CN101713780A - 磁酶免化学发光检测梅毒螺旋体抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫分析诊断技术领域，涉及一种磁酶免化学发光检测梅毒螺旋体抗体的方法。该方法以金磁微粒为载体，包被梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原TP15、TP17、TP47、TP44.5中的一种或多种，然后加入待检标本和酶标抗原，最后加入发光底物，进行发光检测。由于金磁微粒表面对抗原较大的偶联容量，加之其兼备酶联免疫分析的高特异性、无污染的特点，以及化学发光法高灵敏度的特点，使该方法具有检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、无放射性污染等优点。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析诊断技术领域，涉及一种磁酶免化学发光检测梅毒螺旋体抗体的方法，具体说是一种以金磁微粒为载体的检测梅毒螺旋体抗体的方法。
背景技术
梅毒(Syphilis)是由苍白密螺旋体(Treponema pallidum，TP)感染引起的一种性传播疾病。梅毒螺旋体可侵犯全身各脏器，造成多器官病变、功能失常、组织破坏甚至死亡。梅毒是人类独有的疾病，显性和隐性梅毒患者是传染源。梅毒的传播方式主要是性交，极少数可通过输血或接触污染了梅毒螺旋体的物品被传染。母亲患梅毒可传给胎儿。近年来，梅毒在我国的发病率呈逐年增加的趋势，2003～2006年发病率年均增长42.13％，2006年发病率高达12.8/10万。流行病调查的结果还表明，梅毒发病率高的地区，相应感染艾滋病毒的增长率也快。国家卫生部2007年公布的甲、乙类法定报告传染病中，梅毒发病人数已从2005年的第5位跃居第3位。因此，梅毒在我国已成为一个严峻的公共卫生问题。
在检测梅毒螺旋体抗体的方法中，血清学检测是目前临床诊断梅毒的重要方法，包括性病实验室研究试验(VDRL)、荧光螺旋体吸收试验(FTA-ABS)、梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。FTA-ABs试验的提取物为活菌，存在潜在危险性，且需荧光显微镜。此外还需要具有一定专业技能和工作经验的操作者，因此方法还具有一定的局限性；由于TPHA使用完全抗原，可能存在非特异性交叉反应，使该方法受到一定的限制；将TP重组抗原应用于酶联免疫吸附试验(ELISA)后，极大地提高了检测灵敏度和特异性，因重组抗原具有高纯度、高特异性、易于制备等优点，加之酶标法易于操作及标准化，该方法已被指定为血站血源初筛和临床诊断的重要方法。近年来，随着梅毒螺旋体TP人工重组抗原技术的进步，以酶标板为载体，结合梅毒混合抗原，通过免疫学双抗原夹心比色法检测梅毒抗体已成为国内三甲级以上医院通用的诊断方法，也是血站对梅毒螺旋体IgM和IgG抗体筛查的指定方法，但方法灵敏度尚需进一步提高。鉴于灵敏度较高的核酸检测方法尚无法在医院和血站大规模推广，因此，提高梅毒螺旋体抗体免疫学检测方法的灵敏度具有重要意义。
磁性微粒，又称磁性微球或磁珠。磁性复合微粒是20世纪70年代末发展起来并被广泛用于生物医学领域的超顺磁性纳微米复合粒子，是由高分子或无机材料与磁性超细粉末(包括磁性金属如Fe、Co、Ni或其金属氧化物等)构成的胶态复合物。在外加磁场作用下，磁性粒子的超顺磁性可保证既能被快速分离，本身又不会被永久磁化。纳微米级磁性复合微粒具有较高的比表面积，表现出较强的吸附能力。通过物理吸附，或利用修饰在磁性复合微粒表面的活性基团可将酶、抗体、寡核苷酸及核酸等生物活性物质偶联在其表面。表面固定有链亲和素的磁性复合微粒还可与生物素标记的生物分子特异结合而将其固定在磁性微粒表面，所以在外加磁场的定向控制下，通过吸附、清洗等操作，可检测到目标物质。
磁性微粒颗粒微小，比表面积大，生物分子等物质在其表面偶联容量大；悬浮稳定性好，更有利于抗体抗原间反应充分，因而MAIA技术具检测速度快、特异性高、灵敏度高、重复性好、无放射性污染等优点，该方法在食品安全检测、环境监测及医学检测等领域有着很好的应用前景。
胶体金很早就被用于生物分子的标记和检测，将磁性纳米粒子在外磁场中的可分离性和胶体金特性结合起来，制备组成为Fe/Au、Fe3O4/Au、Co/Au等磁性微粒被称为金磁微粒。
金磁微粒是一种新型磁性无机物复合微粒，由胶体金颗粒与磁性粒子复合形成的，这种材料兼有磁性粒子在外磁场中的可分离性以及对生物分子的快速固定化等特点，在生物与医学领域具有重要的应用前景。结合磁性纳米粒子的超顺磁性和金表面生物分子可修饰性的双重特质，发明人研制了Fe3O4/Au磁性复合微粒，并将其实现了商业化(金磁微粒
)。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁酶免化学发光检测梅毒螺旋体抗体的方法，解决了背景技术中其他传统方法检测梅毒螺旋体抗体存在的限制性、特异性、灵敏性、危险性等问题。该方法在检测灵敏度、特异性、准确度及精密度方面均比显色法酶免检测有所提高，操作安全，方法简便快速。
本发明的技术方案
