CN106841613A - 一种检测外泌体的方法及体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测外泌体的方法及体系，所述方法包括如下步骤：A.采集含有外泌体的生物样本，去除细胞，得到外泌体分析液；对外泌体进行大小鉴定、计数；取外泌体，进行蛋白定量；B.用外泌体检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体含量；C.采用外泌体CEA检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体CEA含量，确定外泌体CEA阴性和外泌体CEA阳性的判断标准；D.基于步骤C的检测结果，将上述外泌体分析液中的外泌体区分为外泌体CEA阴性亚群和外泌体CEA阳性亚群；E.建立生物样本的外泌体分布模型。本发明的外泌体检测体系能够用于肠癌的诊断和病程监测。

Description

一种检测外泌体的方法及体系

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地说，涉及一种检测外泌体的方法及体系、尤其是一种检测生物样本中外泌体CEA的方法及体系。

背景技术

《2015年中国肿瘤登记年报》中的数据显示，2015年中国肿瘤发病数为4249,000例，平均每天就有12,000例新诊断的肿瘤患者，而结直肠癌均是男性与女性发病率最高的五大肿瘤之一。世界卫生组织(WHO)指出防治癌症关键是“早发现、早诊断、早治疗”。因此，采用有效的方法实现癌症的早期诊断对于降低癌症整体死亡率、提高患者生存期起重大作用。目前，临床常用的肿瘤标志物癌胚抗原CEA在肠癌病人血清中的灵敏度仅为30％-50％，早期检出率更低，只有约10％-20％，这样的灵敏度及特异性都满足不了临床早诊早治的需求。

肠癌包括结肠癌和直肠癌的防治仍存在大量亟待解决的问题，关键是如何更早期发现、及时干预及如何提高检测灵敏度。外泌体是一类大小介于30-150nm的细胞分泌的囊泡，存在于人各种体液中。外泌体在细胞间通讯、信号转导、肿瘤进展等方面发挥作用，特别地，外泌体通过表面丰富的蛋白分子，在介导肿瘤微环境的形成中起重要作用。近年来研究表明，外泌体携带肿瘤遗传信息(DNA、RNA、蛋白质)，是肿瘤标志物的重要来源之一。2015年，美国安德森癌症中心在Nature上发表重要研究成果，报道胰腺癌细胞外泌体中包含有一种GPC1蛋白，这种蛋白有可能可以作为一种标志物用于非侵入性诊断和筛查处于适合手术治疗阶段的早期胰腺癌。外泌体肿瘤蛋白标志物相对于血清标志物检测，主要两个优势：1.诊断准确性提高，灵敏度提高(尤其是在早期诊断中)；2.特异性提高。因此，检测外泌体肿瘤标志物备受人们关注。

癌胚抗原CEA是一种肿瘤(结直肠癌、肺癌等)上皮细胞过表达的一种膜糖蛋白，参与肿瘤的发生和进展。血清CEA是一个广谱的肿瘤标志物，临床上常用于结直肠癌、肺癌、胃癌等辅助诊断及病程监控，然而，血清中CEA的检测灵敏度低，不能满足临床要求。至今，结直肠癌临床检测缺乏一种检测灵敏度高、特异性好的方法。相关文献报道，外泌体上存在CEA，但迄今为止，外泌体CEA与结肠癌、直肠癌的关系尚未见报道。

发明内容

为了更清晰地分析生物样本比如血清中的外泌体CEA与结直肠癌之间的关系，为探讨外泌体CEA作为结直肠癌诊断指标的可行性、研究生物样本种类与外泌体大小和CEA含量之间的关系、并且为生物样本种类与外泌体CEA之间关系的研究提供实验设计基础，进而探讨外泌体CEA在结直肠癌诊断中的临床意义，本发明采用新的定性和定量检测技术并结合数理统计手段来建立生物样本的外泌体分布模型。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种检测外泌体的方法，包括如下步骤：

A.采集含有外泌体的生物样本，去除细胞，得到外泌体分析液；对外泌体进行大小鉴定、计数；取一定数量的外泌体，进行蛋白定量。

B.用外泌体检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体含量，所述外泌体检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体，CD9和/或CD63和/或CD81标准品，化学发光底物液；

C.采用外泌体CEA检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体CEA含量，确定外泌体CEA阴性和外泌体CEA阳性的判断标准，所述外泌体CEA检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗癌胚抗原CEA单克隆抗体，CEA蛋白标准品，所述CEA蛋白可以是CEA重组蛋白，化学发光底物液；

