JP2022522112A - ヒト化細胞系 - Google Patents

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Abstract

ヒトインフルエンザウイルス受容体を高レベルで発現する哺乳類細胞系または鳥類細胞系が提供される。一実施態様では、この細胞系は、対応する従来の(改変されていない)細胞または対応するヒトウイルス受容体過剰発現細胞におけるよりもはるかに効率的にヒトインフルエンザウイルス、例えばヒトA/H3インフルエンザウイルス、単離、および増殖をサポートし、増殖されたウイルスは、対応する細胞内におけるよりも大きな遺伝子安定性を維持することができる。

Description

関連する出願の相互参照
本出願は、2019年2月8日に出願されたアメリカ合衆国出願第62/803,266号の出願日の恩恵を主張するものであり、その開示内容は参照によって本明細書に組み込まれている。
政府の権利の宣言
本発明は、政府の援助を得て国立衛生研究所から資金提供されたHHSN272201400008Cのもとでなされた。政府は本発明において所定の権利を有する。
A型とB型のインフルエンザウイルスは2つの主要な表面糖タンパク質、ヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)を有する。HAは細胞表面のシアル酸含有受容体を認識するのに対し、NAはシアル酸を細胞表面の受容体から切断し、感染した細胞の表面から子孫ビリオンが放出されやすくする(GamblinとSkehel、2010年)。HAは、宿主の免疫、特に中和抗体の産生を刺激する主要な抗原でもある。
臨床検体からのウイルス単離は、流行しているウイルスの同定と特徴づけのための重要な手段である。現在、A型インフルエンザウイルスの2つの亜型(A/H1N1とA/H3N2)とB型インフルエンザウイルスの2つの系統(B/山形系統とB/ヴィクトリア系統)がヒトの集団で流行していて季節性インフルエンザのエピデミックを引き起こしている。Madin-Darbyイヌ腎(MDCK)細胞は、ヒトインフルエンザウイルスの単離と増殖のために最も広く使用されている細胞系である。この細胞系はインフルエンザウイルスに対して大きな感受性を示すが、最近のA/H3N2ウイルスの増殖はわずかしかサポートしない。さらに、MDCK細胞の中でのインフルエンザウイルスの継代が、そのHA遺伝子および/またはNA遺伝子の中に変異を持つバリアントの選択につながることがしばしばある(Chambers他、2014年;Lee他、2013年;Tamura他、2013年;Lin他、2017年;Li他、2009年;Oh他、2008年)。細胞培養物へのインフルエンザウイルスの適応にとって重要な変異を持つこのようなバリアントの出現は、流行しているインフルエンザウイルスの抗原特性、遺伝特性、および抗ウイルス特性の評価を歪める可能性がある。例えばA/H3N2ウイルスのNAに受容体結合活性を与える変異の出現(例えば151位におけるアスパラギン酸からグリシンへの置換(D151G)(Moh他、2015年;Lin他、2010年;Zhu他、2012年))は、血球凝集抑制アッセイ、ウイルス中和アッセイ、および感染細胞巣減数アッセイによるHA抗原性の特徴づけにとって問題である。なぜならNAの受容体結合活性は、これらアッセイの結果に寄与するからである。それでも多くの研究室がMDCK細胞を利用してA/H3N2ウイルスを単離している。Leeら(2013年)によるGISAID EpiFluデータベース分析から、MDCKで培養したA/H3N2単離体の約30%が151位にアミノ酸変化を有することがわかった。したがって現在流行しているA/H3N2株は、その特徴を忠実に維持することのできる細胞系の中で単離して増殖させるべきである。
ヒトインフルエンザウイルスのHAは、α2,6-結合によってガラクトースに結合したシアル酸で終わるグリカンに結合するほうを好むのに対し、トリウイルスのHAは、α2,3-結合によってガラクトースに結合したシアル酸で終わるグリカンのほうに好んで結合する(Connor他、1994年;RogersとPaulson, 1983年;Stevens他、2006年)。それに対応して、ヒト上気道の中の上皮細胞は、α2,6-シアログリカンを優勢に発現する(van Riel他、2006年;Shinya他、2006)。α2,6-シアログリカンとα2,3-シアログリカンの両方を発現するMDCK細胞は多くの動物種からインフルエンザウイルスを単離するのに適しているが、この細胞系は、α2,6-シアログリカンの発現レベルが比較的低いことが示されている(Lin他、2017年;Hatakeyama他、2005年;Matrosovich他、2003年)。以前にわれわれのグループと他のグループはMDCK細胞を操作してα2,6-シアログリカンを過剰発現させた(Hatakeyama他、2005年;Matrosovich他、2003年)。これらの改変されたMDCK細胞(AX4またはMDCK-SIAT1と名づけた)は、ヒトインフルエンザウイルス単離体に対して従来のMDCK細胞系よりも大きな感受性を示した(Oh他、2008年;Hatakeyama他、2005年)が、それでもα2,3-シアログリカンを発現した。重要なことだが、従来のMDCK細胞と同様、HAまたはNAに変異を持つバリアントが、季節性インフルエンザウイルスをMDCK-SIAT1細胞を通じて継代したときに検出されている(Tamura他、2013年;Li他、2009年)。したがって、いかなる細胞培養物適応変異もなしにヒトインフルエンザウイルスの効率的な単離と増殖をサポートする代替細胞系が、流行しているウイルスの正確な特徴づけのため、そして可能であれば細胞内での効果的なワクチン製造のために必要とされている。
本開示は、ヒトインフルエンザウイルス、特にヒトH3インフルエンザウイルスの例えばより効率的な単離および/または増幅(増殖)をサポートするために遺伝子改変された哺乳類または鳥類の細胞系に関する。開示されている細胞系を遺伝子改変し、アルファ-2,3-結合シアル酸、アルファ-2,6-結合シアル酸、またはその両方の発現が変化するように改変されていない親細胞系と比べて細胞表面のアルファ-2,3-結合シアル酸の発現を減少させるとともに、アルファ-2,6-結合シアル酸の発現を増加させることができる。一実施態様では、改変された哺乳類細胞系または鳥類細胞系は、高レベルのヒトインフルエンザウイルス受容体と低レベルのインフルエンザウイルス受容体を発現するように改変されている。一実施態様では、細胞系は、哺乳類細胞系(例えば非ヒト細胞系である霊長類細胞系またはイヌ細胞系など)である。一実施態様では、改変された細胞系は、AX-4と比べてアルファ-2,3-結合シアル酸の発現が減少しているか、改変されていないMDCK細胞系と比べてアルファ-2,6-結合シアル酸の発現が増加している改変されたMDCK細胞系である。一実施態様では、改変された細胞系はhCKであり、これは、MDCK細胞およびAX-4細胞と比べてヒトインフルエンザウイルスのより効率的な単離と増幅をサポートする。一実施態様では、アルファ-2,3-結合シアル酸の発現減少は、アルファ-2,3-結合シアル酸を産生する1つ以上のシアリルトランスフェラーゼの発現を減少または消失させる遺伝子改変に起因し、遺伝子改変の非限定的な例に含まれるのは、1つ以上のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子の中の1つ以上のヌクレオチドの挿入、1つ以上のヌクレオチドの欠失、1つ以上のヌクレオチドの置換、またはこれらの任意の組み合わせである。一実施態様では、遺伝子改変は、1つ以上のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子の中の1つ以上のヌクレオチドの挿入を含んでいる。一実施態様では、遺伝子改変は、1つ以上のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子の中の1つ以上のヌクレオチドの欠失を含んでいる。一実施態様では、遺伝子改変は、1つ以上のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子の中の1つ以上のヌクレオチドの置換を含んでいる。一実施態様では、遺伝子改変は、少なくとも1つのシアリルトランスフェラーゼ遺伝子の中の1つ以上のヌクレオチドの挿入を含んでいる。一実施態様では、遺伝子改変は、少なくとも1つのシアリルトランスフェラーゼ遺伝子の中の1つ以上のヌクレオチドの欠失を含んでいる。一実施態様では、遺伝子改変は、少なくとも1つのシアリルトランスフェラーゼ遺伝子の中の1つ以上のヌクレオチドの置換を含んでいる。アルファ-2,3-結合シアル酸の発現を減少させる遺伝子改変は、発現を「ノックダウン」または「ノックアウト」する任意の方法の結果である可能性があり、方法に含まれるのは、リコンビナーゼ系(CRISPR/Cas、TALEN、またはジンクフィンガー結合タンパク質など)の利用である。一実施態様では、アルファ-2,6-結合シアル酸の発現の増加は、アルファ-2,6-結合シアル酸を産生する1つ以上のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を増加させる遺伝子改変に起因し、遺伝子改変の非限定的な例に含まれるのは、アルファ-2,6-結合シアル酸を産生するシアリルトランスフェラーゼ(例えばヒトβ-ガラクトシドα2,6-シアリルトランスフェラーゼI(ST6Gal I)遺伝子)をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットである。
一実施態様では、哺乳類または鳥類の対応する非組み換え細胞と比べて減少した量の細胞表面β-ガラクトシドα2,3-シアリル残基と、増加した量のヒトβ-ガラクトシドα2,6-シアリル残基を含む、哺乳類または鳥類の単離された組み換え細胞が提供される。一実施態様では、単離された組み換え細胞は、非ヒト哺乳類細胞である。一実施態様では、単離された組み換え細胞は、イヌ細胞または非ヒト霊長類細胞である。一実施態様では、表面β-ガラクトシドα2,3-シアリル残基の量の減少は、1つ以上のα2,3シアリルトランスフェラーゼの量または活性が減少した結果である(組み換え細胞の中で例えば1つ以上のα2,3シアリルトランスフェラーゼの量または活性が少なくとも5%、10%、20%、50%、70%、80%、90%、95%、またはそれよりも多く減少し、その結果として2,3-シアリル残基が少なくとも5%、10%、20%、50%、70%、80%、90%、95%、またはそれよりも多く減少する結果となる可能性がある)。一実施態様では、組み換え細胞の中のα2,3シアリルトランスフェラーゼの量または活性、またはα2,3シアリル残基の量は検出できない。一実施態様では、改変されたα2,3シアリルトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号6、8、10、12、14、16または18のいずれか1つとアミノ酸配列が少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するα2,3シアリルトランスフェラーゼをコードするか、配列番号5、7、9、11、13、15、または17のいずれか1つとヌクレオチド酸配列が少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するヌクレオチド配列をコードしている。一実施態様では、単離された組み換え細胞は、ヒトβ-ガラクトシドα2,6-シアリルトランスフェラーゼI(ST6Gal I)またはST6Gal IIをコードする発現カセットを含んでいる。一実施態様では、ST6Gal IまたはST6Gal IIは、配列番号1~4、101または150のいずれか1つとアミノ酸配列が少なくとも80%一致するタンパク質を含んでいる。一実施態様では、α2,6-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号1~4、101または150のいずれか1つとアミノ酸配列が少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するα2,6-シアリルトランスフェラーゼをコードするか、配列番号101または151とヌクレオチド酸配列が少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するヌクレオチド配列をコードしている。一実施態様では、組み換え細胞の中のヒトβ-ガラクトシドα2,6-シアリルトランスフェラーゼの量または活性は、少なくとも1%、5%、10%、20%、50%、70%、80%、90%、95%、またはそれよりも多く増加した。一実施態様では、1つ以上のβ-ガラクトシドα2,3-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子が変異し、細胞表面β-ガラクトシドα2,3-シアリル残基の量が減少している。一実施態様では、ST3Gal-I遺伝子、ST3Gal-II遺伝子、ST3Gal-III遺伝子、ST3Gal-IV遺伝子、ST3Gal-V遺伝子、ST3Gal-VI遺伝子、またはST3Gal-II様遺伝子の2つ以上が変異している。一実施態様では、ST3Gal-I遺伝子、ST3Gal-II遺伝子、ST3Gal-III遺伝子、ST3Gal-IV遺伝子、ST3Gal-V遺伝子、ST3Gal-VI遺伝子、またはST3Gal-II様遺伝子の3つ、4つ、5つ、6つ、または7つが変異している。一実施態様では、ST3遺伝子は、配列番号5、7、9、11、13、15、または17のいずれか1つと少なくとも80%一致する核酸配列を持つ。一実施態様では、細胞表面β-ガラクトシドα2,3-シアリル残基の減少は、1つ以上のST3シアリルトランスフェラーゼの発現が減少した結果である。一実施態様では、その1つ以上のST3シアリルトランスフェラーゼは、配列番号6、8、10、12、14、16、または18のいずれか1つと少なくとも80%一致するアミノ酸配列を持つ。一実施態様では、インフルエンザH3ウイルスは、組み換え細胞の中で非組み換え細胞よりも効率的に複製される。
さらに提供されるのは、哺乳類または鳥類の対応する非組み換え細胞と比べて減少した量の細胞表面β-ガラクトシドα2,3-シアリル残基を含む、哺乳類または鳥類の単離された組み換え細胞である。一実施態様では、組み換え細胞の中のST3Gal-I遺伝子、ST3Gal-II遺伝子、ST3Gal-III遺伝子、ST3Gal-IV遺伝子、ST3Gal-V遺伝子、ST3Gal-VI遺伝子、またはST3Gal-II様遺伝子の1つ以上が変異している。一実施態様では、組み換え細胞の中のST3Gal-I遺伝子、ST3Gal-II遺伝子、ST3Gal-III遺伝子、ST3Gal-IV遺伝子、ST3Gal-V遺伝子、ST3Gal-VI遺伝子、またはST3Gal-II様遺伝子の組み合わせが変異している。一実施態様では、組み換え細胞の中のST3Gal-I遺伝子、ST3Gal-II遺伝子、ST3Gal-III遺伝子、ST3Gal-IV遺伝子、ST3Gal-V遺伝子、ST3Gal-VI遺伝子、およびST3Gal-II様遺伝子が変異している。
本明細書に記載されている組み換え細胞は、例えばウイルス単離、ワクチン製造、および診断に有用である。例えばこの組み換え細胞により、子孫ウイルスの単離および/または増幅が可能になる。さらに、HAアッセイは一般に、最近のヒトH3N2ウイルスの検出に使用されない。この組み換え細胞は、その点(例えばウイルスの増幅)に関して有利である可能性がある。
さらに、β-ガラクトシドα2,6-シアリル残基が増加した組み換え細胞は、単離されたβ-ガラクトシドα2,6-シアリルの供給源として用いることができ、今度はそれを用いて表面(ビーズなど)を被覆し、ガレクチンを抑制すること、セイヨウニワトコのアグルチニン(SNA)、ニワトコ(SSA)、またはキカラスウリのアグルチニンI(TJA-I)を単離または検出することができる。
一実施態様では、哺乳類細胞または鳥類細胞の細胞表面β-ガラクトシドα2,3-シアリル残基とヒトβ-ガラクトシドα2,6-シアリル残基の量を変化させる方法が提供される。一実施態様では、この方法は、親哺乳類細胞または親鳥類細胞の中で1つ以上のβ-ガラクトシドα2,3シアリルトランスフェラーゼ(ST3Gal)遺伝子を変異させるとともにヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリルトランスフェラーゼ(ST6Gal)遺伝子を過剰発現させて、対応する親細胞と比べて減少した量の細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基と増加した量のヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリル残基を表面に持つ改変された哺乳類細胞または鳥類細胞にすることを含んでいる。一実施態様では、その1つ以上のST6Gal遺伝子は、ゲノム編集システム(例えばCRISPR/Cas9システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システム、または転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ(TALEN)システム)を用いて変異させる。一実施態様では、変異は、1つ以上のST3遺伝子の中の1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失、またはその両方を含んでいる。一実施態様では、改変された細胞は、ST6Galオープンリーディングフレームを含む発現カセットを含んでいる。一実施態様では、改変された細胞は、腎細胞である。一実施態様では、改変された細胞は、イヌ細胞である。
組み換え細胞を利用する方法には、ワクチン製造のためにインフルエンザウイルス(例えばヒトインフルエンザウイルス)を増殖させる方法が含まれる。一実施態様では、インフルエンザウイルスはA型インフルエンザウイルスである。一実施態様では、インフルエンザウイルスはB型インフルエンザウイルスである。一実施態様では、インフルエンザウイルスはH3ウイルスである。一実施態様では、ウイルスは、A/H1N1、A/H3N2、B/山形系統B型インフルエンザウイルス、またはB/ヴィクトリア系統B型インフルエンザウイルスである。
組み換え細胞を利用するさらに別の方法は、インフルエンザウイルスを単離する方法である。この方法は、インフルエンザウイルスに感染していることが疑われる鳥類または哺乳類からのサンプルを用意し;組み換え細胞にそのサンプルを接触させることを含んでいる。一実施態様では、この方法はさらに、サンプルがインフルエンザウイルスに感染しているかどうかを判断することを含んでいる。一実施態様では、この方法はさらに、ウイルスのHA亜型および/またはNA亜型を同定することを含んでいる。
一実施態様では、細胞系は、アルファ-2,3-結合シアル酸の合成を触媒する複数のシアリルトランスフェラーゼを下方調節するとともにアルファ-2,6-結合シアル酸の合成を触媒する1つのシアリルトランスフェラーゼを過剰発現させるためCRISPR/Casを媒介とした遺伝子ノックアウト法を利用して調製された改変MDCK細胞系(「hCK」は「ヒト化MDCK」細胞を意味する)である。hCK細胞は、(上気道のヒト上皮細胞と同様)低レベルのアルファ-2,3-結合シアル酸と高レベルのアルファ-2,6-結合シアル酸を発現する。本明細書に開示されているように、hCK細胞により、H3N2ヒトインフルエンザウイルスをAX-4細胞系よりも10~100倍よく単離することが可能になる。ヒトインフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルスの効率的な単離と増幅は、ワクチンの製造(例えば季節性インフルエンザウイルスのワクチン製造)に有利である(おそらく複製をよりよくサポートする)。というのも季節性ヒトインフルエンザウイルスは、改変されていないMDCK細胞の中では、そしてアルファ-2,6-結合シアル酸を表面に過剰発現していてヒトインフルエンザウイルスが効率的に結合するMDCK(AX-4)細胞においてさえ、複製が非効率的であることがしばしばあるからである。一実施態様では、本明細書に開示されている改変された細胞系の表面のヒトインフルエンザウイルスの力価は、改変されていないMDCK細胞、MDCK(AX-4)細胞、またはMDCK-SIAT1細胞におけるよりも少なくとも1桁、少なくとも2桁、少なくとも3桁、またはそれよりも大きい(Li他、2009年)。
図1A~図1P。ヒトインフルエンザウイルスの増殖と単離に対するhCK細胞の感度。A~L)MDCK細胞、AX-4細胞、およびhCK細胞における季節性インフルエンザウイルスの増殖動態。MDCK細胞、AX-4細胞、およびhCK細胞にウイルスを0.002の感染多重度(MOI)で感染させた。感染した細胞の上清を指定された時点に回収し、hCK細胞中のプラークアッセイによってウイルス力価を求めた。誤差棒は、独立な3回の実験からの標準偏差を示す。P値は、方法の項に記載されている線形混合モデルを用いて計算した(*P<0.05;**P<0.01)。赤色と青色の星印は、hCK細胞およびAX4細胞とMDCK細胞の比較を示す。灰色の星印は、赤色と青色で示されている細胞系の間の比較を示す。M~P)季節性インフルエンザウイルスに対するhCK細胞とAX4細胞の比較感度。臨床サンプルの段階2倍希釈液(21から220)を用意し、AX4細胞とhCK細胞に接種した。細胞で細胞変性効果(CPE)の展開を7日間観察した。3つのウエルに各ウイルス希釈液を接種した。合計3つのウエルの中で最大希釈倍数を示したCPEを水平な棒で示してある。それぞれの水平な棒の端部にある数は、AX4最大希釈倍数に対するhCK最大希釈倍数の比を示している。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図2A~図2B。著しく低レベルのα2,3-結合シアル酸と高レベルのα2,6-結合シアル酸を発現しているMDCK細胞の生成の全体模式図。 同上。
図3A~図3C。α2,6-結合シアル酸とα2,3-結合シアル酸の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析。クローン6~11(オレンジ色の輪郭線)と親細胞(黒色の輪郭線)を、ビオチニル化されたイヌエンジュ IIアグルチニン(MAL II)レクチン(α2,3-結合シアル酸に対して特異的)またはセイヨウニワトコのアグルチニン(SNA)レクチン(α2,6-結合シアル酸に対して特異的)とともにインキュベートした後、Alexa 488で標識したストレプトアビジンとともにインキュベートし、次いでフローサイトメトリーによって分析した。染色されなかった細胞は陰性対象(レクチンなし)として機能した。 同上。
