CN116735891B - 检测外泌体ca125的物质在制备诊断或辅助诊断肺部疾病的产品中的应用 - Google Patents
检测外泌体ca125的物质在制备诊断或辅助诊断肺部疾病的产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及检测外泌体CA125的物质在制备诊断或辅助诊断肺部疾病的产品中的应用。本发明提供了一种外泌体处理液,采用本发明提供的外泌体处理液对待测外泌体样本进行预处理,可以减少洗脱液中成分对外泌体蛋白检测的影响,有效缩短了检测时间,实现了外泌体蛋白的稳定检测,有利于外泌体蛋白全自动化检测的实现。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及检测外泌体CA125的物质在制备诊断或辅助诊断肺部疾病的产品中的应用。
背景技术
间质性肺疾病(interstitial lung diseases,ILD)是以进行性呼吸困难、干咳为主要症状的一组异质性疾病,病变部位在肺实质,伴有广泛炎症和弥漫性纤维化。肺纤维化作为间质性肺疾病的共同改变之一,具体表现为肺泡上皮细胞损伤,弥漫性局部肺泡炎、成纤维细胞病理性间质增生,细胞外基质(ECM)在肺间质和肺泡沉积,导致不可逆转的肺脏结构重塑和功能丧失,气体交换受损,甚至引起呼吸衰竭。间质性肺炎和肺纤维化的早期诊断可以指导用药以及改善预后,目前临床常用的诊断手段有肺功能检查、胸部HRCT以及有创的经支气管肺泡灌洗液检查和肺活检,故针对ILD疾病的早期筛查以及进展监控的血清学检测成为近年来有潜力的研究方向。
目前已用于临床的辅助诊断ILD的血清标志物有涎液化糖链抗原(KL-6),但KL-6检出率与灵敏度不够高,所以未能普及。糖类抗原CA125是目前应用最广泛的肿瘤血清标志物,主要表达在间皮、米勒管上皮、米勒管衍生物所发生的体腔上皮组织中,这些组织发生组织病变或异常增生时会导致CA125水平明显上升。多项研究证实,在肺癌患者血清中,CA125阳性率可达60%~70%。不仅如此,有研究证实血清CA125与ILD有显著相关性,且能够区分特发性肺纤维化(IPF)与其他ILD。
外泌体是指直径在30nm~150nm,平均直径为100nm的细胞外囊泡,经由细胞质膜内陷后与其他细胞内囊泡和细胞器融合形成。外泌体携带有丰富的蛋白质、核酸、脂质和代谢物,通过这些物质,外泌体可以通过调节受体细胞的下游信号通路而成为细胞-细胞交流的媒介。
外泌体在疾病的发生及进展中发挥着重要的作用,在疾病诊断和治疗方面具有独特的优势和潜在的价值。外泌体中的蛋白质也已作为潜在的生物标志物得到大量研究。CA125为MUC16基因表达的一种存在于细胞膜上的糖蛋白,最新研究发现卵巢癌的外泌体的CA125含量高于血液中游离的CA125,但外泌体上CA125蛋白在肺部疾病中诊断应用暂未见报道。
发明内容
本发明第一方面的目的,在于提供一种外泌体处理液。
本发明第二方面的目的,在于提供本发明第一方面的外泌体处理液的应用。
本发明第三方面的目的,在于提供一种试剂。
本发明第四方面的目的,在于提供一种试剂盒。
本发明第五方面的目的,在于提供一种检测系统。
本发明第六方面的目的,在于提供一种检测外泌体蛋白存在或含量的方法。
本发明第七方面的目的,在于提供检测外泌体CA125的物质在制备产品中的应用。
为了实现上述目的,本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供一种外泌体处理液,包含以下组分:缓冲物质、离子强度维持剂、封闭剂、表面活性剂、螯合剂和糖类。
优选地,所述缓冲物质在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为2~4%;进一步为2.2~3.8%。
优选地,所述缓冲物质包含硼砂盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸缓冲盐、醋酸缓冲盐、柠檬酸缓冲盐中的至少一种;进一步包含三羟甲基氨基甲烷(Tris)和磷酸缓冲盐。
优选地,所述三羟甲基氨基甲烷(Tris)在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为0.9~2.1%;进一步为1~2%。
优选地,所述磷酸缓冲盐在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为1.1~1.9%;进一步为1.2~1.8%。
优选地,所述磷酸缓冲盐为磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的至少一种;进一步为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物。