D.基于步骤C的检测结果，将上述外泌体分析液中的外泌体区分为表面不包含CEA蛋白的外泌体CEA阴性亚群和表面包含CEA蛋白的外泌体CEA阳性亚群，并且计算外泌体CEA阴性亚群和外泌体CEA阳性亚群的比例；

E.基于步骤A至D的检测结果，建立生物样本的外泌体分布模型。

上述生物样本选自全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液、或眼泪。优选地，所述生物样本是血清。

优选地，当生物样本是血清时，检测血清CEA，并且比较分析检测外泌体CEA与血清CEA的灵敏度及特异性。其中血清CEA的检测可采用常规技术手段进行检测。由于血清CEA已经是一个广谱的肿瘤标志物，并且在临床上用于结直肠癌、肺癌、胃癌等辅助诊断及病程监控，如果血清CEA水平与血清中外泌体CEA水平之间存在特定关系比如线性关系，那么血清中外泌体CEA有潜力成为一种肿瘤标志物从而用于癌症的诊断及病程监控。

上述的方法中，步骤B和/或步骤C中的酶可以是常用于ELISA中的酶，选自过氧化物酶比如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、磷酸酯酶或荧光素酶等，比如是碱性磷酸酶。

在上述方法的步骤C中，可以将外泌体分析液梯度稀释，分析稀释倍数与相应发光值关系，以便验证检测到的信号是否是CEA特异性信号。

此外，在上述方法的步骤C中，可以将CEA重组蛋白加入到CEA阴性生物样本中，验证外泌体CEA检测体系中的抗CEA单克隆抗体是否是仅与游离CEA重组蛋白发生交叉反应、但不与阴性生物样本中其他蛋白发生交叉反应。这种情况下CEA重组蛋白可以作为外泌体CEA替代物或同工蛋白，从而用作外泌体CEA标准品。

优选地，在上述方法的步骤B和/或步骤D中，采用磁性微粒捕获外泌体后，采用添加有低浓度吐温(比如0.05％Tween-20)的洗液(或称洗涤液)洗涤磁性微粒，以便去除非特异性捕获物。

与上述方法相适应地，本发明的另一目的是提供一种用于检测外泌体的试剂盒，其包括外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系，其中

外泌体检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体或多克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体，CD9和/或CD63和/或CD81标准品，化学发光底物液；

外泌体CEA检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体或多克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗癌胚抗原CEA单克隆抗体，CEA蛋白标准品，所述CEA蛋白可以是CEA重组蛋白，化学发光底物液。

上述的试剂盒中，外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系中用于捕获外泌体的捕获抗体是单克隆抗体或多克隆抗体，更优选都是单克隆抗体，选自下组：抗CD9抗体，抗CD63抗体，抗CD81抗体；抗CD9和CD63抗体，抗CD9和CD81抗体，抗CD63和CD81抗体；抗CD9、CD63和CD81抗体。

相对应地，外泌体检测体系中酶标记的抗体是单克隆抗体，选自下组：抗CD9单克隆抗体，抗CD63单克隆抗体，抗CD81单克隆抗体；抗CD9和CD63单克隆抗体，抗CD9和CD81单克隆抗体，抗CD63和CD81单克隆抗体；抗CD9、CD63和CD81单克隆抗体。

优选地，当捕获抗体和酶标记的抗体是混合物时，两种以上抗体之间的摩尔比为1：1。

本发明的试剂盒可用于用于测定含有外泌体的生物样本比如血清中的外泌体CEA。

在一种优选的实施方式中，上述试剂盒中的外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系还分别包括稀释液和洗液。优选地，所述稀释液比如是含0.1wt％BSA的PBS缓冲液；所述洗液比如为25倍的PBST。

本发明设计的洗液主要由缓冲体系和表面活性剂组成，其中缓冲体系可以选择PBS、Tris-HCl等；表面活性剂通常选自Tween-20、Tween-80、TritonX-100等，洗液有助于清除磁珠表面附着的游离标记物，降低读数本底，提高信噪比。比如，洗液由0.01M的pH7.4磷酸盐缓冲液和0.15％Tween20配制而成，使用时可以用25倍超纯水稀释。

上述的试剂盒中，外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系中用于偶联捕获抗体的磁性微粒的粒径是0.1-10微米、优选0.2-5微米、优选0.2-3微米、更优选0.2-2微米、更优选0.3-1微米，以便在试剂盒的外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系使用时分别形成接近均相的反应体系。

