CN104697988A - 检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒及其检测方法和应用，属于体外诊断检测技术领域。该试剂盒包括以下组分：1)磁性微球体系：包括有通过第一桥连物组合间接连接的磁性微球和HCV抗原；2)标记物体系：包括有通过第二桥连物组合间接连接的HCV融合抗原和标记示踪物；所述HCV抗原和HCV融合抗原与HCV抗体在不同的位点结合。该试剂盒和检测方法，利用化学发光免疫的方法来检测丙型肝炎病毒抗体，具有灵敏度高，特异性好和检测范围宽的优点。

Description

检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的传染病，可通过血液、吸毒、母婴及性传播等。有研究表明，20％～50％的HCV感染者会发生自发性病毒清除，但是仍然有50％～80％的感染者会持续感染，其中85％进展为慢性肝炎，10～30年后，部分慢性丙肝患者(尤其年龄较长患者)发展为肝硬化，2～10年后，可能发展为肝细胞癌。由于与慢性乙肝相比，丙肝更隐蔽，潜伏期为2～26周；症状更不明显，高达75％的感染者无任何症状，因此很容易被忽视，在中国，丙肝漏报率高达52％。

目前为止，尚未研制成功可以预防丙肝的疫苗，因此防治丙肝只有早诊断、早治疗，防治病情的进一步恶化，否则将会使自身病情加重、影响身体健康，甚至可能将病毒传染给其他人。因此有必要开发出一种性能较好的诊断方法，能有效地在早期就将该疾病诊断出来，及时治疗，减少因丙肝带来的健康和财产的损失。

目前HCV感染的诊断实验室化验方法有以下几种：1.HCV抗体检测。2.定量检测HCV RNA的分子试验(包括RT-PCR，TMA，bDNA)。3.HCV基因分型技术。而由于技术限制及高昂的诊断费用，后面两种方法未能普及。

HCV抗体检测中常用方法有：酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、胶体金法、化学发光法等。其中，ELISA检测丙肝抗体的方法已得到了大量的推广，该方法具有很多优点，但在检测的灵敏度，稳定性等方面还有待进一步提高。全自动化学发光免疫分析是在酶免疫分析基础上结合了高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，与其他方法相比，这种方法有许多独特的优点，首先它用顺磁性微粒作为固相载体，由于颗粒体积小，表面积大，扩大了反应面积，大大提高了检测灵敏度；其次由于使用全自动仪器及配套试剂，使人为因素减至最低，提高了方法的稳定性和结果的重复性，同时也使得批内差异与批间差异都较小。与放射免疫法(RIA)相比，化学发光免疫法除具有高灵敏度、高精确度、高可靠性等优点外，还具有如下优点：a.无放射性污染，稳定性好；b.特异性高；c.试剂可随用随取，测定方便迅速，可作为急诊检测项目。根据大量的实验结果以及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及其发展前景来看，该方法逐渐成为取代放射性免疫分析和酶免疫分析的首选。

但是，目前尚无灵敏度和特异性较高的化学发光免疫诊断试剂，可以作为ELISA试剂和其他试剂的替代品，用于丙肝的诊断。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，该试剂盒采用化学发光法，具有灵敏度高，特异性好和检测范围宽的优点。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，包括以下组分：

1)磁性微球体系：包括有通过第一桥连物组合间接连接的磁性微球和HCV抗原；

2)标记物体系：包括有通过第二桥连物组合间接连接的HCV融合抗原和标记示踪物；

所述HCV抗原和HCV融合抗原与HCV抗体在不同的位点结合。

由于病毒性传染病的抗原往往较大，难以实现体外完整蛋白的表达，即使能够实现完整蛋白的表达，由于种属差异，分子量比较大的蛋白往往不能正确折叠，后期的复性困难，而制约检测试剂的开发。因此利用基因工程技术，将多个优势表面抗原肽基因融合表达成为抗原研究的方向。可利用HCV融合抗原制备灵敏度高、特异性好和检测范围宽的化学发光免疫诊断试剂。

在其中一个实施例中，所述第一桥连物组合为融合蛋白抗体和标签蛋白，或链霉亲和素和生物素，或抗FITC(异硫氰酸荧光素)抗体和FITC(异硫氰酸荧光素)中的任意一对；

