CN111912988B - 检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用。本发明首先公开了检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条包括PVC背衬及设置在PVC背衬上的依次搭接的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫上含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体，所述反应垫上依次设置相互平行的分别包被不同浓度的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的检测线T1线和检测线T2线及包被羊抗鼠IgG的控制线C线。本发明进一步公开了上述双信号胶体金免疫层析试纸条的制备方法和应用。本发明双信号胶体金免疫层析试纸条能实现游离棉酚的定量检测，速度快，便携，适合现场检测，操作简便，不需要专业技术人员。

Description

检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及棉酚的检测领域。更具体地，涉及检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
棉籽饼粕是一种营养丰富的蛋白质原料，一直作为蛋白质饲料用于畜牧养殖业中，可在一定程度上代替豆粕等常规蛋白质原料，弥补蛋白质饲料资源法的不足。但是有毒物质棉酚的存在限制了棉籽饼粕的大量使用。棉酚(gossypol)，又称棉花毒素，是一种黄色多羟基双萘醛化合物，主要分布在锦葵科植物树棉、草棉或陆地棉根皮、成熟种子、茎秆中色素腺体中。棉酚可分为左旋棉酚[(-)-棉酚]和右旋棉酚[(+)-棉酚]2种光学异构体。(+)-棉酚几乎无活性，而(-)-棉酚表现出更强的药用活性，如抗生育、抗肿瘤、抗病毒和抗菌作用。当棉酚被畜禽大量摄入时，其中含有的游离棉酚会使畜禽出现食欲减退，呼吸困难，受精率下降等症状，并通过食物链的作用，蓄积在肉、蛋、奶等食物中，间接威胁人类健康。
关于测定游离棉酚的方法，目前有纸层析法、薄层层析法、比色法、气相色谱法和近红外方法等。这些方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，远不能适应于棉籽蛋白工业化生产中棉酚的快速准确的检测，严重制约了棉籽蛋白在饲料工业上的利用。
因此，需要提供一种低成本、高通量、高灵敏，且适用于大量样品的快速筛查的检测游离棉酚的方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，以实现对游离棉酚的快速、高通量检测。
本发明的第二个目的在于提供上述双信号胶体金免疫层析试纸条在检测待测样品中游离棉酚的应用。
为达到第一个目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供一种检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条，包括PVC背衬及设置在PVC背衬上的依次搭接的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫上含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体，所述反应垫上从靠近所述结合垫端到靠近所述吸水垫端依次设置相互平行的检测线T1线、检测线T2线和控制线C线，所述检测线T1线和检测线T2线分别包被不同浓度的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物，所述控制线C线包被羊抗鼠IgG。
进一步，所述可识别游离棉酚的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.19682的单克隆细胞株AAB1分泌产生。
进一步，所述游离棉酚半抗原为半游离棉酚，其分子结构式如式I所示：
Figure BDA0002589967310000021
进一步，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)，优选的为牛血清白蛋白(BSA)。
进一步，所述游离棉酚半抗原与载体蛋白的偶联比为1:5-1:20，优选的为1:10。
进一步，所述检测线T1线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.75mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm；所述检测线T2线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.25mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm。
进一步，所述控制线C线包被的羊抗鼠IgG的浓度为0.15mg/mL，羊抗鼠IgG的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm。
进一步，所述结合垫每立方厘米含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的量为0.0375-0.075μg；优选的为0.05μg。
本发明进一步提供了上述检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
样品垫的制备：用含有0.5％BSA的0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS)浸泡玻璃纤维后，37℃烘干0.5-4小时，得到样品垫；
结合垫的制备：将胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体均匀涂抹到玻璃纤维上，37℃烘干4-6小时，得到结合垫；
反应垫的制备：将不同浓度的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物分别包被在硝酸纤维素膜上形成检测线T1线和检测线T2线，将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上作为控制线C线，干燥，得到反应垫；
吸水垫的制备：将吸水纸剪裁，得到吸水垫；
检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的组装：将所述样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，即得到用于检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条。
