CN207923895U - 半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，包括底板，样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫，其中，检测垫位于底板的中段，金标垫覆盖在检测垫的端部及对应的底板上，样品垫由底板的一端向中段延伸，其端部覆盖在金标垫的端部，吸水垫由底板的另一端向中段延伸，其端部覆盖在检测垫的另一端部；金标垫端部与吸水垫端部之间外露的检测垫自靠近吸水垫端依次设有与底板端面平行的质控线、检测线T3、检测线T2和检测线T1；所述质控线上喷涂羊抗小鼠IgG抗体，检测线T1、检测线T2和检测线T3上分别喷涂有三唑磷半抗原‑鸡卵清蛋白偶联物，所述金标垫上喷涂有胶体金标记的三唑磷单克隆抗体。

Description

半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条

技术领域

本实用新型涉及一种半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，尤其是用于对蔬菜水果中三唑磷农药的快速筛选检测的试纸条，属于金标免疫检测领域。

背景技术

三唑磷农药作为一种中毒广谱有机磷杀虫剂，具有强烈的触杀和胃毒作用，渗透性较强，兼具一定内吸作用的特点，主要用于防治鳞翅目害虫、害螨等，在蔬菜、水果、茶叶等农作物生产中得到广泛的使用。但其残留期长，对环境生态系统及人类健康存在危害风险。日本和欧盟等国家和组织对三唑磷农药在蔬果上的残留制定了严格限量标准，我国也对该农药制定了限量标准（GB 2763-2016）。农业部公告第2032号：2016年12月31日起，禁止三唑磷在蔬菜上使用。

目前报道的三唑磷农药的检测方法，主要包括仪器分析方法、免疫化学等方法。然而，这些检测技术虽然准确性高、专一性强，但样品前处理过程复杂，耗时长，需要昂贵的仪器和专业技术人员，对大批量样品的现场快速检测和监测的响应相对滞后。

胶体金免疫层析技术是20世纪80-90年代发展起来的一种快速简易免疫检测技术，具有快速、简便、易判断等优点。其是将特异性的抗原固定在硝酸纤维素膜上，胶体金标记抗体吸附在金标垫上，当待检样液接触到试纸条金标垫端部，通过毛细作用向上移动，检测物与金标垫上的胶体金标记抗体反应结合，再移动至检测带（固定的免疫原区域），此时固定的免疫原与待检物竞争结合抗体，未与待测物结合的金标抗体与免疫原发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，从而产生颜色变化，当抗体与待测物复合物或游离的抗体到达质控带（固定的第二抗体）时，第二抗体与第一抗体发生特异性结合而被截留在检测带上，胶体金聚集呈现红色，随后可通过肉眼观察检测带的颜色变化，进行阳性判断。目前，针对三唑磷农药的多检测线试纸尚未见报道。

发明内容

本实用新型提供了一种快速诊断及半定量检测三唑磷农药残留的试纸条制备及应用方法，可满足现场快速筛查的要求。

上述发明目的是这样实现的：

一种半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，包括PVC底板，样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫，其特征在于，检测垫的材质为硝酸纤维素膜，其位于PVC底板的中段，金标垫覆盖在检测垫的端部及对应的底板上，样品垫由底板的一端向中段延伸，其端部覆盖在金标垫的端部，吸水垫由底板的另一端向中段延伸，其端部覆盖在检测垫的另一端部；

金标垫端部与吸水垫端部之间外露的检测垫自靠近吸水垫端依次设有与底板端面平行的质控线、检测线T3、检测线T2和检测线T1；所述质控线上喷涂羊抗小鼠IgG抗体，检测线T1、检测线T2和检测线T3上分别喷涂有三唑磷半抗原-鸡卵清蛋白偶联物，所述金标垫上喷涂有纳米金标记的三唑磷单克隆抗体。

