CN104165986A - 基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片制备法和使用法 - Google Patents

基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片制备法和使用法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法：以硝酸纤维素膜为载体，将检测点及质控点点样在载体上形成点阵列，洗涤液洗涤并晾干后，用牛血清白蛋白封闭未结合的区域，再用洗涤液洗涤后晾干；得农药多残留可视化检测芯片。质控点分为阳性质控点和阴性质控点；阳性质控点为：羊抗鼠IgG；阴性质控点为0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)；检测点为农药半抗原-鸡卵清蛋白偶联物。本发明还同时提供了上述农药多残留可视化检测芯片的使用方法。本发明集增强型金标显色的“可视化”与芯片技术的“高通量”于一体，制备了一种可用肉眼判断、且能同时检测多种(类)农药残留的免疫芯片。

Description

基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片制备法和使用法
技术领域
本发明涉及一种基于膜材料的农药多残留可视化芯片及其制备方法和使用方法，该芯片可实现对农产品和环境样本中多种有机磷农药、氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯类农药及烟碱类农药直接进行快速定性及半定量检测。 
背景技术
农药是农业生产中用于防治农作物中病、虫、杂草等不可缺少的物质，对保障和促进农业稳产增收有极其重要的作用。然而，由于长期不合理使用，农药污染及多残留超标问题越来越严重，食品安全问题也逐渐成为人们的关注的焦点。目前，我国农药残留检测主要依赖仪器分析，如气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、气相-质谱联用法(GC-MS)及液相-质谱联用法(LC-MS)。此类方法不仅需要价格昂贵的仪器及具专业技能的操作人员，而且耗时较长、不能实现现场快速检测。另外，尽管侧向层析金标试纸条可弥补仪器分析法这一缺陷，但有综述(Dzantiev,B B,Byzova,N A,Urusov,A E and Zherdev,A V.Immunochromatographic methods in food analysis[J].Trends in Analytical Chemistry,2014:81-93)表明，由于试纸空间尺寸和层析动力学的受限，实际使用时侧向层析金标试纸条上平行设置的T线(检测线)不宜多于5条，也就是说一个金标试纸条一般最多只能检测5种(类)目标分析物。然而，随着新农药的不断研发，农药种类和数量日趋增多，传统的侧向层析金标试纸条已不能满足多种农药现场检测需要。 
生物芯片技术是自20世纪90年代迅猛发展起来的一门科学技术，具有微型化、高通量、自动化等特点。生物芯片主要分为两类：基因芯片和蛋白芯片，其中蛋白芯片在实际应用中以抗体芯片研究最多。抗体芯片或称免疫芯片，在化学分析中主要依赖“抗原-抗体”特异性结合这一原理，直接或间接法检测样品中的化合物。目前，免疫芯片技术在农兽药等小分子污染物残留分析中已有陆续报道。如中国专利(CN103558257A)报道了一种基于阵列式传感器的农药多残留检测仪，它是在各工作电极上固定不同的农药抗体，与实际样品接触后，根据各个传感器阻抗值的变化来确定农药是否超标，并确定农药的种类。中国专利(CN103439514A)报道了一种基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，它是用生物芯片点样仪将单克隆抗体点样到玻片固相载体上，检测时将样品与荧光标记的农兽药半抗原-OVA混合，并与芯片孵育，最后用芯片扫描仪检测结果。中国专利(CN101782580A)公开 了一种用于多种兽药残留检测的蛋白芯片及其试剂盒，通过在基片上点样多种兽药抗体，并结合化学发光可同时检测秋水仙碱、二甲硝咪唑等8种兽药。中国专利(CN1715923)公布了一种用于快速检测食品、农副产品中兽药残留物的蛋白芯片，它是在固相载体上包被兽药偶联抗原，然后将样品与生物素化的抗体混合并与该芯片仪器孵育反应，最后加亲和素化的胶体金进行放大显色，通过CCD扫描获得灰度值，图像越黑代表样品中兽药含量越低，反之，越高。然而，以上这些专利报道均需要配套的信号监测设备仪器(生物芯片扫描仪、CCD检测仪等)，成本相对较高，仍不能满足目前农产品安全领域中大批量样品农药多残留现场速测的要求，很难普及应用到人们的日常生活中。 
