CN101003803A - 家蝇乙酰胆碱酯酶活性蛋白的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备家蝇乙酰胆碱酯酶活性蛋白的方法，包括以下步骤：1)将编码具有家蝇乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成家蝇乙酰胆碱酯酶表达载体；2)将上述步骤的表达载体转入宿主细胞，形成家蝇乙酰胆碱酯酶的重组细胞；3)在适合表达家蝇乙酰胆碱酯酶多肽的条件下，培养上述步骤的重组细胞；4)分离出具有家蝇乙酰胆碱酯酶蛋白活性的多肽。按照本发明方法制备的乙酰胆碱酯酶活性蛋白，能用于在有机磷或氨基甲酸酯类杀虫剂中的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及蝇乙酰胆碱酯酶基因在昆虫细胞中的表达，以及表达产物的纯化及在农药检测中的应用。
背景技术
1951年Giang与Hall应用有机磷和氨基甲酸酯类农药在体外对胆碱酯酶(chE)具有抑制作用来测定其含量。1957年Kramer与Gamson用一种与靛酚乙酸酯相似的化合物，测定1～10μg的各种有机磷酸酯化合物。从此，开创了一种快速检测有机磷农药的方法-酶抑制法。
1953年Stedman(1932)等首先从马血清中分离出乙酰胆碱酯酶，此后不同来源的乙酰胆碱酯酶相继得到纯化和研究。据文献报道，目前已就以下来源的乙酰胆碱酯酶进行了分离纯化的研究，动物来源主要集中在动物肝脏和血液，如猪肝、鸡血等，鸡血中提取的乙酰胆碱酯酶活性保持较好，而猪肝中提取的酶对农药的参比数据较大，所以也比较好(赵建庄，梁桂枝等，2003)。另外，蚯蚓、电鳐中乙酰胆碱酯酶含量也较为丰富(丁诗华，李清漪.1997)。也有报道海洋鱼类如黄鱼、甲壳类动物的神经组织、血液、肝脏中也广泛存在乙酰胆碱酯酶，其中脑组织中含量最为丰富(朱小山等，2003；何东海等，2003)。植物来源的乙酰胆碱酯酶研究尚未深入，只是表明粮食作物中含量较其它的高。目前研究比较集中在从昆虫体内提取乙酰胆碱酯酶，而且国内外也进行了大量的研究，根据湖北大学彭宇等人的总结整理，现在已就下列昆虫体内的乙酰胆碱酯酶进行了分离纯化(彭宇，王荫长等，2002)：家蝇、麦二叉蚜、黄猩猩果蝇、烟草天蛾、光叶库蚊、黄粉甲、美洲淤夜蛾、豆荚草盲蝽、马铃薯叶甲、骚扰角蝇、棉铃虫等。酶抑制法进行农药残留检测以从敏感家蝇中提取的乙酰胆碱酯酶效果最佳，其敏感性优于其他来源的乙酰胆碱酯酶，董杰等人研究表明，家蝇羽化后2-3d(3-5 d龄)时其头部的乙酰胆碱酯酶敏感性最高(董杰，王开运等，2003)。
但是用敏感家蝇头部乙酰胆碱酯酶提取液检测农药残留有一定的局限性，大部分研究中都是成虫头部的天然匀浆作为粗酶液。但是在天然匀浆中包含了除AChE外的多种蛋白(包括多种酶)，这些蛋白的存在会干扰AChE对杀虫剂的敏感性。例如，从绿色桃蚜中分离出的一种羧酸酯酶能够水解或是屏蔽AChE抑制剂，如有机磷和氨基甲酸盐类杀虫剂。类似的，从绿色稻叶蝉中分离出的酯酶能起到双重的作用：为水解马拉硫磷和氰戊菊酯做催化剂，为有机磷杀虫剂(oxygen analogs)做绑定蛋白。对草地贪夜蛾头部AChE的研究也发现了这个问题(S.J.Yu，2003；S.J.Yu，et al，2006)。所以用纯化的AChE来检测非常重要的，但是繁殖饲养大量的敏感家蝇，前期的准备工作也是比较复杂的。
杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system，BEVS)是20世纪80年代发展起来的真核表达系统，Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是利用杆状病毒穿梭载体Bacmid，它含有完整的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)基因组，既能在大肠杆菌中低拷贝复制和稳定分离，又可以直接转染昆虫细胞，得到病毒粒子。外源基因通过位点特异性转座作用整合到Bacmid中，经过筛选重组Bacmid。直接转染昆虫细胞，得到纯的重组病毒，同时高效表达外源基因，该系统具有快速稳定高效等特点。
