CN108196069B

CN108196069B - 一种包含重组融合抗原a和b的丙型肝炎病毒抗体检测试剂及应用和重组融合抗原a和b

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Publication number: CN108196069B
Application number: CN201810099974.8A
Authority: CN
Inventors: 周珂
Original assignee: Shenzhen Derui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Derui Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2038-02-01
Also published as: CN108196069A

Abstract

本发明一种包含重组融合抗原A和B的丙型肝炎病毒抗体检测试剂及应用和重组融合抗原A和B，属于生物工程技术领域。所述一种包含重组融合抗原A和B的丙型肝炎病毒抗体检测试剂，其中重组融合抗原A包含的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述重组融合抗原B包含的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述检测试剂由R1试剂、R2试剂、R3试剂和R4试剂组成。本发明具有以下优点：本发明的两个重组融合抗原具有特异性高、稳定性好的特点，通过一定的比例混合使用，可用于丙型肝炎病毒抗体检测试剂的制备，试剂的临床检测效果显著。同时该检测试剂对乳糜微粒、胆红素以及血红蛋白具有很强的抗干扰能力，可极大满足丙型肝炎病毒临床诊断的需求。

Description

一种包含重组融合抗原A和B的丙型肝炎病毒抗体检测试剂及应用和重组融合抗原A和B

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种包含重组融合抗原A和B的丙型肝炎病毒抗体检测试剂及应用和重组融合抗原A和B；具体涉及的是一种利用不同丙型肝炎病毒融合抗原片段进行组合，制备出重组融合抗原A和重组融合抗原B的方法。同时，将这两个重组融合抗原应用于丙型肝炎病毒抗体检测试剂的制备及临床检测的应用。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染而引起的严重威胁人类健康的传染性疾病，主要由血液、体液传播为主。据世界卫生组织估计，全球大约有1.3～1.7亿丙型肝炎病毒感染者。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7～3.1％，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，感染者中约20％左右可以自然清除，约80％左右可发展为丙肝慢性感染。其中20～30％的丙肝慢性感染会进一步发展成为慢性进行性肝病，如肝硬化等。肝硬化患者中每年有1～4％的人发展成为肝细胞癌症。

HCV的RNA大约有9500～10000bp组成。在5′非编码区下游紧接一开放的阅读框(ORF)，其基因组排列顺序为5′-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3′，编码一个长度大约为3014个氨基酸的多聚蛋白前体，后者经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成多种病毒蛋白，包括3种结构蛋白，包括核心蛋白Core、E1糖蛋白和E2糖蛋白；6种非结构蛋白，包括NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B。

不同亚型的HCV具有一定的地区和人群分布特征。现知欧美国家多数HCV的Ⅰ型感染，而亚洲国家以Ⅱ型为主，Ⅲ型次之。Wang氏报告我国北京地区慢性丙型肝炎患者86.2％为HCV的Ⅱ型感染，13.8％为Ⅲ型感染。而新疆地区的Ⅲ型感染却占50％。

由于多数丙型肝炎患者不出现明显临床症状，大部分病人直到出现肝硬化甚至肝癌时才发现自己患有丙型肝炎。因此对丙型肝炎的早期诊断、早期治疗非常重要。

目前丙型肝炎病毒检测的方法主要有两种，一种是病毒核酸检测，另一种类型是基于病毒抗原/抗体的免疫检测。HCV的RNA分子检测，由于容易出现RNA降解导致的假阴性，并且检测的成本略高，对人员操作、仪器设备、实验环境的要求较高，在临床应用上有一定的局限性。HCV抗体的免疫检测，目前国际HCV诊断试剂已经发展到第三代。第一代HCVELLISA诊断试剂采用的抗原为C100，是由人超氧歧化酶SOD与HCV非结构蛋白NS3/NS4嵌合表达的融合蛋白，其中SOD有154个氨基酸，HCV部分有363个氨基酸。应用C100对鲜血人员进行HCV筛查，输血性丙型肝炎发病率下降84％。但第一代检测试剂具有灵敏度低导致假阴性高、特异性差导致的假阳性高、C100抗体阳性出现较晚不宜用于丙型肝炎病毒早期诊断。第二代HCV ELISA试剂包含HCV核衣壳蛋白和非结构蛋白NS3区域的重组C33C抗原，抗HCV检出率较第一代高20～30％。在急性输血性丙型肝炎和散发性丙型肝炎中抗HCV检出率高于第一代约20％，在慢性丙型肝炎中抗HCV检出率较第一代高10％，此外将HCV血清转换窗口期从第一代的18周缩短到10周。但是第二代ELISA诊断试剂依旧存在一定的假阳性和假阴性问题。第三代HCV ELISA诊断试剂，与第二代相比增加了NS5抗原片段，可检测单独NS5抗体阳性的患者，使得特异性达到99％。目前公认第三代丙型肝炎诊断试剂是HCV3.0RIBA，该试剂包含2个重组抗原(C33C，NS5)和3个合成肽抗原(C100，C22，5-1-1)。人工合成肽抗原的优点是特异性好，无感染性，但其缺点是合成肽分子量小不易被吸附，氨基酸结构短且为线性与抗体亲和力低，表位少容易导致漏检，合成肽的价格高等问题。除此之外，重组抗原的稳定性也是影响诊断试剂性能的重要因素之一。

目前用于诊断试剂的HCV重组原料主要以进口为主，但由于国外的HCV抗原多为I型重组抗原，我国主要以II型丙型肝炎为主，由于不同亚型病毒间抗原序列的差异会导致进口HCV抗原制备的国产试剂在临床检测上存在漏检或假阳的问题。何如开发出一套适用于我国HCV诊断试剂开发的国产重组抗原，同时保证试剂的准确性、灵敏性和稳定性是至关重要的。由于HCV重组抗原的制备具有难以表达或折叠不正确的技术瓶颈，目前国内自主研发的HCV重组抗原多为包涵体，活性不佳，有的则是抗原稳定性不好。用其开发出的试剂性能也不能同国外同类型的诊断试剂相媲美，存在较多的假阳性和假阴性、且灵敏度低的问题。缺少活性好、稳定性高的HCV重组抗原是导致不能制备出满足临床诊断要求的国产检测试剂的主要原因。

另一方面，化学发光技术平台在检测灵敏度方面较ELISA技术平台高，目前很多国内外的体外诊断试剂公司都在以化学发光技术平台来研发诊断试剂，这是诊断技术发展的趋势。因此能开发出一种特异性好、灵敏度高、性能稳定、可以满足临床要求的丙型肝炎病毒抗体化学发光检测试剂是非常重要和极具应用前景的。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种包含重组融合抗原A和重组融合抗原B的丙型肝炎病毒抗体检测试剂。

