CN109541231A - 一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒及其制备方法，由如下组分组成：链霉亲和素磁性微球、阴性对照品、阳性对照品、与镧系元素结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液、增强液和RFID卡。本方法基于磁性微球与时间分辨免疫分析法相结合，既克服了酶标板物理性吸附反应时间较长，检测结果较慢的弊端，大大缩短反应时间，同时也具备时间分辨检测技术准确性高、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、检测稳定且方便的优点。磁性微球包被相应的抗原或抗体，因磁性微球立体的特性，大大增加免疫反应的接触表面积，从而大大缩短检测时间，30分钟内即可检出结果。

Description

一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒及其制备方法，具体涉及一种基于磁性微球与时间分辨免疫分析法相结合检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒的制备方法。

背景技术

丙型肝炎病毒（HCV）呈球形颗粒，外有脂质外壳、囊膜和棘突结构，内有由核心蛋白和核酸组成的核衣壳。HCV基因组5’非编码区保守，在设计用于诊断HCV感染的PCR引物时，此区段为首选。另外非结构蛋白区（NS2、NS3、NS4、NS5）中NS3基因区编码螺旋酶和蛋白酶，NS3蛋白具有强免疫原性，可刺激机体产生抗体，在临床诊断上有重要价值。抗-HCV不是保护性抗体，是HCV感染标志。大多数HCV感染都在急性期及慢性感染早期症状隐匿，慢性化率为60%至85%，其中又以年长者、男性局多。

目前丙肝病毒血清学检测方法有酶联免疫（ELISA）、胶体金法、化学发光（CLIA）、电化学发光（ECL）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）等。ELISA作为半定量检测方法是现应用最广的检测方法，但其灵敏度、线性宽度范围均未达到较高水平，难以适应市场发展的需求。胶体金法与ELISA均有相同的缺点。而CLIA及ECL虽灵敏度高但均存在检测设备造价高昂，而相应的标记物研发门槛高，短时期内国内均会受制于人的缺点同样也限制了在国内的推广。时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）灵敏度能达到CLIA一致的水平，不仅检测设备造价较低，并且相关技术在国内已相当成熟。传统时间分辨检测，仍以空白酶标板的物理吸附为主，检测过程耗时较长。缩短反应时间，降低检测成本，提高检测灵敏度及线性范围，将具有不错的市场前景。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服现有技术及相关技术检测费用高昂的缺点，提供一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒，及所述试剂盒的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒，由如下组分组成：链霉亲和素（SA）磁性微球、阴性对照品、阳性对照品、与镧系元素结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、浓缩洗液（清洗液）和增强液、RFID卡。

优选地，所述的与镧系元素结合的IgG1抗体标记物，其中的镧系元素与IgG1融合蛋白抗体是通过中间螯合剂结合，镧系元素包括但不限于铕（EU）、钐（Sm）, 螯合剂包括但不限于异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-DTTA、P-异硫氰基苄基-DTTA、二乙烯三胺五醋酸氨基苯基-EDTA。

优选地，所述的生物素抗原是由HCV重组抗原（含NS3、CORE）与HCV生物素化抗原（含NS3、CORE）按一定稀释比例混合后制成。

本发明还提供一种采用上述试剂盒检测抗-HCV的方法,所述方法包括如下步骤：

（1）用分析缓冲液将IgG1抗体标记物稀释至工作液；

（2）用纯化水将浓缩洗液稀释至工作液；

（3）将稀释好的工作浓度的SA磁性微球混匀后加于反应杯内；

（4）将待检样本或阴性对照品、阳性对照品加于上述反应杯内；

（5）将生物素化抗原加入反应杯内，室温下孵育；

（6）孵育后使用（2）中的清洗工作液反应杯加磁洗涤；

（7）洗涤后，加入（1）中标记物工作液，室温下孵育；

（8）孵育后使用（2）中的清洗工作液反应杯加磁洗涤；

（9）洗涤后，加入增强液孵育；

（10） 孵育结束后，进行对应波长的荧光采集检测并分析。

优选地，本发明为了更进一步减少人工操作步骤，配合公司自研自产的SmartTRF全系列免疫荧光检测设备，将本发明检测方法的相应参数、操作步骤均悉数拷贝至RFID卡中。实际操作过程中，只需要将RFID卡与上述免疫荧光检测设备适配即可全自动完成上述实验的操作步骤。RFID（Radio Frequency Identification）技术，又称无线射频识别，是一种通信技术，可通过无线电讯号识别特定目标并读写相关数据，而无需识别系统与特定目标之间建立机械或光学接触。