进一步，本实用新型所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条中，样品垫和金标垫端部覆盖部分宽度为1 mm，金标垫和检测垫端部覆盖部分宽度为1 mm，检测垫和吸水垫端部覆盖部分为1 mm。

进一步，本实用新型所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条中，所述底板为宽3.5 mm的条形PVC底板；吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫均覆于底板一面并与底板等宽，他们的长度分别为17 mm、25 mm、8 mm和17 mm。

进一步，本实用新型所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条中，检测垫上的质控线距检测垫上沿（靠近吸水垫端上沿）的距离为9 mm，质控线与检测线T3之间的距离为5 mm，与检测线T2之间的距离为8 mm，与检测线T1之间的距离为10 mm。

进一步，本实用新型所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条中，检测线T1、检测线T2和检测线T3上三唑磷半抗原-鸡卵清蛋白偶联物的包被量分别为1.7 μg/mm、1.7 μg/mm和1.5 μg/mm，质控线上羊抗小鼠IgG抗体的包被量为1.0 mg/mm。

进一步，本实用新型所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条中，所述金标垫上所用的纳米金粒径为15 ~ 20 nm；纳米金标记的三唑磷单克隆抗体用量为0.002 μg/mm。

本实用新型中的手持三唑磷农药试纸条的原理如下：

(1) 当待检样品不含或者所含三唑磷浓度小于0.05 μg/mL时，溶液因毛细作用向上迁移溶解金标垫上胶体金标记的三唑磷单抗，并与之形成复合物，多余的三唑磷单抗继续向上迁移到达检测线时，与检测线上的三唑磷包被原结合形成沉积，使T1线显色，过量的金标三唑磷抗体及与三唑磷结合形成的复合物继续向上迁移，依次与T2线和T3线包被的三唑磷包被原结合；同时过量的金标三唑磷抗体及其与三唑磷结合形成的复合物继续向上迁移，与质控线（C线）上的羊抗鼠二抗结合，形成肉眼可见的红色。此时三条检测线与质控线均显示，结果判断为阴性。

(2) 当待检样品中三唑磷浓度在0.05~0.1 μg/mL时，其作用原理同（1），但由于样品液中的三唑磷消耗掉了一部分金标抗体形成复合物，而金标三唑磷抗体优先与T1、T2线包被的三唑磷包被原结合，形成肉眼可见的红色条带，使得到达T3线时金标三唑磷抗体浓度不足以与T3包被的三唑磷包被原反应，此时T3线完全消失。

(3) 当待检样品中三唑磷浓度在0.1~0.2 μg/mL时，其作用原理同（1）、（2），样品液中的三唑磷消耗掉了一部分金标抗体形成复合物，而剩余的金标抗体优先与T1线的包被原结合，形成肉眼可见的红色条带，使得到达T2线与T3线时金标抗体浓度不足以与T2线与T3线的包被原反应，此时T2线与T3线完全消失。

(4) 当待检样品含三唑磷浓度高于0.2 μg/mL时，样品液中的三唑磷将金标垫中的金标三唑磷抗体完全消耗殆尽形成复合物，此时T1、T2、T3线均完全消失，仅C线仍然呈肉眼可见红色。

(5) 当C线没有颜色时，无论 T 线是否有颜色，均视为无效结果。

本实用新型所提供的三唑磷农药免疫层析检测试纸条可适用于快速检测大米蔬菜水果中三唑磷农药残留是否超过MRL值，通过设置三条基于MRL值的三条检测线检测结果直观、精确，无需换算，为基于残留限量值（MRL）农产品安全性的快速判断提供了更为直观简单、准确的方法，从而可以准确判断农产品的安全性，并可准确定量三唑磷农药残留量范围。

