利用化学发光法检测反应体系的发光强度；
(4)利用标准曲线法，根据步骤(3)检测得到的发光强度计算得到待测外泌体样本的KL-6蛋白含量。
本发明首次提出外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法，检测的原理如附图1所示，图中1—捕获抗体标记的磁珠；2—含有KL-6蛋白的外泌体；3—发光物标记的检测抗体。通过捕获抗体与KL-6蛋白的特异性结合作用以及检测抗体与KL-6蛋白的特异性结合作用，构建得到磁珠-外泌体-检测抗体复合物，由于检测抗体上标记有发光物，因此通过检测反应体系的发光强度可以间接反映外泌体上KL-6蛋白含量信息。通过标准曲线法，即可计算出KL-6蛋白含量的具体数值。本发明提供的检测方法具有较好的稳定性，基于本发明提供的检测方法得到的检测结果与传统的血清检测得到的结果显著相关，证明了本发明检测方法具有较高的准确性和可行性，在外泌体相关基础研究等领域具有重要的应用价值。基于此检测方法，本发明首次发现外泌体上KL-6蛋白含量与肺部患病情况有较大的相关性，此发现对于肺部疾病的机理研究以及临床诊断等方面具有重要意义。
优选地，步骤(1)所述反应的温度为33-40℃，例如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。所述反应的时间为5-15min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地，步骤(2)所述反应的温度为33-40℃，例如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。所述反应的时间为5-15min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地，步骤(3)所述反应的温度为33-40℃，例如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。所述反应的时间为5-10min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
优选地，所述待测外泌体样本由全血、血浆、血清、支气管肺泡灌洗液、脑脊液或尿液中的任意一种待测样本制备得到。
优选地，所述待测外泌体样本的制备方法包括离心法、超滤法、磁珠免疫法、聚乙二醇沉淀法或试剂盒提取法中的任意一种，优选离心法。
优选地，所述离心的转速为10000-20000g，例如10000g、11000g、12000g、13000g、14000g、15000g、16000g、17000g、18000g、19000g、20000g等。所述离心的时间为1-2h，例如1h、1.1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2h等。
作为本发明的一个优选方案，所述外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法包括如下步骤：
(1)向待测样本中加入0.5-3倍样本体积的磷酸盐缓冲液进行稀释，在0-4℃下以10000-20000g的转速离心1-2h，收集沉淀，加入磷酸盐缓冲液进行重悬，得待测外泌体样本；
向0.8-1.2mg磁珠中加入400-600μL平衡液，混合，移去液体，加入150-250μL磁珠活化液，混合，15-40℃下孵育20-60min，移去液体，加入80-120μg捕获抗体，15-40℃下孵育2.5-4h，移去液体，加入400-600μL封闭液，15-40℃下封闭2-3h，洗涤，加入磁珠保存液，得捕获抗体标记的磁珠；
取发光物8-12μL，用无水二甲基甲酰胺稀释8-12倍后，取10-30μL与80-120μg待标记检测抗体混合，15-40℃下避光孵育20-60min，加入10-30μL封闭液，15-40℃下避光封闭20-60min，加入保存液，得发光物标记的检测抗体；
(2)取8-12μL待测外泌体样本与200-300μL捕获抗体标记的磁珠混合，33-40℃下反应5-15min，洗涤，除去液体，加入200-300μL发光物标记的检测抗体，33-40℃下反应5-15min，洗涤，除去液体，加入180-220μL发光底物，33-40℃下孵育5-10min，在477nm波长下检测反应体系的发光强度；