优选地,所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的重量比为1:(0.7~1.1);进一步为1:(0.8~1)。
优选地,所述磷酸氢二钠为十二水合磷酸氢二钠。
优选地,所述磷酸二氢钠为二水合磷酸二氢钠。
优选地,所述离子强度维持剂包含氯化盐;进一步为氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁中的至少一种;更进一步为氯化钠。
优选地,所述离子强度维持剂在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为0.6~1.2%;进一步为0.8~1%。
优选地,所述封闭剂包含牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、胶原蛋白肽中的至少一种。
优选地,所述封闭剂包含酪蛋白、胶原蛋白肽中的至少一种和BSA。
优选地,所述封闭剂包含BSA。
优选地,所述封闭剂在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为0.8~2.2%;进一步为1~2%。
优选地,所述表面活性剂包含阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂中的至少一种;进一步包含非离子表面活性剂,例如:含聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂(例如,醇乙氧基化物、聚氧乙烯-聚氧化亚烷基嵌段共聚物)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如,TWEEN(注册商标)系列(例如,Tween-20、Tween-40、Tween-80))、聚氧乙烯辛基苯基醚(例如,TRITON(注册商标)系列(例如,TritonX-100、Triton X-114、Triton X-305、Triton X-405、Triton X-705))、N-D-葡糖-N-甲基烷酰胺(例如,MEGA系列(例如,MEGA 8,MEGA 10);更进一步包含Tween-20。
优选地,所述表面活性剂在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为0.05~0.6%;进一步为0.1~0.5%。
优选地,所述螯合剂包含乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐中的至少一种;进一步包含乙二胺四乙酸的水溶性盐;更进一步包含乙二胺四乙酸二钠。
优选地,所述螯合剂在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为0.03~0.25%;进一步为0.05~0.2%。
优选地,所述糖类包含蔗糖、海藻糖中的至少一种;进一步包含海藻糖。
优选地,所述糖类在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为0.8~2.2%;进一步为1~2%。
优选地,所述外泌体处理液还包含防腐剂。
优选地,所述防腐剂包含叠氮钠、Proclin300、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷(BND)、Proclin900中的至少一种;进一步包含叠氮钠或Proclin300。
优选地,所述防腐剂在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为0.08~0.22%;进一步为0.1~0.2%。
优选地,所述外泌体处理液还包含水,水的用量为余量。
优选地,所述外泌体处理液的pH为6~8;进一步为7~8;更进一步为7.5。
优选地,所述外泌体来源于:全血、血清、血浆、支气管肺泡灌洗液、尿液中的一种或多种组合。
本发明的第二个方面,提供本发明第一个方面的外泌体处理液在a1)~a6)中至少一种的应用;
a1)检测外泌体物质的存在与否;
a2)检测外泌体物质的含量;
a3)制备诊断或辅助诊断疾病的产品,所述疾病通过外泌体物质的存在与否、或含量进行诊断或辅助诊断;
a4)制备评估疾病的严重程度的产品,所述疾病的严重程度通过外泌体物质的含量进行评估;
a5)制备检测外泌体物质的存在与否的产品;
a6)制备检测外泌体物质的含量的产品;
所述物质包含核酸、蛋白中的至少一种。
优选地,所述核酸包含DNA和RNA中的至少一种。
优选地,所述物质包含蛋白。
优选地,所述产品包含试剂、试剂盒、检测系统中的至少一种。
优选地,a1)、a2)所述应用为非诊断目的的应用。
