CN104597039A

CN104597039A - 一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法及用途

Info

Publication number: CN104597039A
Application number: CN201410825887.8A
Authority: CN
Inventors: 姚宏; 史培颖; 林新华
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2014-12-28
Filing date: 2014-12-28
Publication date: 2015-05-06

Abstract

本发明公开一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法及用途。其特征在于，以化学发光探针为指示剂，指示有机磷农药抑制乙酰胆碱酯酶催化水解氯乙酰胆碱生成胆碱减少的程度，通过偶联胆碱氧化酶催化胆碱生成过氧化氢，随后过氧化氢氧化发光探针产生化学发光，经过上述这种多步耦合反应等步骤，利用化学发光仪实现有机磷农残的传感检测。该传感方法在20分钟内能检测96个样本，以敌敌畏为例，检测限达到1nmol/L。该方法灵敏、快速，可以用于食品、水样及有机磷毒物中毒病人的血样监控。

Description

一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法及用途

技术领域

本发明属于分析检测新方法和新原理,特别涉及利用化学发光酶标仪和化学发光探针高通量、快速检测有机磷农药残留的新原理及应用。

背景技术

有机磷农药是我国目前应用最为广泛和常见的杀虫剂。近年来，由于有机磷农药的滥用、超量使用及误用，导致有机磷中毒事件时有发生。特别是农作物病虫防害过程中，经常超量使用有机磷农药，导致农产品中有机磷农药残留情况严重，长期食用农残超标的农产品对身体造成的伤害毋庸置疑。此外，误服有机磷农药导致的急性中毒事件也经常发生。为满足农残检测、环境及误服患者血液监控的需要，发明快速、高通量的有机磷毒物检测方法或仪器，意义显著。目前已有的有机磷毒物检测方法或仪器存在灵敏度低、样品处理能力低、耗时的缺陷，对农残样本、环境样本、中毒患者血样本的快速、高通量检测难以实现。

发明内容

本发明旨在提供一种高灵敏度、高通量的有机磷农药残留化学发光传感检测新方法。

本发明的另一目的是提供这种传感检测方法的用途。

本发明的高灵敏度、高通量的有机磷农药残留化学发光传感检测新方法的原理是：有机磷农药是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，能够竞争性抑制乙酰胆碱酯酶催化氯乙酰胆碱生成甜菜碱的反应，进而导致了胆碱氧化酶催化甜菜碱生成过氧化氢量的减少，从而抑制了化学发光探针与过氧化氢的化学发光反应，导致了化学发光强度的降低。利用化学发光传感仪，检测这种化学发光被抑制的程度，可反映出测试样中有机磷的残留量。

本发明的目的是这样实现的，所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于：

以化学发光探针为指示剂，有机磷农药同时竞争性抑制胆碱酯酶催化乙酰胆碱生成胆碱的反应，导致胆碱生成减少，引起酶催化胆碱生成的过氧化氢的量减少，化学发光探针被过氧化氢氧化产生的化学发光强度随之降低；通过发光检测仪检测化学发光强度的变化测定有机磷农药残留量。

所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于1）以鲁米诺或过氧化草酸酯为化学发光探针，以乙酰胆碱酯酶及胆碱氧化酶为酶体系，以氯化乙酰胆碱为底物；有机磷农药抑制乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱生成胆碱的反应，导致胆碱生成减少，引起胆碱氧化酶催化胆碱生成的过氧化氢的量减少，化学发光探针被过氧化氢氧化产生的化学发光强度随之降低，通过发光检测仪检测化学发光强度的变化而建立敌敌畏农药的标准曲线；2）有机磷农药残留样品检测，取有机磷农药残留待测样品配制成溶液放置在酶标板的孔中，取蒸馏水加入酶标板的其它孔中做空白对照，所有加了溶液的孔均加入乙酰胆碱酯酶溶液，酶标板震摇器上在30-40℃震摇反应后再各加入氯乙酰胆碱及胆碱氧化酶，30-40℃震摇反应，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂鲁米诺，同时检测化学发光反应强度变化；代入敌敌畏标准曲线，计算残留量。

