CN101852800A - 半定量检测人全血中他克莫司药物浓度的胶体金试纸条及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明“半定量检测全血中他克莫司药物浓度的胶体金检测试纸条及试剂盒”，属于医学检测领域。其膜反应体系包括胶体金结合垫和检测垫，其特征在于，在胶体金结合垫上包被有胶体金标记的抗他克莫司抗体；检测垫设置有检测线，所述检测线上固定有他克莫司-载体蛋白偶联物。检测时无需进行有机溶剂沉淀、离心等步骤，可以简便快速、准确有效的对全血中的他克莫司进行半定量检测。

Description

半定量检测人全血中他克莫司药物浓度的胶体金试纸条及检测方法

技术领域

发明涉及人全血中他克莫司药物的检测，特别涉及一种半定量检测人全血中他克莫司药物浓度的胶体金试纸条。

背景技术

他克莫司(tacrolimus)是大环内酯类免疫抑制剂，1989年首次应用于临床。他克莫司与其结合蛋白FKBP12相结合，而在细胞内蓄积产生效用。FKBP12-他克莫司等复合物会专一性地结合以及抑制钙调神经磷酸酶的活性，阻断T细胞激活过程，同时还有他克莫司所不具备的T-细胞依赖性抗体的生成，阻断细胞因子的转录，呈现双重的免疫抑制作用，其免疫抑制作用较他克莫司强100倍，其临床上主要用于肝肾等器官移植后的免疫排斥抑制治疗。他克莫司的个体吸收率和清除率差别很大，且用药剂量与血药浓度之间缺乏紧密的相关性，在高血浓度时有一定的毒性，主要是神经毒性、肾毒性和糖代谢异常等。由于其治疗窗窄，给临床治疗增加了相当的难度，因此需要反复测定期血中浓度以调整用药剂量。

大部分(75％～80％)的他克莫司药物连结在红细胞上，导致全血药物浓度较血浆药物浓度为高，两者不相关，全血和血浆中药物浓度的分布与多种因素有关。药代动力学研究表明，他克莫司全血而非血浆浓度能够更好的表明他克莫司的药代动力学特征，故血液检测中以该药品以全血药物浓度为依据。

目前测定全血FK506浓度的方法主要有，受体结合法、高效液相-质普测定法(HPLC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)、微粒子酶联免疫测定法(MELA)以及化学发光微粒子免疫法等。其中受体结合法主要用于药物研究；液质联用是目前最准确、灵敏度最高、具有特异性的FK506浓度分析方法，最低检测限为0.2μg/L，但其稳定性不是很好且成本较高，需要大型设备仪器，仍主要用于科研领域；微粒子酶联免疫测定法(MELA)以及化学发光微粒子免疫法(CMIA)是目前最常用的检测方法，这两种方法检测结果准确，操作相对简便，但是试剂目前均需要进口，价格高昂，而且必须配以昂贵的专有设备使用，因此只适用于一些大型医院使用。目前所用的ELISA试剂盒也依赖进口，价格昂贵。使用过程反应时间较长，需要对样品进行酶消化、震荡等处理，使用不是很方便。

基于以上情况，目前仅有一些大型医疗机构可以进行他克莫司药物浓度的检测，远离大城市的患者往往需要长途跋涉到达医院或是通过邮寄标本的方式才能进行此项测试，费时费力，而且不能得到及时的检测。即使在大型医院，由于使用大型机器成本的问题，往往也是积攒够一定数量样品后，才进行检测，检测往往被延误，以至于医生不能即使指导病人用药。因此市场急切的需要一种快捷简单、价格低廉、不依赖任何仪器设备，同时又能准备、灵敏的检测他克莫司浓度范围的手段，这一手段可以供所有医疗机构甚至患者自己使用，为患者提供血药浓度范围的基本信息，为是否需要进行下一步精确检测提供依据。