本发明还提供一种检测丙型肝炎抗体试剂盒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

（1）清洗、缓冲置换SA磁珠后，稀释至工作浓度制成SA磁性微球；

（2）滴配HCV重组抗原及HCV生物化抗原，两者按最佳滴配浓度混合制成试剂盒生物化抗原；

（3）制备阴性对照品、阳性对照品；

（4）制备铕标记的IgG1抗体标记物；

（5）制备分析缓冲液、浓缩洗液和增强液；

（6）将各组份分别分装至相应的存储容器中；

（7）RFID卡复制拷贝；

（8）喷码、贴标签；

（9）组装成成品试剂盒。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：

本方法基于磁性微球与时间分辨免疫分析法相结合，既克服了酶标板物理性吸附反应时间较长，检测结果较慢的弊端，大大缩短反应时间，同时也具备时间分辨检测技术准确性高、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、检测稳定且方便的优点。磁性微球包被相应的抗原或抗体，因磁性微球立体的特性，大大增加免疫反应的接触表面积，从而大大缩短检测时间，30分钟内即可检出结果。另外，由于磁性微球的流体特性，不再受限于传统酶标板的框架限制，在任意的反应杯及小试管内即可完成检测，同时也能减小检测仪器设备的体积及成本以满足二、三线城市的全自动化检测需求，亦能如酶标板、化学反光检测一样进行大通量检测，满足一线城市的全自动化检测需求。

附图说明

图1为采用本发明所述检测试剂盒用来储存链霉亲和素（SA）磁性微球、铕标记结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液和增强液的试剂条的俯视示意图。

图2为采用本发明所述检测试剂盒用来储存链霉亲和素（SA）磁性微球、铕标记结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液和增强液的试剂条的立体结构标意图示意图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，更好地说明本发明的技术特点、技术方案。以下实施例并不对本发明造成任何限制。以下实施例中SA磁性微球来源于JSR公司；铕标记购于芬兰Wallac 公司；丙型肝炎病毒抗体国家参考品由中国食品药品检定研究院提供；对照试剂盒为雅培丙肝病毒抗体检测试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)。

实施例1

一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒，所述试剂盒包括：链霉亲和素（SA）磁性微球、阴性对照品、阳性对照品、与镧系元素结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、浓缩洗液和增强液、RFID卡。

本发明还提供上述检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

（1）制备链霉亲和素（SA）磁性微球：将3μm的链霉亲和素（SA）磁性微球使用25mM PH7.0的Tris-HCL缓冲液在磁力架上反复清洗4次后高浓度保存待用；其他组分制备完成后，将高浓度链霉亲和素（SA）磁性微球按不同使用浓度进行滴配，最终磁性微球使用浓度为100μg/ml，加液量为50μL/孔。

（2）制备铕标记的IgG1抗体标记物： 将IgG1抗体置于截留分子量为10000超滤离心管中，10000rpm离心7～10min，弃去滤液。再加入0.05M PH 9.6碳酸盐缓冲液10000rpm离心7～10min反复2～3次，将离心管滤膜反转3000rpm离心6min，收集最后浓缩的200μL溶液。并将其与事先用碳酸盐缓冲液溶好的DTTA-EU³⁺混合，IgG1抗体与铕质量比为3：1，2～8℃振荡混匀48±2小时。标记溶液经0.05M PH 7.8 Tris-Hcl缓冲液平衡的Sephadex^TM G-50凝胶柱（⌀1.0*50cm）层析纯化，在A280监测收集第一峰。将收集到的铕标记的IgG1抗体用0.2%0.05M PH 7.8 Tris-Hcl缓冲液稀释至最佳浓度的1/20倍，分装至1.0mL/瓶。

（3）制备生物素化抗原：将HCV重组抗原及HCV生物化抗原用25mM PH7.0的Tris-HCL缓冲液分别按1/1500、1/1000稀释混合即成生物素化抗原。

