CN101334409A

CN101334409A - 一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法

Info

Publication number: CN101334409A
Application number: CNA2008100212230A
Authority: CN
Inventors: 胥传来; 殷祥刚; 尹丽梅; 袁媛; 徐一平; 马伟; 彭池方
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2008-07-22
Filing date: 2008-07-22
Publication date: 2008-12-31

Abstract

一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，属于免疫分析技术领域。本发明利用合成的甲基对氧磷免疫原免疫获得到多克隆抗体，以甲基对氧磷为标准品，以甲基对氧磷半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了纺织品(棉花)中甲基对氧磷的间接竞争酶联免疫分析方法。本发明建立了纺织品中甲基对氧磷农药代谢物的间接ELISA方法，为甲基对氧磷在纺织品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.01ppm，线性范围为0.1－20ppm。免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏度。

Description

一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法

技术领域

一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，涉及一种农药代谢物残留检测方法，更具体的说是用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测纺织品原料棉花中的甲基对氧磷的残留，属于免疫分析技术领域。

背景技术

上世纪60年代以来的研究进一步发现，除了农药本身以外，它的代谢产物也会出现残留毒性问题，且毒性比农药母体还要强。这一发现不仅促使加强了对农药残留降解的研究，还引发了对农药降解过程中代谢产物毒性的研究。甲基对硫磷(M 1605)是常见的有机磷农药，而甲基对氧磷(M 1600)为其代谢产物。甲基对氧磷的毒性，比原母体甲基对硫磷毒性更大。甲基对硫磷在喷洒作物上消失很快，在短期内，少量的甲基对硫磷已转变为甲基对氧磷而增加毒性。因而检测甲基对氧磷的残留成为一种必要，而且还可以作为甲基对硫磷的接触生物标志物。

甲基对硫磷(Parathion-methyl) 甲基对氧磷(Paraoxon-methyl)

既往甲基对氧磷检测多用液相色谱法，仪器昂贵，纯化费时，且需要专门人员操作。酶联免疫吸附测定法(ELISA)提供了一种痕量甲基对氧磷检测的快速、灵敏、选择性的检测方法。张卫国，马兆扬合成了甲基对氧磷的人工抗原并进行了鉴定，得到了较好的多克隆抗体。但只对抗体的效价、特异性进行了测定。目前还缺少对实际样本中的甲基对氧磷残留检测建立ELISA方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，是一种快速检测纺织品中甲基对氧磷农药代谢物残留的免疫学检测方法，使样品无需经过繁琐的提纯或浓缩步骤，并且保证较高的敏感性和特异性。

本发明的技术方案：利用尹丽梅、胥传来、袁媛等(一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法[P].中国专利：CN101172984A)合成的O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯为半抗原，此半抗原与BSA偶联作为免疫原免疫健康新西兰大白兔得到多克隆抗体，半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了纺织品中甲基对氧磷农药残留的间接竞争酶联免疫方法。

一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，步骤如下：

(1)抗原的包被

以半抗原O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯与卵清蛋白OVA的偶联复合物作为包被抗原，以0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1∶32000～1∶64000，浓度为0.625～1.25μg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，封闭2h；

(2)竞争反应

将免疫制备的甲基对氧磷多克隆抗体用抗体稀释液：含0.1％明胶、含0.05％吐温-20、pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲溶液PBST，按1∶2000～1∶4000比例稀释后，加入酶标板中，每孔加50μL，同时每孔分别加入标准品稀释液PBST稀释的0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL系列浓度之一的甲基对氧磷标准品50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(3)加酶标二抗

加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，以抗体稀释液稀释为1∶5000，每孔加100μL，37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(4)显色

每孔加入100μL显色液，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL、2mol/L的硫酸终止液，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀，与所作的标准曲线对比算出待测样品的甲基对氧磷浓度。

显色液配方：A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL30％H₂O₂用超纯水定容至100mL；B液：60mg 3，3^/，5，5^/-四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；使用前将A液与B液以5∶1体积混合。