以胶体金试纸条技术为代表的快速膜检测技术作为一种稳定和实用的技术适合在多样情况下使用，这类胶体金检测试纸主要包括一层膜反应体系，如图1所示，膜反应体系由胶体金结合垫、硝酸纤维素膜检测区以及吸水膜组成，待测样品与胶体结合垫上的胶体金结合形成胶体金标记复合物，在纤维毛吸作用下泳动到检测区，并途经检测区的检测线上包被或固定的检测底物，如待测样品中存在与检测底物识别的靶标物质，则胶体金标记复合物将被截获聚集在检测区使检测线显示颜色，即检测呈阳性，如果没有靶标物质，则胶体金标记复合物不会在检测线聚集，因而不会显色，即为阴性。在过去的十年里使用该技术制备的标记物作为检测系统中的指示试剂使用在检测敏感症、传染病、环境污染物、毒品、心梗标志物、早孕以及兽医等领域。随着快速诊断技术进步使胶体金结合物的灵敏度得到提高，在大多数快速诊断分析中，检测下限达到1ng/ml。如果抗体优质，可以低到10pg/ml。随着技术的发展，检测灵敏度将可能提高10-100倍。最初大多数的胶体金检测试纸条仅用于定性检测，只能用于检测临床样本中是否含有超过检测浓度的特定生物成分存在。然而在临床使用中，有很多检测室需要定量的。由于灵敏度和特异性的提升以及其他辅助技术的发展，用以胶体金试纸条技术为代表的快速膜检测技术进行定量或是半定量检测已经成为可能。这样的检测包括三种形式，第一种形式是，简单根据测试结果信号在视觉上的对比，提供半定量结果，可分为阴性、弱阳性、中阳性和强阳性。第二种类型，在检测区域设计多条检测线，每条检测线设计成只结合已知一定量的分析物，当分析物过量或不足量时，分析物将会和下一条检测线结合，这样会在测试区产生一个温度计式的条带梯度，因此可以根据检测结果中出现检测线的多少，判断样品中被测物的浓度范围。在第三种测试类型中，测试样品所产生的信号由一个小型的、便携式的分析仪读取，并由分析仪将有色的测试线转换为数字信号，从而根据信号的强弱判断被测物的量。

另外，他克莫司的全血样品的前处理是他克莫司检测中的一个重要问题，如前所述，他克莫司在血液中主要和红细胞上的FK结合蛋白结合，因此在他克莫司血液浓度检测前，必须对全血样本进行处理，使红细胞破裂，他克莫司与其绑定蛋白分离。由于他克莫司水溶性较差，目前常用有机溶剂如甲醇、DMSO裂解沉淀法，酶消化法来提取他克莫司，这些方法都需要使用离心机对样品进行高速离心以除去沉淀蛋白，这使得他克莫司不能直接在自动化平台上检测，而需要前处理操作。同时这一前处理方式有很多缺点，如所用有机溶剂往往有毒性，操作需谨慎，同时这些有机溶剂易于挥发，如果在样品前处理完成后不能及时检测，结果将有较大变化等等。为了实现他克莫司检测的完全自动化，同时克服有机溶剂提取前处理法的缺点，科学家已经找到一些无需有机溶剂沉淀和离心的方法。在美国专利7186518中，作者合成了一个他克莫司的衍生物，该化合物能够竞争性的与他克莫司结合蛋白结合，将他克莫司从其结合蛋白中置换出来，但是确不与他克莫司单克隆抗体结合，研究表明雷帕霉素也可以起到这样的作用。因此作者首先将全血样品用超声波进行破碎，然后在样品中加入含一定浓度的他克莫司衍生物的提取液，混合均匀，样品即可用于检测，结果显示此法的结果优于有机溶剂提取法。在美国专利2007/0087396中，作者用分别用非离子去垢剂如Triton X100作为红细胞裂解剂，胆酸盐作为提取剂来处理样品，处理过的样品可以直接用于他克莫司检测而无需其他任何处理。这两项技术使得使用自动化平台全过程检测他克莫司成为可能，同时也为他克莫司的快速半定量检测提供了样品处理的方法。

目前为止，没有见到报道高效便捷地半定量检测全血中他克莫司药物浓度的方法，也没有结合竞争性免疫结合技术与胶体金检测技术对全血中他克莫司药物浓度进行半定量检测方面的报道。

发明内容

本发明根据上述领域的空白，提供一种快速半定量检测全血中他克莫司药物浓度的胶体金检测试纸条。

半定量检测全血中他克莫司药物浓度的胶体金检测试纸条，其膜反应体系包括胶体金结合垫和检测垫，其特征在于，在胶体金结合垫上包被有胶体金标记的抗他克莫司抗体；检测垫设置有检测线，所述检测线上固定有他克莫司-载体蛋白偶联物。