进一步，所述可识别游离棉酚的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.19682的单克隆细胞株AAB1分泌产生。
进一步，所述结合垫每立方厘米含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的量为0.0375-0.075μg；优选的为0.05μg。
具体的，所述胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原得到胶体金溶液；调胶体金溶液至pH 8.8，搅拌下逐滴加入可识别游离棉酚的单克隆抗体，放置后加入牛血清蛋白，放置后，离心，沉淀物用硼酸盐缓冲液重悬，得到稳定的胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体。
在本发明具体的实施方式中，所述胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原得到胶体金溶液；取10mL胶体金溶液调至pH 8.8，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.2mg/mL的可识别游离棉酚的单克隆抗体1mL，放置30min后加入牛血清蛋白，使蛋白的终浓度为1％，放置1h后，8000r/min离心45min，沉淀物用0.002mol/L、pH 8.8的硼酸盐缓冲液10mL重悬两次，最后用该硼酸盐缓冲液1mL重悬，得到稳定的胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体。
进一步，所述检测线T1线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.75mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm；所述检测线T2线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.25mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm。
进一步，所述控制线C线包被的羊抗鼠IgG的浓度为0.15mg/mL，羊抗鼠IgG的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm。
进一步，所述游离棉酚半抗原为半游离棉酚，其分子结构式如式I所示：
Figure BDA0002589967310000041
进一步，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)，优选的为牛血清白蛋白(BSA)。
进一步，所述游离棉酚半抗原与载体蛋白的偶联比为1:5-1:20，优选的为1:10。
具体的，所述游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的制备方法包括如下步骤：取半游离棉酚溶于甲醇中，与载体蛋白溶液混合，避光搅拌，加入氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，反应得到反应液，透析后得到游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物。
在本发明具体的实施方式中，所述载体蛋白为BSA(牛血清白蛋白)；所述游离棉酚半抗原与BSA偶联物的制备方法包括如下步骤：取5mg半游离棉酚溶于2mL甲醇中，与10mL的5mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)溶液混合，室温下避光搅拌12小时，之后加入50mg氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，反应1小时得到反应液，将反应液装入透析袋中，4℃，PBS溶液透析48小时，-20℃分装保存。
本发明进一步还提供了上述检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条在检测待测样品中游离棉酚的浓度的应用。
本发明利用检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条检测样品中游离棉酚的浓度的方法包括如下步骤：
1)建立标准曲线：
将已知浓度的游离棉酚溶液配制成梯度浓度的样品稀释液，利用双信号胶体金免疫层析试纸条分别对样品稀释液进行检测(即分别滴加到检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，在滴加样品后5-8min读取结果)，预判检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的显色情况，结果判断如下：如果在反应垫上仅有控制线C线一条红线显现或检测线T1线和检测线T2线中任一条和控制线C线红线显现，表示检测结果为阳性；如果在反应垫上控制线C线、检测线T1线和检测线T2线三条红线都显现，表示检测结果为阴性；如果在反应垫上控制线C线红线不显现，则表明试纸条已失效；
当预判处于有效范围时，使用手持式读数仪测定检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的光密度值，以光密度值代入公式(T1+T2)/C作为纵坐标，以样品稀释液中游离棉酚的浓度为横坐标，建立标准曲线；
2)待测样品中游离棉酚的浓度的检测：
利用双信号胶体金免疫层析试纸条对待测样品进行检测(将待测样品滴加到检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，在滴加样品后5-8min读取结果)，根据步骤1)的方法得到待测样品的检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的光密度值，代入公式(T1+T2)/C后通过标准曲线得出待测样品中游离棉酚的浓度；
其中，在公式(T1+T2)/C中，T1代表检测线T1线的光密度值，T2代表检测线T2线的光密度值，C代表控制线C线的光密度值。
进一步，所述待测样品为棉籽。
本发明的有益效果如下：
本发明基于高灵敏度和特异性的可识别游离棉酚的单克隆抗体提供了一种便携、快速、适合进行现场检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条，能实现游离棉酚的定量检测。应用本发明检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条检测速度快，仅需要5-10分钟；便携，适合现场检测；操作简便，不需要专业技术人员。