図4A~図4J。著しく低レベルのα2,3-結合シアル酸と高レベルのα2,6-結合シアル酸を発現しているMDCK細胞の特徴づけ。方法の項に記載されているように、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを利用することにより、7つの異なるβ-ガラクトシドα2,3シアリルトランスフェラーゼ(ST3Gal)遺伝子の中に変異を持つMDCK細胞を生成させた。編集されたMDCK細胞をさらに改変し、ヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリルトランスフェラーゼI(ST6Gal-I)を、ST6Gal-I遺伝子を含有するプラスミドのトランスフェクションによって過剰発現させた。改変された細胞クローンをピューロマイシンとブラスチシジンによって選択し、特徴づけた。A~D)α2,6-結合シアル酸とα2,3-結合シアル酸の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析。改変されたMDCK細胞(緑色と赤色の輪郭線)と親MDCK細胞(黒色の輪郭線)を、ビオチニル化されたイヌエンジュIIアグルチニン(MAL II)レクチン(α2,3-結合シアル酸に対して特異的)またはセイヨウニワトコのアグルチニン(SNA)レクチン(α2,6-結合シアル酸に対して特異的)とともにインキュベートした後、Alexa 488で標識したストレプトアビジンとともにインキュベートし、次いでフローサイトメトリーによって分析した。E~G)α2,3-結合シアル酸の発現の免疫蛍光分析。改変されたMDCK細胞と親MDCK細胞を固定し、Siaα2,3Galβ1,4GlcNAcを認識するモノクローナル抗体(緑色)で染色した。核をHoechst染料(青色)で染色した。HとJ)α2,6-結合シアル酸の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析。改変されたMDCK細胞(赤色の輪郭線)、親MDCK細胞(黒色の輪郭線)、およびAX4細胞(青色の輪郭線)をSNAレクチンまたはニワトコ(SSA)レクチン(α2,6-結合シアル酸に対して特異的)とともにインキュベートした後、Alexa 488で標識したストレプトアビジンとともにインキュベートし、次いでフローサイトメトリーによって分析した。I)α2,3-結合シアル酸の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析。改変されたMDCK細胞(赤色の輪郭線)、親MDCK細胞(黒色の輪郭線)、およびAX4細胞(青色の輪郭線)をMAL IIレクチンとともにインキュベートした後、Alexa 488で標識したストレプトアビジンとともにインキュベートし、次いでフローサイトメトリーによって分析した。 同上。 同上。 同上。 同上。
図5A~図5F。HAタンパク質とNAタンパク質においてアミノ酸が変化している位置。A~C)ヒト受容体類似体との複合体になったA/カリフォルニア/04/2009(H1N1pdm)HA(PDB ID:3UBN)、A/ワイオミング/3/2003(H3N2)HA(PDB ID:6BKR)、およびB/香港/8/1973 HA(PDB ID:2RFU)の三次元構造が示されている。この研究で同定された変異が赤色で示されている。A型インフルエンザHAにおける変異がH3のナンバリングとともに示されている。D~F)カルボン酸オセルタミビルとの複合体になったA/カリフォルニア/04/2009(H1N1pdm)NA(PDB ID: 3TI6)、A/タンザニア/205/2010(H3N2)NA(PDB ID: 4GZP)、およびB/ブリスベーン/60/2008 NA(PDB ID: 4CPM)の三次元構造が示されている。この研究で同定された変異が赤色で示されている。すべての変異がN2のナンバリングとともに示されている。図面はDS Visualizer v17.2.を用いて作成した。 同上。
定義
「ベクター」または「コンストラクト」(遺伝子送達用または遺伝子導入用の「ビヒクル」と呼ばれることがときにある)は、インビトロまたは生体内で宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子複合体を意味する。送達されるポリヌクレオチドは、興味あるコード配列を含むこと、または宿主細胞のゲノムに変異を導入するための配列を含むこと、またはその両方が可能である。ベクターには、宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することのできる例えばプラスミド、ウイルスベクター(アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスなど)、リポソームとそれ以外の脂質含有複合体、および他の巨大分子複合体が含まれる。ベクターは、遺伝子送達および/または遺伝子発現をさらに変化させるか、そうでない場合には標的とする細胞に有益な特性を提供する他の成分または機能も含むことができる。そのような他の成分に含まれるのは、例えば、細胞への結合またはターゲティングに影響を与える成分(細胞タイプまたは組織に特異的な結合を媒介する成分が含まれる);細胞によるベクターの核酸の取り込みに影響を与える成分;取り込み後に細胞内のポリヌクレオチドの位置に影響を与える成分(核局在化を媒介する薬剤など);およびポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分である。このような成分には、ベクターによって送達された核酸を取り込んで発現している細胞の検出または選択に使用できるマーカー(検出可能なマーカーおよび/または選択マーカーなど)も含まれる可能性がある。このような成分を、ベクターの天然の特徴として提供すること(結合と取り込みを媒介する成分または機能を持ついくつかのウイルスベクターの使用など)、またはベクターを改変してこのような機能を提供することができる。多彩なこのようなベクターが本分野で知られており、一般に入手することができる。ベクターが宿主細胞の中に維持されているとき、ベクターは、有糸分裂の間に細胞によって安定に複製されること、宿主細胞のゲノム内に組み込まれること、または宿主細胞の核または細胞質の中に維持されることが可能である。
「組み換えウイルスベクター」は、1つ以上の異種遺伝子または異種配列を含むウイルスベクターを意味する。多くのウイルスベクターはパッケージングに付随するサイズの制約を示すため、異種遺伝子または異種配列は、典型的には、ウイルスゲノムの1つ以上の部分を置き換えることによって導入される。このようなウイルスは複製欠損になる(生物学的に抑制される)可能性があるため、(例えば複製および/またはカプシド形成に必要な遺伝子を持つヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系を用いることによって)消去された機能をウイルスの複製とカプシド形成の間にトランスで提供する必要がある。送達されるポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側にある改変されたウイルスベクターもこれまでに報告されている。
「遺伝子送達」、「遺伝子導入」などは、本明細書では、導入に用いる方法に関係なく、外来ポリヌクレオチド(「導入遺伝子」と呼ばれることがときにある)を宿主細胞の中に導入することを意味する用語である。このような方法には多彩な周知の技術((例えばウイルス感染/トランスフェクション、またはタンパク質または脂質に基づく他のさまざまな遺伝子送達複合体による)ベクターを媒介とした遺伝子導入など)のほか、「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技術(例えば電気穿孔、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入に用いられる他のさまざまな技術)が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞の中で安定に、または一過性に維持することができる。安定な維持には、典型的には、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合した複製起点を含有していること、または宿主細胞のレプリコン(染色体外レプリコン(例えばプラスミド)など)に組み込まれるか、核またはミトコンドリアの染色体に組み込まれることが必要とされる。本分野で知られているように、多数のベクターが、哺乳類細胞への遺伝子の導入を媒介できることが知られている。
「導入遺伝子」は、工夫によって細胞の中に一過性に、または恒久的に挿入されて、その生物の一部になる(ゲノムの中に組み込まれる場合)か、染色体外に維持される核酸分子(例えばDNA)の任意の断片を意味する。このような導入遺伝子は、トランスジェニック生物にとって一部または全体が異種(すなわち外来)の遺伝子のオープンリーディングフレームの少なくとも一部分を含むこと、またはその生物の内在遺伝子と相同な遺伝子のオープンリーディングフレームの少なくとも一部分を表わすことができ、その一部分は、場合によっては、対応する完全長ポリペプチドと実質的に同じ活性、または対応する完全長ポリペプチドの少なくとも1つの活性を持つポリペプチドをコードしている。
「トランスジェニック細胞」は、導入遺伝子を含有する細胞を意味する。例えば発現カセットを含有するベクターで安定に、または一過性に形質転換された細胞は、変化した表現型特性を持つ細胞の集団を生成させるのに使用できるトランスジェニック細胞である。「組み換え細胞」は、例えば遺伝子操作による非組み換え細胞内の配列の挿入、欠失、または置換によって遺伝子改変された細胞である。
「野生型」または「天然」という用語は、遺伝子または遺伝子産物であって、天然の供給源から単離されたときにその遺伝子または遺伝子産物の特徴を持っているものを意味する。野生型遺伝子は、集団内で最も頻繁に観察される遺伝子であるため、自由裁量でその遺伝子の「正常な」形態または「野生型」形態と表記される。それとは対照的に、「改変された」または「変異体」という用語は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比べたときに配列または機能的特性の改変(すなわち変化した特徴)を示す遺伝子または遺伝子産物を意味する。天然の変異体が単離される可能性があることに注意されたい。天然の変異体は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比べたときに変化した特徴を持つという事実によって特定される。
「遺伝子導入」という用語は、生体内またはインビトロで、ウイルスベクター(複製欠損ウイルスベクターなど)を通じてレシピエント細胞にポリヌクレオチドを送達することを表わす。
「異種」という用語は、核酸配列(タンパク質をコードする遺伝子配列、制御配列など)に関するときには、特定の細胞と通常は合体していない配列、および/または特定の細胞に通常は付随していない配列、例えば異なる供給源からの配列を表わす(例えばウイルスからの配列は、感染していない細胞のゲノム内の配列にとって異種である)。したがって核酸コンストラクトまたはベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子に付随して見られることのない別の核酸分子の中にあるかその核酸分子に付着している核酸のセグメントである。例えば核酸コンストラクトの異種領域は、コード配列として、自然界でそのコード配列に付随して見られることのない配列が隣接したコード配列(すなわち異種プロモータ)を含むことができよう。異種コード配列の別の一例は、中に含まれているコード配列(例えば天然の遺伝子とは異なるコドンを持つ合成配列)そのものが自然界には見られないコンストラクトである。同様に、細胞内に通常は存在しないコンストラクトで形質転換した細胞は、異種であると見なされると考えられる。
「DNA」は、特に直線的なDNA分子(例えば制限断片)、ウイルス、プラスミド、および染色体の中に見られる二本鎖または一本鎖の形態になったデオキシリボヌクレオチド(アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン)の多量体形態を意味する。特定のDNA分子の構造を議論するとき、配列は、本明細書では、DNAの非転写鎖(すなわちmRNAと相補的な配列を持つ鎖)に沿って5'から3'の方向の配列だけを与える通常の慣例に従って記述することができる。この用語には、4種類の塩基アデニン、グアニン、チミン、またはシトシンを含む分子のほか、本分野で知られている塩基類似体を含む分子が包含される。
本明細書では、「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成規則によって関係づけられたポリヌクレオチド(すなわちヌクレオチドの配列)に関して用いられる。例えば配列「A-G-T」は、配列「T-C-A」と相補的である。相補性は「部分的」でもよく、その場合には核酸の塩基のいくつかだけが塩基対形成規則に従ってマッチする。あるいは核酸の間に「完全な」または「全面的な」相補性が存在していてもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率と強度に顕著な効果を有する。これは、増幅反応においてと、核酸の間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
DNA分子は、「5'末端」と「3'末端」を持つと言われる。なぜなら複数のモノヌクレオチドが反応することで1つのモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸がその近傍の3'酸素にホスホジエステル結合を通じて一方向に結合し、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを形成するからである。したがってオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一端が「5'末端」と呼ばれるのは、その5'リン酸がモノヌクレオチドペントース環の3'酸素に結合されていない場合であり、「3'末端」と呼ばれるのは、その3'酸素が、あとに続くモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸に結合されていない場合である。本明細書では、核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの内部にある場合でさえ、5'末端と3'末端を持つと言うこともできる。直線状または環状のDNA分子では、離散したエレメントを、「下流」エレメントまたは3'エレメントの「上流」または5'にあると言う。この用語法は、転写がDNA鎖に沿って5'から3'へと進行するという事実を反映している。連結された遺伝子の転写を指示するプロモータエレメントとエンハンサエレメントは一般にコード領域の5'または上流に位置する。しかしエンハンサエレメントは、プロモータエレメントとコード領域の3'に位置しているときでさえ、その効果を及ぼすことができる。転写終了とポリアデニル化のシグナルはコード領域の3'または下流に位置する。
一実施態様で特定のタンパク質を「コードして」いる「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、または「導入遺伝子」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、インビトロまたは生体内で転写され、場合によっては翻訳もされて遺伝子産物(例えばポリペプチド)になる核酸分子である。コード領域は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAの形態で存在することができる。核酸分子は、DNAの形態で存在するとき、一本鎖(すなわちセンス鎖)または二本鎖が可能である。コード領域の境界は、5'(アミノ)末端にある開始コドンと、3'(カルボキシ)末端にある翻訳終止コドンによって決まる。遺伝子の非限定的な例に含めることができるのは、原核生物または真核生物のmRNAからのcDNA、原核生物または真核生物のDNAからのゲノムDNA配列、および合成DNA配列である。転写終止配列は、通常は、遺伝子配列にとって3'に位置することになる。
「制御エレメント」という用語は、集合的に、プロモータ領域、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位(「IRES」)、エンハンサ、スプライスジャンクションなどを意味し、これらはレシピエント細胞の中で、集合的に、複製、転写、転写後プロセシング、およびコード配列の翻訳を提供する。選択されたコード配列の複製、転写、および翻訳が適切な宿主細胞の中で可能である限り、これら制御エレメントのすべてが常に存在している必要はない。
「プロモータ」という用語は、本明細書ではその通常の意味で用いられ、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域を意味する。この調節配列は、RNAポリメラーゼに結合して下流(3'方向)コード配列の転写を開始させることのできる遺伝子に由来する。
「エンハンサ」は、プロモータの近くに位置しているとき、そのエンハンサドメインがないときにプロモータから得られる転写活性と比べて増加した転写活性を与える核酸配列を意味する。
核酸分子に関する「機能可能に連結された」は、2つ以上の核酸分子(例えば転写される核酸分子、プロモータエレメント、およびエンハンサエレメント)が、これら核酸分子の転写が可能になるように接続されていることを意味する。ペプチド分子および/またはポリペプチド分子に関する「機能可能に連結された」は、2つ以上のペプチド分子および/またはポリペプチド分子が、単一のポリペプチド鎖(すなわち融合ポリペプチド)を生成させるように接続されていて、その融合体のそれぞれのペプチド成分および/またはポリペプチド成分の少なくとも1つの特性を持つことを意味する。融合ポリペプチドは、キメラであること、すなわち異種分子で構成されていることが可能である。
「相同性」は、2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチドの間の一致率を意味する。1つの配列と別の配列の間の対応は、本分野で知られている技術によって決めることができる。例えば相同性は、2つのポリペプチド分子の間の配列情報を、その配列情報をアラインメントし、容易に入手できるコンピュータプログラムを用いて直接比較することによって求めることができる。あるいは相同性は、相同な領域の間に安定な二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、一本鎖特異的なヌクレアーゼを用いて消化させ、消化された断片のサイズを求めることによって求めることができる。上記の方法を用いて判断されるように、2つのDNA配列、または2つのポリペプチド配列が互いに「実質的に相同である」のは、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%が分子の決められた長さにわたって一致しているときである。
「哺乳類」は、哺乳綱の任意のメンバーを意味し、その非限定的な例に含まれるのは、ヒトと非ヒト霊長類(チンパンジーとそれ以外の猿類、およびサル種);家畜(ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマなど);飼いならされた哺乳類(イヌとネコなど);実験室の動物(齧歯類であるマウス、ラット、ウサギ、およびモルモットが含まれる)などである。
「に由来する」は、核酸分子が親核酸分子から作製または設計されたことを意味し、この誘導体は、それが作製または設計される元になった親核酸分子と実質的に同じ機能的特徴を保持している(例えば親核酸分子によってコードされる遺伝子産物と実質的に同じ活性を持つ遺伝子産物をコードする)。
「発現コンストラクト」または「発現カセット」は、転写を指示することのできる核酸分子を意味する。発現コンストラクトは、少なくともプロモータを含んでいる。追加エレメント(エンハンサおよび/または転写終止シグナルなど)も含めることができる。
「外来」という用語は、細胞または生物の中のタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドに関して用いられているときには、その細胞または生物の中に人工的な手段または天然の手段によって導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを意味する。外来核酸は、異なる生物または細胞に由来すること、またはその生物または細胞の中で自然に生じる核酸の1つ以上の追加コピーであることが可能である。非限定的な例として、外来核酸は、天然の細胞とは異なる染色体位置にあるか、別の場合には自然界に見られるのとは異なる核酸が隣接している。
「単離された」という用語は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ウイルス、または細胞に関して用いられているときには、同定されて、天然の供給源に通常付随する少なくとも1つの汚染核酸、ポリペプチド、または他の生体成分から分離された核酸配列、ペプチド、ポリペプチド、ウイルス、または細胞を意味する。例えばそれが理由で、それは、生体内物質と関係していないか、インビトロ物質から実質的に精製されている。単離された核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはウイルスは、自然界に見られるのとは異なる形態または設定で存在する。例えば所与のDNA配列(例えば遺伝子)は、宿主細胞の染色体上で近傍の遺伝子に近接して見いだされる。RNA配列(特定のタンパク質をコードする特定のmRNAなど)は、細胞の中に、多彩なタンパク質をコードする多数の他のmRNAとの混合物として見いだされる。単離された核酸分子は、一本鎖または二本鎖の形態で存在することができる。単離された核酸分子がタンパク質の発現に用いられるときには、その分子は少なくともセンス鎖またはコード鎖を含有することになるが、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含有していてもよい(すなわちこの分子は二本鎖であることが可能である)。
