CN105158461A - 适用于茶叶中啶虫脒残留的速测方法及相应的试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条,试纸条包括衬板、样品垫、金标一抗结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫,金标一抗结合垫包被有胶体金标记的啶虫脒抗体,硝酸纤维素膜上包被有啶虫脒抗原的检测线和包被有二抗的质控线。实际使用时,取茶汤滴加2~3滴到样品垫的点样区中进行层析反应,5~10分钟后根据检测线和质控线的显色情况直接判断样品中农药的阴阳性结果;质控线显红色表示试纸条有效,未显色则失效;检测线显红色则判断为阴性,表示茶汤中未检测到啶虫脒残留,或茶汤中啶虫脒残留浓度低于0.01mg/L;检测线---T线未显色则判断为阳性,表示茶汤中啶虫脒浓度高于0.01mg/L。
Description
技术领域
本发明属于小分子化合物的金标免疫分析检测领域,具体涉及一种基于异源竞争免疫层析法的农药残留金标速测试纸条--适用于茶叶中啶虫脒残留的速测试纸条,该试纸条适用于茶叶样品中氯化烟碱类农药啶虫脒残留的快速检测。
背景技术
自美国、欧盟、日本加强对进口食品、农产品检疫检验力度后,我国茶叶出口呈现大幅下降的趋势,其主要原因是农药超标困扰我国茶叶出口。近两年来,由于啶虫脒等新烟碱类农药在茶叶上使用频率高,导致啶虫脒等农药残留在茶叶上检出率高、超标率不断上升。2013年5月,欧盟食品安全局(EFSA)发布的报告指出,新烟碱类农药对授粉昆虫构成“严重风险”,这类农药与蜜蜂死亡有关,可能影响农作物的授粉,因而啶虫脒作为常用的新烟碱类农药在茶叶和其他授粉作物上的使用亟需得到有效控制。
鉴于茶叶日常检测样品量较大,常规的农药残留检测仪器分析方法(如气相、液相色谱及其质谱联用)满足不了大量样品在较短时间内完成快速筛查的需求。因此,人们迫切希望有一种简便、快速、灵敏及价廉的农残检测技术能在野外现场和实验室内进行大批量的快速筛查试验。迄今,常见的农药残留现场快速筛查方法为酶抑制显色纸片法,但其检测假阳性比率偏高,受基质干扰大,检测对象局限于有机磷类和氨基甲酸酯类农药,且特异性不高。近些年来,基于抗原-抗体特异性反应的免疫化学分析法是农药残留快速检测技术的研究热点之一,其中研究报道最多的是酶联免疫吸附法(ELISA),已研制出多类农药ELISA试剂盒,确实有潜在的市场应用前景,但检测需要多步反应,不易于现场操作,仍不能真正实现现场快速筛查。
胶体金标记技术是继同位素、酶、荧光素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。基于胶体金免疫层析技术的试纸条以其使用便捷、价格低廉、筛查结果可视化、环境友好性等独特优势更受大众欢迎。近些年来,适用于检测小分子化合物的竞争型金标试纸条研发也越来越多,有关农药方面的公开报道集中在三嗪类、有机磷类、氨基甲酸酯类,而针对新烟碱类农药金标试纸条的仅涉及吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺单残留或双残留的测定。此外,一般金标试纸条都是采用同源竞争(免疫半抗原与包被半抗原结构一致)的模式。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高、结果可视化、适用于现场速测的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条(即,基于异源竞争免疫层析法的啶虫脒金标速测试纸条)及相应的检测方法。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条(即,基于异源竞争免疫层析法的农药残留金标速测试纸条),该试纸条包括衬板、样品垫、金标一抗结合垫、硝酸纤维素膜---NC膜、吸水垫,金标一抗结合垫包被有胶体金标记的啶虫脒抗体(一抗),所述硝酸纤维素膜---NC膜上包被有啶虫脒抗原的检测线---T线和包被有二抗(例如为兔抗鼠IgG)的质控线---C线。