优选地,所述外泌体来源于:全血、血清、血浆、支气管肺泡灌洗液、尿液中的一种或多种组合。
本发明的第三个方面,提供一种试剂,包含本发明第一个方面的外泌体处理液。
优选地,所述试剂用于b1)~b4)中至少一种:
b1)检测外泌体物质的存在与否;
b2)检测外泌体物质的含量;
b3)诊断或辅助诊断疾病,所述疾病通过外泌体物质的存在与否、或含量进行诊断或辅助诊断;
b4)评估疾病的严重程度,所述疾病的严重程度通过外泌体物质的含量进行评估。
所述物质包含核酸、蛋白中的至少一种。
优选地,所述核酸包含DNA和RNA中的至少一种。
优选地,所述物质包含蛋白。
优选地,所述外泌体来源于:全血、血清、血浆、支气管肺泡灌洗液、尿液中的一种或多种组合。
优选地,所述试剂通过用于对外泌体进行预处理进而用于b1)~b4)中至少一种。
本发明的第四个方面,提供一种试剂盒,包含c1)~c2)中至少一种:
c1)本发明第一个方面的外泌体处理液;
c2)本发明第三个方面的试剂。
优选地,所述试剂盒用于本发明第三个方面的b1)~b4)中至少一种。
优选地,一种试剂盒,包含c1)~c2)中至少一种、包被捕获抗体的磁珠和发光物标记的检测抗体:
c1)本发明第一个方面的外泌体处理液;
c2)本发明第三个方面的试剂;
所述试剂盒用于d1)~d4)中至少一种:
d1)检测外泌体蛋白的存在与否;
d2)检测外泌体蛋白的含量;
d3)诊断或辅助诊断疾病,所述疾病通过外泌体蛋白的存在与否、或含量进行诊断或辅助诊断;
d4)评估疾病的严重程度,所述疾病的严重程度通过外泌体蛋白的含量进行评估;
所述捕获抗体和/或所述检测抗体特异性结合所述蛋白。
优选地,所述捕获抗体和所述检测抗体分别针对所述蛋白的不同的抗原表位。
优选地,所述发光物包含吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的至少一种;进一步包含吖啶酯。
优选地,所述试剂盒还包含发光底物、蛋白校准品中的至少一种;进一步包含发光底物和蛋白校准品。
优选地,所述发光底物包含APS-5或AMPPD缓冲液(配套碱性磷酸酶)、吖啶酯预激发液和激发液(配套吖啶酯)、鲁米诺或异鲁米诺缓冲液(配套辣根过氧化物酶)中的至少一种。
优选地,所述蛋白为CA125,所述试剂盒用于e1)~e5)中至少一种:
e1)检测外泌体CA125的存在与否;
e2)检测外泌体CA125的含量;
e3)诊断或辅助诊断肺部疾病;
e4)评估肺部疾病的严重程度;
e5)诊断或辅助诊断肺纤维化。
优选地,所述肺部疾病包含肺炎或间质性肺疾病。
优选地,所述外泌体来源于:全血、血清、血浆、支气管肺泡灌洗液、尿液中的一种或多种组合。
本发明的第五个方面,提供一种检测系统,包含f1)~f3)中至少一种和化学发光仪;
f1)本发明第一个方面的外泌体处理液;
f2)本发明第三个方面的试剂;
f3)本发明第四个方面的试剂盒。
优选地,所述检测系统用于本发明第三个方面中的b1)~b4)中至少一种、或本发明第四个方面中的d1)~d4)中至少一种。
本发明的第六个方面,提供一种检测外泌体蛋白存在或含量的方法,包含采用本发明第一个方面的外泌体处理液对所述外泌体进行预处理的步骤。
优选地,所述采用本发明第一个方面的外泌体处理液对所述外泌体进行预处理的步骤具体如下:将所述外泌体处理液与所述外泌体混合,反应。
优选地,所述外泌体处理液与所述外泌体的体积比为1:(2~30),例如可以是1:2、1:5、1:9、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:22、1:25、1:28或1:30等。
优选地,所述反应的时间为5~120min;进一步为5~10min,例如可以是5min、6min、7min、8min、9min或10min等。
优选地,所述反应的温度为25~42℃;进一步为35~40℃,例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
优选地,所述外泌体来源于:全血、血清、血浆、支气管肺泡灌洗液、尿液中的一种或多种组合。
优选地,所述外泌体的制备方法为全自动外泌体提取仪器或手动提取方法(如离心法、试剂盒法、超滤法、磁珠免疫法、聚乙二醇沉淀法)中的任意一种。
优选地,所述方法还包含如下步骤:
(1)将预处理后的外泌体与包被捕获抗体的磁珠混合,反应,得到包被捕获抗体的磁珠-外泌体复合物;
(2)将包被捕获抗体的磁珠-外泌体复合物与发光物标记的检测抗体混合,反应,得到包被捕获抗体的磁珠-外泌体-发光物标记的检测抗体复合物;
(3)将包被捕获抗体的磁珠-外泌体-发光物标记的检测抗体复合物与发光底物混合,反应,检测发光强度,获得外泌体样本中蛋白的含量。
优选地,步骤(1)、(2)中所述反应的时间为5~120min;进一步为5~10min,例如可以是5min、6min、7min、8min、9min或10min等。