本明細書では、「組み換え核酸」または「組み換えDNA配列、分子、またはセグメント」という用語は、1つの供給源に由来するか、1つの供給源から単離され、その後インビトロで化学的に改変される可能性がある核酸(例えばDNA)を意味し、その非限定的な例に含まれるのは、天然の配列、天然ではない配列、または天然のゲノム内で位置するはずの位置にない天然の配列に対応する配列である。1つの供給源に「由来する」DNAの一例として、有用な断片であると同定された後、実質的に純粋な形態で化学的に合成されるDNA配列が考えられる。1つの供給源から「単離された」このようなDNAの一例として、その供給源から化学的手段(例えば制限エンドヌクレアーゼの使用)によって切り取られるか取り出されるかした有用なDNA配列が考えられる。そのためこのDNA配列は、使用するため、遺伝子工学の方法によってさらに操作する(例えば増幅する)ことができる。
「組み換えタンパク質」または「組み換えポリペプチド」という用語は、本明細書では、組み換えDNA分子から発現されるタンパク質分子を意味する。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、およびタンパク質」という用語は、本明細書では、特に断らない限り交換可能に用いられる。
「配列相同性」という用語は、2つの核酸配列の間の塩基一致の割合、または2つのアミノ酸配列の間のアミノ酸一致の割合を意味する。配列相同性がパーセンテージ(例えば50%)で表現されているときには、パーセンテージは、何らかの他の配列と比較される選択された配列の長さ全体での一致の割合を示す。(2つの配列のどちらかにある)ギャップは、一致を最大にするため許容される。15塩基以下のギャップ長が通常用いられ、6塩基以下、例えば2塩基以下である。プローブまたは処置としてオリゴヌクレオチドを使用するとき、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列の間の配列相同性は一般に、20個の可能なオリゴヌクレオチド塩基対一致のうちの17標的塩基一致(85%)未満、10個の可能なオリゴヌクレオチド塩基対一致のうちの9一致(90%)未満、または20個の可能なオリゴヌクレオチド塩基対一致のうちの19一致(95%)未満である。
一般に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および断片と、興味ある核酸配列の間の核酸配列の相同性は、少なくとも65%であり、より典型的には、少なくとも約70%、約90%、約95%、約98%、100%とy増加していく相同性を持つ。
2つのアミノ酸配列が相同なのは、これらの配列の間に部分的または完全な一致が存在する場合である。例えば85%の相同性は、2つの配列をマッチングが最大になるようにアラインメントしたときに85%のアミノ酸が同じであることを意味する。(マッチさせる2つの配列のどちらかにある)ギャップは、マッチングを最大化するために許容される。ギャップ長は5以下、例えば2以下である。あるいは2つのタンパク質配列(またはこれらに由来し、長さが少なくとも30個のアミノ酸であるポリペプチド配列)が、本明細書でこの用語が用いられているように相同であるのは、プログラムALIGNを変異データマトリックスとギャップペナルティ6以上で用いたアラインメントスコアが(標準偏差単位で)5超である場合である。2つの配列またはその部分が相同であると見なすことができるのは、ALIGNプログラムを用いて最適なアラインメントにしたときにそのアミノ酸が50%以上同じである場合である。
「に対応する」という表現は、本明細書では、ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド配列またはその相補鎖の全体または一部と相同である(例えば同じで、厳密に進化的に関係してはいない)こと、またはポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列と配列または機能が同じであることを意味する。具体的に説明すると、ヌクレオチド配列「TATAC」は参照配列「TATAC」に対応し、参照配列「GTATA」と相補的である。
以下の用語、すなわち「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列一致」、「配列一致の割合」、および「実質的な一致」は、2つ以上のポリヌクレオチドの間の配列関係を記述するのに用いられる。「参照配列」は、配列比較のための基礎として用いられる規定された配列である。参照配列は、より大きな配列の部分であること(例えば配列リストに与えられている完全長のcDNAまたは遺伝子配列のセグメント)、または完全なcDNAまたは遺伝子配列を含むことが可能である。一般に、参照配列は長さが少なくとも20個のヌクレオチドであり、長さが少なくとも25個のヌクレオチドであることが頻繁にあり、長さが少なくとも50個のヌクレオチドであることがしばしばある。2つのポリヌクレオチドは、それぞれ、(1)その2つのポリヌクレオチドの間で似ている配列(すなわち完全なポリヌクレオチド配列の一部)を含む可能性と、(2)さらに、その2つのポリヌクレオチドの間で異なる配列を含む可能性があるため、2つ(以上)のポリヌクレオチドの間の配列比較は、典型的には、その2つのポリヌクレオチドの配列を、配列類似性がある局所的領域を同定して比較するための「比較ウインドウ」上で比較することによって実行される。
「比較ウインドウ」は、本明細書では、少なくとも20個の連続したヌクレオチドからなる概念的セグメントを意味し、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列のその部分は、2つの配列の最適なアラインメントのため、(付加または欠失を含まない)参照配列と比べて20%以下の付加または欠失(すなわちギャップ)を含むことができる。比較ウインドウでのアラインメントのための配列の最適なアラインメントは、局所的相同性アルゴリズムを用いることによって、または類似性検索法によって、これらアルゴリズムのコンピュータ化実装(GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA Genetics Software Packageによって、または目視によって実施することができ、さまざまな方法によって生成した最良の(すなわち比較ウインドウ上で相同性が最大パーセンテージになる)アラインメントが選択される。
「配列一致」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較のウインドウ上で(すなわちヌクレオチドごとの基準で)一致していることを意味する。「配列一致の割合」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較のウインドウ上で(すなわちヌクレオチドごとの基準で)一致していることを意味する。「配列一致の割合」という用語は、2つの最適にアラインメントされた配列を比較のウインドウ上で比較し、同じ核酸塩基(例えばA、T、C、G、U、またはI)が両方の配列に生じる位置の数を求めて一致した位置の数を生成させ、一致した位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数(すなわちウインドウのサイズ)で割り、その結果に100を掛けることによって計算されて、配列一致の割合が得られる。「実質的な一致」という用語は、本明細書では、ポリヌクレオチド配列の1つの特徴を意味し、そのポリヌクレオチドは、少なくとも20個のヌクレオチド位置からなる比較ウインドウ上で、頻繁には少なくとも20~50個のヌクレオチドからなる比較ウインドウ上で、参照配列と比べて少なくとも85%の配列一致、少なくとも90~95%の配列一致、より一般には少なくとも99%の配列一致となる配列を含んでおり、配列一致の割合は、参照配列を、比較のウインドウ上で合計してその参照配列の20%以下となる欠失または付加を含む可能性があるポリヌクレオチド配列と比較することによって計算される。
ポリペプチドに適用されたときの「実質的な一致」という用語は、2つのペプチド配列が、例えばプログラムGAPまたはBESTFITによってデフォルトのギャップ重みを用いて最適なアラインメントにされたとき、少なくとも約80%の配列一致、少なくとも約90%の配列一致、少なくとも約95%の配列一致、およびまたは少なくとも約99%の配列一致を共有することを意味する。
本明細書では、「実質的に純粋」は、対象とする種が、存在している優勢な種である(すなわちモルベースで、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である)ことを意味し、実質的に精製された分画は、対象とする種が、存在している全巨大分子種の(モルベースで)少なくとも約50%を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、この組成物の中に存在している全巨大分子種の約80%超、約85%超、約90%超、約95%超、および約99%超を含むことになる。対象とする種は、本質的に均質になるまで精製することができ(通常の検出法では組成物中に汚染種を検出することができない)、組成物は本質的に単一の巨大分子種からなる。
「トランスフェクトされた」、「形質転換された」、または「トランスジェニック」は、本明細書では、任意の宿主細胞または細胞系を含み、少なくとも1つの組み換えDNA配列の存在によって変えられるか増強されている。本発明の宿主細胞は、典型的には、プラスミド発現ベクターの中のDNA配列を単離された直線状DNA配列としてトランスフェクトすることによって、または組み換えウイルスベクターを感染させることによって作製される。
代表的な細胞とその改変
たいていのインフルエンザワクチンは、孵化した鶏卵の中で製造されるが、インフルエンザワクチンは他のシステムの中で製造されることが増えている。MDCK(Madin-Darbyイヌ腎臓)細胞は、インフルエンザワクチン製造に関して認可された2つの哺乳類細胞系の1つである。細胞内でのワクチン製造は、宿主細胞またはウイルスを変化させることによって増強することができる。しかしワクチン製造にとって、継代中のウイルス改変は有利ではない。
本明細書に開示されているように、細胞(例えば鳥類細胞または哺乳類細胞であり、その非限定的な例に含まれるのは、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒト、または非ヒト霊長類の細胞である)のゲノムを改変してインフルエンザウイルスの単離、増殖、またはその両方を増強することができる。例えばいくつかのHA亜型(HA亜型H1~H18)は、HAに対する細胞表面受容体の数または組成が理由で、ある種またはタイプの細胞によく結合することができる。これらの細胞は、細胞表面受容体の数を増加させることによって、または細胞表面受容体の表面に見られる分子のタイプを変化させることによって、またはその両方によって改変することができる。例えば哺乳類では、シアル酸残基を糖複合体のオリゴ糖側鎖に転移させる約20種類のシアリルトランスフェラーゼが存在している。これら酵素の1つ以上をコードする遺伝子を改変し、コードされる酵素の発現を減少させること(例えば1%、5%、10%、50%、70%、80%、90%、またはそれよりも多く減少させること)または消失させることができる。あるいはこれら酵素の1つ以上のオープンリーディングフレームを、外部から導入された発現カセット(例えばその発現カセットを持つプラスミド)から細胞内で発現させることができる。例えばα2,6-シアリルトランスフェラーゼは、α2,6-結合を持つシアル酸を末端Gal(ST6Gal IとII)またはGalNAc(ST6GalNAcI-VI)に転移させ;α2,8-シアリルトランスフェラーゼは、α2,8-結合を持つシアル酸(STSiaI-IV)を転移させ;α2,3-シアリルトランスフェラーゼは、α2,3-結合を持つシアル酸を末端Gal残基(ST3Gal)に転移させる。ST3GalI-IIとIVは、末端Galβ1-3GlcNAcに位置するGal残基に転移し、ST3GalIVとVI は、末端Galβ1-4GlcNAcに位置するGal残基に転移し、ST3GalVは、末端Galβ1-4Glc-Cer に位置するGal残基に転移し、ST3GalIIIは、末端Galβ1-3GlcNAcまたはGalβ1-3GlcNAcに位置するGal残基に転移する。したがってこれらシアリルトランスフェラーゼの遺伝子のそれぞれを用いて本明細書に開示されている細胞を調製することができる。一実施態様では、宿主細胞のゲノム内の1つ以上のα2,3-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子を改変し、コードされる酵素の発現を減少(例えば消失)させ、1つ以上のα2,6-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子を、宿主細胞に導入された組み換え発現ベクターから発現させる。シアリルトランスフェラーゼの発現を減少させるため、1つ以上のベクターまたはベクターの組み合わせと単離されたタンパク質を細胞に導入することができる。ベクターおよび/またはタンパク質として、細胞内の特定の遺伝子を標的とすることができるリコンビナーゼシステムの一部が可能であり、システムには、CRISPR/Cas、TALEN、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが含まれる。
本明細書の形質転換のために発現カセットを調製するため(gRNAなどのRNA、またはリコンビナーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを含むタンパク質を発現させるため)、組み換えDNAの配列またはセグメントは、環状または直線状の二本鎖または一本鎖であることが可能である。興味ある遺伝子産物をコードするmRNA配列と実質的に相補的なRNA配列をコードするDNA配列は、典型的には、反対向き(すなわち5'から3'へではなくて3'から5'へ)のカセットに入れてクローニングされる「センス」DNA配列である。一般に、DNAの配列またはセグメントはキメラDNAの形態(プラスミドDNAなど)であり、それは、細胞内でそのDNAの発現を促進する制御配列が隣接したコード領域も含有することができる。本明細書では、「キメラ」は、ベクターが、少なくとも2つの種からのDNAを含むこと、または同じ種からのDNAを含み、そのDNAが、その種の「天然」または野生型には生じないようなやり方で連結または関連していることを意味する。
転写ユニットとして機能するDNA配列またはその一部とは別に、DNAの一部を転写せず、調節機能または構造的機能に役立てることができる。例えばDNAは、それ自体が、真核細胞(例えば哺乳類細胞)の中、またはあるタイプの細胞の中で活性なプロモータを含むこと、またはDNAは、リンパ向性ウイルスの形質転換標的であるゲノムの中にすでに存在するプロモータを利用することができる。このようなプロモータには、CMVプロモータのほか、SV40後期プロモータとレトロウイルスLTR(長い末端反復エレメント)、例えばMMTV、RSV、MLV、またはHIV LTRが含まれるが、本分野で周知の他の多くのプロモータエレメントを用いることができる。
宿主細胞の中で機能する他のエレメント(イントロン、エンハンサ、ポリアデニル化配列など)も組み換えDNAの一部になることができる。このようなエレメントはDNAの機能に必要である可能性、または必要でない可能性があるが、転写、mRNAの安定性などに影響を与えることによってDNAの発現を改善することができる。細胞内でDNAを形質転換する最適な性能を得ることを望むときには、このようなエレメントをDNAの中に含めることができる。
細胞の中に導入される組み換えDNAは、形質転換させようとする細胞の集団から形質転換された細胞を同定して選択することを容易にするため、選択マーカー遺伝子、またはレポータ遺伝子、またはその両方を含有することができる。あるいは選択マーカーをDNAの別の断片に載せ、同時形質転換処置で用いることができる。選択マーカーとレポータ遺伝子の両方を適切な調節配列に隣接させて宿主細胞の中での発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーは本分野で周知であり、その中に含まれるのは、例えば抗生剤耐性遺伝子と除草剤耐性遺伝子(neo、hpt、dhfr、bar、aroA、puro、hyg、dapAなど)である。Lundquistら(アメリカ合衆国特許第5,848,956号)の表1に掲載されている遺伝子も参照されたい。
レポータ遺伝子を用い、形質転換された可能性のある細胞を同定することと、調節配列の機能を評価することができる。アッセイが容易なタンパク質をコードするレポータ遺伝子は本分野で周知である。一般に、レポータ遺伝子は、レシピエント生物または組織の中に存在していないか、そのレシピエント生物または組織によって発現されない遺伝子であり、この遺伝子は、発現が容易に検出できる何らかの特性(例えば酵素活性)によって示されるタンパク質をコードしている。代表的なレポータ遺伝子に含まれるのは、大腸菌のTn9からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)、大腸菌のuidA遺伝子座のベータ-グルクロニダーゼ遺伝子(gus)、緑色、赤色、または青色の蛍光タンパク質遺伝子、およびルシフェラーゼ遺伝子である。レポータ遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞の中に導入された後の適切な時期に調べられる。
標的細胞の形質転換が可能な組み換えDNAを構成する一般的な方法は当業者に周知である。構成のための同じ組成物と方法を利用して本明細書で有用なDNAを生成させることができる。例えばSambrook他、『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』(2002年)が、構成する適切な方法を提供している。
組み換えDNAは、組み換えDNAを含む発現ベクターを、特定の細胞に導入するのに有用な任意の手続き(例えば物理的または生物学的な方法)によってトランスフェクトすることによって宿主細胞(例えば哺乳類、酵母、または昆虫の細胞)の中に容易に導入することができて、組み換えDNAを持つ形質転換された(トランスジェニック細胞)が生成し、その結果として興味ある組み換えDNAが宿主細胞によって発現される。一実施態様では、細胞に導入された組み換えDNAの少なくとも1つが染色体外に維持される。一実施態様では、少なくとも1つの組み換えDNAが宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれる。
組み換えDNAを宿主細胞の中に導入する物理的な方法には、カルシウムを媒介とした方法、パーティクルボンバードメント、微量注入、電気穿孔などが含まれる。興味あるDNAを宿主細胞の中に導入するための生物学的方法には、DNAベクターまたはRNAベクターの利用が含まれる。ウイルスベクター(例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター)が、真核細胞(哺乳類(例えばヒト)細胞など)の中に遺伝子を挿入するために広く利用される方法になっている。遺伝子を細胞の中に導入するのに有用な他のウイルスベクターは、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルスなどに由来することができる。
宿主細胞の中に組み換えDNA配列が存在することを確認するため、多彩なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイに含まれるのは、例えば、当業者に周知の分子生物学的アッセイ(サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、RT-PCR、およびPCRなど);生化学的アッセイ(例えば免疫学的手段(ELISAとウエスタンブロット)または他の分子アッセイによる特定の遺伝子産物の存在または不在の検出など)である。
導入された組み換えDNAセグメントから生成したRNAを検出して定量するため、RT-PCRを利用することができる。PCRのこの応用では、酵素(逆転写酵素など)を用いてRNAをDNAに逆転写した後、従来のPCR技術の利用を通じてDNAを増幅することが最初に必要である。たいていの場合、PCR技術は有用だが、RNA産物の完全性を証明することはない。RNA産物に関するさらなる情報は、ノーザンブロッティングによって得ることができる。この技術はRNA種の存在を証明し、そのRNAの完全性に関する情報を与える。RNA種の存在または不在は、ドットまたはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを利用して明らかにすることもできる。これらの技術はノーザンブロッティングの改変であり、RNA種の存在または不在だけを証明する。
サザンブロッティングとPCRを利用して問題の組み換えDNAセグメントを検出できるが、これらはその組み換えDNAセグメントが発現しているかどうかに関する情報を提供しない。発現は、導入されたDNA配列のペプチド産物を特異的に同定することによって、または宿主細胞に導入されたDNAセグメントが発現することでもたらされた表現型の変化を評価することによって、評価することができる。