因此，利用基因工程手段生产敏感家蝇的AChE则会避免上述问题，通过分子生物学手段找到敏感家蝇的乙酰胆碱酯酶基因，克隆之后，利用Bac-to-Bac杆状病毒高效表达系统在昆虫细胞中快速稳定高效表达。真核表达的特点就是可以进行翻译后加工，表达的蛋白具有活性，因此用此种方法即可获得大量的活性蛋白，经过纯化之后便可以获得纯的AChE，避免了昆虫体内多种蛋白的干扰，进一步完善了农药残留的快速检测方法。同时，真核细胞表达的蝇AChE在农药设计和筛选方面也有广泛用途。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能用于快速检测有机磷或氨基甲酸酯类杀虫剂的蝇乙酰胆碱酯酶。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种制备家蝇乙酰胆碱酯酶活性蛋白的方法，包括以下步骤：
1)、将编码具有家蝇乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成家蝇乙酰胆碱酯酶表达载体；
2)、将上述步骤的表达载体转入宿主细胞，形成家蝇乙酰胆碱酯酶的重组细胞；
3)、在适合表达家蝇乙酰胆碱酯酶多肽的条件下，培养上述步骤的重组细胞；
4)、分离出具有家蝇乙酰胆碱酯酶蛋白活性的多肽。
本发明还提供了上述方法制得的乙酰胆碱酯酶活性蛋白的用途，用于在有机磷或氨基甲酸酯类杀虫剂中的快速检测。
因此，本发明主要解决了以下几个问题：1、外源基因在昆虫细胞中的表达技术，2、乙酰胆碱酯酶的纯化技术，3、家蝇乙酰胆碱酯酶对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的快速检测方法。
本发明所提供的制备这种家蝇乙酰胆碱酯酶的表达系统，含家蝇乙酰胆碱酯酶核苷酸的重组载体，含重组载体的宿主细胞。
本发明所提供的一种农药残留检测的新方法，利用上述从宿主细胞中表达出的家蝇乙酰胆碱酯酶活性蛋白，通过分离纯化，得到了纯度较高的活性蛋白，试验表明，该蛋白有比直接从家蝇头部提取的粗酶更好的检测活性，进一步完善了乙酰胆碱酯酶在有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂中的快速检测的方法。
本发明的优点：
(1)传统经典的有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测主要是应用色谱和层析的方法，此种方法虽然精密但是价格昂贵，不适用于一般的农药残留检测；
(2)最初应用乙酰胆碱酯酶检测有机磷和氨甲甲酸酯类农药，酶源主要来自于马血清，然后是猪肝和鸡血中的乙酰胆碱酯酶，但是这些酶的灵敏度都不够高；
(3)目前所用的酶源主要来自于敏感家蝇头部的粗提酶液，比动物来源的乙酰胆碱酯酶敏感性要高许多。但是该粗提酶液中还有许多其余的杂蛋白，会干扰对酶活性的研究，所以使用纯化的酶来检测效果要好得多。但是前期饲养家蝇需要做大量的准备工作，程序比较繁琐；
(4)此法应用基因工程手段，克隆到敏感家蝇的乙酰胆碱酯酶基因，利用Bac-to-Bac杆状病毒高效表达系统在昆虫细胞中高效表达此外源基因，获得大量表达蛋白，经过纯化后可以获得大量的活性蛋白。此方法只需要一次性构建载体，转染进细胞，获得重组病毒之后就可以不断地表达目的蛋白。
附图说明
图1所示的为家蝇AChE在Tn细胞中的表达和Western印迹分析，与对照相比表达的乙酰胆碱酯酶在所有的蛋白中占将近22％。M：标准分子量；泳道1：Tn细胞；泳道2：感染对照病毒的Tn细胞；泳道3：感染重组病毒的Tn细胞；泳道4：Western印迹分析。
图2所示为家蝇AChE在细胞中的表达产物纯化图，可以看出经过亲和层析以后的蛋白达到了电泳级。家蝇AChE在细胞里的表达产物的纯化。M：标准分子量；泳道1：纯化产物。
具体实施方式
在本发明的一个具体实施方案中，本发明中的“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“蝇乙酰胆碱酯酶蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有蝇类乙酰胆碱酯酶蛋白(或多肽)的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与蝇乙酰胆碱酯酶相同功能的蛋白的序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层折、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“蝇乙酰胆碱酯酶蛋白多肽”指具有家蝇乙酰胆碱酯酶蛋白活性的多肽。