所述胆碱酯酶为乙酰胆碱酯酶，其浓度为1～100U/mL。

所述催化胆碱生成过氧化氢的酶为胆碱氧化酶，其浓度为1～100U/mL。

所用的化学发光探针为鲁米诺或过氧化草酸酯，鲁米诺浓度为1×10^-5 ~1×10^-2 mol/L，过氧化草酸酯TCPO浓度为1×10^-4 ~1×10^-2 mol/L。

所述的发光检测仪为荧光或化学发光检测酶标仪。

所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于1）建立敌敌畏农药的标准曲线，吸取50μL 1 ng/mL～1μg/mL系列敌敌畏标准溶液放置在96孔酶标板的孔中，再另外吸取空白溶液50μl加入96孔酶标板的其他孔中，所有加了溶液的孔均加入乙酰胆碱酯酶（pH=7）溶液50μl，酶标板震摇器上37℃震摇反应10分钟，之后再各加入氯乙酰胆碱及胆碱氧化酶各50μl（pH=7），37℃震摇反应10分钟，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂鲁米诺，同时检测化学发光反应强度。化学发光强度与样品中的有机磷物质成负相关，其线性方程为ΔI = 3333 logC (mol L^-1) + 120.19，检测限为1nmol/L；2）有机磷农药残留样品检测，取有机磷农药残留待测样品配制成溶液放置在96孔酶标板的孔中，取蒸馏水50μl加入96孔酶标板的其它孔中做空白对照，所有加了溶液的孔均加入乙酰胆碱酯酶（pH=7）溶液50μl，酶标板震摇器上37℃震摇反应10分钟，之后再各加入氯乙酰胆碱及胆碱氧化酶各50μl（pH=7），37℃震摇反应10分钟，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂鲁米诺，同时检测化学发光反应强度变化；代入敌敌畏标准曲线，计算残留量。

本发明所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于应用于食品、水样及有机磷毒物中毒病人的血样监控。

具体地说，本发明提供了如下技术方案：

本发明的胆碱酯酶为乙酰胆碱酯酶，其浓度为1～100U/mL，优选为10U/mL。

本发明的催化胆碱氧化生成甜菜碱和过氧化氢的酶为胆碱氧化酶，其浓度为1～100U/mL，优选为10U/mL。

本发明的乙酰胆碱酯酶反应底物为氯化乙酰胆碱，其浓度为1×10^-8g/mL ~1×10^-2g/mL，优选为1×10^-4g/mL。

本发明的化学发光探针为鲁米诺或过氧化草酸酯TCPO，其浓度分别为1×10^-5 ~1×10^-2 mol/L，1×10^-4 ~1×10^-2 mol/L。优选的浓度分别为1×10^-4 mol/L的鲁米诺溶液和1×10^-3 mol/L过氧化草酸酯溶液。

本发明的有机磷农药竞争性抑制胆碱酯酶催化乙酰胆碱酯酶的反应时间为1～30min，优选为10min。

本发明的胆碱氧化酶催化胆碱反应时间为1～30min，优选为10min。

本发明的化学发光传感检测仪为流动注射化学发光分析仪、静态化学发光检测仪、化学发光及荧光酶标检测仪，优选为化学发光酶标检测仪。

本发明的化学发光检测时间点为化学发光探针混合到反应溶液后0.1～60s，优选为0.1s。

本发明的优点：

本发明的有机磷农药残留化学发光传感检测新方法可应用于果蔬、生物体液、环境水样本中有机磷农药的残留灵敏、高通量检测。该传感检测方法在20分钟内能检测96个样本，以敌敌畏为例，检测限达到1nmol/L。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例一敌敌畏农药的标准曲线