(3)取与待测外泌体样本等体积的KL-6标准品，重复步骤(2)的操作，依据标准品检测得的发光强度拟合成标准曲线，利用标准曲线法计算出待测样本中KL-6含量。
上述0.5-3倍中的具体数值可以为0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、1.2倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.2倍、2.5倍、2.7倍、3倍等。
上述0.8-1.2mg中的具体数值可以为0.8mg、0.85mg、0.9mg、0.95mg、1mg、1.05mg、1.1mg、1.15mg、1.2mg。
上述400-600μL中的具体数值可以为400μL、420μL、440μL、450μL、460μL、480μL、500μL、520μL、540μL、550μL、560μL、580μL、600μL等。
上述150-250μL中的具体数值可以为150μL、160μL、170μL、180μL、190μL、200μL、210μL、220μL、230μL、240μL、250μL等。
上述80-120μg中的具体数值可以为80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、105μg、110μg、115μg、120μg等。
上述2-3h中的具体数值可以为2h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h、2.5h、2.6h、2.7h、2.8h、2.9h、3h等。
上述8-12μL中的具体数值可以为8μL、8.5μL、9.5μL、10μL、10.5μL、11μL、11.5μL、12μL等。
上述8-12倍中的具体数值可以为8倍、8.5倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍等。
上述10-30μL中的具体数值可以为10μL、12μL、15μL、18μL、20μL、22μL、25μL、28μL、30μL等。
上述80-120μg中的具体数值可以为80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、105μg、110μg、115μg、120μg等。
上述200-300μL中的具体数值可以为200μL、210μL、220μL、230μL、240μL、250μL、260μL、270μL、280μL、290μL、300μL等。
上述180-220μL中的具体数值可以为180μL、185μL、190μL、195μL、200μL、205μL、210μL、215μL、220μL等。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法在制备诊断肺部疾病的试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供一种诊断肺部疾病的试剂盒，所述诊断肺部疾病的试剂盒包括捕获抗体标记的磁珠、发光物标记的检测抗体、发光底物和KL-6标准品。
本发明创造性地提供了一种诊断肺部疾病的试剂盒，基于检测结果，依照健康人外泌体KL-6浓度的2.1倍设置截断值(CUTOFF值)，即50U/mL，确定待测样本外泌体KL-6检测结果的阴阳性，并以此来确认患者肺部疾病状态。本发明提供的试剂盒相比于传统血清检测在肺部疾病的诊断上具有更好的灵敏度，减少了诊断结果的假阴性，具有重要的应用价值。
优选地，所述捕获抗体包括8MKL-61。
优选地，所述检测抗体包括8MKL-62。
所述捕获抗体标记的磁珠由包括如下步骤的制备方法制备得到：
将捕获抗体与活化后的磁珠混合，孵育，封闭磁珠，即得。
优选地，所述孵育的温度为15-40℃，例如15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃等。所述孵育的时间为2.5-4h，例如2.5h、2.6h、2.7h、2.8h、2.9h、3h、3.1h、3.2h、3.3h、3.4h、3.5h、3.6h、3.7h、3.8h、3.9h、4h等。
优选地，所述捕获抗体与磁珠的质量比为1:(8-12)，例如1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10、1:10.5、1:11、1:11.5、1:12等。
