KR20210139265A - 표적 서열에서 핵염기를 변형하기 위한 아데노신 데아미나제 염기 편집기 및 이의 사용 방법 - Google Patents

표적 서열에서 핵염기를 변형하기 위한 아데노신 데아미나제 염기 편집기 및 이의 사용 방법 Download PDF

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이안 슬레이메이커
이 유
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제이슨 마이클 게르케
나탈리 페트로시안
엔젤리카 메사나
이본 아라틴
프랑신 그레고아르
제네시스 룽
샤우나 베르코비치
데이비드 에이. 본
승주 이
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Abstract

본원 개시내용은 증가된 효율을 갖는 신규한 아데노신 염기 편집기 (예를 들어, ABE8)를 포함하는 조성물 및 표적 서열을 편집하기 위해 이들 아데노신 데아미나제 변이체를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

표적 서열에서 핵염기를 변형하기 위한 아데노신 데아미나제 염기 편집기 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 PCT 국제 특허 출원으로서 2019년 2월 13일에 출원된 미국 가출원 제62/805,271호; 2019년 2월 13일에 출원된 미국 가출원 제62/805,238호; 2019년 2월 13일에 출원된 미국 가출원 제62/805,277호; 2019년 5월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/852,228호; 2019년 5월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/852,224호; 2019년 7월 11일에 출원된 미국 가출원 제62/873,138호; 2019년 7월 11일에 출원된 미국 가출원 제62/873,140호; 2019년 7월 11일에 출원된 미국 가출원 제62/873,144호; 2019년 7월 19일에 출원된 미국 가출원 제62/876,354호; 2019년 8월 19일에 출원된 미국 가출원 제62/888,867호; 2019년 10월 9일에 출원된 미국 가출원 제62/912,992호; 2019년 11월 6일에 출원된 미국 가출원 제62/931,722호; 2019년 11월 6일에 출원된 미국 가출원 제62/931,747호; 2019년 11월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/941,523호; 2019년 11월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/941,569호; 및 2020년 1월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/966,526호에 대한 우선권의 이득을 주장하고, 이의 모든 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
참조 인용
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다. 달리 어떠한 표시도 하지 않는다면, 본 명세서에 언급된 공보, 특허 및 특허 출원은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
핵산 서열의 표적화된 편집, 예를 들어, 표적화된 절단 또는 게놈 DNA의 표적화된 변형은 유전자 기능 연구를 위한 매우 유망한 접근법이며 또한 인간 유전성 질환에 대한 신규한 치료요법을 제공할 가능성이 있다. 현재 이용 가능한 염기 편집기는 표적 CㆍG 염기쌍을 TㆍA로 전환시키는 시티딘 염기 편집기 (예를 들어, BE4) 및 AㆍT를 GㆍC로 전환시키는 아데닌 염기 편집기 (예를 들어, ABE7.10)를 포함한다. 더 큰 특이성과 효율로 표적 서열 내에서 변형을 유도할 수 있는 개선된 염기 편집기가 당업계에 필요하다.
본 발명은 증가된 효율을 갖는 신규한 아데닌 염기 편집기 (예를 들어, ABE8)를 포함하는 조성물 및 표적 서열을 편집하기 위해 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 염기 편집기를 사용하는 방법을 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인 및MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD의 아미노산 위치 82 및/또는 166에서의 변경, 또는 MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSST의 변이체에서 위치　82 및/또는 166에 상응하는 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체인 적어도 하나의 염기 편집기를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인 및MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD, 또는 이에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열의 아미노산 위치 82 및/또는 166에서의 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체인 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 임의의 하기 아데노신 데아미나제에서 MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD에 상응하는 아미노산 위치 82 및/또는 166에서의 변경, 또는 이에 대한 임의의 변이체를 포함한다:
스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (에스. 아우레우스 (S. aureus)) TadA:
Figure pct00001
바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) (비. 서브틸리스 (B. subtilis)) TadA:
Figure pct00002
살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) (에스. 티피무리움 (S. typhimurium)) TadA:
Figure pct00003
쉐와넬라 푸트레파시엔스 (Shewanella putrefaciens) (에스. 푸트레파시엔스 (S. putrefaciens)) TadA:
Figure pct00004
해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) F3031 (에이취. 인플루엔자 (H. influenzae)) TadA:
Figure pct00005
콜로박터 크레슨투스 (Caulobacter crescentus) (씨. 크레슨투스 (C. crescentus)) TadA:
Figure pct00006
게오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens) (지. 설푸레두센스 (G. sulfurreducens)) TadA:
Figure pct00007
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인은 하기 서열을 포함하고:
Figure pct00008
여기서, 상기 굵게 표시된 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고 밑줄 친 서열은 양분된 (bipartite) 핵 국소화 서열을 지칭한다.
상기 양상의 다양한 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 아미노산 위치 82 및 166에서의 변경을 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 V82S 변경을 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 T166R 변경을 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 V82S 및 T166R 변경을 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 하기의 변경 중 하나 이상을 추가로 포함한다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및 Q154R. 또 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 하기의 변경의 조합을 포함한다: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 또는 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 및 157로 이루어진 그룹으로부터 선택된 잔기에서 시작하는 C 말단의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기 도메인은 아데노신 데아미나제 변이체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 도메인은 ABE8.1-m, ABE8.2-m, ABE8.3-m, ABE8.4-m, ABE8.5-m, ABE8.6-m, ABE8.7-m, ABE8.8-m, ABE8.9-m, ABE8.10-m, ABE8.11-m, ABE8.12-m, ABE8.13-m, ABE8.14-m, ABE8.15-m, ABE8.16-m, ABE8.17-m, ABE8.18-m, ABE8.19-m, ABE8.20-m, ABE8.21-m, ABE8.22-m, ABE8.23-m, 또는 ABE8.24-m이다. 다양한 구현예에서, 염기 편집기 도메인은 야생형 아데노신 데아미나제 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 도메인은 ABE8.1-d, ABE8.2-d, ABE8.3-d, ABE8.4-d, ABE8.5-d, ABE8.6-d, ABE8.7-d, ABE8.8-d, ABE8.9-d, ABE8.10-d, ABE8.11-d, ABE8.12-d, ABE8.13-d, ABE8.14-d, ABE8.15-d, ABE8.16-d, ABE8.17-d, ABE8.18-d, ABE8.19-d, ABE8.20-d, ABE8.21-d, ABE8.22-d, ABE8.23-d, 또는 ABE8.24-d이다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 염기 편집기는 TadA7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 포함하는 이종이량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*8.1, TadA*8.2, TadA*8.3, TadA*8.4, TadA*8.5, TadA*8.6, TadA*8.7, TadA*8.8, TadA*8.9, TadA*8.10, TadA*8.11, TadA*8.12, TadA*8.13, TadA*8.14, TadA*8.15, TadA*8.16, TadA*8.17, TadA*8.18, TadA*8.19, TadA*8.20, TadA*8.21, TadA*8.22, TadA*8.23, 또는 TadA*8.24이다.
다양한 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다: MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD. 또 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 전장 아데노신 데아미나제에 상대적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20개 N-말단 아미노산 잔기가 결실된다. 또 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 전장 아데노신 데아미나제에 상대적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20개 C-말단 아미노산 잔기가 결실된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y147T + Q154R을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y147T + Q154S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y147R + Q154S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 V82S + Q154S; V82S + Y147R을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 V82S + Q154R을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 V82S + Y123H를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 I76Y + V82S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 V82S + Y123H + Y147T를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 V82S + Y123H + Y147R을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 V82S + Y123H + Q154R을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y147R + Q154R +Y123H를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y147R + Q154R + I76Y를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y147R + Q154R + T166R을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y123H + Y147R + Q154R + I76Y를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 V82S + Y123H + Y147R + Q154R을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인은 Cas9이다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열 (Cas9 참조 서열) 또는 이의 상응하는 영역을 포함한다:
Figure pct00009
(한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인; (Cas9 참조 서열).
다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) Cas9 (SaCas9), 스타필로코커스 써모필러스 1 (Streptococcus thermophilus 1) Cas9 (St1Cas9), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) Cas9 (SpCas9), 또는 이의 변이체이다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인은 변경된 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM) 특이성 또는 비-G PAM에 대해 특이성을 갖는 SpCas9의 변이체를 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 변경된 PAM은 핵산 서열 5'-NGC-3'에 대해 특이성을 갖는다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 변형된 SpCas9는 아미노산 치환 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인은 뉴클레아제 비활성 또는 닉카제 변이체이다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 닉카제 변이체는 아미노산 치환 D10A 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 염기 편집기는 아연 핑거 도메인을 추가로 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 아데노신 데아미나제 도메인은 데옥시리보핵산 (DNA)에서 아데닌을 탈아민화할 수 있다.
다양한 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA 데아미나제이다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, TadA 데아미나제는 TadA*7.10이다. 다양한 구현예에서, TadA 데아미나제는 TadA*8 변이체이다. 아데노신 데아미나제 변이체는 데옥시리보핵산 (DNA)에서 아데닌을 탈아민화할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) TadA, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) TadA, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) TadA, 쉐와넬라 푸트레파시엔스 (Shewanella putrefaciens) TadA, 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) F3031 TadA, 콜로박터 크레슨투스 (Caulobacter crescentus) (씨. 크레슨투스 (C. crescentus)) TadA, 또는 게오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens) TadA, 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 자연에서 발생하지 않는 아데도신 데아미나제이다.
상기 양상의 다양한 구현예에서, 융합 단백질은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인과 아데노신 데아미나제 도메인 사이에 링커를 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 링커는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 하나 이상의 핵 국소화 신호를 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 핵 국소화 신호는 양분된 핵 국소화 신호이다.
상기 양상의 다양한 구현예에서, Cas9는 StCas9 또는 SaCas9이다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, Cas9는 변형된 SaCas9이다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 변형된 SaCas9는 아미노산 치환 E781K, N967K, 및 R1014H, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 상기 양상의 다양한 구현예에서, 변형된 SaCas9는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00010
융합 단백질은 다음을 포함한다:
하기의 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체 도메인, 여기서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSST (여기서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 변경을 포함한다), 및 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드 (여기서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드 내에 삽입된다).
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 TadA*8 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 포함하는 아데노신 데아미나제 단량체이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 야생형 아데노신 데아미나제 도메인 및 TadA*8 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 TadA 도메인 및 TadA*8 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드의 가요성 루프, 알파 나선 영역, 비구조화된 부분, 또는 용매 접근 가능한 부분 내에 삽입된다. 일부 구현예에서, 가요성 루프는 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드의 알파 나선 구조의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인 Cas9 폴리펩타이드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하기 구조를 포함한다: NH2-[Cas9의 N-말단 단편]-[아데노신 데아미나제 변이체]-[Cas9의 C-말단 단편]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다. 일부 구현예에서, Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드의 N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합한다.
일부 구현예에서, N 말단 단편의 C-말단 또는 C 말단 단편의 N-말단은 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드의 가요성 루프의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 가요성 루프는 융합 단백질이 표적 핵염기를 탈아민화하는 경우, 표적 핵염기에 근접한 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열로부터 1 내지 20개 핵염기로 이격되어 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 2 내지 12개 핵염기 업스트림에 있다. 일부 구현예에서, N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 RuvC 도메인을 포함하거나; N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 HNH 도메인을 포함하거나; N-말단 단편 및 C-말단 단편의 어느 것도 HNH 도메인을 포함하지 않거나, N-말단 단편 및 C-말단 단편의 어느 것도 RuvC 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드는 하나 이상의 구조적 도메인에서 부분적 또는 완전한 결실을 포함하고, 여기서, 아데노신 데아미나제는 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드의 부분적 또는 완전한 결실 위치에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 결실은 RuvC 도메인에 내에 있거나; 결실은 HNH 도메인에 내에 있거나; 결실은 RuvC 도메인 및 C-말단 도메인을 브릿징한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 Cas12 폴리펩타이드에 삽입된다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) Cas9 (SpCas9), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) Cas9 (SaCas9), 스트렙토코커스 써모필러스 1 (Streptococcus thermophilus 1) Cas9 (St1Cas9), 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas9는 하기의 아미노산 서열 (Cas9 참조 서열) 또는 이의 상응하는 영역을 포함한다:
Figure pct00011
(한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인; ("Cas9 참조 서열").
하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 제공하며, 여기서: Cas9 폴리펩타이드는 Cas9 폴리펩타이드 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 1017-1069 또는 이의 상응하는 아미노산의 결실을 포함하거나; Cas9 폴리펩타이드는 Cas9 폴리펩타이드 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 792-872 또는 이의 상응하는 아미노산의 결실을 포함하거나; Cas9 폴리펩타이드는 Cas9 폴리펩타이드 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 792-906 또는 이의 상응하는 아미노산의 결실을 포함한다. 하나의 양상에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 Cas9 폴리펩타이드의 가요성 루프 내에 삽입된다. 하나의 구현예에서, 가요성 루프는 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 위치 530-537, 569-579, 686-691, 768-793, 943-947, 1002-1040, 1052-1077, 1232-1248, 및 1298-1300 또는 이의 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 768-769, 791-792, 792-793, 1015-1016, 1022-1023, 1026-1027, 1029-1030, 1040-1041, 1052-1053, 1054-1055, 1067-1068, 1068-1069, 1247-1248, 또는 1248-1249 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 768-769, 792-793, 1022-1023, 1026-1027, 1040-1041, 1068-1069, 또는 1247-1248 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 1016-1017, 1023-1024, 1029-1030, 1040-1041, 1069-1070, 또는 1247-1248 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 하나의 구현예에서, 데아미나제 변이체 도메인은 표 10A에서 동정된 유전자좌에서 Cas9 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 하나의 구현예에서, N-말단 단편은 Cas9 참조 서열의 아미노산 잔기 1-529, 538-568, 580-685, 692-942, 948-1001, 1026-1051, 1078-1231, 및/또는 1248-1297 또는 이의 상응하는 잔기를 포함한다. 하나의 구현예에서, C-말단 단편은 Cas9 참조 서열의 아미노산 잔기 1301-1368, 1248-1297, 1078-1231, 1026-1051, 948-1001, 692-942, 580-685, 및/또는 538-568 또는 이의 상응하는 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 닉카제이거나, Cas9 폴리펩타이드는 뉴클레아제 불활성이다. 하나의 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 변형된 SpCas9 폴리펩타이드이고, 변경된 PAM에 대해 특이성을 갖거나 비-G PAM에 대해 특이성을 갖는다. 하나의 구현예에서, 변형된 SpCas9 폴리펩타이드는 아미노산 치환 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R (SpCas9-MQKFRAER)을 포함하고 변경된 PAM 5'-NGC-3'에 대해 특이성을 갖는다.
하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 Cas12 폴리펩타이드에 삽입된다. 하나의 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드는 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i이다. 하나의 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드는 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) Cas12b, 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) Cas12b, 바실러스 종 (Bacillus sp.) V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실러스 액시디필러스 (Alicyclobacillus acidiphilus) Cas12b와 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 하나의 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드는 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) Cas12b, 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) Cas12b, 바실러스 종 (Bacillus sp.) V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실러스 액시디필러스 (Alicyclobacillus acidiphilus) Cas12b의 단편을 포함하거나 필수적으로 이들로 이루어진다. 하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 하기의 아미노산 위치 사이에 삽입된다: a) BhCas12b의 153-154, 255-256, 306-307, 980-981, 1019-1020, 534-535, 604-605 또는 344-345, 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i의 상응하는 아미노산 잔기; b) BvCas12b의 147 및 148, 248 및 249, 299 및 300, 991 및 992 또는 1031 및 1032, 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i의 상응하는 아미노산 잔기; 또는 c) AaCas12b의 157 및 158, 258 및 259, 310 및 311, 1008 및 1009, 또는 1044 및 1045, 또는 CCas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i의 상응하는 아미노산 잔기. 하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 표 10B에 동정된 유전자좌에서 삽입된다.
일부 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드는 Cas12b이다. 하나의 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드는 BhCas12b 도메인, BvCas12b 도메인, 또는 AACas12b 도메인을 포함한다. Cas12b 폴리펩타이드는 RuvC 도메인의 촉매 활성을 사일런싱시키는 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, Cas12b 폴리펩타이드는 D574A, D829A 및/또는 D952A 돌연변이를 포함한다.
하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 스타필로코커스 아우레우스 TadA, 바실러스 서브틸리스 TadA, 살모넬라 타이피무리움 TadA, 쉐와넬라 푸트레파시엔스 TadA, 해모필러스 인플루엔자 F3031 TadA, 콜로박터 크레슨투스 (씨. 크레슨투스) TadA, 또는 게오박터 설푸레두센스 TadA, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 비천연적으로 발생하는 아데노신 데아미나제이다.
다양한 구현예에서, 융합 단백질은 시티딘 데아미나제를 추가로 포함한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 하기의 구조를 포함하는 융합 단백질을 제공한다: NH2-[TadA*8]-[Cas9]-[시티딘 데아미나제]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 하기의 구조를 포함하는 융합 단백질을 제공한다: NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9]-[TadA*8]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 하기의 구조를 포함하는 융합 단백질을 제공한다: NH2-[Cas9(TadA*8)]-[시티딘 데아미나제]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커 (예를 들어, Cas9 내에 내부적으로 융합된 TadA*8 및 C-말단에 융합된 시티딘 데아미나제)이다. 하나의 양상에서, 본 발명은 하기의 구조를 포함하는 융합 단백질을 제공한다: NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9(TadA*8)]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커 (예를 들어, Cas9 내에 내부적으로 융합된 TadA*8 및 N-말단에 융합된 시티딘 데아미나제)이다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 하기의 구조를 포함하는 융합 단백질을 제공한다: NH2-[Cas9(시티딘 데아미나제)]-[TadA*8]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 하기의 구조를 포함하는 융합 단백질을 제공한다: NH2-[TadA*8]-[Cas9(시티딘 데아미나제)]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 하기의 구조를 포함하는 융합 단백질을 제공한다: NH2-[Cas12(아데노신 데아미나제)]-[시티딘 데아미나제]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커 (예를 들어, Cas12 내에 내부적으로 융합된 아데노신 데아미나제 및 C-말단에 융합된 시티딘 데아미나제)이다. 하나의 양상에서, 본 발명은 하기의 구조를 포함하는 융합 단백질을 제공한다: NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas12(아데노신 데아미나제)]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커 (예를 들어, Cas12 내에 내부적으로 융합된 아데노신 데아미나제 및 N-말단에 융합된 시티딘 데아미나제)이다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 하기의 구조를 포함하는 융합 단백질을 제공한다: NH2-[Cas12(시티딘 데아미나제)]-[아데노신 데아미나제]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 하기의 구조를 포함하는 융합 단백질을 제공한다: NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas12(시티딘 데아미나제)]-C, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 표적 핵염기의 탈아민화를 수행하기 위해 하나 이상의 가이드 핵산 서열과 복합체로 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 표적 폴리뉴틀레오타이드와 추가로 복합체화된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 포유동물 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 아데노 연관련 바이러스 (AAV), 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 및 헤르페스바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 프로모터를 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 포함하는 세포를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 다양한 구현예에서, 세포는 세균 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 인간 세포, 또는 포유동물 세포이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드와의 복합체에 본원에 제공된 임의의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 염기 편집기를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 폴리뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 벡터 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 세포 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 벡터를 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 서열을 본원에 제공된 임의의 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 염기 편집 방법을 제공하며, 여기서, 융합 단백질의 아데노신 데아미나제 변이체 도메인은 폴리뉴클레오타이드 내의 핵염기를 탈아민화하여 폴리뉴클레오타이드 서열을 편집한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 표적 핵염기의 탈아민화를 수행하기 위해 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오타이드를 편집하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드를 제116항의 염기 편집기와 접촉시켜 표적 폴리뉴클레오타이드에서 AㆍT를 GㆍC로 변경하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포, 진핵 세포, 포유동물 세포, 또는 인간 세포에서 접촉하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 생체내이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체외이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 대상체에서 유전적 결함을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 염기 편집기 또는 상기 염기 편집기를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 염기 편집기가 대상체의 표적 뉴클레오타이드 서열에서 표적 핵염기를 탈아민화시키도록 지시하는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드를 대상체에게 투여하여 유전적 결함을 치료하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다: a) GACCUAGGCGAGGCAGUAGG; b) CCAGUAUGGACACUGUCCAAA; c) CAGUAUGGACACUGUCCAAA; 및 d) AGUAUGGACACUGUCCAAAG. 다양한 구현예에서, gRNA는 핵산 서열 GUUUUUGUACUCUCAAGAUUUAAGUAACUGUACAACGAAACUUACACAGUUACUUAAAUCUUGCAGAAGCUACAAAGAUAAGGCUUCAUGCCGAAAUCAACACCCUGUCAUUUUAUGGCAGGGUG를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 염기 편집기, 또는 상기 염기 편집기를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드를 대상체의 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 대상체는 포유동물 또는 인간이다. 다양한 구현예에서, 표적 핵염기의 탈아민화는 표적 핵염기를 야생형 핵염기로 대체한다. 다양한 구현예에서, 표적 핵염기의 탈아민화는 표적 핵염기를 비야생형 핵염기로 대체하고, 여기서, 표적 핵염기의 탈아민화는 유전학적 병태의 증상을 개선한다. 다양한 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 핵염기 이외의 핵염기에서의 유전학적 병태와 연관된 돌연변이를 포함한다.
본원의 기재사항 및 실시예는 본원의 개시내용의 구현예를 상세히 설명한다. 본원의 개시내용은 본원에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않고 이와 같이 다양할 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 당업자는 이의 범위에 포괄되는 본원 개시내용의 다수의 변화 및 변형이 있음을 인지할 것이다.
본원에 개시된 일부 구현예의 수행은 달리 지적되지 않는 경우, 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 게놈학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 사용하고, 이는 당업자 기술 내에 있다. 예를 들어, 문헌 (참조: Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012); the series Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds.); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R.I. Freshney, ed. (2010))을 참조한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 구성 목적을 위한 것이고 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원 개시내용의 다양한 특성이 단일 구현예와 관련하여 기재될 수 있지만, 상기 특성은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공될 수 있다. 역으로, 본원의 개시내용은 명확하게 하기 위해 별도의 구현예와 관련하여 기재될 수 있지만, 본원의 개시내용은 단일 구현예에서 수행될 수 있다. 본원에 사용된 섹션 제목은 단지 구성 목적을 위한 것이고 기재된 주제를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
본원 개시내용의 특성은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 제시된다. 본 발명의 특성 및 이점의 보다 양호한 이해는 본 개시내용의 원리가 이용되는 예시적인 구현예를 설명하는 다음의 상세한 설명을 참조하고, 이하에서 설명되는 첨부 도면을 고려하여 얻어질 것이다.
정의
다음 정의는 해당 기술 분야의 정의를 보완하고 현재 출원에 대한 것이며 관련되거나 관련되지 않은 사례, 예를 들어, 공동 소유의 특허 또는 출원에 귀속되어서는 안된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 균등한 임의의 방법과 물질들을 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용할 수 있지만 바람직한 물질 및 방법들을 본원에 기재한다. 따라서, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 것이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기의 참조문헌은 당업자에게 본 발명에 사용되는 많은 용어의 일반 정의를 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).
본원에서, 단수의 사용은 구체적으로 달리 언급되지 않는 경우 복수를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 문맥에 달리 명백하게 지적되지 않는 경우 복수의 언급을 포함한다. 본원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 경우 "및/또는"을 의미하고 포괄적인 것으로 이해된다. 추가로, "포함한다 (include)", "포함한다 (includes)" 및 "포함되는 (included)"과 같은 다른 형태 뿐만 아니라 "포함하는"이라는 용어의 사용은 제한적이지 않다.