优选地,步骤(1)、(2)中所述反应的温度为25~42℃;进一步为35~40℃,例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
优选地,步骤(3)中获得外泌体样本中蛋白的含量的方法为:使用蛋白校准品通过标准曲线法构建标准曲线,然后根据检测的发光强度计算得到外泌体样本中蛋白的含量。
优选地,所述包被捕获抗体的磁珠、发光物标记的检测抗体、发光底物为本发明第四个方面中的包被捕获抗体的磁珠、发光物标记的检测抗体、发光底物。
优选地,所述包被捕获抗体的磁珠的制备方法为本领域的常用方法,具体如下:将活化的磁珠与捕获抗体混合,孵育,封闭,得到。
优选地,所述活化的磁珠与捕获抗体的质量比为100:(1~10);进一步为100:(1~4);更进一步为100:(2~3)。
优选地,所述活化的磁珠的制备方法为:将磁珠、EDC和NHS混合,反应,得到。
优选地,所述磁珠、EDC和NHS的质量比为(0.03~0.07):(0.06~0.14):1。
优选地,所述磁珠为包含磁珠的磁珠活化缓冲液。
优选地,所述反应的条件为室温下反应15~120min。
优选地,所述孵育的时间为1~4h。
优选地,所述封闭的具体方法为:孵育后的活化的磁珠与捕获抗体的混合液与封闭剂混合。
优选地,所述孵育后的活化的磁珠与捕获抗体的混合液与封闭剂的用量按磁珠与封闭剂的质量比计为1:(2~10);进一步为1:(2~5)。
优选地,所述封闭后还包括如下步骤:磁分离去除上清,然后用稀释液稀释。
优选地,所述稀释液按重量百分比计由以下组分组成:Tris 0.05~0.1%、NaCl0.9~3.0%、BSA 1~3%、Tween-20 0.1~0.5%、叠氮钠0.1~0.2%、水余量,pH7.5。
优选地,所述发光物标记的检测抗体的制备方法为本领域的常用方法,具体如下:将发光物与检测抗体混合,孵育,淬灭,得到。
优选地,所述孵育的时间为30~120min。
优选地,所述淬灭的具体方法为:将孵育后的发光物与检测抗体的混合液与淬灭剂混合,反应。
优选地,所述反应的时间为30~120min。
优选地,所述淬灭后还包括如下步骤:纯化、稀释液稀释。
优选地,所述纯化的方法包括透析或脱盐柱处理。
优选地,所述稀释液按重量百分比计由以下组分组成:MES 0.05~0.1%、NaCl0.9~3.0%、BSA 1~3%、Tween-20 0.1~0.5%、叠氮钠0.1~0.2%、水余量,pH6.5。
优选地,所述方法为非疾病诊断方法。
本发明的第七个方面,提供检测外泌体CA125的物质在制备产品中的应用;
所述产品用于g1)~g3)中至少一种:
g1)诊断或辅助诊断肺部疾病;
g2)评估肺部疾病的严重程度;
g3)诊断或辅助诊断肺纤维化。
优选地,所述肺部疾病包含肺炎或间质性肺疾病。
优选地,所述检测CA125的物质包含在基因水平和/或蛋白质水平上检测CA125的物质;进一步包含在蛋白质水平上检测CA125的物质。
优选地,所述产品为试剂、试剂盒、检测芯片或检测系统。
优选地,所述产品包含本发明第一个方面的外泌体处理液。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种外泌体处理液,采用本发明提供的外泌体处理液对待测外泌体样本进行预处理,可以减少洗脱液中成分对外泌体蛋白检测的影响,有效缩短了检测时间,实现了外泌体蛋白的稳定检测,有利于外泌体蛋白全自动化检测的实现。
本发明首次公开了外泌体CA125作为肺部疾病的诊断、辅助诊断、严重程度评估和/或肺纤维化诊断的标志物,该方法相比较于传统的标志物--血清CA125具有更好的诊断效果:更高的特异性和灵敏度,具有重要的临床价值和推广前景。
附图说明
图1是效果实施例2中采用对比例1、对比例2和实施例5提供的检测方法进行外泌体上CA125蛋白含量的检测的结果图。
图2是效果实施例3中血清CA125与外泌体上CA125诊断间质性肺疾病的ROC曲线图。
图3是效果实施例4中健康人群、ILD阳性且已上市血清KL-6检测试剂结果阴性样本、ILD阳性且已上市血清KL-6检测试剂结果阳性样本采用实施例5提供的检测方法进行外泌体上CA125蛋白含量检测的结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等,如无特别说明,为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中缩略语和关键术语定义如下:
Tris:三羟甲基氨基甲烷;
BSA:牛血清白蛋白;
Tween-20:吐温20;
EDTA-2Na:乙二胺四乙酸二钠;
MES:吗啉乙磺酸;