本发明记载了一种磁酶免化学发光检测梅毒螺旋体抗体的方法，该方法是以金磁微粒为载体，包被梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原TP15、TP17、TP47、TP44.5中的一种或多种，然后加入待检标本和酶标抗原，最后加入发光底物，进行发光检测。
该方法包括以下步骤：
(1)包被：以金磁微粒作为反应和分离的固相载体，将梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原偶联在金磁微粒的表面；
(2)封闭：用封闭液封闭金磁微粒表面未与抗原结合的空白位点；磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用；
(3)与待测物结合：将待检标本、酶标抗原结合物加入经过步骤(2)封闭后的结合有抗原的金磁微粒中反应，使包被在金磁微粒表面的抗原与待检标本中的梅毒螺旋体抗体和酶标抗原结合物结合，形成特异性抗原-抗体-酶标抗原复合物；
(4)清洗：用清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清；
(5)检测：向经过步骤(4)处理后形成的抗原-抗体-抗原复合物的金磁微粒中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后的3～50分钟内测量各孔的发光强度(RLU)。
上述步骤(1)将梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原偶联在金磁微粒表面的方法包括：
(1.1)预处理：取金磁微粒，用偶联缓冲液清洗1～3遍；
(1.2)偶联：将梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原与偶联液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在4～37℃，100～300rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；
(1.3)清洗：用清洗缓冲液清洗2～5次，磁性分离，弃上清；
上述步骤(2)封闭的方法是：在步骤(1)的产物中加入封闭液，置于摇床中，在4～37℃条件下，以100～300rpm的转速反应1～2小时，封闭金磁微粒表面未与抗原结合的空白位点；经实验确定，在摇床中反应1小时是确保最佳封闭效果的最短时间。
上述步骤(3)反应的条件为：将待检标本、酶标抗原结合物加入金磁微粒中，置于摇床，在4～37℃条件下，以100～300rpm的转速反应0.5～1小时；
上述步骤(1)偶联缓冲液是pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液、pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液之中的任一种。
上述步骤(1.3)清洗缓冲液是浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液或摩尔浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液。
上述步骤(1)梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原为TP15、TP17、TP47、TP44.5中的一种或多种；
上述步骤(2)封闭液为牛血清白蛋白、脱脂奶粉、乙醇胺、赖氨酸或动物血清之中的任一种或2～3种的混合物，该封闭液的质量体积浓度为1～10％；所述动物血清为小牛血清或山羊血清。
上述步骤(2)清洗缓冲液是pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液、pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的TBS缓冲液之中的任一种或含0.02～0.2％吐温的上述缓冲液，其中吐温含量为0.05％时效果最好。
上述步骤(2)保存缓冲液是pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的TBS缓冲液、pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液或pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液之中的任一种。
上述步骤(3)酶标抗原是碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记的梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原。
上述步骤(4)清洗缓冲液是浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液或浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液。
