CN114859055A - 特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒及其使用方法，该试剂盒用于预测肿瘤免疫治疗疗效，包括磁分离单元和ELISA检测单元；磁分离单元用于处理从样品中分离出的总细胞外囊泡，包括用于封闭总细胞外囊泡上非特异性吸附位点的牛血清白蛋白封闭液，用于捕获总细胞外囊泡中所有非肿瘤来源细胞外囊泡的生物素修饰的捕获抗体，用于捕获生物素化细胞外囊泡的链霉亲和素修饰的磁珠以及用于吸附捕获了生物素化细胞外囊泡的链霉亲和素修饰的磁珠的磁力装置；ELISA检测单元用于检测未被磁力装置吸附的细胞外囊泡上的PD‑L1水平。该试剂盒能消除非肿瘤来源细胞外囊泡上PD‑L1的影响，准确检测出肿瘤细胞来源细胞外囊泡的PD‑L1水平，提高免疫治疗疗效预测准确度。

Description

特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物技术领域，涉及一种特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
近年来新兴的免疫治疗为恶性肿瘤患者带来了希望。尽管免疫治疗疗效显著，但其响应率仅为10％-30％，导致大量患者无法从免疫治疗中获益，部分免疫治疗无响应的患者，甚至还会出现免疫治疗导致的疾病快速进展。与传统治疗方法(手术、放疗及化疗等)直接作用于肿瘤细胞不同，免疫治疗通过重新激活患者自身的抗肿瘤免疫，“间接”作用于肿瘤细胞，因此免疫治疗起效较慢，往往需要治疗数月后才进行疗效评估，这无疑会导致大量对免疫治疗无响应的患者错失选择其他治疗方案的时机。因此，在免疫治疗开始前或治疗的早期阶段预测患者是否对免疫治疗响应，是当前免疫治疗领域急需解决的难题。
细胞外囊泡(Extracellularvesicles,EVs)是细胞分泌的膜性结构的总称，携带丰富的生物活性分子(如蛋白质、核酸等)，并可通过自分泌或旁分泌途径参与对局部或远处细胞的功能调控，在包括肿瘤发生和发展在内的多种生理和病理过程中均发挥关键作用。由于细胞外囊泡高度继承母细胞表面标志分子，并携带大量来自母细胞的生物信息分子，检测细胞外囊泡有望反应母细胞的功能和状态。因此，广泛存在于血清、唾液以及尿液等体液中的细胞外囊泡，在疾病早期诊断和疗效预测方面受到了广泛关注。
多数肿瘤细胞表面表达细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death1ligand 1，PD-L1)，并可以与T细胞表面的PD-1结合，抑制免疫细胞的功能，从而发挥免疫逃逸的功能。更重要的是，肿瘤细胞可分泌携带PD-L1的细胞外囊泡进入患者的体液中(如外周血)或组织，且患者外周血细胞外囊泡中PD-L1水平与肿瘤进展密切相关，可用于预测免疫治疗疗效。尽管基于细胞外囊泡的PD-L1水平预测免疫治疗疗效已经取得了一定的进展，但其特异性和敏感性仍有待提高。最新的研究显示，除肿瘤细胞外，多种表达PD-L1的非肿瘤细胞(如免疫细胞、内皮细胞等)，也可分泌大量携带PD-L1的细胞外囊泡。因此，患者体内PD-L1阳性的细胞外囊泡是由肿瘤细胞和非肿瘤细胞分泌的混合囊泡，即总细胞外囊泡。显然，非肿瘤细胞分泌的PD-L1阳性细胞微囊泡，将会对检测肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1水平带来极大的干扰，可能是引起基于细胞外囊泡的PD-L1液体活检特异性和敏感性不高的重要原因。事实上，最新的研究利用流式细胞术检测已经证实，只有肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡上的PD-L1可用于预测免疫治疗的疗效。因此，检测肿瘤细胞来源细胞外囊泡PD-L1水平有望进一步提高预测免疫治疗疗效的特异性和敏感性。
当前检测的细胞外囊泡PD-L1的水平主要为ELISA，其采用“双抗夹心”的策略，利用抗PD-L1抗体捕获和检测细胞外囊泡上PD-L1水平。显然，现有策略无法区分PD-L1阳性细胞外囊泡的细胞来源。尽管流式细胞仪可检测PD-L1阳性细胞外囊泡的细胞来源，但其无法对PD-L1水平进行准确定量，用于临床预测的可行性一般。因此，研发一种检测体液或组织中肿瘤细胞来源细胞外囊泡PD-L1水平的试剂盒是非常有必要的。
发明内容