标准品稀释液PBST为含0.15mol/LNaCl、含0.5％Tween-20的0.01mol/L、pH 7.4PBST溶液。

1、主要溶液配制：

1)配制0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)：

Na₂HPO₄.12H₂O 3.62g，

KH₂PO₄ 0.2g，

KCl 0.2g，

NaCl 8.0g，加超纯水稀释至1000mL。

2)配置0.05M、pH 9.6碳酸盐缓冲溶液(CBS)

Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加超纯水稀释至1000mL。

3)配制PBST溶液：含0.05％Tween-20的PBS溶液。

4)配制封闭液：含0.1％明胶的碳酸盐缓冲液

5)配制抗体稀释液：含0.1％明胶的PBST溶液。

6)配制标准品稀释液：含0.15mol/L NaCl、含0.5％Tween-20的0.01mol/L、pH7.4PBST溶液。

7)显色液：

A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL30％H₂O₂，用超纯水定容至100mL；

B液：60mg 3，3^/，5，5^/-四甲基联苯胺(TMB)溶于100mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5∶1体积混合。

8)终止液：2M的H₂SO₄。

本发明的有益效果：本发明建立了纺织品中甲基对氧磷农药的间接ELISA方法，为纺织品中甲基对氧磷农药残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.01ppm，线性范围为0.1～20ppm，半数抑制量(IC₅₀)为1.27μg/mL，回收率为78.9％，与其他有机磷农药几乎无交叉反应。免疫反应的高特异性和高亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏性，样本前处理过程简单。

附图说明

图1甲基对氧磷的标准抑制曲线。

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。

仪器：

TGL-40B台式低速离心机上海安亭科学仪器厂，

KFLO纯水机凯佛隆公司，

ZD-9556水平摇床太仓科教器材厂，

Costar96孔8×12可拆酶标板上海吉泰生物科技有限公司，

MuLtiska Mks酶标仪 Thermo Labsystems公司，

可调试移液器 Thermo Labsystems公司，

涡旋混合器上海沪西仪器分析厂。

试剂：

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG) 康成生物工程公司，

四甲基联苯胺(TMB) 华美生物工程公司，

其他试剂均为分析纯试剂

实施例1、间接竞争ELISA实验方法的步骤如下：

预先将甲基对氧磷标准品配制成1000μg/mL的甲醇溶液作为工作母液，在4℃保存待用。配制PBST溶液(0.01mol/L，pH7.4，0.15mol/L NaCl，0.5％Tween-20)，以此为基础配制系列反应液，用以稀释竞争物标准液和抗血清。

a、包被：用设定浓度的包被原包被酶联反应板，100μL/孔，4℃过夜。

b、洗涤：用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板。

c、封闭：含0.1％明胶的CBS，200μL/孔.37℃封闭2h。

d、洗涤：同b

e、竞争：用标准品稀释液PBST将甲基对氧磷母液稀释成0.01μg/mL，0.1μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL系列浓度，另设一个标准品稀释液PBST空白对照，50μL/孔。然后每孔加入50μL稀释4000倍的抗血清，于37℃温育1h。

f、洗涤：同b

g、加酶标二抗(羊抗兔HRP-IgG，1∶5000)，100μL/孔，37C反应1h。

h、洗涤：同b

i、显色：加底物TMB100μL/孔，显色15min。

j、终止：加终止液100μL/孔。

k、测定：用酶标仪检测OD_450nm。

实施例2、实际样本检测

取阴性样本(棉花)为代表性样品，将其剪碎至5mm×5mm一下，混匀。分别称取1.0g试样置于100mL具塞锥形瓶中，然后将一定浓度的甲基对氧磷标准品的丙酮溶液加入其中，使甲基对氧磷在棉花中的终浓度分别为0.1μg/g、1μg/g、10μg/g，室温静置15min。在锥形瓶中加入20mL乙酸乙酯，于超声波发生器中提取20min，将提取液滤出。残渣再用10mL乙酸乙酯超声提取5min，将两次滤液合并。将滤液在40℃水浴旋转蒸发器中浓缩至近干，用丙酮溶解并定容至1mL，然后用氮气吹干，以含10％-20％甲醇的PBS溶解，用于ELISA检测；由于甲基对氧磷具有一定的疏水性及非极性，极易吸附于玻璃器皿壁上，溶解时要充分振荡。