保藏说明
参据的生物材料(株)：AAB1
建议的分类命名：单克隆细胞株
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年4月23日
保藏号：CGMCC No.19682
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的俯视图，其中，(1)为聚氯乙烯(PVC)背衬、(2)为样品垫、(3)为结合垫、(4)为反应垫、(5)为吸水垫、(6)为检测线T1线、(7)为检测线T2线和(8)为控制线C线。
图2是示出检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条对不同浓度样品稀释液的游离棉酚的检测结果，其中，(1)为游离棉酚的浓度为5000μg/kg的样品稀释液、(2)为游离棉酚的浓度为2000μg/kg的样品稀释液、(3)为游离棉酚的浓度为1000μg/kg的样品稀释液、(4)为游离棉酚的浓度为500μg/kg的样品稀释液、(5)为游离棉酚的浓度为200μg/kg的样品稀释液、(6)为检测线T1线、(7)为游离棉酚的浓度为100μg/kg的样品稀释液和(8)为游离棉酚的浓度为0μg/kg的样品稀释液。
图3是检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条检测游离棉酚浓度的标准曲线。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1一种检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
一种检测游离棉酚的双重信号免疫层析试纸条，如图1所示，包括聚氯乙烯(PVC)背衬1及设置在PVC背衬1上的依次搭接的样品垫2、结合垫3、反应垫4和吸水垫5；PVC背衬1前端的边缘设置样品垫2，所述结合垫3与所述样品垫2部分搭接，所述结合垫3和吸水垫5分别于所述反应垫4两端部分搭接；所述结合垫3上含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体，所述反应垫4从靠近所述结合垫端到靠近所述吸水垫端依次设置包被不同浓度的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的检测线T1线6和检测线T2线7和包被羊抗鼠IgG的控制线C线8。
一种检测游离棉酚的双重信号免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1、样品垫的制备：样品垫的材质为玻璃纤维，用含有0.5％BSA的0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS)浸泡玻璃纤维后，放37℃烘箱中2小时，得到样品垫；
2、结合垫的制备：结合垫的材质为玻璃纤维，将游离棉酚单克隆抗体-胶体金偶联物均匀涂抹到玻璃纤维上，37℃烘箱中5小时，得到结合垫；所述结合垫每立方厘米含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的量为0.05μg。
其中，所述可识别游离棉酚的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.19682的单克隆细胞株AAB1分泌产生。
所述可识别游离棉酚的单克隆抗体的制备与纯化方法如下：
以游离棉酚(分子结构式如式II所示)的类似物(即半游离棉酚，分子结构式如式I所示)作为半抗原，采用牛血清白蛋白(BSA)作为载体蛋白，合成免疫原，混合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠；取合格的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合，经过三次亚克隆和间接竞争ELISA的筛选得到能稳定分泌可识别游离棉酚的单克隆抗体的单克隆细胞株AAB1，将其进行扩大培养后，注射到小鼠体内诱发产生腹水；采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水即得到可识别游离棉酚的单克隆抗体。
Figure BDA0002589967310000071
小鼠免疫期间比较了半游离棉酚作为半抗原和BSA作为载体蛋白合成免疫原(即半游离棉酚-BSA复合物)和游离棉酚作为抗原和BSA作为载体蛋白合成免疫原(即游离棉酚-BSA复合物)分别免疫小鼠的免疫效果。以间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA)检测两种免疫原所免疫小鼠血清，结果如表1所示，结果显示，以半游离棉酚-BSA复合物为免疫原免疫小鼠的血清具有更高的吸光值和对游离棉酚更好的抑制效果，且优势明显。
其中，间接竞争酶联免疫吸附法具体操作步骤如下所示：
1)、游离棉酚-OVA用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的0.1μg/mL作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
2)、用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
3)、将1000μg/kg棉酚标准溶液分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个标准溶液重复3个孔，再每孔加入50μL用磷酸盐缓冲液梯度稀释的小鼠血清，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
4)、每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
5)、每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M H2SO4终止液，450nm测吸光值。
表1：小鼠免疫ic-ELISA结果比较
Figure BDA0002589967310000081
注：1：1号小鼠免疫原为游离棉酚-BSA；2：2号小鼠免疫原为半游离棉酚-BSA。
分泌可识别游离棉酚的单克隆抗体的单克隆细胞株AAB1已于2020年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.19682。