针对样品中同时存在多种细胞来源的PD-L1阳性细胞外囊泡，影响免疫治疗疗效预测效果的问题，本发明提供一种特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒及其使用方法，该试剂盒能准确检测肿瘤细胞来源细胞外囊泡PD-L1水平，从而准确预测肿瘤免疫治疗疗效。
本发明提供的技术方案具体如下：
本发明一方面提供特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒，用于预测肿瘤免疫治疗疗效，包括磁分离单元和ELISA检测单元；
磁分离单元用于处理从样品中分离出的总细胞外囊泡，包括：
牛血清白蛋白封闭液，其用于封闭总细胞外囊泡上的非特异性吸附位点；
生物素修饰的捕获抗体，其用于捕获总细胞外囊泡中所有非肿瘤来源细胞外囊泡，使其形成生物素化细胞外囊泡；捕获抗体包括抗CD3抗体、抗CD235a抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD11b抗体、抗CD14抗体、抗CD31抗体、抗CD41抗体、抗CD45抗体和抗CD144抗体；
链霉亲和素修饰的磁珠，其用于捕获生物素化细胞外囊泡；以及
磁力装置，其用于吸附捕获了生物素化细胞外囊泡的链霉亲和素修饰的磁珠；
ELISA检测单元用于检测未被磁力装置吸附的细胞外囊泡上的PD-L1水平。
差速离心是分离细胞外囊泡最常用的方法。该方法先通过低速离心去除细胞和较大的颗粒，然后通过超速离心分离出细胞外囊泡。显然，差速离心得到的细胞外囊泡，是多种细胞来源细胞外囊泡的混合物，无法得到特定亚型的细胞外囊泡。本发明通过上述试剂盒中的磁分离单元将非肿瘤来源细胞外囊泡吸附走，仅留下肿瘤来源细胞外囊泡，然后采用ELISA检测单元检测肿瘤来源细胞外囊泡的PD-L1水平，能准确预测肿瘤免疫治疗疗效。
本发明另一个方面提供上述特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
采用牛血清白蛋白封闭液封闭总细胞外囊泡上的非特异性吸附位点；
用生物素修饰的捕获抗体捕获总细胞外囊泡中所有非肿瘤来源细胞外囊泡，使其形成生物素化细胞外囊泡；
利用磁场将链霉亲和素修饰的磁珠捕获的生物素化细胞外囊泡吸附于容器壁上，并将总细胞外囊泡其余部分转移至另一容器；
对总细胞外囊泡其余部分的PD-L1水平进行ELISA检测。
该试剂盒的使用从根本上解决了传统ELISA“双抗夹心”策略无法准确检测出肿瘤来源细胞外囊泡上PD-L1水平的现状，为预测肿瘤免疫治疗疗效提供了新的技术手段。
本发明再一个方面提供特定亚型细胞外囊泡的分离方法，该分离方法利用免疫吸附技术的分离方法去除体液或组织中非目标亚型细胞外囊泡，得到只含有目标亚型细胞外囊泡的样品，然后利用超速离心法收集目标亚型细胞外囊泡。
该分离方法以非接触的方式从复杂体液中无损分离出特定亚型细胞外囊泡，分离出的特定亚型细胞外囊泡不带有任何抗体和磁球等成分，完整保留了细胞外囊泡的物理、化学和生物学特征，真正做到“无损分离”；该分离方法操作简便，耗时短，无需特殊设备。
附图说明
图1为利用本发明提供的特定亚型细胞外囊泡的分离方法从正常人外周血中分离获得的内皮细胞来源细胞外囊泡的粒径分布(a)及CD144+细胞外囊泡比例(b)。
图2为利用本发明提供的特定亚型细胞外囊泡的分离方法从头颈部鳞癌患者外周血中分离获得的肿瘤来源细胞外囊泡的粒径分布(a)及EpCAM+细胞外囊泡比例(b)。
图3为根据标准品结果绘制标准曲线(a)，PD-L1敲除的肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡样本和从肿瘤患者外周血中分离得到的肿瘤来源细胞外囊泡亚型中PD-L1水平(b)。
图4为westernblot进行验证经过本发明提供的特定亚型细胞外囊泡的分离方法分离之前和之后，细胞外囊泡样品中肿瘤标志物EpCAM+和免疫细胞等非肿瘤细胞标志物水平变化情况。
图5为PD-L1敲除的肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡样本和从肿瘤组织中分离得到的肿瘤来源细胞外囊泡亚型中PD-L1水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步描述，该描述只是为了更好地说明本发明的技术方案而不是对权利要求进行限制。本发明并不限于这里所描述的特殊实施例和实施方案。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，都落入本发明的保护范围。