本发明的二个目的在于公开了上述检测试剂的应用。

本发明第三个目的在于公开了用于上述检测试剂的重组融合抗原A。

本发明第四个目的在于公开了用于上述检测试剂的重组融合抗原B。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种包含重组融合抗原A和重组融合抗原B的丙型肝炎病毒抗体的检测试剂，其中，所述重组融合抗原A包含的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述重组融合抗原B包含的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQID NO:4所示；所述检测试剂由R1试剂、R2试剂、R3试剂和R4试剂组成；其中：

R1试剂的缓冲液组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 2.56g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.436g/L、NaCl9g/L、甘露醇20～50g/L、酪蛋白10～30g/L、果绿色素0.1～0.5g/L、TritonX-1000.1～0.5ml/L、PC-3000.5～2ml/L、丙三醇5～20ml/L；HRP-鼠抗人IgG 0.5～10mg/L；

R2试剂的缓冲液组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 5.8g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.592g/L、NaCl9g/L、Tween-200.1～0.5ml/L、丙三醇5～20ml/L、PC-3000.5～2ml/L；

R3试剂的缓冲液组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 2.56g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.436g/L、NaCl9g/L、甘露醇10～50g/L、酪蛋白5～20g/L、牛血清白蛋白0.1～1g/L、PVP-401～5g/L、PVA0.05～0.5g/L、Tween-205～20ml/L、TritonX-1000.05～0.2ml/L、丙三醇5～20ml/L、PC-3000.5～2ml/L、链霉亲和素0.1g/L、包被重组融合抗原的磁珠0.2～1g/L；所述包被重组融合抗原的磁珠中，重组融合抗原A和重组融合抗原B按照一定比例混合后再进行包被磁珠，其中重组融合抗原A的包被量为10～50μg/mg磁珠，重组融合抗原B的包被量为0.1～10μg/mg磁珠；

R4试剂的缓冲液由A体系和B体系等体积组成，其中A体系为：鲁米诺0.8～1.2g/L、对碘苯酚0.1～1g/L、肉桂酸1～2g/L、EDTA5～10g/L、聚乙二醇6001～2.5g/L、Tween-205～20ml/L、PC-3000.5～2ml、Tris 0.1～0.2mol/L、pH8.0～9.0；B体系为：H₂O₂4～10mol/L，Tris 0.1～0.2mol/L、pH8.0～9.0；使用时A体系和B体积等体积加入。

上述技术方案所述的检测试剂，其中：所述Biotin-重组融合抗原A为经过超声和加高岭土处理的Biotin-重组融合抗原A。该处理过程可以增强重组融合抗原A的活性，提高诊断试剂的性能。具体处理过程如下：取出一定量的biotin-重组融合抗原A，计算溶液体积，加入0.5～3％体积Tween-20，混匀，用R2试剂的缓冲液将biotin-重组融合抗原A的浓度稀释至0.1mg/ml，混匀后用超声仪20～40％功率超声：工作5s，间隙10s，超声8～12次。4℃静置2h，每0.1mg的biotin-重组融合抗原A加入10～20mg高岭土，涡旋10min。以5000rpm离心10min，取上清备用；处理好的biotin-重组融合抗原A保存于-20℃或用于包被磁珠。

上述技术方案所述的检测试剂在检测丙型肝炎病毒抗体中的应用。

用于上述技术方案所述检测试剂的重组融合抗原A，其中：所述重组融合抗原A包含的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

上述技术方案所述检测试剂的重组融合抗原A，其中：所述重组融合抗原A是由Core抗原的1-119aa与NS3抗原的1192-1458aa构成；其中重组融合抗原A的N端为Core抗原1-119aa，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；C端为NS3抗原1192-1458aa，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

上述技术方案所述检测试剂的重组融合抗原A，其中：所述重组融合抗原A的表达系统为pTYB系列载体。

由上述技术方案所述重组融合抗原A构成的重组质粒及基因工程菌株。

上述技术方案所述检测试剂的重组融合抗原B，其中：所述重组融合抗原B包含的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

上述技术方案所述的重组融合抗原B，其中：所述重组融合抗原B是由NS5抗原2180-2302aa与Core1-119aa组成构成；其中重组融合抗原B的N端为NS5抗原2180-2302aa，核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；重组融合抗原B的C端为Core抗原1-119aa，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO:6所示。

上述技术方案所述的重组融合抗原B，其中：所述重组融合抗原B的表达系统为pET系列载体或pGEX系列载体。

本发明具有以下有益效果：

1、丙型肝炎病毒重组融合抗原设计思路就是采用在国内亚型HCV的不同抗原片段序列的组合，形成多表位的嵌合融合抗原，降低样本漏检的风险。将重组融合抗原A和重组融合抗原B分开设计，小片段的重组融合抗原的可溶性更高，可避免重组抗原太大导致不表达或表达空间折叠不正确形成包涵体、复性后抗原活性低的问题。在重组融合抗原制备工艺过程中通过表达系统的选择与优化，确保获得折叠正确、可溶性、高活性的重组抗原。同时通过对表达基因片段的选择，增强了重组抗原的稳定性。尤其重组融合抗原A采用pTYB系列表达载体，通过低温诱导表达和用Chitin Resin纯化，切除标签蛋白后可获得无标签的、可溶性的、稳定的、高活性的重组融合抗原A。两种重组融合抗原制备的诊断试剂通过热加速实验也证明了两种重组融合抗原具有良好的稳定性。

2、本发明制备出的重组融合抗原A、重组融合抗原B在包被磁珠时通过调节两种抗原的用量比例来优化试剂的临床检测效果，达到提高试剂准确性的目的。

3、本发明检测试剂制备的工艺过程中，重组融合抗原A标记生物素后包被磁珠前，有一个超声和加高岭土处理的步骤，可提高试剂的性能。

4、本发明中的重组融合抗原所制备的诊断试剂，其批次内的精密度变异系数(CV)在10％以内，批次间的精密度变异系数(CV)在15％以内，对浊度乳糜微粒、胆红素、血红蛋白干扰具有良好的抵抗能力。与商业化丙型肝炎病毒抗体化学发光检测试剂对465个临床样本进行同时检测，比对结果的符合率为99.57％，检测效果显著。本发明制备的丙型肝炎病毒重组融合抗原可以作为HCV临床诊断试剂的重要生物原材料使用。

附图说明

1、图1重组融合抗原A和重组融合抗原B制备及应用流程的示意图。

2、图2为本发明重组融合抗原A诱导表达及纯化的SDS-PAGE电泳图。

3、图3为本发明重组融合抗原B诱导表达及纯化的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例及图1重组融合抗原A和重组融合抗原B制备及应用流程的示意图对本发明作进一步的说明。