1つ以上のシアリルトランスフェラーゼの発現をノックダウンまたはノックアウトするのに用いられるベクターでは、ベクターは、細胞のゲノムの中に1つ以上の変異をもたらす配列を有する。変異は、少なくとも1つの機能するシアリルトランスフェラーゼの産生を抑制または阻止するのに有効である。一実施態様では、変異は、1、10、20、50、100、500から数千個までのヌクレオチドの欠失であり、例えばシアリルトランスフェラーゼ遺伝子に対応する配列の1%、10%、50%、90%、またはそれよりも多くが欠失している(例えばシアリルトランスフェラーゼ(例えば2,3-シアリルトランスフェラーゼ(ST3))をコードしている領域の中の欠失)。一実施態様では、欠失した配列は、実質的に一致する配列に対応する(配列番号5、7、9、11、13、15、または17、またはこれらの任意の組み合わせと例えば少なくとも80%以上(例えば85%、90%、または95%)かつ100%まで、またはその間の任意の整数の核酸配列一致)。一実施態様では、変異は、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子に対応する配列への1、2、3、5、10、20、50、100、500から数千個まで、またはそれよりも多数のヌクレオチドの挿入(例えばシアリルトランスフェラーゼ(例えば2,3-シアリルトランスフェラーゼ(ST3)をコードしている領域への挿入))である。一実施態様では、挿入は、実質的に一致(配列番号5、7、9、11、13、15、または17、またはこれらの任意の組み合わせと例えば少なくとも80%以上(例えば85%、90%、または95%)かつ100%まで、またはその間の任意の整数の核酸配列一致)する配列に対応する配列への挿入である。一実施態様では、変異は、1つ以上のヌクレオチド置換(例えばシアリルトランスフェラーゼ(例えば2,3-シアリルトランスフェラーゼ(ST3))をコードしている領域に対応する配列内の1、2、3、4、5、6、10、または数百個までのヌクレオチド置換(例えば配列番号5、7、9、11、13、15、または17、またはこれらの任意の組み合わせの中の置換))を含んでいる。一実施態様では、実質的に一致(配列番号5、7、9、11、13、15、または17、またはこれらの任意の組み合わせと例えば少なくとも80%以上(例えば85%、90%、または95%)かつ100%まで、またはその間の任意の整数の核酸配列一致)する配列の中の挿入、ヌクレオチド置換、および/または欠失の組み合わせが、宿主細胞の中にある。一実施態様では、変異の結果として、例えば配列番号6、8、10、12、14、16、または18のいずれかとアミノ酸配列が少なくとも80%以上(例えば85%、90%、または95%)かつ100%まで、またはその間の任意の整数で一致するタンパク質をコードする1つ以上のST3遺伝子の発現が減少した宿主細胞になる。
一実施態様では、宿主細胞は、例えば配列番号1~4のいずれかとアミノ酸配列が少なくとも80%以上(例えば85%、90%、または95%、かつ100%まで、またはその間の任意の整数)一致するタンパク質をコードしている1つ以上のST6遺伝子を発現する。
CRISPR/Casシステム
II型CRISPRは、標的となるDNA二本鎖の切断を4つの逐次的な工程において実行するよく特徴づけられたシステムである。最初に、2つの非コードRNA、プレcrRNAアレイ、およびtracrRNAをCRISPR遺伝子座から転写する。第2に、tracrRNAがプレcrRNAの反復領域にハイブリダイズし、プレcrRNAが、個別のスペーサ配列を含有する成熟crRNAになるプロセシングを媒介する。第3に、成熟crRNA:tracrRNA複合体が、crRNA上のスペーサと、プロトスペーサ隣接モチーフ(PAM)(標識認識のための追加条件)の隣にある標的DNA上のプロトスペーサの間のワトソン-クリック塩基対形成を通じ、Cas9を標的DNAに向かわせる。最後に、Cas9が標的DNAの切断を媒介してプロトスペーサの中に二本鎖切断を生じさせる。CRISPR/Casシステムの活性は3つの工程を含んでいる。すなわち、(i)「適応」と呼ばれるプロセスにおいて、外来DNA配列をCRISPRアレイに挿入して将来の攻撃を阻止する工程、(ii)関係するタンパク質の発現のほか、アレイの発現とプロセシングを実施する工程、それに続く(iii)RNAを媒介として外来核酸に干渉する工程である。したがって細菌細胞では、いくつかのいわゆる「Cas」タンパク質がCRISPR/Casシステムの天然機能に関与する。CRISPR遺伝子座の主要な産物は、侵入者を標的とする配列を含有する短いRNAであるように見え、それをガイドRNAと名づける。
「Cas1」ポリペプチドは、CRISPR関連(Cas)タンパク質1を意味する。Cas1(タンパク質分類システムのClusters of Orthologous Groupの中のCOG1518)は、CRISPR関連システム(CASS)の最良のマーカーである。系統発生的比較に基づき、CRISPR関連免疫系の7つの異なるバージョンがこれまでに同定されている(CASS1~7)。本明細書に記載されている方法で用いられるCas1ポリペプチドとして、任意の原核生物の中に存在する任意のCas1ポリペプチドが可能である。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、古細菌微生物のCas1ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、ユーリ古細菌微生物のCas1ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、クレン古細菌微生物のCas1ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、細菌のCas1ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、グラム陰性菌またはグラム陽性菌のCas1ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、緑膿菌のCas1ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、アクゥイフェクス・アエオリクスのCas1ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、CASs1~7の1つのメンバーであるCas1ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、CASS3の1つのメンバーであるCas1ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、CASS7の1つのメンバーであるCas1ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、CASS3またはCASS7の1つのメンバーであるCas1ポリペプチドである。
いくつかの実施態様では、Cas1ポリペプチドは、GenBankに例えばGeneID番号:2781520、1006874、9001811、947228、3169280、2650014、1175302、3993120、4380485、906625、3165126、905808、1454460、1445886、1485099、4274010、888506、3169526、997745、897836、または1193018で示されているヌクレオチド配列、および/またはこれらポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸と相同性(例えば80%超、90~99%(91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%が含まれる))を示すアミノ酸配列によってコードされており、これらのポリペプチドはCas1ポリペプチドとして機能する。
3つのタイプのCRISPR/Casシステムが存在しており、そのすべてがRNAタンパク質とCasタンパク質を組み込んでいる。I型とIII型の両方とも、プレcrRNAを処理するCasエンドヌクレアーゼを持ち、プレcrRNAは、完全に処理されてcrRNAになるとき、crRNAと相補的な核酸を切断することのできるマルチCasタンパク質複合体を組み立てる。
II型CRISPR/Casシステムでは、crRNAは異なる機構を利用して生成される。この機構では、プレcrRNAの中の反復配列と相補的なトランス活性化RNA(tracrRNA)が、Cas9タンパク質の存在下で二本鎖特異的なRNアーゼIIIによるプロセシングを開始させる。その後Cas9は、成熟crRNAと相補的な標的DNAを切断することができるが、Cas9による切断は、crRNAと標的DNAの間の塩基対形成と、crRNAの中の短いモチーフ(PAM(プロトスペーサ隣接モチーフ)配列と呼ばれる)の存在の両方に依存する。それに加え、tracrRNAも存在していなければならない。なぜならtracrRNAはcrRNAとその3'末端で塩基対を形成し、この会合がCas9活性を開始させるからである。
Cas9タンパク質は少なくとも2つのヌクレアーゼドメインを有する。1つのヌクレアーゼドメインはHNHエンドヌクレアーゼと類似しているのに対し、他方はRuvエンドヌクレアーゼドメインに似ている。HNH型ドメインは、crRNAと相補的なDNA鎖の切断に責任があるように見えるのに対し、Ruvドメインは非相補的な鎖を切断する。
crRNA-tracrRNA複合体の必要性は、通常はcrRNAとtracrRNAのアニーリングによって形成されるヘアピンを含む操作された「単一ガイドRNA」(sgRNA)の使用によって回避することができる(Jinek他(2012年)Science 第337巻:816ページと、Cong他(2013年)Sciencexpress/10.1126/science.1231143を参照されたい)。化膿レンサ球菌では、二本鎖RNA:DNAヘテロ二量体がCas関連RNAと標的DNAの間に形成されるとき、操作されたtracrRNA:crRNA融合体またはsgRNAがCas9をガイドして標的DNAを切断する。Cas9タンパク質と操作されたsgRNAを含むこのシステム。
「Casポリペプチド」には、完全長Casポリペプチド、Casポリペプチドの酵素活性な断片、およびCasポリペプチドの酵素活性な誘導体またはその断片が含まれる。Casポリペプチドの適切な誘導体またはその断片の非限定的な例に含まれるのは、Casタンパク質の変異体、融合体、共有結合性修飾体、またはその断片である。
CRISPR/CasのRNA成分
Cas9に関連するCRISPR/Casシステムは、2つのRNA非コード成分を含んでいる。すなわちtracrRNAと、同一の直接反復(DR)によって隔てられたヌクレアーゼガイド配列(スペーサ)を含有するプレcrRNAアレイである。CRISPR/Casシステムを利用してゲノム操作を実現するには、これらRNAの両方の機能が存在している必要がある(Cong他(2013年)Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143を参照されたい)。いくつかの実施態様では、tracrRNAとプレcrRNAは、別々の発現コンストラクトを通じて供給されるか、別々のRNAとして供給される。別の実施態様では、キメラRNAが構成され、その中では操作された(標的特異性を与える)成熟crRNAが(Cas9との相互作用を提供する)tracrRNAに融合されてキメラcrRNA-tracrRNAハイブリッド(単一ガイドRNAとも呼ばれる)を生成させる。(Jinek、上記文献と、Cong、上記文献を参照されたい)。
キメラまたはsgRNAを操作し、任意の望む標的と相補的な配列を含めることができる。このRNAは、標的と相補的でG[n19]の形態の22塩基と、それに続くNGGの形態のプロトスペーサ隣接モチーフ(PAM)を含んでいる。したがって1つの方法では、sgRNAを興味ある遺伝子の中の既知のZFN標的を利用して設計することが、(i)ZFNヘテロ二量体の認識配列を、関連するゲノム(ヒト、マウス、または特定の植物種)の参照配列とアラインメントさせ;(ii)ZFN半部位の間のスペーサ領域を同定し;(iii)スペーサ領域に最も近いモチーフG[n20]GGの位置を同定し(そのような2つ以上のモチーフがスペーサと重なっているときには、スペーサよりも中心にあるモチーフを選択する);(iv)そのモチーフをsgRNAのコアとして使用することにより可能になる。この方法は、有利なことに、証明されたヌクレアーゼ標的に依存している。あるいはsgRNAは、G[n20]GG形式に合致する適切な標的配列を同定することにより、興味ある任意の領域を標的とするように設計することができる。
ドナー
上に指摘したように、例えば変異遺伝子の修正、または野生型遺伝子の発現増加のための外来配列(「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」または「興味ある遺伝子」とも呼ばれる)の挿入。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同じでないことは容易にわかるであろう。ドナー配列は、興味ある位置での効率的なHDRを可能にするため、相同な2つの領域が隣接した非相同配列を含有することができる。あるいはドナーは、DNA内の標的とする位置と相同な領域を持たない可能性があり、標的部位での切断の後にNHEJ依存性末端結合によって組み込むことができる。それに加え、ドナー配列は、細胞クロマチン内の興味ある領域と相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同ないくつかの不連続な領域を含有することができる。例えば通常は興味ある領域に存在していない配列を狙い通りに挿入するため、その配列がドナー核酸分子の中に存在して興味ある領域内の配列と相同な領域に隣接することが可能である。
ドナーポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAであること、一本鎖および/または二本鎖であることが可能であり、直線または環状の形態で細胞の中に導入することができる。直線形態で導入される場合には、ドナー配列の端部は当業者に知られている方法によって(例えばエキソヌクレアーゼによる分解から)保護することができる。例えば1つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直線状分子の3'末端に付加する、および/または自己相補的オリゴヌクレオチドを一端または両端に連結させる。例えばChang他(1987年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第84巻:4959~4963ページ;Nehls他(1996年)Science第272巻:886~889ページを参照されたい。外来ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法の非限定的な例に含まれるのは、末端アミノ基の付加と、改変されたヌクレオチド間結合(例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート、およびO-メチルリボース残基またはO-メチルデオキシリボース残基など)の利用である。
ポリヌクレオチドは、細胞の中に、追加配列(例えば複製起点、プロモータ、および抗生剤耐性をコードする遺伝子など)を有するベクター分子の一部として導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として導入すること、薬剤(リポソームまたはポロキサマーなど)との複合体になった核酸として導入すること、またはウイルス(例えばアデノウイルス、AAV、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠損レンチウイルス(IDLV))によって送達することができる。
ドナーは一般に、その発現が組み込み部位において内在性プロモータ(すなわち、ドナーが中に挿入される内在性遺伝子の発現を駆動するプロモータ)によって駆動されるように挿入される(例えば高度に発現するアルブミン、AAVS1、HPRTなど)。しかしドナーがプロモータおよび/またはエンハンサ(例えば構成的プロモータ、または誘導性プロモータ、または組織特異的プロモータ)を含むことができることは明らかであろう。
ドナー分子を内在性遺伝子の中に挿入し、その内在性遺伝子のすべてまたは一部を発現させること、またはその内在性遺伝子をまったく発現させないことができる。例えば本明細書に記載されている導入遺伝子をアルブミンまたは他の遺伝子座に挿入し、その内在性アルブミン配列のいくらか(リソソーム酵素をコードする導入遺伝子のN末端および/またはC末端)が、例えばリソソーム酵素をコードする導入遺伝子との融合体として発現するようにすること、またはその内在性アルブミン配列がまったく発現しないようにすることができる。別の実施態様では、(例えばアルブミンなどの追加コード配列あり、またはなしの)導入遺伝子は、任意の内在性遺伝子座(例えばセーフ・ハーバー遺伝子座)に組み込まれる。例えばアメリカ合衆国特許出願公開第2008/0299580号;第2008/0159996号;および第2010/0218264号を参照されたい。
内在配列(内在性、または導入遺伝子の一部)が導入遺伝子とともに発現するとき、その内在配列(例えばアルブミンなど)は、完全長配列(野生型または変異体)または部分配列であることが可能である。一実施態様では、内在配列は機能的である。これら完全長配列または部分配列(例えばアルブミン)の機能の非限定的な例に含まれるのは、導入遺伝子(例えば治療用遺伝子)によって発現するポリペプチドの血清半減期を長くすること、および/または担体として作用することである。
さらに、発現には必要とされないが、外来配列は、転写または翻訳を調節する配列(例えばプロモータ、エンハンサ、インシュレータ、内部リボソーム侵入部位、2Aペプチドをコードする配列、および/またはポリアデニル化部位)も含むことができる。
他のヌクレアーゼ(例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ(TALEN)、または標的とする遺伝子およびに特異的な他のもの)を利用し、導入遺伝子コンストラクトが、相同組み換え修復(HDR)によって、または非相同末端結合(NHEJ)により駆動されるプロセスの間の末端捕獲によって挿入されるようにすることができる。
代表的な実施態様
一実施態様では、哺乳類または鳥類の対応する非組み換え細胞と比べて減少した量の細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基と増加した量のヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリル残基を含む、哺乳類または鳥類の単離された組み換え細胞が提供される。一実施態様では、単離された組み換え細胞は非ヒト細胞である。一実施態様では、単離された組み換え細胞は、イヌまたは霊長類の細胞である。一実施態様では、単離された組み換え細胞は、ヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリルトランスフェラーゼI(ST6Gal-I)またはST6Gal-IIをコードする発現カセットを含んでいる。一実施態様では、ST6Gal-IまたはST6Gal-IIは、配列番号1~4または101のいずれか1つとアミノ酸配列が少なくとも80%一致するタンパク質を含んでいる。一実施態様では、1つ以上のβ-ガラクトシドα2,3シアリルトランスフェラーゼ遺伝子が組み換え細胞の中で変異して細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基の量が減少している。一実施態様では、ST3Gal-I遺伝子、ST3Gal-II遺伝子、ST3Gal-III遺伝子、ST3Gal-IV遺伝子、ST3Gal-V遺伝子、ST3Gal-VI遺伝子、またはST3Gal-II様遺伝子の2つ以上が組み換え細胞の中で変異している。一実施態様では、ST3遺伝子は、配列番号5、7、9、11、13、15、または17のいずれか1つと少なくとも80%一致する核酸配列を持つ。一実施態様では、細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基の減少は、1つ以上のST3シアリルトランスフェラーゼの発現が減少した結果である。一実施態様では、その1つ以上のST3シアリルトランスフェラーゼは、配列番号6、8、10、12、14、16、または18のいずれか1つと少なくとも80%一致するアミノ酸配列を持つ。一実施態様では、インフルエンザH3ウイルスは、組み換え細胞の中で非組み換え細胞と比べてより効率的に複製される。
一実施態様では、哺乳類または鳥類の対応する非組み換え細胞と比べて減少した量の細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基を含む、哺乳類または鳥類の単離された組み換え細胞が提供される。一実施態様では、ST3Gal-I、ST3Gal-II、ST3Gal-III、ST3Gal-IV、ST3Gal-V、ST3Gal-VI、またはST3Gal-II様遺伝子の1つ以上が組み換え細胞の中で変異している。一実施態様では、ST3Gal-I、ST3Gal-II、ST3Gal-III、ST3Gal-IV、ST3Gal-V、ST3Gal-VI、またはST3Gal-II様遺伝子の組み合わせが組み換え細胞の中で変異している。一実施態様では、ST3Gal-I、ST3Gal-II、ST3Gal-III、ST3Gal-IV、ST3Gal-V、ST3Gal-VI、およびST3Gal-II様遺伝子が変異している。
一実施態様では、哺乳類細胞または鳥類細胞の細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基とヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリル残基の量を変化させる方法が提供される。一実施態様では、この方法は、親哺乳類細胞または親鳥類細胞の中で1つ以上のβ-ガラクトシドα2,3シアリルトランスフェラーゼ(ST3Gal)遺伝子を変異させるとともにヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリルトランスフェラーゼI(ST6Gal)遺伝子を過剰発現させて、対応する親細胞と比べて減少した量の細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基と増加した量のヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリル残基を表面に持つ改変された哺乳類細胞または鳥類細胞にすることを含んでいる。一実施態様では、その1つ以上のST3Gal遺伝子は、ゲノム編集システムを用いて変異させる。一実施態様では、ゲノム編集システムは、CRISPR/Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、または転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ(TALEN)を含んでいる。一実施態様では、変異は、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失、またはその両方を1つ以上のST3遺伝子の中に含んでいる。一実施態様では、改変された細胞は、ST6Galオープンリーディングフレームを含む発現カセットを含んでいる。一実施態様では、改変された細胞は腎細胞である。一実施態様では、改変された細胞はイヌ細胞である。一実施態様では、改変された細胞はMadin-Darbyイヌ腎(MDCK)細胞である。