所述胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的制备如下：
(1)胶体金溶液的制备：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原得到20-40nm胶体金颗粒；
(2)胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的制备：取步骤(1)制备的10mL胶体金调至pH 8.8，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.2mg/mL的可识别游离棉酚的单克隆抗体1mL，放置30min后加入牛血清蛋白，使蛋白的终浓度为1％，放置1h后，8000r/min离心45min，沉淀物用0.002mol/L、pH 8.8的硼酸盐缓冲液10mL重悬两次，最后用该硼酸盐缓冲液1mL重悬，得到稳定的胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体。
3、反应垫的制备
所述结合垫的材质为硝酸纤维素膜，将0.75mg/mL、0.25mg/mL的游离棉酚半抗原-BSA偶联物分别包被在硝酸纤维素膜上形成检测线T1线和检测线T2线，其中，每厘米检测线T1线所需游离棉酚半抗原-BSA偶联物的包被量为0.675μg，每厘米检测线T2线所需游离棉酚半抗原-BSA偶联物的包被量为0.225μg；将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上作为控制线C线，每厘米控制线C线所需羊抗鼠IgG的包被量为0.135μg；在37℃烘箱干燥，即得到含有检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的硝酸纤维素膜。
其中，游离棉酚半抗原-BSA偶联物的制备方法如下：
取5mg半游离棉酚溶于2mL甲醇中，与10mL的5mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)溶液混合，室温下避光搅拌12小时，之后加入50mg氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，反应1小时得到反应液，将反应液装入透析袋中，4℃，PBS溶液透析48小时，-20℃分装保存。
4、吸水垫的制备：吸水垫的材质为吸水纸，经裁剪后得到吸水垫。
5、检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的组装
将样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，相邻各垫在连接处交叠，交叠的长度为1-2mm，即得到用于检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条。
实施例2用于检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的可靠性分析
一、标准曲线的建立
1、用甲醇溶解游离棉酚得到浓度为1mg/mL的标准品母液，然后用0.01M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液分别进行梯度稀释作为样品稀释液，得到游离棉酚的浓度分别为0，100,200,500,1000,2000,5000mg/mL的样品稀释液。
2、分别吸取不同浓度的样品稀释液100μL滴加到双信号胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时。
3、在滴加样品后5min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直于观察者正面；
将已知浓度的游离棉酚溶液配制成梯度浓度的样品稀释液，利用双信号胶体金免疫层析试纸条分别对样品稀释液进行检测(即分别滴加到检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，在滴加样品后5-8min读取结果)，预判检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的显色情况，结果判断如下：如果在反应垫上仅有控制线C线一条红线显现或检测线T1线和检测线T2线中任一条和控制线C线红线显现，表示检测结果为阳性；如果在硝酸纤维素膜上控制线C线、检测线T1线和检测线T2线三条红线都显现，表示检测结果为阴性；如果在硝酸纤维素膜上控制线C线红线不显现，则表明试纸条已失效；
当预判处于有效范围时，使用手持式读数仪测定检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的光密度(测定需在2min内完成)，以光密度值代入公式(T1+T2)/C(其中T1代表检测。线T1线的光密度值，T2代表检测线T2线的光密度值，C代表控制线C线的光密度值)作为纵坐标，以样品稀释液中游离棉酚的浓度为横坐标，建立标准曲线。
样品稀释液的检测结果如图2所示，根据以上方法每个样品稀释液重复检测三次，取平均值，得到的标准曲线结果如图3所示，其标准曲线方程为y＝0.0116+1.8342/(1+(x/396)^1.0919)，本发明检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条，其对游离棉酚的检测限为55.6μg/kg，定量限为111.2μg/kg，检测范围为111.2-1409.6μg/kg。
二、游离棉酚浓度的确定
吸取待测样品100μL滴加到双信号胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时。
根据步骤一中3所述的方法得到待测样品的检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的光密度，代入公式(T1+T2)/C(其中T1代表检测线T1线的光密度值，T2代表检测线T2线的光密度值，C代表控制线C线的光密度值)后通过标准曲线(如图3所示)得出待测样品中游离棉酚的浓度。
实施例3回收率的测定
一、样品的前处理：称取5g粉碎的棉籽样品置入250mL具塞三角瓶中，分别添加2ng、10ng和20ng游离棉酚，加入20粒玻璃珠，用移液管准确加入50mL溶剂A，塞紧瓶塞，放入振荡器内振荡1h(每分钟120次左右)。用干燥的定墩滤纸过滤，过滤时在漏斗上加盖一表玻璃以减少溶剂挥发，弃去最初几滴滤液，收集滤液于100mL具塞三角烧瓶中。滤液用含0.01％明胶的PBS稀释4倍后，得到三种添加比例的游离棉酚的样品稀释液。