EDC:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐;
NHS:N-羟基琥珀酰亚胺;
BND:5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷。
实施例1一种外泌体处理液
一种外泌体处理液,按重量百分比计,由以下组分组成:Tris 1%、十二水合磷酸氢二钠0.6%、二水合磷酸二氢钠0.6%、NaCl 0.8%、BSA 1%、Tween-20 0.1%、EDTA-2Na0.05%、海藻糖1%、叠氮钠0.1%、水余量;pH7.5。
实施例2一种外泌体处理液
一种外泌体处理液,按重量百分比计,由以下组分组成:Tris 2%、十二水合磷酸氢二钠1%、二水合磷酸二氢钠0.8%、NaCl 1%、BSA 2%、Tween-20 0.5%、EDTA-2Na0.2%、海藻糖2%、叠氮钠0.2%、水余量;pH7.5。
实施例3一种外泌体处理液
一种外泌体处理液,按重量百分比计,由以下组分组成:Tris 1.5%、十二水合磷酸氢二钠0.8%、二水合磷酸二氢钠0.7%、NaCl 0.9%、BSA 1.5%、Tween-20 0.3%、EDTA-2Na 0.1%、海藻糖1.5%、叠氮钠0.15%、水余量;pH7.5。
实施例4一种外泌体处理液
一种外泌体处理液,按重量百分比计,由以下组分组成:Tris 1%、十二水合磷酸氢二钠0.6%、二水合磷酸二氢钠0.6%、NaCl 0.8%、BSA 1%、Tween-20 0.1%、EDTA-2Na0.05%、海藻糖1%、proclin300 0.1%、水余量;pH7.5。
实施例5一种外泌体上CA125蛋白的检测方法
一种外泌体上CA125蛋白的检测方法,包括如下步骤:
(1)磁珠包被物的制备
1)磁珠活化:往1mL磁珠活化缓冲液(含质量浓度1%的MES的水溶液)中加入10mg磁珠,加入EDC溶液(终浓度0.5mg/mL)和NHS溶液(终浓度1mg/mL),室温反应30min,使磁珠活化,后通过磁分离去除上清。
2)抗体偶联:使用1mL磁珠偶联缓冲液(含质量浓度1%的MES的水溶液)将10mg磁珠重悬,加入300μg CA125捕获抗体(北京开景,货号:BXA003),室温孵育2h,得到磁珠-抗体偶联物的溶液。
3)封闭:向磁珠-抗体偶联物的溶液中加入100μL封闭剂(质量浓度1%的牛血清白蛋白水溶液),室温孵育2h。
4)清洗:磁分离去除上清后,加入1mL磁珠清洗液(含质量浓度0.1%的proclin300的PBS缓冲液)进行清洗,重复清洗步骤2次后磁分离去上清,得到包被CA125捕获抗体的磁珠(CA125磁珠包被物)。
5)磁珠包被物工作液制备:将CA125磁珠包被物使用磁珠包被物稀释液稀释,得到浓度为0.5mg/mL的磁珠包被物工作液;其中,磁珠包被物稀释液按重量百分比计由以下组分组成:Tris 0.1%、NaCl 2%、BSA 3%、Tween-20 0.5%、叠氮钠0.1%、水余量,pH7.5。
(2)吖啶酯标志物的制备
1)吖啶酯母液制备:将吖啶酯溶于无水DMSO,使其终浓度为5mg/mL。
2)标记反应:使用0.2M NaHCO3(pH=9.0)溶液稀释300μg的CA125检测抗体(北京开景,货号:BXA004),加入15μL吖啶酯母液,定容至300μL,此时吖啶酯的浓度为0.25mg/mL;使用锡箔纸包好,将混合液体至于恒温混匀仪上,室温标记30分钟。
3)淬灭反应:加入100μL标记终止缓冲液(含质量浓度10%赖氨酸的0.2M NaHCO3溶液,pH 9.0),室温混匀30分钟。
4)纯化:使用脱盐柱纯化已标记抗体,收集吖啶酯标记蛋白组分并检测浓度,得到CA125检测抗体吖啶酯标记物。
5)发光物标记抗体工作液(吖啶酯标记物工作液)制备:将CA125检测抗体吖啶酯标记物使用吖啶酯标记物稀释液稀释,得到浓度为0.4μg/mL的吖啶酯标记物工作液;其中,吖啶酯标记物稀释液按重量百分比计由以下组分组成:MES 0.1%、NaCl 2%、BSA 3%、Tween-200.1%、叠氮钠0.1%、水余量,pH6.5。
(3)外泌体样本预处理
1)样本预处理:将血清或血浆使用PBS稀释一倍后,使用0.22um滤膜过滤去除细胞碎片和其他杂质。
2)外泌体提取:使用外泌体自动提取仪进行外泌体提取。
将10μL外泌体样本与90μL实施例1的外泌体处理液混合,在37℃下反应5min。
(4)待测外泌体样本中CA125含量的检测与计算
1)取步骤(3)得到的预处理后的样本20μL,加入磁珠包被物工作液50μL,混匀后37℃孵育5min;然后经磁分离,洗涤除去未结合物质,弃上清,得到磁珠包被物-外泌体复合物。
2)磁珠包被物-外泌体复合物中加入发光物标记抗体工作液(吖啶酯标记物工作液)50μL,混匀后37℃孵育5min;然后经磁分离,洗涤除去未结合物质,得到磁珠包被物-外泌体-标记物复合物。