本实用新型所述的三唑磷农药免疫层析试纸条与现有技术相比，具有以下优点：

(1) 基于MRL值的多阈值检测线的设置，使检测结果更加直观，精确。

(2) 基于不同检测线的变化，可以准确判定农产品的安全性及残留是否超标。

(3) 检测时间只需8-10 min，能够满足现场检测的要求。

(4) 适用于多种农产品对象的检测与判定，携带方便，操作简单，无需专业培训。

附图说明

图1为本实用新型实施例的结构示意图；

图1中，1.PVC底板，2.检测垫，3.金标垫，4.样品垫，5.吸水垫，6.T1检测线，7.T2检测线，8.T3检测线，9.质控线（C线）。

图2为样品检测方法流程图。

图3为检测结果图。

图4为实际样品检测结果图。

具体实施方案

附图非限制性的公开了本实用新型实施例的具体结构及其使用方法，下面结合附图对本实用新型作进一步的描述。

实施例中所涉及的试剂：

羊抗小鼠IgG抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司；

底板为PVC材质（SM31-40）、吸水垫型号为SX27、样品垫均购自上海金标生物科技有限公司；

金标垫为玻璃纤维，型号为Millipore GFCP000800；

检测垫硝酸纤维素膜型号为Millipore135。

实施例1 试纸条的制备

一种半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，其结构如图1所示，包括PVC底板1，样品垫4、金标垫3、硝酸纤维素膜材质的检测垫2和吸水垫5，检测垫2位于底板1的中段，金标垫3覆盖在检测垫2的端部及对应的底板1上，样品垫4由底板1的一端向中段延伸，其端部覆盖在金标垫3的端部，吸水垫5由底板1的另一端向中段延伸，其端部覆盖在检测垫2的另一端部；

金标垫3端部与吸水垫5端部之间外露的检测垫2自靠近吸水垫5的一端依次设有与底板1端面平行的质控线9（C线）、检测线T3 8、检测线T2 7和检测线T1 6；质控线9上喷涂羊抗小鼠IgG抗体，检测线T1 6、检测线T2 7和检测线T3 8上分别喷涂有三唑磷半抗原-鸡卵清蛋白偶联物，金标垫3上喷涂有纳米金标记的三唑磷单克隆抗体。

本实施例中，底板1为条状PVC材质，其大小为60 mm×3.5 mm；样品垫4长17 mm，宽3.5 mm；金标垫3长8 mm，宽3.5 mm；检测垫2（硝酸纤维素膜）长25 mm，宽3.5 mm；吸水垫5长17 mm，宽3.5 mm；样品垫4、金标垫3、检测垫2、吸水垫5的各覆盖区域长度为1 mm。

质控线9距检测垫2靠近吸水垫5端上沿的距离为9 mm，质控线9和检测线T3 8之间的距离为5 mm，质控线9和检测线T2 7之间的距离为8 mm，质控线9和检测线T1 6之间的距离为10 mm。

检测垫2上的检测线6、检测线7、检测线8喷涂有三唑磷半抗原-鸡卵清蛋白偶联物，制备方法见文献：“Gui Wen Jun, Jin Ren Yao, Chen Ze Li, Cheng Jing Li, ZhuGuo Nian. Hapten synthesis for enzyme-linked immunoassay of the insecticidetriazophos, Analytical Biochemistry. 2006, 357 (1), 9-14.”，包被量分别为1.7 μg/mm、1.7 μg/mm、1.5 μg/mm。

临近吸水垫5的质控线9喷涂羊抗小鼠IgG抗体，浓度为1 mg/mm。

本实施例中，试纸条是通过如下方法制备的：

1、检测线和质控线的制备：

Bio-Dot XYZ-3050三维喷点仪中进行喷膜（Airjet模式），将三唑磷半抗原-鸡卵清蛋白偶联物和羊抗小鼠IgG抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜上，作为检测线和质控线，制备方法见参考文献：“Zhang Dao Hong, Li Pei Wu, Zhang Qi, Li Ran, Zhang Wen, DingXiao Xia, Li Chang Ming. A naked-eye based strategy for semiquantitativeimmunochramotographic assay, Analytica Chimica Acta, 2012, 740: 74-79.”。