该术语还包括具有与家蝇乙酰蛋白胆碱酯酶蛋白相同功能的序列的变异形式例如果蝇、丽蝇等昆虫乙酰蛋白胆碱酯酶蛋白。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括家蝇乙酰胆碱酯酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或低的严谨度条件下能与家蝇乙酰胆碱酯酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白，以及利用抗家蝇乙酰胆碱酯酶多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还包括检测家蝇乙酰胆碱酯酶核苷酸序列的方法，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于家蝇乙酰胆碱酯酶多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为15-50个核苷酸。
本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞，较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如Tn细胞、Sf细胞、Bm细胞，、各种昆虫活体及活体内细胞、CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对蝇乙酰胆碱酯酶活性蛋白的纯化，指将表达的蝇乙酰胆碱酯酶从真核宿主细胞中分离纯化出来，获得大量活性蛋白，应用于有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速残留检测。
本发明还包括了应用几种比较典型的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，经过测其对纯化的蝇乙酰胆碱酯酶的抑制率，来鉴定该酶对这两种杀虫剂的敏感性以得出结论。其中“抑制率”是以抑制90％的酶活为标准。
本发明的活性蛋白制备可以通过本领域内技术人员已知的技术进行制备。
蝇乙酰胆碱酯酶在家蝇头部最为丰富，但是相对含量还是比较少，本发明的家蝇乙酰胆家酯酶为宿主细胞所表达，为进一步改善农药药效检测和农药残留快速检测提供了新的思路。
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1、家蝇乙酰胆碱酯酶基因在真核细胞(Tn细胞株，即粉纹夜蛾细胞株)中的表达和表达产物纯化：
在该实施例中，
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：
MuF：5’-GGATCCATGACAGATCATCTAACG-3′
3’端引物序列为：MuR：5’-CTCGAGTTAGTTTTCACATTCGGAACC-3′。
具体如下：
SEQ ID NO.1的信息：
(I)序列特征
(A)长度：24碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑；线性
(II)分子型：寡核苷酸
(III)序列描述：SEQ ID NO.1
5’-
GGATCCATGACAGATCATCTAACG-3′。
SEQ ID NO.2的信息：
(I)序列特征
(A)长度：27碱基
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑；线性
(II)分子型：寡核苷酸
(III)序列描述：SEQ ID NO.2
5’-CTCGAGTTAGTTTTCACATTCGGAACC-3′
5’端引物含有BamH I酶切位点，3’端引物含有Xho I酶切位点。
引物上限制性内切酶酶切位点对应于Tn细胞表达载体pBacFastbacHTa上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Gmr)，一个噬菌体复制起点(Ori)、一个病毒复制起点(SV40)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)，一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用Xhol I和Hind III消化pBacFastHTa载体及插入片段，随后用连结混合物转化E.coliTG I菌株，在含有Ampr和Gmr的LB培养皿上筛选转化子，补加Ampr和Gmr的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，测序验证家蝇乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段已正确插入了载体。