所述第二桥连物组合为融合蛋白抗体和标签蛋白，或链霉亲和素和生物素，或抗FITC抗体和FITC中的任意一对；

且第一桥连物组合和第二桥连物组合选用不同的桥连物组合，所述融合蛋白抗体为针对标签蛋白的抗体。

上述方案中，当第二桥连物组合选取融合蛋白抗体和标签蛋白对时，HCV融合抗原中嵌有的标签蛋白与针对该标签蛋白的抗体有很高的特异性的结合，所以采用具有标签蛋白的HCV融合抗原和融合蛋白抗体相配合的方式可以极大地提高试剂盒的检测灵敏度。而亲和素(或链霉亲和素)是由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，可以同时与4个生物素相结合，起到放大的效果，因此，当第二桥连物组合选取链霉亲和素和生物素时，能够提高试剂检测灵敏度。

在其中一个实施例中，所述第一桥连物组合为链霉亲和素和生物素，所述第二桥连物组合为融合蛋白抗体和标签蛋白。即磁性微球体系包括有包被链霉亲和素的磁性微球，和标记生物素的HCV抗原；标记物体系包括有标记示踪物标记的融合蛋白抗体，和具有标签蛋白的HCV融合抗原。该优选方案采用了具有标签蛋白的HCV融合抗原和融合蛋白抗体相配合的方式，以及利用链霉亲和素和生物素的搭桥作用将磁性微球和HCV抗原连接，提高了检测灵敏度，使检测结果准确可靠。

适用于本发明的磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。优选的是，本发明使用的磁球，是将纳米级的Fe₂O₃或Fe₃O₄磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特别限制，可根据需要进行选择。

本发明所使用的磁性微球应能满足直径为0.1-5μm，磁性微球还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH₂。

在其中一个实施例中，所述磁性微球为Fe₂O₃或Fe₃O₄磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并具有0.1-5μm的粒径，并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。

在上述技术方案中，磁性微球体系中，磁性微球的工作浓度优选0.1-2mg/ml，链霉亲和素的工作浓度优选1-20μg/ml，生物素的工作浓度优选5-1000ng/ml，HCV抗原的工作浓度优选25-5000ng/ml，FITC的工作浓度优选0.5-50μg/ml，抗FITC抗体的工作浓度优选1-20μg/ml；标记物体系中，标记示踪物工作浓度优选5-500ng/ml，融合蛋白抗体的工作浓度优选50-5000ng/ml，具有标签蛋白的HCV融合抗原的工作浓度可以为50-5000ng/ml。可根据具体情况调整。将各试剂成分的浓度设定在此范围内，既能避免由于浓度过低导致光信号低，影响试剂检测的灵敏度；又能避免浓度过高所造成的成本浪费。

同样可以理解的，该试剂盒中的各组分均含有牛血清白蛋白(BSA)和防腐剂，BSA的浓度为0.01-0.5g/ml，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或两种以上混合物。

上述标签蛋白(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。

在其中一个实施例中，所述标签蛋白选自：多聚精氨酸－标签蛋白(Arg-tag)、多聚组氨酸-标签蛋白(His-tag)、Flag-标签蛋白、Strep-标签蛋白(Strep-tag)、c-myc-标签蛋白、S-标签蛋白、葡萄球菌蛋白A-标签蛋白、麦芽糖结合蛋白-标签蛋白、硫氧化还原蛋白-标签蛋白。通过上述标签蛋白的运用，便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化，并且该标签蛋白还可以作为抗原，被标签蛋白的抗体识别，从而可以通过标签蛋白及其抗体的搭桥作用将标记物和HCV融合抗原连接。

在其中一个实施例中，所述标签蛋白为Flag-标签蛋白。Flag-标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，具有不会与其它蛋白相互作用且不影响其它蛋白功能、性质等优点。并且还可以直接通过Flag-标签蛋白进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且具有纯化效率高的特点。

在其中一个实施例中，所述HCV融合抗原是HCV Core(2-120aa)、NS3(1192-1457aa)、NS4(1694-1735aa)，NS4(1859-1931aa)，NS5(2212-2313aa)基因片段串联融合表达得到的。该HCV融合抗原的基因片段为上述基因片段，通过6个氨基酸的柔性链接子进行串联融合表达得到。该HCV融合抗原具有特异性好，检出率高的优点。