본 명세서 및 청구항(들)에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예를 들어, "포함한다 (comprise)" 및 "포함한다 (comprises)"), "갖는 (having)" (및 갖는의 임의의 형태, 예를 들어, "갖는다 (have)" 및 "갖는다 (has)"), "포함하는 (including)" (및 포함하는의 임의의 형태, 예를 들어, "포함한다 (includes)" 및 "포함한다 (include)") 또는 "함유하는 (containing)" (및 함유하는의 임의의 형태, 예를 들어 "함유한다 (contains)" 및 "함유한다 (contain)")는 포괄적이거나 개방형 (open-ended)이고 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에 논의된 임의의 구현예는 본원 개시내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있고 그 반대도 마찬가지인 것으로 고려된다. 추가로, 본원 개시내용의 조성물을 사용하여 본원 개시내용의 방법을 성취할 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략적으로"는 당업자에 의한 결정시 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하고, 이것은 상기 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 한계치에 부분적으로 의존한다. 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 소정의 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히, 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 값의 5배 이내 또는 2배 이내와 같은 한자릿수 (order of magnitude) 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 본원 및 청구항에 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는다면, 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용되는 오차 범위 내를 의미하는 것으로 추정되어야만 한다.
본원에 제공된 범위는 상기 범위 내 모든 값에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 그룹으로부터 임의의 수, 수의 조합 또는 서브-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
명세서에서 "일부 구현예", "구현예", "하나의 구현예" 또는 "다른 구현예"에 대한 언급은 구현예와 연계하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 적어도 일부 구현예에 포함되지만 본원 개시내용의 모든 구현예에 필수적으로 포함되는 것은 아님을 의미한다.
"비염기성 염기 편집기"는 핵염기를 절단하고 DNA 핵염기 (A, T, C 또는 G)를 삽입할 수 있는 제제를 의미한다. 비염기성 염기 편집기는 핵산 글리코실라제 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함한다. 하나의 구현예에서, 핵산 글리코실라제는 이후 서열에서 아미노산 204 (예를 들어, 아미노산 204에서 Asn을 대체하는) 또는 우라실 DNA 글리코실라제의 상응하는 위치에 Asp를 포함하고 시토신-DNA 글리코실라제 활성을 갖는 돌연변이 인간 우라실 DNA 글리코실라제, 또는 이의 활성 단편이다. 하나의 구현예에서, 헥산 글리코실라제는 이후 서열에서 아미노산 147 (예를 들어, 아미노산 147에서 Tyr을 대체하는) 또는 우라실 DNA 글리코실라제의 상응하는 위치에 Ala, Gly, Cys, 또는 Ser을 포함하고 티민-DNA 글리코실라제 활성을 갖는 돌연변이 인간 우라실 DNA 글리코실라제, 또는 이의 활성 단편이다. 예시적인 인간 우라실-DNA 글리코실라제, 이소형 1의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00012
인간 우라실-DNA 글리코실라제, 이소형 2의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00013
다른 구현예에서, 비염기성 편집기는 본원에 참조로 포함된 PCT/JP2015/080958 및 US20170321210에 기재된 비염기성 편집기 중 임의의 하나이다. 특정 구현예에서, 비염기성 편집기는 상기 서열에서 밑줄로 굵게 표시된 위치 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 비염기성 편집기 또는 우라실 데글리코실라제에서의 상응하는 아미노산에서 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 비염기성 편집기는 Y147, N204, L272, 및/또는 R276, 또는 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 비염기성 편집기는 Y147A 또는 Y147G 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 비염기성 편집기는 N204D 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 비염기성 편집기는 L272A 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 비염기성 편집기는 R276E 또는 R276C 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다.
"아데노신 데아미나제"란 아데닌 또는 아데노신의 가수분해 탈아민화를 촉매할 수 있는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 의미한다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 아데노신의 이노신으로 또는 데옥시 아데노신의 데옥시이노신으로의 가수분해 탈아민화를 촉매하는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 데옥시리보핵산 (DNA)에서 아데닌 또는 아데노신의 가수분해 탈아민화를 촉매한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나제 (예를 들어, 가공된 아데노신 데아미나제, 변화된 아데노신 데아미나제)는 임의의 유기체, 예를 들어, 세균으로부터 기원할 수 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 데아미나제이다. 일부 구현예에서, TadA 데아미나제는 TadA 변이체이다. 일부 구현예에서, TadA 변이체는 TadA*8이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 인간, 침팬지, 고릴라, 몽키, 소, 개, 래트 또는 마우스와 같은 유기체 기원의 천연적으로 발생하는 데아미나제의 변이체이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인 자연에서 발생하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 천연적으로 발생하는 데아미나제와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 동일하다. 예를 들어, 데아미나제 도메인은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381 (WO 2018/027078) 및 PCT/US2016/058344 (WO 2017/070632)에 기재되어 있으며, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)), and Rees, H.A., et al., "Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells." Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1)을 참조하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
야생형 TadA(wt) 아데노신 데아미나제는 하기의 서열을 갖는다 (또한 TadA 참조 서열로 호칭됨; 서열번호 2):
Figure pct00014
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하기의 서열에서의 변경을 포함한다:
Figure pct00015
(또한 TadA*7.10으로 호칭됨).
일부 구현예에서, TadA*7.10은 적어도 하나의 변경을 포함한다. 일부 구현예에서, TadA*7.10은 아미노산 82 및/또는 166에서의 변경을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 언급된 서열의 변이체는 하기 변경 중 하나 이상을 포함한다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R. 변경 Y123H는 또한 본원에서 H123H로서 언급된다 (TadA*7.10에서 변경 H123Y는 Y123H (wt)로 복귀함). 다른 구현예에서, TadA*7.10 서열의 변이체는 하기의 그룹으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
다른 구현예에서, 본 발명은 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA7에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 잔기 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 또는 15에서 시작하는 C 말단의 결실을 포함하는 결실, 예를 들어, TadA*8을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체를 제공한다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 하기의 변경 중 하나 이상을 포함하는 TadA (예를 들어, TadA*8) 단량체이다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 하기의 그룹으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 단량체이다: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
여전히 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 2개의 아데노신 데아미나제 도메인 (예를 들어, TadA*8)을 포함하는 동종이량체이고 이의 각각은 하기의 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 갖는다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 2개의 아데노신 데아미나제 도메인 (예를 들어, TadA*8)을 포함하는 동종이량체이고, 이의 각각은 하기의 그룹으로부터 선택된 변경의 조합을 갖는다: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 야생형 TadA 아데노신 데아미나제 도메인, 및 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 하기의 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체 도메인 (예를 들어, TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 야생형 TadA 아데노신 데아미나제 도메인 및 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 하기의 그룹으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체 도메인 (예를 들어, TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10 도메인, 및 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 하기의 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상의 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체 도메인 (예를 들어, TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10 도메인, 및 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 하기의 변경의 조합을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체 도메인 (예를 들어, TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 또는 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 TadA*8이다:
Figure pct00016
일부 구현예에서, TadA*8은 절단된다. 일부 구현예에서, 절단된 TadA*8은 전장 TadA*8에 상대적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 N-말단 아미노산 잔기가 결실된다. 일부 구현예에서, 절단된 TadA*8은 전장 TadA*8에 상대적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 C-말단 아미노산 잔기가 결실된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 전장 TadA*8이다.
특정 구현예에서, 아데노신 데아미나제 이종이량체는 TadA*8 도메인 및 다음 중 하나로부터 선택된 아데노신 데아미나제 도메인을 포함한다:
스타필로코커스 아우레우스 (에스. 아우레우스 (S. aureus)) TadA:
Figure pct00017
바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) (비. 서브틸리스 (B. subtilis)) TadA:
Figure pct00018
살모넬라 타이피무리움 (Salmonella typhimurium) (에스. 티피무리움 (S. typhimurium)) TadA:
Figure pct00019
쉐와넬라 푸트레파시엔스 (Shewanella putrefaciens) (에스. 푸트레파시엔스 (S. putrefaciens)) TadA:
Figure pct00020
해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) F3031 (에이취. 인플루엔자 (H. influenzae)) TadA:
Figure pct00021
콜로박터 크레슨투스 (Caulobacter crescentus) (씨. 크레슨투스 (C. crescentus)) TadA:
Figure pct00022
게오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens) (지. 설푸레두센스 (G. sulfurreducens)) TadA:
Figure pct00023
TadA*7.10
Figure pct00024
"아데노신 데아미나제 염기 편집기 8 (ABE8) 폴리펩타이드 또는 "ABE8"이란 하기의 참조 서열의 아미노산 위치 82 및/또는 166에서 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 염기 편집기를 의미한다:
Figure pct00025
일부 구현예에서, ABE8은 참조 서열에 상대적으로 본원에 기재된 바와 같은 추가의 변경을 포함한다.
"아데노신 데아미나제 염기 편집기 8 (ABE8) 폴리뉴클레오타이드"란 ABE8을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.
"투여하는"은 본원에 기재된 하나 이상의 조성물을 환자 또는 대상체에게 제공하는 것으로서 본원에 언급된다. 예를 들어 그리고 제한 없이, 조성물 투여, 예를 들어, 주사는 정맥내 (i.v.) 주사, 피하 (s.c.) 주사, 피내 (i.d.) 주사, 복막내 (i.p.) 주사, 또는 근육내 (i.m.) 주사에 의해 수행될 수 있다. 하나 이상의 상기 경로가 사용될 수 있다. 비경구 투여는 예를 들어, 볼러스 주사에 의해 또는 시간 경과에 따른 점진적 관류에 의한 것일 수 있다. 대안적으로, 또는 동시에, 투여는 경구 경로에 의한 것일 수 있다.
"제제"란 임의의 소분자의 화학적 화합물, 항체, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 의미한다.
"변경"이란 본원에 기재된 것들과 같이 표준 당업계 방법에 의해 검출된 바와 같은 유전자 또는 폴리펩타이드의 구조, 발현 수준 또는 활성에서의 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 변경은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에서의 변화 또는 발현 수준에서의 변화, 예를 들어, 25% 변화, 40% 변화, 50% 변화 또는 그 이상을 포함한다.
"개선한다"란 질환의 발병 또는 진행의 감소, 억제, 감쇠, 약화, 정지 또는 안정화를 의미한다.
"유사체"란 동일하지 않지만 유사한 기능 또는 구조적 특징을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 유사체는 상응하는 천연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유하면서 천연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 비해 유사체의 기능을 증진시키는 특정 변형을 갖는다. 상기 변형은 예를 들어, 리간드 결합을 변경하지 않고 DNA에 대한 유사체의 친화성, 효율, 특이성, 프로테아제 또는 뉴클레아제 내성, 막 투과성 및/또는 반감기를 증가시킬 수 있다. 유사체는 비천연 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 포함할 수 있다.
"염기 편집기 (BE)" 또는 "핵염기 편집기 (NBE)"란 폴리뉴클레오타이드에 결합하고 핵염기 변형 활성을 갖는 제제를 의미한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집기는 핵염기 변형 폴리펩타이드 (예를 들어, 데아미나제), 및 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 가이드 RNA)와 연합된 핵산 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인을 포함한다. 다양한 구현예에서, 상기 제제는 염기 편집 활성을 갖는 단백질 도메인, 즉, 핵산 분자 (예를 들어, DNA) 내 염기 (예를 들어, A, T, C, G, 또는 U)를 변형시킬 수 있는 도메인을 포함하는 생분자 복합체이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인은 데아미나제 도메인에 융합되거나 연결된다. 하나의 구현예에서, 상기 제제는 염기 편집 활성을 갖는 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 또 다른 구현예에서, 염기 편집 활성을 갖는 단백질 도메인은 가이드 RNA (예를 들어, 데아미나제에 융합된 가이드 RNA 및 RNA 결합 도메인 상의 RNA 결합 모티프를 통해)에 연결된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 활성을 갖는 도메인은 핵산 분자 내 염기를 탈아민화할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 DNA 분자 내 하나 이상의 염기를 탈아민화할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 DNA 내 아데노신 (A)을 탈아민화할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 염기 편집기 (ABE)이다.
예를 들어, 염기 편집 조성물에 사용된 바와 같은 시티딘 염기 편집기 (CBE), 본원에 기재된 시스템 및 방법은 아래에 제공된 바와 같은 핵산 서열 (8877 염기쌍)을 갖는다 (참조: Addgene, Watertown, MA.; Komor AC, et al., 2017, Sci Adv., 30;3(8):eaao4774. doi: 10.1126/sciadv.aao4774). BE4 핵산 서열과 적어도 95% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열이 또한 포함된다.
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
일부 구현예에서, 시티딘 염기 편집기는 하기 중 하나로부터 선택된 핵산 서열을 갖는 BE4이다:
본래의 BE4 핵산 서열:
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
BE4 코돈 최적화 1 핵산 서열:
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
BE4 코돈 최적화 2 핵산 서열:
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 변이체 (예를 들어, TadA*8)를 환형의 퍼뮤턴트 Cas9 (예를 들어, spCAS9 또는 saCAS9) 및 양분된 핵 국소화 서열을 포함하는 스캐폴드에 클로닝함에 의해 생성된다 (예를 들어, ABE8). 환형의 퍼뮤턴트 Cas9는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 (참조: Oakes et al., Cell 176, 254-267, 2019)에 기재되어 있다. 예시적인 환형의 퍼뮤턴트는 하기에 제시되어 있고, 여기서, 굵게 표시된 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭한다.
CP5 (MSP "NGC=NGG와 같은 돌연변이 정규 Cas9를 갖는 팜 변이체", PID=단백질 상호작용 도메인 및 "D10A" 낙카제와 함께):
Figure pct00040
일부 구현예에서, ABE8은 하기 표 7, 9, 14 또는 15로부터의 염기 편집기로부터 선택된다. 일부 구현예에서, ABE8은 TadA로부터 유래된 아데노신 데아미나제 변이체를 함유한다. 일부 구현예에서, ABE8의 아데노신 데아미나제 변이체는 하기 표 7, 9, 14 또는 15에 기재된 바와 같은 TadA*8 변이체이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10 변이체 (예를 들어, TadA*8)이고, 이는 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R의 그룹으로부터 선택된 변경의 하나 이상을 포함한다. 다양한 구현예에서, ABE8은 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 그룹으로부터 선택된 변경의 조합과 함께 TadA*7.10 변이체 (예를 들어, TadA*8)를 포함한다. 일부 구현예에서, ABE8은 단량체 작제물이다. 일부 구현예에서, ABE8은 이종이량체 작제물이다. 일부 구현예에서, ABE8은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00041
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 CRISPR 연합된 (예를 들어, Cas 또는 Cpf1) 효소이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 데아미나제 도메인과 융합된 촉매적으로 데드 Cas9 (dCas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 데아미나제 도메인과 융합된 Cas9 닉카제 (nCas9)이다. 이들 염기 편집기의 세부사항은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381 (WO 2018/027078) 및 PCT/US2016/058344 (WO2017/070632)에 기재되어 있고, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017), and Rees, H.A., et al., "Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells." Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1)을 참조하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어, 염기 편집 조성물에 사용된 바와 같은 아데닌 염기 편집기 (ABE), 본원에 기재된 시스템 및 방법은 아래에 제공된 바와 같은 핵산 서열 (8877 염기쌍)을 갖는다 (참조: Addgene, Watertown, MA.; Gaudelli NM, et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471. doi: 10.1038/nature24644; Koblan LW, et al., Nat Biotechnol. 2018 Oct;36(9):843-846. doi: 10.1038/nbt.4172.). ABE 핵산 서열과 적어도 95% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열이 또한 포함된다.
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
"염기 편집 활성"이란 폴리뉴클레오타이드 내에서 염기를 화학적으로 변경하는 작용을 함을 의미한다. 하나의 구현예에서, 제1 염기는 제2 염기로 전환된다. 하나의 구현예에서, 염기 편집 활성은 시티딘 데아미나제 활성, 예를 들어, 표적 CㆍG를 TㆍA로 전환시키는 활성이다. 또 다른 구현예에서, 염기 편집 활성은 아데노신 또는 아데닌 데아미나제 활성, 예를 들어, AㆍT를 GㆍC로 전환시키는 활성이다. 또 다른 구현예에서, 염기 편집 활성은 시티딘 데아미나제 활성, 예를 들어, CㆍG를 TㆍA로 전환시키는 활성 및 아데노신 또는 아데닌 데아미나제 활성, 예를 들어, AㆍT를 GㆍC로 전환시키는 활성이다 (참조: PCT/US2019/044935, PCT/US2020/016288, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함됨).
일부 구현예에서, 염기 편집 활성은 편집 효율에 의해 평가된다. 염기 편집 효율은 임의의 적합한 수단, 예를 들어, 생거 서열 분석 또는 차세대 서열 분석에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 염기 편집기에 의해 수행된 핵염기 전환을 갖는 총 서열분석 판독의 퍼센트, 예를 들어, G.C 염기쌍으로 전환된 표적 A.T 염기 쌍을 갖는 총 서열분석 판독의 퍼센트에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 염기 편집이 세포 집단에서 수행된 경우, 염기 편집기에 의해 수행된 핵염기 전환을 갖는 총 세포의 퍼센트에 의해 측정된다.
용어 "염기 편집기 시스템"은 표적 뉴클레오타이드 서열의 핵염기를 편집하기 위한 시스템을 언급한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 (1) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 (예를 들어, Cas9); (2) 상기 핵염기를 탈아민화하기 위한 데아미나제 도메인 (예를 들어, 아데노신 데아미나제 및/또는 시티딘 데아미나제; 참조: PCT/US2019/044935, PCT/US2020/016288, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함됨); 및 (3) 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데닌 또는 아데노신 염기 편집기 (ABE)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 ABE8이다.
일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 하나 초과의 염기 편집 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기 시스템은 하나 초과의 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 아데노신 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상이한 데아미나제를 표적 핵산 서열에 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 쌍의 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상이한 데아미나제를 표적 핵산 서열에 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
염기 편집기 시스템의 데아미나제 도메인 및 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 성분은 서로 공유적으로 또는 비공유적으로, 또는 연합 및 이의 상호작용의 임의의 조합과 연합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데아미나제 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 데아미나제 도메인에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 데아미나제 도메인을 데아미나제 도메인과 비공유적으로 상호작용하거나 연합함에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데아미나제 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인의 일부인 추가의 이종성 부분 또는 도메인과 상호작용하거나, 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있는 추가의 이종성 부분 또는 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩타이드에 결합하거나 이와 상호작용하거나 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드에 결합하거나 이와 상호작용하거나 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩타이드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드 링커에 결합할 수 있다. 추가의 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 K 상동성 (KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 무균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인지 모티프일 수 있다.
염기 편집기 시스템은 가이드 폴리뉴클레오타이드 성분을 추가로 포함할 수 있다. 염기 편집기 시스템의 성분들은 공유 결합, 비공유 상호작용, 또는 이의 연합과 상호작용의 임의의 조합을 통해 서로 연합될 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나제 도메인은 가이드 폴리뉴클레오타이드에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데아미나제 도메인은 가이드 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 분절 (예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 모티프)과 상호작용하거나, 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있는 추가의 이종성 부분 또는 도메인 (예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오타이드 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분 또는 도메인 (예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오타이드 결합 도메인)은 데아미나제 도메인에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩타이드에 결합하거나 이와 상호작용하거나 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드에 결합하거나 이와 상호작용하거나 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩타이드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드 링커에 결합할 수 있다. 추가의 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 K 상동성 (KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 무균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인지 모티프일 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 염기 절제 복구 (BER) 성분의 저해제를 추가로 포함할 수 있다. 염기 편집기 시스템의 성분들은 공유 결합, 비공유 상호작용, 또는 이의 연합과 상호작용의 임의의 조합을 통해 서로 연합될 수 있다. BER 성분의 저해제는 BER 저해제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, BER의 저해제는 우라실 DNA 글리코실라제 저해제 (UGI)일 수 있다. 일부 구현예에서, BER의 저해제는 이노신 BER 저해제일 수 있다. 일부 구현예에서, BER의 저해제는 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 BER의 저해제에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 데아미나제 도메인 및 BER의 저해제에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 BER의 저해제를 BER의 저해제와 비공유적으로 상호작용하거나 연합함에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, BER 성분의 저해제는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인의 일부인 추가의 이종성 부분 또는 도메인과 상호작용하거나, 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있는 추가의 이종성 부분 또는 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, BER의 저해제는 가이드 폴리뉴클레오타이드에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, BER의 저해제는 가이드 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 분절 (예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 모티프)과 상호작용하거나, 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있는 추가의 이종성 부분 또는 도메인 (예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오타이드 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드의 추가의 이종성 부분 또는 도메인 (예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오타이드 결합 도메인)은 BER의 저해제에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드에 결합하거나 이와 상호작용하거나 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩타이드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드 링커에 결합할 수 있다. 추가의 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 K 상동성 (KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 무균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인지 모티프일 수 있다.
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 도메인"은 Cas9 단백질, 또는 이의 단편을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9의 활성, 불활성, 또는 부분적 활성 DNA 절단 도메인, 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)를 언급한다. Cas9 뉴클레아제는 또한 때로는 Casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR (클러스터형 규칙적 간격을 둔 짧은 팔린드롬 반복체)연합된 뉴클레아제로서 언급된다. CRISPR은 이동 유전학적 요소 (바이러스, 전이할 수 있는 요소 (transposable elements) 및 접합성 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 후천성 면역계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동 요소에 상보적인 서열 및 표적 공격 핵산을 포함한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사되고 프로세싱된다. II형 CRISPR 시스템에서, 전구-crRNA의 올바른 프로세싱은 트랜스-암호화된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질을 요구한다. tracrRNA는 전구-crRNA의 리보뉴클레아제 3-원조 프로세싱에 대한 가이드로서 작용한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 환형 dsDNA 표적을 엔도핵산분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 엔도핵산분해적으로 절단됨에 이어서 3'-5' 엑소핵산분해적으로 절단 제거한다. 실제로, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 2개의 RNA를 요구한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 단순히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 양상을 단일 RNA 종으로 혼입하기 위해 가공될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (참조: Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. science 337:816-821(2012))을 참조하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 자가 대 비-자가의 구분을 도와주기 위해 CRISPR 반복 서열 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)에서 짧은 모티프를 인지한다. Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, "Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); and "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. science 337:816-821(2012), 이의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). Cas9 오톨로그는 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) 및 에스. 써모필러스 (S. thermophilus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 종에 기재되었다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본원 개시내용을 기준으로 당업자에게 자명할 것이고, 상기 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 (참조: Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737)에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다.
예시적인 Cas9는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 (spCas9)이고, 이의 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00046
(한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인)
뉴클레아제-불활성화된 Cas9 단백질은 상호교환적으로 "dCas9" 단백질 (뉴클레아제-"데드" Cas9) 또는 촉매 불활성 Cas9로서 언급될 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 단백질 (또는 이의 단편)을 생성하기 위한 방법은 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28;152(5):1173-83, 이의 각각의 전문의 내용은 본원에 참조로 포함됨). 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 2개의 서브도메인인 HNH 뉴클레아제 서브도메인 및 RuvC1 서브도메인을 포함하는 것으로 공지되어 있다. HNH 서브도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하는 반면 RuvC1 서브도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. 이들 서브도메인 내 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 사일런싱시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 D10A 및 H840A는 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킨다 (참조: Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)). 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 불활성 (예를 들어, 불활성화된) DNA 절단 도메인을 갖고, 즉, Cas9는 "nCas9" 단백질 ("닉카제" Cas9에 대해)로서 언급되는 닉카제이다. 일부 구현예에서, Cas9의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질은 2개의 Cas9 도메인 중 하나를 포함한다: (1) Cas9의 gRNA 결합 도메인; 또는 (2) Cas9의 DNA 절단 도메인. 일부 구현예에서, Cas9 또는 이의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로서 언급된다. Cas9 변이체는 Cas9 또는 이의 단편과 상동성을 공유한다. 예를 들어, 상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체는 Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하여, 상기 단편은 야생형 Cas9의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, 단편은 상응하는 야생형 Cas9의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하거나, 이의 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다.