实施例1：重组融合抗原A的制备：

本实施例公开的是重组融合抗原A的制备方法，具体如下：

一、人工合成重组融合抗原A基因序列并构建表达载体：

按照重组融合抗原A基因序列信息由生工生物工程(上海)股份有限公司进行人工基因合成，其序列为SEQ ID NO:1。该基因完成基因合成后与pMD-18载体链接，重组融合抗原A基因序列的5′端设计有BamH I酶切位点，3′端设计有终止子和EcoR I酶切位点。利用BamH I和EcoR I酶切位点将重组融合抗原A基因序列从pMD-18载体上双酶切下来，同时用BamH I和EcoR I酶切位点对pTYB21载体表达载体进行双酶切。胶回收这两个基因片段。用连接酶将双酶切后的重组融合抗原A基因序列与pTYB21载体表达载体链接，转化大肠杆菌DH5α。挑取单克隆菌落进行培养，提取重组质粒并进行双酶切鉴定，确认阳性重组质粒。将重组质粒送生工测序。经过DNA测序验证，确定重组质粒的序列和阅读框是正确的。将获得的重组质粒转化宿主细胞Rosetta(DE3)。通过重组质粒转化宿主细胞Rosetta(DE3)即可有效表达出具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重组融合抗原A。

二、筛选高效的表达重组融合抗原A的菌株：

取适量转化后的宿主细胞涂布到带抗性的LB固体培养基中，37℃培养过夜，第二天挑选10株以上的单克隆菌落，接种于5ml带抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，同时转化pTYB21空载体的宿主菌作为对照。第三天，上述各样品各取5μl培养后的菌液接种于新的5ml带抗性的液体LB培养基中，以37℃，200rpm培养5小时后，每个样品加入终浓度为1mM的IPTG，再以37℃，200rpm培养5小时。取1ml培养产物，离心收集菌体，用50μl 20mM的PBS缓冲液重悬菌体，加入12.5μl蛋白电泳上样缓冲液(60mM Tris-HCl，25％甘油(W/V)，2％SDS(W/V)，5％2-巯基乙醇(V/V)，0.1％溴酚蓝(W/V)，pH6.8)，沸水煮10分钟，以12000rpm离心10分钟后，取20μl上清液进行SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝染色，在预测分子量大小的地方有一条明显的蛋白条带，而转化pTYB21空载体的菌株没有这条带。进一步将诱导后的菌体超声破碎后离心取上清液和沉淀，SDS-PAGE电泳显示，目标蛋白主要以可溶形式存在于上清中。

比较不同的重组表达细胞的表达量差异，选择表达量较高的菌株作为后续大规模表达的菌株。

三、表达菌株的大规模发酵：

取两瓶100ml液体LB培养基的250ml三角瓶，在超净台中打开三角瓶塞，加入100ul氯霉素母液和100ul氨苄青霉素母液。用接种环挑取单克隆菌株，接种到100ml含有氨苄青霉素和氯霉素抗性的LB培养基中，封好瓶塞，置于恒温摇床中以37℃、220rpm转速培养16～18小时后，放置于4℃冰箱中备用。

取出-20℃储存的氯霉素母液和氨苄青霉素母液，室温融化。取1～8瓶含有1L的LB培养基的三角摇瓶，在超净台中分别向三角摇瓶中加入氨苄青霉素和氯霉素母液各1ml。每个三角摇瓶中加入上述的种子菌液15ml。设置培养温度37℃，转速180～220rpm，培养时间约3～4小时。将培养后的八瓶菌液取出，室温冷却。在超净台中向每瓶菌液中分别加入IPTG母液1ml，放入低温摇床中，在20℃环境下以180～220rpm进行诱导，诱导时间控制在20～24h左右。诱导完成后，使用贝克曼大型离心机以4℃，6500rpm对诱导产物离心10min，弃上清，沉淀用20mM PBS洗涤、重悬，合并收集菌体。再次以前述条件离心，弃上清，留沉淀。如果不需要进行下一步纯化，可将菌体保存于-20℃。

四、表达抗原的纯化：

打开低温冷却液循环机开关，设定冷却温度为-8℃，开启冷却循环对高压匀浆机进行冷却。打开高压匀浆机开关，用纯水清洗进样漏斗及内部管路三次。再用预冷的ColumnBuffer冲洗进样漏斗及内部管路。向离心瓶中加入300ml预冷的Column Buffer(Tris2.434g/L、NaCl 29.25g/L、EDTA-2Na 0.3722g/L、吐温-200.1％(V/V)，pH8.5)重悬菌体，同时加入3ml PMSF母液，并用玻璃棒搅拌均匀，无块状物。排空进样漏斗及内部管路中的液体，将重悬菌液加入进样漏斗中并不时搅拌，防止菌体沉淀而堵塞高压匀浆机。开启高压匀浆机压力表，旋动加压开关，缓慢地将压力增加至800～1000barg。同时手触摸进样漏斗下部的管路，感受下部管路是否发热。当下部管路温度高于10℃时，立刻旋松加压开关，将压力降为零，待循环冷却后再次重复加压。重复加压匀浆6～8次即可完成菌体的破碎，可观察到匀浆后的菌液较匀浆前清亮。收集菌体破碎液，用大型高速离心机以4℃，12000rpm转速离心20分钟，收集上清液。上清液用Column Buffer稀释5～10倍，并用0.22μm滤器过滤，2～8℃暂存待用。

依据纯化规模及柱载量选择一定大小的chitin柱。先用纯化水冲洗AKTA系统，从4℃冰箱中取出5ml的chitin柱并安装在AKTA系统上，设置流速2ml/min，用水冲洗层析柱10个柱床体积(CV)。设置报警压力为0.3Mpa，避免因压力过大造成层析柱的损坏。用ColumnBuffer对层析柱进行平衡，设置流速为2ml/min，平衡体积至少为6个CV，待基线稳定后对紫外归零。将破碎液12000rpm条件下离心20min，收集上清后并用0.2μm滤膜过滤后进行上样，上样流速为2ml/min，收集穿透液。上样完成后，再次用Column Buffer冲洗层析柱至少6个CV，设置流速为2ml/min。用Cleavage Buffer(Tris 2.434g/L、NaCl 29.25g/L、EDTA-2Na0.3722g/L、DTT 7.7g/L，pH8.5)冲洗层析柱3个CV，设置流速为2ml/min，卸下层析柱放置于4℃环境中，切割时间控制在20h以上。将层析柱从4℃环境中取出后并安装在AKTA系统上，用Column Buffer冲洗层析柱2个CV，设置流速为2ml/min，2个CV的洗脱液合并收集于一个容器中。