优选地，所述发光物标记的检测抗体由包括如下步骤的制备方法制备得到：
将发光物与待标记的检测抗体混合，避光孵育，封闭抗体，即得。
优选地，所述孵育的温度为15-40℃，例如15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃等。所述孵育的时间为20-60min，例如20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min等。
优选地，所述肺部疾病的类型包括肺炎或间质性肺部疾病。
第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的诊断肺部疾病的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括：
(1)将捕获抗体标记的磁珠与待测外泌体样本混合，反应，得磁珠-外泌体复合物；
(2)将步骤(1)得到的磁珠-外泌体复合物与发光物标记的检测抗体混合，反应，得磁珠-外泌体-检测抗体复合物；
(3)将步骤(2)得到的磁珠-外泌体-检测抗体复合物与发光底物混合，反应，利用化学发光法检测反应体系的发光强度；
(4)利用KL-6标准品，通过标准曲线法，根据步骤(3)检测得到的发光强度计算得到待测外泌体样本的KL-6蛋白含量。
优选地，步骤(1)所述反应的温度为33-40℃，所述反应的时间为5-15min；
优选地，步骤(2)所述反应的温度为33-40℃，所述反应的时间为5-15min；
优选地，步骤(3)所述反应的温度为33-40℃，所述反应的时间为5-10min。
优选地，所述待测外泌体样本由全血、血浆、血清、支气管肺泡灌洗液、脑脊液或尿液中的任意一种待测样本制备得到。
优选地，所述待测外泌体样本的制备方法包括离心法、超滤法、磁珠免疫法、聚乙二醇沉淀法或试剂盒提取法中的任意一种，优选离心法。
优选地，所述离心的转速为10000-20000g，所述离心的时间为1-2h。
作为本发明的一个优选方案，所述诊断肺部疾病的试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)向待测样本中加入0.5-3倍样本体积的磷酸盐缓冲液进行稀释，在0-4℃下以10000-20000g的转速离心1-2h，收集沉淀，加入磷酸盐缓冲液进行重悬，得待测外泌体样本；
向0.8-1.2mg磁珠中加入400-600μL平衡液，混合，移去液体，加入150-250μL磁珠活化液，混合，15-40℃下孵育20-60min，移去液体，加入80-120μg捕获抗体，15-40℃下孵育2.5-4h，移去液体，加入400-600μL封闭液，15-40℃下封闭2-3h，洗涤，加入磁珠保存液，得捕获抗体标记的磁珠；
取发光物8-12μL，用无水二甲基甲酰胺稀释8-12倍后，取10-30μL与80-120μg待标记检测抗体混合，15-40℃下避光孵育20-60min，加入10-30μL封闭液，15-40℃下避光封闭20-60min，加入保存液，得发光物标记的检测抗体；
(2)取8-12μL待测外泌体样本与200-300μL捕获抗体标记的磁珠混合，33-40℃下反应5-15min，洗涤，除去液体，加入200-300μL发光物标记的检测抗体，33-40℃下反应5-15min，洗涤，除去液体，加入180-220μL发光底物，33-40℃下孵育5-10min，在477nm波长下检测反应体系的发光强度；
(3)取与待测外泌体样本等体积的KL-6标准品，重复步骤(2)的操作，依据标准品检测得的发光强度拟合成标准曲线，利用标准曲线法计算出待测样本中KL-6含量。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明首次提出外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法，并应用于血清样本的检测，检测方法具有较高的稳定性。基于本发明提供的检测方法得到的检测结果与传统的血清检测得到的结果显著相关，证明了本发明检测方法具有较高的准确性和可行性。本发明提供的外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法在外泌体相关基础研究等领域具有重要的应用价值。本发明还首次发现外泌体上KL-6蛋白含量与肺部患病情况有较大相关性，此发现对于肺部疾病的机理研究以及临床诊断等方面具有重要意义。本发明还提供了一种诊断肺部疾病的试剂盒，基于检测结果，依照健康人外泌体KL-6浓度的2.1倍设置截断值(CUTOFF值)，即50U/mL，确定待测样本外泌体KL-6检测结果的阴阳性，并以此来确认患者肺部疾病状态。本发明提供的试剂盒相比于传统血清检测在肺部疾病的诊断上具有更好的灵敏度，减少了诊断结果的假阴性，具有重要的应用价值。