吸取50μL1 ng/mL～1μg/mL系列敌敌畏标准溶液放置在96孔酶标板的孔中，再另外吸取取蒸馏水50μl加入96孔酶标板的其它孔中做空白对照，在96孔酶标板的孔中所有加了溶液的孔均加入浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶（pH=7）溶液50μl，酶标板震摇器上37℃震摇反应10分钟，之后再各加入浓度为1×10^-4g/mL 的乙酰胆碱及浓度为10U/mL的胆碱氧化酶各50μl（pH=7），37℃震摇反应10分钟，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂鲁米诺或过氧化草酸酯TCPO，鲁米诺溶液或过氧化草酸酯TCPO的浓度分别为1×10^-4 mol/L、1×10^-3 mol/L，同时检测化学发光反应强度。化学发光强度与样品中的有机磷物质成负相关。当以鲁米诺为发光探针检测时，其线性方程为ΔI = 3333 logC (mol L^-1) + 120.19，检测限为1nmol/L, 对1nmol/L样品进行11次平行测定，RSD为5.7%；当以过氧化草酸酯TCPO为发光探针检测时，其线性方程为ΔI = 1.231 C (mol L^-1) + 12.19，检测限为1nmol/L，对1nmol/L样品进行11次平行测定，RSD为7.5%。

实施例二苹果中敌敌畏农药的检测

取新鲜的苹果1个，榨汁，将果汁抽滤，取三份上清夜各1mL，用移液器取10μL 、50μL、100 μL 1 μg/mL敌敌畏分别加入上述三份上清夜中，混匀，为样品溶液。取样品溶液各50μl，分别放置在96孔酶标板的孔中，再另外吸取蒸馏水50μl加入96孔酶标板的其他孔中做空白对照，在96孔酶标板的孔中所有加了溶液的孔均加入浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶（pH=7）溶液50μl，酶标板震摇器上37℃震摇反应10分钟，之后再各加入浓度为1×10^-4g/mL 的乙酰胆碱及浓度为10U/mL的胆碱氧化酶各50μl（pH=7），37℃震摇反应10分钟，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂鲁米诺，鲁米诺溶液的浓度为1×10^-4 mol/L，同时检测化学发光反应强度变化。带入敌敌畏标准曲线，计算敌敌畏量结果如下表1。

表1为样品测定结果（n＝6 ）

实施例三小白菜中敌敌畏农药残留检测

新鲜小白菜5颗，榨汁后，普通滤纸抽滤，取滤液50μL，放置在96孔酶标板的孔中，再另外吸取蒸馏水50μl加入96孔酶标板的其他孔中做空白对照，在96孔酶标板的孔中所有加了溶液的孔均加入浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶（pH=7）溶液50μl，酶标板震摇器上37℃震摇反应10分钟，之后再各加入浓度为1×10^-4g/mL 的乙酰胆碱及浓度为10U/mL的胆碱氧化酶各50μl（pH=7），37℃震摇反应10分钟，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂鲁米诺，鲁米诺溶液的浓度为1×10^-4 mol/L，同时检测化学发光反应强度变化。代入敌敌畏标准曲线，计算残留量。

实施例四水体中敌敌畏农药残留检测

10ml水样，普通滤纸抽滤，取滤液50μL，放置在96孔酶标板的孔中，再另外吸取蒸馏水50μl加入96孔酶标板的其他孔中做空白对照，在96孔酶标板的孔中所有加了溶液的孔均加入浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶（pH=7）溶液50μl，酶标板震摇器上37℃震摇反应10分钟，之后再各加入浓度为1×10^-4g/mL 的乙酰胆碱及浓度为10U/mL的胆碱氧化酶各50μl（pH=7），37℃震摇反应10分钟，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂鲁米诺，鲁米诺溶液的浓度为1×10^-4 mol/L，同时检测化学发光反应强度变化。代入敌敌畏标准曲线，计算残留量。