收集目的抗原洗脱液，装入3000分子量的透析袋，用5L的20mM PBS缓冲液(pH7.4)在2～8℃透析2天，更换透析液3次。将透析后的抗原以12000rpm离心20min，收集上清，测定上清体积。用BCA蛋白定量试剂盒检测抗原浓度。取10μl进行SDS-PAGE电泳。完成电泳后对SDS-PAGE胶进行显色/脱色，用凝胶成像仪拍照，通过软件对图像灰度进行分析，估算出抗原的纯度。重组融合抗原A的诱导表达和纯化如图2所示(图2中Lane M：PremixProtein Marker；Lane 1：丙型肝炎病毒重组融合抗原A诱导前；Lane2：丙型肝炎病毒重组融合抗原A诱导后；Lane 3：丙型肝炎病毒重组融合抗原A纯化)，重组融合抗原A纯度大于85％，蛋白浓度大于2mg/ml。

实施例2：重组融合抗原B的制备：

本实施例公开的是一种重组融合抗原B的制备方法，具体如下：

一、人工合成重组融合抗原B基因序列并构建表达载体：

按照重组融合抗原B基因序列信息由生工生物工程(上海)股份有限公司进行人工基因合成，其序列为SEQ ID NO:3。该基因完成合成后与pMD-18载体链接，重组融合抗原B基因序列的5′端设计有EcoR I酶切位点，3′端设计有终止子和XhoI酶切位点。利用EcoR I和XhoI酶切位点组合将重组融合抗原B基因序列从pMD-18载体上双酶切下来，同时用EcoR I和XhoI酶切位点组合对pET28a(+)表达载体进行双酶切。胶回收这两个基因片段。用连接酶将双酶切后的重组融合抗原B基因序列与pET28a(+)表达载体链接，转化大肠杆菌DH5α。挑取单克隆菌落进行培养，提取重组质粒并进行双酶切鉴定，确认阳性重组质粒。将重组质粒送生工测序。经过DNA测序验证，确定重组质粒的序列和阅读框是正确的。将获得的重组质粒转化宿主细胞Rosetta(DE3)。通过重组质粒转化宿主细胞Rosetta(DE3)即可有效表达出具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重组融合抗原B。

二、筛选高效的表达重组融合抗原B的菌株：

取适量转化后的宿主细胞涂布到带抗性的LB固体培养基中，37℃培养过夜，第二天挑选10株以上的单克隆菌落，接种于5ml带抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，同时转化pET28a(+)空载体的宿主菌作为对照。第三天，上述各样品各取5μl培养后的菌液接种于新的5ml带抗性的液体LB培养基中，以37℃，200rpm培养5小时后，每个样品加入终浓度为1mM的IPTG，再以37℃，200rpm培养5小时。取1ml培养产物，离心收集菌体，用50μl20mM的PBS缓冲液重悬菌体，加入12.5μl蛋白电泳上样缓冲液(60mM Tris-HCl，25％甘油(W/V)，2％SDS(W/V)，5％2-巯基乙醇(V/V)，0.1％溴酚蓝(W/V)，pH6.8)，沸水煮10分钟，以12000rpm离心10分钟后，取20μl上清液进行SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝染色，在预测分子量大小的地方有一条明显的蛋白条带，而转化pET28a(+)空载体的菌没有这条带。进一步将诱导后的菌体超声破碎后离心取上清液和沉淀，SDS-PAGE电泳显示，目标蛋白主要以可溶形式存在于上清中。

三、表达菌株的大规模发酵：

三角瓶的发酵：将筛选的高表达菌接种于200ml带抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜。第二天，按照1:50～1:100的比例接种于1～8个内有1000ml带抗性的LB培养基的三角瓶中，以37℃，220rpm培养4～6小时至OD值0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，于37℃，220rpm诱导4～6小时；或者以23～25℃，220rpm诱导16～20小时。

生物反应器的发酵：将筛选的高表达菌株接种于500ml带抗性的LB液体培养基中，以37℃，500rpm培养过夜。第二天，在总体积为7L的生物反应器中加入3～4L的LB液体培养基，煮沸灭菌后降温至37℃。将前一天的培养菌液按照1:50～1:100的比例接种于生物反应器的培养基中，同时加入相应抗生素，以37℃，200～300rpm培养4～6小时至OD值0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，以37℃，200～300rpm诱导4～6小时；或者以23～25℃，200～300rpm诱导16～20小时。

四、表达抗原的纯化：

诱导后的菌液用大型高速离心机以6000rpm转速离心10分钟，收集菌体，然后以1g菌体对应10ml缓冲液的比例加入His Loadingbuffer(Na₂HPO₄3.58g/L，NaH₂PO₄ 1.56g/L，NaCl 29.22g/L，咪唑2g/L，pH7.4)重悬菌体，同时加入一定量的PMSF防止蛋白降解，用超声破碎或高压匀浆的方式裂解菌体。裂解完成后，用大型高速离心机以4℃，12000rpm转速离心20分钟，收集上清液。上清液用His Loading Buffer稀释5～10倍后用0.22μm滤器过滤，待纯化。

采用AKTAUPC10纯化仪进行蛋白纯化。将AKTA纯化仪的A泵管，B泵管放入已经用0.22um滤膜过滤的纯水中，进样阀4，5出口管和收集阀的废液出口接到废液瓶中，在Systemcontrol窗口下，点击Manual打开pump菜单，选择PumpWashBasic命令，指定冲洗液A泵管，B泵管，执行命令。运行前，在Alarm&Mon中设定报警压力为0.3MPa，设定流速为2ml/min，用水冲洗仪器管路约5min。

根据纯化量与亲和填料最大载量的关系，选择已装好的Ni SepharoseTM6FastFlow亲和柱。将亲和柱的上端和下端管路与AKTAUPC10纯化仪器链接，用约5倍柱体积的纯水冲洗，分别将A泵管放入His Loading Buffer中，B泵管放入His Elution Buffer(Na2HPO43.58g/L，NaH2PO41.56g/L，NaCl 29.22g/L，咪唑20.4g/L，pH7.4)中。先用100％B泵冲洗约20ml，再切换到100％A泵冲洗柱子约10倍柱体积，同时冲洗干净所有收集管道。平衡好后，在Alarm&Mon菜单中选autozeroUV将紫外调零，并在Frc中设置峰收集150mAu，50ml/管，点击pause暂停仪器，将A泵管从His Loading Buffer中移入到重组抗原的上清液中，点击continue开始以2ml/min的流速上样。待上样完成后，将A泵管放入His LoadingBuffer中冲洗亲和柱，洗去未结合的杂蛋白，直至紫外基线平衡。当紫外基线平衡后，切换到100％B泵用His Elution Buffer洗脱目的抗原，收集洗脱液。洗脱液装入3000分子量的透析袋，用20mM Tris缓冲液(Tris 2.42g/L，pH8.0)在2～8℃透析2天，更换透析液3次以上。透析完成后，取10μl进行SDS-PAGE电泳检测。重组融合抗原B的诱导表达和纯化如图3所示(图3中Lane M：Premix Protein Marker；Lane 1：丙型肝炎病毒重组融合抗原B诱导前；Lane 2：丙型肝炎病毒重组融合抗原B诱导后；Lane 3：丙型肝炎病毒重组融合抗原B纯化)，重组融合抗原B纯度大于90％，蛋白浓度大于2mg/ml。