一実施態様では、インフルエンザウイルスを増殖させる方法が提供される。この方法は、組み換え細胞にインフルエンザウイルスを感染させ;子孫ウイルスを回収することを含んでいる。一実施態様では、インフルエンザウイルスはヒトインフルエンザウイルスである。一実施態様では、インフルエンザウイルスはA型インフルエンザウイルスである。一実施態様では、インフルエンザウイルスはB型インフルエンザウイルスである。一実施態様では、インフルエンザウイルスはH3ウイルスである。一実施態様では、ウイルスは、A/H1N1、A/H3N2、B山形系統B型インフルエンザウイルス、またはB/ヴィクトリア系統B型インフルエンザウイルスである。
一実施態様では、インフルエンザウイルスを単離する方法が提供され、この方法は、インフルエンザウイルスに感染していることが疑われる鳥類または哺乳類からのサンプルを用意し;組み換え細胞にそのサンプルを接触させることを含んでいる。一実施態様では、この方法は、サンプルがインフルエンザウイルスに感染しているかどうかを判断することを含んでいる。一実施態様では、この方法は、ウイルスのHA亜型および/またはNA亜型を同定することを含んでいる。
一実施態様では、インフルエンザウイルス感染を診断する方法が提供される。この方法は、組み換え細胞に、インフルエンザウイルスに感染していることが疑われる鳥類または哺乳類からのサンプルを感染させ;その細胞がウイルスに感染しているかどうかを判断することを含んでいる。一実施形態では、プラークアッセイを利用して、ウイルスの量の存在を決定する。一実施態様では、プラークアッセイを利用して、例えば感染した細胞の上清の中のウイルスの量の存在を明らかにする。
代表的なシアリルトランスフェラーゼ配列
高等脊椎動物のシアリルトランスフェラーゼは、活性化された糖ドナー(CMP-β-Neu5Ac、CMP-β-Neu5Gc、およびCMP-β-KDN)からのシアル酸残基を糖タンパク質と糖脂質のオリゴ糖鎖の末端非還元位置に転移するのを媒介するグリコシルトランスフェラーゼである。脊椎動物のシアリルトランスフェラーゼスーパーファミリーは、形成されるグリコシド結合と使用する単糖アクセプタに応じて4つのファミリーST6Gal、ST3Gal、ST6GalNAc、およびST8Siaに分けられる。哺乳類と鳥類のST6Galファミリーのメンバーは、シアル酸残基を2型二糖の末端ガラクトース残基(Gal(NAc) β1,4GlcNAc)に転移させる触媒となり、α2-6グリコシド結合が形成される。他のシアリルトランスフェラーゼファミリーとは異なり、このファミリーは、ヒトゲノムの中にそれぞれST6GAL1およびST6GAL2と呼ばれる2つのパラログだけを含んでいる。ヒトST6GAL1遺伝子は多彩な組織の中に遍在的に発現しているのに対し、ST6GAL2遺伝子は組織特異的(成人の脳)かつ段階特異的(胎生期)なやり方で発現する。哺乳類のst6gal1遺伝子発現は、同じポリペプチド酵素をコードするいくつかの転写産物の発現を支配する多数のプロモータによって調節される。
一実施態様では、鳥類細胞または哺乳類細胞(例えばイヌまたは非ヒト霊長類の細胞)の中の1つ以上のST3遺伝子が改変される結果として、細胞表面のα2,3-結合シアル酸の発現が減少する。一実施態様では、1つ以上のヒトST6遺伝子がイヌまたは非ヒト霊長類の細胞に導入される。一実施態様では、1つ以上のST3遺伝子が改変された後、1つ以上のST6遺伝子が細胞に導入される。一実施態様では、1つ以上のST6遺伝子が導入された後、細胞の中でST3遺伝子が改変される。一実施態様では、同時または逐次的に、ST3遺伝子が改変され、ST6遺伝子が細胞に導入される。
一実施態様では、発現するST6Galに含まれるのは、
MIHTNLKKKFSCCVLVFLLFAVICVWKEKKKGSYYDSFKLQTKEFQVLKSLGKLAMGSDSQSVSSSSTQDPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC(配列番号1)または
MIHTNLKKKFSCCVLVFLLFAVICVWKEKKKGSYYDSFKLQTKEFQVLKSLGKLAMGSDSQSVSSSSTQDPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHPDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRRTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLFEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC(配列番号150)を含んでいて、
ATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAGAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGATCTGGAAGAATTACCTAAGCATGAACAAGTACAAAGTGTCCTACAAGGGGCCAGGACCAGGCATCAAGTTCAGTGCAGAGGCCCTGCGCTGCCACCTCCGGGACCATGTGAATGTATCCATGGTAGAGGTCACAGATTTTCCCTTCAATACCTCTGAATGGGAGGGTTATCTGCCCAAGGAGAGCATTAGGACCAAGGCTGGGCCTTGGGGCAGGTGTGCTGTTGTGTCGTCAGCGGGATCTCTGAAGTCCTCCCAACTAGGCAGAGAAATCGATGATCATGACGCAGTCCTGAGGTTTAATGGGGCACCCACAGCCAACTTCCAACAAGATGTGGGCACAAAAACTACCATTCGCCTGATGAACTCTCAGTTGGTTACCACAGAGAAGCGCTTCCTCAAAGACAGTTTGTACAATGAAGGAATCCTAATTGTATGGGACCCATCTGTATACCACCCAGATATCCCAAAGTGGTACCAGAATCCGGATTATAATTTCTTTAACAACTACAAGACTTATCGTAAGCTGCACCCCAATCAGCCCTTTTACATCCTCAAGCCCCAGATGCCTTGGGAGCTATGGGACATTCTTCAAGAAATCTCCCCAGAAGAGATTCAGCCAAACCCCCCATCCTCTGGGATGCTTGGTATCATCATCATGATGACGCTGTGTGACCAGGTGGATATTTATGAGTTCCTCCCATCCAAGCGCAGGACTGACGTGTGCTACTACTACCAGAAGTTCTTCGATAGTGCCTGCACGATGGGTGCCTACCACCCGCTGCTCTTTGAGAAGAATTTGGTGAAGCATCTCAACCAGGGCACAGATGAGGACATCTACCTGCTTGGAAAAGCCACACTGCCTGGCTTCCGGACCATTCACTGCTAA(配列番号151)によってコードされているヒトST6(アクセッション番号KJ897554);
mkphlkqwrq rmlfgifawg llfllifiyf tdsnpaepvp sslsfletrr llpvqgkqra imgaahepsp pggldarqal prahpagsfh agpgdlqkwa qsqdgfehke ffssqvgrks qsafypeddd yffaagqpgw hshtqgtlgf pspgepgpre gafpaaqvqr rrvkkrhrrq rrshvleegd dgdrlyssms raflyrlwkg nvsskmlnpr lqkamkdylt ankhgvrfrg kreaglsraq llcqlrsrar vrtldgteap fsalgwrrlv pavplsqlhp rglrscavvm sagailnssl geeidshdav lrfnsaptrg yekdvgnktt iriinsqilt npshhfidss lykdvilvaw dpapysanln lwykkpdynl ftpyiqhrqr npnqpfyilh pkfiwqlwdi iqentkekiq pnppssgfig ilimmsmcre vhvyeyipsv rqtelchyhe lyydaactlg ayhpllyekl lvqrlnmgtq gdlhrkgkvv lpgfqavhcp apspviphs(配列番号2)を含むヒトST6(アクセッション番号BAC24793);
aamgsdsqsv sssstqdphr grqtlgslrg lakakpeasf qvwnkdsssk nliprlqkiw knylsmnkyk vsykgpgpgi kfsaealrch lrdhvnvsmv evtdfpfnts ewegylpkes irtkagpwgr cavvssagsl kssqlgreid dhdavlrfng aptanfqqdv gtkttirlmn sqlvttekrf lkdslynegi livwdpsvyh sdipkwyqnp dynffnnykt yrklhpnqpf yilkpqmpwe lwdilqeisp eeiqpnppss gmlgiiimmt lcdqvdiyef lpskrktdvc yyyqkffdsa ctmgayhpll yeknlvkhln qgtdediyll gkatlpgfrt ihc(配列番号3)を含むヒトST6(アクセッション番号SJL87798);または
ヒトST6 Gal-II
MKPHLKQWRQRMLFGIFAWGLLFLLIFIYFTDSNPAEPVPSSLSFLETRRLLPVQGKQRAIMGAAHEPSPPGGLDARQALPRAHPAGSFHAGPGDLQKWAQSQDGFEHKEFFSSQVGRKSQSAFYPEDDDYFFAAGQPGWHSHTQGTLGFPSPGEPGPREGAFPAAQVQRRRVKKRHRRQRRSHVLEEGDDGDRLYSSMSRAFLYRLWKGNVSSKMLNPRLQKAMKDYLTANKHGVRFRGKREAGLSRAQLLCQLRSRARVRTLDGTEAPFSALGWRRLVPAVPLSQLHPRGLRSCAVVMSAGAILNSSLGEEIDSHDAVLRFNSAPTRGYEKDVGNKTTIRIINSQILTNPSHHFIDSSLYKDVILVAWDPAPYSANLNLWYKKPDYNLFTPYIQHRQRNPNQPFYILHPKFIWQLWDIIQENTKEKIQPNPPSSGFIGILIMMSMCREVHVYEYIPSVRQTELCHYHELYYDAACTLGAYHPLLYEKLLVQRLNMGTQGDLHRKGKVVLPGFQAVHCPAPSPVIPHS(配列番号4);
ATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAGAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGATCTGGAAGAATTACCTAAGCATGAACAAGTACAAAGTGTCCTACAAGGGGCCAGGACCAGGCATCAAGTTCAGTGCAGAGGCCCTGCGCTGCCACCTCCGGGACCATGTGAATGTATCCATGGTAGAGGTCACAGATTTTCCCTTCAATACCTCTGAATGGGAGGGTTATCTGCCCAAGGAGAGCATTAGGACCAAGGCTGGGCCTTGGGGCAGGTGTGCTGTTGTGTCGTCAGCGGGATCTCTGAAGTCCTCCCAACTAGGCAGAGAAATCGATGATCATGACGCAGTCCTGAGGTTTAATGGGGCACCCACAGCCAACTTCCAACAAGATGTGGGCACAAAAACTACCATTCGCCTGATGAACTCTCAGTTGGTTACCACAGAGAAGCGCTTCCTCAAAGACAGTTTGTACAATGAAGGAATCCTAATTGTATGGGACCCATCTGTATACCACCCAGATATCCCAAAGTGGTACCAGAATCCGGATTATAATTTCTTTAACAACTACAAGACTTATCGTAAGCTGCACCCCAATCAGCCCTTTTACATCCTCAAGCCCCAGATGCCTTGGGAGCTATGGGACATTCTTCAAGAAATCTCCCCAGAAGAGATTCAGCCAAACCCCCCATCCTCTGGGATGCTTGGTATCATCATCATGATGACGCTGTGTGACCAGGTGGATATTTATGAGTTCCTCCCATCCAAGCGCAGGACTGACGTGTGCTACTACTACCAGAAGTTCTTCGATAGTGCCTGCACGATGGGTGCCTACCACCCGCTGCTCTTTGAGAAGAATTTGGTGAAGCATCTCAACCAGGGCACAGATGAGGACATCTACCTGCTTGGAAAAGCCACACTGCCTGGCTTCCGGACCATTCACTGCTAA(配列番号100)によってコードされるヒトST6 Gal1;
MIHTNLKKKFSCCVLVFLLFAVICVWKEKKKGSYYDSFKLQTKEFQVLKSLGKLAMGSDSQSVSSSSTQDPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHPDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRRTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLFEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC(配列番号101)を含むヒトST6 Gal1;
または配列番号1~4、101、または150のいずれか1つとアミノ酸配列が少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するタンパク質、または配列番号100または151のいずれか1つのヌクレオチド酸配列と少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するヌクレオチド配列である。
一実施態様では、変異したST3遺伝子は、
gtcaggtctc agaaaagtct agaataaggc ttacaggcac tttgttcagt tgtggaacac atggaaactt catacaccgc ccccctcctt gcagaccgga gagctctctg ctctaatttg ggcacaggcg cccaaccttg ggccccagag gaagcctgtt ctactcccag ggccaacgct caattgcttg gtaacttggc acccacactg ttccaggctc tggtctcagt ttcactctct gcaaaatgag aggctcagag ttccgctgac atggcctcgg ggccgttaaa acctttcttc atgaagacag cctgcaccct tcctgcttct gctccaggtc catcctcaga accttccaga aagtcctggc acgtcagata acagggccaa cccggcagtg atgccccacc ccccacccct tcccttactc atagagcctg ctccagactc tcagagccca cacccacttg gtgaagtcat ttgccagtaa ttcttcgcac tggacattga gaggtttcag accccagaag tctcaggcgc tgggtctgaa agtgggcaga gcccaggtga catttgtgga gactctcagt ggtgcgtata gccgccggga ccattttcag actcaacctt tctgacctgg aaatgccaat agaagtaatc atcatcgcca ggggctgtgg tgagcaaatg cttggagctc tgtggccagg gcagtttcat ttgaggacca gagatggaca atccctcagc ctactgagat gaagaaactg agtctcagag aggttaagga actcccccga ggttgcacca ctgaggaaga ttgacctgac ttcccaagac catacatctg gtaaaccgga acctgcacct gcgccatctc aagcctactc tggaggcccg aggctaattg gcagagtttg agggctgaga tgacagacaa ccctcagtgc cttcatcggg cgggctgctt acctgcacat ccctggtgac agcatgggaa agaccgcttc taattaagcg tcatcacaca tcaccctttt ccggaggaag agaggcaaag acagctcccc tctatcctgc actgtgaacc ttcctccgag gtcctcccct cacccccgag agtccttgcc ctgtcaccaa gattaattac ccctcaaccc ctttggatgg caaaggcagt cattttatta agtttgatta aagcttcaag agacattgcc ggatgtttca ggactgctga caaagcagcc tgcttgtttc ctgaaaagac caattatatg caagaagcgt cagccccact ccccgagggg tccacttagc ctccgaccac cacagggtga tgtccagcgc accggtgtgg ccatcacctg gcgggagtga ggtcggccgt agcaggtctg gaggcccccc tgcaagtccc tgcctcaccc tgtgactgag cctctcgtct ctgggaattt tgttccaaat tccccgtcta ccaggtgtga tttcctccag ccccaccagc cctgggaggc gcccatccag agagcagaga tggtgaccat gagaaagagg actctcaaag tgctcaccct cctcgtcctc ttcatcttcc tcacctcctt cttcctgaat tactcccaca ccatggtgac caccacctgg tttcccaagc agatggttgt cgagctctca gagaacttta agaagttcat gaaatacact cacaggcctt gcacctgtgc ccgctgcatc gggcagcaga gggtctcggc ctggttcgat gagaggttca accggtccat gcagccgctg ctgaccgccc agaacgccct cttggaggag gacacctaca gctggtggct gaggctccag cgggagaagc aacccaacaa cttgaacgat accatcaggg agctgttcca ggtggtgccc gggaacgtgg accccctgct ggagaagagg tcggtgggct gccggcgctg cgcagtcgtg ggcaactctg gcaacctccg agagtcctgg tacgggcctc agatcgacag ccacgacttc gtgctcagga tgaacaaggc ccccacggcg ggcttcgaga tggatgtcgg gagcaagacc acccaccacc tggtgtaccc cgagagcttc agggagctgg cggagaatgt cagcatggtc ctggtgccct tcaagaccac cgacctggag tgggtggtca gtgccaccac cacaggcacc atctctcaca cctatgttcc tgttcctgca aagatcaaag tgaaaaagga taagatcctc atctaccacc cggccttcat caagtacgtc ttcgacagct ggctgcaggg ccacgggcgg tacccgtcca ccggcatcct ctccgtcatc ttctcgctgc acatctgcga cgaggtggac ttgtacggct tcggggcaga cagtaagggg aactggcatc actactggga gaacaatcca tcggcggggg ctttccgcaa gaccggggtg cacgacggag actttgagtc caacgtgacg gccaccttgg cgtccatcaa taagatccgg atatttaagg ggagatgacg ctgccgagga gcaccggagc ccgcctcttt ggccagcccc agcctctgct ggagccgatc tgtgctgggg gctttgaggg ccagcctcgg gggcgtgttc aggtgcccct cgtgccccct cgcaccccga catttggcag catcgactca gcaaggcccc 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ggtttgtggg gccatcccag gaacatgacc ctcggagcgg gagaagacat acctcatcct ctcacttctg ggctgctctg attcctcctc atgattattt attgattttt ttttaattca gctgacattg cgtgcacttt gtggctccgt ggctggtcct gatgttttaa ttaagcttgc tctcgcttca cctggcagcc ggggcatggg gggcttaagt caaggtttgc aggagtcctc agacttggga gggggatgca tatctagggc ttgggggctc gtcggtgggc aaatgccagg gtttcaggtt ggtaggttct ccgagtgctc tgtacctcct tcccctcagc tctgcctccc ttctccatca ttgcgggttg ggatcattct caggctaaga atctgcaaaa cccagtgaga cggccttggg gccaggtggg gagtggagtc acacaggcag ggcagcgatg gttggctccg gttgctgaca ctgaatcaga aaatccacgt ttcctattga gagcatttcc taacaggcca ctgctacttc gaggaggtgt gacagtgtcc tggctgtcac gggggcccgt ctcctgtgct ccttgcagca gcactccggc aagttctgct ctcctggctt cagtctctgc ctctgcaaac ggagagggag gcatttgggg agctcagggg gccacaggtg gtttcagggg gttcacaagc gtccccagag agagcacacc acgcccgtgt tttaccccaa gcctgtgtgt atgagcatat attcctgggg agcggtgccg tagcgttcat tcaattgtca gaggttcaga acccagacaa tggtttacaa aaacacgaaa cgacagcaag caaacaaaaa cccgttcgag ctttaaaatc ctccaacact 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tcctctccgc ccagcagaca tctgccctgc ccttgccctt gaccccattg ctgcgcttcc ctcaaggacg ggcctggcct tggtggccac ctgcggacag ccctgcgccc gacgcccgct tcaccccggg gcccgggtct ggaggggccg cccccaggac gaacgcggct gccccacggg gccggcccct caccggcttc gcgtccaagc caaagtttct cgagcacttt tttgttcttt gcaatcatgt tgggttcatt gttggtgttt taaaattttg cttccctctc cctctggcct cgctcctgtg tgtgttttgt agccgagcgc taacctggat gcttttttga atgacctttg caagagcctg ccttcctcgg cctctgctct gttttattta ttgttgaata tttccaatga tccaaatcaa agtgaattaa aacaaagcta ttttatcgtt(配列番号5)(アクセッション番号XM_022426722)を含むイヌST3GalIとの少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%の核酸配列一致;