作为本发明的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条的改进:
胶体金标记的啶虫脒抗体(一抗),是由20~40nm(例如为30nm)的纳米金颗粒与啶虫脒特异性抗体相结合的复合物,抗体与胶体金的结合浓度为4~12mg/L(较佳为5mg/L);即,每1L胶体金溶液中配用4~12mg(较佳为5mg)抗体。
备注说明:胶体金溶液中胶体金的质量浓度为0.01%;
包被量为0.4~0.6μL/mm2(较佳为0.5μL/mm2)。
作为本发明的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条的进一步改进:所述啶虫脒抗体为啶虫脒小鼠单抗。
作为本发明的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条的进一步改进:所述检测线上包被的啶虫脒抗原为噻虫啉-OVA卵白蛋白偶联物,即,是指将噻虫啉半抗原偶联到鸡卵清蛋白(OVA)上的人工抗原,其浓度为500~2000mg/L,所述噻虫啉半抗原与OVA的偶联比为8:1~15:1(例如为10:1)。
所述质控线包被的二抗为兔抗鼠IgG,其浓度为50~200mg/L(例如为75mg/L)。T线和C线的包被量均为0.04~0.06μL/mm(较佳为0.05μL/mm)。
作为本发明的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条的进一步改进:
所述检测线和质控线所用的稀释液是质量浓度1~5%蔗糖的0.01MPBS溶液(PH7.4磷酸盐PBS缓冲液)。
本发明还同时提供了利用上述试纸条进行的茶叶鲜叶和/或成品茶中啶虫脒残留的快速检测方法:
以茶叶鲜叶、成品茶作为待测样品;
直接用开水冲泡待测样品30~60分钟,得茶汤;或者,先将待测样品研磨成粉状后,加入开水冲泡30~60分钟,得茶汤;
取茶汤滴加2~3滴到样品垫的点样区(该点样区位于样品垫的中间位置)中进行层析反应,5~10分钟后根据检测线和质控线的显色情况直接判断样品中农药的阴阳性结果;
质控线---C线显红色表示试纸条有效,未显色则失效;
检测线---T线显红色则判断为阴性,表示茶汤中未检测到啶虫脒残留,或茶汤中啶虫脒残留浓度低于0.01mg/L;
检测线---T线未显色则判断为阳性,表示茶汤中啶虫脒浓度高于(≥)0.01mg/L。
备注说明:粉红色即显色不完全,表示偏阳性,显示浅红色代表检测到啶虫脒农药的浓度低于不显色的情况。
作为本发明的茶叶鲜叶和成品茶中啶虫脒残留的快速检测方法的改进:
所述成品茶包括:绿茶、红茶、乌龙茶、白茶、黄茶、黑茶。
在本发明中,采用质量浓度1%蔗糖的0.01MPBS溶液(PH7.4磷酸盐PBS缓冲液)作为稀释液可以保护包被抗原和包被二抗,从而延长抗原和二抗的活性。
本发明的判断方式具体如下:
当质控线---C线和检测线---T线均显示红色,表示待测样品为阴性;
质控线---C线显示红色,检测线---T线显示浅红色,表示待测样品为偏阳性;
质控线---C线显示红色,检测线---T线不显色,表示待测样品为阳性;
质控线---C线不显色,无论检测线---T线为什么状态,均表示待测样品的检测为失效。