附图说明
图1是外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法的检测原理图。其中1—捕获抗体标记的磁珠；2—含有KL-6蛋白的外泌体；3—发光物标记的检测抗体。
图2是实施例1的步骤(1)制备得到的外泌体的形态表征图。
图3是健康人样本与ILDs患者样本的检测结果对比图。
图4是实施例1的检测结果与传统血清检测结果的相关性分析图。
图5是血清KL-6临床参考值与本发明的外泌体KL-6截断值对比分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例所涉及的健康人血清样本来源于健康志愿者，ILDs患者的血清样本来源于广州医科大学附属第一医院，所有人员采样前均对本实验知情并同意，血清样本的采集遵循医院标准。
实施例1
本实施例提供一种外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法，包括如下步骤：
(1)分离提取外泌体
样本预处理：将血清样本(1mL)于4℃以10000g的转速离心10min，去除样本中杂质，将离心后上清液转移至新的离心管中。
上清液预处理：在去除杂质的上清液中加入4倍样本体积的预冷的0.01MPBS，将混合液放置于4℃静置2h。
分离外泌体：将混合液于4℃以10000g的转速离心1h，弃上清，收集沉淀，加入1/2样本体积的预冷的0.01M PBS，均匀吹打混匀，即得待测外泌体样本。
(2)制备捕获抗体标记的磁珠
磁珠预处理：向1mg磁珠中加入500μL平衡液(0.01M PBS)，涡旋震荡混匀，于磁力架上移去液体。加入200μL磁珠活化Buffer(10mg/mL EDC，10mg/mL NHS)，涡旋混匀，利用涡旋振荡器在25℃下震荡孵育30min。
抗体偶联：磁力架上移去磁珠活化Buffer，加入捕获抗体(8MKL-61 100μg)，涡旋混匀，利用涡旋振荡器在25℃下震荡孵育3h。
磁珠封闭：在磁力架上移去未偶联的抗体，加入500μL封闭液(0.01M PBS配制的5％BSA)，涡旋混匀，利用垂直混匀器在25℃下颠倒封闭2h。洗涤后，加入1mL磁珠保存液(0.01M PBS配制的3％BSA)，4℃保存备用。
(3)制备发光物标记的检测抗体
取AP(碱性磷酸酶)10μL，加入90μL无水DMF(无水二甲基甲酰胺)，混合均匀后取20μL至100μg待标记的检测抗体(8MKL-62)中，混匀后利用振荡器在25℃避光下孵育30min。
抗体封闭：取20μL封闭液(5％赖氨酸)至孵育完成的AP标记的检测抗体中，混匀后利用振荡器在25℃避光下震荡封闭30min。透析，加入1mL AP保存液(0.01M PBS)重悬，4℃保存备用。
(4)待测外泌体样本中KL-6含量的检测与计算
将10μL步骤(1)制得的待测外泌体样本与180μL样本稀释液(0.01M PBS，0.05％吐温-20)混合，充分混匀，得待测样本测试液。将10μL标准品(已知浓度的KL-6重组蛋白)与180μL样本稀释液混合，充分混匀，得标准品测试液。将10μL校准品(440U/ml的KL-6)与180μL样本稀释液混合，充分混匀，得低值校准品测试液。将10μL校准品(1040U/ml的KL-6)与180μL样本稀释液混合，充分混匀，得高值校准品测试液。分别对待测样本测试液、标准品测试液(6种浓度的KL-6重组蛋白分别进行操作)、低值校准品测试液和高值校准品测试液进行如下操作：
取250μL步骤(2)制得的捕获抗体标记的磁珠，加入10μL测试液，充分混匀后37℃孵育10min。反复清洗去除反应液，得捕获外泌体的磁珠。