在一种优选的实施方式中，磁性微粒是超顺磁亲水高分子磁微粒。优选所述磁性微粒是表面带有氨基或羧基活性基团、以四氧化三铁为内核的聚合物。所述活性基团可以是氨基、羧基、IDA(亚氨基二乙酸)、环氧基等，优选氨基或羧基。更优选磁性微粒的表面含有羧基活性基团。

在一种优选的实施方式中，上述试剂盒的外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系中偶联捕获抗体的磁性微粒呈磁珠悬液形式。

上述的试剂盒中，用于标记抗体的酶选自过氧化物酶比如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、磷酸酯酶或荧光素酶，优选是碱性磷酸酶(AP)。

当酶是辣根过氧化物酶时，其作用底物可以是鲁米诺(luminol)，通常称作化学发光底物A或者A液；引发剂溶液比如是双氧水溶液，通常称作化学发光底物B或者B液。

当酶是碱性磷酸酶(AP)时，其作用底物可以是9,10-二氢吖啶、1,2-二氧杂环丁烷化合物、对硝基苯磷酸酯(p-NPP)、磷酸4-甲基伞酮、Lumigen APS 5等。

本发明的检测外泌体的方法可用于针对不同生物样本中的外泌体的大小、外泌体表面蛋白比如CEA建立分布模型，为生物样本种类与外泌体大小和表面蛋白之间关系的研究提供数据支撑。

本发明的外泌体检测试剂盒通过比较结直肠癌患者与肠良性疾病、正常人血清外泌体中CEA含量来为结直肠癌的诊断和病程监控提供指导。与现有的血清CEA定量检测技术相比，本发明的血清外泌体CEA检测的灵敏度和特异性有明显提高。

附图说明

图1是本发明实施例中从人结直肠癌细胞系SW403细胞培养上清提取的外泌体表面蛋白CEA和CD63的免疫印迹分析。

图2是本发明实施例中外泌体鉴定体系曲线图。

图3是本发明实施例中外泌体CEA检测体系曲线图，图中Exos是指外泌体。

图4是本发明实施例中外泌体CEA标准曲线。

图5a是本发明实施例中血清中外泌体CEA检测的ROC曲线。

图5b是本发明实施例中血清CEA样本检测的ROC曲线。

具体实施方式

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本发明的外泌体检测体系的原理是基于磁微粒化学发光免疫检测机制。磁珠偶联抗CD9和/或CD63和/或CD81抗体、抗原CD9和/或CD63和/或CD81、酶标记抗CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体三者相结合形成双抗夹心免疫复合物，得到磁珠免疫复合物，然后利用磁场分离出该磁珠免疫复合物，加入酶促反应的化学发光底物液并借助化学发光信号来测定外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81含量，其中的酶用于催化或激活化学发光反应。

类似地，本发明的外泌体CEA检测体系的原理也是基于磁微粒化学发光免疫检测机制。磁珠偶联抗CD9和/或CD63和/或CD81抗体、抗原外泌体CEA、酶标记抗CEA单克隆抗体三者相结合形成双抗夹心免疫复合物，得到磁珠免疫复合物，然后利用磁场分离出该磁珠免疫复合物，加入酶促反应的化学发光底物液并借助化学发光信号来测定外泌体表面标志物CEA含量，其中的酶用于催化或激活化学发光反应。

在本发明中，术语“磁性微粒”、“磁微粒”、“磁珠”和“磁性颗粒”表示相同的意义，都是指用于将抗CD9和/或CD63和/或CD81抗体固定在其表面的具有超顺磁性的胶态复合材料，可均匀分散于一定基液中，在磁场中富集。

在本发明中，术语“单克隆抗体”和“单抗”表示相同的意义，术语“多克隆抗体”和“多抗”表示相同的意义。

至于磁性微粒，可以使用生物检测领域中常用的磁性微粒。作为一种选择方式，可以根据需要在磁性微粒表面覆盖高分子成分比如PEI(聚醚酰亚胺Polyetherimide)、PVA(聚乙烯醇)、PS(聚苯乙烯)等聚合物，包括硅化物、多聚糖、蛋白、纤维素或树脂等。