研究证实，外周血中细胞外囊泡来自血小板、内皮细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞等正常细胞，以及疾病状态(包括但不限于良性及恶性肿瘤、心血管疾病、内分泌系统疾病、免疫相关疾病、胃肠道疾病、创伤等)下的细胞(如肿瘤细胞)。基于不同细胞来源的细胞外囊泡均携带与母细胞相同的表面标志分子，为了得到特定亚型的细胞外囊泡，研究人员提出了基于免疫吸附技术的分离方法。免疫吸附法的原理是目标细胞外囊泡表面携带的特定抗原分子(如PD-L1)，而磁珠表面修饰着与该抗原对应的抗体，目标细胞外囊泡与磁珠借助抗原和抗体特之间异性结合形成磁珠偶联的细胞外囊泡。磁珠偶联的目标细胞外囊泡在磁场作用下可从体液中分离出来。该方法的缺点是：分离之后的目标细胞外囊泡上带有捕获抗体和磁球，将严重影响目标细胞外囊泡的物理性能(尺寸、表面电荷、生物标志物)，不利于下游的蛋白检测，并影响细胞外囊泡功能研究。例如，目标细胞外囊泡表面的标志物分子被抗体和磁球等封闭或占据，再加上抗体和磁球等带来的空间位阻等原因，导致细胞外囊泡上待测抗原分子无法被ELISA法检出。
本发明提供一种特定亚型细胞外囊泡的分离方法、基于该分离方法的预测肿瘤免疫治疗疗效的试剂盒及其使用方法，该分离方法利用免疫吸附技术去除样品中目标亚型细胞外囊泡以外的所有细胞外囊泡，从而无损分离出特定亚型细胞外囊泡，即利用抗体偶联的磁球与细胞外囊泡特异性结合，并去掉目的亚群之外的细胞外囊泡，最后再利用超速离心法收集目标细胞外囊泡。该分离方法中分离试剂无需与目标亚型细胞外囊泡直接接触，避免了现有免疫吸附技术对目标细胞外囊泡理化性能、以及特定蛋白后期检测的影响，在保证目标细胞外囊泡纯度的同时，最大限度地保持了其理化性能，为后续分子检测和研究提供了保证。该试剂盒基于上述分离方法设置磁分离单元，将肿瘤来源的细胞外囊泡从总细胞囊泡中分离出来。
进一步地，该试剂盒采用ELISA检测单元检测纯净特定亚型细胞外囊泡上的PD-L1水平，以预测免疫治疗疗效。
在一些实施方案中，样品为体液或组织，体液包括但不限于不限于血液、唾液、尿液、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、汗液、精液、淋巴液中的一种或多种；体液来源包括但不局限于人、猴、小鼠、大鼠、兔、猪、猴、狗等动物；样品也可为细胞培养上清液。
本发明以血液和肿瘤组织来源的细胞外囊泡为实验对象展示该分离方法。根据不同的需求，该分离方法还可以用于其他的体液或组织中特定细胞外囊泡的分离。
在一些实施方案中，本发明以分离血液中内皮细胞来源的细胞外囊泡(CD144阳性)和上皮源性恶性肿瘤来源的细胞囊泡(EpCAM阳性)为例，展示本发明的分离方法。本领域技术人员可根据不同的体液以及需分离的细胞外囊泡的种类不同，对捕获抗体种类进行调整和更换，即可实现其他亚型细胞外囊泡的分离。
本发明提供用于预测肿瘤免疫治疗疗效的特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒，包括磁分离单元和ELISA检测单元；
磁分离单元用于处理从样品中分离出的总细胞外囊泡，包括：
牛血清白蛋白封闭液，其用于封闭总细胞外囊泡上的非特异性吸附位点；
生物素修饰的捕获抗体，其用于捕获总细胞外囊泡中所有非肿瘤来源细胞外囊泡，使其形成生物素化细胞外囊泡；捕获抗体包括抗CD3抗体、抗CD235a抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD11b抗体、抗CD14抗体、抗CD31抗体、抗CD41抗体、抗CD45抗体和抗CD144抗体；
链霉亲和素修饰的磁珠，其用于捕获生物素化细胞外囊泡；以及
磁力装置，其用于吸附捕获了生物素化细胞外囊泡的链霉亲和素修饰的磁珠；
ELISA检测单元用于检测未被磁力装置吸附的细胞外囊泡上的PD-L1水平。
本发明提供的该试剂盒从根本上改变了现在的ELISA技术只能检测总细胞外囊泡PD-L1水平，而无法区分其细胞来源的现状。