2、胶体金的制备：

2.1 将200 mL双蒸水加入到500 mL广口玻璃瓶中，加入1 mL过0.22 μm滤膜的2%氯金酸溶液，顺时针方向轻轻晃动至混匀后，放置于微波炉中高火加热5 min至沸腾。

2.2 取出玻璃瓶，迅速顺时针方向轻轻晃动玻璃瓶，使瓶内溶液旋转后快速加入4.8 mL过0.22 μm滤膜的1%柠檬酸三钠溶液，沿同一方向继续轻轻晃动玻璃瓶5 s，再次放入微波炉中，高火继续加热4 min。

2.3 取出玻璃瓶，此时瓶内酒红色液体即为所需胶体金溶液，其纳米金粒径为15-20 nm；置室温冷却后，用双蒸水重新定容至200 mL，混匀后避光4℃保存。

3、纳米金标记的三唑磷单克隆抗体的制备：

3.1 取步骤2制备的胶体金溶液，每毫升胶体金溶液中加入7 µL的K₂CO₃（0.1mol/L）溶液调节PH值为8.0，搅拌状态下缓慢加入5 µL 1 mg/mL三唑磷单克隆抗体溶液，三唑磷单克隆抗体的制备方法见文献：“Gui Wen Jun, Jin Ren Yao, Chen Ze Li, Cheng JingLi, Zhu Guo Nian. Hapten synthesis for enzyme-linked immunoassay of theinsecticide triazophos, Analytical Biochemistry. 2006, 357 (1), 9-14.”。此时其抗体终浓度为5 µg抗体/mL胶体金溶液，搅拌30 min；

3.2 加入10%BSA溶液使BSA终浓度为1%，继续搅拌30 min后，1500 r/min离心15min，留取上清，上清液继续以12000 r/min离心35 min后，弃去上清，加入洗涤保存液（0.01%硼酸，0.2%PEG₂₀₀₀₀，0.02%NaN₃）至原溶液体积；

3.3 再次以12000 r/min离心35 min后，弃去上清，加入洗涤保存液溶解沉淀至体积为原溶液体积的1/10，即得纳米金标记的三唑磷单克隆抗体液，4℃避光保存。

4、金标垫的制备：

首先将金标垫浸入金标垫处理液（20mM Na₃PO₄•12H₂O，5%BSA，0.25%Tween-20，10%蔗糖）30 min后，37℃烘干；然后用Bio-Dot XYZ-3050三维喷点仪喷膜，将步骤3制备的纳米金标记的三唑磷单克隆抗体溶液按0.002 μg/mm喷于已处理好的金标垫上；37℃干燥2 h后，28℃保存于干燥皿中。

5、试纸条的组装：

将样品垫，上述步骤1制备的检测垫，上述步骤4制备的金标垫和吸水垫按图1所示粘贴于PVC底板上。用ZQ2000微电脑自动斩切机（上海金标生物科技有限公司）将组装好的试纸条切割成3.5 mm的试纸条，28℃干燥条件下保存。

实施例2 试纸条的检测浓度范围

用甲醇溶液配制100 μg/mL的三唑磷农药溶液，再用含10%甲醇的PBS溶液分别将其稀释至0.2，0.1，0.05 μg/mL，同时设立含有10%甲醇的PBS溶液作为对照组，向微孔中分别加入100 µL上述浓度三唑磷农药标样溶液和对照缓冲液，将实施例1制备的试纸条的样品垫端插入微孔中，8-10 min观察结果。

结果如图3所示：可见，当T1、T2、T3检测线和质控线C线均显色时，样品浓度小于0.05 μg/mL；当T1、T2检测线和质控线C线显色，T3检测线不显色时，样品浓度在0.05 ~ 0.1μg/mL；当T1检测线和质控线C线显色，T2、T3检测线不显色时，样品浓度在0.1 ~ 0.2 μg/mL；当T1、T2、T3检测线均不显色，质控线C线显色时，样品浓度大于等于0.2 μg/mL。