所述检测线为多条且间隔。

所述抗他克莫司抗体为单克隆抗体。

所述检测垫上还设置有质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠抗体IgM。

所述膜反应层贴附在一层PVC板上。

半定量检测全血中他克莫司药物浓度的试剂盒，包括外盒体和盒内支架，其特征在于：所述盒内支架上设置有试纸条凹槽，试纸条凹槽内放置所述胶体金检测试纸条。

所述盒内支架上还设置有若干试剂管孔，所述试剂管孔内放置有试剂管，试剂管中分别盛装的试剂包括全血处理液。

所述盒内支架上还设置有取血针存放孔和采血器存放槽，所述取血针存放孔内放置取血针，采血器存放槽放置有采血器。

半定量检测全血中他克莫司药物浓度的检测方法，步骤如下：

(1)待测血前处理得到待测样品

(2)将待测样品滴加在上述胶体金检测试纸条上。

所述前处理采用全血处理液，其成分如下：4mg/ml EDTA-2K，1％Triton X100，0.5％脱氧胆酸钠，0.05％Proclin300的pH值7.4的PBS溶液；所述前处理指将待测血加入到所述全血处理液中，剧烈震荡1～10分钟使细胞破碎。

本发明提供一种半定量检测全血中他克莫司药物浓度的胶体金检测试纸条。其原理是用胶体金标记抗他克莫司抗体，将该胶体金标记物包被在胶体金结合垫上；在检测垫的检测线上包被一定量的他克莫司-载体蛋白偶联物，当将待检测全血加到胶体金结合垫后，全血中的他克莫司与胶体金标记的抗体结合，该胶体金标记复合物由于不再有结合位点，泳动到检测线时不会被检测线5上他克莫司-载体蛋白偶联物的他克莫司所捕获而聚集在检测线上，如果待测全血中他克莫司药物浓度不足于完全结合胶体金标的抗体时，剩余的胶体金标抗体泳动到检测线将会与检测线上的他克莫司-载体蛋白偶联物的他克莫司结合，并在检测线聚集胶体金而显色；制作该试纸条时，通过定量胶体金垫上包被的抗体量，即只能够结合一定量的他克莫司，通过限制滴加的检测全血的体积，当检测线不显色时，说明滴加的一定体积的全血中他克莫司量是胶体金结合垫上抗体的结合位点饱和，这时，需通过对全血进行稀释，直至检测线显色，说明待测血液中他克莫司的浓度在检测线所代表的浓度乘上稀释倍数所得的浓度以下，即对待测全血进行半定量检测。本发明实现了便捷、经济、快速半定量检测全血中他克莫司的目的。

本发明进一步优选在检测垫上设置多条间隔检测线。该优选设计方案使得半定量检测更为精确。由距离胶体金垫的距离由近到远，检测线显示阳性时所代表的他克莫司浓度依次减少。

本发明中包被在胶体金垫上的抗体可以是单克隆抗体也可以使多克隆抗体，本发明优选单克隆抗体，以尽量减低检测过程中交叉反应的干扰，提高检测准确性。

本发明胶体金检测试纸条，进一步优选在检测垫上设置质控线，所述质控线上包被羊抗鼠抗体IgM.作为监测试纸条有效性以及试剂污染的依据。

本发明胶体金检测试纸条可以做成将膜反应体系贴附在双面胶一类的载体上，以减少耗材和成本，又不影响检测结果；而本发明还提供一种将膜反应体系贴附在尺寸相应的PVC条上的方案，以适用于某些情况下的检测需要。

本发明根据检测需要，还提供包括上述试纸条的试剂盒，试剂盒盒体内设置盒内支架，支架上设置对应于试纸条存放槽，还可以包括检测过程中需要的其它试剂和器械的存放槽。以进一步提高本发明试纸条的实用性和便捷性。

本发明优选盒内支架上设置的其它存放槽为适合于放置试剂管的试剂管槽以及取血针存放孔和取血器存放槽。这样试剂盒内可以稳妥安全地放置检测中必备的试剂盒器械。只要购买了本试剂盒就可以在任何地方进行检测。

本发明还提供了检测方法，检测方法中提供了优选的全血处理液配方及处理方式。本领域技术人员也可以采用其他更复杂的方式进行全血处理一样能现实本发明。而本发明提供的检测方法则仅仅是最简便和高效的一种。

综合而言，用本发明进行他克莫司检测时无需进行有机溶剂沉淀、离心等步骤，可以简便快速、准确有效的对全血中的他克莫司进行半定量，具有高特异性、高灵敏度、高通量、操作快速简便、费用低廉、不需要任何仪器、适合患者家庭使用等特点