生物素修饰的捕获抗体包括生物素偶联的抗CD3抗体、生物素偶联的抗CD235a抗体、生物素偶联的抗CD4抗体、生物素偶联的抗CD8抗体、生物素偶联的抗CD11b抗体、生物素偶联的抗CD31抗体、生物素偶联的抗CD41抗体和生物素偶联的抗CD45抗体。牛血清白蛋白封闭液含有1％-20％的牛血清白蛋白。检测抗体为抗CD144抗体和抗EpCAM抗体(验证负向分离的效率)、以及抗PD-L1抗体(ELISA检测分离所得的肿瘤细胞来源细胞外囊泡的PD-L1水平)。
在一个实施方案中，链霉亲和素修饰的磁珠的直径为30-100nm或1-5μm，磁珠为四氧化三铁超顺磁纳米颗粒。
在一个实施方案中，样品为血液、唾液、尿液、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、汗液、精液、淋巴液、细胞培养上清液中的一种或多种。
在一个实施方案中，ELISA检测单元包括PD-L1捕获抗体、多个浓度梯度的标准蛋白溶液、酶标抗体、显色液。
在一个实施方案中，酶标抗体包括PD-L1检测抗体和辣根过氧化物酶偶联显色抗体；显色液包括A液和B液，A液按质量百分数计包括醋酸钠2.72％、柠檬酸0.32％、双氧水0.02％，余量为蒸馏水；B液按质量百分数计包括乙二胺四乙酸二钠0.04％、柠檬酸0.19％、甘油9％、3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.03％，余量为蒸馏水。
在一个实施方案中，ELISA检测单元包括ELISA酶标板、封板膜、标准蛋白、标准蛋白稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体A、酶标抗体B、显色剂A液、显色剂B液和终止液等。ELISA酶标板为按1-5μg/mL浓度提前包被好抗PD-L1捕获抗体的酶标板；标准蛋白为构建的PD-L1纯化蛋白。标准蛋白为PD-L1纯化蛋白。PD-L1捕获抗体为Millipore公司的抗PD-L1抗体(5H1-A3)，货号MABC1115。酶标抗体A为1μg/mLPD-L1检测抗体(eBioscience公司的抗PD-L1抗体(克隆号：MIH1)，货号13-5983-82)，酶标抗体B为1μg/mL辣根过氧化物酶耦联显色抗体；显色剂A液按质量百分数计包括醋酸钠2.72％、柠檬酸0.32％、双氧水0.02％，余量为蒸馏水；显色剂B液按质量百分数计包括乙二胺四乙酸二钠0.04％、柠檬酸0.19％、甘油9％、3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.03％，余量为蒸馏水；终止液为2mol/L稀硫酸。
本发明中的“试剂盒”不限于试剂盒的固有形式，可以表现为微芯片、微检测系统或者依赖于各种载体的检测系统，以及包括前述检测系统的统一包装形式，如微孔板系统、纸质载体、玻璃载体、尼龙膜载体，塑料载体、硅胶载体、凝胶载体、膜质载体等。
本发明另一个方面提供上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
采用牛血清白蛋白封闭液封闭总细胞外囊泡上的非特异性吸附位点；
用生物素修饰的捕获抗体捕获总细胞外囊泡中所有非肿瘤来源细胞外囊泡，使其形成生物素化细胞外囊泡；
利用磁场将链霉亲和素修饰的磁珠捕获的生物素化细胞外囊泡吸附于容器壁上，并将总细胞外囊泡其余部分转移至另一容器；
对总细胞外囊泡其余部分的PD-L1水平进行ELISA检测。
在一个实施方案中，采用牛血清白蛋白封闭液封闭总细胞外囊泡上的非特异性吸附位点时，将牛血清白蛋白封闭液加入所述总细胞外囊泡中，使牛血清白蛋白封闭液终浓度不小于1％，充分混合后于37℃孵育至少1h。
在一个实施方案中，用生物素修饰的捕获抗体捕获所有非肿瘤来源的细胞外囊泡时，加入相对非肿瘤来源细胞外囊泡过量的生物素修饰的捕获抗体，于4℃孵育至少1h。
在一个实施方案中，用生物素修饰的捕获抗体捕获总细胞外囊泡中所有非肿瘤来源细胞外囊泡时，加入相对生物素过量的链霉亲和素修饰的磁珠，室温孵育至少20min。
具体地，试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)体液收集：根据不同他需求，收集对应的体液，并对体液进行初步离心，去除细胞、细胞碎片和较大的颗粒。针对不同体液采用不同的离心条件：针对唾液和其他粘稠体液的方法，离心力2600g，离心温度4℃，离心时间15min，收集上清液，共离心两次；针对血液的离心方法，离心力1550g，离心温度4℃，离心时间20min，收集上清液，共离心两次；针对尿液等相对清亮体液的离心方法，离心力1550g，离心温度4℃，离心时间15min，取上清液，共离心两次。