备注说明:阴性代表待测样品中不含有啶虫脒,阳性代表待测样品中含有啶虫脒;相对而言,“检测线---T线不显色”比“T线显示浅红色”代表该待测样品中脒残留的浓度高。
通过本发明的判定方法可以对茶叶样品中啶虫脒残留的进行快速定性与定量筛选甄别,本试纸条的检测灵敏度高、使用方便快捷、结果准确。
在本发明的试纸条的制备方法中,确定了单个试纸条的最终宽度控制在2.5~3.5mm;所述胶体金垫(金标一抗结合垫)的材料为亲水玻璃纤维膜(厚度约为0.35~0.55mm);所述样品垫为亲水玻璃纤维膜(厚度约为0.35~0.55mm);所述吸水垫的材料为吸水滤纸(厚度约为0.75~1.05mm)。
本发明的有益效果:本试纸条采用胶体金标记啶虫脒一抗作为免疫金标探针,可以快速检测茶叶鲜叶和成品茶中氯化烟碱类农药啶虫脒的残留量,是一种快速、简便、准确、低成本的农药残留检测新手段。本发明中采用的啶虫脒抗体对啶虫脒的亲和性高,这有利于提高竞争式免疫层析法的灵敏度,肉眼判断检出限可达到0.01mg/L。
本发明的发明点在于啶虫脒金标速测试纸条还未见公开报道,采用的检测技术首次公开。与现有的仪器检测方法相比,本发明的试纸条实现了啶虫脒残留的快速检测,具有灵敏度高、特异性好、使用便捷、结果准确等优点。本发明具备良好的实用性,试纸条可应用于现场筛查茶叶鲜叶和成品茶样品中啶虫脒的残留量及超标检测与诊断,检出限0.01mg/L,符合我国现行食品安全标准要求,检测时间5~10分钟。该产品技术具有灵敏度高、使用便捷、结果准确、成本低的优点,对于加强茶叶生产的质量安全监督管理具有良好的应用前景。
本发明采用异源竞争(免疫半抗原与包被半抗原结构不完全相同),可提高小分子化合物的免疫分析检测灵敏度,检测灵敏度效果优于同源竞争模式。
综上所述,本发明根据茶叶现场农药残留快速检测方法的急迫需求,研究开发了一种操作简单、灵敏度高、结果可视化、适用于现场速测的农药多残留诊断技术产品。本发明中的金标试纸条检测对象为啶虫脒,有关啶虫脒的金标试纸条还未见公开报道,同时本产品能够实现茶叶鲜叶采摘时以及制茶后的成品茶中的啶虫脒残留进行快速检测,若发现鲜茶农药超标可通过延缓采摘时间等方式来降低茶叶中的农药残留。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明的啶虫脒金标速测试纸条的示意图;
图2是图1的俯视示意图;
图3是啶虫脒残留速测试纸条检测过程示意图;
图4是检测结果判定方法;
图4中,从左至右分别为:
C线和T线均显示红色→阴性;
C线显示红色,T线显示浅红色→阳性;
C线显示红色,T线不显色→阳性;
C线不显色,T线显示红色→失效;
C线和T线均不显色→失效。
图5:茶叶实际样品检测结果。
具体实施方式
实施例1:啶虫脒金标速测试纸条的制备:
1、胶体金的制备
采用柠檬酸钠(柠檬酸三钠)还原法制备胶体金颗粒。将150mL0.01%(质量%)氯金酸溶液在油浴条件下加热至沸腾(约120℃),在磁力搅拌下迅速加入2.5mL1%(质量%)柠檬酸钠水溶液,当溶液的颜色完全变为亮红色时,继续回流5~10min后停止加热,冷却后将溶液装入试剂瓶并放置于4℃冰箱中保存。得质量浓度为0.01%的胶体金溶液。
通过紫外-可见分光光度计对胶体金颗粒在可见光范围内进行扫描,测得最大吸收波长λmax为520nm,吸光值0.80;并在透射电镜下观察胶体金颗粒,大小均一性较好,采用马尔文激光粒度分析仪测量颗粒平均直径为30nm。
2、金标一抗的制备