上述标记示踪物包括以下几种：1、化学发光免疫分析使用的能够直接发光的标记物，如鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物、吖啶酯等；2、化学发光酶免疫分析使用的配合相应底物可以发光的标记物，如碱性磷酸酶或过氧化物酶等。

在其中一个实施例中，所述标记示踪物为发光标记物，选自：金刚烷，鲁米诺及其衍生物，异鲁米诺及其衍生物，吖啶酯。优选N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)，与上述发光标记物配合的氧化系统包括H₂O₂-微过氧化物酶、H₂O₂-过氧化氢酶、H₂O₂-乳过氧化物酶、H₂O₂-次氯血红素、H₂O₂-氯化血红素、次氯酸盐-CoCl₂、过硫酸盐、过氧化钾、高碘酸钠、H₂O₂-K₃Fe(CN)₆、黄嘌呤-次黄嘌呤氧化酶、叔丁醇钾中的至少一种。

上述发光标记物是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，该化合物能够经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM)。

在其中一个实施例中，所述标记示踪物为化学发光催化剂，选自：碱性磷酸酶，过氧化物酶。使用时，配合相应的化学发光底物即可发光被定量检测，所述化学发光底物包括NaOH和H₂O₂，还包括金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物中的至少一种，优选N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。

在其中一个实施例中，该试剂盒还包括以下组分：

3)校准品溶液：包括HCV抗体浓度为0.1AU/ml-100AU/ml的校准品溶液和浓度为200AU/ml-1000AU/ml的校准品溶液。

本发明还公开了一种检测丙型肝炎病毒抗体的方法，采用上述的试剂盒，包括以下步骤：

1)一次加样：将待测样本与磁性微球体系混合，温育，形成复合物；

2)清洗：外加磁场将上述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗；

3)二次加样：将标记物体系加入上述沉淀中，混合均匀，温育，使上述沉淀与标记物体系反应，形成双抗夹心复合物；

4)检测：外加磁场将上述双抗夹心复合物沉淀，去除上清液，清洗后，加入发光底物，检测发出的相对光强度，计算得到HCV抗体的含量。

本发明还公开了一种上述的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒在化学发光分析仪中的应用。

将该检测试剂盒与化学发光分析仪配合使用，实现了自动化检测，避免了人为因素可能导致的实验误差，并提高了分析效率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，利用化学发光免疫的方法来检测丙型肝炎病毒抗体，具有灵敏度高，特异性好和检测范围宽的优点。并且本发明中采用了具有标签蛋白的HCV融合抗原和融合蛋白抗体相配合的方式，以及磁性微球体系使用链霉亲和素和生物素，或FITC和抗FITC抗体桥连的方式能够极大的提高该HCV抗体检测试剂盒的灵敏度。

本发明的一种检测丙型肝炎病毒抗体的方法，采用上述的试剂盒，以化学发光法免疫法检测丙型肝炎病毒抗体，具有灵敏度高，特异性好和检测范围宽的优点。

本发明的一种上述的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒在化学发光平台上的应用，通过将该检测试剂盒与化学发光平台配合使用，实现了自动化检测，避免了人为因素可能导致的实验误差，并提高了分析效率。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步的说明，但并不对本发明造成任何限制。

以下实施例中：

HCV抗体，来源：美国Meridian公司。

HCV抗原，来源：美国RA Biosources公司。

融合蛋白抗体，来源：美国Abbkine公司。

具有Flag-标签蛋白的HCV融合抗原，来源：美国Abbkine公司。

磁性微球，来源：德国Merck公司生产的纳米磁性微球。

ABEI：为深圳新产业生物医学股份有限公司生产。

生物素、链霉亲和素：均购自美国Biosources公司。

实施例1

一种检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，包括以下组分：

1)磁性微球体系：

包被链霉亲和素的磁性微球溶液，其中：磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml，链霉亲和素的工作浓度：10μg/ml。

标记生物素的HCV抗原溶液，其中:生物素的工作浓度：500ng/ml，HCV抗原的工作浓度：50ng/ml。

2)标记物体系：

N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)标记的融合蛋白抗体溶液，其中：ABEI工作浓度：200ng/ml，融合蛋白抗体的工作浓度：2000ng/ml。