(2)将牛血清白蛋白封闭液加入步骤(1)获得的上清液中，使牛血清白蛋白封闭液终浓度为0.5wt％-1wt％，充分混合后于37℃孵育1h。
(3)将捕获抗体加入步骤(2)获得的孵育液中，充分混合，于4℃孵育1h，利用抗原抗体特异性结合原理，将非目标亚型细胞外囊泡标记上生物素修饰的捕获抗体。
(4)向步骤(3)处理后的液体中加入过量的链霉亲和素修饰的磁珠，混合均匀后于摇床上室温孵育30min，利用链霉亲和素和生物素之间特异性结合的原理，使链霉亲和素修饰的磁珠标记非目标亚型细胞外囊泡。
(5)将步骤(4)处理后的液体置于永磁铁的磁场中，静置10-15min，利用磁场将磁性纳米颗粒吸附于容器壁上，并将液体转移至新的容器中。
(6)将获得的液体转移至超速离心管中，在4℃、100000g条件下离心70min，去除上清液，并以20μLPBS重悬沉淀获得细胞外囊泡沉淀，即目标细胞外囊泡。
(7)在室温条件下平衡后取出ELISA酶标板，在ELISA酶标板上设置标准品孔和样本孔，标准品孔加入不同浓度梯度的标准蛋白，样本孔中加入目标细胞外囊泡，37℃培养1h。
(8)弃去孔内液体，注入洗涤液，反复洗涤多次，倒置于吸水纸上拍干。
(9)在ELISA酶标板孔加入100μL预先混合好的酶标抗体A液、酶标抗体B液，用封板膜封住酶标板孔，37℃孵育1h。
(10)弃去孔内液体，注入洗涤液，反复洗涤多次，倒置于吸水纸上拍干。
(11)将显色剂A液、显色剂B液按体积比为1:1混合，每孔加入100μL，室温避光显色。
(12)观察标准品孔10-30min内出现颜色梯度改变后加入50μL终止液终止显色，轻轻摇动至孔内终止完全，15min内分别在450nm和570nm波长处测定各孔OD值，计算450nm处OD值减去570nm处OD值即为样品的最终OD值，并计算目标细胞外囊泡浓度。
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的解释说明。
实施例1：从外周血中分离内皮细胞来源细胞外囊泡
(1)外周血的采集：采集人静脉血4mL，1550g条件下离心15min(4℃)，去除细胞和碎片收集上层血浆，同样条件下离心15min，收集上层血浆1.5-2mL。将样品置于超速离心机中，在4℃，100000g条件下离心70min，弃上清液，并以20μLPBS重悬沉淀获得细胞外囊泡沉淀(总细胞外囊泡)。
(2)将牛血清白蛋白封闭液加入步骤(1)中获得的细胞外囊泡沉淀中，使牛血清白蛋白终浓度为1％，充分混合后于37℃孵育1h，得到孵育液A。
(3)将生物素偶联的抗CD3抗体、生物素偶联的抗CD235a抗体(红细胞)、生物素偶联的抗CD4抗体(CD4 T细胞)、生物素偶联的抗CD8抗体(CD8 T细胞)、生物素偶联的抗CD11b抗体(巨噬细胞)、生物素偶联的抗CD31抗体(血小板)、生物素偶联的抗CD41抗体(血小板)、生物素偶联的抗CD45抗体(白细胞)、生物素偶联的抗CD14抗体(巨噬细胞)各取10μL加入步骤(2)得到的孵育液A中，充分混匀，于4℃孵育1h，得到孵育液B。
(4)向步骤(3)得到的孵育液B中加入过量的链霉亲和素修饰的磁珠(20μL，链霉亲和素浓度10mg/mL)，混合均匀后于摇床上室温孵育30min，得到孵育液C。
(5)将步骤(4)得到的孵育液C置于外磁力架中静置10-15min，利用外加磁场的作用将链霉亲和素修饰的磁珠吸附于管侧壁上。
(6)小心将上清液转移至新的离心管中，重复步骤(5)中的操作，最后将上清液转移至新的容器中。
内皮细胞来源细胞外囊泡鉴定：取1μL步骤(6)得到的上清液，稀释至1mL，纳米粒子跟踪分析(Nanoparticletrackinganalysis,NTA)检测结果显示细胞外囊泡平均粒径均为100nm左右(图1a)。
取1μL步骤(6)得到的上清液作为实验组，并取1μL步骤(1)得到的细胞外囊泡沉淀作为对照组，分别稀释至20μL，加入1μL抗CD144抗体，于4℃孵育1h后，100000g条件下离心70min，弃上清液，并以20μLPBS重悬沉淀获得细胞外囊泡沉淀。加入1μL抗CD144抗体对应的荧光二抗，充分混合，于4℃孵育1h。最后利用纳米流式细胞仪检测胞外囊泡CD144阳性率。结果如图1b所示，本发明提供的分离方法分离所得的细胞外囊泡，其CD144阳性率92％，明显高于对照组(16％)。提示可以用该分离方法从人外周血中无损分离内皮细胞来源细胞外囊泡。