mvtmrkrtlk vltllvlfif ltsfflnysh tmvtttwfpk qmvvelsenf kkfmkythrp ctcarcigqq rvsawfderf nrsmqpllta qnalleedty swwlrlqrek qpnnlndtir elfqvvpgnv dpllekrsvg crrcavvgns gnlreswygp qidshdfvlr mnkaptagfe mdvgsktthh lvypesfrel aenvsmvlvp fkttdlewvv satttgtish tyvpvpakik vkkdkiliyh pafikyvfds wlqghgryps tgilsvifsl hicdevdlyg fgadskgnwh hywennpsag afrktgvhdg dfesnvtatl asinkirifk gr(配列番号6;アクセッション番号XP_022282430)と少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするST3遺伝子;
cggctcgctc cgggagggca gagccggcaa gggcgggact ggcctgctgc gggcggacgg gggagccgcg gagctaacgg gtccggacgt cgccagcggc ggagctttct gcacgggcgg aggcggcggc aggagcggca agcatggccc gcgcggcgcc cggcgctgac tgagggtcat gctgcggcag cctggcgcct gacgagtgag ggggaacctg ccaggggatt actgctagca cgagctaaca gcaggacagc aggcctcagg ggagtgggga tgggcatagc agcctgcctg caacgctggg ccagtggcac caaggaggcc caggccctgg cagggagctc ggcacacgct cagctgaccc agacagcatt caaagcaggt ccctgctgag cagcagctgt tcccaggccc tggaggaccg caaacgcctc agcaaccaca tttggggctg tgaccatcag gagaagggac caacacctcg aatgggaagc agaagggcag aacctgctgc caggaggatc ttggtctctg cagcaaagtc ttccgacacc cgtggagctt cttgggtttc tcctctcagg actggggcct tgtttcctcc tctggtggag ggggtaggcc aggagggcca gctgaggtgg ggacgactct cggatggaat ccaggccact tgaagcccat gggctctctg ctgtgattgg ggttcgaggg cttccccact gcaggggacg aggggccgcc tccgtgtctg ctcatgaacc acaaggaccc cgaatgctcc agactggacc atttcgagcc accaaagagt ggggccccca gagctggcag ccagcagctc caagggacta gagagctggg atggactgac ctccccctca ccagggcatt aggagagtca 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mkcslrvwfl svafllvfim sllftyshhs matlpyldsg alggthrvkl vpgyaglqrl skegltgksc acrrcmgdtg asdwfdshfn snispvwtre nmdlppdvqr wwmmlqpqfk shntnevlek lfqivpgenp yrfrdphqcr rcavvgnsgn lrgsgygpdv dghnfimrmn qaptvgfeqd vgsrtthhfm ypesaknlpa nvsfvlvpfk aldllwiasa lstgqirfty apvksflrvd kekvqiynpa ffkyihdrwt ehhgrypstg mlvlffalhv cdevnvygfg adsrgnwhhy wennryagef rktgvhdadf eahiidmlak askievyrgn(配列番号8)(アクセッション番号XP_013969498)と少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするST3遺伝子;
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cgctctggaa ccacttacag ccacctggtg catcctcctt tggggtgcgt ttggagggcc tggttcctgc tcagccacat cttctgccac tttcaccagc aatgcccagt gagtataact atgtaaaact gagaagcgat cgctcaagac cctctctgca atggtacacc cgagctcaaa acaagatgag aagacccaac ttgttgttaa aagacatcct taagtgtaca ttgcttgtgt ttggagtgtg gatcctttat attctcaagt taaattatac tactgaagaa tgtgacatga aaaaaatgca ttatgtggac ccagaccgtg taaagagagc tcagaaatat gctcagcaag tcttgcaaaa ggagtgccga cccaagtttg cgaagaagtc gatggcgcag ttgttcgagc acaggtacag cacggacttg ccacctttcg tgaaggagac ccccaaaatg aatgaagccg agtacaagta tgatcctcct tttggattcc gaaagttctc cagtgaagtc cagaccctgt tggaaatact gcccgagcat gacatgcccg aacacttgag agcaaagagc tgtaggcgtt gtgtggtcat cggaagcggt ggcatactcc acggactagc actgggccag gccctcaacc agttcgatgt ggtgataagg ttaaacagtg caccagttga gggatattct gagcatgttg gtaataaaac tactataagg atgacttatc cagagggcgc gccactgtct gaccttgaat attattccaa tgacttgttt gttgctgttt tattcaagag tgttgacttc aactggcttc aagcaatggt aaaaaatgaa accctgccat tttgggtgcg gctcttcttt tggaagcagg tggcggaaaa aatcccacta cagccaaaac atttcaggat tttgaatcca gttattatca aagagactgc ctttgacatc cttcaatact cagagcccca gtcaaggttc tggggccgag ataagaacgt gcccaccatt ggtgtcattg ccgttgtctt agccacacat ctgtgtgatg aagtcagctt ggcaggcttt ggatatgacc tcaatcaacc caaaacacct ttgcactact ttgacaatct ctgcatggct gccatgaact ttcaaaccat gcataatgtg acaacggaga ccaggttcct cctcaagctg gtcaaagagg gcgtggtgaa ggatctcagc ggaggcatcc attgtgaatt ttgaacacag ggaaacctca tgtgacaatg caactctgac tctgaaggct gtttttcgta gccttctcga tgcagcgcat cctgcaaaat acttagaggt gcagctgggg ttttt(配列番号13)(アクセッション番号XM_022404744)を含むイヌST3GalVと少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致する核酸配列を持つST3遺伝子;
mpseynyvkl rsdrsrpslq wytraqnkmr rpnlllkdil kctllvfgvw ilyilklnyt teecdmkkmh yvdpdrvkra qkyaqqvlqk ecrpkfakks maqlfehrys tdlppfvket pkmneaeyky dppfgfrkfs sevqtlleil pehdmpehlr akscrrcvvi gsggilhgla lgqalnqfdv virlnsapve gysehvgnkt tirmtypega plsdleyysn dlfvavlfks vdfnwlqamv knetlpfwvr lffwkqvaek iplqpkhfri lnpviiketa fdilqysepq srfwgrdknv ptigviavvl athlcdevsl agfgydlnqp ktplhyfdnl cmaamnfqtm hnvttetrfl lklvkegvvk dlsggihcef(配列番号14)(アクセッション番号XP_022260452)と少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするST3遺伝子;
ST3遺伝子ggtcgattgc cccttggctg ctgtggaggc tgtgatgacc tccagggccg cggccctccg ggcgatgctt ctccaggggc tgaggccaac gcagaactcc cgtggcaccc actcggactc gcggcgtgtt cacatgtggg gttttattaa atcctcccac caaccgtgtg agacaggaac agttagcccc ggtgtgtccg ccaagattgc cccgcacaag tggctccgga tggatcacac gaagcacttg caagtgaaga agcagcacag ccctttatct tgggctattt cctgtggaga gactccaaca atttagcagc caggctcctg ggcctctggg accctcacca catcacatcc ttcaccttca ggagcagagc gcctttggga aacagacttc taaaagtgca ggtgggccag ccatgagagg gtacctagtg gccatattcc tgagtgctgt ctttctctat tatgtgctgc attgtatatt gtggggaaca aacatctatt gggtgccacc tgtggaaatg aagcggagaa ataagatcca gccttgttta gcgaagccag cttttgcctc tctcctgagg tttcatcagt ttcacccttt tctgtgtgca gctgatttta aaaagattgc ttccttgtat ggtagcgata agtttgatct gccctatggg ataagaacat cagcggaata ttttcgactc gctctttcaa aactgcagag ttgtgatctc tttgatgagt ttgacaatgt gccgtgtaaa aagtgcgtgg tggttggtaa tggaggagtt ctgaagaata agacattagg agaaaaaatt gactcctatg atgtcataat aagaatgaat aatggtcctg ttttaggaca tgaagaggaa gttgggagaa ggacaacctt ccgacttttt tatccagaat ctgttttttc agatcccaat cacaatgatc ctaatactac agcgattctc actgctttta agccgcttga cttaaagtgg ctgtgggaag tgttgacggg tggcaaaata aacactaatg gtttttggaa gaaaccagct ttaaacttga tctacaaacc ttatcaaatc agaatattag atcctttcat tatcagaatg gcagcttatg aactgcttca cttcccaaaa gtgtttccca aaaaccagaa acccaaacac ccaacaacag gaattattgc catcacgctg gcctttcaca tatgtcacga agttcacctt gctggtttta aatacaattt ttctgacctc aagagccctt tacactatta tgggaacgcg accatgtctt tgatgaataa gaatgcgtat cacaatgtga cagcggaaca gctctttttg aaggacattc tagaaaaaaa ctttgtaatc aacttgactg aagattgacc ctacagactc tgcagatgat gctaagagta ttagttttat ttttatactg caatttttag tttattttta aatatgttgg atgcacttgt caaaaaattg tgtatagtca gtctgttgct gcctggtgat tcataaccac cagcttaatt tctgtgaata tatttaattt ataaaaacca agaagatatg cttagatatc cgggaagttt tgattgcgtt ggttttaaaa caaccttagt tctctgaagt gtttttaaac atctttttta atagttactt catctttgac ttctgagggc atgtgacgtc caagtaaggg gctttagctt gaccaccaca aactctgaac agagttggtg gcggattcgg ctactgtaaa ttggtgggga atagccatgt gattgtgcaa actggaaccg gtttaggcaa gtatcgagtt cctttttact gaacccgagg aaacggattt gaatcttaaa gcaggcccaa ccatagcagt aggtacggtt atgaaatcta agatcataat ggtttcatta agcttttttt cctgtaagta aaccagatta taaaatgaaa ggtgtttgtt tttaaggtgg aggaaacagg ctacatgtga aattctggat gagtaaacaa cctaggaatg caattactaa agtctggtgg ctgcattatt ttaaagttca tacaaagaag cagagctagg ccacctcaag gagacagttc ttaaacgtca tcttttgcct gccttaatat gttaaaattt ggaagtttac tatttgaaat aggaaagatg aatacggcac agtaggtaaa tccttcagac tcctcaggct gtttttggat ttaaatggtc ctttcgtgaa aaatctcact tgtccacggt gaaatcccat cttcaaaggg aaggcttacc cggctaccta gggtgcatca gagaagagtc ctgctggatg cagacaagtc aaaaccagcc tgtccaacaa acgtgcgccc gtctctcttc tcaaagaggg atggaatgaa cagctctcag aagaggtaag agttgaagga cttgttatcc tctgagcgat aatcgtcatg gagagacact gctggtgttc ctgaaaacca gcctgcctct gagtctcaga gacaaaatat gagagcagcc actgggataa atcgtgaagc acggcataag gggggagaag cctcgtagtt gattgaaccc atgtctacgt ggcttcagct gattcccctg taacggaggt ggaaagttcc cgcacgtaca cagctgcacg ctgcagcctg gcggctggga ttccatgggt ggactcattc agggtacaaa gacagtcctg gctgcaaagt gaaaaacccc aggtggcatt ttcaagtgtt tatggactga aataatggct gtacggtatc tggcggatgc tcaacttgag gaatcggcat ttttgtacag tgggagctga ggctataaac ctcagcgtgg cttcacataa gccagaagaa actctcagcc cgatacatat gtacaattta ttaaaaacac atgaacacgt taaaatctca ctatttatac aatctacatt ctagcaacat atacaaatac cgagtgacta cagtacatgc cgaggtaaga aaagtacatt cggggagact atcactgaca ctcaagccat ttttatttcc aatatgtttt gctttcacct ttcccagtgc caaaaaaaaa aaaaaaaaa(配列番号15)(アクセッション番号XM_005639375)を含むイヌST3GalVIと少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致する核酸配列を持つST3遺伝子;
mrgylvaifl savflyyvlh cilwgtniyw vppvemkrrn kiqpclakpa fasllrfhqf hpflcaadfk kiaslygsdk fdlpygirts aeyfrlalsk lqscdlfdef dnvpckkcvv vgnggvlknk tlgekidsyd viirmnngpv lgheeevgrr ttfrlfypes vfsdpnhndp nttailtafk pldlkwlwev ltggkintng fwkkpalnli ykpyqirild pfiirmaaye llhfpkvfpk nqkpkhpttg iiaitlafhi chevhlagfk ynfsdlkspl hyygnatmsl mnknayhnvt aeqlflkdil eknfvinlte d(配列番号16)(アクセッション番号XP_005639432)と少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするST3遺伝子;