随后用重组质粒转化E.coli DH10Bac菌株，在含有Ampr、Gmr、四环素的LB培养皿上筛选转化子，在补加Ampr、Gmr、四环素的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，经Sepharose 2B柱纯化，回收质粒-70℃保存。
质粒转染Tn细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，收集细胞及细胞上清，含重组病毒粒子的细胞上清用于下一轮感染。经2-3代的TMF Highfive express medium连续传代培养，收集细胞，在100mL细胞悬浮液中加入0.02％NaN3以免污染；0.1％Triton X-100破碎细胞膜；40g的硫酸铵，饱和度为40％，剧烈振荡后放置4℃保存。4℃以4000rpm离心20min，弃上清；用25mM PB pH7.0+0.02％ NaN3悬浮沉淀；4℃以4000rpm离心20min，收集上清，酶比活力测定。同时用0.45um的膜对上清过滤。4℃以1mL/min速度把样品注射入亲和层析柱；用25mM PB pH7.0将未结合于亲和层析柱上的蛋白质洗脱下来；再用procainamide把亲和层析柱上的蛋白质洗脱下来，最后对样品进行部份收集，每管收集5mL；测定每管样品酶的比活力。最后将具有较高酶活力的各管样品集中在一起，并测定酶比活力。然后以25Mm PBS(PH7.0)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。用10％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为62.8kDa，具体如图1，2所示。
实施例2、农药乙酰胆碱酯酶抑制中浓度的测定：
乙酰胆碱酯酶活性的测定，采用酶标仪进行测量。总体积200μL反应体系中含有10μL酶，10μL碘化硫代乙酰胆碱和180μL磷酸缓冲液(含有DTNB)，在酶标板加样孔中依次加入酶液、不同浓度的碘化硫代乙酰胆碱溶液和显色液，在405nm，每隔30′读一次光密度，共记录10个值，重复三次。抑制中浓度的测定是将酶液与以不同浓度稀释的杀虫剂液混匀于酶标板加样孔中，25℃下放置5min，测定乙酰胆碱酯酶的剩余活力。计算方法为，以乙酰胆碱酯酶活力抑制率的机率值为纵座标，以杀虫剂(对氧磷)浓度对数为横座标，得一直线并计算求得线性回归方程，取机率值为5求得抑制酶50％活力时的杀虫剂浓度对数，反对数即得抑制中浓度(I50)。测定结果为杀虫剂(对氧磷)对表达的乙酰胆碱酯酶酶液的抑制中浓度为6.9×10-6M。
实例3、家蝇乙酰胆碱酯酶在农药药效和农药残留检测中的应用：
根据国家农药残留检测标准(2005年颁布)，将酶∶抑制剂∶显色液按照10∶10∶180(μl)比例配合，根据颜色反应测得数值，进行比较，得到的值可以近似符合GB的要求。具体如下：
细胞表达的家蝇乙酰胆碱酯酶可以检出几种有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的范围(抑制90％的酶浓度)：
克百威：0.12ppm接近GB
敌敌畏：0.02ppm＞0.1ppm(GB)
残杀威：0.15ppm
恶虫威：0.15ppm。
Claims (2)
1、一种制备家蝇乙酰胆碱酯酶活性蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、将编码具有家蝇乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成家蝇乙酰胆碱酯酶表达载体；
2)、将上述步骤的表达载体转入宿主细胞，形成家蝇乙酰胆碱酯酶的重组细胞；
3)、在适合表达家蝇乙酰胆碱酯酶多肽的条件下，培养上述步骤的重组细胞；
4)、分离出具有家蝇乙酰胆碱酯酶蛋白活性的多肽。
2、按照权利要求1所述方法制得的乙酰胆碱酯酶活性蛋白的用途，用于在有机磷或氨基甲酸酯类杀虫剂中的快速检测。
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