磁微粒化学发光免疫检测所使用的磁珠具有超顺磁和相应的磁场响应性，超顺磁性在后期洗涤分离过程中更利于全自动仪器应用。根据磁珠表面基团类型，所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、硅基磁珠、巯基磁珠、IDA(亚氨基二乙酸)磁珠、环氧基磁珠、醛基磁珠、链霉素亲和素磁珠等，本发明所提供的试剂盒中优选羧基磁珠。

在本发明的一种实施方式中，上述磁性微粒的粒径范围是0.1-10微米。磁性微粒的平均粒径的下限为0.1微米，优选为0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1微米；其上限为10微米，优选为9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5或3微米。更优选0.2-5微米、优选0.2-3微米、更优选0.3-2微米、更优选0.3-1微米。比如磁性微粒的平均粒径可以为0.2-5微米，优选0.2-3微米、更优选0.3-2微米、更优选0.5-1微米。如果平均粒径小于0.1微米，则不容易在反应或洗涤后从液体中分离，并可能影响外泌体、外泌体CEA含量的测定精确性；另一方面，如果平均粒径大于10微米，则在反应过程中容易发生沉降，难以形成稳定的混悬液，不利于外泌体、外泌体CEA检测体系形成接近均相的反应体系，进而可能影响到外泌体、外泌体CEA含量的测定精确性。

在反应和洗涤过程中，通过振荡等机械作用或变化的磁场等方式使磁性微粒保持悬浮状态。而在固液分离时则利用磁场吸附或离心等方式使磁性微粒沉降。

在优选的实施方式中，上述试剂盒中可进一步包括辅助试剂，比如，显色剂(底物溶液和引发剂溶液)、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂、以及CD9、CD63、CD81、CEA标准品和/或CD9、CD63、CD81、CEA质控品。比如，所述缓冲液用于增加检测试剂的稳定性、提高检测灵敏度以及检测特异性。所述稀释剂用于稀释样本，是含有BSA的溶液。所述洗涤试剂用于洗涤磁珠，除去没有偶联到磁珠上的物质。洗涤试剂可以是含有磷酸盐、氯化钠以及表面活性剂的缓冲液。

在优选的实施方式中，上述试剂盒还可分别包括下述物品中的至少之一：携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部；也可以是多媒体的形式比如录像、视频等。

本发明试剂盒进行外泌体、外泌体CEA的测试具有操作简单、线性范围宽、准确度高、重复性好、灵敏度高、检测时间短等优点。

本发明的试剂盒在医学领域的具体应用，主要体现在肠癌的鉴别诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测方面。以下以个体的血清为生物样本实例进行肠癌癌鉴别诊断为例，对本发明作进一步详细说明。

发明人发现，采用本发明的检测外泌体CEA的方法，可明显提高直肠癌诊断准确性。作为一个实例，其包括以下如下步骤：

(1)临床血清样本预处理

临床血清样本-80℃解冻后，1200g离心30min(4℃)，

去沉淀，保留含外泌体的上清液。

(2)细胞上清含CEA外泌体提取

采用高速离心方法提取人结肠癌细胞系SW403细胞培养上清液中的外泌体。

(3)外泌体捕获

利用偶联外泌体表面标志物CD63或CD9或CD81抗体的磁珠捕获细胞培养上清提取液中的外泌体，捕获条件4℃震荡过夜。

(4)外泌体捕获后洗涤

外泌体捕获后用PBS洗涤，为了增强去除非特异性捕获物，洗涤液可添加低浓度的吐温，如0.05％Tween-20。

(5)外泌体检测

AP标记的CD63单抗或CD9单抗或CD81单抗添加到稀释液PBS+1％BSA中，37℃反应10-30min，洗涤后加AP的发光底物Lumigen APS 5读取发光值；

(6)外泌体表面CEA检测及验证

首先用偶联CD9/CD63/CD81抗体的磁珠捕获外泌体，然后用AP标记的CEA单抗检测外泌体表面的CEA。进一步地，为了验证检测到的信号是CEA特异性信号，将血清样本或SW403细胞培养上清提取的外泌体梯度稀释，分析稀释倍数与相应发光值关系。此外，将CEA重组蛋白投入到健康个体的血清中，分析体系中AP标记的CEA单抗是否与血清样本中游离CEA蛋白发生交叉反应。

(7)外泌体CEA检测体系构建

以人结肠癌细胞系SW403细胞培养上清提取的外泌体作为标准物质，确定CD9/CD63/CD81捕获抗体最优浓度、CEA检测抗体最优浓度及线性范围，构建外泌体CEA检测体系。