일부 구현예에서, 단편은 적어도 100개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 단편은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 또는 적어도 1300개 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코커스 피오게네스 기원의 Cas9 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1, 다음과 같은 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열)에 상응한다.
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
(한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인)
일부 구현예에서, 야생형 Cas9는 하기의 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열에 상응하거나 이를 포함한다:
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
(한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인)
일부 구현예에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9에 상응한다 (NCBI 참조 서열: NC_002737.2 (하기와 같은 뉴클레오타이드 서열); 및 Uniprot 참조 서열: Q99ZW2 (하기와 같은 아미노산 서열)).
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
(서열번호: 1; 한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인)
일부 구현예에서, Cas9는 코리네박테리움 울세란스 (Corynebacterium ulcerans) (NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria) (NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라 (Spiroplasma syrphidicola) (NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 인터메디아 (Prevotella intermedia) (NCBI Ref: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와넨스 (Spiroplasma taiwanense) (NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코커스 이니애 (Streptococcus iniae) (NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카 (Belliella baltica) (NCBI Ref: NC_018010.1); 사이크로플렉서스 토르쿠이스I (Psychroflexus torquisI) (NCBI Ref: NC_018721.1); 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) (NCBI Ref: YP_820832.1), 리스테리아 이노쿠아 (Listeria innocua) (NCBI Ref: NP_472073.1), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) (NCBI Ref: YP_002344900.1) 또는 나이세리아 메닌기티디스 (Neisseria. meningitidis) (NCBI Ref: YP_002342100.1)로부터 기원하는 Cas9를 언급하거나 임의의 다른 유기체 기원의 Cas9를 언급한다.
일부 구현예에서, Cas9는 나이세리아 메닌기티디스 (Nme)로부터 기원한다. 일부 구현예에서, Cas9는 Nme1, Nme2 또는 Nme3이다. 일부 구현예에서, Nme1, Nme2 또는 Nme3에 대한 PAM-상호작용 도메인은 각각 N4GAT, N4CC, 및 N4CAAA이다 (참조: 예를 들어, Edraki, A., et al., A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing, Molecular Cell (2018)). 예시적인 나이세리아 메닌기티디스 Cas9 단백질, Nme1Cas9, (NCBI 참조: WP_002235162.1; II형 CRISPR RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 Cas9)는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00058
또 다른 예시적인 나이세리아 메닌기티디스 Cas9 단백질, Nme2Cas9, (NCBI 참조: WP_002230835; II형 CRISPR RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 Cas9)는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00059
일부 구현예에서, dCas9는 Cas9 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 Cas9 아미노산 서열에 부분적으로 또는 전반적으로 상응하거나 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, dCas9 도메인은 또 다른 Cas9에서 D10A 및 H840A 돌연변이 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, dCas9는 dCas9 (D10A 및 H840A)의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00060
(한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인).
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 D10A 돌연변이를 포함하고, 위치 840에서 잔기는 상기 제공된 아미노산 서열에서, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 위치에 히스티딘을 유지한다.
다른 구현예에서, D10A 및 H840A 이외의 돌연변이를 갖는 dCas9 변이체가 제공되고, 상기 변이체는 예를 들어, 뉴클레아제 불활성화된 Cas9 (dCas9)를 유도한다. 상기 돌연변이는 예를 들어 D10 및 H840에서 다른 아미노산 치환, 또는 Cas9의 뉴클레아제 도메인 내 다른 치환 (예를 들어, HNH 뉴클레아제 서브도메인 및/또는 RuvC1 서브도메인에서의 치환)을 포함한다. 일부 구현예에서, dCas9의 변이체 또는 동족체가 제공되고, 이는 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, dCas9의 변이체가 제공되고, 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 이상의 아미노산만큼 더 짧거나 더 긴 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 융합 단백질은 Cas9 단백질의 전장 아미노산 서열, 예를 들어, 본원에 제공된 Cas9 서열 중 하나를 포함한다. 그러나, 다른 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질은 전장 Cas9 서열을 포함하지 않고 단지 하나 이상의 이의 단편을 포함한다. 적합한 Cas9 도메인 및 Cas9 단편의 예시적인 아미노산 서열이 본원에 제공되고, Cas9 도메인 및 단편의 추가의 적합한 서열은 당업자에게 자명할 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 융합 단백질은 Cas9 단백질의 전장 아미노산 서열, 예를 들어, 본원에 제공된 Cas9 서열 중 하나를 포함한다. 그러나, 다른 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질은 전장 Cas9 서열을 포함하지 않고 단지 하나 이상의 이의 단편을 포함한다. 적합한 Cas9 도메인 및 Cas9 단편의 예시적인 아미노산 서열이 본원에 제공되고, Cas9 도메인 및 단편의 추가의 적합한 서열은 당업자에게 자명할 것이다.
변이체 및 이의 동족체를 포함하는, 추가의 Cas9 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제 데드 Cas9 (dCas9), Cas9 닉카제 (nCas9), 또는 뉴클레아제 활성 Cas9)이 본원의 범위 내에 있는 것으로 인지해야 한다. 예시적인 Cas9 단백질은 제한 없이 하기에 제공된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 뉴클레아제 데드 Cas9 (dCas9)이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 Cas9 닉카제 (nCas9)이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 뉴클레아제 활성 Cas9이다.
예시적인 촉매적 불활성 Cas9 (dCas9):
Figure pct00061
예시적인 촉매적 Cas9 닉타제 (nCas9):
Figure pct00062
예시적인 촉매적 활성 Cas9:
Figure pct00063
일부 구현예에서, Cas9는 고세균 (archaea) (예를 들어, 나노고세균) 기원의 Cas9를 언급하고, 이것은 단세포 원핵 미생물의 도메인 및 킹덤을 구성한다. 일부 구현예에서, Cas9는 CasX 또는 CasY를 언급하고, 이는 예를 들어, 이의 전체 내용이 참조로 포함되는 문헌 (참조: Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21)에 기재되어 있다. 게놈-분리 균유전체학을 사용하여, 생활 고세균 도메인에서 최초 보고된 Cas9를 포함하는, 다수의 CRISPR-Cas 시스템을 동정하였다. 상기 다양한 Cas9 단백질은 활성 CRISPR-Cas 시스템의 일부로서 거의 연구되지 않은 나노고세균에서 발견되었다. 세균에서, 2개의 이전에 공지되지 않은 시스템인 CRISPR-CasX 및 CRISPR-CasY가 발견되었고, 이는 지금까지 발견된 가장 콤팩트한 시스템 중 하나이다. 일부 구현예에서, Cas9는 CasX, 또는 CasX의 변이체를 언급한다. 일부 구현예에서, Cas9는 CasY, 또는 CasY의 변이체를 언급한다. 다른 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질이 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)로서 사용될 수 있고 본원 개시내용의 범위내에 있는 것으로 인지되어야 한다.
특정 구현예에서, 본원 개시내용의 방법에 유용한 napDNAbps는 당업계에 공지되고 예를 들어, 문헌 (참조: Oakes et al., Cell 176, 254-267, 2019)에 기재된 환형 퍼뮤턴트를 포함한다. 예시적인 환형의 퍼뮤턴트는 하기에 제시되어 있고, 여기서, 굵게 표시된 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭한다.
CP5 (MSP "NGC=NGG와 같이 돌연변이 정규 Cas9를 갖는 팜 변이체", PID=단백질 상호작용 도메인 및 "D10A" 낙카제와 함께):
Figure pct00064
염기 편집기에 혼입될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인의 비제한적인 예는 CRISPR 단백질-유래된 도메인, 제한 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, TAL 뉴클레아제 (TALEN), 및 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 CasX 또는 CasY 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 CasX 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 CasY 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 천연적으로 발생하는 CasX 또는 CasY 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 천연적으로 발생하는 CasX 또는 CasY 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 본원에 기재된 임의의 CasX 또는 CasY 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 세균 종 기원의 Cas12b/C2c1, CasX 및 CasY가 또한 본원의 개시내용에 따라 사용될 수 있음을 인지해야 한다.
Cas12b/C2c1 (uniprot.org/uniprot/T0D7A2#2)　
sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR-연합된 엔도-뉴클레아제 C2c1 OS =　알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (균주 ATCC 49025 / DSM 3922/　CIP 106132 / NCIMB 13137/GD3B) GN=c2c1 PE=1　SV=1　
Figure pct00065
CasX (uniprot.org/uniprot/F0NN87;　uniprot.org/uniprot/F0NH53)　
>tr|F0NN87|F0NN87_SULIH CRISPR-연합된 Casx　단백질 OS =　설폴로부스 아슬란디쿠스 (Sulfolobus islandicus)　(균주 HVE10/4)GN= SiH_0402 PE=4 SV=1
Figure pct00066
>tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR 연합된 단백질,　Casx OS =　설폴로부스 아이슬란디쿠스 (Sulfolobus islandicus) (균주 REY15A)　GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1
Figure pct00067
델타프로테오박테리아 CasX
Figure pct00068
CasY (ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1)
>APG80656.1 CRISPR-연합된 단백질 CasY　[배양되지 않은 파르쿠박테리아 그룹 박테리움 (Parcubacteria group bacterium)]　
Figure pct00069
용어 "Cas12" 또는 "Cas12 도메인"은 Cas12 단백질 또는 이의 단편 (예를 들어, Cas12의 활성, 불활성 또는 부분 활성 DNA 절단 도메인, 및/또는 Cas12의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 언급한다. Cas12는 부류 2, V형 CRISPR/Cas 시스템에 속한다. Cas12 뉴클레아제는 종종 CRISPR (클러스터형 규칙적 간격을 둔 짧은 팔린드롬 반복체) 연합된 뉴클레아제로서 언급된다. 예시적인 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) Cas 12b (BhCas12b) Cas 12 도메인의 서열은 아래에 제공된다:
Figure pct00070
BhCas12b 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열이 또한 본원 개시내용의 방법에 유용하다.
용어 "보존성 아미노산 치환" 또는 "보존성 돌연변이"는 하나의 아미노산의 공통된 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로의 대체를 언급한다. 개별 아미노산 간의 공통된 성질을 한정하는 기능적 방식은 상동성 유기체의 상응하는 단백질 간의 아미노산 변화의 정규화된 빈도를 분석하는 것이다 (참조: Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). 상기 분석에 따라, 아미노산 그룹은 그룹 내 아미노산이 우선적으로 서로 교환하는 경우 및 따라서 전체 단백질 구조에 대한 이들의 영향에서 서로 가장 유사한 경우 한정될 수 있다 (참조: 상기 Schulz, G. E. and Schirmer, R. H.). 보존성 돌연변이의 비제한적인 예는 아미노산, 예를 들어, 라이신의 아르기닌으로의 아미노산 치환 및 그 반대의 아미노산 치환을 포함하여 양전하가 유지될 수 있고; 글루탐산의 아르파르트산으로의 아미노산 치환 및 그 반대의 아미노산 치환을 포함하여 음전하가 유지될 수 있고; 세린의 트레오닌으로의 아미노산 치환을 포함하여 유리 -OH가 유지될 수 있고; 글루타민의 아스파라긴으로의 아미노산 치환을 포함하여 유리 -NH2가 유지될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "암호화 서열" 또는 "단백질 암호화 서열"은 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분절을 언급한다. 영역 또는 서열은 개시 코돈에 의해 5' 말단에 보다 근접하고 정지 코돈과 함께 3' 말단에 보다 근접하여 결합된다. 암호화 서열은 또한 개방 판독 프레임으로 언급될 수 있다.
"시티딘 데아미나제"란 아미노 그룹을 카보닐 그룹으로 전환시키는 탈아민화 반응을 촉매할 수 있는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 의미한다. 하나의 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 시토신을 우라실로 또는 5-메틸시토신을 티민으로 전환시킨다. 페트로마이존 마리누스 (Petromyzon marinus)로부터 유래된 PmCDA1 (페트로마이존 마리누스 시토신 데아미나제 1), 또는 포유동물 (예를 들어, 인간, 돼지, 소, 말, 몽키 등)로부터 유래된 AID (활성화-유도된 시티딘 데아미나제; AICDA), 및 APOBEC는 예시적인 시티딘 데아미나제이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "데아미나제" 또는 "데아미나제 도메인"은 탈아민화 반응을 촉매하는 단백질 또는 효소를 언급한다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 아데닌의 하이포크산틴으로의 가수분해 탈아민화를 촉매하는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 아데노신 또는 아데닌 (A)의 이노신 (I)으로의 가수분해 탈아민화를 촉매하는 아데노신 데아마나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 아데노신 또는 데옥시아데노신이 각각 이노신으로 또는 데옥시이노신으로의 가수분해 탈아민화를 촉매하는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 데옥시리보핵산 (DNA)에서 아데노신의 가수분해 탈아민화를 촉매한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나제 (예를 들어, 가공된 아데노신 데아미나제, 변화된 아데노신 데아미나제)는 임의의 유기체, 예를 들어, 세균으로부터 기원할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 세균, 예를 들어, 에스케리치아 콜리 (Escherichia. coli), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus. aureus), 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella. typhimurium), 슈와넬라 푸트레파시엔스 (Shewanella. putrefaciens), 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 또는 콜로박터 크레슨투스 (Caulobacter. crescentus)로부터 기원한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 데아미나제이다. 일부 구현예에서, TadA 데아미나제는 TadA 변이체이다. 일부 구현예에서, TadA 변이체는 TadA*8이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 인간, 침팬지, 고릴라, 몽키, 소, 개, 래트 또는 마우스와 같은 유기체 기원의 천연적으로 발생하는 데아미나제의 변이체이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 천연적으로 발생하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 천연적으로 발생하는 데아미나제와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 동일하다. 예를 들어, 데아미나제 도메인은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381 (WO 2018/027078) 및 PCT/US2016/058344 (WO 2017/070632)에 기재되어 있고, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017), and Rees, H.A., et al., "Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells." Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1)을 참조하고, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
"검출한다"는 검출될 분석물의 존재, 부재 또는 양을 동정하는 것을 언급한다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에서 서열 변경이 검출된다. 또 다른 구현예에서, 삽입-결실 (indel)의 존재가 검출된다.
"검출 가능한 표지"란 관심 대상의 분자에 연결된 경우 분광측정, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단을 통해 후자가 검출되도록 하는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 유용한 표지는 방사성 동위원소, 자기 비드, 금속성 비드, 콜로이드성 입자, 형광성 염료, 전자-밀도 시약, 효소 (예를 들어, ELISA에서 통상적으로 사용되는 바와 같이), 비오틴, 디곡시게닌, 또는 합텐을 포함한다.
"질환"이란 세포, 조직 또는 기관의 정상 기능을 손상시키거나 방해하는 임의의 병태 또는 장애를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 목적하는 생물학적 반응을 유발하기에 충분한 생물학적 활성제의 양을 언급한다. 질환의 치료학적 치료를 위해 본원 개시내용을 수행하기 위해 사용되는 유효량의 활성제(들)는 투여 방식, 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 건강에 따라 달라진다. 궁극적으로, 담당 의사 또는 수의사는 적당한 양 및 투여 용법을 결정할 것이다. 상기 양은 "유효"량으로서 언급된다. 하나의 구현예에서, 유효량은 세포 (예를 들어, 시험관내 세포 또는 생체내 세포)에서 관심 대상의 유전자에 변경을 도입하기에 충분한 본원 개시내용의 염기 편집기 (예를 들어, 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질, 핵염기 편집기 및 gRNA를 포함하는 융합 단백질)의 양이다. 하나의 구현예에서, 유효량은 치료학적 효과를 달성하기 위해 (예를 들어, 질환 또는 이의 증상 또는 병태를 감소시키거나 제어하기 위해) 요구되는 염기 편집기의 양이다. 상기 치료 효과는 대상체, 조직 또는 기관의 모든 세포에서 관심 유전자를 변경하기에 충분할 필요는 없지만 대상체, 조직 또는 기관에 존재하는 세포의 약 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% 이상에서 관심 유전자를 변경하는 데만 필요하다.
"단편"이란 폴리펩타이드 또는 핵산 분자 부분을 의미한다. 상기 부분은 참조 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 전체 길이의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 포함한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 포함할 수 있다.
"가이드 RNA" 또는 "gRNA"란 표적 서열에 특이적일 수 있고 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 단백질 (예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)과 복합체를 형성할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 하나의 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 가이드 RNA (gRNA)이다. gRNA는 2개 이상의 RNA의 복합체 또는 단일 RNA 분자로서 존재할 수 있다. 단일 RNA 분자로서 존재하는 gRNA는 단일-가이드 RNA (sgRNA)로서 언급될 수 있지만, "gRNA"는 단일 분자로서 또는 2개 이상의 분자의 복합체로서 존재하는 가이드 RNA를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 전형적으로, 단일 RNA 종으로서 존재하는 gRNA는 2개의 도메인을 포함한다: (1) 표적 핵산과 상동성을 공유하는 (예를 들어, Cas9 복합체의 표적으로의 결합을 지시하는) 도메인; 및 (2) Cas9 단백질에 결합하는 도메인. 일부 구현예에서, 도메인 (2)은 tracrRNA로서 공지된 서열에 상응하고, 스템-루프 구조를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 도메인 (2)은 이의 전체 내용이 참조로 본원에 포함된 문헌 (참조: Jinek et al, Science 337:816-821(2012))에 제공된 바와 같은 tracrRNA와 동일하거나 상동성이다. gRNA의 다른 예 (예를 들어, 도메인 2를 포함하는 것들)는 "Switchable Cas9 Nucleases and Uses Thereof" 표제의 2013년 9월 6일자로 출원된 미국 가특허 출원 U.S.S.N 제61/874,682호 및 "Delivery System For Functional Nucleases" 표제의 2013년 9월 6일자로 출원된 미국 가특허 출원 U.S.S.N. 제61/874,746호에서 찾을 수 있고, 각각의 전체 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, gRNA는 2개 이상의 도메인 (1) 및 (2)를 포함하고, "연장된 gRNA"로서 언급될 수 있다. 연장된 gRNA는 본원에 기재된 바와 같이, 2개 이상의 Cas9 단백질에 결합하고 2개 이상의 특유한 영역에서 표적 핵산에 결합할 것이다. gRNA는 표적 부위와 상보체를 형성하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이는 뉴클레아제/RNA 복합체의 상기 표적 부위로의 결합을 매개하여 뉴클레아제:RNA 복합체의 서열 특이성을 제공한다.
"이종이량체"란 야생형 TadA 도메인 및 TadA 도메인의 변이체 (예를 들어, TadA*8) 또는 2개의 변이체 TadA 도메인 (예를 들어, TadA*7.10 및 TadA*8 또는 2개의 TadA*8 도메인)과 같은 2개의 도메인을 포함하는 융합 단백질을 의미한다.
"하이드리드화"는 상보적 핵염기 간의 왓슨-크릭, 후그스틴 또는 역의 (reversed) 후그스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합을 의미한다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 형성하는 상보적 핵염기이다.
용어 "염기 복구의 저해제" 또는 "IBR"은 핵산 복구 효소, 예를 들어, 염기 절제 복구 (BER) 효소의 활성을 저해할 수 있는 단백질을 언급한다. 일부 구현예에서, IBR은 이노신 염기 절제 복구의 저해제이다. 염기 복구의 예시적인 저해제는 APE1, Endo III, Endo IV, Endo V, Endo VIII, Fpg, hOGGl, hNEILl, T7 Endol, T4PDG, UDG, hSMUGl, 및 hAAG의 저해제를 포함한다. 일부 구현예에서, IBR은 Endo V 또는 hAAG의 저해제이다. 일부 구현예에서, IBR은 촉매 불활성 EndoV 또는 촉매 불활성 hAAG이다. 일부 구현예에서, 염기 복구 저해제는 Endo V 또는 hAAG의 저해제이다. 일부 구현예에서, 염기 복구 저해제는 촉매 불활성 EndoV 또는 촉매 불활성 hAAG이다.
일부 구현예에서, 염기 복구 저해제는 우라실 글리코실라제 저해제 (UGI)이다. UGI는 우라실-DNA 글리코실라제 염기-절제 복구 효소를 저해할 수 있는 단백질을 언급한다. 일부 구현예에서, UGI 도메인은 야생형 UGI 또는 야생형 UGI의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 UGI 단백질은 UGI 또는 UGI 단편과 상동성인 UGI 및 단백질의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 복구 저해제는 이노신 염기 절제 복구의 저해제이다. 일부 구현예에서, 염기 복구 저해제는 "촉매 불활성 이노신 특이적 뉴클레아제" 또는 "데드 이노신 특이적 뉴클레아제"이다. 임의의 특정 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, 촉매 불활성 이노신 글리코실라제 (예를 들어, 알킬 아데닌 글리코실라제 (AAG))는 이노신에 결합할 수 있지만 무염기 부위를 생성할 수 없거나 이노신을 제거할 수 있어 새롭게 형성된 이노신 잔기를 DNA 손상/복구 기전으로부터 입체적으로 차단할 수 있다. 일부 구현예에서, 촉매 불활성 이노신 특이적 뉴클레아제는 핵산 내 이오신에 결합할 수 있지만 핵산을 절단하지 못한다. 비제한적 예시의 촉매 불활성 이노신 특이적 뉴클레아제는 예를 들어, 인간으로부터의 촉매 불활성 알킬 아데노신 글리코실라제 (AAG 뉴클레아제), 및 예를 들어, 이. 콜리로부터의 촉매 불활성 엔도뉴클레아제 V (EndoV 뉴클레아제)를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매 불활성 AAG 뉴클레아제는 또 다른 AAG 뉴클레아제 내 E125Q 돌연변이 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다.
"증가시킨다"란 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 양성 변경을 의미한다.
"인테인 (intein)"은 그 자체를 절개할 수 있고 단백질 스플라이싱으로서 공지된 공정에서 나머지 단편 (익스테인 (extein))을 펩타이드 결합으로 연결할 수 있는 단백질의 단편이다. 인테인은 또한 "단백질 인트론"으로서 언급된다. 단백질 자체를 절개하고 나머지 부분을 연결하는 인테인의 공정은 본원에서 "단백질 스플라이싱" 또는 "인테인-매개된 단백질 스플라이싱"으로 호칭된다. 일부 구현예에서, 전구체 단백질의 인테인 (인테인-매개된 단백질 스플라이싱 전 단백질을 함유하는 인테인)은 2개의 유전자로부터 기원한다. 상기 인테인은 본원에서 스플릿 인테인 (예를 들어, 스플릿 인테인-N 및 스플릿 인테인-C)으로서 언급된다. 예를 들어, 시아노박테리아에서 DNA 폴리머라제 III의 촉매 서브뉴닛인 DnaE는 2개의 별도의 유전자 dnaE-n 및 dnaE-c에 의해 암호화되어 있다. dnaE-n 유전자에 의해 암호화된 인테인은 본원에서 "인테인-N"으로서 언급될 수 있다. dnaE-c 유전자에 의해 암호화된 인테인은 본원에서 "인테인-C"로서 언급될 수 있다.