实施例2：从头颈部鳞癌患者的外周血中提取肿瘤来源的细胞外囊泡，并检测其PD-L1水平
按以下步骤分离肿瘤来源的细胞外囊泡亚型：
(1)外周血中总细胞外囊泡的采集：采集头颈部鳞癌患者静脉血4mL，1550g条件下离心15min(4℃)，去除细胞和碎片收集上层血浆，同样条件下离心15min，收集上层血浆1.5-2mL。将样品置于超速离心机中，在4℃、100000g条件下离心70min，弃上清液，并以20μLPBS重悬沉淀获得细胞外囊泡沉淀，即总细胞外囊泡。
(2)将牛血清白蛋白封闭液加入步骤(1)中获得的总细胞外囊泡中，使牛血清白蛋白终浓度为1wt％，充分混合后于37℃孵育1h，得到孵育液A。
(3)将生物素偶联的抗CD3抗体、生物素偶联的抗CD235a抗体(红细胞)、生物素偶联的抗CD4抗体(CD4 T细胞)、生物素偶联的抗CD8抗体(CD8 T细胞)、生物素偶联的抗CD11b抗体(巨噬细胞)、生物素偶联的抗CD31抗体(血小板)、生物素偶联的抗CD41抗体(血小板)、生物素偶联的抗CD45抗体(白细胞)、生物素偶联的抗CD14抗体(巨噬细胞)、生物素偶联的抗CD144抗体(内皮细胞)各取10μL加入步骤(2)得到的孵育液A中，充分混匀，于4℃孵育1h，得到孵育液B。
(4)向步骤(3)得到的孵育液B中加入过量的链霉亲和素修饰的磁珠(20μL，链霉亲和素浓度10mg/mL)，混合均匀后于摇床上室温孵育30min，得到孵育液C。
(5)将步骤(4)得到的孵育液C置于外磁力架中静置10-15min，利用外加磁场的作用将磁珠吸附于管侧壁上。
(6)小心将上清液转移至新的离心管中，重复步骤(5)中的操作，最后将上清液转移至新的容器中。
肿瘤细胞来源细胞外囊泡的鉴定：
取1μL步骤(6)转移至新容器中的上清液稀释至1mL，NTA检测结果显示，细胞外囊泡平均粒径均为100nm左右(图2a)。
取1μL步骤(6)得到的上清液作为实验组，并取1μL步骤(1)得到的细胞外囊泡沉淀作为对照组，分别稀释至20μL，加入1μL抗EpCAM抗体，于4℃孵育1h后，100000g条件下离心70min，去除上清液，并以20μLPBS重悬沉淀获得细胞外囊泡沉淀。加入1μL抗EpCAM抗体对应的荧光二抗，充分混合，于4℃孵育1h。最后利用纳米流式细胞仪检测细胞外囊泡中EpCAM阳性率。结果如图2b所示，本发明提供的分离方法分离所得的细胞外囊泡，其EpCAM阳性率超过85％，明显高于对照组(6.2％)。表明本发明提供的试剂盒可用于肿瘤患者外周血中肿瘤来源细胞外囊泡的无损分离。
实施例3：肿瘤来源细胞外囊泡中PD-L1水平的检测：
(1)取20μL实施例2步骤(6)所得的上清液，加入已预先铺好PD-L1捕获抗体的酶标板样本孔；将标准蛋白设置16ng/mL、12ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0ng/mL共8个浓度梯度，加入标准品孔；封口膜封闭孔板，放入37℃温箱孵育1h。
(2)操作步骤(1)的同时将酶标抗体A液、B液按照1:1混合，放入37℃温箱孵育1h。
(3)吸净孔内反应液，注入洗涤液300μL，轻摇2min后吸干孔内液体，重复洗涤4次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干；加入100μL步骤(2)的酶标抗体混合液，放入37℃温箱孵育1h。
(4)吸净孔内反应液，注入洗涤液300μL，轻摇2min后吸干孔内液体，重复洗涤5次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干；将显色液A液、B液按1:1混合，每孔加入100μL，避光显色。
(5)观察标准品孔10-30min内出现颜色梯度改变后加入50μL终止液终止显色反应，轻轻摇动至孔内终止完全，15min内于酶联免疫检测仪450nm和570nm波长处测定各孔OD值，计算450nm处OD值减去570nm处OD值即为样品的最终OD值，并计算细胞外囊泡上PD-L1水平。