具有Flag-标签蛋白的HCV融合抗原溶液，其中：具有Flag-标签蛋白的HCV融合抗原的工作浓度：500ng/ml。

所述融合蛋白抗体为所述具有标签蛋白的HCV融合抗原中标签蛋白的抗体，并且所述HCV抗原和HCV融合抗原与HCV抗体在不同的位点结合。

3)校准品溶液：HCV抗体浓度为5.622AU/ml的低点校准品溶液和浓度为421.258AU/ml的高点校准品溶液。

上述各组分均含有牛血清白蛋白(BSA)和防腐剂，BSA的浓度为0.1g/ml，防腐剂主要成分为NaN₃，浓度为0.2g/ml。

本实施例的检测HCV抗体的试剂盒的制备方法中，除以下试剂外，其余均按照常规方法制备。

一、磁性微球体系的制备

1、包被链霉亲和素的磁性微球的制备

1)配制pH3.6的醋酸缓冲液：

称取2.55g三水合乙酸钠用4500ml纯化水溶解后再加入14ml乙酸混匀后，定容至5000ml，即得pH为3.6的醋酸缓冲液。

2)磁性微球连接(磁性微球连接CMC法)：

往磁性微球中加入包被体积等量的上述pH3.6醋酸缓冲液悬浮，其中磁性微球浓度为20mg/mL，再加入浓度为10mg/ml的1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)，按1mg磁性微球加入12μg链霉亲和素(SA)，组成反应体系。将上述反应体系放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时。

3)磁性微球的清洗：

磁珠清洗液的配制：在0.05M pH7.4的PBS中溶入BSA，使BSA浓度为0.5g/ml，即为磁珠清洗液。

清洗：将反应好的反应体系倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入5倍体积的磁珠清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液。

4)磁性微球的悬浮：

磁珠悬浮液的配制:在0.05M pH7.4的PBS中溶入BSA和甲基纤维素(MC)，使BSA的浓度为0.5g/ml，MC的浓度为0.4g/ml，即为磁珠悬浮液。

清洗完毕后，加入包被体积的磁珠悬浮液，悬浮浓度为20mg/ml，即得到包被链霉亲和素的磁性微球溶液。

2、标记生物素的HCV抗原的制备

1)0.1mol/L的碳酸缓冲液(透析液)的配制：在5000ml烧杯中加入Na₂CO₃14.31g，NaHCO₃26.46g，加水定容至4500ml，即得0.1mol/L的碳酸缓冲液(透析液)。上述配制好的透析液置于磁力搅拌器上备用。

2)选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸，取1mg HCV抗原用透析液调整到1ml，放入透析液中，室温搅拌透析2小时。将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素与HCV抗原的摩尔比为20:1的比例将二者混合，37℃反应2h；再将反应后的液体用0.1mol/L PBS于4℃透析24小时，即制成标记生物素的HCV抗原溶液。

3)以G-25凝胶柱纯化上述反应得到的标记生物素的HCV抗原。

二、标记物体系的制备

1、具有Flag-标签蛋白的HCV融合抗原的制备。

1)HCV融合抗原的选择。

本实施例中选用的HCV重组融合抗原，其基因片段为HCV Core(2-120aa)、NS3(1192-1457aa)、NS4(1694-1735aa)，NS4(1859-1931aa)，NS5(2212-2313aa)基因片段，通过6个氨基酸的柔性链接子进行串联，进行融合表达。

2)标签蛋白的选择：

3)具有Flag-标签蛋白的HCV融合抗原的制备：

步骤1.将克隆得到的丙肝病毒基因和报告基因片段亚克隆到带有标签蛋白基因的真核表达载体的多克隆位点处。

步骤2.将重组质粒转染入哺乳动物细胞株进行表达，并利用标签蛋白抗体纯化得到报告基因蛋白和抗原的融合蛋白。

2、ABEI标记的融合蛋白抗体的制备。

和上述标记生物素的HCV抗原的制备方法相同，仅是将其中的HCV抗原替换为融合蛋白抗体，生物素替换为ABEI即可。

采用本实施例的试剂盒检测HCV抗体的方法，包括以下步骤：

1)一次加样：将20μl待测样本、高、低浓度校准品分别加入到反应杯中，然后再加入40μl包被链霉亲和素的磁性微球溶液，40μl标记生物素的HCV抗原，混匀，37℃温浴10min，使待测样本中的HCV抗体和包被链霉亲和素的磁性微球及标记生物素的HCV抗原反应，形成复合物。