다른 인테인 시스템이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, dnaE 인테인, Cfa-N (예를 들어, 스플릿 인테인-N) 및 Cfa-C (예를 들어, 스플릿 인테인-C) 인테인 쌍을 기반으로 하는 합성 인테인이 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 (참조: Stevens et al., J Am Chem Soc. 2016 Feb. 24; 138(7):2162-5), 본원에 참조로 포함됨). 본원 개시내용에 따라 사용될 수 있는 인테인 쌍의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: Cfa DnaE 인테인, Ssp GyrB 인테인, Ssp DnaX 인테인, Ter DnaE3 인테인, Ter ThyX 인테인, Rma DnaB 인테인 및 Cne Prp8 인테인 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제8,394,604호에 기재되어 있음).
인테인의 예시적인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 제공된다.
DnaE 인테인-N DNA:
Figure pct00071
DnaE 인테인-N 단백질:
Figure pct00072
DnaE 인테인-C DNA:
Figure pct00073
인테인-C:
Figure pct00074
Cfa-N DNA:
Figure pct00075
Cfa-N 단백질:
Figure pct00076
Cfa-C DNA:
Figure pct00077
Cfa-C 단백질:
Figure pct00078
인테인-N 및 인테인-C는 각각 스플릿 Cas9의 N-말단 부분 및 스플릿 Cas9의 C-말단 부분의 연결을 위해 스플릿 Cas9의 N-말단 부분 및 스플릿 Cas9의 C-말단 부분에 융합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인테인-N은 스플릿 Cas9의 N-말단 부분의 C-말단에 융합되어, 즉, N--[스플릿 Cas9의 N-말단 부분]-[인테인-N]--C의 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 인테인-C는 스플릿 Cas9의 C-말단 부분의 N-말단에 융합되어, 즉, N-[인테인-C]--[스플릿 Cas9의 C-말단 부분]-C의 구조를 형성한다. 인테인이 융합된 단백질 (예를 들어, 스플릿 Cas9)을 연결하기 위한 인테인 매개된 단백질의 기전은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 (참조: Shah et al., Chem Sci. 2014; 5(1):446-461)에 기재되어 있다. 인테인을 디자인하고 사용하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, WO2014004336, WO2017132580, US20150344549, 및 US20180127780에 기재되어 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
용어 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 이의 고유 상태에서 발견된 바와 같이 정상적으로 여기에 수반되는 성분들로부터 다양한 정도로 유리된 물질을 언급한다. "단리물"은 본래의 공급원 또는 주변으로부터 분리 정도를 지칭한다. "정제한다"는 단리 보다 높은 분리 정도를 지칭한다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 다른 물질이 상당히 제거되어 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 성질에 실질적으로 영향을 미치지 않거나 다른 부작용을 유발하지 않는다. 즉, 본원 개시내용의 핵산 또는 펩타이드는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 경우 세포 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 상당히 제거된 경우 정제된다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기술, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 필수적으로 하나의 밴드를 생성함을 지칭할 수 있다. 변형, 예를 들어, 인산화 또는 당화에 적용될 수 있는 단백질에 대해, 상이한 변형은 상이한 단리된 단백질을 생성할 수 있고 이들은 별도로 정제될 수 있다.
"단리된 폴리뉴클레오타이드"란 본원 개시내용의 핵산 분자가 유래된 천연적으로 발생하는 유기체의 게놈에서 유전자를 플랭킹하는 유전자가 제거된 핵산 (예를 들어, DNA)을 의미한다. 따라서, 용어는, 예를 들어, 벡터로; 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스; 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA로 혼입되거나, 다른 서열과 무관하게 별도의 분자 (예를 들어, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 추가로, 용어는 추가의 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA 뿐만 아니라 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자를 포함한다.
"단리된 폴리펩타이드"란 천연적으로 여기에 수반되는 성분으로부터 분리된 본원 개시내용의 폴리펩타이드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩타이드는 단백질 및 천연적으로 연합된 천연적으로 발생하는 유기 분자로부터 적어도 60 중량%로 제거된 경우 단리된다. 바람직하게는, 상기 제제는 적어도 75 중량%, 보다 바람직하게 적어도 90 중량%, 및 가장 바람직하게 적어도 99 중량%의 본원 개시내용의 폴리펩타이드이다. 본원 개시내용의 단리된 폴리펩타이드는 예를 들어, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 상기 단백질을 화학적으로 합성함에 의해 천연 공급원으로부터의 추출에 의해 수득될 수 있다. 순도는 임의의 적당한 방법, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "링커"는 공유 링커 (예를 들어, 공유 결합), 비-공유 링커, 화학적 그룹, 또는 2개의 분자 또는 모이어티를 연결하는 분자, 예를 들어, 단백질 복합체 또는 리보뉴클레오 복합체의 2개의 성분, 또는 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인 (예를 들어, dCas9) 및 데아미나제 도메인과 같은, 융합 단백질의 2개의 도메인 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제, 참조: PCT/US2019/044935, PCT/US2020/016288, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 언급할 수 있다. 링커는 염기 편집기 시스템의 상이한 성분 또는 성분의 상이한 부분을 연결할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 링커는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인의 가이드 폴리뉴클레오타이드 결합 도메인, 및 데아미나제의 촉매 도메인을 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 CRISPR 폴리펩타이드와 데아미나제를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 Cas9와 데아미나제를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 dCas9와 데아미나제를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 nCas9와 데아미나제를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 가이드 폴리뉴클레오타이드와 데아미나제를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 염기 편집기 시스템의 탈아민화 성분과 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 성분을 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 염기 편집기 시스템의 탈아민화 성분의 RNA-결합 부분과 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 성분을 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 염기 편집기 시스템의 탈아민화 성분의 RNA-결합 부분과 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 성분의 RNA-결합 부분을 연결할 수 있다. 링커는 2개의 그룹, 분자 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나 이에 의해 플랭킹되고, 공유 결합 또는 비-공유 상호작용을 통해 각각 하나에 연결됨에 따라 2개를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 유기 분자, 그룹, 중합체, 또는 화학적 모이어티일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 DNA 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 RNA 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 리간드에 결합할 수 있는 압타머를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 탄수화물, 펩타이드, 단백질 또는 핵산일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 리보스위치로부터 유래할 수 있는 압타머를 포함할 수 있다. 압타머가 유래하는 리보스위치는 테오필린 리보스위치, 티아민 피로포스페이트 (TPP) 리보스위치, 아데노신 코발라민 (AdoCbl) 리보스위치, S-아데노실 메티오닌 (SAM) 리보스위치, SAH 리보스위치, 플라빈 모노뉴클레오타이드 (FMN) 리보스위치, 테트라하이드로폴레이트 리보스위치, 라이신 리보스위치, 글라이신 리보스위치, 퓨린 리보스위치, GlmS 리보스위치, 또는 프레-쿠에오신1 (PreQ1) 리보스위치로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리펩타이드 또는 단백질 도메인, 예를 들어, 폴리펩타이드 리간드에 결합된 압타머를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 리간드는 K 상동성 (KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 무균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인지 모티프일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 리간드는 염기 편집기 시스템 성분의 일부일 수 있다. 예를 들어, 핵염기 편집 성분은 데아미나제 도메인 및 RNA 인지 모티프를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 아미노산 또는 다수의 아미노산 (예를 들어, 펩타이드 또는 단백질)일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 약 5-100개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 또는 90-100개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 약 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 또는 450-500개 아미노산 길이일 수 있다. 보다 길거나 짧은 링커가 또한 고려될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 Cas9 뉴클레아제 도메인을 포함하는 RNA 프로그래밍 가능한 뉴클레아제의 gRNA 결합 도메인과 핵산 편집 단백질 (예를 들어, 아데노신 데아미나제)의 촉매 도메인을 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 dCas9와 핵산 편집 단백질을 연결한다. 예를 들어, 링커는 2개의 그룹, 분자 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나 이에 의해 플랭킹되고 공유 결합을 통해 각각 하나에 연결됨에 따라 2개를 연결한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 아미노산 또는 다수의 아미노산 (예를 들어, 펩타이드 또는 단백질)이다. 일부 구현예에서, 링커는 유기 분자, 그룹, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 구현예에서, 링커는 5-200개 아미노산 길이, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35, 45, 50, 55, 60, 60, 65, 70, 70, 75, 80, 85, 90, 90, 95, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 175, 180, 190, 또는 200개 아미노산 길이이다. 더 길거나 더 짧은 링커가 또한 고려된다.
일부 구현예에서, 핵염기 편집기의 도메인은 SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, 또는 GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS의 아미노산 서열을 포함하는 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집기의 도메인은 또한 XTEN 링커로서 언급될 수 있는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES를 포함하는 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 (SGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n, (G)n, (EAAAK)n, (GGS)n, SGSETPGTSESATPES, 또는 (XP)n 모티프, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 여기서, n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이고, X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다.
일부 구현예에서, 링커는 24개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 40개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 64개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGS SGGS를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 92개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS를 포함한다.
"마커"란 질환 또는 장애와 연관된 발현 수준 또는 활성이 변경된 임의의 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열 내 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 서열 내 하나 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 언급한다. 돌연변이는 전형적으로 본원에서 본래의 잔기에 이어서 서열 내 잔기의 위치를 표시하고 새롭게 치환된 잔기를 확인하여 기재된다. 본원에 제공된 아미노산 치환 (돌연변이)을 제조하기 위한 다양한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 예를 들어, 문헌 (참조: Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th　ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 현재 개시된 염기 편집기는 의도되지 않은 점 돌연변이와 같은, 상당수의 의도되지 않은 돌연변이 없이 핵산 (예를 들어, 대상체의 게놈 내 핵산) 내 점 돌연변이와 같은 "의도된 돌연변이"를 효율적으로 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 의도된 돌연변이를 생성하도록 특이적으로 디자인된, 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, gRNA)에 결합하는 특이적 염기 편집기 (예를 들어, 아데노신 염기 편집기)에 의해 생성되는 돌연변이이다.
일반적으로, 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열)에서 만들어지거나 동정된 돌연변이는 참조 (또는 야생형) 서열, 즉, 돌연변이를 함유하지 않는 서열에 상대적으로 넘버링된다. 당업자는 참조 서열에 상대적으로 아미노산 및 핵산 서열에서 돌연변이의 위치를 결정하는 법을 용이하게 이해할 것이다.
용어 "비-보존성 돌연변이"는 상이한 그룹 간 아미노산 치환, 예를 들어, 라이신의 트립토판으로의 치환, 또는 페닐알라닌의 세린으로의 치환 등을 포함한다. 이 경우에, 비-보존성 아미노산 치환은 기능성 변이체의 생물학적 활성을 방해하지 않도록 또는 저해하지 않도록 하는 것이 바람직하다. 비-보존성 아미노산 치환은 기능성 변이체의 생물학적 활성을 증진시켜 상기 기능성 변이체의 생물학적 활성이 야생형 단백질과 비교하여 증가될 수 있다.
용어 "핵 국소화 서열", "핵 국소화 신호" 또는 "NLS"는 세포 핵으로의 단백질의 도입을 촉진시키는 아미노산 서열을 언급한다. 핵 국소화 서열은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 플랭크 등 (Plank et al.)의 2000년 11월 23일에 출원된 국제 PCT 출원 번호 PCT/EP2000/011690에 기재되고 2001년 5월 31일에 WO/2001/038547로 공개되어 있으며, 이의 내용이 예시적인 핵 국소화 서열의 이들의 기재를 위해 본원에 참조로 포함된다. 다른 구현예에서, NLS는 예를 들어, 문헌 (참조: Koblan et al., Nature Biotech. 2018 doi:10.1038/nbt.4172)에 기재된 최적화된 NLS이다. 일부 구현예에서, NLS는 KRTADGSEFESPKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, KKTELQTTNAENKTKKL, KRGINDRNFWRGENGRKTR, RKSGKIAAIVVKRPRK, PKKKRKV, 또는 MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 핵염기 및 산성 모이어티, 예를 들어, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 중합체를 포함하는 화합물을 언급한다. 전형적으로, 중합체 핵산, 예를 들어, 3개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자는 선형 분자이고, 여기서, 인접 뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 연결을 통해 서로 연결된다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기 (예를 들어. 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오사이드)를 언급한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 3개 이상의 개별 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 쇄를 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 중합체 (예를 들어, 적어도 3개의 뉴클레오타이드 스트링)를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, "핵산"은 단일 및/또는 이중 가닥 DNA 뿐만 아니라 RNA를 포함한다. 핵산은 예를 들어, 게놈, 전사체, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, snRNA, 플라스미드, 코스미드, 염색체, 염색분체, 또는 다른 천연적으로 발생하는 핵산 분자와 관련하여 천연적으로 존재할 수 있다. 한편, 핵산 분자는 비천연적으로 발생하는 분자, 예를 들어, 재조합 DNA 또는 RNA, 인공 염색체, 가공된 게놈, 또는 이의 단편, 또는 합성 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드일 수 있거나, 비-천연적으로 발생하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 포함한다. 추가로, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사 용어는 핵산 유사체, 예를 들어, 포스포디에스테르 골격과는 다른 것을 갖는 유사체를 포함한다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성되고, 임의로 정제되고, 화학적으로 합성될 수 있다. 경우에 따라, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우에, 핵산은 화학적으로 변형된 염기 또는 당 및 골격 변형을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 지적되지 않는 경우 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 뉴클레오사이드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오사이드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예를 들어, 메틸화된 염기); 인터컬레이팅된 염기; 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 그룹 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미디트 결합)이거나 이들을 포함한다.
용어 "핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질" 또는 "napDNAbp"는 "폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인"과 상호교환적으로 사용되어 상기 napDNAbp를 특이적 핵산 서열에 가이드하는 가이드 핵산 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, gRNA)와 같은 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)과 연합된 단백질을 언급할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 RNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 Cas9 단백질이다. Cas9 단백질은 Cas9 단백질을, 가이드 RNA와 상보적인 특이적 DNA 서열로 가이드하는 가이드 RNA와 연합될 수 있다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas9 도메인, 예를 들어, 뉴클레아제 활성 Cas9, Cas9 닉카제 (nCas9), 또는 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9)이다. 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질의 비제한적인 예는 Cas9 (예를 들어, dCas9 및 nCas9), Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i를 포함한다. Cas 효소의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9 (또한 Csn1 또는 Csx12로서 공지된), Cas10, Cas10d, Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csx11, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, II형 Cas 이펙터 단백질, V형 Cas 이펙터 단백질, VI형 Cas 이펙터 단백질, CARF, DinG, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 또는 가공된 버전을 포함한다. 다른 핵산 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 또한 본원 개시내용의 범위 내에 있지만, 이들은 구체적으로 본원 개시내용에 열거되지 않을 수 있다. 예를 들어, 문헌 (참조: Makarova et al. "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?" CRISPR J. 2018 Oct;1:325-336. doi: 10.1089/crispr.2018.0033; Yan et al., "Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems" Science. 2019 Jan 4;363(6422):88-91. doi: 10.1126/science.aav7271)을 참조하고, 이의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 상호교환적으로 사용되는 용어 "핵염기", "질소성 염기" 또는 "염기"는 뉴클레오타이드의 성분인 뉴클레오사이드를 형성하는 질소-함유 생물학적 화합물을 언급한다. 핵염기가 염기쌍을 형성하고 하나가 또 다른 하나에 스택킹하는 능력은 직접적으로 리보핵산 (RNA)과 데옥시리보핵산 (DNA)와 같은 장쇄 나선 구조를 유도한다. 5개 핵염기 - 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T), 및 우라실 (U)은 1차 또는 카노니칼로 불리운다. 아데닌 및 구아닌은 퓨린으로부터 유래하고, 시토신, 우라실, 및 티민은 피리미딘으로부터 유래한다. DNA 및 RNA는 또한 변형된 다른 (비-1차) 염기를 함유할 수 있다. 비제한적인 예시적 변형된 핵염기는 하이포크산틴, 크산틴, 7-메틸구아닌, 5,6-디하이드로우라실, 5-메틸시토신 (m5C), 및 5-하이드로메틸시토신을 포함할 수 있다. 하이포크산틴 및 크산틴은 돌연변이 유발제를 통해 생성될 수 있고 이들 둘 다는 탈아민화 (아민 그룹의 카보닐 그룹으로의 대체)를 통해서 생성될 수 있다. 하이포크산틴은 아데닌으로부터 변형될 수 있다. 크산틴은 구아닌으로부터 변형될 수 있다. 우라실은 시토신의 탈아민화로부터 비롯될 수 있다. "뉴클레오사이드"는 핵염기 및 5개 탄소 당 (리보스 또는 데옥시리보스)으로 이루어진다. 뉴클레오사이드의 예는 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘, 5-메틸우리딘 (m5U), 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 데옥시우리딘 및 데옥시시티딘을 포함한다. 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오사이드의 예는 이노신 (I), 크산토신 (X), 7-메틸구아노신 (m7G), 디하이드로우리딘 (D), 5-메틸시티딘 (m5C), 및 슈도우리딘 (Ψ)을 포함한다. "뉴클레오타이드"는 핵염기, 5개 탄소 당 (리보스 또는 데옥시리보스) 및 적어도 하나의 포스페이트 그룹으로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵염기 편집 도메인" 또는 "핵염기 편집 단백질"은 RNA 또는 DNA에서 핵염기 변형, 예를 들어, 시토신 (또는 시티딘)의 우라실 (또는 우리딘) 또는 티민 (또는 티미딘)으로의 그리고 아데닌 (또는 아데노신)의 하이포크산틴 (또는 이노신)으로의 탈아민화, 및 비-주형 뉴클레오타이드 부가 및 삽입을 촉매할 수 있는 단백질 또는 효소를 언급한다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 데아미나제 도메인 (예를 들어, 아데닌 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제)이다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 하나 초과의 데아미나제 도메인 (예를 들어, 아데노신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 또는 시토신 데아미나제)이다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 천연적으로 발생하는 핵염기 편집 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 천연적으로 발생하는 핵염기 편집 도메인으로부터 가공되거나 변화된 핵염기 편집 도메인일 수 있다. 핵염기 편집 도메인은 임의의 유기체, 예를 들어, 세균, 인간, 침팬지, 고릴라, 몽키, 소, 개, 래트, 또는 마우스로부터 기원할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "제제를 수득하는"에서와 같이 "수득하는"은 합성, 구매, 또는 다르게 제제를 획득하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "환자" 또는 "대상체"는 질환 또는 장애를 앓는 것으로 진단되거나, 질환 또는 장애를 갖거나 발병할 위험에 있거나 질환 또는 장애를 갖거나 발병한 것으로 의심되는 포유동물 대상체 또는 개체를 언급한다. 일부 구현예에서, 용어 "환자"는 질환 또는 장애가 발병할 평균 확률보다 높은 포유동물 대상체를 언급한다. 예시적인 환자는 인간, 비-인간 영장류, 고양이, 개, 돼지, 소, 고양이, 말, 낙타, 라마 (llama), 염소, 양, 설치류 (예를 들어, 마우스, 토끼, 래트 또는 기니아 피그) 및 본원에 기재된 치료요법이 이득이 될 수 있는 다른 포유류일 수 있다. 예시적인 인간 환자는 남성이고/이거나 여성일 수 있다.
"이를 필요로 하는 환자" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 질환 또는 장애로 진단되거나, 이의 위험에 처하거나, 이를 갖거나, 가질 것으로 미리 결정되거나, 또는 가질 것으로 의심되는 환자로서 본원에서 언급된다.
용어 "병원성 돌연변이", "병원성 변이체", 질환 유발 돌연변이", "질환 유발 변이체", "해로운 돌연변이" 또는 "소인 돌연변이"는 특정 질환 또는 장애에 대한 개체의 민감성 또는 소인을 증가시키는 유전학적 변경 또는 돌연변이를 언급한다. 일부 구현예에서, 병원성 돌연변이는 유전자에 의해 암호화된 단백질에서 적어도 하나의 병원성 아미노산에 의해 치환된 적어도 하나의 야생형 아미노산을 포함한다.
용어 "단백질", "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 이들의 문법적 등가물은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 펩타이드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 언급한다. 상기 용어는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 언급한다. 전형적으로, 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 개별 단백질 또는 단백질 집합체를 언급할 수 있다. 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 내 하나 이상의 아미노산은 탄수화물 그룹, 하이드록실 그룹, 포스페이트 그룹, 파르네실 그룹, 이소파르네실 그룹, 지방산 그룹, 접합, 기능성화 또는 다른 변형 등을 위한 링커와 같은 화학적 실체의 부가에 의해 변형될 수 있다. 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 또한 단일 분자일 수 있거나 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩타이드, 또는 폴리펩타이드는 단지 천연적으로 발생하는 단백질 또는 펩타이드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 천연적으로 발생하거나, 재조합이거나 합성이거나 이의 임의의 조합일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 적어도 2개의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 하이브리드 폴리펩타이드를 언급한다. 하나의 단백질은 융합 단백질의 아미노 말단 (N-말단) 부분에 또는 카복시 말단 (C-말단) 단백질에 위치함에 따라서 각각 아미노 말단 융합 단백질 또는 카복시 말단 융합 단백질을 형성할 수 있다. 단백질은 상이한 도메인, 예를 들어, 핵산 결합 도메인 (예를 들어, 단백질의 결합을 표적 부위로 지시하는 Cas9의 gRNA 결합 도메인) 및 핵산 편집 단백질의 핵산 절단 도메인 또는 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 단백질성 부분, 예를 들어, 핵산 결합 도메인을 구성하는 아미노산 서열, 및 유기 화합물, 예를 들어, 핵산 절단 제제로서 작용할 수 있는 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA와 복합체로 존재하거나 이와 연합되어 있다. 본원에 제공된 임의의 단백질은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 단백질은 특히 펩타이드 링커를 포함하는 융합 단백질에 적합한 재조합 단백질 발현 및 정제를 통해 생성될 수 있다. 재조합 단백질 발현 및 정제를 위한 방법은 널리 공지되어 있고, 문헌 (참조: Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))에 기재된 것들을 포함하고, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로 포함된다.
본원에 기재된 폴리펩타이드 및 단백질 (기능성 부분 및 이의 기능성 변이체 포함)은 하나 이상의 천연적으로 발생하는 아미노산 대신 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 합성 아미노산은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 아미노사이클로헥산 카복실산, 노르류신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글라이신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글라이신, 인돌린-2-카복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-라이신, N',N'-디벤질-라이신, 6-하이드록시라이신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카복실산, α-아미노사이클로헥산 카복실산, α-아미노사이클로헵탄 카복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌 및 α-3급-부틸글라이신을 포함한다. 폴리펩타이드 및 단백질은 폴리펩타이드 작제물의 하나 이상의 아미노산의 해독 후 변형과 관련될 수 있다. 해독 후 변형의 비제한적인 예는 인산화, 아세틸화 및 포밀화를 포함하는 아실화, 글리코실화 (N-연결된 및 O-연결된), 아미드화, 하이드록실화, 메틸화 및 에틸화를 포함하는 알킬화, 유비퀴틸화, 피롤리돈 카복실산의 부가, 디설파이드 브릿지의 형성, 황화, 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화, 파르네실화, 게라닐화, 글리피화 (glypiation), 지질화 및 요오드화를 포함한다.
단백질 또는 핵산과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합체"는 천연적으로 발생하지 않지만 인간 가공 생성물인 단백질 또는 핵산을 언급한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 단백질 또는 핵산 분자는 임의의 천연적으로 발생하는 서열과 비교하여 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개 돌연변이를 포함하는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"감소시킨다"란 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 음성 변경을 의미한다.