附图说明

图1.现有技术中胶体金试纸条的一般结构示意图

图2.本发明胶体金检测试纸条膜层反应体系结构示意图

图3.本发明试剂盒俯视结构示意图

图4a本发明检测结果解读示意图--表示他克莫司浓度小于5ng/ml

图4b本发明检测结果解读示意图--表示他克莫司浓度在5-10ng/ml之间

图4c.本发明检测结果解读示意图--表示他克莫司浓度在10-20ng/ml之间

图4d.本发明检测结果解读示意图--他克莫司浓度大于20ng/ml，应稀释后再测量

其中1-胶体金结合垫，2-检测垫，3-质控线，4-PVC板，5-检测线，6-胶体金标记的抗他克莫司抗体，7-盒内支架，8-试纸条凹槽，9-试剂管孔，10-取血针存放孔，11-采血器存放槽。

具体实施方式

如图2所示，本发明半定量检测全血中他克莫司药物浓度的胶体金检测试纸条，其膜反应体系包括胶体金结合垫1和检测垫2，其特征在于，在胶体金结合垫1上包被有胶体金标记的抗他克莫司抗体6；检测垫设置有检测线5，所述检测线5上固定有他克莫司-载体蛋白偶联物。运用了竞争性免疫学反应及层析技术：将胶体金标记的抗他克莫司抗体6包被在胶体金结合垫1上；在检测垫2的检测线5上包被一定量的他克莫司-载体蛋白偶联物的他克莫司，当将一定体积的待检测全血加到胶体金结合垫1后，全血中的他克莫司与胶体金垫上的胶体金标记的抗他克莫司抗体6结合，如果待测全血中他克莫司药物浓度不足于完全结合胶体金标记的抗他克莫司抗体6时，剩余的胶体金标抗体泳动到检测线将会与检测线上的他克莫司-载体蛋白偶联物的他克莫司结合，并在检测线聚集胶体金而显色，这时说明，全血中他克莫司的浓度低于胶体金结合垫上胶体金标抗体所代表的他克莫司的浓度。如果胶体金结合垫1上面不再有剩余的闲置的胶体金标记的抗他克莫司抗体6，则结合了待测全血中他克莫司的胶体金标记的抗他克莫司抗体6的复合物泳动到检测线5时不会聚集在检测线上，因此检测线不会显色，这时说明，全血中他克莫司的浓度高于胶体金结合垫的结合能力所代表的他克莫司浓度；这时，如需进一步精确他克莫司浓度，需通过对全血进行稀释后在检测直至检测线5显色，说明待测血液中他克莫司的浓度在检测线5所代表的浓度乘上稀释倍数所得的浓度与胶体金结合垫结合能力所代表的浓度之间，即实现了对待测全血进行半定量检测的目的。

本发明进一步优选在检测垫2上设置多条间隔检测线5。该优选设计方案使得半定量检测更为精确和简便。由距离胶体金垫结合垫1的距离由近到远，检测线显示阳性时所代表的他克莫司浓度依次减少，可根据检测线5显色的多少和位置，判断待测血液中他克莫司的浓度范围。

本发明中包被在胶体金结合垫1上的抗体可以是单克隆抗体也可以使多克隆抗体，本发明优选单克隆抗体，以尽量减低检测过程中交叉反应的干扰，提高检测准确性。

本发明胶体金检测试纸条，进一步优选在检测垫2上设置质控线3，所述质控线3上包被羊抗鼠抗体IgM。以作为监测试纸条有效性以及试剂污染的依据。

本发明胶体金检测试纸条可以做成将膜反应体系贴附在双面胶一类的载体上，以减少耗材和成本，又不影响检测结果；而本发明提供一种将膜反应体系贴附在尺寸相应的PVC板4上的方案，以适用于某些情况下的检测需要。

本发明还提供半定量检测全血中他克莫司药物浓度的试剂盒，包括外盒体和盒内支架7，其特征在于：所述盒内支架7上设置有试纸条凹槽8，试纸条凹槽8内放置所述胶体金检测试纸条。本发明提供的试剂盒，盒内支架上7设置对应于试纸条凹槽之外，还可以包括检测过程中需要的其它试剂和器械的存放槽。以进一步提高本发明试纸条的实用性和便捷性。

本发明优选所述盒内支架7上还设置有若干试剂管孔9，所述试剂管孔9内放置有试剂管，试剂管中分别盛装的试剂包括全血处理液、稀释液。

本发明优选盒内支架7上设置的其它存放槽还包括取血针存放孔10和取血器存放槽11，取血针存放孔10内放置取血针，采血器存放槽11放置有采血器。这样试剂盒内可以稳妥安全地放置检测中必备的试剂和器械。只要购买了本试剂盒就可以在任何地方进行检测。

制备实验例1.