3)向得到的磁珠包被物-外泌体-标记物复合物中加入100μL吖啶酯预激发液(含0.1wt%的30wt%过氧化氢和0.2mol/L硝酸的水溶液)和100μL激发液(含0.1wt%十六烷基三甲基氯化铵和0.2mol/L氢氧化钠的水溶液),充分混匀后测定最大发光强度;依据标准品检测得的发光强度拟合成标准曲线,通过标准曲线计算出待测外泌体样本中CA125含量。
实施例6一种外泌体上CA125蛋白的检测方法
本实施例的检测方法与实施例5相同,区别仅在于:步骤(3)采用实施例2的外泌体处理液。
实施例7一种外泌体上CA125蛋白的检测方法
本实施例的检测方法与实施例5相同,区别仅在于:步骤(3)采用实施例3的外泌体处理液。
实施例8一种外泌体上CA125蛋白的检测方法
本实施例的检测方法与实施例5相同,区别仅在于:步骤(3)采用实施例4的外泌体处理液。
实施例9一种外泌体上CA125蛋白的检测方法
本实施例的检测方法与实施例5相同,区别仅在于:步骤(1)的2)中CA125捕获抗体的用量为200μg。
实施例10一种外泌体上CA125蛋白的检测方法
本实施例的检测方法与实施例5相同,区别仅在于:步骤(2)的2)中CA125检测抗体的用量为200μg。
对比例1一种外泌体上CA125蛋白的检测方法
本实施例的检测方法与实施例5相同,区别仅在于:不对外泌体样本进行预处理,即不包含步骤(3)。
对比例2一种外泌体上CA125蛋白的检测方法
本实施例的检测方法与实施例5相同,区别仅在于:将实施例1的外泌体处理液替换为市售的PBS缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司,货号:ST447)。
效果实施例1
外泌体预处理液对外泌体CA125蛋白检测结果稀释回收的影响
血清外泌体CA125阳性的样本使用试剂盒提取外泌体获得外泌体原液,使用PBS缓冲液进行2倍、4倍稀释,然后分别采用实施例5~10和对比例1~2的检测方法在全自动化学发光免疫分析仪(型号:shine i2910)上进行外泌体上CA125蛋白含量的检测。根据外泌体原液、2倍稀释、4倍稀释的发光值计算稀释回收率,样本经稀释后室温放置超过1h后与外泌体原液同时进行检测。
结果如表1所示:采用本发明提供的外泌体处理液进行预处理后(实施例5~10)检测外泌体蛋白,稀释回收率在92~112%,显著优于未进行预处理或采用PBS缓冲液进行预处理(对比例1~2);可见,采用本发明提供的外泌体处理液对待测外泌体样本进行预处理,通过对外泌体样本进行稀释,降低洗脱液中的高盐和表面活性剂成分对外泌体蛋白检测的干扰,有利于外泌体蛋白全自动化检测的实现。
表1外泌体处理液对外泌体CA125蛋白检测结果影响
效果实施例2
外泌体预处理液对外泌体CA125蛋白检测结果差异显著性的影响
取健康人血清(CN)样本8例,ILD阳性(ILD)样本8例,采用对比例1、对比例2和实施例5提供的检测方法进行外泌体上CA125蛋白含量的检测,评估三种方法的差异显著性。结果如图1所示:采用对比例1检测方法的结果无显著性差异,采用对比例2检测方法的结果差异显著(p<0.05),采用实施例5检测方法的结果差异极显著(p<0.001)。
效果实施例3
健康人样本与ILD患者样本血清CA125与外泌体上CA125检测结果对比
取健康人群血清样本20例,ILD阳性且已上市血清KL-6检测试剂结果阴性样本20例、ILD阳性且已上市血清KL-6检测试剂结果阳性样本20例;使用市面上已获证的血清CA125试剂盒检测60例血清中的CA125;采用实施例5提供的检测方法进行外泌体上CA125蛋白含量的检测;对两部分结果进行ROC分析,结果如图2所示:基于间质性肺疾病的临床诊断对样本阴阳进行界定,并分别制作ROC曲线,其中,外泌体上的CA125(serum-exo)的ROC曲线的AUC=0.88,血清CA125(serum)的ROC曲线的AUC=0.83,可见,外泌体上的CA125(serum-exo)的诊断效果优于血清CA125(serum)。根据AUC得出外泌体CA125的cutoff值为11000,其敏感度为90%;血清CA125的cufoff值为115000,其敏感度为70%。外泌体上CA125测值敏感度高于血清CA125测值,即采用外泌体CA125作为ILD等肺部疾病的标志物具有更高的灵敏度。
效果实施例4
健康人样本与ILD患者样本外泌体上CA125检测结果对比