实施例3：GST-重组融合抗原B：

本实施例与实施例2的区别在于，本实施例公开一种GST-重组融合抗原B，该抗原带有GST标签，其具体制备方法与实施例2的区别仅仅在于：

步骤(1)中的表达载体为pGEX-4T-1；步骤(2)中对照采用转化pGEX-4T-1空载体的宿主菌；步骤(3)中加入GST Loadingbuffer替换His Loading buffer，GST ElutionBuffer替换His Elution Buffer，Glutathione Sepharose 4Fast Flow亲和柱替换NiSepharose^TM6Fast Flow亲和柱，PBS缓冲液替换Tris缓冲液。

其中，GST Loading buffer的组成为：NaCl 8.18g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄3.58g/L，KH₂PO₄0.25g/L，pH7.3。GST Elution Buffer的组成为：Tris 6.06g/L，还原性谷胱甘肽3.04g/L，pH8.0。PBS缓冲液的组成为：Na₂HPO₄5.8g/L，NaH₂PO₄0.6g/L，NaCl 9.0g/L，pH7.4。

本实施例中通过重组质粒转化宿主细胞Rosetta(DE3)即可有效表达出具有SEQID NO:3所示核苷酸序列、SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的GST-重组融合抗原B。

本实施例中，透析完成后，取10μl进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示GST-重组融合抗原B纯度大于85％，蛋白浓度大于2mg/ml。

实施例4：Trx-重组融合抗原B：

本实施例与实施例2的区别在于，本实施例公开一种Trx-重组融合抗原B，该抗原带有Trx标签，其具体制备方法与实施例2的区别仅仅在于：

步骤(1)中的表达载体为pET32a(+)；步骤(2)中对照采用转化pET32a(+)空载体的宿主菌。

本实施例中通过重组质粒转化宿主细胞Rosetta(DE3)即可有效表达出具有SEQID NO:3所示核苷酸序列、SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的Trx-重组融合抗原B。

本实施例中，透析完成后，取10μl进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示Trx-重组融合抗原B纯度大于85％，蛋白浓度大于2mg/ml。

经酶联免疫(ELISA)实验验证，重组融合抗原B、Trx-重组融合抗原B、GST-重组融合抗原B具有相同的比活。

实施例5：一种包含重组融合抗原A和重组融合抗原B的丙型肝炎病毒抗体检测试剂的制备及应用：

该试剂由R1试剂、R1试剂、R3试剂和R4试剂组成，采用抗原直接检测丙肝抗体的化学发光方法，可在多种全自动化学发光免疫分析仪上使用。

本实施例是利用实施例1和实施例2制备的重组融合抗原A和重组融合抗原B作为重要生物原料，用于丙型肝炎病毒抗体化学发光检测试剂的制备及检测，具体过程如下：

一、重组融合抗原A和重组融合抗原B标记生物素：

具体步骤以标记1mg重组融合抗原为例：

(1)、取1mg重组融合抗原，记录溶液体积，用移液枪在近靠玻璃瓶内壁液体的上方以5～10秒/滴的速度加入10mM BNHS溶液(BNHS 4.6mg/ml DMSO，现配现用)13.3μl，30秒内加完，边加边旋转摇动混匀，室温放置反应30min；

(2)、反应终止：用移液枪以2～5秒/滴的速度加入1％体积的1M Tris，室温放置反应10min；

(3)、标记好的抗原用0.05M CB缓冲液(Na₂CO₃1.59g/L、NaHCO₃2.93g/L)透析过夜，取出后根据体积计算浓度，命名为Biotin-重组融合抗原A和Biotin-重组融合抗原B。

二、Biotin-重组融合抗原A的处理：

(1)、取出一定量标记好的Biotin-重组融合抗原A抗原，计算体积；

(2)、加入1.5％体积Tween-20，混匀，用R2试剂的缓冲液将biotin-重组融合抗原A的浓度稀释至0.1mg/ml，混匀后用超声仪30％功率超声：工作5s，间隙10s，超声8次。

(3)、4℃静置2h，加入18mg高岭土，涡旋10min。

(4)、5000rpm离心10min，取上清备用；处理好的biotin-重组融合抗原A保存于-20℃或用于包被磁珠。

三、R1试剂的配制：

最终R1试剂的缓冲液组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 2.56g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.436g/L、NaCl 9g/L、甘露醇50g/L、酪蛋白20g/L、果绿色素0.2g/L、TritonX-1000.1ml/L、PC-3001ml/L、丙三醇10ml/L；HRP-鼠抗人IgG 0.5～10mg/L。

四、R2试剂的配制：

最终R2试剂的缓冲液组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 5.8g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.592g/L、NaCl 9g/L、Tween-200.5ml/L、丙三醇10ml/L、PC-3001ml/L。

五、R3试剂的配制：

具体步骤以100人份的配制为例：

(1)、取一瓶10mg/ml链霉亲和素(SA)-磁珠，置于混匀仪；

(2)、各取0.4ml混匀好的SA-磁珠到玻璃瓶中，然后将玻璃瓶置于磁分离架上，在磁场磁力下作用3-5分钟；待上部液体变澄清后，用移液枪吸弃上清；再加入2ml Buffer H(Na₂HPO₄·12H₂O 2.56g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.436g/L、NaCl 9g/L、甘露醇20g/L、酪蛋白10g/L、牛血清白蛋白0.5g/L、PVP-402g/L、PVA0.1g/L、Tween-2010ml/L、TritonX-1000.1ml/L、丙三醇10ml/L、PC-3001ml/L)，混匀，然后将玻璃瓶置于磁分离架上，在磁力下作用3-5分钟；待上部液体变澄清后，用移液枪吸弃上清，重复前述操作三次；

(3)、Biotin-重组融合抗原包被量计算公式如下：

注：V(μl)：应加Biotin-重组融合抗原的体积

10mg/ml：SA-磁珠的浓度

Cμg/mg：Biotin-重组融合抗原的包被浓度

Aml：SA-磁珠的体积

Bμg/μl：Biotin-重组融合抗原的浓度

(4)、投料：向预洗好的SA-磁珠加入2ml Buffer H，按照Biotin-重组融合抗原A包被量为10μg/mg磁珠，Biotin-重组融合抗原B包被量为0.25μg/mg磁珠，按(3)计算公式加入体积V1(μl)的处理后的Biotin-重组融合抗原A和V2(μl)体积的Biotin-重组融合抗原B，混匀，盖紧瓶盖，分别置于血液混匀仪上室温混匀反应30分钟；