"참조"란 표준 또는 대조군 조건을 의미한다. 하나의 구현예에서, 참조는 야생형 또는 건강한 세포이다. 다른 구현예에서 및 제한 없이, 참조는 시험 조건에 적용되지 않거나, 위약 또는 정규 식염수, 배지, 완충액 및/또는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 함유하지 않는 대조군 벡터에 적용된 비처리된 세포이다.
"참조 서열"은 서열 비교용 기준으로서 사용되는 한정된 서열이다. 참조 서열은 특정 서열; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 분절, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열의 서브세트 또는 전체일 수 있다. 폴리펩타이드에 대해, 참조 폴리펩타이드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16개 아미노산, 적어도 약 20개 아미노산, 적어도 약 25개 아미노산, 약 35개 아미노산, 약 50개 아미노산 또는 약 100개 아미노산이다. 핵산에 대해, 참조 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50개 뉴클레오타이드, 적어도 약 60개 뉴클레오타이드, 적어도 약 75개 뉴클레오타이드, 약 100개 뉴클레오타이드 또는 약 300개 뉴클레오타이드 또는 이에 대한 또는 이들 사이의 임의의 정수이다. 일부 구현예에서, 참조 서열은 관심 대상의 단백질의 야생형 서열이다. 다른 구현예에서, 참조 서열은 야생형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
용어 "RNA-프로그래밍 가능한 뉴클레아제" 및 "RNA-가이드된 뉴클레아제"는 절단을 위한 표적이 아닌 하나 이상의 RNA(들)와 함께 (예를 들어, ~와 결합하거나 연합된) 사용된다. 일부 구현예에서, RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제는 RNA와 복합체로 있는 경우 뉴클레아제:RNA 복합체로서 언급될 수 있다. 전형적으로, 결합된 RNA(들)는 가이드 RNA (gRNA)로서 언급된다. gRNA는 2개 이상의 RNA 복합체로서 또는 단일 RNA 분자로서 존재할 수 있다. 단일 RNA 분자로서 존재하는 gRNA는 단일-가이드 RNA (sgRNA)로서 언급될 수 있지만 "gRNA"는 단일 분자로서 또는 2개 이상의 분자의 복합체로서 존재하는 가이드 RNA를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 전형적으로, 단일 RNA 종으로서 존재하는 gRNA는 2개의 도메인을 포함한다: (1) 표적 핵산과 상동성을 공유하는 (예를 들어, Cas9 복합체의 표적으로의 결합을 지시하는) 도메인; 및 (2) Cas9 단백질에 결합하는 도메인. 일부 구현예에서, 도메인 (2)은 tracrRNA로서 공지된 서열에 상응하고, 스템-루프 구조를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 도메인 (2)은 이의 전체 내용이 참조로 본원에 포함된 문헌 (참조: Jinek et ah, Science 337:816-821(2012))에 제공된 바와 같은 tracrRNA와 동일하거나 상동성이다. gRNA의 다른 예 (예를 들어, 도메인 2를 포함하는 것들)는 "Switchable Cas9 Nucleases and Uses Thereof" 표제의 2013년 9월 6일자로 출원된 미국 가특허 출원 U.S.S.N 제61/874,682호 및 "Delivery System For Functional Nucleases" 표제의 2013년 9월 6일자로 출원된 미국 가특허 출원 U.S.S.N. 제61/874,746호에서 찾을 수 있고, 각각의 전체 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, gRNA는 2개 이상의 도메인 (1) 및 (2)를 포함하고, "연장된 gRNA"로서 언급될 수 있다. 예를 들어, 연장된 gRNA는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 2개 이상의 Cas9 단백질에 결합하고 2개 이상의 특유한 영역에서 표적 핵산에 결합한다. gRNA는 표적 부위와 상보체를 형성하는 핵산 서열을 포함하고, 이는 뉴클레아제/RNA 복합체의 상기 표적 부위로의 결합을 매개하여 뉴클레아제:RNA 복합체의 서열 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, RNA-프로그래밍 가능한 뉴클레아제는 (CRISPR-연합된 시스템) Cas9 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9 (Csnl)이다 (참조: 예를 들어, "Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)).
RNA-프로그래밍 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)는 DNA 절단 부위를 표적화하기 위해 RNA:DNA 하이브리드화를 사용하기 때문에, 이들 단백질은 원칙적으로 가이드 RNA에 의해 특정된 임의의 서열에 표적화될 수 있다. 부위-특이적 절단을 위해 (예를 들어, 게놈을 변형시키기 위해) Cas9와 같은 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제를 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Cong, L. et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P. et ah, RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013); Hwang, W.Y. et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013); Jinek, M. et ah, RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al., Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013); Jiang, W. et ah RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013); 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).
용어 "단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP)"는 게놈 내 특정 위치에 존재하는 단일 뉴클레오타이드에서의 변화이고, 여기서, 각각의 변화는 집단 내 일부 감지할 수 있는 정도 (예를 들어, > 1%)로 존재한다. 예를 들어, 인간 게놈 내 특정 염기 위치에서, C 뉴클레오타이드는 대부분의 개체에서 나타나지만 소수의 개체에서 나타날 수 있고, 상기 위치는 A에 의해 점유된다. 이것은 상기 특정 위치에서 SNP가 있음을 의미하고 2개의 가능한 뉴클레오타이드 변화, C 또는 A는 상기 위치에 대해 대립유전자인 것으로 일컬어진다. SNP는 질환에 대한 민감성에서의 차이를 뒷받침한다. 질병의 중증도 및 우리의 신체가 치료에 응답하는 방식은 또한 유전학적 변화를 나타낸다. SNP는 유전자의 암호화 영역, 유전자의 비-암호화 영역 내 또는 유전자 간 영역 (유전자 사이의 영역) 내에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 암호화 서열 내 SNP는 필수적으로 유전학적 코드의 축퇴성으로 인해 생성된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. 암호화 영역 내 SNP는 2개의 유형: 인접하거나 인접하지 않은 SNP이다. 유사한 SNP는 단백질 서열에 영향을 주지 않고, 인접하지 않은 SNP는 단백질의 아미노산 서열을 변화시킨다. 인접하지 않은 SNP는 2개 유형: 미스센스 및 넌센스이다. 단백질-암호화 영역 내에 있지 않은 SNP는 여전히 유전자 스플라이싱, 전사 인자 결합, 전령 RNA 분해 또는 비암호화 RNA의 서열에 영향을 미칠 수 있다. 상기 유형의 SNP에 의해 영향받은 유전자 발현은 eSNP (발현 SNP)로서 언급되고, 유전자로부터 업스트림 또는 다운스트림에 있을 수 있다. 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV)는 빈도의 어떠한 제한 없이 단일 뉴클레오타이드에서의 변화이고 체세포에서 발생할 수 있다. 체세포 단일 뉴클레오타이드 변화는 또한 단일 뉴클레오타이드 변경으로 호칭될 수 있다.
"특이적으로 결합한다"란 핵산 분자, 폴리펩타이드, 또는 이의 복합체 (예를 들어, 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질, 가이드 핵산), 본원 개시내용의 폴리펩타이드 및/또는 핵산 분자를 인지하고 결합하는 화합물 또는 분자를 의미하지만, 이는 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인지하지 못하고 결합하지 않는다.
본원 개시내용의 방법에 유용한 핵산 분자는 본원 개시내용의 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 상기 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낸다. 내인성 서열과 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 이중 가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 하이브리드화할 수 있다. 본원 개시내용의 방법에 유용한 핵산 분자는 본원 개시내용의 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 상기 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열과 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 이중 가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 하이브리드화할 수 있다. "하이브리드화한다"란 다양한 엄중 조건하에서 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 유전자) 또는 이의 일부 간에 쌍을 이루어 이중 가닥 분자를 형성함을 의미한다. (참조: 예를 들어, Wahl, G. M. and S. L. BERger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507).
예를 들어, 엄중 염 농도는 통상적으로 약 750 mM 미만의 NaCl 및 75 mM의 삼나트륨 시트레이트, 바람직하게 약 500 mM 미만의 NaCl 및 50 mM 삼나트륨 시트레이트 및 보다 바람직하게 약 250 mM 미만의 NaCl 및 25 mM의 삼나트륨 시트레이트일 것이다. 낮은 엄중 하이브리드화는 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 부재하에 수득될 수 있고, 높은 엄중 하이브리드화는 적어도 약 35% 포름아미드 및 보다 바람직하게 적어도 약 50% 포름아미드의 존재하에 수득될 수 있다. 엄중 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 30℃, 보다 바람직하게 적어도 약 37℃, 및 가장 바람직하게 적어도 약 42℃의 온도를 포함한다. 다양한 추가의 파라미터, 예를 들어, 하이브리드화 시간, 세제의 농도, 예를 들어, 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 및 캐리어 DNA의 내포 또는 배제는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 다양한 수준의 엄중도는 필요한 만큼 이들 다양한 조건을 조합함에 의해 성취된다. 하나의 구현예에서, 하이브리드화는 750 mM NaCl, 75 mM 삼나트륨 시트레이트 및 1% SDS에서 30℃에서 수행할 것이다. 또 다른 구현예에서, 하이브리드화는 500 mM NaCl, 50 mM 삼나트륨 시트레이트, 1% SDS, 35% 포름아미드, 및 100 μg/ml의 변성된 연어 정자 DNA (ssDNA)에서 37℃에서 수행할 것이다. 또 다른 구현예에서, 하이브리드화는 250 mM NaCl, 25 mM 삼나트륨 시트레이트, 1% SDS, 50% 포름아미드, 및 200 μg/ml ssDNA에서 42℃에서 수행할 것이다. 이들 조건에 대한 유용한 변화는 당업자에게 용이하게 자명할 것이다.
대부분의 적용을 위해, 하이브리드화에 이어서 세척 단계는 또한 엄중도에서 다양할 것이다. 세척 엄중 조건은 염 농도 및 온도에 의해 한정될 수 있다. 상기와 같이, 세척 엄중도는 염 농도를 감소시킴에 의해 또는 온도를 증가시킴에 의해 증가될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계를 위한 엄중 염 농도는 바람직하게 약 30 mM 미만의 NaCl 및 3 mM의 삼나트륨 시트레이트 및 가장 바람직하게 약 15 mM 미만의 NaCl 및 1.5 mM 삼나트륨 시트레이트이다. 세척 단계를 위한 엄중 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 25℃, 보다 바람직하게 적어도 약 42℃, 및 보다 더 바람직하게 적어도 약 68℃의 온도를 포함한다. 하나의 구현예에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 삼나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS에서 25℃에서 수행할 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 삼나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS에서 42℃에서 수행할 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 삼나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS에서 68℃에서 수행할 것이다. 이들 조건에 대한 추가의 변화는 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 하이브리드화 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 (참조: Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 기재되어 있다.
"스플릿"이란 2개 이상의 단편으로 나누어짐을 의미한다.
"스플릿 Cas9 단백질" 또는 "스플릿 Cas9"는 2개의 별도의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 N-말단 단편 및 C-말단 단편으로서 제공되는 Cas9 단백질을 언급한다. Cas9 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분에 상응하는 폴리펩타이드는 스플라이싱되어 "재구성된" Cas9 단백질을 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, Cas9 단백질은 예를 들어, 이의 각각이 본원에 참조로 포함된, 문헌 (참조: Nishimasu et al., Cell, Volume 156, Issue 5, pp. 935-949, 2014)에 기재되거나, 문헌 (참조: Jiang et al. (2016) Science 351: 867-871. PDB file: 5F9R)에 기재된 바와 같이, 단백질의 무질서 영역 내에서 2개의 단편으로 나누어진다. 일부 구현예에서, 단백질은 약 아미노산 A292-G364, F445-K483, 또는 E565-T637 사이의 SpCas9의 영역 내 임의의 C, T, A 또는 S에서, 또는 임의의 다른 Cas9, Cas9 변이체 (예를 들어, nCas9, dCas9), 또는 다른 napDNAbp 내 상응하는 위치에서 2개의 단편으로 나누어진다. 일부 구현예에서, 단백질은 SpCas9 T310, T313, A456, S469, 또는 C574에서 2개의 단편으로 나누어진다. 일부 구현예에서, 단백질을 2개의 단편으로 나누는 공정은 상기 단백질을 "스프릿팅"하는 것으로서 언급된다.
다른 구현예에서, Cas9 단백질의 N-말단 부분은 아미노산 1-573 또는 1-637 에스. 피오게네스 (S. pyogenes) Cas9 야생형 (SpCas9) (NCBI 참조 서열: NC_002737.2, 유니프롯 참조 서열: Q99ZW2)을 포함하고, Cas9 단백질의 C-말단 부분은 SpCas9 야생형의 아미노산 574-1368 또는 638-1368의 부분 또는 이의 상응하는 위치를 포함한다.
스플릿 Cas9의 C-말단 부분은 스플릿 Cas9의 N-말단 부분과 연결되어 완전한 Cas9 단백질을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질의 C-말단 부분은 Cas9 단백질의 N-말단 부분이 종료되는 위치에서 개시한다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 스플릿 Cas9의 C-말단 부분은 spCas9의 아미노산 (551-651)-1368 부분을 포함한다. "(551-651)-1368"은 아미노산 551-651 (포괄적) 사이의 아미노산에서 개시하고 아미노산 1368에서 종료됨을 의미한다. 예를 들어, 스플릿 Cas9의 C-말단 부분은 spCas9의 아미노산 551-1368, 552-1368, 553-1368, 554-1368, 555-1368, 556-1368, 557-1368, 558-1368, 559-1368, 560-1368, 561-1368, 562-1368, 563-1368, 564-1368, 565-1368, 566-1368, 567-1368, 568-1368, 569-1368, 570-1368, 571-1368, 572-1368, 573-1368, 574-1368, 575-1368, 576-1368, 577-1368, 578-1368, 579-1368, 580-1368, 581-1368, 582-1368, 583-1368, 584-1368, 585-1368, 586-1368, 587-1368, 588-1368, 589-1368, 590-1368, 591-1368, 592-1368, 593-1368, 594-1368, 595-1368, 596-1368, 597-1368, 598-1368, 599-1368, 600-1368, 601-1368, 602-1368, 603-1368, 604-1368, 605-1368, 606-1368, 607-1368, 608-1368, 609-1368, 610-1368, 611-1368, 612-1368, 613-1368, 614-1368, 615-1368, 616-1368, 617-1368, 618-1368, 619-1368, 620-1368, 621-1368, 622-1368, 623-1368, 624-1368, 625-1368, 626-1368, 627-1368, 628-1368, 629-1368, 630-1368, 631-1368, 632-1368, 633-1368, 634-1368, 635-1368, 636-1368, 637-1368, 638-1368, 639-1368, 640-1368, 641-1368, 642-1368, 643-1368, 644-1368, 645-1368, 646-1368, 647-1368, 648-1368, 649-1368, 650-1368, 또는 651-1368 중 어느 하나의 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스플릿 Cas9 단백질의 C-말단 부분은 SpCas9의 아미노산 574-1368 또는 638-1368의 부분을 포함한다.
"대상체"란 인간 또는 비-인간 포유류, 예를 들어, 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유류를 의미한다. 대상체는 가축, 노동력을 생산하고 식품과 같은 상품을 제공하기 위해 길러진 가정용 동물, 소, 염소, 닭, 말, 돼지, 토끼 및 양을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
"실질적으로 동일한"이란 참조 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열 중 어느 하나)과 적어도 50% 동일성 나타내는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 의미한다. 하나의 구현예에서, 상기 서열은 비교를 위해 사용되는 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 60%, 80% 또는 85%, 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.
서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다 (참조: 예를 들어, 기관 (the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)의 서열 분석 소프트웨어 패키지, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램). 상기 소프트웨어는 상동성 정도를 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 할당함에 의해 동일하거나 유사한 서열을 매칭시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 하기의 그룹 내 치환을 포함한다: 글라이신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 결정하기 위한 예시적 접근법에서, BLAST 프로그램이 사용될 수 있고, 확률 스코어는 e-3과 e-100 사이이고 이는 밀접하게 관련된 서열을 지적한다.
COBALT는 예를 들어, 하기의 파라미터와 함께 사용된다:
a) 정렬 파라미터: 갭 페널티-11,-1 및 종료-갭 페널티-5,-1,
b) CDD 파라미터: CDD 파라미터에 RPS BLAST를 사용; Blast E-값 0.003; 보존된 컬럼을 발견하고 CDD 파라미터에서 재계산, 및
c) 조회 클러스터링 파라미터: CDD 파라미터에 조회 클러스터를 사용; 워드 크기 4; 최대 클러스터 거리 0.8; 알파벳 규칙.
EMBOSS 바늘은 예를 들어, 하기의 파라미터와 함께 사용한다:
a) 매트릭스: BLOSUM62;
b) 갭 개방: 10;
c) 갭 연장: 0.5;
d) 아웃풋 포맷: 쌍;
e) 종료 갭 페널티: 거짓;
f) 종료 갭 개방: 10; 및
g) 종료 갭 연장: 0.5.
용어 "표적 부위"는 핵염기 편집기에 의해 변형된 핵산 분자 내 서열을 언급한다. 하나의 구현예에서, 표적 부위는 데아미나제 또는 데아미나제 (예를 들어, 아데닌 데아미나제)를 포함하는 융합 단백질에 의해 탈아민화된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료한다", "치료하는", "치료" 등은 장애 및/또는 이와 연관된 증상을 감소시키거나 개선시키거나 목적하는 약리학적 및/또는 병리학적 효과를 수득함을 언급한다. 배제하는 것은 아니지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것은 장애, 병태 또는 이와 연관된 증상이 완전히 제거될 것을 요구하지 않음을 인지할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 효과는 치료학적이고, 제한 없이, 상기 효과는 질환 및/또는 상기 질환에 기인할 수 있는 부작용 증상을 부분적으로 또는 완전하게 감소시키거나, 감쇠시키거나, 폐지시키거나, 약화시키거나, 완화시키거나, 감소시키거나, 이를 치유한다. 일부 구현예에서, 상기 효과는 예방적이고, 즉, 상기 효과는 질환 또는 병태의 발병 또는 재발로부터 보호하거나 이를 예방한다. 이를 위해, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 바와 같이 치료학적 유효량의 조성물을 투여함을 포함한다.
"우라실 글리코실라제 저해제" 또는 "UGI"란 우라실-절제 복구 시스템을 저해하는 제제를 의미한다. 하나의 구현예에서, 제제는 숙주 우라실-DNA 글리코실라제에 결합하고 DNA로부터 우라실 잔기의 제거를 예방하는 단백질 또는 이의 단편이다. 하나의 구현예에서, UGI는 우라실-DNA 글리코실라제 염기-절제 복구 효소를 저해할 수 있는 단백질, 이의 단편 또는 도메인이다. 일부 구현예에서, UGI 도메인은 야생형 UGI 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 일부 구현예에서, UGI 도메인은 하기에 제시된 예시적인 아미노산 서열의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, UGI 단편은 하기에 제공된 예시적인 UGI 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, UGI는 하기에 제시된 바와 같이 예시적인 UGI 아미노산 서열 또는 이의 단편과 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, UGI, 또는 이의 일부는 하기에 제시된 바와 같이 야생형 UGI 또는 UGI 서열 또는 이의 일부와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 동일하다. 예시적인 UGI는 다음과 같은 아미노산 서열을 포함한다:
>splP14739IUNGI_BPPB2 우라실-DNA 글리코실라제 저해제
Figure pct00079
용어 "벡터"는 핵산 서열을 세포에 도입하여 형질전환된 세포를 유도하는 수단을 언급한다. 벡터는 플라스미드, 트랜스포존, 파아지, 바이러스, 리포좀, 및 에피좀을 포함한다. "발현 벡터"는 수용자 세포에서 발현될 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이다. 발현 벡터는 개시, 정지, 인핸서, 프로모터 및 분비 서열과 같은 도입된 서열의 발현을 촉진시키고/시키거나 용이하게 하기 위해 추가의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에 제공된 임의의 다른 조성물 및 방법의 하나 이상과 조합될 수 있다.
DNA 편집은 유전학적 수준에서 병원성 돌연변이를 보정함에 의해 질환 상태를 변형시키는 실행 가능한 수단으로서 출현하였다. 최근까지, 모든 DNA 편집 플랫폼은 특정 게놈 부위에서 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 유도하고, 반-확률적 방식의 생성물 결과를 결정하기 위한 내인성 DNA 복구 경로에 의존함에 의해 기능하여 복잡한 유전학적 생성물의 집단을 유도한다. 정확하지만, 사용자 정의된 복구 결과는 상동성 지시된 복구 (HDR) 경로를 통해 성취될 수 있고, 다수의 챌린지는 치료학적 관련 세포 유형에서 HDR을 사용한 고효율 복구를 차단하였다. 실제로, 상기 경로는 경쟁의 오류 성향 비-상동성 말단 연결 경로에 비해 비효율적이다. 추가로, HDR은 세포 주기의 G1 및 S기에 엄격히 제한되어 유사분열 후 세포에서 DSB의 정확한 복구를 차단한다. 결과로서, 이들 집단에서 고효율과 함께 사용자 정의된 프로그래밍 가능한 방식으로 게놈 서열을 변경하기 어렵거나 불가능한 것으로 입증되었다.
도 1a-1c는 플라스미드를 묘사한다. 도 1a는 TadA7.10-dCas9 염기 편집기를 암호화하는 발현 벡터이다. 도 1b는 클로람페니콜 내성 (CamR) 및 스펙티노마이신 내성 (SpectR)을 부여하는 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 플라스미드이다. 플라스미드는 또한 2개의 점 돌연변이에 의해 비활성화된 카나마이신 내성 유전자를 포함한다. 도 1c는 클로람페니콜 내성 (CamR) 및 스펙티노마이신 내성 (SpectR)을 부여하는 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 플라스미드이다. 플라스미드는 또한 3점 돌연변이에 의해 비활성화된 카나마이신 내성 유전자를 포함한다.
도 2a-2c는 유도된 변화를 통한 아데닌 데아미나제 (TadA)의 선택을 묘사한다. 도 2a는 프로토스페이서 및 PAM 서열을 갖는 게놈 DNA에 사용하기 위한 가이드 RNA 및 데아미나제 (예를 들어, TadA)를 갖는 염기 편집기를 묘사하는 개략도이다. 도 2b는 유도된 변화를 통한 아데닌 데아미나제 (TadA) 선택을 묘사하는 개략도이다. 도 2c는 결함 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 도 1a-1c에 묘사된 발현 벡터로 형질도입된 세균 콜로니의 이미지이다. 벡터는 오류 성향 PCR을 사용하여 생성된 ABE7.10 변이체를 포함한다. 이러한 "변화된" ABE7.10 변이체를 발현하는 세균 세포는 증가하는 농도의 카나마이신을 사용하여 카나마이신 내성에 대해 선택되었다. 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 ABE7.10 변이체를 발현하는 세균은 카나마이신 내성 유전자에 도입된 돌연변이를 교정하여 카나마이신 내성을 회복시킬 수 있었다. 추가 분석을 위해 카나마이신 내성 세포를 선택하였다.
도 3a 및 3b는 태아 헤모글로빈의 상향조절을 위한 치료학적으로 관련된 부위인 헤모글로빈 서브유닛 감마 (HGB1) 유전자좌의 조절 영역의 편집을 도시한다. 도 3a는 HGB1 유전자에 대한 조절 영역의 일부의 도면이다. 도 3b는 표 6에 나열된 아데노신 데아미나제 변이체의 효율 및 특이성을 정량화한다. 편집은 HEK293T 세포의 헤모글로빈 서브유닛 감마 1 (HGB1) 유전자좌에서 검정되며, 이는 태아 헤모글로빈의 상향조절을 위한 치료학적 관련 부위이다. 상단 패널은 HGB1 유전자의 조절 서열의 표적 영역에 있는 뉴클레오타이드 잔기를 묘사한다. A5, A8, A9 및 A11은 HGB1에서 편집된 아데노신 잔기를 지칭한다.