取10mL质量浓度为0.01%的胶体金溶液,逐滴加入1mL50mg/L的啶虫脒小鼠单抗(一抗)溶液,边加边混匀,混合均匀后静置1h。再加入2.5mL含5%BSA(牛血清蛋白)和0.1%PEG(聚乙二醇)的0.01MPBS缓冲溶液,混合均匀后静置1h。4℃条件下10000r/min离心30min,弃上清,红色沉淀再用10mL含1%BSA和0.02%PEG的0.01MPBS缓冲溶液复溶(洗涤作用),4℃条件下10000r/min离心30min,弃上清,再重复上述复溶离心弃上清一次。最后用含1%BSA和5%蔗糖的0.01MPBS缓冲溶液溶解红色沉淀并定容至1mL,即获得纯化的金标啶虫脒一抗;放置于4℃冰箱中备用。
备注说明:
上述啶虫脒小鼠单抗(一抗)可参考文献:WanatabeS,ItoS,KamataY,OmodaN,YamazakiT,MunakataH,KanekoTandYuasaY,Developmentofcompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassays(ELISAs)basedonmonoclonalantibodiesforchloronicotinoidinsecticidesimidaclopridandacetamiprid.AnalChimActa427:211-219(2001)制备而得。
上述%均为质量%。例如,上述含5%BSA(牛血清蛋白)和0.1%PEG(聚乙二醇)的0.01MPBS缓冲溶液的制备方法为:在100ml的0.01MPBS缓冲溶液(PH7.4磷酸盐PBS缓冲液)中加入5g的BSA(牛血清蛋白)和0.1g的PEG(聚乙二醇)。
3.样品垫1的处理
配制20mL封闭液,称取50mgBSA、50mgPVP(聚乙烯吡咯烷酮)、1g蔗糖,将其加入20mL0.01MPBST(含0.05%吐温的磷酸缓冲溶液)中。
备注说明:上述0.01MPBST(含0.05%吐温的磷酸缓冲溶液)是指在100mL的0.01MPBS缓冲溶液(PH7.4磷酸盐PBS缓冲液)中加入0.05mL的吐温。
将上述试剂和溶液充分混合溶解即封闭液配制完成,将样品垫原料浸入封闭液中,待样品垫原料完全吸附封闭液时取出样品垫,并在37℃烘箱中烘干(约3小时),得样品垫1;放入封口袋中并保存于玻璃器皿干燥器中备用(也作为“金标一抗结合垫2”的原始材料)。
备注说明:上述“完全吸附封闭液”即,样品垫原料浸泡至封闭液中,直至封闭液的余量不再改变;上述浸泡时间一般为20~30秒。
4.金标一抗结合垫2的制备
将步骤2)所得的混合均匀的金标啶虫脒一抗均匀包被在上述封闭液处理的样品垫1上,包被量为0.5μL/mm2,37℃烘箱中干燥30min,得金标一抗结合垫2放入封口带中并保存于玻璃器皿干燥器中备用。
5.检测线、质控线的包被
首先配制检测线(T线)和质控线(C线)的保护剂,其成分为质量浓度1%蔗糖的0.01MPBS溶液。再用该保护剂作为稀释液,分别配制500mg/L的噻虫啉-OVA卵白蛋白偶联物(检测线T线)和75mg/L的兔抗鼠IgG(质控线C线)。
备注说明:上述噻虫啉-OVA卵白蛋白偶联物可依据以下参考文献制备而得:LiuZ,LiM,ShiHandWangM,DevelopmentandevaluationofanEnzyme-Linkedimmunosorbentassayforthedeterminationofthiaclopridinagriculturalsamples.FoodAnalMethod6:691-697(2013);噻虫啉抗原是指将噻虫啉半抗原偶联到鸡卵清蛋白(OVA)上的人工抗原,半抗原与OVA的偶联比为10:1。
上述兔抗鼠IgG购于北京博枫科生物科技有限公司(北京博奥龙免疫技术有限公司),原始浓度为5mg/mL。