(5)、洗涤：取下包被好的重组融合抗原磁珠，置于磁分离架上，在磁场磁力下作用3-5分钟；待上部液体变澄清后，用移液枪吸去上清；再加入2ml Buffer H，混匀，再将玻璃瓶置于磁分离架上，在磁场磁力下作用3-5分钟；待上部液体变澄清后，用移液枪吸去上清，重复前述操作三次；

(6)、封闭：取2ml Buffer H，每1mg磁珠加50ul封闭液(2.445mg维生素H、5ml DMSO中，5ml丙三醇，-20℃避光)，盖紧瓶盖，置于混匀仪上室温混匀反应30分钟；

(7)、洗涤：重复操作5；

(8)、稀释：按照1mg/10ml的链霉亲和素(SA)添加量计算10ml需要加入链霉亲和素(SA)的体积V3。用10ml减去V3，取相应体积的缓冲液Buffer H加入到含有洗涤好的重组融合抗原磁珠的试剂瓶中，并加入V3体积的SA，混匀后备用。

最终R3试剂的缓冲液组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 2.56g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.436g/L、NaCl 9g/L、甘露醇20g/L、酪蛋白10g/L、牛血清白蛋白0.5g/L、PVP-402g/L、PVA0.1g/L、Tween-2010ml/L、TritonX-1000.1ml/L、丙三醇10ml/L、PC-3001ml/L、链霉亲和素SA 0.1g/L、包被重组融合抗原的磁珠0.4g/L。

六、R4试剂的配制：

最终R4试剂的缓冲液组成为：A体系为鲁米诺0.8g/L、对碘苯酚0.5g/L、肉桂酸1g/L、EDTA5g/L、聚乙二醇6002g/L、Tween-205ml/L、PC-3001ml、Tris 0.1mol/L、pH8.8。B体系为H₂O₂8mol/L，Tris 0.1mol/L、pH8.8。使用时A、B体系等体积加入。

七、丙型肝炎病毒抗体检测试剂的性能检测：

本实施例中采用化学发光免疫分析仪进行检测，检测波长设定425nm，反应模式为：第一步，加入10ul样本+50ul R2试剂+50ul R3试剂，37度孵育10～20min，吸附磁珠去液体，第二步，加入100ul R1试剂，37度孵育10～20min，吸附磁珠去液体，第三步，加入R4试剂100ul A体系和100ul B体系，37度孵育5min，检测发光值。

(1)、丙型肝炎病毒抗体检测试剂精密度检测

采用上述配制的丙型肝炎病毒抗体检测试剂对质控样品(中值：1∶2500稀释；低值：1∶10000稀释)进行重复检测，计算批内的精密度。结果显示，批内的精密度，变异系数(CV)在10％以内，符合临床诊断的允许范围(见表1)。

表1本发明检测试剂批内精密度

样本	低值(1∶2500)	中值(1∶10000)
			rep1	36676	176425
rep2	38060	184209
			rep3	28077	178229
rep4	37538	181042
			rep5	37466	180575
rep6	36917	175352
			rep7	37352	176442
rep8	38692	176263
			rep9	31629	174948
rep10	39953	174754
			rep11	39517	172886
rep12	38460	174919
			rep13	35118	175876
rep14	39491	169652
			rep15	38694	175113
rep16	39301	177418
			rep17	37380	174979
rep18	40604	172753
			rep19	39151	176890
rep20	39899	176406
			mean	37498.75	176256.55
SD	2986.7	3140.9
			CV	7.96％	1.78％

以十天为周期，每天使用相同的检测试剂以及仪器测定质控样品(中值：1∶2500稀释；低值：1∶10000稀释)检测2次，计算批间的精密度。结果显示，虽然在低值区有偶然跳管的现象，批间的精密度变异系数(CV)也在15％以内，符合临床诊断的允许范围(见表2)。

表2本发明检测试剂批间精密度

(2)、丙型肝炎病毒抗体检测试剂抗干扰能力检测：

以10％偏差作为抗干扰的标准，本发明检测试剂能够抗6000浊度乳糜微粒干扰(见表3)、1500umol/L胆红素干扰(见表4)以及10g/L血红蛋白干扰(见表5)。

表3本发明检测试剂抗乳糜微粒干扰检测

表4本发明检测试剂抗胆红素干扰检测

检验样本	rep1	rep2	mean	干扰率
					500umol/L对照+质控低值	24379	30474	30474	\
500umol/L胆红素+质控低值	33101	33530	33315.5	8.5％
					1000umol/L对照+质控低值	29576	32067	30821.5	\
1000umol/L胆红素+质控低值	33050	32132	32591	5.4％
					1500umol/L对照+质控低值	29264	30012	29638	\
1500umol/L胆红素+质控低值	30336	29557	29946.5	1.0％
					500umol/L对照+质控中值	154885	167109	160997	\
500umol/L胆红素+质控中值	156450	166659	161554.5	0.3％
					1000umol/L对照+质控中值	154561	160264	157412.5	\
1000umol/L胆红素+质控中值	160326	160844	160585	2.0％
					1500umol/L对照+质控中值	127933	150878	139405.5	\
1500umol/L胆红素+质控中值	150412	156935	153673.5	9.3％

表5本发明检测试剂抗血红蛋白干扰检测

检验样本	rep1	rep2	mean	干扰率
					6g/L血红蛋白对照+质控低值	26891	29379	28135	\
6g/L血红蛋白+质控低值	30605	30439	30522	7.8％
					8g/L血红蛋白对照+质控低值	29360	30276	29818	\
8g/L血红蛋白+质控低值	29584	31170	30377	1.8％
					10g/L血红蛋白对照+质控低值	29031	31939	30485	\
10g/L血红蛋白+质控低值	28482	31057	29769.5	-2.4％
					6g/L血红蛋白对照+质控中值	142311	148343	145327	\
6g/L血红蛋白+质控中值	144701	145111	144906	-0.3％
					8g/L血红蛋白对照+质控中值	141027	150934	145880.5	\
8g/L血红蛋白+质控中值	147859	150030	148944.5	2.0％
					10g/L血红蛋白对照+质控中值	140466	151393	145829.5	\
10g/L血红蛋白+质控中值	145124	143940	144532	-1.0％

(3)、丙型肝炎病毒抗体检测试剂与商业化试剂的临床样本检测结果的比对：

本发明检测试剂与商业化试剂同时检测临床随机样本共465例，商业化试剂出现阳性样本4例，本发明检测试剂检出阳性样本2例。两份差异样本经过第三方雅培试剂的复测，确认商业化试剂为假阳性，本发明试剂结果正确。本发明试剂检测临床样本的假阳性率低，与商业化试剂的符合率为99.57％(463/465，见表6)，检测效果显著。