(8)临床样本检测

1)选取术前结直肠癌样本、肠良性疾病样本、正常人样本；用外泌体CEA检测体系检测样本中外泌体CEA含量，分别比较分析患者与良性疾病患者、正常人信号差异，以cutoff值X为阈值，即高于该值作为阳性信号样本、低于该值作为阴性信号样本，ROC曲线分析，计算灵敏度与特异度。同时以市售血清CEA定量试剂盒同时检测上述血清中CEA含量，进行ROC曲线分析，计算灵敏度与特异性。

2)收集结直肠癌术前样本及术后跟踪样本，跟踪3次，用外泌体CEA检测体系评价病程和外泌体CEA表达量的关系。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。此外应理解，在阅读了本发明的构思之后，本领域技术人员对其作出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书限定的范围。

实施例

材料和仪器

磁珠偶联抗CD9、CD63和CD81单克隆抗体(或称CD9/CD63/CD81标记磁珠，也可表示为CD9/CD63/CD81)、AP标记抗CD9、CD63和CD81单克隆抗体(也可表示为AP-CD9/CD63/CD81)、AP标记抗CEA单克隆抗体(也可表示为AP-CEA)、CD63单抗、CEA单抗，皆由上海良润生物医药科技有限公司提供。

其中磁珠的粒径为300nm，为磁微粒悬液，浓度为1mg/mL，磁微粒含羧基活性基团，每毫克(mg)磁微粒羧基含量不低于0.05毫摩尔(mmol)。购自无锡百迈格生物科技有限公司。

作为标准品的CD9/CD63/CD81蛋白冻干粉、作为标准品的CEA重组蛋白冻干粉，上海良润生物医药科技有限公司。

碱性磷酸酶(AP)标记试剂盒，购自Thermo公司。

洗液：洗液含0.01M磷酸盐缓冲液PBS，0.15％Tween20，pH7.4。使用前以纯化水25倍稀释。

化学发光底物液：购自江苏泽成生物有限公司，货号SR2001底物是Lumigen APS5。

其他化学试剂均为分析纯，均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。

为简要起见，实施例中，有时将碱性磷酸酶称为“酶”或者“AP”。

磁力架，购自Corning公司。

化学发光型免疫分析仪，安图生物，型号：LUMO。

实施例1临床血清样本预处理

临床血清样本用采血管收集后，室温静置30min，然后3000rpm、4℃离心10min，取上清液，-80℃保存。新鲜样本或-80℃解冻样本1200g离心30min(4℃)，去沉淀，保留上清液，备测。

实施例2细胞上清外泌体提取

人结肠癌细胞系SW403用无外泌体10％FBS的DMEM培养48h后，收集细胞培养上清。细胞上清处理如下：

1)4℃、300xg离心10min后，弃沉淀；

2)取上清，4℃、2000xg离心10min后，弃沉淀；

3)取上清，4℃、10,000xg离心30min后，弃沉淀；

4)上清用0.22μm滤膜过滤；

5)滤液4℃、100,000xg离心70min后，弃上清；

6)加入0.01M PBS重悬沉淀；

7)悬液4℃、100,000xg离心70min，弃上清；

8)加入适量的0.01M PBS重悬外泌体；

9)采用NTA(纳米颗粒跟踪分析)法对外泌体进行大小鉴定、计数；

10)取一定数目外泌体，BCA(Bicinchoninic acid，二辛可宁酸)法对蛋白进行定量；

11)以外泌体个数及对应蛋白含量为单位分装外泌体；

12)加入蛋白酶抑制剂，-80℃保存，或外泌体以冻干方式-80℃保存。

实施例3表面含CEA蛋白的外泌体验证

从实施例2中SW403细胞培养上清中提取外泌体后，用RIPA裂解液裂解外泌体，BCA法测定蛋白浓度，后加入上样缓冲液，沸水煮5-10min，冷却，12000rpm、4℃离心10min后取上清进行SDS-PAGE电泳，每个泳道上30μg蛋白，后转PVDF膜，用CD63单抗、CEA单抗免疫印迹分析表面含CEA蛋白的外泌体，确认外泌体表面含CEA蛋白，参见图1。

实施例4外泌体检测体系模型构建

1)外泌体检测体系建立

使CD9/CD63/CD81单抗标记磁珠与细胞上清提取的外泌体(Exos)反应，100μl/孔，4℃过夜反应后，用PBS+0.05％Tween-20洗涤四次，后加入AP标记的CD9/CD63/CD81混合抗体悬液，37℃反应30min，洗涤4次后，加发光底物100μl/孔后测量发光值(表1)。