实施例3 试纸条对实际样品的检测

测试样品：大米，甘蓝，苹果。

检测步骤流程如图2所示。

样品前处理：称取10.0 g粉碎(匀浆或者切碎)的大米、甘蓝、苹果样品至50 mL离心管中，对于添加样品，使添加浓度分别为0，0.05，0.1和0.2 mg/kg（每个浓度3次重复）。分别加入10 mL乙腈溶液，振荡1 min，加入3 g氯化钠振荡1 min，静置30 min，然后以4000 r/min离心10 min，使水相和有机相分层。吸取上层乙腈溶液1 mL，氮气吹干，以10%甲醇-PBS溶液定容至1 mL复溶过滤后，用于试纸条检测。

检测：取上述样品的提取液，同时设立含有10%甲醇的PBS溶液配置的0，0.05，0.1和0.2 mg/L三唑磷标准品为对阳性照组，向微孔中分别加入100 µL上述样品处理液和对照，将试纸条的样品垫端插入微孔中，静置8-10 min观察结果，结果表明基质干扰可忽略，对添加浓度分别为0，0.05，0.1和0.2 mg/kg的添加样品检测结果准确，如图4所示。

结果判断：

（1） 阳性结果：仅检测线T3不显色，则三唑磷农药的残留浓度在0.05 ~ 0.1 mg/kg之间；若检测线T3和检测线T2不显色，残留浓度在0.1 ~ 0.2 mg/kg之间；若三条检测线均不显色，残留浓度大于等于0.2 mg/kg。

（2） 阴性结果：检测线T1、检测线T2和检测线T3颜色与质控线（C线）颜色基本一致或深于质控线（C线）。

（3） 当质控线（C线）不显色时，无论检测线是否显色，均视为试纸条失效。

以上实例仅以说明本实用新型的技术方案而非限制，尽管参照较佳实例对本实用新型进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，可以对本实用新型的技术方案进行修改，但其均应涵盖在本实用新型的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，包括底板，样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫，其特征在于，检测垫位于底板的中段，金标垫覆盖在检测垫的端部及对应的底板上，样品垫由底板的一端向中段延伸，其端部覆盖在金标垫的端部，吸水垫由底板的另一端向中段延伸，其端部覆盖在检测垫的另一端部；

金标垫端部与吸水垫端部之间外露的检测垫自靠近吸水垫端依次设有与底板端面平行的质控线、检测线T3、检测线T2和检测线T1；所述质控线上喷涂羊抗小鼠IgG抗体，检测线T1、检测线T2和检测线T3上分别喷涂有三唑磷半抗原-鸡卵清蛋白偶联物，所述金标垫上喷涂有纳米金标记的三唑磷单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测垫的材质为硝酸纤维素膜。

3.根据权利要求2所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于，样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫各交叠区别的长度为1 mm。

4.根据权利要求3所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于，所述底板为宽3.5 mm的条形PVC底板；吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫均与底板等宽，他们的长度分别为17 mm、25 mm、8 mm和17 mm。

5.根据权利要求4所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测垫上的质控线距检测垫上沿的距离为9 mm，质控线与检测线T3之间的距离为5 mm，质控线与检测线T2之间的距离为8 mm，质控线与检测线T1之间的距离为10 mm。

6.根据权利要求1-5之一所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线T1、检测线T2和检测线T3上三唑磷半抗原-鸡卵清蛋白偶联物的包被浓度分别为1.7 μg/mm、1.7 μg/mm和1.5 μg/mm，质控线上羊抗小鼠IgG抗体的包被量为1.0 mg/mm。

7.根据权利要求6所述半定量化检测三唑磷农药的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于，所述金标垫上所用的纳米金粒径为15 ~ 20 nm；纳米金标记的三唑磷单克隆抗体用量为0.002 μg/mm。