도 4는 비정규의 PAM 서열을 인식하는 dCas9를 포함하는 아데노신 염기 편집기의 상대적 효율을 도시한다. 상단 패널은 헤모글로빈 서브유닛의 암호화 서열을 묘사한다. 하단 패널은 다양한 길이의 가이드 RNA가 있는 아데노신 데아미나제 변이체 염기 편집기의 효율을 나타내는 그래프이다.
도 5는 ABE8의 효율 및 특이성을 나타내는 그래프이다. 의도된 표적 뉴클레오타이드 및 의도하지 않은 표적 뉴클레오타이드 (방관자(bystander))에서의 편집 퍼센트가 정량화된다.
도 6은 ABE8의 효율 및 특이성을 나타내는 그래프이다. 의도된 표적 뉴클레오타이드 및 의도하지 않은 표적 뉴클레오타이드 (방관자)에서의 편집 퍼센트가 정량화된다.
도 7a-7e는 인간 세포에서 우수한 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 매개하는 8세대 아데닌 염기 편집기를 묘사한다. 도 7a는 아데닌 염기 편집의 개요를 도시한다: i) ABE8은 게놈에서의 sgRNA-표적화된 부위에서 R-루프를 생성하고; ii) TadA* 데아미나제는 R-루프의 ss-DNA 부분에서 가수분해 탈아민화를 통해 아데닌을 이노신으로 화학적으로 전환시키고; iii) Cas9의 D10A 닉카제는 이노신 함유 가닥의 반대쪽 가닥을 닉킹하고; iv) 이노신 함유 가닥은 DNA 복제 동안 주형으로서 사용될 수 있고; v) DNA 폴리머라제와 관련하여 이노신은 우선적으로 시토신과 염기쌍을 이루고; vi) 복제 후, 이노신은 구아노신으로 대체될 수 있다. 도 7b는 ABE8.x-m 및 ABE8.x-d의 구조를 도시한다. ABE8.x-m/d에 대한 명명법은 다음과 같다: ABE8은 ABE7.10 변화 캠페인을 진행하는 추가 변화 라운드 (라운드 8)로부터 발생된 아데닌 염기 편집기이다 (7회 반복의 변화 수행 (Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017)). ABE8.x의 "x" 숫자 값은 상응하는 ABE8 편집기의 변화된 TadA 프로토머에 포함된 돌연변이를 나타낸다; 각각의 숫자는 표 9에 기재된 상이한 돌연변이 세트를 나타낸다. "m" 또는 "d"의 지적은 ABE8 작제물이 변화된 TadA에 연결된 N-말단 야생형 TadA ("d")를 포함하는지 또는 TadA 변화된 변이체만 포함하는지 ("m")를 나타낸다. 도 7c는 TadA*7.10 배경 돌연변이의 합성 라이브러리에서 아미노산 위치에 대한 변이체 아미노산의 백분율을 지적하는 그래프이다. 도 7d는 tRNAArg2 (PDB 2B3J)와 복합체화된 에스. 아우레스 TadA (나타내지 않음)와 함께 정렬된 이. 콜리 데아미나제 (PDB 1Z3A)의 3가지 관점 (즉, 개요, 활성 부위, 및 C-말단 α-나선)을 도시하는 개략도이다. 제8 라운드의 변화에서 동정된 돌연변이가 강조 표시된다. ABE8 및 활성 부위 전체에 걸쳐 주요 잔기가 표시된다. C-말단 알파 나선 영역이 강조 표시된다. 도 7e는 8개의 게놈 부위에 걸쳐 Hek293T 세포에서 ABE7.10 작제물에 상대적으로 코어 ABE8 작제물의 AㆍT에서 GㆍC로의 염기 편집 효율을 묘사하는 그래프이다. 값과 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3개의 독립적인 생물학적 복제물의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 8a-8c는 Cas9 PAM-변이체 ABE8을 도시하고 촉매적으로 데드 Cas9 ABE8 변이체는 인간 세포에서 상응하는 ABE7.10 변이체보다 더 높은 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 매개한다. 값과 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3개의 독립적인 생물학적 복제물의 평균 및 s.d.를 반영한다. ABE7.10 및 ABE8 편집기 활동 윈도우를 나타낸다. 숫자는 프로토스페이서 내의 위치를 지적한다. 표적 DNA 골격에서 유도된 닉의 위치는 삼각형으로 지적되고 상응하는 PAM 인식 서열을 나타낸다. 도 8a는 NG-Cas9 ABE8 (-NG PAM)을 갖는 Hek293T 세포에서 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사하는 그래프이다. 도 8b는 Sa-Cas9 ABE8 (-NNGRRT PAM)을 갖는 Hek293T 세포에서 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사하는 그래프이다. 도 8c는 촉매적으로 불활성화된 dCas9-ABE8 (에스. 피오게네스 (S. pyogenes) Cas9에서 D10A, H840A)을 갖는 Hek293T 세포에서 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사하는 그래프이다.
도 9a-9f는 Hek293T 세포에서 하나의 BPNLS를 갖는 ABE7.10, ABEmax 및 ABEmax 사이의 표적-적중(on-target) 편집 빈도 및 표적-이탈(off-target) 편집 빈도 사이의 비교를 묘사한다. 개별 데이터 포인트를 나타내고 오차 막대는 상이한 날에 수행된 n=3 또는 n=4 독립적인 생물학적 복제물에 대한 s.d.를 나타낸다. 도 9a 및 9b는 표적-적중 DNA 편집 빈도를 묘사하는 그래프이다. 도 9c 및 도 9d는 sgRNA-가이드된 DNA-표적-이탈 편집 빈도를 묘사하는 그래프이다. 도 9e 및 9f는 RNA 표적-이탈 편집 빈도를 묘사하는 그래프이다.
도 10a-10d는 HEK293T 세포에서 메디안 AㆍT에서 GㆍC로의 전환 및 TadA, C-말단 알파-나선 절단 ABE 작제물의 상응하는 삽입-결실 (INDEL) 형성을 묘사한다. 도 10a 및 10c는 8개의 게놈 부위에 걸쳐 AㆍT에서 GㆍC로의 메디안 편집 전환을 묘사하는 히트 맵이다. 도 10b 및 10d는 삽입-결실 형성을 묘사하는 히트 맵이다. 델타 잔기 값은 TadA에서의 결실 위치에 해당한다. 메디안 값은 n=3 생물학적 복제물로부터 생성되었다.
도 11a 및 11b는 8개의 게놈 부위에 걸쳐 HEK293T 세포에서 40개의 ABE8 작제물의 메디안 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사하는 히트 맵이다. 메디안 값은 n=3 이상의 생물학적 복제물로부터 결정되었다.
도 12는 8개의 게놈 부위에 걸쳐 HEK293T 세포에서 40개의 ABE8 작제물의 메디안 삽입-결실 %를 묘사하는 히트 맵이다. 메디안 값은 2개 이상의 생물학적 복제물로부터 결정되었다.
도 13은 편집 시 배수 변화, ABE8:ABE7을 묘사하는 그래프이다. 8개의 상이한 게놈 부위의 표적 내 모든 A 위치에 걸쳐 Hek293T 세포에서 평균 ABE8:ABE7 AㆍT에서 GㆍC 편집에 대한 표현. 위치 2-12는 위치 20이 -NGG PAM의 바로 5'인 20-nt 프로토스페이서 내의 표적 아데닌의 위치를 지칭한다.
도 14는 ABE8의 덴드로그램을 묘사한다. 추가 연구를 위해 선택된 코어 ABE8 작제물이 강조 표시되었다.
도 15a 및 15b는 8개의 게놈 부위에 걸쳐 HEK293T 세포에서 8개의 코어 ABE8 작제물의 메디안 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사하는 히트 맵이다. 메디안 값은 n=3 이상의 생물학적 복제물로부터 결정되었다.
도 16a 및 16b는 HEK293T 세포에서 8개 게놈 부위에서 시험된 8개의 코어 ABE8의 메디안 삽입-결실 빈도를 묘사하는 히트 맵이다.
도 17a 및 17b는 HEK293T 세포에서 6개 게놈 부위에서 코어 NG-ABE8 작제물 (-NG PAM)의 메디안 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사내는 히트 맵이다. 메디안 값은 n=3 생물학적 복제물로부터 생성되었다.
도 18a 및 18b는 HEK293T 세포에서 6개 게놈 부위에서 시험된 코어 NG-ABE8 작제물의 메디안 삽입-결실 빈도를 묘사하는 히트 맵이다. 메디안 값은 n=3 생물학적 복제물로부터 생성되었다.
도 19a 및 19b는 HEK293T 세포에서 6개 게놈 부위에서 코어 Sa-ABE8 작제물 (-NNGRRT PAM)의 메디안 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사하는 히트 맵이다. 부위 위치는 22-nt 프로토스페이서 내에서 -2에서 20 (5'에서 3')으로 넘버링된다. 위치 20은 NNGRRT PAM에 대해 5'이다. 메디안 값은 n=3 생물학적 복제물로부터 생성되었다.
도 20a 및 20b는 HEK293T 세포에서 8개 게놈 부위에서 시험된 코어 Sa-ABE8의 메디안 삽입-결실 빈도를 묘사하는 히트 맵이다. 메디안 값은 n=3 생물학적 복제물로부터 생성되었다.
도 21a 및 21b는 HEK293T 세포에서 8개 게놈 부위에서 코어 dC9-ABE8-m 작제물의 메디안 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사하는 히트 맵이다. 데드 Cas9 (dC9)는 에스. 피오게네스 (S. pyogenes) Cas9 내의 D10A 및 H840A 돌연변이로서 정의된다. 메디안 값은 n≥3 생물학적 복제물로부터 생성되었다.
도 22a 및 22b는 HEK293T 세포에서 8개 게놈 부위에서 코어 dC9-ABE8-d 작제물의 메디안 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사하는 히트 맵이다. 데드 Cas9 (dC9)는 에스. 피오게네스 (S. pyogenes) Cas9 내의 D10A 및 H840A 돌연변이로서 정의된다. 메디안 값은 n≥3 생물학적 복제물로부터 생성되었다.
도 23a-23d는 HEK293T 세포에서 8개 게놈 부위에서 시험된 코어 dC9-ABE8의 메디안 삽입-결실 빈도를 묘사한다. 메디안 값은 n≥3 생물학적 복제물로부터 생성되었다. 도 23a 및 23c는 ABE7.10에 상대적으로 dC9-ABE8-m 변이체에 대해 나타낸 삽입-결실 빈도를 묘사하는 히트 맵이다. 도 23b 및 23d는 ABE7.10에 상대적으로 dC9-ABE8-d 변이체에 대해 나타낸 삽입-결실 빈도를 묘사하는 히트 맵이다.
도 24는 ABE8 및 ABE7.10으로 처리된 Hek293T 세포를 사용한 CㆍG에서 TㆍA로의 편집을 묘사한다. 도 24 (상단)는 표적 내의 모든 'C' 위치에 걸쳐 평균화된 각 부위에 대한 편집 빈도를 묘사하는 박스 플롯이다. 프로토스페이서 내의 시토신은 음영으로 지적한다. 박스의 경계는 1사분위수 (하위)와 3사분위수 (상위)를 지적하고 박스 내의 띠는 메디안을 지적한다. 메디안으로부터 사분위수간 범위 (|Q3-Q1|)의 1.5배보다 먼 값은 이상값 (outlier)으로서 표시되고 개별적으로 나타낸다. 위스커는 박스의 가장자리로부터 이상값으로 간주되지 않는 최대값과 최소값까지 확장된다. 도 24 (하단)는 부위 및 표적 DNA 서열을 지적하는 표이다.
도 25a-25h는 ABE8 작제물 및 DNA에 대한 특이성을 개선하기 위한 TadA 돌연변이를 갖는 ABE8 작제물에 의한 DNA 표적-적중 및 sgRNA-의존성 DNA 표적-이탈 편집을 묘사한다. 개별 데이터 포인트를 나타내고 오차 막대는 상이한 날에 수행된 n=3 독립적인 생물학적 복제물에 대한 s.d.를 나타낸다. 도 25a 및 25b는 ABE7과 비교하여 코어 ABE8 작제물에 대한 표적-적중 DNA 편집 빈도를 묘사하는 그래프이다. 도 25c 및 25d는 RNA 표적-이탈 편집을 개선하는 4개의 게놈 유전자좌에서 ABE8 작제물에 대한 표적-적중 DNA 편집 빈도를 묘사하는 그래프이다. 도 25e 및 25f는 ABE7과 비교하여 ABE8 작제물에 대한 sgRNA-가이드된 DNA-표적-이탈 편집 빈도를 묘사하는 그래프이다. 도 25g 및 25h는 RNA 표적-이탈 편집을 개선하는 것으로 알려진, 공지된 sgRNA-의존성 유전자좌에서 ABE8 작제물에 대한 표적-이탈 DNA 편집 빈도를 묘사하는 그래프이다.
도 26은 인간 세포 개별 데이터 포인트에서 이전에 동정된 12개의 sgRNA-의존성 Cas9 표적-이탈 유전자좌에서 삽입-결실 빈도를 나타내는 그래프이고 오차 막대는 상이한 날에 수행된 n=3 독립적인 생물학적 복제물에 대한 s.d.를 나타낸다.
도 27a-27c는 1차 세포에서 AㆍT에서 GㆍC로의 전환 및 표현형 결과를 묘사한다. 도 27a는 HBG1/2에 대한 게놈 염기 편집 부위를 묘사하는 개략도이다. 도 27b는 2명의 개별 공여자로부터의 ABE로 처리된 CD34+ 세포에서 -198 HBG1/2 부위에서 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사하는 그래프이다. NGS 분석은 처리 후 48시간 및 144시간 째에 수행되었다. -198 HBG1/2 표적 서열은 A7이 강조 표시되어 나타낸다. A7에 대해 플롯팅된 AㆍT에서 GㆍC에 대한 퍼센트. 도 27c는 ABE 처리된 세포로부터 유래된 적혈구에서 α-글로빈의 분획으로서 형성된 γ-글로빈의 백분율을 묘사하는 그래프이다. ABE 처리 후 및 적혈구 분화 후 2명의 다른 공여자로부터 값을 나타낸다.
도 28a 및 28b는 HBG1/2의 업스트림에 있는 -198 프로모터 부위에서 ABE8로 처리된 CD34+ 세포의 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 묘사한다. 도 28a는 2명의 공여자로부터의 CD34+ 세포에서 ABE8의 A에서 G로의 편집 빈도를 묘사하는 히트 맵으로, 여기서, 공여자 2는 편집기 처리 48시간 및 144시간 후 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다. 도 28b는 A7 단독 편집 또는 조합된 ((A7 + A8) 편집을 포함하는 전체 서열분석 판독의 분포를 그래픽으로 나타낸 것이다.
도 29a 및 29b는 감마-글로빈 프로모터의 -198 부위에서 ABE8로 처리된 CD34+ 세포의 삽입-결실 빈도를 묘사하는 히트 맵이다. 48h 및 144h 시점에서 2명의 공여자로부터의 빈도를 나타낸다. HBG1/2 -198 프로모터 표적 부위에서 완전한 AㆍT에서 GㆍC로의 전환은 10-nt의 폴리-G 스트레치를 생성한다. 상기 단독중합체 실행은 종종 PCR- 및 서열분석-유도된 오류의 비율을 증가시켜 이 부위에서 상승된 삽입-결실 빈도를 나타낸다.
도 30은 미처리 분화된 CD34+ 세포 (공여자 1)의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 31은 ABE7.10-m (공여자 1)으로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 32는 ABE7.10-d (공여자 1)로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 33은 ABE8.8-m (공여자 1)으로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 34는 ABE8.8-d (공여자 1)로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 35는 ABE8.13-m (공여자 1)으로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 36은 ABE8.13-d (공여자 1)로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 37은 ABE8.17-m (공여자 1)으로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 38은 ABE8.17-d (공여자 1)로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 39는 ABE8.20-m (공여자 1)으로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 40은 ABE8.20-d (공여자 1)로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 41은 미처리된 (공여자 2) 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다. 참고: 공여자 2는 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다.
도 42는 ABE7.10-m (공여자 2)으로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다. 참고: 공여자 2는 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다.
도 43은 ABE7.10-d (공여자 2)로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다. 참고: 공여자 2는 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다.
도 44는 ABE8.8-m (공여자 2)으로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다. 참고: 공여자 2는 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다.
도 45는 ABE8.8-d (공여자 2)로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다. 참고: 공여자 2는 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다.
도 46은 ABE8.13-m (공여자 2)으로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다. 참고: 공여자 2는 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다.
도 47은 ABE8.13-d (공여자 2)로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다. 참고: 공여자 2는 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다.
도 48a 및 48b는 ABE8.17-d (공여자 2; 참고: 공여자 2는 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다) (도 48a) 또는 ABE8.17-m (공여자 1) (도 48e)로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다.
도 49는 ABE8.20-d (공여자 2)로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다. 참고: 공여자 2는 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다.
도 50은 ABE8.20-m (공여자 2)으로 처리된 분화된 CD34+ 세포의 UHPLC UV-Vis 트레이스 (220 nm) 및 글로빈 쇄 수준의 통합을 묘사한다. 참고: 공여자 2는 겸상 세포 질환에 대해 이종접합성이다.
도 51a-51e는 적출 전 적혈구 분화 후 11일 째에 90% 편집 초과 및 적혈구 분화 후 18일 째에 알파 글로빈 또는 전체 베타 패밀리 글로빈에 비해 약 60%의 감마 글로빈에 도달한 2개의 독립적인 부위에서 ABE8.8을 사용한 편집을 묘사한다. 도 51a는 2개의 독립적인 실험에서 2명의 건강한 공여자에서의 평균 ABE8.8 편집을 묘사하는 그래프이다. 편집 효율은 HBG1과 HBG2를 구별하는 프라이머로 측정되었다. 도 51b는 2개의 독립적인 실험에서 평균 1명의 건강한 공여자를 묘사하는 그래프이다. 편집 효율은 HBG1과 HBG2를 둘 다 인식하는 프라이머로 측정되었다. 도 51c는 이종접합성 E6V 돌연변이를 갖는 공여자에서 ABE8.8의 편집을 묘사하는 그래프이다. 도 51d 및 51e는 ABE8.8 편집된 세포에서 감마 글로빈 증가를 묘사하는 그래프이다.
도 52a 및 52b는 겸상 세포 돌연변이를 교정하기 위해 ABE 변이체를 사용한 퍼센트 편집을 묘사한다. 도 52a는 SCD 환자 섬유아세포에서 약 70% 편집을 갖는 상이한 편집기 변이체의 스크린을 묘사하는 그래프이다. 도 52b는 편집 윈도우 내에 존재하고 SCD 돌연변이 편집을 위한 프록시 역할을 하는 인접 프롤린에서 동의 돌연변이 A13을 표적으로 하는 리드 ABE 변이체로 편집된 건강한 공여자로부터의 CD34 세포를 묘사하는 그래프이다. ABE8 변이체는 프록시 A13에서 약 40%의 평균 편집 빈도를 나타내었다.
도 53a-53c는 ABE 처리와 연관된 RNA에서 세포 A에서 I로의 편집을 검출하기 위한 RNA 앰플리콘 서열분석을 묘사한다. 개별 데이터 포인트를 나타내고 오차 막대는 상이한 날에 수행된 n=3 독립적인 생물학적 복제물에 대한 s.d.를 나타낸다. 도 53a는 ABE7 및 Cas9 (D10A) 닉카제 대조군과 비교하여 코어 ABE 8 작제물에 대한 표적화된 RNA 앰플리콘에서 A에서 I로의 편집 빈도를 묘사하는 그래프이다. 도 53b는 RNA 표적-이탈 편집을 개선하는 것으로 보고된 돌연변이를 갖는 ABE8에 대한 표적화된 RNA 앰플리콘에서 A에서 I로의 편집 빈도를 묘사하는 그래프이다. 도 53c는 지적된 작제물로 처리된 세포로부터 단리된 세포 mRNA 샘플에서 A에서 I로의 돌연변이의 최대 수준을 묘사는 그래프이다.
도 54a-54c는 인간 세포에서 우수한 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 매개하는 8세대 아데닌 염기 편집기를 묘사한다. 도 54a 및 54b는 ABE8과 ABE7 사이의 염기 편집에서 절대 및 배수 변화를 묘사한다. 8개의 상이한 게놈 부위의 표적 내의 모든 'A' 위치에 걸쳐 Hek293T 세포에서 평균 ABE8:ABE7 AㆍT에서 GㆍC로의 편집에 대한 표현. 위치 2-12는 위치 20이 -NGG PAM의 바로 5'인 20-nt 프로토스페이서 내의 표적 아데닌의 위치를 지칭한다. 각각의 포인트는 동일한 부위 및 위치에서 ABE7.10 편집기의 메디안 값과 비교하여 나타낸다 (도 54a). 각각의 위치에서 편집 시 절대 차이 (ABE8-ABE7)를 나타낸다 (도 54b). ABE8:ABE7 편집 비율을 나타낸다. 도 54c (상단)는 ABE7.10 및 ABE8 편집기 활성 윈도우를 묘사하는 개략도이다. 숫자는 프로토스페이서 내의 위치를 지적한다. 표적 DNA 골격에서 유도된 닉의 위치는 삼각형으로 지적되고 상응하는 PAM 인식 서열을 나타낸다. 도 54c (하단)는 표적화 가능한 부위, ABE7 대 ABE8의 비교를 묘사하는 히트 맵이다. 각각의 박스는 ABE7 또는 ABE8로 표적화될 수 있는 ClinVar 데이터베이스 (참조: Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res 44, D862-868, doi:10.1093/nar/gkv1222 (2016); Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Res 42, D980-985, doi:10.1093/nar/gkt1113 (2014))에서 병원성 G->A 또는 C->T SNV 변이체의 수와 백분율을 나타낸다. 분석은 20-nt 프로토스페이서 서열과 NGG 또는 NGA PAM을 표적으로 할 수 있는 Cas9를 고려한다. 편집 윈도우는 ABE7의 경우 5-7, ABE8의 경우 4-8로 가정하였다. 정확한 교정은 적어도 하나의 가능한 스페이서/PAM 조합에서 지정된 윈도우 내에서 병원성 돌연변이만 편집할 수 있음을 의미한다. 가능한 모든 교정 전략이 변형된 다른 변형된 염기를 포함하는 경우, 상응하는 변이체는 "방관자를 갖는" 범주로 계산된다.
도 55a-55e는 플라스미드 또는 mRNA 전달을 사용하는 ABE8 작제물에 의한 DNA 표적-적중 염기 편집, sgRNA-의존성 DNA 표적-이탈 염기 편집 및 sgRNA-독립적인 표적-이탈 mRNA 편집을 묘사한다. 도 55a 및 55b는 ABE7과 비교하여 코어 ABE 8개 작제물에 대한 표적-적중 DNA 편집 빈도를 묘사하는 히트 맵이다. 작제물은 플라스미드 (도 55a) 및 mRNA (도 55b)로서 전달되었다. 도 55c 및 55d는 ABE8과 비교하여 ABE8에 대한 sgRNA-의존성 표적-이탈 DNA 편집 빈도를 묘사하는 히트 맵이다. 작제물은 플라스미드 (도 55c) 및 mRNA (도 55d)로 전달되었다. 도 55e는 지적된 앰플리콘의 125-nt 영역에서 측정된 최대 A에서 G로의 편집 빈도를 묘사하는 히트 맵이다. 작제물은 플라스미드 (좌측) 및 mRNA (우측)로 전달되었다.