实施例3、回收率及样品提取方法的确定

取阴性样本(棉花)为代表性样品，将其剪碎至5mm×5mm一下，混匀。分别称取1.0g试样置于100mL具塞锥形瓶中，然后将一定浓度的甲基对氧磷标准品的丙酮溶液加入其中，使甲基对氧磷在棉花中的终浓度分别为0.1μg/g、1μg/g、10μg/g，室温静置15min。

在锥形瓶中加入20mL乙酸乙酯，于超声波发生器中提取20min，将提取液滤出。残渣再用10mL乙酸乙酯超声提取5min，将两次滤液合并。

将滤液在40℃水浴旋转蒸发器中浓缩至近干，用丙酮溶解并定容至1mL，然后用氮气吹干，以含10-20％甲醇的PBS溶解。

移取50μL样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定。

回收率的计算：根据不同添加浓度的样品OD值计算相应的抑制率，再根据相应的抑制率从标准曲线上查到各自的浓度。检测浓度与真实浓度之比为对应浓度的回收率。

试验结果如下：

标准曲线：本方法所获得的抗原检测的线性范围是为0.1～20μg/mL，具体请见说明书附图。

灵敏度：灵敏度是所得90％空白孔吸光值所对应的标准品的浓度，即IC₉₀为0.01μg/mL。

交叉反应率(Cross Reactive，C.R％)

将几种结构相近的有机磷农药进行交叉反应研究。

IC₅₀是抑制率为50％时各有机磷农药标准品的浓度。从下表数据可知与其他类似结构有机磷农药的交叉反应率很低，说明此抗体具有较好的特异性。

表1交叉反应率测定结果

名称(name)	IC₅₀(μg/mL)	C.R％
名称(name)	IC₅₀(μg/mL)	C.R％	甲基对氧磷(paraoxon-methyl)	1.27	100
甲基对硫磷(parathion-methyl)	13	9.7	甲基对氧磷(paraoxon-methyl)	1.27	100
甲基对硫磷(parathion-methyl)	13	9.7	对氧磷(paraoxon)	10.7	11.8
对硫磷(parathion)	＞100	＜1	对氧磷(paraoxon)	10.7	11.8
对硫磷(parathion)	＞100	＜1	敌敌畏(dichlorvos)	24	5.3
速灭磷(mevinphos)	＞1000	-	敌敌畏(dichlorvos)	24	5.3

回收率测定

加标棉花样品后进行ELISA测定，结果见下表。回收率在78％～117％之间。

表2ELISA检测加标样品回收率结果

甲基对氧磷添加量(μg/g)	检出量(μg/g)	回收率(％)
甲基对氧磷添加量(μg/g)	检出量(μg/g)	回收率(％)	0.1	0.117	117
1	0.914	91.4	0.1	0.117	117
1	0.914	91.4	10	7.884	78.84

Claims

1、一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，其特征在于步骤如下：

(1)抗原的包被

(2)竞争反应

(3)加酶标二抗

(4)显色

2、根据权利要求1所述的甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，其特征在于显色液配方：A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL30％H₂O₂用超纯水定容至100mL；B液：60mg 3，3^/，5，5^/-四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；使用前将A液与B液以5∶1体积混合。

3、根据权利要求1所述的甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，其特征在于标准品稀释液PBST为含0.15mo1/LNaCl、含0.5％Tween-20的0.01mol/L、pH 7.4PBST溶液。