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种使用方便、成本低廉的基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法和使用方法。本发明的检测芯片是一种可同时检测多种(类)农药残留的可视化芯片。 
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法，以硝酸纤维素膜为载体，将检测点(农药半抗原-载体蛋白偶联物)及质控点(羊抗鼠IgG和溶剂对照)点样(按顺序点样)在载体上形成点阵列(需要置37℃温箱中干燥30min)，洗涤液洗涤并晾干后，用牛血清白蛋白(BSA)封闭未结合的区域，再用洗涤液洗涤后晾干；得农药多残留可视化检测芯片(即形成可用的膜芯片，亦称：可视化检测芯片)。 
作为本发明的基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法的改进：所述质控点分为阳性质控点和阴性质控点；所述阳性质控点为：羊抗鼠IgG；所述阴性质控点(即溶剂对照)为0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)； 
所述检测点为农药半抗原-鸡卵清蛋白(OVA)偶联物。 
作为本发明的基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法的进一步改进：农药半抗原-鸡卵清蛋白(OVA)偶联物为三唑磷-OVA、对硫磷-OVA、甲基对硫磷-OVA、克百威-OVA、毒死蜱-OVA、吡虫啉-OVA、啶虫脒-OVA、菊酯-OVA中的至少1个。 
作为本发明的基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法的进一步改进：用0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)将农药半抗原-鸡卵清蛋白(OVA)偶联物稀释成浓度为5-10mg/mL； 
用0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)将羊抗鼠IgG稀释至质量浓度为2mg/mL； 
所述阳性质控点、阴性质控点、检测点的点样用量均分别为1～5μg/点。 
备注说明：上述点样用量1～5μg是指有效成分的量，以检测点为例，是指农药半抗原-OVA 偶联物的量。 
一般点样密度为10～30点/cm2。 
作为本发明的基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法的进一步改进：所述洗涤液是体积浓度为0.05％Tween20的0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)溶液。 
即，在0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)中添加Tween20，直至Tween20的体积浓度为0.05％。 
作为本发明的基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法的进一步改进：所述用牛血清白蛋白(BSA)封闭未结合的区域，为：将前述步骤所得的载体浸泡在10mg/mL的BSA溶液中，并放于湿度为45％-60％的湿盒中于36.5～37.5℃中孵育28～32min(较佳为于37℃孵育孵育30min)。 
备注说明：上述BSA溶液是以0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)作为溶剂。 
一张1cm2大小的膜一般需要500μL的封闭液。 
作为本发明的基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法的进一步改进：所述硝酸纤维素膜为Sartorius CN140，孔径8μm。 
本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的使用方法： 
先将每种金标农药抗体等体积混合，得混合金标抗体；然后将待测样品液与混合金标抗体等体积混合，得样品/抗体混合液；接着将农药多残留可视化检测芯片(简称：芯片载体)浸泡在样品/抗体混合液中，于36.5～37.5℃孵育反应8～12分钟(较佳为于37℃孵育反应10分钟)；所述金标农药抗体与芯片上的农药半抗原相一一对应； 
反应结束后，先将孵育反应后所得的芯片洗涤并干燥，然后浸泡在金标增强液(现配的，目的是放大信号)中于室温(20～30℃)反应3分钟；接着用超纯水终止显色反应；最后根据点的颜色深浅来判断待测样品中农药含量的多少(例如，可与比色卡比对来判断样品中农药含量)。 