aaagacttca ctgggtatca gtctcctttg ggagaccaca ggacacgtgt cacctctccc atcctctcag cctccagccc agaccttggc agagttcctt ttaggagtta gcaagtggct gaggaggcaa gaggtgccag agccaatcta ctatctgctg ggggatgatt gccagggcca gagatgaggg ctcaatactt gaagtggggt ctggtagctg cctgtatagt tacgttatgg ctgatgatga tgaacttcct ggaccaggag ttcaaacaga atgacttccc taaaaagaca agaatacaat tatgccactg ccccaggaac tctttcagaa agtgtaggtg ttcgtttgag atccgcaagt gctctgcctg cctccgcgta cgtggaacgt ctgtctggtt tgatgaacgc ttcgaaacgg ctattgagcc tgtgcagaga ccagaagatc ccatatcctc tgatgctctg atattgtggt tgggtgtcca atcaaagagg gagtttgaga ctcagaagcc aatagaagag cctcctgggc aaccactggg ctacgtggag tccagttgtc ggacctgtgc agtggttgga aactcaaggt gcctacgggg ctctggccat ggattcagga ttaaccaaaa tgacatggtc ctcaggatga accaggcccc cgtccaagga tttgagatgg atgtggggaa cacaaccacc atgcgcataa tgtaccccga tatggctagc acgcagaatc ctggcaccaa attgctgctg cttcctctga attcatctgg tctaaagtgg tttatggaag tactacagga acagagcttc agaaagccca taaaccctgg atttcagata gtccagtttc ctggtggaag taacacgagc aaagacgagg tcttggtgat cagcctcacc tttcttcagt acatccagga tcattggctg cgaaaacgtc atcgttttcc atccttgggg tttgtgggtc tgttatatgc cctgcacact tgtgaccagg tatccttatt tggttttggg acagatcagc tcatgaggtg gtcccattac tgggatgata aatatcggtt cgagagtaac atgcacagtt tcaaagaaga gcagaagctc atcctccagc tgcaatgtga ggggaagatt gttatctaca gctgacatgt ttctgtcctg ttcagcccac tggaggcccc aggaggctga caggtagtca aggggaccac agagtgtcag agagggactg gggcttcaag tggaccctgg atatagatca gtctgctgct aaataaaact acagcttatt tctccca(配列番号17)(アクセッション番号XM_025469036)を含むイヌST3GalII様と少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致する核酸配列を持つST3遺伝子;または
mraqylkwgl vaacivtlwl mmmnfldqef kqndfpkktr iqlchcprns frkcrcsfei rkcsaclrvr gtsvwfderf etaiepvqrp edpissdali lwlgvqskre fetqkpieep pgqplgyves scrtcavvgn srclrgsghg frinqndmvl rmnqapvqgf emdvgntttm rimypdmast qnpgtkllll plnssglkwf mevlqeqsfr kpinpgfqiv qfpggsntsk devlvisltf lqyiqdhwlr krhrfpslgf vgllyalhtc dqvslfgfgt dqlmrwshyw ddkyrfesnm hsfkeeqkli lqlqcegkiv iys(配列番号18)(アクセッション番号XP_025324821)と少なくとも80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%一致するアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするST3遺伝子を持つ。
以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに説明する。
方法
細胞。MDCK細胞とAX4細胞を、5%ウシ新生児血清(NCS)または10%ウシ胎仔血清(FCS)を含有するイーグル最少必須培地(MEM)の中に維持した。全細胞を5%CO2で37℃にてインキュベートし、PCRを利用することによってマイコプラズマ汚染を定期的に検査してマイコプラズマが存在しないことを確認した。
臨床検体。2017年~2018年のインフルエンザの季節に横浜市(日本国)内のクリニックで受診したインフルエンザ様症状がある患者から呼吸器検体を取得し、ウイルスを単離するため横浜市衛生研究所に提出した。これらの臨床検体は日本国の感染症発生動向調査事業の元で回収した。呼吸器検体は、2013年~2014年、2015年~2016年、2016年~2017年、および2017年~2018年の季節に東京都(日本国)内のクリニックで受診したインフルエンザ様症状がある患者からも取得し、ウイルスを単離するため東京大学医科学研究所感染・免疫部門、ウイルス分野に提出した。これらの検体は、診察した医師により、インフォームドコンセントを取得後に回収された。われわれの研究プロトコルは東京大学の医科学研究所の研究倫理審査委員会によって承認された(承認番号26-42-0822)。リアルタイムRT-PCR(下記参照)または迅速な診断キットによって陽性であったサンプルを本研究で使用した。
ウイルス。1μgのL-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン(TPCK)-トリプシン/mlを含有するMEM内のhCK細胞の中でヒトインフルエンザウイルスを増殖させた。
リアルタイムRT-PCR。Simply RNA Tissue Kit(Promega社)またはRNeasy Mini Kit(Qiagen 社)を用いることによってRNAを臨床検体から抽出した。リアルタイムPCRによる増幅と検出を、Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems社)またはStepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems社)を用いて実施した。RT-PCRは、QuantiTect multiplex RT-PCRキット(Qiagen社)またはQuantiTect Probe RT-PCRキット(Qiagen社)を用いて実施した。プローブは、5'末端に6-カルボキシフルオレセイン(FAM)レポータ染料またはヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(HEX)レポータ染料を、3'末端にBlack Hole Quencher-1(BHQ-1)クエンチャ染料または6-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)クエンチャ染料を持つオリゴヌクレオチドを含有していた。使用したプライマーとプローブのリストは表5に示されている。
ウイルス単離。12ウエルのプレートの中で増殖させたNDCK細胞、AX4細胞、およびhCK細胞に、ウエル1つ当たり0.2 mlの臨床サンプルを接種し、34℃で少なくとも30分間インキュベートした。その後、2.5μg/mlのアセチル化トリプシンを含有する1マイクロリットルのMEMを細胞に添加した。次に、CPEが明らかになるまで培養物を7日間までインキュベートした。細胞培養物の上清を回収し、モルモットの赤血球細胞を用いて血球凝集アッセイを実施した(下記参照)。
血球凝集アッセイ。微量滴定プレートの中で50μlのPBSを用いてウイルス(50μl)を段階希釈した。同体積(すなわち50μl)の0.75%(vol/vol) モルモット赤血球細胞懸濁液を各ウエルに添加した。プレートを4℃に維持して90分インキュベートした後に血球凝集を調べた。
ウイルス遺伝子のRT-PCRとシークエンシング。QIAamp Viral RNA Miniキット(Qiagen社)を用いて140μlの培養物上清からウイルスRNAを抽出した。SuperScript III One-step RT-PCR Systemを、Platinum Taq High Fidelity DNA Polymerase(Invitrogen社)と、HA遺伝子またはNA遺伝子の特異的プライマーとともに用いてサンプルを増幅した。次いでトリスバッファ中の1.5%アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を分析し、標的バンドをGelRed(Biotium社)で染色することによって可視化した。PCR産物を精製し、直接シークエンシングした。シークエンシングクロマトグラム上の各位置における波の高さに基づいて変異頻度のレベルを調べた。小さな集団の検出限界は10%~20%であった。使用したプライマーのリストは表5に示されている。
ヒトインフルエンザウイルスの連続継代。ウイルスの10倍段階希釈液(101から106)をMEMの中で調製した。各希釈液を24ウエルの培養プレート内のMDCK細胞、AX4細胞、およびhCK細胞の単層の中に、希釈液ごとに1つのウエルを用いて接種した。プレートを33℃で3日間インキュベートした。エンドポイントは、CPEを示すサンプルの最高希釈倍数とした。培養物の上清を、エンドポイント希釈倍数よりも希釈倍数が10倍大きい濃度で接種したウエルから回収し、次のラウンドの感染で使用した。各細胞の上清の中で初代継代と6代継代の後にサンプリングされたウイルスで配列分析を実施した。
統計分析。データは平均値±SDとして表示されている。増殖曲線のデータを分析するため、われわれは線形混合効果分析を実施した。固定された効果として、異なる細胞系と、測定の時点(と、これらの固定された効果の間の相互作用期間)を使用した。ランダムな効果として、個々の動物に関するインターセプトを使用した。ウイルス力価の値をlog 10スケールに変換し、群を比較するためR統計パッケージ(www.r-project.org)、lme4(Bates他、2015年)、およびlsmeansパッケージ(Lenth、2016年)を使用した。p値はHolmの方法を利用して調整し、0.05未満である場合に有意であると見なした。
顕著に低レベルのα2,3-結合シアル酸と高レベルのα2,6-結合シアル酸を発現するMDCK細胞の生成
ヒト上気道上皮細胞の表面におけるシアル酸(Sia)分子の発現パターンを模倣するため、クラスター化されて規則的な間隔で配置された短い回文反復(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質9(Cas9)遺伝子編集システム(Cong他、2013年;Jinek他、2012年;Han他、2018年;Shalem他、2014年)を利用することによってβ-ガラクトシドα2,3シアリルトランスフェラーゼ(ST3Gal)遺伝子(その産物は、α2,3結合を有するSiaを末端ガラクトース(Gal)残基に転移する触媒となる)をノックアウトすることを最初に試みた。イヌは7つの異なるST3Galタンパク質(ST3Gal-I、-II、-III、-IV、-V、-VI、およびST3Gal-II様タンパク質を持ち、そのそれぞれは別々の遺伝子によってコードされている。ST3Gal-I、-II、-III、-IV、および-VIは、糖タンパク質の表面、または糖タンパク質と糖脂質の表面のオリゴ糖をアクセプタ物質として利用するのに対し、ST3Gal-Vは、糖脂質だけの表面のオリゴ糖を利用する(TakashimaとTsuji、2011年)。以前の1つの研究が、宿主細胞の中へのインフルエンザウイルスの生産的な侵入にN結合型糖タンパク質が必要とされることを報告した(ChuとWhittaker、2004年)。したがってα2,3結合Siaが糖タンパク質に転移するのを抑制するため、MDCK細胞に6つのプラスミドの混合物をトランスフェクトした(それぞれのプラスミドは、Cas9遺伝子発現カセットと、ST3Gal-I、-II、-III、-IV、-VI、またはST3Gal-II様タンパク質遺伝子を標的とする個々のガイドRNA(gRNA)のための発現カセットを含有している)(図2)。トランスフェクションの後、ピューロマイシンを細胞に添加し、33個の薬剤耐性クローンをランダムに採取した。ゲノムDNA分析から、1つのクローン(6-11)だけが、6つのST3Gal遺伝子に関するgRNA標的領域に変異を含有することが明らかになった(データは示さない)。α2,3結合Siaに対して特異的なイヌエンジュ IIアグルチニン(MAL II)レクチンとα2,6結合Siaに対して特異的なセイヨウニワトコのアグルチニン(SNA)レクチンを用いて細胞表面Siaをフローサイトメトリーによって測定した。予想に反し、MAL IIとの反応性は、親MDCK細胞とクローン6-11の間で非常によく似ており、これは、そのクローンが高レベルのα2,3結合Siaを相変わらず発現したことを示している(図3)。これは、ST3Gal-Vの補償活性に起因していた。
α2,3結合Siasの転移をより効率的に抑制するとともに細胞表面のα2,6結合Siaを高レベルで発現させるため、クローン6-11に、ヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリルトランスフェラーゼ(ST6Gal-I)(α2,6結合SiaをGal含有グリカンに付加する触媒となる)をコードするプラスミドと、Cas9のための発現カセットとST3Gal-Vを標的とするgRNAを含有するプラスミドを同時にトランスフェクトした。18個の細胞クローンをブラスチシジンで選択し、ゲノムDNAを分析した。薬剤耐性クローンのうちで9個がST3Gal-V遺伝子に関するgRNA標的領域に変異を持っていた(データは示さない)。MAL IIとSNAレクチンを用いたフローサイトメトリー分析から、9つのクローンのうちの2つ(クローン6-11#2と6-11#10)で、α2,3結合Siaの発現が親MDCK細胞と比べて顕著に減少し、α2,6結合Siaの発現レベルが親細胞の発現レベルよりも高いことが明らかになった(Sy図4a;クローン6-11#2と6-11#10だけのデータが示されている)。末端Siaは、糖タンパク質または糖脂質の表面にあるいくつかのタイプのオリゴ糖構造(Galβ1,4GlcNAc(GlcNAc;N-アセチルグルコサミン)、Galβ1,3GalNAc(GalNAc;N-アセチルガラクトサミン)、およびGalβ1,4Glc(Glc;グルコース)など)に付着する(TakashimaとTsuji、2011年)。MAL IIレクチンはSiaα2,3Galβ1,3GalNAcを選択的に認識する(Hidari他、2013年)。上記の2つのクローンが細胞表面に異なるタイプのα2,3結合オリゴ糖構造を発現するかどうかを評価するため、Siaα2,3Galβ1,4GlcNAc7に対するモノクローナル抗体を用いて間接的免疫蛍光アッセイ(IFA)分析を実施した。IFAは、これら2つのクローンの1つ(6-11#10)でSiaα2,3Galβ1,4GlcNAcのレベルが検出不能であるか顕著に低いことを示した(図4b)。これは、6-11#10では末端α2,3結合Siaを含む多くのタイプのオリゴ糖が親細胞におけるよりも低いレベルで発現していることを示唆している。次に、SNAとニワトコ(SSA)レクチン(両方ともSiaα2,6Gal構造またはSiaα2,6GalNAc構造を認識する(Shibuya他、1989年))を用いてAX4細胞とクローン6-11#10の表面のα2,6結合Siaの細胞表面発現レベルを比較した。フローサイトメトリー分析は、AX4細胞とクローン6-11#10の間でα2,6結合Siaの発現レベルに差がないことを示した(図4c)。しかしMAL IIレクチンを用いて測定したα2,3結合Siaの発現レベルは、クローン6-11#10においてAX4細胞と比べて顕著に低かった(図4d)。クローン6-11#10は、7つのST3Gal遺伝子に関するgRNA標的領域の中に望む変異を含有することが確認された(表1)。これらの結果は、クローン6-11#10が主にヒトウイルス受容体を発現しているとともに、限定された量の鳥類ウイルス受容体を発現していることを示している。得られたクローン6-11#10をhCKと表記し、その後増殖させてさらに分析した。
Figure 2022522112000001
a臨床検体から単離されたインフルエンザウイルスをMDCK細胞、AX4細胞、またはhCK細胞の中で10代継代させた。ウイルスのHA遺伝子とNA遺伝子の配列を単一回の継代(P1)、6代継代(P6)、および10代継代(P10)の後に求めた。bA型インフルエンザウイルスの変異をH3ナンバリングとともに示してある。cすべての変異をN2ナンバリングとともに示してある。d-、原初の臨床検体からの配列と比べて変異が検出されなかった。eT/I、167位のトレオニンとイソロイシンの混合。fN/S、296位のアスパラギンとセリンの混合物。gN/S、446位のアスパラギンとセリンの混合。hH/Y、411c位のヒスチジンとチロシンの混合。iC/Y、53位のシステインとチロシンの混合。jMDCK細胞内の臨床検体からはインフルエンザウイルスが単離されなかった。kN/K、158位のアスパラギンとリシンの混合。lD/N、408位のアスパラギン酸とアスパラギンの混合。mS/N、148位のセリンとアスパラギンの混合。nD/N、459位のアスパラギン酸とアスパラギンの混合。oG/R、208位のグリシンとアルギニンの混合。pN/S、196位のアスパラギンとセリンの混合。qL/F、72位のロイシンとフェニルアラニンの混合。
ST3Gal遺伝子の中に変異を持ち、ST6Gal-I遺伝子とHAT遺伝子を発現する安定な細胞系の確立。Michael Boutros研究室(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)からのsgRNA Design Toolを用い、それぞれがST3Gal-I、-II、-III、-IV、V、-VI、およびST3Gal-II様タンパク質遺伝子座を標的とするgRNA配列を設計した。gRNAのためのオリゴDNAを、ピューロマイシン耐性をコードするCas9/gRNA二重発現ベクターpSpCas9(BB)-2APuro(PX459)(addgene)に入れてクローニングした。得られたコンストラクトをPX459-ST3Gal-I、PX459-ST3Gal-II、PX459-ST3Gal-III、PX459-ST3Gal-IV、PX459-ST3Gal-V、PX459-ST3Gal-VI、およびPX459-ST3Gal-II様と名づけた。これらは、ST3Gal-I、-II、-III、-IV、V、-VI、およびST3Gal-II様タンパク質遺伝子をそれぞれ標的とするgRNAを発現する。ヒトST6Gal-I遺伝子をpCAGGS-FLAG-PUR-ST6Gal-Iプラスミド(Hatakeyama他、2005年)からPCRによって増幅した後、NotIとXhoIを用いて消化させた。消化された断片を、ブラスチシジン耐性をコードする真核生物発現ベクターpCAG-Bsd(Wako社)のNotI部位とXhoI部位の間にクローニングした。得られたコンストラクトをpCAG-Bsd-ST6Gal-Iと名づけた。これはST3Gal-Iを発現する。すべてのコンストラクトの配列をサンガーシークエンシングによって確認した。BigDye Terminatorバージョン3.1 Cycle Sequencing Kits(Thermo Fisher Scientific社)を用いてサイクルシークエンシングを実施し、配列をABI Prism 3130xl Genetic Analyzer(Thermo Fisher Scientific社)で分析した。
AMAXA Nucleofector II機械(Lonza社)を製造者の指示に従って用いて電気穿孔を実施した。簡単に述べると、5×105個のMDCK細胞を100μlの望む電気穿孔バッファに懸濁させ、5μgのCas9/gRNA二重発現ベクター(1μgのPX459-ST3Gal-I、1μgのPX459-ST3Gal-II、1μgのPX459-ST3Gal-III、1μgのPX459-ST3Gal-IV、1μgのPX459-ST3Gal-VI、および1μgのPX459-ST3Gal-II様)または1.7μgのPX459-ST3Gal-V、および1.7μgのpCAG-Bsd-ST6Gal-Iと混合した。再懸濁された細胞をキュベットに移し、プログラムA-024を利用してただちに電気穿孔した。細胞を、5%NCSを補足したMEM の中で2μg/mlのピューロマイシンまたは10μg/mlのブラスチシジンの存在下にて培養し、トランスフェクトされた細胞を選択した。クローニングリングを用いてクローンを単離し、トリプシンとEDTAを用いて解離させ、増殖させた。ゲノム単離キット(Promega社)を製造者の指示に従って用いてゲノムDNAを単離した。各標的部位を取り囲むプライマーを用いて標的領域をPCRによって増幅し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen社)を用いて増幅産物をクローニングした。各遺伝子について少なくとも8つのクローンをランダムに選択し、単離されたプラスミドをシークエンシングした。使用したプライマーのリストは表5に示されている。
フローサイトメトリー分析。0.125%トリプシン-20 mM EDTA(Dojindo社)を含有するPBSの中で10分間インキュベートすることによって細胞を剥離させた。PBSで洗浄した後、細胞を4℃にてCarbo-Free Blocking Solution(Vector社)で15分間ブロックした。細胞をビオチニル化されたMAL II、SNA、またはSSAとともに4℃で30分間インキュベートした。次いで細胞をPBSでリンスした後、Alexa 488で標識したストレプトアビジン(Invitrogen社)とともに4℃で30分間インキュベートした(Invitrogen社)。蛍光をFACS CaliburまたはFACS Verse(Becton Dickinson社)を用いて測定し、FlowJoソフトウエア(Becton Dickinson社)を用いて分析した。
シアル酸特異的なレクチンの結合を確認するため、細胞を処理した後、レクチンおよびウェルシュ菌(Roche社)とともに37℃で1時間インキュベートした。細胞に結合したレクチンを上記のようにして検出した。