采用自动划线仪将T线和C线包被在硝酸纤维素膜3上(划线位置见图1和图2),T线和C线的包被量均为0.05μL/mm。划线完成后将其放于37℃烘箱中干燥10min备用;得包被啶虫脒抗原的检测线---T线5和包被二抗(兔抗鼠IgG)的质控线---C线6的NC膜3。
6.试纸条的组装
先在衬板7的中间段贴上上述包被有T线6和C线5的NC膜3,然后在该NC膜3粘贴金标一抗结合垫2,金标一抗结合垫2的纵向长度为2mm,粘贴位置为靠近T线5端的NC膜3末端,从而使约一半的金标一抗结合垫2位于在NC膜3的上方。然后,将将封闭液处理过的样品垫1粘贴在金标一抗结合垫2的上方,从而盖住约一半的金标一抗结合垫2。最后粘贴吸水垫4,吸水垫4的粘贴位置为靠近C线6端的NC膜3末端,吸水垫4盖住NC膜约3mm。衬板组装完成后水平放入自动切条机中,将其切割成3mm宽的试纸条。
实施例2:应用
1.试纸条灵敏度实验
(1)标准溶液配制
用甲醇配制啶虫脒的标准储备液,标准储备液的浓度为1mg/L。再用0.01MPBS缓冲液稀释啶虫脒至系列浓度的标准工作液0.1mg/L、0.01mg/L、0.005mg/L、0.002mg/L。
(2)标准溶液检测
设置4个处理组,分别为空白对照(0.01MPBS缓冲液),啶虫脒0.01mg/L、0.005mg/L、0.002mg/L标准工作液。分别使用同一批次的残留速测试纸条进行检测,每个处理组重复2次,检测方法为:取茶汤样品滴加2滴到点样孔中进行层析反应,5~10分钟后根据检测线5和质控线6的显色情况直接判断样品中农药的阴阳性结果。以检测线5不显色作为试纸条的检测灵敏度。
4个处理组的检测结果见表1。结果表明,标准工作液检测条件下,啶虫脒的检测灵敏度均为0.005mg/L,即最低检测限为0.005mg/L。
表1啶虫脒残留速测试纸条对啶虫脒标准工作液的检测结果
注:4组处理每组2个重复。+++表示完全显色判断为阴性;++或+表示显色不完全,判断为偏阳性(未达到设定的最低检出限);-表示不显色判断为阳性。
(3)茶汤中标准溶液添加试验
称取绿茶干茶样品1g加入50mL开水冲泡,得到的茶汤作为样品基质,分别添加步骤(1)所述的1mg/L的啶虫脒标准溶液。设置4个处理组,分别为空白对照(茶汤基质),1mL茶汤中添加2μL、5μL、10μL啶虫脒标准溶液。分别使用同一批次的残留速测试纸条进行检测,每个处理组重复2次,检测方法同上。以检测线不显色作为试纸条的检测灵敏度。
4个处理组的检测结果见表2。结果表明,茶汤基质加标条件下,啶虫脒的检测灵敏度均为0.01mg/L,即最低检测限为0.01mg/L。
表2啶虫脒残留速测试纸条对茶汤中啶虫脒添加样品的检测结果
注:4组处理每组2个重复。+++表示完全显色判断为阴性;++或+表示显色不完全,判断为偏阳性(未达到设定的最低检出限);-表示不显色判断为阳性。
2.茶叶样品快速检测
(1)茶汤样品制备
准备3份茶叶样品,分别为绿茶(代号1261)、红茶(代号1264)、乌龙茶。实验室已用液质联用仪检测得到3份茶叶中啶虫脒的含量:绿茶中未检出;红茶中0.393mg/kg;乌龙茶中0.578mg/kg。以上茶叶样品各称取1g加入50mL开水冲泡,30min后取茶汤进行检测。
(2)茶汤样品检测及结果判定
茶汤样品用同一批次的残留速测试纸条进行检测,检测方法同上。
检测结果见图5,结果显示:绿茶(代号1261)阴性,红茶(代号1264)偏阳性,乌龙茶阳性,表明绿茶茶汤中未检测到啶虫脒,红茶的茶汤中0.005mg/L≤啶虫脒含量≤0.01mg/L,乌龙茶的茶汤中啶虫脒含量≥0.01mg/L,折算到茶叶中则为0.25mg/kg≤红茶中啶虫脒的含量≤0.5mg/kg、乌龙茶中啶虫脒的含量≥0.5mg/kg。此试纸条测定结果和仪器检测结果完全相符合,从而验证了试纸条检测结果的准确性和实用性。