备注说明： 
1、一般而言，每1cm2大小的农药多残留可视化检测芯片大约需要300μL的样品/抗体混合液才能实现被浸没；这样每点(检测点、阳性质控点、阴性质控点)接触的金标农药抗体量是一样的，从而保证反应的均一性和稳定可靠性。同样，每1cm2大小的农药多残留可视化检测芯片大约需要300μL的金标增强液。 
相对于点加式，本发明的浸泡式更易于操作。 
2、所述洗涤液是体积浓度为0.05％Tween20的0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)溶液。 
作为本发明的农药多残留可视化检测芯片的使用方法的改进： 
所述金标增强液按照以下任一方法制备而得： 
方法一：以质量浓度是2％的氯金酸水溶液作为A液，以浓度是1mol/L盐酸羟胺水溶液作为B液；将A液与B液按照1:1的体积比混合； 
方法二：以质量浓度是2％的氯金酸水溶液作为A液，以体积浓度是30％H2O2水溶液作为B液，以浓度是25mmol/L吗啉乙磺酸(MES)水溶液作为C液；将A液、B液、C液按照2：3：5的体积比混合。 
作为本发明的农药多残留可视化检测芯片的使用方法的进一步改进： 
比色卡中颜色深浅代表待测样品中农药含量的多少； 
如果检测点颜色越浅，则代表待测样品中对应农药越多；反之，越少。 
备注说明：金标农药抗体是指各种农药的特异性抗体分别与20-30nm胶体金颗粒相结合所得的标记复合物。属于常规技术。 
比色卡可按照以下常规方式进行设置： 
通过设计一系列梯度的农药标准溶液，观察到检测点的颜色(用+表示)由深变浅。从这一系列颜色中选择具有代表性的几个作为中间点，其对应的农药浓度则为临界值。以三唑磷农药为例，空白样品时检测点颜色为待测样品中三唑磷浓度为0.5ng/mL时，对应检测点颜色为待测样品中三唑磷浓度为2ng/mL时，对应检测点颜色为当待测样品中三唑磷浓度大于或等于10ng/mL时，对应检测点颜色几乎为“零”，即接近膜的颜色。 
同理，可设计得到其他农药对应的比色卡。 
具体而言： 
本发明的可视化检测芯片包括一个大小可调的膜载体(硝酸纤维素膜)，然后将各种检测点(农药半抗原-OVA载体蛋白偶联物)及质控点(阳性质控点：羊抗鼠IgG和阴性质控点：0.01M PBS)用芯片点样仪按一定顺序点样于该载体上(1～5μg/点)。同时，这些蛋白因物理吸附作用而被固定，在膜上形成点阵列。洗涤液(含0.05％Tween20的0.01M PBS)洗涤(一 般为洗3次)并晾干后，用牛血清白蛋白(BSA)溶液浸没膜载体并放于37℃湿盒中孵育30min以封闭未结合的区域，再用洗涤液洗3次后晾干，即形成可用的膜芯片。 
本发明实际检测使用时，先将多种金标农药抗体与样品混合并加到该膜芯片(农药多残留可视化检测芯片)上孵育反应，再用洗涤液洗涤(一般为洗3次)并干燥后，加金标增强液反应3分钟，最后用超纯水终止显色反应。最后，可通过与比色卡比对，判断样品中农药含量。 
本发明具有如下技术优势： 
1、本发明所用的金标增强液是利用金核催大增强信号，相对于常用的银染增强法，不仅反应时间大大缩短，只需3分钟；而且，检测灵敏度也得到提高。 
2、本发明所用的芯片载体是硝酸纤维素膜，相对于传统芯片所用的醛基玻片或氨基玻片，价格低廉，大大降低了成本。 
3、本发明的芯片可同时检测6-8种农药，实现了多残留快速检测。 
4、本发明中可以根据检测点颜色深浅来判断样品中对应农药含量高低，结果可肉眼判断，实现了可视化检测。 
综上所述，本发明集增强型金标显色的“可视化”与芯片技术的“高通量”于一体，制备了一种可用肉眼判断、且能同时检测多种(类)农药残留的免疫芯片。 
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 
图1为实施例1所述的可视化芯片的示意图； 
其中1＝羊抗IgG；2＝0.01M PBS；3＝三唑磷-OVA；4＝对硫磷-OVA；5＝甲基对硫磷-OVA；6＝吡虫啉-OVA；7＝毒死蜱-OVA；8＝克百威-OVA；每个三点重复(自上到下)。 
图2为实施例2所述的可视化芯片示意图； 
其中1＝羊抗鼠IgG；2＝0.01M PBS；3＝三唑磷-OVA；4＝对硫磷-OVA；5＝甲基对硫磷-OVA；6＝毒死蜱-OVA；7＝吡虫啉-OVA；8＝啶虫脒-OVA；9＝甲氰菊酯-OVA；10＝克百威-OVA；每个三点重复(自外向内)。 
具体实施方式
实施例1：三唑磷等6种农药多残留可视化芯片的制备方法： 