表1.外泌体检测体系发光值

检测体系	CD9/CD63/CD81+AP-CD9/CD63/CD81
		发光值(Exos)	45386
发光值(稀释液PBS)	5634

2)外泌体检测体系验证

将血清或SW403细胞培养上清超速离心，提取外泌体，梯度稀释，用上述检测体系检测外泌体，分析稀释倍数与发光值对应关系，结果显示，血清或SW403细胞培养上清超速离心，提取外泌体，稀释倍数与发光值大小呈较好线性关系(参见图2)。表明该体系能够捕获并检测血清及细胞来源的外泌体。

实施例5外泌体CEA检测体系建立

1)外泌体表面CEA检测及验证

将SW403细胞培养上清超速离心，提取外泌体，梯度稀释，同时将CEA重组蛋白投入到稀释液PBS中作对照。分别加入CD9/CD63/CD81单抗标记磁珠，4℃反应过夜，用PBS+0.05％Tween-20洗涤四次，后加入AP标记的CEA单抗稀释液，浓度为200ng/ml，37℃反应30min，洗涤4次后，加发光底物100μl/孔测量发光值，分析SW403细胞培养上清提取外泌体的稀释倍数与相应发光值关系，结果如图3所示，结直肠癌细胞系SW403分泌的外泌体表面含CEA，即验证了CEA是一个外泌体表面蛋白。

2)外泌体CEA检测体系优化

将CD9/CD63/CD81标记磁珠的体积分别设为2μl、5μl、10μl、20μl，以SW403细胞培养上清提取外泌体作为标准品，以稀释液为样本作为阴性对照，AP标记CEA检测抗体浓度为200ng/ml，比较发光值大小变化，确定CD9/CD63/CD81标记磁珠最优体积。结果显示于表2中，从表2中可以看出，CD9/CD63/CD81标记磁珠的最优体积为10μl。

表2外泌体CEA检测体系磁珠体积最优浓度选择

磁珠体积	2μl	5μl	10μl	20μl	40μl
						发光值(CEA+Exos)	163724	252753	381862	539321	896512
发光值(稀释液PBS)	5621	7548	8763	15832	36156
						阳性/阴性比率(P/N)	29.13	33.49	43.58	34.07	24.8

取CD9/CD63/CD81标记磁珠体积10μl，以SW403细胞培养上清提取外泌体作为标准品，以稀释液为样本作为阴性对照，AP标记CEA检测抗体浓度分别设为100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml，比较发光值大小变化，确定AP标记CEA检测抗体最佳浓度。结果显示于表3中，从表3中可以看出，AP标记CEA抗体的最佳浓度为200ng/ml。

表3外泌体CEA检测体系检测抗体浓度最优浓度选择

AP-CEA浓度	100ng/ml	200ng/ml	400ng/ml
				发光值(CEA+Exos)	246152	359852	526798
发光值(稀释液PBS)	5312	6563	21842
				阳性/阴性比率(P/N)	46.34	54.83	24.12

取CD9/CD63/CD81标记磁珠10μl，AP-CEA检测抗体浓度为200ng/ml，以SW403细胞培养上清提取外泌体为标准品，建立标准曲线，如图4所示。

实施例6外泌体CEA检测体系用于结直肠癌辅助诊断

从北京协和医院收集了术前结直肠癌血清80例、结直肠良性疾病40例、正常人体检人员血清40例，使用本发明外泌体CEA检测体系分别检测结直肠癌、结直肠良性疾病及正常人血清中CEA阳性外泌体水平。同时，采用市售的CEA定量试剂盒(供应商：科华生物，注册证编号：国食药监械械(准)字2008第3400692号)检测对应血清CEA的浓度，结果：正常对照组血清外泌体CEA浓度范围是0.83-10.15ng/ml，均值为4.25ng/ml，结肠良性疾病血清外泌体CEA浓度范围是0.75-11.83ng/ml，均值为5.18ng/ml，肠癌患者血清外泌体CEA浓度范围是0.91-35.02ng/ml，均值为12.62ng/ml；ROC曲线统计结果如图5a所示。正常对照组血清CEA浓度范围是0.97-12.62ng/ml，均值为3.15ng/ml，结肠良性疾病血清CEA浓度范围是0.75-18.55ng/ml，均值为4.12ng/ml，肠癌患者血清CEA浓度范围是0.87-38.43ng/ml，均值为7.85ng/ml；ROC曲线统计结果如图5b所示。