（4）制备阴性对照品、阳性对照品：使用5% BSA、0.5% Tween-20，0.02%Proclin300，pH 7.8 0.02M Tris-HCl缓冲液将丙肝抗体强阳性血清制成阴性对照品、阳性对照品。

（5）制备分析缓冲液：含有Tween-20、Proclin300、EDTA、BSA、Tris-HCl缓冲液，分装至30～40mL/瓶。

（6）制备浓缩洗液：含有Tween-20、Proclin300、Tris-Hcl缓冲液，分装至30～40mL/瓶。

（7）制备增强液：含有乙酸钠、β-NTA、TOPO 、冰乙酸、无水乙醇、Triton X-100，分装至30～40mL/瓶。

（8）制备RFID卡：将空白RFID卡按本发明本实施例中检测方法进行相关参数设置；

（9）喷码、贴标签，组装试剂盒。

本发明还提供上述检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒的检测方法，所述方法具体操作如下：

（1）试剂准备

试剂盒于室温放置，恢复至室温；

将铕标记的IgG1抗体标记物使用分析缓冲液稀释20倍至工作液，混匀待用；

清洗液:将浓缩洗液按1：25加入纯化水稀释至工作清洗液；

实验前直立轻晃SA磁性微球，混匀待用；

（2）实验操作

吸取50μL混匀的SA磁性微球加入反应杯内；

向每个反应杯内加入待测样本或阴性对照品、阳性对照品100μL；

再向每个反应杯内加入100μL生物素化抗原；

室温静置孵育15分钟；

孵育结束后，使用清洗液第一次加磁清洗4次；

清洗后，去磁，向各反应杯内加入100μL铕标记的IgG1抗体标记物，静置孵育15分钟；

孵育结束后，使用清洗液第二次加磁清洗4次；

清洗后，去磁，向各反应杯中加入100μL增强液，室温静置孵育3分钟；在30分钟内完成荧光采集并进行数据分析。

本实施例中，实际的实验操作步骤及相关参数，已事先拷贝至配套的RFID卡内，实验操作过程只需要按试剂准备过程准备好后，将RFID卡与全自动设备适配即可完成从信息读取、加样到检测的全过程。

实施例2

一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒，与实施例1中所述检测试剂盒基本相同，不同在于：

（1）所述检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒组份包括：试剂条、阴性对照品、阳性对照品、RFID卡。

（2）本实施例中，所述检测试剂盒中试剂条是由链霉亲和素（SA）磁性微球、铕标记结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液和增强液分装至试剂条对应的孔内封膜后而成。其中清洗液为实施例1中浓缩洗加纯化水稀释25倍而成；其余各组分与实施例1中相同。

本实施例中，正如图1、图2所示，所述检测试剂盒中试剂条各孔位功能描述如下：

试剂条从左到右依次排列，名称依次为第1～13个孔。第1、2孔均为测试孔，第3、4孔为荧光标记孔，第5孔为分析缓冲液孔、第6、7孔为清洗液孔，第8、9为样本稀释液孔，第12为增强液孔，第10、11、13为预备孔。第1与2孔均为存放磁性微球进行免疫反应的反应孔，最大可存放液体体积为800μL；第3、4孔可以从整个试剂条上拆卸成为独立的组分，便于对荧光标记物进行分装储存。第3、4、5孔可以存放最大液体体积为400μL；第6、7孔可以存放最大液体体积为3000μL；第8~12孔可以存放最大液体体积为400μL；第13孔可以存放最大液体体积为600μL。

本实施例中，所述检测试剂盒中的试剂条是按如下方式进行封膜后制成：

将300μL链霉亲和素（SA）磁性微球、50μL铕标记的IgG1抗体标记物、150μL生物素化抗原、200μL分析缓冲液、3000μL清洗液、200μL增强液分别分装至试剂条的第1、3、10、5、6、12孔内，封膜喷码后即制成所述试剂条。

本发明还提供上述检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒的制备方法，按上述方式制得试剂条后，与阴性对照品、阳性对照品、RFID卡即可组成试剂盒。除了各组份分装方式及储存容器不一样外，其余与实施例1中相同。

本发明还提供上述检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒的检测方法，只需要将上述试剂条轻晃混匀后插入SmartTRF系列设备的试剂条卡槽内，设备读取RFID卡相关信息即可全自动完成检测过程。RFID卡的相关信息参数及检测步骤与实施例1中相同。