固相载体是长方形硝酸纤维素膜(Sartorius CN140，孔径8μm),大小为0.5cm(宽)×2cm(长)。固相载体上样品点包括阳性对照--阳性质控点，为羊抗鼠IgG用0.01M PBS(pH7.4) 稀释至质量浓度为2mg/mL；阴性对照---阴性质控点，为0.01M PBS(pH7.4)；检测点所用的农药半抗原-鸡卵清蛋白(OVA)偶联物分别为以下6种：三唑磷-OVA、对硫磷-OVA、甲基对硫磷-OVA、克百威-OVA、吡虫啉-OVA、毒死蜱-OVA)，用0.01M PBS(pH7.4)稀释成浓度为5-10mg/mL。 
将上述阳性对照、阴性对照、稀释后的6种农药半抗原-鸡卵清蛋白(OVA)偶联物按一定顺序点于硝酸纤维素膜上，点样示意图如图1所示。其中点样量为1μg/点，点样密度为30点/cm2，置37℃温箱中干燥30min。 
然后用洗涤液洗3次后晾干(吸水纸擦拭后自然晾干)，然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭未结合的区域，即，用500μL的BSA封闭液浸没膜载体并放于37℃湿盒(湿度45％-60％)中孵育30min；再用洗涤液洗涤3次后晾干(吸水纸擦拭后自然晾干)；得农药多残留可视化检测芯片(即形成可用的膜芯片)。放于4℃保存。 
所述BSA封闭液是浓度为10mg/mL的BSA溶液，上述BSA溶液是以0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)作为溶剂。 
所述洗涤液是体积浓度为0.05％Tween20的0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)溶液。即，在0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)中添加Tween20，直至Tween20的体积浓度为0.05％。 
实验1、利用实施例1所得的农药多残留可视化芯片进行的检测方法： 
分别制备6种农药对应的金标抗体复合物，采用常规金标蛋白的方法。标记时，先取10mL平均粒径为25nm的胶体金溶液，将pH调至8.5，逐滴加入1mL超纯水稀释的100μg/mL农药抗体，边加边混匀，10min加完后静置1h。再加入0.1g BSA，静置1h后离心0.5h(4℃，12000r/min)，弃上清。沉淀再用质量浓度为1％的BSA-PBS溶液(0.01M,pH8.5)洗涤并离心。然后重复洗涤-离心一次，最终沉淀溶于1mL的PBS缓冲溶液(0.01M,pH8.5，含质量浓度为1％BSA和10％蔗糖)，即获得纯化的金标抗体浓缩液，4℃冷藏备用。 
将所述的6种纯化的金标抗体浓缩液，即金标三唑磷单抗、金标对硫磷单抗、金标甲基对硫磷单抗、金标克百威单抗、金标吡虫啉单抗和金标毒死蜱单抗各25μL等体积混合，得150μL混合金标抗体。 
取待测样品液150μL与混合金标抗体150μL充分混匀后，得样品/抗体混合液；将实施例1所得的种农药多残留可视化芯片放入上述300μL的样品/抗体混合液浸泡，于37℃孵育反应10min。反应结束后，用洗涤液洗3次，吸水纸吸干。然后放入300μL现配的金标增强液浸泡(A液：2％氯金酸；B液：1M盐酸羟胺，1:1(V:V)混合)，于室温反应3min，最后用超纯水终 止反应(即，用超纯水洗涤掉膜上面的金标增强液，从而终止反应)。 
金标增强液的制备方法为：以质量浓度是2％的氯金酸水溶液作为A液，以浓度是1mol/L盐酸羟胺水溶液作为B液；将A液与B液按照1:1的体积比混合； 
所述洗涤液是体积浓度为0.05％Tween20的0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)溶液。 
经肉眼观察，如果列1颜色很浅甚至没有颜色，或者列2有颜色，则代表该芯片失效。如果列3(或列4、5、6、7、8)颜色越深，则代表样品中三唑磷(或对硫磷、甲基对硫磷、吡虫啉、毒死蜱、克百威)农药含量越少；反之，越多。通过与比色卡比对，可大致判断样品中某农药的浓度范围。设计的比色卡及解析见表1。 
备注说明：3个重复中，如果两个重复结果一致，另外一个有差异，那么少数服从多数，以两个相同点为准。 
如果三个重复差异均较大，有可能是因为操作不当或者芯片上固定的蛋白部分失活，建议换张芯片重试。 
表1.用于三唑磷等6种农药检测芯片的比色卡示意 
实际样品验证试验： 
选用风干并过筛后的稻田土壤作为人工样品基质，设置1档添加浓度(6种农药添加浓度均为20ng/g)。前处理方法如下：取2g土壤样品，加2mL乙腈涡旋提取1min，离心(4000rpm,5min)，吸取1mL上清液，氮气吹干，加入2mL含10％(v/v)甲醇的PBS(即样品稀释2倍)，涡旋1min，作为待测样品液；用于芯片检测。同时，用行业标准的色谱仪器法进行比对确证。检测结果为表2。 
表2.土壤人工样品验证结果 