2)清洗：外加磁场将上述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗3次；

3)二次加样：将40μl具有标签蛋白的HCV融合抗原溶液和100μl ABEI标记的融合蛋白抗体溶液加入上述沉淀中，混合均匀，温育，使上述沉淀与标记物体系反应，形成双抗夹心复合物；

4)检测：外加磁场将上述双抗夹心复合物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗后，加入发光底物(NaOH，H₂O₂)，检测发出的相对光强度，通过计算得到HCV抗体的含量。

对比例1

一种检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：

1)磁性微球体系：包被HCV抗原的磁性微球溶液。

其中：磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml，HCV抗原的工作浓度：10μg/ml。

本实施例的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒的制备方法，参照实施例1中的制备方法，除以下步骤外，其余均与实施例1中的方法相同。

一、磁性微球体系的制备。

1、包被HCV抗原的磁性微球溶液的制备。

和上述实施例1中包被链霉亲和素的磁性微球溶液的制备方法相同，仅是将其中的链霉亲和素替换为HCV抗原即可。

本实施例的检测丙型肝炎病毒抗体的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：

1)一次加样：将20μl待测样本、高、低浓度校准品分别加入到反应杯中，然后再加入40μl包被HCV抗原的磁性微球溶液，混匀，37℃温浴10min，使待测样本中的HCV抗体和包被HCV抗原的磁性微球反应，形成复合物。

对比例2

一种检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：

2)标记物体系：标记ABEI的HCV融合抗原。

其中：ABEI的工作浓度：200ng/ml，HCV融合抗原的工作浓度：2000ng/ml。

本实施例的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒的制备方法，参照实施例1中的制备方法，除以下步骤外，其余均与实施例1中的方法相同。

二、标记物体系的制备

1、标记ABEI的HCV融合抗原的制备。

和上述标记生物素的HCV抗原的制备方法相同，仅是将其中的HCV抗原替换为HCV融合抗原，生物素替换为ABEI即可。

本实施例的检测丙型肝炎病毒抗体的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：

3)二次加样：将100μl标记ABEI的HCV融合抗原溶液加入上述沉淀中，混合均匀，温育，使上述沉淀与标记物体系反应，形成双抗夹心复合物。

实验例

采用上述实施例和对比例中的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒及其检测方法进行实验对比。

测试样本包括：采购自中国药品生物制品检定所的抗HCV试剂国家标准品(批号：901)，以及从深圳某医院收集到的114例乙肝临床标本(经雅培anti-HCV酶免试剂检测)。使用深圳市新产业生物医学工程股份有限公司研发生产的Maglumi 2000全自动化学发光分析仪检测，结果如下。

表1、国家标准品测定结果

HCV抗体测试试剂国家标准品的检测要求是：阴性国家参考品(N1-N30)结果符合率达到≥29/30；阳性国家参考品(P1-P30)结果符合率达到≥29/30；灵敏度参考品中L1、L2检测阳性，L3检测可阴可阳，L4检测阴性。

从上述结果中可以看出，本发明实施例1的试剂盒及其检测方法，检出阴性国家参考品符合率达到30/30；阳性国家参考品结果符合率达到30/30；灵敏度参考品中L1、L2检测阳性，L3检测可阴可阳，L4检测阴性，即实施例1试剂盒测定结果完全符合HCV抗体测试试剂国家标准品的要求。

而对比例1的检测结果显示，阴性国家参考品出现三例假阳性，结果符合率只有27/30(出现N6、N18和N13三例假阳性)；阳性国家参考品出现一例假阴性，结果符合率29/30(出现P30假阴性)；而灵敏度参考品符合要求。其中阴性参考品的检测结果不符合国家标准品的要求。

对比例2的检测结果显示，阴性国家参考品出现两例假阳性，结果符合率只有28/30(出现N8和N18两例假阳性)；同样，阳性国家参考品出现两例假阴性，结果符合率只有28/30(出现P4和P30两例假阴性)；灵敏度参考品符合要求，但从浓度可以看出L4已经处于临界值附近，与L3区分不明显。不符合国家标准品的要求。