实施例3

本发明所述检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒的性能评价：

按实施例中制备的试剂盒及检测方法，检测采购自中国食品药品检定研究院的丙型肝炎病毒抗体国家参考品，以及收集来源于医院雅培Architect i2000检测丙肝抗体的临床样本262例。

实施例1、实施例2检测丙型肝炎病毒抗体国家参考品，结果如下：

（1）阴性参考品符合率：30份阴性国家参考品N1～N30,实施例1、实施例2检测符合率（-/-）均为30/30；

（2）阳性参考品符合率：30份阳性国家参考品P1～P30,实施例1、实施例2检测符合率（+/+）均为30/30；

（3）精密性：精密性参考品J重复检测10次，实施例1、实施例2检测精密性C.V≤8.4%；

（4）最低检出限：L1、L2检出阳性、L3、L4检出为阴性。

实施例1、实施例2检测雅培抗-HCV 262例临床样本，结果如下：

表1 实施例1临床样本对比

本发明实施例1中所述检测试剂盒检测丙型肝炎病毒抗体与对照试剂阴性样本符合率100%、阳性样本符合率100%。

表2 实施例2临床样本对比

本发明实施例2中所述检测试剂盒检测丙型肝炎病毒抗体与对照试剂阴性样本符合率100%、阳性样本符合率100%。

浓缩洗液（清洗液）在实施例1中指代的是待稀释至工作液的高浓度清洗液；清洗液在实施例2中指代的是不需要任何处理的工作液。

可以理解的，在实施例1中检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒的检测方法及制备方法是为了满足大通量检测目的而发明的，仪器设备体积较大且造价相对较高，为了进一步满足二、三线城市的检测需求，相应的，我们在实施例1的基础上更进一步作了一些检测方法及试剂盒制备方法上的修改，如实施例2中的一样。

可以理解的，本发明在实施例2中与实施例1中的检测方法及制备方法的区别在于，实施例2是将实施例1中的链霉亲和素（SA）磁性微球、铕标记结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液和增强液同时分装进特制的试剂条（如图1、图2所示），因此实施例2中试剂盒的组份仅有试剂条、RFID卡、阴性对照品、阳性对照品。其中RFID卡、阴性对照品、阳性对照品与实施例1中保持一致。

可以理解的，本发明在实施例2中的检测方法是将试剂条插入检测设备后，将相应的RFID卡与设备适配即可，设备全程自动化操作步骤与实施例1保持一致；

可以理解的，本发明在实施例2中的检测试剂盒的制备方法与实施例1中的不同在于，步骤（6）变为“将各组份分别分装至试剂条的相应孔内，分装完后封膜喷码”即可。

Claims (5)

1.一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒，其特征在于由如下组分组成：链霉亲和素磁性微球、阴性对照品、阳性对照品、与镧系元素结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液、增强液和RFID卡。

2.如权利要求1所述的检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述的与镧系元素结合的IgG1抗体标记物，其中的镧系元素与IgG1融合蛋白抗体是通过中间螯合剂结合，镧系元素为铕或钐, 螯合剂为异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-DTTA、P-异硫氰基苄基-DTTA或二乙烯三胺五醋酸氨基苯基-EDTA。

3.如权利要求1所述的检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述的生物素抗原是由HCV重组抗原与HCV生物素化抗原混合后制成。

4.如权利要求1所述的检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述的生物素抗原是将HCV重组抗原及HCV生物化抗原用25mM pH7.0的Tris-HCL缓冲液分别按1/1500、1/1000稀释混合即成生物素化抗原。

5.权利要求1所述的检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）清洗、缓冲置换SA磁珠后，稀释至工作浓度制成链霉亲和素磁性微球；

（2）滴配HCV重组抗原及HCV生物化抗原，混合制成试剂盒生物化抗原；

（3）制备阴性对照品、阳性对照品；

（4）制备铕标记的IgG1抗体标记物；

（5）制备分析缓冲液、浓缩洗液和增强液；

（6）将各组份分别分装至相应的存储容器中；

（7）RFID卡复制拷贝；

（8）喷码、贴标签；

（9）组装成成品试剂盒。