메디안은 도 55d 이외의 상이한 날에 수행된 n=3 또는 n=4 독립적인 생물학적 복제물에 대해 나타내고, 여기서, 일부 샘플은 <5,000 Miseq 판독을 생성하므로 제외되었다; 구체적으로, 도 55e (우측)에서 HEK4OT3 (ABE7.10-d n=1 및 ABE8.13-m n=2) 및 HEK4OT4 (ABE8.13-d, ABE8.17-d, ABE8.20-m 및 ABE8.20-d n=2)로 이는 ABE8.8-m: CTNNB1의 경우 n=2.
도 56은 ABE8 가이드-독립적인 DNA 표적-이탈 분석을 묘사하는 개략도이다.
도 57은 전체 게놈 서열분석을 위해 보낸 각각의 샘플에 대한 돌연변이 분류 플롯을 묘사한다. 모든 전체 게놈 서열분석된 샘플에서 돌연변이 유형의 분포. 염기 편집기가 생성하는 유형의 돌연변이에 대해 상당히 농축된 샘플은 **로 지적된다. 편집기가 생성하는 유형의 변형이 상당히 적은 샘플은 *로 지적된다
도 58은 염기 편집기 mRNA로 처리된 세포로부터의 전체 전사체 및 전체 게놈 서열분석 데이터를 묘사하는 그래프이다. 각각의 편집기에 대해, 승산 비율은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 각각의 처리 복제에서 편집기-유도된 돌연변이 유형 (BE4의 경우 C에서 T로 그리고 기타의 경우 A에서 G로) 및 기타 모든 돌연변이 유형에 대한 돌연변이 빈도의 배수 변화를 정량화한다. [***]는 처리군과 미처리된 대조군 간의 일측면 만-휘트니 (one-sided Mann-Whitney) U 시험에 대한 유의한 p-값 (<0.05)을 지적한다.
도 59a 및 59b는 전체 게놈 서열분석 전에 B2M-양성 및 B2M-음성 세포를 유동 분류하기 위해 사용되는 게이트의 대표적인 예를 묘사한다. 도 59a는 미처리된 조건에 대해 단일 세포 클론으로 분류된 살아 있는 B2M-양성 HEK293T 세포에 대한 대표적인 플롯 및 게이트를 묘사한다. 도 59b는 모든 처리된 조건에 대해 분류된 살아 있는 B2M-음성 HEK293T 세포 (ABE, CBE 또는 Cas9-처리된 세포)에 대한 대표적인 플롯 및 게이트를 묘사한다.
도 60은 HEK293T 세포에서 8개의 상이한 게놈 부위에 걸쳐 ABE에 의해 생성된 대립유전자를 묘사하는 그래프이다.
도 61은 인간 세포에서 이전에 동정된 12개의 sgRNA-의존성 Cas9 표적-이탈 유전자좌에서 메디안 삽입-결실 빈도를 나타내는 히트 맵이다. 나타낸 데이터는 상이한 날에 수행된 n=3 독립적인 생물학적 복제물의 메디안 값이다. 플라스미드 전달을 사용하여 작제물을 HEK293T 세포에 투여하였다.
도 62는 NRNN PAM에 대한 모든 가능한 PAM에 접근하기 위한 Cas9 변이체를 묘사하는 표이다. 이들의 PAM에서 3개 이하의 정의된 뉴클레오타이드를 인식해야 하는 Cas9 변이체만 나열된다. 비-G PAM 변이체는 SpCas9-NRRH, SpCas9-NRTH, 및 SpCas9-NRCH를 포함한다.
본원 개시내용은 증가된 효율을 갖는 신규한 아데닌 염기 편집기 (예를 들어, ABE8)를 포함하는 조성물 및 표적 핵염기 서열에서 변형을 생성하기 위해 이들을 사용하는 방법을 제공한다.
핵염기 편집기
본원에서는 폴리뉴클레오타이드의 표적 뉴클레오타이드 서열을 편집하거나, 변형시키거나 변경하기 위한 염기 편집기 또는 핵염기 편집기가 개시된다. 본원에서는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 핵염기 편집 도메인 (예를 들어, 아데노신 데아미나제)를 포함하는 핵염기 편집기 또는 염기 편집기가 기재된다. 결합된 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, gRNA)와 접합된 경우 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 특이적으로 결합 (즉, 결합된 가이드 핵산의 염기와 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 염기 간에 상보적 염기 쌍 형성을 통해)할 수 있고, 이로써 염기 편집기는 편집시키고자 하는 표적 핵산 서열에 위치한다. 일부 구현예에서, 표적 뉴클레오타이드 서열은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 DNA-RNA 하이브리드를 포함한다
폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인
폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 또한 RNA에 결합하는 핵산 프로그래밍 가능한 단백질을 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인을 RNA로 가이드하는 핵산과 연합될 수 있다. 다른 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질은 또한 본원 개시내용의 범위 내에 있지만, 이들은 구체적으로 본원 개시내용에 열거되어 있지 않다.
염기 편집기의 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 그 자체가 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 하나 이상의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인의 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있다. 본원에서 용어 "엑소뉴클레아제"는 자유 말단으로부터 핵산 (예를 들어, RNA 또는 DNA)을 분해할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 언급하고, 상기 용어 "엔도뉴클레아제"는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)내 내부 영역을 촉매 (예를 들어, 절단)할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 언급한다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산의 단일 가닥을 절단할 수 있다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 분자의 양 가닥을 절단할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 데옥시리보뉴클레아제일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 리보뉴클레아제일 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인의 뉴클레아제 도메인은 표적 폴리뉴클레오타이드의 0개, 1개 또는 2개 가닥을 절단할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 닉카제 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서, 용어 "닉카제"는 듀플렉스 핵산 분자 (예를 들어, DNA)에서 2개 가닥 중 하나의 가닥만을 절단할 수 있는 뉴클레아제 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인을 언급한다. 일부 구현예에서, 닉카제는 하나 이상의 돌연변이를 활성 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인에 도입함에 의해 완전한 촉매 활성 (예를 들어, 천연) 형태의 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인이 Cas9로부터 유래된 닉카제 도메인을 포함하는 경우, Cas9-유래된 닉카제 도메인은 D10A 돌연변이 및 위치 840에 히스티딘을 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 잔기 H840은 촉매 활성을 보유하고, 이로써 핵산 듀플렉스의 단일 가닥을 절단할 수 있다. 또 다른 예에서, Cas9-유래된 닉카제 도메인은 H840A 돌연변이를 포함할 수 있고, 위치 10에서 아미노산 잔기는 D로 남아있다. 일부 구현예에서, 닉카제는 닉카제 활성을 위해 요구되지 않는 뉴클레아제 도메인의 전부 또는 일부를 제거함에 의해 완전한 촉매 활성 (예를 들어, 천연) 형태의 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인이 Cas9로부터 유래된 닉카제 도메인을 포함하는 경우, Cas9-유래된 닉카제 도메인은 RuvC 도메인 또는 HNH 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 포함할 수 있다.
예시적인 촉매적 활성 Cas9의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00080
닉카제 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기는 따라서 특이적 폴리뉴클레오타이드 표적 서열에서 (예를 들어, 결합된 가이드 핵산의 상보적 서열에 의한 결정시) 단일 가닥 DNA 절단 (닉)을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 닉카제 도메인 (예를 들어, Cas9-유래된 닉카제 도메인)을 포함하는 염기 편집기에 의해 절단되는 핵산 듀플렉스 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 가닥은 염기 편집기에 의해 편집되지 않는 가닥 (즉, 염기 편집기에 의해 절단되는 가닥은 편집될 염기를 포함하는 가닥의 반대편에 있다)이다. 다른 구현예에서, 닉카제 도메인 (예를 들어, Cas9-유래된 닉카제 도메인)을 포함하는 염기 편집기는 편집을 위해 표적화되는 DNA 분자의 가닥을 절단할 수 있다. 상기 구현예에서, 비-표적화된 가닥은 절단되지 않는다.
또한 본원에서는 촉매적 데드 (즉, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 절단할 수 없는) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기가 제공된다. 본원에서 용어 "촉매적 데드" 및 "뉴클레아제 데드"는 핵산의 가닥을 절단하지 못하는 무능력을 유도하는 하나 이상의 돌연변이 및/또는 결실을 갖는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 촉매적 데드 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 염기 편집기는 하나 이상의 뉴클레아제 도메인에서 특정 점 돌연변이의 결과로서 뉴클레아제 활성이 부재일 수 있다. 예를 들어, Cas9 도메인을 포함하는 염기 편집기의 경우에, Cas9는 D10A 돌연변이 및 H840A 돌연변이 둘 다를 포함할 수 있다. 상기 돌연변이는 뉴클레아제 도메인 둘 다를 불활성화시킴으로써 뉴클레아제 활성을 상실시킨다. 다른 구현예에서, 촉매적 데드 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 촉매 도메인 (예를 들어, RuvC1 및/또는 HNH 도메인)의 전부 또는 일부의 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 촉매적 데드 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 뉴클레아제 도메인의 전부 또는 일부의 결실 뿐만 아니라 점 돌연변이 (예를 들어, D10A 또는 H840A)를 포함한다.
또한 본원에서는 이전에 기능성 버전의 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인으로부터의 촉매적 데드 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 결합 도메인을 생성할 수 있는 돌연변이가 고려된다. 예를 들어, 촉매적 데드 Cas9 ("dCas9")의 경우에, D10A 및 H840A 이외의 다른 돌연변이를 갖는 변이체가 제공되고 이는 뉴클레아제 불활성화된 Cas9를 유도한다. 상기 돌연변이는 예를 들어 D10 및 H840에서 다른 아미노산 치환, 또는 Cas9의 뉴클레아제 도메인 내 다른 치환 (예를 들어, HNH 뉴클레아제 서브도메인 및/또는 RuvC1 서브도메인에서의 치환)을 포함한다. 추가의 적합한 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본원 개시내용 및 당해 분야의 지식을 기준으로 당업자에게 자명할 수 있고, 본원 개시내용의 범위 내에 있다. 상기 추가의 예시적인 적합한 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 D10A/H840A, D10A/D839A/H840A, 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이체 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (참조: 예를 들어, Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).
염기 편집기에 혼입될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인의 비제한적인 예는 CRISPR 단백질-유래된 도메인, 제한 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, TAL 뉴클레아제 (TALEN), 및 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 결합된 가이드 핵산을 통해 핵산의 CRISPR (즉, 클러스터형 규칙적 간격을 둔 짧은 팔린드롬 반복체)-매개된 변형 동안에 핵산 서열에 결합할 수 있는 천연 또는 변형된 단백질 또는 이의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인을 포함한다. 상기 단백질은 본원에서 "CRISPR 단백질"로서 언급된다. 따라서, 본원에서는 CRISPR 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기 (즉, 또한 염기 편집기의 "CRISPR 단백질-유래된 도메인"으로서 언급되는 CRISPR 단백질의 전부 또는 일부를 도메인으로서 포함하는 염기 편집기)가 기재된다. 염기 편집기에 도입된 CRISPR 단백질-유래된 도메인은 야생형 또는 천연 버전의 CRISPR 단백질과 비교하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 하기된 바와 같이, CRISPR 단백질-유래된 도메인은 야생형 또는 천연 버전의 CRISPR 단백질과 비교하여 하나 이상의 돌연변이, 삽입, 결실, 재정렬 및/또는 재조합을 포함할 수 있다.
CRISPR은 이동 유전학적 요소 (바이러스, 전이할 수 있는 요소 (transposable elements) 및 접합성 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 후천성 면역계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동 요소에 상보적인 서열 및 표적 공격 핵산을 포함한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사되고 프로세싱된다. II형 CRISPR 시스템에서, 전구-crRNA의 올바른 프로세싱은 트랜스-암호화된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질을 요구한다. tracrRNA는 전구-crRNA의 리보뉴클레아제 3-원조 프로세싱에 대한 가이드로서 작용한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 환형 dsDNA 표적을 엔도핵산분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 엔도핵산분해적으로 절단됨에 이어서 3'-5' 엑소핵산분해적으로 절단 제거한다. 실제로, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 2개의 RNA를 요구한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA, 또는 단순히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 양상을 단일 RNA 종으로 혼입하기 위해 가공될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (참조: Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012))을 참조하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 자가 대 비-자가의 구분을 도와주기 위해 CRISPR 반복 서열 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)에서 짧은 모티프를 인지한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 가공된 Cas 단백질을 사용할 수 있다. 가이드 RNA (gRNA)는 Cas-결합을 위해 필요한 스캐폴드 서열 및 변형된 게놈 표적을 한정하는 사용자 정의된 ∼20개 뉴클레오타이드 스페이서로 구성된 짧은 합성 RNA이다. 따라서, 당업자는 Cas 단백질의 게놈 표적을 변화시킬 수 있고, 특이성은 부분적으로 gRNA 표적화 서열이 나머지 게놈과 비교하여 게놈 표적에 대해 얼마나 특이적인지에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, gRNA 스캐폴드 서열은 다음과 같다:　 GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU.　
일부 구현예에서, 염기 편집기에 도입된 CRISPR 단백질-유래된 도메인은 결합된 가이드 핵산과 접합되는 경우 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있는 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제 또는 리보뉴클레아제)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 도입된 CRISPR 단백질-유래된 도메인은 결합된 가이드 핵산과 접합되는 경우 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있는 닉카제이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 도입된 CRISPR 단백질-유래된 도메인은 결합된 가이드 핵산과 접합되는 경우 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있는 촉매적 데드 도메인이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 CRISPR 단백질 유래된 도메인에 의해 결합되는 표적 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 CRISPR 단백질 유래된 도메인에 의해 결합되는 표적 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다.
본원에 사용될 수 있는 Cas 단백질은 부류 1 및 부류 2를 포함한다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 또는 Csx12로서 공지된), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i, CARF, DinG, 이의 상동체 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 2개의 기능성 엔도뉴클레아제 도메인을 갖는 Cas9와 같이 변형되지 않은 CRISPR 효소는 DNA 절단 활성을 가질 수 있다: RuvC 및 HNH. CRISPR 효소는 예를 들어, 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 상보체 내에 표적 서열에서 하나의 가닥 또는 가닥 둘 다의 절단을 지시할 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소는 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오타이드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개 이상의 염기쌍 내에 하나의 가닥 또는 가닥 둘 다의 절단을 지시할 수 있다.
상응하는 야생형 효소와 관련하여, 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 하나의 가닥 또는 가닥 둘 다를 절단하는 능력이 부재인 CRISPR 효소를 암호화하는 벡터가 사용될 수 있다. Cas9는 야생형 예시적인 Cas9 폴리펩타이드 (예를 들어, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 언급할 수 있다. Cas9는 야생형 예시적인 Cas9 폴리펩타이드 (예를 들어, 에스. 피오게네스로부터)와 최대 또는 최대 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 언급할 수 있다. Cas9는 야생형 또는 결실, 삽입, 치환, 변이체, 돌연변이, 융합, 키메라 또는 이의 임의의 조합과 같은 아미노산 변화를 포함할 수 있는 변형된 형태의 Cas9 단백질을 언급할 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기의 CRISPR 단백질 유래된 도메인은 코리네박테리움 울세란스 (NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아 (NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라 (NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 인터메디아 (NCBI Ref: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와넨스 (NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코커스 이니애 (NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카 (NCBI Ref: NC_018010.1); 사이크로플렉서스 토르쿠이스 (NCBI Ref: NC_018721.1); 스타필로코커스 써모필러스 (NCBI Ref: YP_820832.1); 리스테리아 이노쿠아 (NCBI Ref: NP_472073.1); 캄필로박터 제주니 (NCBI Ref: YP_002344900.1); 나이세리아 메닌기티디스 (NCBI Ref: YP_002342100.1), 스트렙토코커스 피오게네스, 또는 스타필로코커스 아우레우스로부터 기원하는 Cas9의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
핵염기 편집기의 Cas9 도메인
Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, "Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); and "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. science 337:816-821(2012), 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). Cas9 오톨로그는 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) 및 에스. 써모필러스 (S. thermophilus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 종에 기재되었다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본원 개시내용을 기준으로 당업자에게 자명할 것이고, 상기 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 (참조: Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737)에 기재된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 Cas9 도메인이다. 비제한적으로, 예시적인 Cas9 도메인이 본원에 제공된다. Cas9 도메인은 뉴클레아제 활성 Cas9 도메인, 뉴클레아제 불활성 Cas9 도메인 (dCas9), 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 뉴클레아제 활성 도메인이다. 예를 들어, Cas9 도메인은 듀플렉스 핵산의 가닥 둘 다 (예를 들어, 듀플렉스 DNA 분자의 가닥 둘 다)를 절단하는 Cas9 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개, 적어도 1000개, 적어도 1100개, 또는 적어도 1200개 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas9의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질은 2개의 Cas9 도메인 중 하나를 포함한다: (1) Cas9의 gRNA 결합 도메인; 또는 (2) Cas9의 DNA 절단 도메인. 일부 구현예에서, Cas9 또는 이의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로서 언급된다. Cas9 변이체는 Cas9 또는 이의 단편과 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas9 변이체는 야생형 Cas9 서열과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체는 Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA 절단 도메인)을 포함하여, 상기 단편은 야생형 Cas9의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, 상기 단편은 상응하는 야생형 Cas9의 아미노산 길이와 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하거나, 이의 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다. 일부 구현예에서, 단편은 적어도 100개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 상기 단편은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 또는 적어도 1300개 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 융합 단백질은 Cas9 단백질의 전장 아미노산 서열, 예를 들어, 본원에 제공된 Cas9 서열 중 하나를 포함한다. 그러나, 다른 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질은 전장 Cas9 서열을 포함하지 않고 단지 하나 이상의 이의 단편을 포함한다. 적합한 Cas9 도메인 및 Cas9 단편의 예시적인 아미노산 서열이 본원에 제공되고, Cas9 도메인 및 단편의 추가의 적합한 서열은 당업자에게 자명할 것이다.
Cas9 단백질은 Cas9 단백질을, 가이드 RNA와 상보성을 갖는 특이적 DNA 서열로 가이드하는 가이드 RNA와 연합될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 Cas9 도메인, 예를 들어, 뉴클레아제 활성 Cas9, Cas9 닉카제 (nCas9), 또는 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9)이다. 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질의 예는 제한 없이 Cas9 (예를 들어, dCas9 및 nCas9), CasX, CasY, Cpfl, Cas12b/C2C1, 및 Cas12c/C2C3을 포함한다.
일부 구현예에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코커스 피오게네스 기원의 Cas9 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1, 다음과 같은 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열)에 상응한다.
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
(한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인)
일부 구현예에서, 야생형 Cas9는 하기의 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열에 상응하거나 이를 포함한다:
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
(한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인).
일부 구현예에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코커스 피오게네스 (NCBI 참조 서열: NC_002737.2 (다음과 같은 뉴클레오타이드 서열); 및 유니프롯 참조 서열: Q99ZW2 (다음과 같은 아미노산 서열)로부터의 Cas9에 상응한다:
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
(한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인)
일부 구현예에서, Cas9는 코리네박테리움 울세란스 (NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아 (NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라 (NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 인터메디아 (NCBI Ref: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와넨스 (NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코커스 이니애 (NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카 (NCBI Ref: NC_018010.1); 사이크로플렉서스 토르쿠이스I (NCBI Ref: NC_018721.1); 스타필로코커스 써모필러스 (NCBI Ref: YP_820832.1), 리스테리아 이노쿠아 (NCBI Ref: NP_472073.1), 캄필로박터 제주니 (NCBI Ref: YP_002344900.1) 또는 나이세리아 메닌기티디스 (NCBI Ref: YP_002342100.1)로부터 기원하는 Cas9 를 언급하거나 임의의 다른 기원의 Cas9를 언급한다.
변이체 및 이의 동족체를 포함하는, 추가의 Cas9 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제 데드 Cas9 (dCas9), Cas9 닉카제 (nCas9), 또는 뉴클레아제 활성 Cas9)이 본원의 범위 내에 있는 것으로 인지해야 한다. 예시적인 Cas9 단백질은 제한 없이 하기에 제공된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 뉴클레아제 데드 Cas9 (dCas9)이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 Cas9 닉카제 (nCas9)이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 뉴클레아제 활성 Cas9이다.
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인 (dCas9)이다. 예를 들어, dCas9 도메인은 듀플렉스 핵산 분자에 듀플렉스 핵산 분자의 어느 가닥도 절단하는 것 없이 (예를 들어, gRNA 분자를 통해) 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열의 D10X 돌연변이 및 H840X 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 임의의 아미노산 변화이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열의 D10A 돌연변이 및 H840A 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 하나의 예로서, 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 클로닝 벡터 pPlatTET-gRNA2 (승인 번호 BAV54124)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 촉매적 불활성 Cas9 (dCas9)의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00091
(참조: 예를 들어, Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression." Cell. 2013; 152(5):1173-83, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).
추가의 적합한 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본원 개시내용 및 당해 분야의 지식을 기준으로 당업자에게 자명할 수 있고 본원 개시내용의 범위 내에 있다. 상기 추가의 예시적인 적합한 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 D10A/H840A, D10A/D839A/H840A, 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이체 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (참조: 예를 들어, Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).
일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 불활성 (예를 들어, 불활성화된) DNA 절단 도메인을 갖고, 즉, Cas9는 "nCas9" 단백질 ("닉카제" Cas9에 대해)로서 언급되는 닉카제이다. 뉴클레아제-불활성화된 Cas9 단백질은 상호교환적으로 "dCas9" 단백질 (뉴클레아제-"데드" Cas9) 또는 촉매 불활성 Cas9로서 언급될 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 단백질 (또는 이의 단편)을 생성하기 위한 방법은 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28;152(5):1173-83, 이의 각각의 전문의 내용은 본원에 참조로 포함됨). 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 2개의 서브도메인인 HNH 뉴클레아제 서브도메인 및 RuvC1 서브도메인을 포함하는 것으로 공지되어 있다. HNH 서브도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하는 반면 RuvC1 서브도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. 이들 서브도메인 내 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 사일런싱시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 D10A 및 H840A는 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킨다 (참조: Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)).
일부 구현예에서, dCas9 도메인은 본원에 제공된 dCas9 도메인 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개, 적어도 1000개, 적어도 1100개, 또는 적어도 1200개 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, dCas9는 Cas9 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 Cas9 아미노산 서열에 부분적으로 또는 전반적으로 상응하거나 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, dCas9 도메인은 또 다른 Cas9에 D10A 및 H840A 돌연변이 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, dCas9는 dCas9 (D10A 및 H840A)의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00092
(한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인).
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 D10A 돌연변이를 포함하고, 위치 840에서 잔기는 상기 제공된 아미노산 서열에서, 또는 본문에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 위치에 히스티딘을 유지한다.