表2、114例丙肝临床标本检测数据

从上述结果中可以看出，本发明实施例1的试剂盒及其检测方法，除了80号样本处在阴阳性临界值附近，检测结果与雅培方法检测的结果不一致外，其他113例标本阴阳性都和雅培一致，表明实施例1试剂盒方案可很好的用于HCV抗体的检测。

而对比例1的试剂盒及其检测方法，当样本在阴阳性临界附近检测误差较大，导致大量阴性样本出现假阳性，上述样本共检测出现了10例与雅培方法检测的结果对不上的情况，其中6、12、32、50、67、80、84、107号检测假阳性，73、92号检测假阴性。

从上述结果中还可以看出，对比例2的试剂盒及其检测方法，当样本在阴阳性临界附近检测误差较大，导致出现假阳性和假阳性，表现为试剂灵敏度不够。上述样本共检测出现了9例与雅培对不上的情况，其中12、32、50、80、84、107号检测假阳性，53、73、92号检测假阴性。该对比例2的灵敏度明显低于实施例1，易出现较多假阴性和假阳性结果，可能出现误诊。

本发明的试剂盒提供了一种改良的双抗原夹心法检测HCV抗体的方法，利用融合抗原、标签蛋白等技术方法，提高了试剂的检测灵敏度，使检测结果更加准确可靠，另外还采用了生物素、链霉亲和素的结合特性，进一步提高了HCVIgG抗体的检测灵敏度。用实施例1的试剂盒做国家定性参考品阴阳性符合率100％，与雅培试剂盒对比符合率＞99％，该试剂盒可以用于HCV抗体的筛查和检测。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

1)磁性微球体系：包括有通过第一桥连物组合间接连接的磁性微球和HCV抗原；

2)标记物体系：包括有通过第二桥连物组合间接连接的HCV融合抗原和标记示踪物；

所述HCV抗原和HCV融合抗原与HCV抗体在不同的位点结合。

2.根据权利要求1所述的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述第一桥连物组合为融合蛋白抗体和标签蛋白，或链霉亲和素和生物素，或抗FITC抗体和FITC中的任意一对；

所述第二桥连物组合为融合蛋白抗体和标签蛋白，或链霉亲和素和标签蛋白，或抗FITC抗体和FITC中的任意一对；

且第一桥连物组合和第二桥连物组合选用不同的桥连物组合，所述融合蛋白抗体为针对标签蛋白的抗体。

3.根据权利要求2所述的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述第一桥连物组合为链霉亲和素和生物素，所述第二桥连物组合为融合蛋白抗体和标签蛋白。

4.根据权利要求2或3所述的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述标签蛋白选自：多聚精氨酸－标签蛋白、多聚组氨酸-标签蛋白、Flag-标签蛋白、Strep-标签蛋白、c-myc-标签蛋白、S-标签蛋白、葡萄球菌蛋白A-标签蛋白、麦芽糖结合蛋白-标签蛋白、硫氧化还原蛋白-标签蛋白。

5.根据权利要求4所述的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述标签蛋白为Flag-标签蛋白。

6.根据权利要求1-3任一项所述的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述HCV融合抗原是HCV Core、NS3、NS4，NS5基因片段串联融合表达得到的。

7.根据权利要求1所述的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物为发光标记物，选自：金刚烷，鲁米诺及其衍生物，异鲁米诺及其衍生物，吖啶酯。

8.根据权利要求1所述的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物为化学发光催化剂，选自：碱性磷酸酶，过氧化物酶。

9.一种检测丙型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：

1)一次加样：将待测样本与磁性微球体系混合，温育，形成复合物；

2)清洗：外加磁场将上述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗；

3)二次加样：将标记物体系加入上述沉淀中，混合均匀，温育，使上述沉淀与标记物体系反应，形成双抗夹心复合物；

4)检测：外加磁场将上述双抗夹心复合物沉淀，去除上清液，清洗后，加入发光底物，检测发出的相对光强度，计算得到HCV抗体的含量。

10.权利要求1-8任一项所述的检测丙型肝炎病毒抗体的试剂盒在化学发光分析仪中的应用。