表6本发明检测试剂与商业化试剂检测临床样本的统计

(4)、丙型肝炎病毒抗体检测试剂的稳定性检测：

本发明检测试剂在37度环境下连续处理6天，对质控品进行检测，检测结果的信号保留率≥81.4％，本发明检测试剂的热稳定性符合临床诊断产品的性能要求(见表7)。

表7本发明检测试剂三个批次的稳定性检测

由上述实施例结果可见，本发明制备出的丙型肝炎病毒重组融合抗原A和重组融合抗原B具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的特点，可作为重要生物原料应用于丙型肝炎病毒抗体化学发光检测试剂的制备。所制备的试剂检测效果显著，符合临床诊断的要求。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 周珂

<120> 一种包含重组融合抗原A和B的丙型肝炎病毒抗体检测试剂及应用和重组融合抗原A和B

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1158

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagcacga atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60

gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120

ggccccaggt tgggtgtgcg cgcgactagg aagacttccg agcggtcaca acctcgtgga 180

aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccgt cccgagggaa ggacctgggc gcagcccggg 240

tacccttggc ccctctatgg caatgagggc ttggggtggg caggatggct cctgtcaccc 300

cgaggctccc ggcctagttg gggcccctcg gacccccggc gtaggtcgcg taatttggcg 360

gtggacttcg tacccgttga gtccatggag actactatgc ggtctccggt tttcacagac 420

aactcgtccc ccccggctgt accgcagact ttccaagtgg cccacttaca cgctcctact 480

ggcagcggca agagcaccaa ggtgccggcc gcatatgcgg cccaagggta caaggtgctc 540

gtcttgaacc catccgttgc cgccacctta ggttttggag cgtatatgtc caaggcacat 600

ggtaccgaac ctaacatcag aactggggtg aggaccatca ccacgggcgc ccccatcacg 660

tactccacct acggcaagtt ccttgccgac ggtggttgct ccgggggcgc ctatgatatc 720

ataatatgtg atgagtgcca ctcaactgac tcgactacca ttttgggcat cggcacggtc 780

ttggaccaag cgaagacggt tggagcgcgg cttgtcgtgc tcgctaccgc cactcctccg 840

gggtcagtca ccgtgccaca ccccaacatc gaggaggtgg ccttgtccaa tactggggag 900

attcccttct atggcaaagc catccccatc gagaccatca aggggggaag gcatctcatt 960

ttctgccatt ccaagaagaa gtgtgacgag ctcgccgcaa agctgtcagg cctcggactc 1020

aacgctgtgg cgtattaccg gggtcttgat gtgtccgtca taccgactag tggagacgtc 1080

gttgtcgtgg caacagacgc tctaatgact ggctttaccg gcgactttga ctcagtgatc 1140

gactgtaaca catgtgtc 1158

<210> 2

<211> 386

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly

20 25 30

Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala

35 40 45

Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro

50 55 60

Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly

65 70 75 80

Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp

85 90 95

Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Ser Asp Pro

100 105 110

Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Ala Val Asp Phe Val Pro Val Glu Ser

115 120 125

Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro

130 135 140

Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr

145 150 155 160

Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly

165 170 175

Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe

180 185 190

Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Thr Glu Pro Asn Ile Arg Thr

195 200 205

Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr

210 215 220

Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile

225 230 235 240

Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly

245 250 255

Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Lys Thr Val Gly Ala Arg Leu Val

260 265 270

Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro

275 280 285

Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr

290 295 300

Gly Lys Ala Ile Pro Ile Glu Thr Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile

305 310 315 320

Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser

325 330 335

Gly Leu Gly Leu Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser

340 345 350

Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu

355 360 365

Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr

370 375 380

Cys Val

385

<210> 3

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcccacatca cagcagaaac ggctaagcgt aggctggcca gggggtcccc cccctctttg 60

gccagctctt cagctagcca gttgtctgcg ccttctctga aggcgacatg cactacccat 120

catgactcca cggacgctga cctcatcgag gccaacctcc tgtggcggca ggagatgggc 180

gggaatatca cccgcgtgga gtcagagaat aaggtagtaa ttctggactc tttcgacccg 240

cttcgagcgg aggaggatga tagggaggta tccgttgcag cggagatcct gcggaaaacc 300

aggaaatacc ccccagcgct gcccgtatgg gcgcgcccgg actacaaccc tccattacta 360

gagtcctggg gtggtagtgg tggtagtatg agcacgaatc ctaaacctca aagaaaaacc 420

aaacgtaaca ccaaccgccg cccacaggac gtcaagttcc cgggcggtgg tcagatcgtt 480

ggtggagttt acctgttgcc gcgcaggggc cccaggttgg gtgtgcgcgc gactaggaag 540

acttccgagc ggtcacaacc tcgtggaagg cgacaaccta tccccaaggc tcgccgtccc 600

gagggaagga cctgggcgca gcccgggtac ccttggcccc tctatggcaa tgagggcttg 660

gggtgggcag gatggctcct gtcaccccga ggctcccggc ctagttgggg cccctcggac 720

ccccggcgta ggtcgcgtaa tttg 744

<210> 4

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser

1 5 10 15

Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser

20 25 30

Leu Lys Ala Thr Cys Thr Thr His His Asp Ser Thr Asp Ala Asp Leu

35 40 45

Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr

50 55 60

Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro

65 70 75 80

Leu Arg Ala Glu Glu Asp Asp Arg Glu Val Ser Val Ala Ala Glu Ile

85 90 95

Leu Arg Lys Thr Arg Lys Tyr Pro Pro Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg

100 105 110

Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr

130 135 140

Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val

145 150 155 160

Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg

165 170 175

Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln

180 185 190

Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro

195 200 205

Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly

210 215 220

Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Ser Asp

225 230 235 240

Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu

245

<210> 5

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagcacga atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60

gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120

ggccccaggt tgggtgtgcg cgcgactagg aagacttccg agcggtcaca acctcgtgga 180

aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccgt cccgagggaa ggacctgggc gcagcccggg 240

tacccttggc ccctctatgg caatgagggc ttggggtggg caggatggct cctgtcaccc 300

cgaggctccc ggcctagttg gggcccctcg gacccccggc gtaggtcgcg taatttg 357

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly

20 25 30

Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala

35 40 45

Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro

50 55 60

Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly

65 70 75 80

Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp

85 90 95

Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Ser Asp Pro

100 105 110

Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu

115

<210> 7

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggtggact tcgtacccgt tgagtccatg gagactacta tgcggtctcc ggttttcaca 60

gacaactcgt cccccccggc tgtaccgcag actttccaag tggcccactt acacgctcct 120

actggcagcg gcaagagcac caaggtgccg gccgcatatg cggcccaagg gtacaaggtg 180

ctcgtcttga acccatccgt tgccgccacc ttaggttttg gagcgtatat gtccaaggca 240

catggtaccg aacctaacat cagaactggg gtgaggacca tcaccacggg cgcccccatc 300

acgtactcca cctacggcaa gttccttgcc gacggtggtt gctccggggg cgcctatgat 360

atcataatat gtgatgagtg ccactcaact gactcgacta ccattttggg catcggcacg 420

gtcttggacc aagcgaagac ggttggagcg cggcttgtcg tgctcgctac cgccactcct 480

ccggggtcag tcaccgtgcc acaccccaac atcgaggagg tggccttgtc caatactggg 540

gagattccct tctatggcaa agccatcccc atcgagacca tcaagggggg aaggcatctc 600

attttctgcc attccaagaa gaagtgtgac gagctcgccg caaagctgtc aggcctcgga 660

ctcaacgctg tggcgtatta ccggggtctt gatgtgtccg tcataccgac tagtggagac 720

gtcgttgtcg tggcaacaga cgctctaatg actggcttta ccggcgactt tgactcagtg 780

atcgactgta acacatgtgt c 801

<210> 8

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Val Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser

1 5 10 15

Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe

20 25 30

Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys

35 40 45

Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn

50 55 60

Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala

65 70 75 80

His Gly Thr Glu Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr

85 90 95

Gly Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly

100 105 110

Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His

115 120 125

Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln

130 135 140

Ala Lys Thr Val Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro

145 150 155 160

Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu

165 170 175

Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Ile Glu

180 185 190

Thr Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys

195 200 205

Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser Gly Leu Gly Leu Asn Ala Val

210 215 220

Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp

225 230 235 240

Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp

245 250 255

Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val

260 265

<210> 9

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcccacatca cagcagaaac ggctaagcgt aggctggcca gggggtcccc cccctctttg 60

gccagctctt cagctagcca gttgtctgcg ccttctctga aggcgacatg cactacccat 120

catgactcca cggacgctga cctcatcgag gccaacctcc tgtggcggca ggagatgggc 180

gggaatatca cccgcgtgga gtcagagaat aaggtagtaa ttctggactc tttcgacccg 240

cttcgagcgg aggaggatga tagggaggta tccgttgcag cggagatcct gcggaaaacc 300

aggaaatacc ccccagcgct gcccgtatgg gcgcgcccgg actacaaccc tccattacta 360

gagtcctgg 369

<210> 10

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser

1 5 10 15

Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser

20 25 30

Leu Lys Ala Thr Cys Thr Thr His His Asp Ser Thr Asp Ala Asp Leu

35 40 45

Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr

50 55 60

Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro

65 70 75 80

Leu Arg Ala Glu Glu Asp Asp Arg Glu Val Ser Val Ala Ala Glu Ile

85 90 95

Leu Arg Lys Thr Arg Lys Tyr Pro Pro Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg

100 105 110

Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp

115 120

Claims

1.一种包含重组融合抗原A和B的丙型肝炎病毒抗体检测试剂，其特征在于：所述重组融合抗原A包含的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述重组融合抗原B包含的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO:4所示；

所述检测试剂由R1试剂、R2试剂、R3试剂和R4试剂组成；其中：

R1试剂的缓冲液组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 2.56g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.436g/L、NaCl 9g/L、甘露醇20～50g/L、酪蛋白10～30g/L、果绿色素0.1～0.5g/L、TritonX-100 0.1～0.5ml/L、PC-300 0.5～2ml/L、丙三醇5～20ml/L；HRP-鼠抗人IgG 0.5～10mg/L；

R2试剂的缓冲液组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 5.8g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.592g/L、NaCl 9g/L、Tween-20 0.1～0.5ml/L、丙三醇5～20ml/L、PC-300 0.5～2ml/L；

R3试剂的缓冲液组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 2.56g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 0.436g/L、NaCl 9g/L、甘露醇10～50g/L、酪蛋白5～20g/L、牛血清白蛋白0.1～1g/L、PVP-40 1～5g/L、PVA0.05～0.5g/L、Tween-20 5～20ml/L、TritonX-100 0.05～0.2ml/L、丙三醇5～20ml/L、PC-300 0.5～2ml/L、链霉亲和素0.1g/L、包被重组融合抗原的磁珠0.2～1g/L；所述包被重组融合抗原的磁珠中，重组融合抗原A和重组融合抗原B按照一定比例混合后再进行包被磁珠，其中重组融合抗原A的包被量为10～50μg/mg磁珠，重组融合抗原B的包被量为0.1～10μg/mg磁珠；

R4试剂的缓冲液由A体系和B体系组成，其中A体系为：鲁米诺0.8～1.2g/L、对碘苯酚0.1～1g/L、肉桂酸1～2g/L、EDTA 5～10g/L、聚乙二醇600 1～2.5g/L、Tween-20 5～20ml/L、PC-300 0.5～2ml、Tris 0.1～0.2mol/L、pH8.0～9.0；B体系为：H₂O₂ 4～10mol/L，Tris0.1～0.2mol/L、pH8.0～9.0；使用时A体系和B体积等体积加入。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述重组融合抗原A为经过超声和加高岭土处理的Biotin-重组融合抗原A。

3.权利要求1或2所述的检测试剂在检测丙型肝炎病毒抗体中的应用。

4.用于权利要求1所述检测试剂的重组融合抗原A，其特征在于：所述重组融合抗原A包含的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求4所述的重组融合抗原A，其特征在于：所述重组融合抗原A是由Core抗原的1-119aa与NS3抗原的1192-1458aa构成；其中重组融合抗原A的N端为Core抗原1-119aa，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；C端为NS3抗原1192-1458aa，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

6.根据权利要求4或5所述的重组融合抗原A，其特征在于：所述重组融合抗原A的表达系统为pTYB系列载体。

7.由权利要求4～6所述重组融合抗原A构成的重组质粒及基因工程菌株。

8.用于权利要求1所述检测试剂的重组融合抗原B，其特征在于：所述重组融合抗原B包含的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

9.根据权利要求8所述的重组融合抗原B，其特征在于：所述重组融合抗原B是由NS5抗原2180-2302aa与Core1-119aa组成构成；其中重组融合抗原B的N端为NS5抗原2180-2302aa，核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；重组融合抗原B的C端为Core抗原1-119aa，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

10.根据权利要求8或9所述的重组融合抗原B，其特征在于：所述重组融合抗原B的表达系统为pET系列载体或pGEX系列载体。

11.由权利要求8～10所述重组融合抗原B构成的重组质粒及基因工程菌株。