对比例:改变实施例1的步骤5)的包被抗原“噻虫啉-OVA”,将包被抗原改为“啶虫脒-OVA”,即,由异源竞争模式改成同源竞争模式。
对比实验、将上述对比例所述的试纸条,按照实施例2的“试纸条灵敏度实验”进行检测,所得结果的对比如下:
表3、两种啶虫脒残留速测试纸条对啶虫脒标准工作液的检测结果对比
+++表示完全显色判断为阴性;++或+表示显色不完全,判断为偏阳性(未达到设定的最低检出限);-表示不显色判断为阳性。
结果表明,对比例条件下,试纸条对啶虫脒标准工作液的检测灵敏度为0.02mg/L,明显高于实施例2所达到的检测灵敏度0.005mg/L。通过和对比例的比较,实施例中采用的试纸条灵敏度更高,因此异源竞争模式有利于提高金标试纸条的检测灵敏度。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条,试纸条包括衬板(7)、样品垫(1)、金标一抗结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4),其特征是:所述金标一抗结合垫(2)包被有胶体金标记的啶虫脒抗体,所述硝酸纤维素膜(3)上包被有啶虫脒抗原的检测线(5)和包被有二抗的质控线(6)。
2.根据权利要求1所述的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条,其特征是:
胶体金标记的啶虫脒抗体,是由20~40nm的纳米金颗粒与啶虫脒特异性抗体相结合的复合物,抗体与胶体金的结合浓度为4~12mg/L。
3.根据权利要求2所述的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条,其特征是:
所述啶虫脒抗体为啶虫脒小鼠单抗。
4.根据权利要求2或3所述的基于异源竞争免疫层析法的啶虫脒金标速测试纸条,其特征是:
所述检测线(5)上包被的啶虫脒抗原为噻虫啉-OVA卵白蛋白偶联物,即,是指将噻虫啉半抗原偶联到鸡卵清蛋白(OVA)上的人工抗原,其浓度为500~2000mg/L,所述噻虫啉半抗原与OVA的偶联比为8:1~15:1;
所述质控线(6)包被的二抗为兔抗鼠IgG,其浓度为50~200mg/L。
5.根据权利要求4所述的基于异源竞争免疫层析法的啶虫脒金标速测试纸条,其特征是:
所述检测线(5)和质控线(6)所用的稀释液是质量浓度1~5%蔗糖的0.01MPBS溶液。
6.利用如权利要求1~5任一所述的试纸条进行的茶叶鲜叶和/或成品茶中啶虫脒残留的快速检测方法,其特征是:
以茶叶鲜叶、成品茶作为待测样品;
直接用开水冲泡待测样品30~60分钟,得茶汤;或者,先将待测样品研磨成粉状后,加入开水冲泡30~60分钟,得茶汤;
取茶汤滴加2~3滴到样品垫(1)的点样区中进行层析反应,5~10分钟后根据检测线(5)和质控线(6)的显色情况直接判断样品中农药的阴阳性结果;
质控线(6)显红色表示试纸条有效,未显色则失效;
检测线(5)显红色则判断为阴性,表示茶汤中未检测到啶虫脒残留,或茶汤中啶虫脒残留浓度低于0.01mg/L;
检测线(5)未显色则判断为阳性,表示茶汤中啶虫脒浓度高于0.01mg/L。
7.利用如权利要求6所述的茶叶鲜叶和成品茶中啶虫脒残留的快速检测方法,其特征是:
所述成品茶包括:绿茶、红茶、乌龙茶、白茶、黄茶、黑茶。
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