将250μL步骤(3)制得的AP标记的抗体与捕获外泌体的磁珠混合，充分混匀后37℃孵育10min。反复清洗去除反应液，得抗体结合的磁珠复合物。向其中加入AMPPD底物液200μL，充分混匀后37℃反应5min。在477nm波长下检测反应体系的发光强度。
依据标准品检测得的发光强度拟合成标准曲线，通过标准曲线计算出待测样本中KL-6含量。
实施例2
本实施例提供一种外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法，包括如下步骤：
(1)分离提取外泌体
样本预处理：将血清样本(1mL)于4℃以10000g的转速离心10min，去除样本中杂质，将离心后上清液转移至新的离心管中。
上清液预处理：在去除杂质的上清液中加入1倍样本体积的预冷的PBS(浓度为0.01M)，得混合液。
分离外泌体：将混合液于4℃以20000g的转速离心1h，弃上清，收集沉淀，加入1倍样本体积的预冷的PBS，均匀吹打混匀，即得待测外泌体样本。
(2)制备捕获抗体标记的磁珠
磁珠预处理：向0.9mg磁珠中加入400μL平衡液(0.01M PBS)，涡旋震荡混匀，于磁力架上移去液体。加入160μL磁珠活化Buffer(10mg/mL EDC，10mg/mL NHS)，涡旋混匀，利用涡旋振荡器在25℃下震荡孵育50min。
抗体偶联：磁力架上移去磁珠活化Buffer，加入捕获抗体(8MKL-61 100μg)，涡旋混匀，利用涡旋振荡器在25℃下震荡孵育2.5h。
磁珠封闭：在磁力架上移去未偶联的抗体，加入450μL封闭液(0.01M PBS配制的5％BSA)，涡旋混匀，利用垂直混匀器在25℃下颠倒封闭3h。洗涤后，加入1mL磁珠保存液(0.01M PBS配制的3％BSA)，4℃保存备用。
(3)制备发光物标记的检测抗体
取AE(吖啶酯)10μL，加入90μL无水DMF(无水二甲基甲酰胺)，混合均匀后取20μL至100μg待标记的检测抗体(8MKL-62)中，混匀后利用振荡器在25℃避光下孵育40min。
抗体封闭：取20μL封闭液(5％赖氨酸)至孵育完成的AE标记的检测抗体中，混匀后利用振荡器在25℃避光下震荡封闭40min。透析，加入1mL AE保存液(0.01M PBS，pH7.4)重悬，4℃保存备用。
(4)待测外泌体样本中KL-6含量的检测与计算
将10μL步骤(1)制得的待测外泌体样本与180μL样本稀释液(0.01M PBS，0.05％吐温-20)混合，充分混匀，得待测样本测试液。将10μL标准品(已知浓度的KL-6重组蛋白)与180μL样本稀释液混合，充分混匀，得标准品测试液。将10μL校准品(440U/ml的KL-6)与180μL样本稀释液混合，充分混匀，得低值校准品测试液。将10μL校准品(1040U/ml的KL-6)与180μL样本稀释液混合，充分混匀，得高值校准品测试液。分别对待测样本测试液、标准品测试液(6种浓度的KL-6重组蛋白分别进行操作)、低值校准品测试液和高值校准品测试液进行如下操作：
取200μL步骤(2)制得的捕获抗体标记的磁珠，加入10μL测试液，充分混匀后37℃孵育15min。反复清洗去除反应液，得捕获外泌体的磁珠。
将200μL步骤(3)制得的AE标记的抗体与捕获外泌体的磁珠混合，充分混匀后35℃孵育8min。反复清洗去除反应液，得抗体结合的磁珠复合物。向其中加入AE预激发液100μL，立即加入100μL激发液，充分混匀后测定最大发光强度。依据标准品检测得的发光强度拟合成标准曲线，通过标准曲线计算出待测样本中KL-6含量。
实施例3
本实施例提供一种外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法，包括如下步骤：
(1)分离提取外泌体
样本预处理：将血清样本(1mL)于4℃以10000g的转速离心10min，去除样本中杂质，将离心后上清液转移至新的离心管中。
上清液预处理：在去除杂质的上清液中加入2倍样本体积的预冷的PBS(浓度为0.01M)，得混合液。
分离外泌体：将混合液于4℃以12000g的转速离心2h，弃上清，收集沉淀，加入1/2样本体积的预冷的PBS，均匀吹打混匀，即得待测外泌体样本。
(2)制备捕获抗体标记的磁珠
磁珠预处理：向1.1mg磁珠中加入600μL平衡液(0.01M PBS)，涡旋震荡混匀，于磁力架上移去液体。加入300μL磁珠活化Buffer(10mg/mL EDC，10mg/mL NHS)，涡旋混匀，利用涡旋振荡器在25℃下震荡孵育20min。