免疫蛍光染色。24ウエルのプレートの中で増殖させた細胞を、Siaα2,3Galβ1,4GlcNAc(HYB4:Wako社)を認識するマウスモノクローナル抗体とともに4℃でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を10%トリクロロ酢酸で-20℃にて10分間固定した。次いで細胞をPBSで洗浄し、Alexa 488で標識したヤギ抗マウス免疫グロブリンG(IgG)(Invitrogen社)とともに30分間インキュベートした。Hoechst 33342三塩酸塩三水和物(Molecular Probes社)で細胞核を対比染色した。Zeiss蛍光顕微鏡(モデルImager Z1;Carl Zeiss社)を用いてサンプルを調べた。
Figure 2022522112000002
a各遺伝子のPCR産物を平滑末端ベクターに入れてクローニングし、シークエンシング分析を実施した。
Figure 2022522112000003
sgRNAの配列は太字で示されている。下線を引いた配列はPAM配列を示す。赤字で示されている配列は、MDCK細胞(野生型)と比べたhCK細胞の中の挿入または欠失を示す。
1この配列は PX459ベクターの一部の配列と一致していた。
Figure 2022522112000004
aリアルタイムRT-PCRまたは迅速診断キットによってインフルエンザウイルス陽性であることが示された臨床検体をウイルス単離に使用した。b臨床検体をMDCK細胞、AX4細胞、およびhCK細胞に接種した。細胞で細胞変性効果(CPE)を7日間観察した。接種してから7日後、迅速診断キットと、モルモット赤血球細胞を用いた血球凝集アッセイを利用することにより、CPE陰性細胞培養サンプルからの上清を検査した。
Figure 2022522112000005

Figure 2022522112000006

Figure 2022522112000007
a MDCK細胞、AX4細胞、またはhCK細胞の中の臨床検体から単離されたインフルエンザウイルス。ウイルスのHA遺伝子とNA遺伝子の配列を接種後にMDCK細胞、AX4細胞、またはhCK細胞の中で求めた。b-、原初の臨床検体からの配列と比べて変異が検出されなかった。cD/G、151位のアスパラギン酸とグリシンの混合。dK/R、394位のリシンとアルギニンの混合。eD/N、151位のアスパラギン酸とアスパラギンの混合。fS/P、221位のセリンとプロリンの混合。gD/N、246位のアスパラギン酸とアスパラギンの混合。hK/I、160位のリシンとイソロイシンの混合。iK/T、160位のリシンとトレオニンの混合。jK/T、148位のリシンとトレオニンの混合。kMDCK細胞内とAX4細胞内の臨床検体からはインフルエンザウイルスが単離されなかった。lMDCK細胞内の臨床検体からはインフルエンザウイルスが単離されなかった。mT/I、148位のトレオニンとイソロイシンの混合。nE/K、433位のグルタミン酸とリシンの混合。oS/P、44位のセリンとプロリンの混合。
Figure 2022522112000008
aリアルタイムRT-PCRまたは迅速診断キットによってインフルエンザウイルス陽性であることが示された臨床検体をウイルス単離に使用した。b臨床サンプルの段階2倍希釈液(21から220)を用意し、AX4細胞とhCK細胞に接種した。細胞でCPEの展開を7日間観察した。同じ希釈倍数のウイルスを感染させるため3つのウエルを使用し、3つのウエルすべての中でCPEを示す最大希釈倍数を示してある。
Figure 2022522112000009
Figure 2022522112000010
aFAM、6-カルボキシフルオレセイン;HEX、ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセイン;BHQ-1、ブラックホールクエンチャ;MGB、副溝バインダ;TAMRA、6-カルボキシテトラメチルローダミン。
結果
ヒト上気道上皮細胞のシアル酸発現パターンを模倣するため、α2,6-シアログリカンを過剰発現するとともに極端に低レベルのα2,3-シアログリカンを発現する新たなMDCK細胞系(hCKと名づける)を調製した(図2~図4と表Aを参照されたい)。
hCK細胞がヒトインフルエンザウイルスの効率的な複製をサポートできるかどうかを明らかにするため、ウイルスの増殖動態[3個のA/H1N1 2009パンデミック(A/H1N1pdm)、3個のA/H3N2、3個のB/山形系統、および3個のBヴィクトリア系統]をhCK細胞で調べた。3つのA/H1N1pdm単離体は、MDCK細胞、AX4細胞、およびhCK細胞の中で効率的に増殖し、力価の実質的な差は観察されなかった(図1A)。6つのインフルエンザB単離体も3つの細胞系すべてにおいて似た効率で複製された。それとは対照的に、A/H3N2ウイルスに関しては、3つの単離体すべてがhCK細胞の中ではAX4細胞の中よりもはるかに速く、かつより大きな力価で増殖した(感染後48時間の時点で2.03~2.91 log単位大きい)。別のところに報告されているように(Chambers他、2014年)、MDCK細胞では、これらの最近のA/H3N2単離体は複製がうまくなされない。これらの知見は、非常に低レベルのα2,3-シアログリカンと高レベルのα2,6-シアログリカンを発現するhCK細胞が、MDCK細胞またはAX4細胞よりも最近のA/H3N2ウイルスの複製をより効率的にサポートすることを実証している。
ヒトインフルエンザウイルスの単離体に対するhCK細胞の感受性を評価するため、90個の呼吸器検体のアリコート(30個のA/H1N1pdm、30個のA/H3N2、および30個のB山形系統)をMDCK細胞、AX4細胞、およびhCK細胞に接種した。細胞で細胞変性効果(CPE)の展開を7日間観察した。MDCK細胞、AX4細胞、およびhCK細胞について、A/H1N1pdmウイルスが、RT-PCR陽性サンプルから盲継代の必要なしにうまく回収された(100%の単離効率)(表2)。同様に、これら3つの細胞系は、B型インフルエンザウイルスの単離に関して100%の効率を示した。A/H3N2陽性サンプルについては、MDCK細胞とAX4細胞からそれぞれ5つのウイルスと2つのウイルスが回収されなかった。これらの結果は、従来のMDCK細胞が最近のA/H3N2ウイルスの検出に対して比較的低い感度を持つという以前の報告(Oh他、2008年;Hatakeyama他、2005年)と一致している。
インフルエンザウイルスによる赤血球細胞の凝集は、細胞の表面のシアル酸にウイルスが結合することが原因であると考えられている。2005年以来、A/H3N2単離体は七面鳥の赤血球を凝集させる能力を失っている(Lin他、2013年)。それに加え、現在のA/H3N2単離体は、モルモットの赤血球の凝集が減少を示すか、凝集を示さない(Lin他、Influenza Other Respir Viruses、2017年)。これは、シアル酸受容体に対するこれら単離体のアビディティが変化したことを示している。実際、Linら(2013年)は、α2,6-結合シアル酸受容体に対する最近のA/H3N2ウイルスのアビディティを測定し、それが劇的に低下していることを示した。グリカンアレイ分析から、最近のA/H3N2単離体は、延長されたポリ-Nアセチルラクトサミン鎖を持つ分岐したシアリル化N結合グリカンへの結合のほうを好むことが明らかになった(Peng他、Cell Host Microbe、2017年)
それとは対照的に、hCK細胞からのウイルス単離は、その後のいかなる盲継代もなしにすべてのサンプルで成功した。これは、この細胞系が、臨床検体からのヒトA/H3N2ウイルスの単離に関してAX4細胞またはMDCK細胞よりも効果的であることを示唆している。
最近のA/H3N2ヒト単離体がMDCK細胞の中で複製されている間に、ウイルスはNAタンパク質の148位と151位におけるアミノ酸変化を迅速に獲得し(例えばT148IとD151G)、それがNAの生物学的特性に影響を与える。3つの細胞系から単離されたA/H3N2ウイルスがそのHAタンパク質とNAタンパク質の中に変異を持つかどうかを調べるため、HAセグメントとNAセグメントのヌクレオチド配列をサンガーシークエンシングによって明らかにした(表3)。配列分析から、25個のMDCK増殖単離体のうちの7つが、原初の検体からの配列と比べてNAの151位にアミノ酸変化を含有していることが明らかになった:NA-151N、NA-151D/G、およびNA-151D/N(151位にあるアミノ酸の混合集団)。HAの158位にあるグリコシル化部位の喪失につながるアミノ酸変化が、いくつかの他のMDCK増殖単離体のウイルス集団の中に見いだされた:HA-158K、HA-160K、HA-160K/I、およびHA-160K/T。これらの変化は、HAの抗原特性を変化させることが知られている(Lin他、2017年;Chambers他、2015年;Skowronski他、2016年)。重要なことだが、細胞培養物適応変異は、AX4細胞の中で増殖させたいくつかの単離体のNAタンパク質の中にも見いだされた:NA-148K/T、NA-148T/I、NA-151D/N、およびNA-151D/G 。驚くべきことに、hCK増殖単離体には変異が検出されなかったが、NAストークの中にS44P変異を持つ1つの単離体だけは例外である。これらの知見は、hCK細胞が、細胞培養物適応変異を伴わずにA/H3N2ウイルスの効率的な増殖をサポートすることを示唆している。
臨床検体からの季節性インフルエンザウイルスは、AX4細胞の中ではNDCK細胞におけるよりもよく増殖する(Hatakeyama他、2005年)。hCK細胞がウイルス単離に関してAX4細胞よりも優れているかどうかを判断するため、検体の段階2倍希釈液をテストすることによってhCK細胞とAX4細胞の感度を比較した。24個の検体のアリコート(6個のA/H1N1pdm、6個のA/H3N2、6個のB/山形系統、および6個のB/ヴィクトリア系統)をAX4細胞とhCK細胞にトリプルケートで接種した。すべての培養ウエルで接種の7日後にCPEを調べ、AX4細胞の中で観察された、CPEを示す最大希釈倍数に対するhCK細胞における最大希釈倍数の比を求めた。6つのA/H1N1陽性サンプルのうちの1つ(サンプルID、HP79)では、hCK細胞はAX4細胞よりもわずかに感度が小さかった(図1Bと表4)。しかし残りのサンプルでは、hCK細胞の感度は、AX4細胞の感度と同様であるか、より大きかった。B/山形系統陽性サンプルとB/ヴィクトリア系統陽性サンプルでは、hCK細胞は、AX4細胞と同じか、いくらかより大きな感度を示した。A/H3N2陽性サンプルのすべてでhCK細胞はAX4細胞よりも大きな感度を示し、いくつかのサンプルでは、hCK細胞はAX4細胞よりも約100倍~2,000倍大きな感度を示した。合わせて考えると、これらの結果は、最近の季節性A/H3N2ウイルスの一次単離に関してhCK細胞がAX4細胞またはMDCK細胞よりも適していることを示している。
hCK細胞の中で単離されたウイルスのHA遺伝子とNA遺伝子の遺伝子安定性を評価するため、12個の臨床検体のアリコート(3個のA/H1N1pdm、3個のA/H3N2、および3個のB山形系統、および3個のBヴィクトリア系統)をMDCK細胞、AX4細胞、およびhCK細胞に接種し、単離体を連続的に10継代した。初代、4代、および10代の継代の後、ウイルスのHA配列とNA配列をサンガーシークエンシングによって求め、その配列を臨床検体の中の配列と比較した。A/H1N1pdm陽性検体では、初代継代の後、HAの296位のNまたはSをコードしている混合ウイルス集団が3つのhCK増殖ウイルスの1つ(BB139)で検出された(表1)。hCK増殖ウイルスは、そのNAの中にS153G置換変異も持っていた。別のhCK増殖ウイルス(HP79)は、10代継代の後にそのHAの中にD27N置換をコードしていた。HAの167位にTまたはIをコードする混合集団が、10代継代の後に1つのMDCK増殖ウイルスの中に見いだされた(BB139)。別のMDCK増殖ウイルス(BB131)は、10代継代の時点でHA-446NとHA-446Sをコードする混合集団を持っていた。このMDCK増殖ウイルスは、NAの411c位にHまたはYをコードする混合集団も含有していた。NA内のC53Y/Cの混合が、10代継代の後に1つのAX4増殖ウイルスの中で観察された(BB131)。
A/H3N2陽性サンプルについて、AX4とhCKから回収されたがMDCKからは回収されなかったウイルスを連続的に継代した。6代継代の後、(HAの158位にあるグリコシル化部位の喪失につながる)HA-158NとHA-158Kをコードしている混合集団が3つのAX4増殖ウイルスの1つで検出された(DA30)。それに加え、別のAX4増殖ウイルス(DA29-1)が、6代継代の後にそのNAの中にT148K置換をコードしていた。HA-408DとHA-408Nをコードする混合集団が、10代継代の後に1つのhCK増殖ウイルスで検出された(DA29-1)。
B/山形系統ウイルスでは、初代、6代、または10代の継代の後にどの単離体でも変化は検出されなかったが、6代継代の時点で1つのhCK増殖ウイルス(HP70-2)において検出されたHA-148SとHA-148Nをコードする混合集団は例外である。Bヴィクトリア系統ウイルスでは、NA-208GとNA-208Rをコードする混合集団が、初代継代の後に、3つのAX4増殖ウイルスのうちの1つ(BB139)で見いだされた。6代継代の後、1つのhCK増殖ウイルスが、そのNAの中にL72L/Fの混合をコードしていた(WD28)。10代継代の時点では、1つのMDCK増殖ウイルス(WD28)が、HA の196位におけるグリコシル化部位の喪失につながることが知られているN196S変異を含有していた(B/ヴィクトリア系統)。これは、B型インフルエンザウイルスの抗原性を顕著に変えることができる。別のMDCK増殖ウイルス(HP015)が、そのNAの中にD459D/Nの混合を持っていた。
総合すると、A/H1N1pdmウイルスとB型ウイルスは、MDCK細胞またはhCK細胞の中で継代したとき、AX4細胞におけるよりもわずかに変異しやすかった。それとは対照的に、hCK細胞の中で増殖したA/H3N2ウイルスは、AX4細胞の中のものより大きな遺伝子安定性で維持された。
結論として、MDCK細胞であるhCKに由来する細胞系は、インフルエンザウイルスの研究(特にヒトA/H3N2インフルエンザウイルスが関係する研究)とワクチン製造にとって有用になる大量のα2,6-シアログリカンと少量のα2,3-シアログリカンを発現する。
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あらゆる刊行物、特許、特許出願は、参照によって本明細書に組み込まれている。本明細書ではここまで本発明をそのいくつかの好ましい実施態様に関して記載し、説明を目的として多くの詳細を示してきたが、当業者には、本発明の基本原理から逸脱することなく、本発明には追加の実施態様が可能であることと、本明細書に記載した詳細のいくつかを大きく変更できることが明らかであろう。

Claims (33)

  1. 哺乳類または鳥類の対応する非組み換え細胞と比べて減少した量の細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基と増加した量のヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリル残基を含む哺乳類または鳥類の単離された組み換え細胞。
  2. 非ヒト細胞である、請求項1の単離された組み換え細胞。
  3. イヌ細胞または霊長類細胞である、請求項1または2の単離された組み換え細胞。
  4. ヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリルトランスフェラーゼI(ST6Gal-I)またはST6Gal-IIをコードする発現カセットを含む、請求項1~3のいずれか1項の単離された組み換え細胞。
  5. 前記ST6Gal-IまたはST6Gal-IIが、配列番号1~4または101のいずれか1つとアミノ酸配列が少なくとも80%一致するタンパク質を含む、請求項4の単離された組み換え細胞。
  6. 1つ以上のβ-ガラクトシドα2,3シアリルトランスフェラーゼ遺伝子が変異して細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基の量が減少している、請求項1~5のいずれか1項の単離された組み換え細胞。
  7. ST3Gal-I遺伝子、ST3Gal-II遺伝子、ST3Gal-III遺伝子、ST3Gal-IV遺伝子、ST3Gal-V遺伝子、ST3Gal-VI遺伝子、またはST3Gal-II様遺伝子の2つ以上が変異している、請求項6の単離された組み換え細胞。
  8. 前記ST3遺伝子が、配列番号5、7、9、11、13、15、または17のいずれか1つと少なくとも80%一致する核酸配列を持つ、請求項7の単離された組み換え細胞。
  9. 細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基の前記減少が、1つ以上のST3シアリルトランスフェラーゼの発現が減少した結果である、請求項1~8のいずれか1項の単離された組み換え細胞。
  10. 前記1つ以上のST3シアリルトランスフェラーゼが、配列番号6、8、10、12、14、16、または18のいずれか1つと少なくとも80%一致するアミノ酸配列を持つ、請求項9の単離された組み換え細胞。
  11. インフルエンザH3ウイルスが、前記組み換え細胞の中で前記非組み換え細胞と比べてより効率的に複製される、請求項1~10のいずれか1項の単離された組み換え細胞。
  12. 哺乳類または鳥類の対応する非組み換え細胞と比べて減少した量の細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基を含む、哺乳類または鳥類の単離された組み換え細胞。
  13. ST3Gal-I遺伝子、ST3Gal-II遺伝子、ST3Gal-III遺伝子、ST3Gal-IV遺伝子、ST3Gal-V遺伝子、ST3Gal-VI遺伝子、またはST3Gal-II様遺伝子の1つ以上が変異している、請求項12の組み換え細胞。
  14. ST3Gal-I遺伝子、ST3Gal-II遺伝子、ST3Gal-III遺伝子、ST3Gal-IV遺伝子、ST3Gal-V遺伝子、ST3Gal-VI遺伝子、またはST3Gal-II様遺伝子の組み合わせが変異している、請求項12の組み換え細胞。
  15. ST3Gal-I遺伝子、ST3Gal-II遺伝子、ST3Gal-III遺伝子、ST3Gal-IV遺伝子、ST3Gal-V遺伝子、ST3Gal-VI遺伝子、およびST3Gal-II様遺伝子が変異している、請求項14の組み換え細胞。
  16. 哺乳類細胞上または鳥類細胞上の細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基とヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリル残基の量を変化させる方法であって、
    親哺乳類細胞または親鳥類細胞の中で1つ以上のβ-ガラクトシドα2,3シアリルトランスフェラーゼ(ST3Gal)遺伝子を変異させるとともにヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリルトランスフェラーゼI(ST6Gal)遺伝子を過剰発現させて、対応する親細胞と比べて減少した量の細胞表面β-ガラクトシドα2,3シアリル残基と増加した量のヒトβ-ガラクトシドα2,6シアリル残基を表面に持つ改変された哺乳類細胞または鳥類細胞にすることを含む方法。
  17. ゲノム編集システムを利用して1つ以上のST3Gal遺伝子を変異させる、請求項16の方法。
  18. 前記ゲノム編集システムが、CRISPR/Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、または転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ(TALEN)を含む、請求項17の方法。
  19. 前記変異が、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失、またはその両方を1つ以上のST3遺伝子の中に含む、請求項16~18のいずれか1項の方法。
  20. 前記改変された細胞が、ST6Galオープンリーディングフレームを含む発現カセットを含む、請求項16~19のいずれか1項の方法。
  21. 前記改変された細胞が腎細胞である、請求項16~20のいずれか1項の方法。
  22. 前記改変された細胞がイヌ細胞である、請求項16~21のいずれか1項の方法。
  23. 前記改変された細胞がMadin-Darbyイヌ腎(MDCK)細胞である、請求項16~22のいずれか1項の方法。
  24. インフルエンザウイルスを増殖させる方法であって、
    請求項1~11のいずれか1項の組み換え細胞にインフルエンザウイルスを感染させ;
    子孫ウイルスを回収することを含む方法。
  25. 前記インフルエンザウイルスがヒトインフルエンザウイルスである、請求項24の方法。
  26. 前記インフルエンザウイルスがA型インフルエンザウイルスである、請求項24または25の方法。
  27. 前記インフルエンザウイルスがB型インフルエンザウイルスである、請求項24または25の方法。
  28. 前記インフルエンザウイルスがH3ウイルスである、請求項24、25、または26の方法。
  29. 前記ウイルスが、A/H1N1、A/H3N2、B/山形系統B型インフルエンザウイルス、またはB/ヴィクトリア系統B型インフルエンザウイルスである、請求項24、25、または26の方法。
  30. インフルエンザウイルスを単離する方法であって、
    インフルエンザウイルスに感染していることが疑われる鳥類または哺乳類からのサンプルを用意し;
    請求項1~11のいずれか1項の組み換え細胞に前記サンプルを接触させることを含む方法。
  31. 前記サンプルにインフルエンザウイルスが感染しているかどうかを判断することをさらに含む、請求項30の方法。
  32. 前記ウイルスのHA亜型および/またはNA亜型を同定することをさらに含む、請求項30または31の方法。
  33. インフルエンザウイルス感染を診断する方法であって、
    請求項1~11のいずれか1項の組み換え細胞に、インフルエンザウイルスに感染していることが疑われる鳥類または哺乳類からのサンプルを感染させ;
    その細胞がウイルスに感染しているかどうかを判断することを含む方法。
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