(6)根据标准品结果绘制标准曲线(图3a)，计算各细胞外囊泡样品PD-L1浓度，以PD-L1敲除的肿瘤细胞作为阴性对照组。结果显示：PD-L1敲除的肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡样本均几乎检测不到PD-L1，而从肿瘤患者外周血中分离得到的肿瘤来源细胞外囊泡亚型中可检测到PD-L1(图3b)，可用于定量检测肿瘤患者外周血中肿瘤来源细胞外囊泡中的PD-L1水平。
实施例4：从肿瘤组织中分离肿瘤来源细胞外囊泡，并检测其PD-L1水平
按以下步骤分离肿瘤来源的细胞外囊亚型：
(1)采集头颈部鳞癌患者肿瘤组织，去除肿瘤组织表面残余的血液，并使用器械将肿瘤组织切割成细小的组织碎片。将分离得到的肿瘤组织碎片与含有1mg/mL的胶原酶IV，0.1mg/mL的DNA酶的1640培养基在37℃的条件下震荡孵育1h，500g条件下离心10min(4℃)，去除肿瘤组织中未分离的残余组织和细胞成分；将剩余的上清液进一步离心(2000g,20min，4℃；10000g,40min，4℃)以去除上清液中残余的细胞碎片。将经初步离心得到上清液进行超离(12000g,70min,4℃；Beckman Coulter Optima MAX-XP,mLA-130)，并使用商用PBS对超离后得到的肿瘤组织细胞外囊泡进行重悬。
(2)将磁球在涡轮机上震荡混匀1min，取出部分磁球于离心管中，使用磁球分离缓冲液在磁力架的作用下对其清洗三次，并使用5％BSA对磁球的表面进行封闭(4℃，1h)。封闭后重复清洗磁球三次，并使用一定体积的分离缓冲液(含0.1％BSA的PBS)对磁球进行重悬。将捕获抗体抗CD45抗体，抗CD3抗体(免疫细胞)，抗CD235a抗体(红细胞)，抗CD41抗体(血小板)，抗CD144抗体(内皮细胞)，抗CD11b抗体(髓系细胞)加入磁球重悬液反应(37℃，1h)，使得捕获抗体充分与磁球偶联。将孵育了抗体的磁球在磁力架作用下通过分离缓冲液清洗3次用以去除游离的抗体。
(3)将偶联了抗体的磁球与步骤一中得到的肿瘤组织来源的细胞外囊泡过夜孵育(4℃)，在磁力架的作用下使得磁球上的非肿瘤来源的细胞外囊泡与上清液分离，得到肿瘤组织中肿瘤来源的细胞外囊泡，利用westernblot进行验证(图4)，结果显示经过负向分离后，细胞外囊泡样品中肿瘤标志物EpCAM水平无明显变化，而免疫细胞等非肿瘤细胞标志物水平则显著降低，表明分离单元可用于肿瘤组织中肿瘤来源细胞外囊泡的无损分离。
实施例5：按以下步骤检测肿瘤来源的细胞外囊泡中PD-L1水平：
(1)取20μL实施例4步骤(6)所得的上清液，加入已预先铺好PD-L1捕获抗体的酶标板样本孔；将标准蛋白设置16ng/mL、12ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0ng/mL共8个浓度梯度，加入标准品孔；封口膜封闭孔板，放入37℃温箱孵育1h。
(2)操作步骤(1)的同时将酶标抗体A液、B液按照1:1混合，放入37℃温箱孵育1h。
(3)吸净孔内反应液，注入洗涤液300μL，轻摇2min后吸干孔内液体，重复洗涤4次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干；加入100μL步骤3的酶标抗体混合液，放入37℃温箱孵育1h。
(4)吸净孔内反应液，注入洗涤液300μL，轻摇2min后吸干孔内液体，重复洗涤5次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干；将显色液A液、B液按1:1混合，每孔加入100μL，避光显色。
(5)观察标准品孔10-30min内出现颜色梯度改变后加入50μL终止液终止显色反应，轻轻摇动至孔内终止完全，15min内于酶联免疫检测仪450nm和570nm波长处测定各孔OD值，计算450nm处OD值减去570nm处OD值即为样品的最终OD值，并计算待测样本浓度。
(6)根据标准品结果绘制标准曲线，计算细胞外囊泡样品PD-L1浓度，以PD-L1敲除的肿瘤细胞作为阴性对照组。结果显示：PD-L1敲除的肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡样本均几乎检测不到PD-L1，而从肿瘤组织中分离得到的肿瘤来源细胞外囊泡亚型中可检测到PD-L1(图5)，表明检测单元可用于检测肿瘤患者肿瘤组中肿瘤来源细胞外囊泡中的PD-L1水平。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒，用于预测肿瘤免疫治疗疗效，其特征在于，包括磁分离单元和ELISA检测单元；