抗体偶联：磁力架上移去磁珠活化Buffer，加入捕获抗体(8MKL-61 100μg)，涡旋混匀，利用涡旋振荡器在25℃下震荡孵育3h。
磁珠封闭：在磁力架上移去未偶联的抗体，加入600μL封闭液(0.01M PBS配制的5％BSA)，涡旋混匀，利用垂直混匀器在25℃下颠倒封闭2.5h。洗涤后，加入1mL磁珠保存液(0.01M PBS配制的3％BSA)，4℃保存备用。
(3)制备发光物标记的检测抗体
取AP(碱性磷酸酶)10μL，加入100μL无水DMF(无水二甲基甲酰胺)，混合均匀后取20μL至100μg待标记的检测抗体(8MKL-62)中，混匀后利用振荡器在25℃避光下孵育20min。
抗体封闭：取25μL封闭液(5％赖氨酸)至孵育完成的AP标记的检测抗体中，混匀后利用振荡器在25℃避光下震荡封闭20min。AP保存液重悬透析过的AP标记抗体，4℃保存备用。
(4)待测外泌体样本中KL-6含量的检测与计算
将10μL步骤(1)制得的待测外泌体样本与180μL样本稀释液(0.01M PBS，0.05％吐温-20)混合，充分混匀，得待测样本测试液。将10μL标准品(已知浓度的KL-6重组蛋白)与180μL样本稀释液混合，充分混匀，得标准品测试液。将10μL校准品(440U/ml的KL-6)与180μL样本稀释液混合，充分混匀，得低值校准品测试液。将10μL校准品(1040U/ml的KL-6)与180μL样本稀释液混合，充分混匀，得高值校准品测试液。分别对待测样本测试液、标准品测试液(6种浓度的KL-6重组蛋白分别进行操作)、低值校准品测试液和高值校准品测试液进行如下操作：
取280μL步骤(2)制得的捕获抗体标记的磁珠，加入10μL测试液，充分混匀后37℃孵育10min。反复清洗去除反应液，得捕获外泌体的磁珠。
将280μL步骤(3)制得的AP标记的抗体与捕获外泌体的磁珠混合，充分混匀后38℃孵育6min。反复清洗去除反应液，得抗体结合的磁珠复合物。向其中加入AMPPD底物液200μL，充分混匀后36℃反应5min。在477nm波长下检测反应体系的发光强度。
依据标准品检测得的发光强度拟合成标准曲线，通过标准曲线计算出待测样本中KL-6含量。
测试例1
外泌体形态表征
利用透射电镜对实施例1的步骤(1)中制得的待测外泌体样本进行形态表征，结果见附图2。如图所示，提取到的外泌体具有典型的囊泡状结构，且粒径分布在40-100nm，与相关文献报道的结果一致，证明了外泌体的成功提取。
测试例2
方法的稳定性
取健康志愿者血清样本12例，每例3mL，分别采用实施例1-3提供的检测方法进行外泌体上KL-6蛋白含量的检测(样本量均为1mL)，3种检测方法得到的检测结果见表1。
表1
Figure BDA0003345209170000161
结果显示：实施例1-3的检测方法对同一样本的检测结果较为一致，标准误差较小，说明本发明提供的检测方法稳定性高，具有一定的应用价值。
测试例3
健康人样本与ILDs患者样本检测结果对比
取ILDs患者血清样本12例，采用实施例1提供的检测方法进行外泌体上KL-6蛋白含量的检测(样本量均为1mL)，检测结果见表2，并将测试例2中采用实施例1提供的检测方法得到的12例健康人样本的检测结果也列于表2进行对比。
表2
Figure BDA0003345209170000171
Figure BDA0003345209170000181
结果显示：整体来看，ILDs患者的外泌体上的KL-6蛋白含量显著高于健康志愿者样本的外泌体上的KL-6蛋白含量，将表中数据绘制成箱线图(见附图3)更是可以明显看出此现象。各样本的外泌体KL-6浓度存在个体差异，其中健康人样本的外泌体KL-6浓度范围为9-51U/mL，均值为24。ILDs患者的外泌体KL-6浓度范围为51-10000U/mL，均值为1147。依照健康人外泌体KL-6浓度的2.1倍设置截断值(CUTOFF值)，即50U/mL，可依据此CUTOFF值来确定待测样本外泌体KL-6检测结果的阴阳性，并以此来确认患者肺部疾病状态。
测试例4
本发明的检测方法(即试剂盒检测)与传统血清检测方法的结果对比
采用传统的血清KL-6含量检测方法对测试例2中的12例ILDs患者的血清样本进行检测，将其检测结果与本发明的方法得到的检测结果进行对比，并进行相关性分析，见附图4。结果显示：两种方法得到的检测结果显著相关，相关系数0.9349，P<0.0001。说明了本检测方法的准确性和可行性。