实施例2、三唑磷等8种农药多残留可视化芯片的制备 
其中固相载体是圆形的硝酸纤维素膜(Sartorius CN140,孔径8μm)，直径是1cm；固相载体上样品点包括阳性对照--阳性质控点，为羊抗鼠IgG用0.01M PBS(pH7.4)稀释至质量浓度为2mg/mL；阴性对照---阴性质控点，为0.01M PBS(pH7.4)；检测点所用的农药半抗原-鸡卵清蛋白(OVA)偶联物分别为以下8种：三唑磷-OVA、对硫磷-OVA、甲基对硫磷-OVA、克百威-OVA、吡虫啉-OVA、甲氰菊酯-OVA、啶虫脒-OVA、毒死蜱-OVA，用0.01M PBS(pH7.4)稀释成浓度为5-10mg/mL。 
将上述阳性对照、阴性对照、稀释后的8种农药半抗原-鸡卵清蛋白(OVA)偶联物按一定顺序点于硝酸纤维素膜上，点样示意图如图2所示。其中点样量为1μg/点，点样密度为30点/cm2，置37℃温箱中干燥30min。 
然后用洗涤液洗3次后晾干(吸水纸擦拭后自然晾干)，然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭未结合的区域，即，用500μL的BSA封闭液浸没膜载体并放于37℃湿盒(湿度45％-60％)中孵育30min；再用洗涤液洗涤3次后晾干(吸水纸擦拭后自然晾干)；得农药多残留可视化检测芯片(即形成可用的膜芯片)。放于4℃保存。 
所述BSA封闭液是浓度为10mg/mL的BSA溶液，上述BSA溶液是以0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)作为溶剂。 
所述洗涤液是体积浓度为0.05％Tween20的0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)溶液。即，在0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)中添加Tween20，直至Tween20的体积浓度为 0.05％。 
实验2、利用实施例2所得的农药多残留可视化芯片进行的检测方法： 
分别制备8种农药对应的金标抗体复合物，采用常规金标蛋白的方法。标记时，先取10mL平均粒径为25nm的胶体金溶液，将pH调至8.5，逐滴加入1mL超纯水稀释的100μg/mL农药抗体，边加边混匀，10min加完后静置1h。再加入0.1g BSA，静置1h后离心0.5h(4℃，12000r/min)，弃上清。沉淀再用质量浓度为1％的BSA-PBS溶液(0.01M,pH8.5)洗涤并离心。然后重复洗涤-离心一次，最终沉淀溶于1mL的PBS缓冲溶液(0.01M,pH8.5，含质量浓度为1％BSA和10％蔗糖)，即获得纯化的金标抗体浓缩液，4℃冷藏备用。 
将所述的8种纯化的金标抗体浓缩液，即金标三唑磷单抗、金标对硫磷单抗、金标甲基对硫磷单抗、金标克百威单抗、金标吡虫啉单抗、金标毒死蜱单抗、金标菊酯单抗和金标啶虫脒单抗各25μL等体积混合，得200μL混合金标抗体。 
取待测样品液200μL与混合金标抗体200μL充分混匀后，得样品/抗体混合液；将实施例2所得的种农药多残留可视化芯片放入上述300μL的样品/抗体混合液浸泡，于37℃孵育反应10min。反应结束后，用洗涤液洗3次，吸水纸吸干。然后放入300μL现配的金标增强液(A液：2％氯金酸；B液：30％H2O2；C液：25mM吗啉乙磺酸(MES)，2:3:5(V:V:V)混合)浸泡，于室温反应3min，最后用超纯水终止反应(即，用超纯水洗涤掉膜上面的金标增强液，从而终止反应)。 
金标增强液的制备方法为：以质量浓度是2％的氯金酸水溶液作为A液，以体积浓度是30％H2O2水溶液作为B液，以浓度是25mmol/L吗啉乙磺酸水溶液作为C液；将A液、B液、C液按照2：3：5的体积比混合。 
所述洗涤液是体积浓度为0.05％Tween20的0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)溶液。 
经肉眼观察，如果列1颜色很浅甚至没有颜色，或者列2有颜色，则代表该芯片失效。如果列3(或列4、5、6、7、8、9、10)颜色越深，则代表样品中三唑磷(或对硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱、吡虫啉、啶虫脒、甲氰菊酯、克百威)农药含量越少；反之，越多。通过与比色卡比对，可大致判断样品中某农药的浓度范围。设计的比色卡及解析见表3。 
表3.用于三唑磷等8种农药检测芯片的比色卡示意 
验证试验： 