取健康人群血清样本20例,ILD阳性且已上市血清KL-6检测试剂结果阴性样本20例、ILD阳性且已上市血清KL-6检测试剂结果阳性样本20例;用实施例5提供的检测方法进行外泌体上CA125蛋白含量的检测;结果如表2、图3所示:在血清KL-6阳性的ILD患者,其外泌体上CA125蛋白检测发光值均显著高于健康人群样本外泌体上CA125蛋白检测发光值(P<0.0001),其血清CA125蛋白检测发光值均显著高于健康人群样本外泌体上CA125蛋白检测发光值(P<0.01),但显著性不及外泌体上CA125;在血清KL-6阴性的ILD患者,其血清CA125蛋白检测发光值与健康人群体血清CA125蛋白的检测发光值没有统计学差异(P=0.942),而外泌体上CA125蛋白检测发光值均有高于健康人群样本外泌体上CA125蛋白检测发光值的趋势(P=0.061);可见,外泌体CA125检测能够一定程度上区分部分ILD阳性血清KL-6阴性的患者样本与健康人群样本(效果优于血清CA125),具有更好的诊断效果。
表2健康人样本与ILD患者样本外泌体上CA125检测结果对比
效果实施例5
外泌体CA125用于间质性肺部疾病诊断
根据效果实施例3中健康人群和ILD患者样本外泌体上CA125的发光值,可初步确定外泌体CA125检测方法中的cutoff值为11000。根据cutoff确定ILD患者样本外泌体CA125检测结果的阴阳性,然后评估检测结果阴阳性与ILD患者临床症状的相关性,结果如表3所示:结合表2及表3测试结果初步确定外泌体CA125 cutoff值为11000,对于已上市血清KL-6检测试剂盒测试结果为阴性(<500U/mL)的ILD患者,外泌体CA125检出率为35%(7/20);表明外泌体CA125相比于血清KL-6检测试剂盒,在血清KL-6阴性样本中具有更高的间质性肺炎检出率,除此以外,通过对比外泌体CA125、血清KL-6测值与ILD阳性患者临床表现的相关性,在7例血清KL-6阴性、CA125阳性的患者中,1例出现呼吸衰竭,1例为特发性间质性肺炎;在11例外泌体CA125和血清KL-6均为阳性的患者中,临床明确被诊断为肺纤维化的患者有8例,出现重症肺炎/呼吸衰竭的患者有3例,这说明外泌体上的CA125可以作为标志物筛选出间质性肺炎患者中已经出现肺纤维化或进展为重症肺炎的患者,这表明外泌体CA125在诊断间质性肺疾病和评估间质性肺疾病严重程度过程中具有重要潜在临床价值。
表3外泌体CA125用于间质性肺疾病诊断结果
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上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (22)
1.一种外泌体处理液,按重量百分比计由以下组分组成:2.2~3.8% 缓冲物质、0.8~1% 离子强度维持剂、1~2% 封闭剂、0.1~0.5% 表面活性剂、0.05~0.2% 螯合剂、1~2%糖类、0.1~0.2% 防腐剂和水 余量;
所述离子强度维持剂为氯化钠;
所述封闭剂为BSA;
所述表面活性剂为Tween-20;
所述糖类为海藻糖;
所述螯合剂包含乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐中的至少一种;
所述外泌体处理液的pH为6~8。
2.根据权利要求1所述的外泌体处理液,其特征在于:
所述缓冲物质包含硼砂盐、三羟甲基氨基甲烷、磷酸缓冲盐、醋酸缓冲盐、柠檬酸缓冲盐中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的外泌体处理液,其特征在于:
所述缓冲物质包含三羟甲基氨基甲烷和磷酸缓冲盐。
4.根据权利要求1所述的外泌体处理液,其特征在于:
所述防腐剂包含叠氮钠、Proclin300、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、Proclin 900中的至少一种。
5.根据权利要求1~4任一项所述的外泌体处理液,其特征在于:
所述外泌体处理液的pH为7~8;或
所述外泌体来源于:全血、血清、血浆、支气管肺泡灌洗液、尿液中的一种或多种组合;或
所述防腐剂为叠氮钠或Proclin300。
6.根据权利要求3所述的外泌体处理液,其特征在于:
所述三羟甲基氨基甲烷在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为0.9~2.1%;或
所述磷酸缓冲盐在所述外泌体处理液中的含量按重量百分比计为1.1~1.9% 。
7.根据权利要求3或6所述的外泌体处理液,其特征在于:
所述磷酸缓冲盐为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物。
8.根据权利要求7所述的外泌体处理液,其特征在于:
所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的重量比为1:(0.7~1.1)。