(2)分别取100μL上述样品稀释液，滴加到实施例1制备的检测游离棉酚的双重信号免疫层析试纸条的样品垫上，加样后开始计时。
(3)在滴加样品后6min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直于观察者正面；
预判检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的显色情况，结果判断如下：如果在反应垫上仅有控制线C线一条红线显现或检测线T1线和检测线T2线中任一条和控制线C线红线显现，表示检测结果为阳性；如果在硝酸纤维素膜上控制线C线、检测线T1线和检测线T2线三条红线都显现，表示检测结果为阴性；如果在硝酸纤维素膜上控制线C线红线不显现，则表明试纸条已失效；
当预判处于有效范围时，使用手持式读数仪测定检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的光密度(测定需在2min内完成)，将光密度值代入公式(T1+T2)/C通过标准曲线(如图3所示)得出得出所测样品中游离棉酚的浓度，每个样品重复检测三次，取平均值，计算在棉籽样品分别添加2ng、10ng和20ng游离棉酚的回收率，结果显示游离棉酚在棉籽样品中的回收率分别为93％，102％，98％。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (8)

1.一种检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条，包括PVC背衬及设置在PVC背衬上的依次搭接的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；其特征在于，所述结合垫上含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体，所述反应垫上从靠近所述结合垫端到靠近所述吸水垫端依次设置相互平行的检测线T1线、检测线T2线和控制线C线，所述检测线T1线和检测线T2线分别包被不同浓度的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物，所述控制线C线包被羊抗鼠IgG；
所述可识别游离棉酚的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.19682的单克隆细胞株AAB1分泌产生；
所述游离棉酚半抗原与载体蛋白的偶联比为1:5-1:20；
所述游离棉酚半抗原为半游离棉酚，其分子结构式如式I所示：
Figure FDA0003582540460000011
2.根据权利要求1所述的双信号胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
3.根据权利要求1所述的双信号胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线T1线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.75mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm；所述检测线T2线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.25mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm。
4.根据权利要求1所述的双信号胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述控制线C线包被的羊抗鼠IgG的浓度为0.15mg/mL，羊抗鼠IgG的包被量为0.5-1μL/cm。
5.检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
结合垫的制备：将胶体金标记的可识别游离棉酚溶液涂抹到玻璃纤维上，干燥，得到结合垫；
反应垫的制备：将不同浓度的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物分别包被在硝酸纤维素膜上形成检测线T1线和检测线T2线，将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上作为控制线C线，干燥，得到反应垫；
检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的组装：将样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，得到检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条。
6.权利要求1-4任一所述的双信号胶体金免疫层析试纸条在检测待测样品中游离棉酚的浓度的应用。
7.检测待测样品中游离棉酚的浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)建立标准曲线：
将已知浓度的游离棉酚溶液配制成梯度浓度的样品稀释液，利用权利要求1-5任一所述的双信号胶体金免疫层析试纸条分别对样品稀释液进行检测，预判检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的显色情况，结果判断如下：如果在反应垫上仅有控制线C线一条红线显现或检测线T1线和检测线T2线中任一条和控制线C线红线显现，表示检测结果为阳性；如果在反应垫上控制线C线、检测线T1线和检测线T2线三条红线都显现，表示检测结果为阴性；如果在反应垫上控制线C线红线不显现，则表明试纸条已失效；
当预判处于有效范围时，测定检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的光密度值，以光密度值代入公式(T1+T2)/C作为纵坐标，以样品稀释液中游离棉酚的浓度为横坐标，建立标准曲线；
2)待测样品中游离棉酚的浓度的检测：
利用权利要求1-4任一所述的双信号胶体金免疫层析试纸条对待测样品进行检测，根据步骤1)的方法得到待测样品的检测线T1线、检测线T2线和控制线C线的光密度值，代入公式(T1+T2)/C后通过标准曲线得出待测样品中游离棉酚的浓度；
其中，在公式(T1+T2)/C中，T1代表检测线T1线的光密度值，T2代表检测线T2线的光密度值，C代表控制线C线的光密度值。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测样品为棉籽。
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