选用大白菜作为人工样品基质，设置1档添加浓度(8种农药添加浓度均为20ng/g)。前处理方法如下：取10g大白菜样品，加10mL乙腈涡旋提取1min。加入1g氯化钠和4g硫酸镁，涡旋提取2min后离心(4000rpm，5min)，吸取1mL上清液，氮气吹干，加入2mL含10％甲醇(v/v)的PBS(即样品稀释2倍)，涡旋1min，用于芯片检测。同时，用行业标准的色谱仪器法进行比对确证。检测结果为表4。 
表4.大白菜人工样品验证结果 
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 

Claims (10)

1.基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法，其特征在于：以硝酸纤维素膜为载体，将检测点及质控点点样在载体上形成点阵列，洗涤液洗涤并晾干后，用牛血清白蛋白封闭未结合的区域，再用洗涤液洗涤后晾干；得农药多残留可视化检测芯片。
2.根据权利要求1所述基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法，其特征在于：所述质控点分为阳性质控点和阴性质控点；所述阳性质控点为：羊抗鼠IgG；所述阴性质控点为0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)；
所述检测点为农药半抗原-鸡卵清蛋白偶联物。
3.根据权利要求2所述基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法，其特征在于：农药半抗原-鸡卵清蛋白偶联物为三唑磷-OVA、对硫磷-OVA、甲基对硫磷-OVA、克百威-OVA、毒死蜱-OVA、吡虫啉-OVA、啶虫脒-OVA、菊酯-OVA中的至少1个。
4.根据权利要求3所述基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法，其特征在于：
用0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)将农药半抗原-鸡卵清蛋白偶联物稀释成浓度为5-10mg/mL；
用0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)将羊抗鼠IgG稀释至质量浓度为2mg/mL；
所述阳性质控点、阴性质控点、检测点的点样用量均分别为1～5μg/点。
5.根据权利要求4所述基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法，其特征在于：所述洗涤液是体积浓度为0.05％Tween20的0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)溶液。
6.根据权利要求5所述基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法，其特征在于：
所述用牛血清白蛋白封闭未结合的区域，为：将前述步骤所得的载体浸泡在10mg/mL的BSA溶液中，并放于湿度为45％-60％的湿盒中于36.5～37.5℃中孵育28～32min。
7.根据权利要求6所述基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的制备方法，其特征在于：
所述硝酸纤维素膜为Sartorius CN140，孔径8μm。
8.如权利要求1～7任一方法制备而得的基于膜材料的农药多残留可视化检测芯片的使用方法，其特征在于：
先将每种金标农药抗体等体积混合，得混合金标抗体；然后将待测样品液与混合金标抗体等体积混合，得样品/抗体混合液；接着将农药多残留可视化检测芯片浸泡在样品/抗体混合液中，于36.5～37.5℃孵育反应8～12分钟；所述金标农药抗体与芯片上的农药半抗原相一一对应；
反应结束后，先将孵育反应后所得的芯片洗涤并干燥，然后浸泡在金标增强液中于室温反应3分钟；接着用超纯水终止显色反应；最后根据点的颜色深浅来判断待测样品中农药含量。
9.根据权利要求8所述的农药多残留可视化检测芯片的使用方法，其特征在于：
所述金标增强液按照以下任一方法制备而得：
方法一：以质量浓度是2％的氯金酸水溶液作为A液，以浓度是1mol/L盐酸羟胺水溶液作为B液；将A液与B液按照1:1的体积比混合；
方法二：以质量浓度是2％的氯金酸水溶液作为A液，以体积浓度是30％H2O2水溶液作为B液，以浓度是25mmol/L吗啉乙磺酸水溶液作为C液；将A液、B液、C液按照2：3：5的体积比混合。
10.根据权利要求9所述的农药多残留可视化检测芯片的使用方法，其特征在于：
比色卡中颜色深浅代表待测样品中农药含量的多少；
如果检测点颜色越浅，则代表待测样品中对应农药越多；反之，越少。
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