所述磁分离单元用于处理从样品中分离出的总细胞外囊泡，包括：
牛血清白蛋白封闭液，其用于封闭总细胞外囊泡上的非特异性吸附位点；
生物素修饰的捕获抗体，其用于捕获总细胞外囊泡中所有非肿瘤来源细胞外囊泡，使其形成生物素化细胞外囊泡；所述捕获抗体包括抗CD3抗体、抗CD235a抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD11b抗体、抗CD14抗体、抗CD31抗体、抗CD41抗体、抗CD45抗体和抗CD144抗体；
链霉亲和素修饰的磁珠，其用于捕获所述生物素化细胞外囊泡；以及
磁力装置，其用于吸附捕获了所述生物素化细胞外囊泡的所述链霉亲和素修饰的磁珠；
所述ELISA检测单元用于检测未被磁力装置吸附的细胞外囊泡上的PD-L1水平。
2.根据权利要求1所述的特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒，其特征在于：所述链霉亲和素修饰的磁珠的直径为30-100nm或1-5μm。
3.根据权利要求1所述的特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒，其特征在于：所述样品为血液、唾液、尿液、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、汗液、精液、淋巴液、细胞培养上清液中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒，其特征在于：所述ELISA检测单元包括PD-L1捕获抗体、多个浓度梯度的标准蛋白溶液、酶标抗体、显色液。
5.根据权利要求4所述的特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体包括PD-L1检测抗体和辣根过氧化物酶偶联显色抗体；所述显色液包括A液和B液，所述A液按质量百分数计包括醋酸钠2.72％、柠檬酸0.32％、双氧水0.02％，余量为蒸馏水；所述B液按质量百分数计包括乙二胺四乙酸二钠0.04％、柠檬酸0.19％、甘油9％、3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.03％，余量为蒸馏水。
6.权利要求1所述的特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用牛血清白蛋白封闭液封闭总细胞外囊泡上的非特异性吸附位点；
用生物素修饰的捕获抗体捕获总细胞外囊泡中所有非肿瘤来源细胞外囊泡，使其形成生物素化细胞外囊泡；
利用磁场将链霉亲和素修饰的磁珠捕获的生物素化细胞外囊泡吸附于容器壁上，并将总细胞外囊泡其余部分转移至另一容器；
对总细胞外囊泡其余部分的PD-L1水平进行ELISA检测。
7.根据权利要求6所述的特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒的使用方法，其特征在于：采用牛血清白蛋白封闭液封闭细胞外囊泡上的非特异性吸附位点时，将所述牛血清白蛋白封闭液加入所述总细胞外囊泡中，使牛血清白蛋白封闭液终浓度不小于1％，充分混合后于37℃孵育至少1h。
8.根据权利要求6所述的特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒的使用方法，其特征在于：用生物素修饰的捕获抗体捕获所有非肿瘤来源的细胞外囊泡时，加入相对非肿瘤来源细胞外囊泡过量的生物素修饰的捕获抗体，于4℃孵育至少1h。
9.根据权利要求6所述的特定亚型细胞外囊泡分离和检测试剂盒的使用方法，其特征在于：用生物素修饰的捕获抗体捕获总细胞外囊泡中所有非肿瘤来源细胞外囊泡时，加入相对生物素过量的链霉亲和素修饰的磁珠，室温孵育至少20min。
10.一种特定亚型细胞外囊泡的分离方法，其特征在于：利用免疫吸附技术的分离方法去除样品中非目标亚型细胞外囊泡，得到只含有目标亚型细胞外囊泡的样品，然后利用超速离心法收集目标亚型细胞外囊泡。
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