上述步骤(5)化学发光底物是鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物，其中1，2-二氧乙烷类衍生物是金刚烷-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-STAR。
本发明的优点
本发明采用以金磁微粒为载体，结合化学发光检测系统，建立了梅毒螺旋体抗体的磁酶免化学发光检测方法，由于金磁微粒表面对物质强大的偶联量，加之其兼备酶联免疫分析的高特异性、无污染的特点，还保留了化学发光法的高灵敏度，弥补了它在特异性上的不足。该方法检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好、无放射性污染，安全快捷。
附图说明
图1为本发明实施例金磁微粒包被梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原前后的紫外吸收曲线图。
图2为本发明实施例检测梅毒螺旋体抗体的结果示意图。
图3为本发明实施例检测梅毒螺旋体抗体的标准曲线图。
具体实施方式
本发明是以金磁微粒为载体，包被梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原TP15、TP17、TP47、TP44.5中的一种或多种，然后加入待检标本和酶标抗原，最后加入发光底物，进行发光检测。
以下具体实施例是对本发明的进一步说明，该实施例并不对本发明保护范围作限定。
磁酶免化学发光检测血清中的梅毒螺旋体抗体的方法，包括：
(1)包被
(1.1)预处理：取5mg/mL的金磁微粒100μL，用pH＝7.4，浓度为0.02MTris-HCl偶联缓冲液200μL清洗2次，平衡磁粒的pH。
(1.2)偶联：将TP15、TP17、TP47三种梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原溶解于200μL pH＝7.4，浓度为0.02M Tris-HCl偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37℃，180rpm，摇床中反应20min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
(1.3)清洗：加入400μL浓度为0.02M Tris-HCl清洗缓冲液，磁性分离，弃上清。
(2)封闭：向金磁微粒中加入1mL含5％脱脂奶粉的Tris-HCl缓冲液中，于37℃，180rpm，摇床中反应1小时，磁性分离，弃上清。用1mL pH＝7.4，浓度为0.02M Tris-HCl缓冲液清洗4次，磁粒悬于1mL pH＝7.4，浓度为1×PBS的保存缓冲液中，4℃备用。金磁微粒包被梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原前后的紫外吸收曲线见图1，图中1为包被前的；2为包被后的。
(3)与待测物结合：取出包被后的金磁微粒，于室温下平衡10分钟；取3个2mL离心管，分别设定为阳性、阴性、空白，向该3个离心管中分别加入20μL前述金磁微粒，再向设定为阳性的离心管中加入阳性对照血清50μL，向设定为阴性的离心管中加入阴性对照血清50μL，空白对照不加；再分别向设定为阳性的离心管和设定为阴性的离心管中分别加入待检血清、HRP标记抗原50μL，空白对照不加，37℃，180rpm，置摇床中反应30min，形成特异性抗原-抗体-酶标抗原复合物；
(4)清洗：取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用添加0.05％吐温20，pH＝7.4，浓度为1×PBS的清洗缓冲液清洗5次，磁性分离，弃上清；
(5)检测：将经过步骤(4)处理后形成的抗原-抗体-抗原复合物的金磁微粒转入96孔板，并向其加入发光底物鲁米诺溶液60μL，于加入后的3～50min内检测各孔的发光强度(RLU)；
检测结果示意图见图2，该体系检测有着很强的阳性信号，阴性样品不发光。
用该方法与商品化试剂盒(ELISA法)检测梅毒螺旋体抗体灵敏度作比较，如表1所示：
表1
商品化试剂盒(ELISA法)采用的是聚乙烯酶标板作为固相载体，酶免反应只能在酶标板的表面进行。用金磁微粒作为固相载体，金磁微粒悬浮在液体中，比表面积增加，进一步引入化学发光法，显著提高了检测的灵敏度。由检测结果可以看出，商品化酶标板试剂盒只能检测到稀释400倍的阳性血清，而金磁微粒化学发光法可以检测到6400倍稀释的阳性血清，灵敏度增加至商品化试剂盒的16倍，因此该方法很大程度的提高了检测的灵敏度。
图3是本发明实施例检测梅毒螺旋体抗体的标准曲线，可以看出线性关系很好。
Claims (5)
1.磁酶免化学发光检测梅毒螺旋体抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)包被：以金磁微粒作为反应和分离的固相载体，将梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原偶联在金磁微粒的表面；