步骤1.他克莫司活化与载体蛋白偶联

本发明中他克莫司半抗原与载体蛋白的偶联过程参考美国专利US5164495中的方法，简单的说，在三乙胺的存在下，将他克莫司分子与琥珀酸干混合，加入催化剂4-二甲基氨基吡啶，反应后纯化即可得到他克莫司半酯，再经过活化，后与载体蛋白反应即可得到偶联物。

本发明所述他克莫司抗原为他克莫司半抗原与载体蛋白分子的偶联物，载体单位包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白等常见载体蛋白。

具体操作如下：

称取250mg FK506，15mg琥珀酸酐，6mg吡啶(4-dimethylaminopyridine)溶于6.25ml新蒸馏的二氯甲烷。边搅拌边加入42ul三乙胺。室温继续搅拌2小时。以上混合物用二氯甲烷稀释到20ml。分别用等量的0.1当量盐酸、纯化水、饱和的氯化钠各洗一次。在分液漏斗内静止分层，然后过滤收集下层液(二氯甲烷)。所得到的有机相放在无水硫酸镁上干燥，用磁力搅拌器持续搅拌30分钟，然后用砂芯漏斗抽滤以除掉硫酸镁。用旋转蒸发仪浓缩，直至呈轻微黄色泡沫。用少量二氯甲烷重溶并过硅胶色谱柱，二氯甲烷与甲醇按9∶1的比例混合做流动相，收集第一个流出的组分。在旋转蒸发仪上将进行干燥，得到淡黄色FK506半琥珠酸酯。称取35mg FK506半琥珠酸酯，5.4mg N-羟基琥珀酰亚胺和8.8mg N，N-二环己基碳化二亚胺溶于5ml乙酸乙酯，在磁力搅拌器上继续搅拌24小时。6000rpm离心5分钟以除去中的沉淀物。在旋转蒸发仪上干燥中的上清，得到含有活性酯的反应混合物。上述材料无需进一步纯化活性。称取1mg活性酯溶于2.5ml N，N-二甲基甲酰胺。量取0.14ml与0.62ml N，N-二甲基甲酰胺混合并逐滴加入到10ml(含10mg)卵清蛋白中。用磁力搅拌器于室温混合2.5小时，然后加入1ml1.8M Tris。用Sephadex G-25层析纯化。

步骤2.检测垫的制备

用缓冲液将将步骤1得到的他克莫司-卵清蛋白偶联物稀释到三个不同浓度，由高到低分别用点膜仪点在硝酸纤维素膜上，每条线点20ul，线宽1mm，线间距5mm，其包被量代表了能够检测出5ng/ml，10/ml，20ng/ml的量。同样在检测线后用点膜仪点上200ug/ml的羊抗鼠IgM作为质控线，线宽1mm，距最近检测线8mm。用1％BSA进行封闭，37℃烘干，4℃保存步骤3.胶体金结合垫制备

3.1他克莫司抗体

FK506单克隆抗体mouse monoclonal anti-Tacromilus antibody，IgM，FK1，购于Fitzgerald公司。

3.2他克莫司单克隆抗体-胶体金复合物的制备

用纯化水将1％氯金酸稀释成0.01％，在磁力搅拌器上加热搅拌煮沸，每100ml0.01％氯金酸加入2ml1％柠檬酸三钠，继续煮沸至液体呈红色时停止加热，冷却至室温，加水至原体积。制备好的胶体金有效期一个月。

胶体金标记他克莫司单克隆抗体制备

在磁力搅拌器上用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值8.2，按照1-3ug/ml胶体金加入他克莫司单抗FK506，继续搅拌30min，加入BSA至终浓度1％，静置30min。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用含有0.08％BSA，0.1％吐温20，0.3％PVP300，0.02M硼酸的复溶液，pH9.0洗涤两侧，用复溶液重悬沉淀，4℃备用。