9.一种试剂或试剂盒,包含权利要求1~8任一项所述的外泌体处理液。
10.一种检测试剂盒,包含c1)~c2)中至少一种、包被捕获抗体的磁珠和发光物标记的检测抗体:
c1) 权利要求1~8任一项所述的外泌体处理液;
c2)权利要求9所述的试剂;
所述检测试剂盒用于d1)~d4)中至少一种:
d1)检测外泌体蛋白的存在与否;
d2)检测外泌体蛋白的含量;
d3)诊断疾病,所述疾病通过外泌体蛋白的存在与否、或含量进行诊断;
d4)评估疾病的严重程度,所述疾病的严重程度通过外泌体蛋白的含量进行评估;
所述捕获抗体和/或所述检测抗体特异性结合所述蛋白。
11.根据权利要求10所述的检测试剂盒,其特征在于:
所述发光物包含吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的至少一种;或
所述捕获抗体和所述检测抗体分别针对所述蛋白的不同的抗原表位。
12.根据权利要求11所述的检测试剂盒,其特征在于:
所述检测试剂盒还包含发光底物、蛋白校准品中的至少一种。
13.根据权利要求10所述的检测试剂盒,其特征在于:
所述蛋白为CA125,所述试剂盒用于e1)~e3)中至少一种:
e1)检测外泌体CA125的存在与否;
e2)检测外泌体CA125的含量;
e3)诊断间质性肺疾病。
14.根据权利要求10~13任一项所述的检测试剂盒,其特征在于:
所述诊断包含辅助诊断。
15.一种检测系统,包含f1)~f3)中至少一种和化学发光仪;
f1) 权利要求1~8任一项所述的外泌体处理液;
f2) 权利要求9所述的试剂或试剂盒;
f3) 权利要求10~14任一项所述的检测试剂盒。
16.一种非诊断目的地检测外泌体蛋白存在或含量的方法,包含采用权利要求1~8任一项所述的外泌体处理液对所述外泌体进行预处理的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法,其特征在于:所述采用外泌体处理液对所述外泌体进行预处理的步骤具体如下:将所述外泌体处理液与所述外泌体混合,反应。
18.根据权利要求17所述的方法,其特征在于:
所述反应的时间为5~120min;或
所述反应的温度为25~42℃。
19.根据权利要求18所述的方法,其特征在于:
所述方法还包含如下步骤:
(1)将预处理后的外泌体与包被捕获抗体的磁珠混合,反应,得到包被捕获抗体的磁珠-外泌体复合物;
(2)将包被捕获抗体的磁珠-外泌体复合物与发光物标记的检测抗体混合,反应,得到包被捕获抗体的磁珠-外泌体-发光物标记的检测抗体复合物;
(3)将包被捕获抗体的磁珠-外泌体-发光物标记的检测抗体复合物与发光底物混合,反应,检测发光强度,获得外泌体样本中蛋白的含量。
20.S1~S3中任一种应用:
S1:权利要求1~8任一项所述的外泌体处理液在a1)~a2)中至少一种的应用;
a1)检测外泌体物质的存在与否;
a2)检测外泌体物质的含量;
S1中所述物质包含核酸、蛋白中的至少一种;
S1中所述应用为非诊断目的的应用;
S2:检测外泌体CA125的物质在制备产品中的应用;
所述产品用于诊断间质性肺疾病;
S2中所述产品包含权利要求1~8任一项所述的外泌体处理液;
S3:权利要求1~8任一项所述的外泌体处理液在a3)~a6)中至少一种的应用;
a3)制备诊断疾病的产品,所述疾病通过外泌体物质的存在与否、或含量进行诊断;
a4)制备评估疾病的严重程度的产品,所述疾病的严重程度通过外泌体物质的含量进行评估;
a5)制备检测外泌体物质的存在与否的产品;
a6)制备检测外泌体物质的含量的产品;
S3中所述物质包含核酸、蛋白中的至少一种。
21.根据权利要求20所述的应用,其特征在于:S2、S3中所述产品为试剂、试剂盒、检测芯片或检测系统。
22.根据权利要求20或21所述的应用,其特征在于:
S2、S3中所述诊断包含辅助诊断。
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- 2023-05-15 CN CN202310547579.2A patent/CN116735891B/zh active Active
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Microfluidic-based exosome isolation and highly sensitive aptamer exosome membrane protein detection for lung cancer diagnosis;Liang Zhao et al.;《Biosensors and Bioelectronics》;1-14 * |
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