实施例五有机磷中毒患者血液中敌敌畏农药残留检测

取0.1ml血样，加甲醇0.3ml，涡旋2min，16000 rpm离心15min，取上清50μl放置在96孔酶标板的孔中，再另外吸取蒸馏水50μl加入96孔酶标板的其他孔中做空白对照，在96孔酶标板的孔中所有加了溶液的孔均加入浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶（pH=7）溶液50μl，酶标板震摇器上37℃震摇反应10分钟，之后再各加入浓度为1×10^-4g/mL 的氯乙酰胆碱及浓度为10U/mL的胆碱氧化酶各50μl（pH=7），37℃震摇反应10分钟，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂过氧化草酸酯TCPO，过氧化草酸酯TCPO的浓度为1×10^-3mol/L，同时检测化学发光反应强度变化。代入敌敌畏标准曲线，计算残留量。

Claims

1.一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于1）以鲁米诺或过氧化草酸酯为化学发光探针，以乙酰胆碱酯酶及胆碱氧化酶为酶体系，以氯化乙酰胆碱为底物；有机磷农药抑制乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱生成胆碱的反应，导致胆碱生成减少，引起胆碱氧化酶催化胆碱生成的过氧化氢的量减少，化学发光探针被过氧化氢氧化产生的化学发光强度随之降低，通过发光检测仪检测化学发光强度的变化而建立敌敌畏农药的标准曲线；2）有机磷农药残留样品检测，取有机磷农药残留待测样品配制成溶液放置在酶标板的孔中，取蒸馏水加入酶标板的其它孔中做空白对照，所有加了溶液的孔均加入乙酰胆碱酯酶溶液，酶标板震摇器上在30-40℃震摇反应后再各加入氯乙酰胆碱及胆碱氧化酶，30-40℃震摇反应，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂鲁米诺，同时检测化学发光反应强度变化；代入敌敌畏标准曲线，计算残留量。

3.根据权利要求1所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于所述胆碱酯酶为乙酰胆碱酯酶，其浓度为1～100U/mL。

4.根据权利要求1所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于所述催化胆碱生成过氧化氢的酶为胆碱氧化酶，其浓度为1～100U/mL。

5.根据权利要求1所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于所用的化学发光探针为鲁米诺或过氧化草酸酯，鲁米诺浓度为1×10^-5 ~1×10^-2 mol/L，过氧化草酸酯TCPO浓度为1×10^-4 ~1×10^-2 mol/L。

6.根据权利要求1或2或3或4所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于所述的发光检测仪为荧光或化学发光检测酶标仪。

7.根据权利要求1或2或3或4所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于1）建立敌敌畏农药的标准曲线，吸取50μL 1 ng/mL～1μg/mL系列敌敌畏标准溶液放置在96孔酶标板的孔中，再另外吸取空白溶液50μl加入96孔酶标板的其他孔中，所有加了溶液的孔均加入pH=7的乙酰胆碱酯酶溶液50μl，酶标板震摇器上37℃震摇反应10分钟，之后再各加入pH=7的氯乙酰胆碱及胆碱氧化酶各50μl，37℃震摇反应10分钟，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂鲁米诺，同时检测化学发光反应强度;化学发光强度与样品中的有机磷物质成负相关，其线性方程为ΔI = 3333 logC (mol L^-1) + 120.19，检测限为1nmol/L；2）有机磷农药残留样品检测，取有机磷农药残留待测样品配制成溶液放置在96孔酶标板的孔中，取蒸馏水50μl加入96孔酶标板的其它孔中做空白对照，所有加了溶液的孔均加入pH=7的乙酰胆碱酯酶溶液50μl，酶标板震摇器上37℃震摇反应10分钟，之后再各加入pH=7的氯乙酰胆碱及胆碱氧化酶各50μl，37℃震摇反应10分钟，随后将酶标板转移到化学发光传感检测仪上，自动注射化学发光探针试剂鲁米诺，同时检测化学发光反应强度变化；代入敌敌畏标准曲线，计算残留量。

8.权利要求1-7任一所述的一种有机磷农药残留化学发光传感检测方法，其特征在于应用于食品、水样及有机磷毒物中毒病人的血样监控。