3.3将他克莫司单抗-胶体金结合物结合物稀释到一定溶度，放在加样槽内，将结合物释放垫浸入其中1min，取出后进行真空干燥，即得到胶体金结合垫。

步骤4试纸条组装

在PVC板上依次黏贴吸水垫、检测垫和胶体金结合垫，检测垫需盖住胶体金结合垫。将以上组装好的材料切成3mm宽的小条。加塑料盒，真空包装即得到他克莫司胶体金试纸条。

步骤5全血样品采取、处理液体

美国专利US2007/0087396中，作者分别用非离子去垢剂如Triton X100作为红细胞裂解剂，胆酸盐作为提取剂来处理样品，处理过的样品可以直接用于他克莫司检测而无需其他任何处理。本专利中以此专利为基础，在溶液中同时加入抗凝剂EDTA，这样溶液即具有抗凝、裂解、提取三种功能，将此液体放在小瓶内，采取一定量的指尖血后，迅速放入前述有液体的小瓶内，剧烈震荡，即可得到处理好的检测样品。

样品处理液为含有EDTA抗凝剂、红细胞裂解液以及他克莫司提取液的缓冲液体系，其中EDTA为抗凝作用，Triton X100为红细胞裂解作用，脱氧胆酸钠他克莫司提取作用。其具体为含有4mg/mlEDTA-2K，1％Triton X100，0.5％脱氧胆酸钠，0.05％Proclin300的pH值7.4的PBS溶液。配制完成的液体分装于离心管内，每管0.5ml。样品稀释液与样品处理液相同，当样品中浓度超过检测线时，可以用样品稀释液对样品进行稀释后再次测定。

实验例2检测样品过程

1.1.样品处理

用采血针和定量吸管取指尖血0.5ml，迅速加入到含有样品处理液的离心管内，迅速剧烈震荡5分钟，使红细胞破裂，他克莫司释放出来。

1.2.用试纸条检测

用定量塑料管取处理过的样品120ul滴加在试纸条的样品孔内，开始计时，等待红色条带出现，10分钟内读值，超过20分钟，结果无效。

1.3.结果解释

本试剂采用竞争法，所设计的三个浓度梯度标志线为5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，所得结果解释为如下：

当出现含质控线的四条线时如图4a，说明他克莫司浓度小于5ng/ml。

当出现含质控线的三条线时如图4b，说明他克莫司浓度在5-10ng/ml。

当出现含质控线的二条线时如图4c，说明他克莫司浓度在10-20ng/ml。

当仅出现质控线一条线时如图4d，说明他克莫司浓度大于20ng/ml，应稀释后再测量。

Claims (10)

1.半定量检测全血中他克莫司药物浓度的胶体金检测试纸条，其膜反应体系包括胶体金结合垫和检测垫，其特征在于，在胶体金结合垫上包被有胶体金标记的抗他克莫司抗体；检测垫设置有检测线，所述检测线上固定有他克莫司-载体蛋白偶联物。

2.根据权利要求1所述的半定量检测全血中他克莫司药物浓度的胶体金检测试纸条，其特征在于：所述检测线为多条且间隔。

3.根据权利要求1所述的半定量检测全血中他克莫司药物浓度的胶体金检测试纸条，其特征在于：所述抗他克莫司抗体为单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的半定量检测全血中他克莫司药物浓度的胶体金检测试纸条，其特征在于：所述检测垫上还设置有质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠抗体IgM。

5.根据权利要求1所述的半定量检测全血中他克莫司药物浓度的胶体金检测试纸条，其特征在于：所述膜反应层贴附在一层PVC板上。

6.半定量检测全血中他克莫司药物浓度的试剂盒，包括外盒体和盒内支架，其特征在于：所述盒内支架上设置有试纸条凹槽，试纸条凹槽内放置所述胶体金检测试纸条。

7.根据权利要求6所述的半定量检测全血中他克莫司药物浓度的试剂盒，其特征在于：所述盒内支架上还设置有若干试剂管孔，所述试剂管孔内放置有试剂管，试剂管中分别盛装的试剂包括全血处理液、稀释液。

8.根据权利要求6或7所述的半定量检测全血中他克莫司药物浓度的试剂盒，其特征在于：所述盒内支架上还设置有取血针存放孔和采血器存放槽，所述取血针存放孔内放置有取血针，采血器存放槽放置有采血器。

9.半定量检测全血中他克莫司药物浓度的检测方法，步骤如下：

(1)待测血前处理得到待测样品

(2)将待测样品滴加在权利要求1～5任一所述胶体金检测试纸条上。

10.根据权利要求9所述的检测方法，所述前处理采用全血处理液，其成分如下：4mg/mlEDTA-2K，1％Triton X100，0.5％脱氧胆酸钠，0.05％Proclin300的pH值7.4的PBS溶液；所述前处理指将待测血加入到所述全血处理液中，剧烈震荡1～10分钟使细胞破碎。

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