然后根据ROC曲线，统计外泌体CEA的曲线下面积，结果如表4所示。

表4外泌体CEA及血清CEA曲线下面积

结果显示，用于区分结直肠癌与正常人、肠良性疾病的外泌体CEA cutoff值为9ng/ml时，诊断灵敏度为45％，特异性为97.5％；而血清CEA根据cutoff值为5ng/ml，其灵敏度仅为22.5％，特异性为93.5％，远不如血清外泌体CEA在结直肠癌中的诊断准确性。

实施例7外泌体CEA检测体系用于结直肠癌病程监控

从北京协和医院收集了术前结直肠癌血清10例，并在术后对这10例病人进行跟踪随访3次，采集每次跟踪血清，使用本发明外泌体CEA检测体系分别检测术前及术后病人血清中CEA阳性外泌体水平。同时，采用市售CEA定量试剂盒(供应商：科华生物，注册证编号：国食药监械械(准)字2008第3400692号)检测对应血清CEA的浓度。结果见表5、6，传统血清CEA作为病程监控的符合率为50％，但外泌体CEA的符合率达到了80％，说明外泌体CEA较传统血清CEA能够更准确反映疾病病程发展情况。

表5外泌体CEA检测体系用于结直肠癌病程监控

表6血清CEA检测体系用于结直肠癌病程监控

实验结果表明，本发明的外泌体检测试剂盒可用于精确测定血清中的外泌体及其表面蛋白CEA的含量，其中外泌体CEA的检测具有比现有血清CEA定量检测技术更高的灵敏度和特异性，可为肠癌的早期鉴别诊断、病程监控提供有效的参考。

Claims (10)

1.一种检测外泌体的方法，包括如下步骤：

A.采集含有外泌体的生物样本，去除细胞，得到外泌体分析液；对外泌体进行大小鉴定、计数；取一定数量的外泌体，进行蛋白定量。

B.用外泌体检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体含量，所述外泌体检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体，CD9和/或CD63和/或CD81标准品，化学发光底物液；

C.采用外泌体CEA检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体CEA含量，确定外泌体CEA阴性和外泌体CEA阳性的判断标准，所述外泌体CEA检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗癌胚抗原CEA单克隆抗体，CEA蛋白标准品，化学发光底物液；

D.基于步骤C的检测结果，将上述外泌体分析液中的外泌体区分为表面不包含CEA蛋白的外泌体CEA阴性亚群和表面包含CEA蛋白的外泌体CEA阳性亚群，并且计算外泌体CEA阴性亚群和外泌体CEA阳性亚群的比例；

E.基于步骤A至D的检测结果，建立生物样本的外泌体分布模型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B和/或步骤C中，所述酶选自辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP、磷酸酯酶或荧光素酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤C中，将CEA重组蛋白加入到CEA阴性生物样本中，验证外泌体CEA检测体系中的抗CEA单克隆抗体仅与游离CEA重组蛋白发生交叉反应、但不与阴性生物样本中其他蛋白发生交叉反应。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B和/或步骤D中，采用磁性微粒捕获外泌体后，采用添加有低浓度吐温的洗涤液洗涤磁性微粒，以便去除非特异性捕获物。

5.一种用于检测外泌体的试剂盒，其包括权利要求1中所述的外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系中用于捕获外泌体的捕获抗体是单克隆抗体或多克隆抗体，选自下组：抗CD9抗体，抗CD63抗体，抗CD81抗体；抗CD9和CD63抗体，抗CD9和CD81抗体，抗CD63和CD81抗体；抗CD9、CD63和CD81抗体，

相对应地，外泌体检测体系中酶标记的抗体是单克隆抗体，选自下组：抗CD9单克隆抗体，抗CD63单克隆抗体，抗CD81单克隆抗体；抗CD9和CD63单克隆抗体，抗CD9和CD81单克隆抗体，抗CD63和CD81单克隆抗体；抗CD9、CD63和CD81单克隆抗体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，当捕获抗体和酶标记的抗体是混合物时，两种以上抗体之间的摩尔比为1：1。

8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微粒的粒径是0.1-10微米。

9.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶是碱性磷酸酶。

10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，用于测定血清中的外泌体CEA。