(2)封闭：用封闭液封闭金磁微粒表面未与抗原结合的空白位点；磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用；
(3)与待测物结合：将待检标本、酶标抗原结合物加入经过步骤(2)封闭后的结合有抗原的金磁微粒中反应，使包被在金磁微粒表面的抗原与待检标本中的梅毒螺旋体抗体和酶标抗原结合物结合，形成特异性抗原-抗体-酶标抗原复合物；
(4)清洗：用清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清；
(5)检测：向经过步骤(4)处理后形成的抗原-抗体-抗原复合物的金磁微粒中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后的3～50分钟内测量各孔的发光强度。
2.根据权利要求1所述的磁酶免化学发光检测梅毒螺旋体抗体的方法，其特征在于：
所述步骤(1)将梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原偶联在金磁微粒表面的方法包括：
(1.1)预处理：取金磁微粒，用偶联缓冲液清洗1～3遍；
(1.2)偶联：将梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在4～37℃，100～300rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；
(1.3)清洗：用清洗缓冲液清洗2～5次，磁性分离，弃上清；
所述步骤(2)封闭的方法是：在步骤(1)的产物中加入封闭液，置于摇床中，在4～37℃条件下，以100～300rpm的转速反应1～2小时，封闭金磁微粒表面未与抗原结合的空白位点；
所述步骤(3)反应的条件为：将待检标本、酶标抗原结合物加入金磁微粒中，置于摇床，在4～37℃条件下，以100～300rpm的转速反应0.5～1小时；
3.根据权利要求2所述的磁酶免化学发光检测梅毒螺旋体抗体的方法，其特征在于：
步骤(1)偶联缓冲液是pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的磷酸盐(PBS)缓冲液、pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的碳酸盐(CBS)缓冲液、pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液之中的任一种。
步骤(1.3)清洗缓冲液是浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液或摩尔浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述的磁酶免化学发光检测梅毒螺旋体抗体的方法，其特征在于：
步骤(1)梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原为TP15、TP17、TP47、TP44.5中的一种或多种；
步骤(2)封闭液为牛血清白蛋白、脱脂奶粉、乙醇胺、赖氨酸或动物血清之中的任一种或2～3种的混合物，该封闭液的质量体积浓度为1～10％；所述动物血清为小牛血清或山羊血清。
步骤(2)清洗缓冲液是pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液、pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)之中的任一种或含0.02～0.2％吐温的上述缓冲液。
步骤(2)保存缓冲液是pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液、pH＝5.0～8.0，浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液、pH＝3.0～7.0，浓度为0.005M～1M的柠檬酸盐缓冲液、pH＝7.0～9.0，浓度为0.005M～1M的TBS缓冲液、pH＝9.0～11，浓度为0.005M～1M的CBS缓冲液或pH＝3.6～5.6，浓度为0.005M～1M的醋酸盐缓冲液之中的任一种。
步骤(3)酶标抗原是碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记的梅毒螺旋体特异性重组蛋白抗原。
步骤(4)清洗缓冲液是浓度为0.005M～1M的Tris-HCl缓冲液或浓度为0.5×～10×的PBS缓冲液。
步骤(5)化学发光底物是鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物，其中1，2-二氧乙烷类衍生物是金刚烷-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-STAR。
5.根据权利要求4所述的磁酶免化学发光检测梅毒螺旋体抗体的方法，其特征在于：所述步骤(2)清洗缓冲液中含吐温0.05％。
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