目前，通过传统的血清KL-6含量检测方法进行肺部患病情况的阴阳性判定时，临床上给出的参考值是500U/mL。如附图5所示，图中竖虚线表示血清KL-6检测值为500U/mL，图上横虚线表示本发明提供的外泌体KL-6检测截断值50U/mL。图中箭头标出的四例患者的血清KL-6值低于500U/mL，因此若依照传统的血清KL-6含量检测方法则应判定他们为阴性，而这四例患者的外泌体KL-6值高于本发明提供的截断值50U/mL，因此依照本发明提供的试剂盒检测则应判定他们为阳性。这一结果表明，本发明提供的检测肺部疾病的试剂盒相较于传统的血清检测在肺部疾病的诊断上具有更好的灵敏度，减少了诊断结果的假阴性，具有重要的应用价值。
综上，本发明首次提出外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法，并应用于血清样本的检测，检测方法具有较高的稳定性。基于本发明提供的检测方法得到的检测结果与传统的血清检测得到的结果显著相关，证明了本发明检测方法具有较高的准确性和可行性。本发明提供的外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法在外泌体相关基础研究等领域具有重要的应用价值。本发明还首次发现外泌体上KL-6蛋白含量与肺部患病情况有较大相关性，此发现对于肺部疾病的机理研究以及临床诊断等方面具有重要意义。本发明还提供了一种诊断肺部疾病的试剂盒，基于检测结果，依照健康人外泌体KL-6浓度的2.1倍设置截断值(CUTOFF值)，即50U/mL，确定待测样本外泌体KL-6检测结果的阴阳性，并以此来确认患者肺部疾病状态。本发明提供的试剂盒相比于传统血清检测在肺部疾病的诊断上具有更好的灵敏度，减少了诊断结果的假阴性，具有重要的应用价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (7)

1.一种血清外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法在制备诊断间质性肺疾病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述血清外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法包括如下步骤：
（1）将捕获抗体标记的磁珠与待测血清外泌体样本混合，反应，得磁珠-外泌体复合物；
（2）将步骤（1）得到的磁珠-外泌体复合物与发光物标记的检测抗体混合，反应，得磁珠-外泌体-检测抗体复合物；
（3）将步骤（2）得到的磁珠-外泌体-检测抗体复合物与发光底物混合，反应，利用化学发光法检测反应体系的发光强度；
（4）利用标准曲线法，根据步骤（3）检测得到的发光强度计算得到待测血清外泌体样本的KL-6蛋白含量。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述反应的温度为33-40℃，所述反应的时间为5-15 min。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述反应的温度为33-40℃，所述反应的时间为5-15 min。
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述反应的温度为33-40℃，所述反应的时间为5-10 min。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述待测血清外泌体样本的制备方法选自离心法、超滤法、磁珠免疫法、聚乙二醇沉淀法或试剂盒提取法中的任意一种。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述待测血清外泌体样本的制备方法为离心法。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述离心的转速为10000-20000 g，所述离心的时间为1-2 h。
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