다른 구현예에서, D10A 및 H840A 이외의 돌연변이를 갖는 dCas9 변이체가 제공되고, 상기 변이체는 예를 들어, 뉴클레아제 불활성화된 Cas9 (dCas9)를 유도한다. 상기 돌연변이는 예를 들어 D10 및 H840에서 다른 아미노산 치환, 또는 Cas9의 뉴클레아제 도메인 내 다른 치환 (예를 들어, HNH 뉴클레아제 서브도메인 및/또는 RuvC1 서브도메인에서의 치환)을 포함한다. 일부 구현예에서, dCas9의 변이체 또는 동족체가 제공되고, 이는 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, dCas9의 변이체가 제공되고, 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 이상의 아미노산만큼 더 짧거나 더 긴 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 Cas9 닉카제이다. Cas9 닉카제는 듀플렉스 핵산 분자 (예를 들어, 듀플렉스 DNA 분자)의 단 하나의 가닥을 절단할 수 있는 Cas9 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 듀플렉스 핵산 분자의 표적 가닥을 절단하고, Cas9 닉카제가 Cas9에 결합된 gRNA (예를 들어, sgRNA)와 쌍을 형성하는 (이에 상보적인) 염기인 가닥을 절단함을 의미한다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 D10A 돌연변이를 포함하고 위치 840에 히스티딘을 갖는다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 듀플렉스 핵산 분자의 비-표적, 비-염기-편집 가닥을 절단하고, Cas9 닉카제가 Cas9에 결합된 gRNA (예를 들어, sgRNA)와 쌍을 형성하는 염기가 아닌 가닥을 절단함을 의미한다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 H840A 돌연변이를 포함하고 10번 위치에 아스파르트산 잔기 또는 상응하는 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 본원에 제공된 Cas9 닉카제 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제는 본원 개시내용 및 당해 분야의 지식을 기준으로 당업자에게 자명할 것이고 본원 개시내용의 범위 내에 있다.
예시적인 촉매적 Cas9 닉카제 (nCas9)의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00093
일부 구현예에서, Cas9는 고세균 (archaea) (예를 들어, 나노고세균) 기원의 Cas9를 언급하고, 이것은 단세포 원핵 미생물의 도메인 및 킹덤을 구성한다. 일부 구현예에서, 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 단백질은 CasX 또는 CasY 단백질일 수 있고, 이는 예를 들어, 이의 전체 내용이 참조로 포함되는 문헌 (참조: 예를 들어, Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21)에 기재되어 있다. 게놈 분리 균유전체학을 사용하여, 생활 고세균 도메인에서 최초 보고된 Cas9를 포함하는, 다수의 CRISPR-Cas 시스템을 동정하였다. 상기 다양한 Cas9 단백질은 활성 CRISPR-Cas 시스템의 일부로서 거의 연구되지 않은 나노고세균에서 발견되었다. 세균에서, 2개의 이전에 공지되지 않은 시스템인 CRISPR-CasX 및 CRISPR-CasY가 발견되었고, 이는 지금까지 발견된 가장 콤팩트한 시스템 중 하나이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집기 시스템에서, Cas9는 CasX, 또는 CasX의 변이체에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집기 시스템에서, Cas9는 CasY, 또는 CasY의 변이체에 의해 대체된다. 다른 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질이 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)로서 사용될 수 있고 본원 개시내용의 범위내에 있는 것으로 인지되어야 한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 CasX 또는 CasY 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 CasX 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 CasY 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 천연적으로 발생하는 CasX 또는 CasY 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 단백질은 천연적으로 발생하는 CasX 또는 CasY 단백질이다. 일부 구현예에서, 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 단백질은 본원에 기재된 임의의 CasX 또는 CasY 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 세균 종 기원의 CasX 및 CasY가 또한 본원의 개시내용에 따라 사용될 수 있음을 인지해야 한다.
예시적인 CasX ((uniprot.org/uniprot/F0NN87; uniprot.org/uniprot/F0NH53) tr|F0NN87|F0NN87_SULIHCRISPR-연합된 Casx 단백질 OS = 설폴로부스 아이슬란디쿠스 (Sulfolobus islandicus) (균주 HVE10/4) GN = SiH_0402 PE=4 SV=1) 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00094
예시적인 CasX (>tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR 연합된 단백질, Casx OS = 설폴로부스 아이슬란디쿠스 (균주 REY15A) GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1) 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00095
델타프로테오박테리아 CasX
Figure pct00096
예시적인 CasY ((ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1)>APG80656.1 CRISPR-연합된 단백질 CasY [배양되지 않은 파쿠박테리아 그룹 박테리움]) 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00097
Cas9 뉴클레아제는 2개의 기능성 엔도뉴클레아제 도메인을 갖는다: RuvC 및 HNH. Cas9는 표적 DNA의 반대 가닥을 절단하기 위해 뉴클레아제 도메인을 위치시키는 표적 결합시 형태적 변화를 진행한다. Cas9-매개된 DNA 절단의 최종 결과는 표적 DNA (PAM 서열의 업스트림의 약 3 내지 4개 뉴클레오타이드) 내 이중 가닥 절단 (DSB)이다. 이어서, 생성된 DSB는 2개의 일반 복구 경로 중 하나에 의해 복구된다: (1) 효율적이지만 오류 성향 비-상동성 말단 연결 (NHEJ) 경로; 또는 (2) 덜 효율적이지만 고충실도 상동성 지시된 복구 (HDR) 경로.
비-상동성 말단 연결 (NHEJ) 및/또는 상동성 지시된 복구 (HDR)의 "효율"은 임의의 간편한 방법에 의해 계산될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 효율은 성공적인 HDR의 퍼센트로 표현될 수 있다. 예를 들어, 서베이어 (surveyor) 뉴클레아제 검정을 사용하여 절단 생성물을 생성할 수 있고 기질에 대한 생성물의 비율을 사용하여 퍼센트를 계산할 수 있다. 예를 들어, 서베이어 뉴클레아제 효소를 사용하여 성공적인 HDR의 결과로서 새롭게 통합된 제한 서열을 포함하는 DNA를 직접 절단할 수 있다. 더 절단된 기질은 보다 큰 퍼센트의 HDR (보다 큰 HDR 효율)을 지적한다. 예시적인 예로서, HDR의 분율 (퍼센트)은 하기의 식을 사용하여 계산될 수 있다: [(절단 생성물)/(기질 + 절단 생성물)] (예를 들어, (b+c)/(a+b+c), 여기서, "a"는 DNA 기질의 밴드 강도이고 "b" 및 "c"는 절단 생성물이다).
일부 구현예에서, 효율은 성공적인 NHEJ의 퍼센트로 표현될 수 있다. 예를 들어, T7 엔도뉴클레아제 I 검정을 사용하여 절단 생성물을 생성할 수 있고 기질에 대한 생성물의 비율을 사용하여 NHEJ의 퍼센트를 계산할 수 있다. T7 엔도뉴클레아제 I은 야생형 및 돌연변이체 DNA 가닥의 하이브리드화로부터 비롯된 미스매칭된 헤테로듀플렉스 DNA를 절단한다 ((NHEJ는 본래의 절단 부위에서 소형 무작위 삽입 또는 결실 (indel)을 생성한다). 보다 많은 절단은 보다 큰 퍼센트의 NHEJ (보다 큰 NHEJ의 효율)를 지적한다. 예시적인 예로서, NHEJ의 분율 (백분율)은 하기의 식을 사용하여 계산될 수 있다: (1-(1-(b+c)/(a+b+c))1/2)×100, 여기서, "a"는 DNA 기질의 밴드 강도이고, "b" 및 "c"는 절단 생성물이다 (참조: Ran et. al., Cell. 2013 Sep. 12; 154(6):1380-9; and Ran et al., Nat Protoc. 2013 Nov.; 8(11): 2281-2308).
NHEJ 복구 경로는 가장 활성의 복구 기전이고, 이것은 흔히 DSB 부위에 소형 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실 (indel)을 유발한다. NHEJ-매개된 DSB 복구의 무작위는 Cas9 및 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 세포 집단이 다양한 어레이의 돌연변이를 유도할 수 있기 때문에 중요한 수행 관련성을 갖는다. 대부분의 구현예에서, NHEJ는 표적 DNA에 소형 삽입-결실을 유발하여 아미노산 결실, 삽입 또는 표적화된 유전자의 개방 판독 프레임 (ORF) 내 미성숙한 정지 코돈을 유도하는 프레임쉬프트 돌연변이를 유도한다. 이상적인 최종 결과는 표적화된 유전자 내 기능 상실 돌연변이이다.
NHEJ-매개된 DSB 복구는 흔히 유전자의 개방 판독 프레임을 붕괴시키고, 상동성 지시된 복구 (HDR)를 사용하여 단일 뉴클레오타이드 변화에서 형광단 또는 태그의 부가와 같은 대형 삽입에 이르는 특이적 뉴클레오타이드 변화를 생성할 수 있다. 유전자 편집을 위해 HDR을 사용하기 위해, 목적하는 서열을 포함하는 DNA 복구 주형은 gRNA(들) 및 Cas9 또는 Cas9 닉카제와 함께 관심 대상의 세포 유형에 전달될 수 있다. 복구 주형은 목적하는 편집은 물론 표적의 바로 업스트림 및 다운스트림에 있는 추가의 상동성 서열 (좌측 및 우측 상동성 아암으로 호칭됨)을 포함할 수 있다. 각각의 상동성 아암의 길이는 도입되는 변화의 크기에 좌우될 수 있고, 보다 큰 삽입은 보다 긴 상동성 아암을 요구한다. 복구 주형은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 이중 가닥 DNA 플라스미드일 수 있다. HDR의 효율은 Cas9, gRNA 및 외인성 복구 주형을 발현하는 세포에서도 일반적으로 낮다 (<10%의 변형된 대립유전자). HDR의 효율은 HDR이 세포 주기의 S 및 G2기 동안에 발생하기 때문에 세포를 동조 (synchronizing)시킴으로써 증진될 수 있다. 화학적으로 또는 유전학적으로 NHEJ에 관여하는 유전자의 억제는 또한 HDR 빈도를 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9는 변형된 Cas9이다. 소정의 gRNA 표적화 서열은 부분 상동성이 존재하는 게놈 전반에 걸쳐 추가의 부위를 가질 수 있다. 이들 부위는 표적-이탈으로 불리우고 gRNA를 디자인하는 경우 고려될 필요가 있다. gRNA 디자인을 최적화시키는 것에 추가로, CRISPR 특이성은 또한 Cas9로의 변형을 통해 증가될 수 있다. Cas9는 2개의 뉴클레아제 도메인, RuvC 및 HNH의 조합 활성을 통해 이중 가닥 절단 (DSB)을 생성한다. SpCas9의 D10A 돌연변이체인 Cas9 닉카제는 하나의 뉴클레아제 도메인을 보유하고 DSB가 아닌 DNA 닉 (nick)을 생성한다. 닉카제 시스템은 또한 특이적 유전자 편집을 위해 HDR-매개된 유전자 편집과 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9는 변이체 Cas9 단백질이다. 변이체 Cas9 폴리펩타이드는 야생형 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 비교하는 경우 하나의 아미노산이 상이한 (예를 들어, 결실, 삽입, 치환, 융합을 갖는) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 Cas9 폴리펩타이드는 Cas9 폴리펩타이드의 뉴클레아제 활성을 감소시키는 아미노산 변화 (예를 들어, 결실, 삽입 또는 치환)를 갖는다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 Cas9 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 Cas9 단백질의 뉴클레아제 활성의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 실질적인 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다. 대상 Cas9 단백질이 실질적인 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 변이체 Cas9 단백질인 경우, 이것은 "dCas9"로서 언급될 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는다. 예를 들어, 변이체 Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질, 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질의 엔도뉴클레아제 활성의 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.1% 미만을 나타낸다.
일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 가이드 표적 서열의 상보적 가닥을 절단할 수 있지만 이중 가닥 가이드 표적 서열의 비-상보적 가닥을 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 예를 들어, 변이체 Cas9 단백질은 RuvC 도메인의 기능을 감소시키는 돌연변이 (아미노산 치환)를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 D10A (아미노산 위치 10에서 아스파르테이트에서 알라닌으로)를 갖고 따라서 이중 가닥 가이드 표적 서열의 상보적 가닥을 절단할 수 있지만 이중 가닥 가이드 표적 서열의 비-상보성 가닥을 절단하는 감소된 능력 (따라서, 변이체 Cas9 단백질이 이중 가닥 표적 핵산을 절단하는 경우 이중 가닥 절단 (DSB) 대신 단일 가닥 절단 (SSB)을 유도한다)을 갖는다 (참조: 예를 들어, Jinek et al., Science. 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21).
일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 이중 가닥 가이드 표적 서열의 비-상보성 가닥을 절단할 수 있지만 가이드 표적 서열의 상보성 가닥을 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 예를 들어, 변이체 Cas9 단백질은 HNH 도메인 (RuvC/HNH/RuvC 도메인 모티프)의 기능을 감소시키는 돌연변이 (아미노산 치환)를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A (아미노산 위치 840에서 히스티딘에서 알라닌으로) 돌연변이를 갖고 따라서 가이드 표적 서열의 비-상보성 가닥을 절단할 수 있지만 가이드 표적 서열의 상보성 가닥을 절단하는 감소된 능력 (따라서, 변이체 Cas9 단백질이 이중 가닥 가이드 표적 서열을 절단하는 경우 DSB 대신 SSB를 유도하는)을 갖는다. 상기 Cas9 단백질은 가이드 표적 서열 (예를 들어, 단일 가닥 가이드 표적 서열)을 절단하는 감소된 능력을 갖지만 가이드 표적 서열 (예를 들어, 단일 가닥 가이드 표적 서열)에 결합하는 능력을 보유한다.
일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 이중 가닥 표적 DNA의 상보성 및 비-상보성 가닥 둘 다를 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 D10A 및 H840A 돌연변이 둘 다를 함유하여, 상기 폴리펩타이드는 이중 가닥 표적 DNA의 상보성 및 비-상보성 가닥 둘 다를 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 상기 Cas9 단백질은 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 감소된 능력을 갖지만 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 보유한다.
또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 W476A 및 W1126A 돌연변이를 함유하여 폴리펩타이드는 표적 DNA를 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 상기 Cas9 단백질은 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 감소된 능력을 갖지만 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 보유한다.
또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 함유하여 폴리펩타이드는 표적 DNA를 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 상기 Cas9 단백질은 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 감소된 능력을 갖지만 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 보유한다.
또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, W476A 및 W1126A 돌연변이를 함유하여 폴리펩타이드는 표적 DNA를 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 상기 Cas9 단백질은 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 감소된 능력을 갖지만 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, D10A, W476A 및 W1126A 돌연변이를 함유하여 폴리펩타이드는 표적 DNA를 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 상기 Cas9 단백질은 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 감소된 능력을 갖지만 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 변이체 Cas9는 Cas9 HNH 도메인에서 위치 840에서 촉매 His 잔기 (A840H)를 복구하였다.
또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 함유하여 폴리펩타이드는 표적 DNA를 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 상기 Cas9 단백질은 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 감소된 능력을 갖지만 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 D10A, H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 함유하여 폴리펩타이드는 표적 DNA를 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 상기 Cas9 단백질은 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 감소된 능력을 갖지만 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질이 W476A 및 W1126A 돌연변이를 함유하는 경우 또는 상기 변이체 Cas9 단백질이 P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 함유하는 경우, 변이체 Cas9 단백질은 효율적으로 PAM 서열에 결합하지 않는다. 따라서, 일부 상기 구현예에서, 상기 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용되는 경우, 상기 방법은 PAM 서열을 요구하지 않는다. 다른 말로, 일부 구현예에서, 상기 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용되는 경우, 상기 방법은 가이드 RNA를 포함할 수 있지만 상기 방법은 PAM 서열의 부재하에 수행될 수 있다 (그리고, 결합 특이성은 따라서 가이드 RNA의 표적화 분절에 의해 제공된다). 다른 잔기는 상기 효과를 성취하기 위해 돌연변이될 수 있다 (즉, 하나 또는 다른 뉴클레아제 부분을 불활성화시킬 수 있다). 비제한적인 예로서, 잔기 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, 및/또는 A987은 변경 (즉, 치환된)될 수 있다. 또한, 알라닌 치환과는 다른 돌연변이가 적합하다.
일부 구현예에서, 감소된 촉매 활성 (예를 들어, Cas9 단백질이 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, 및/또는 A987 돌연변이, 예를 들어, D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A, 및/또는 D986A를 갖는 경우)을 갖는 변이체 Cas9 단백질은 이것이 가이드 RNA와 상호작용하는 능력을 보유하는 한 부위 특이적 방식으로 (이것은 여전히 가이드 RNA에 의해 표적 DNA 서열에 가이드되기 때문에) 표적 DNA에 여전히 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체 Cas 단백질은 spCas9, spCas9-VRQR, spCas9-VRER, xCas9 (sp), saCas9, saCas9-KKH, spCas9-MQKSER, spCas9-LRKIQK, 또는 spCas9-LRVSQL일 수 있다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환체 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R (SpCas9-MQKFRAER)을 포함하고 변경된 PAM 5'-NGC-3'에 대해 특이성을 갖는 변형된 SpCas9가 사용되었다.
에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) Cas9에 대한 대안은 포유동물 세포에서 절단 활성을 나타내는 Cpf1 패밀리로부터 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 프레보텔라 (Prevotella) 및 프란시셀라 1 (Francisella 1)로부터의 CRISPR(CRISPR/Cpf1)은 CRISPR/Cas9 시스템과 유사한 DNA-편집 기술이다. Cpf1은 부류 II CRISPR/Cas 시스템의 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제이다. 이와 같이 획득된 면역 기전은 프레보텔라 (Prevotella) 및 프란시셀라 (Francisella) 세균에서 발견된다. Cpf1 유전자는 바이러스 DNA를 발견하고 절단하기 위해 가이드 RNA를 사용하는 엔도뉴클레아제를 암호화하는, CRISPR 유전자좌와 연합되어 있다. Cpf1은 Cas9 보다 소형이거나 보다 단순한 엔도뉴클레아제이고 CRISPR/Cas9 시스템 한계의 일부를 극복한다. Cas9 뉴클레아제와 다르게, Cpf1-매개된 DNA 절단의 결과는 짧은 3' 오버행과 함께 이중 가닥 절단이다. Cpf1의 엇갈린 절단 패턴은 통상적인 제한 효소 클로닝과 유사하게, 방향성 유전자 전달 가능성을 열어 유전자 편집의 효율을 증가시킬 수 있다. 상기된 Cas9 변이체 및 오톨로그 처럼, Cpf1은 또한 CRISPR에 의해 SpCas9가 선호하는 NGG PAM 부위가 없는 AT-풍부 영역 또는 AT-풍부 게놈에 표적화될 수 있는 부위의 수를 증대시킬 수 있다. Cpf1 유전자좌는 혼합된 알파/베타 도메인, RuvC-I에 이어서 나선 영역, RuvC-II 및 아연 핑거 유사 도메인을 포함한다. Cpf1 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 갖는다. 추가로, Cpf1은 HNH 엔도뉴클레아제 도메인을 갖지 않고, Cpf1의 N-말단은 Cas9의 알파-나선 인지 돌출부를 갖지 않는다. Cpf1 CRISPR-Cas 도메인 구조는 Cpf1이 기능적으로 특유하고, 부류 2, V형 CRISPR 시스템으로서 분류됨을 보여준다. Cpf1 유전자좌는 II형 시스템으로부터 기원하는 것 보다 I형 및 III형과 보다 유사한 Cas1, Cas2 및 Cas4 단백질을 암호화한다. 기능적 Cpf1은 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 필요로 하지 않고 따라서 CRISPR (crRNA)만이 요구된다. 이것은 게놈 편집에 이로운데 이는 Cpf1이 Cas9 보다 소형인 것 뿐만 아니라 이것은 보다 소형의 sgRNA 분자 (대략적으로 Cas9 만큼 많은 뉴클레오타이드의 절반)를 갖기 때문이다. Cpf1-crRNA 복합체는 Cas9에 의해 표적화된 G-풍부 PAM과는 대조적으로 프로토스페이서 인접 모티프 5'-YTN-3'의 동정에 의해 표적 DNA 또는 RNA를 절단한다. PAM의 동정 후, Cpf1은 4 또는 5개 뉴클레오타이드 오버행의 점성 말단 유사 DNA 이중 가닥 절단을 도입한다.
일부 구현예에서, Cas9는 변경된 PAM 서열에 대해 특이성을 갖는 Cas9이다. 일부 구현예에서, 추가 Cas9 변이체 및 PAM 서열은 문헌 (참조: Miller, S.M., et al. Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs, Nat. Biotechnol. (2020), 이의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체는 특이적 PAM 요건을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체, 예를 들어, SpCas9 변이체는 NRNH PAM에 대해 특이성을 가지며, 여기서, R은 A 또는 G이고 H는 A, C 또는 T이다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 PAM 서열 AAA, TAA, CAA, GAA, TAT, GAT, 또는 CAC에 대해 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 서열번호 1에 넘버링된 바와 같이 위치 1114, 1134, 1135, 1137, 1139, 1151, 1180, 1188, 1211, 1218, 1219, 1221, 1249, 1256, 1264, 1290, 1318, 1317, 1320, 1321, 1323, 1332, 1333, 1335, 1337, 또는 1339에서 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 서열번호 1에 넘버링된 바와 같이 위치 1114, 1135, 1218, 1219, 1221, 1249, 1320, 1321, 1323, 1332, 1333, 1335, 또는 1337에서 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 서열번호 1에 넘버링된 바와 같이 위치 1114, 1134, 1135, 1137, 1139, 1151, 1180, 1188, 1211, 1219, 1221, 1256, 1264, 1290, 1318, 1317, 1320, 1323, 1333에서 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 서열번호 1에 넘버링된 바와 같이 위치 1114, 1131, 1135, 1150, 1156, 1180, 1191, 1218, 1219, 1221, 1227, 1249, 1253, 1286, 1293, 1320, 1321, 1332, 1335, 1339에서 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 서열번호 1에 넘버링된 바와 같이 위치 1114, 1127, 1135, 1180, 1207, 1219, 1234, 1286, 1301, 1332, 1335, 1337, 1338, 1349에서 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. SpCas9 변이체의 예시적인 아미노산 치환 및 PAM 특이성은 표 1A-1D에 나타낸다.
[표 1A]
Figure pct00098
[표 1B]
Figure pct00099
[표 1C]
Figure pct00100
[표 1D]
Figure pct00101
일부 구현예에서, Cas9는 나이세리아 메닌기티디스 Cas9 (NmeCas9) 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNGAYW PAM에 대해 특이성을 가지고, 여기서, Y는 C 또는 T이고, W는 A 또는 T이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNGYTT PAM에 대해 특이성을 가지고, 여기서, Y는 C 또는 T이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNGTCT PAM에 대해 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 Nme1 Cas9이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNGATT PAM, NNNNCCTA PAM, NNNNCCTC PAM, NNNNCCTT PAM, NNNNCCTG PAM, NNNNCCGT PAM, NNNNCCGGPAM, NNNNCCCA PAM, NNNNCCCT PAM, NNNNCCCC PAM, NNNNCCAT PAM, NNNNCCAG PAM, NNNNCCAT PAM, 또는 NNNGATT PAM에 대해 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, Nme1Cas9는 NNNNGATT PAM, NNNNCCTA PAM, NNNNCCTC PAM, NNNNCCTT PAM, 또는 NNNNCCTG PAM에 대해 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 CAA PAM, CAAA PAM, 또는 CCA PAM에 대해 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 Nme2 Cas9이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNCC (N4CC) PAM에 대해 특이성을 가지고, 여기서, N은 A, G, C, 또는 T 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNCCGT PAM, NNNNCCGGPAM, NNNNCCCA PAM, NNNNCCCT PAM, NNNNCCCC PAM, NNNNCCAT PAM, NNNNCCAG PAM, NNNNCCAT PAM, 또는 NNNGATT PAM에 대해 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 Nme3Cas9이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNCAAA PAM, NNNNCC PAM, 또는 NNNNCNNN PAM에 대해 특이성을 갖는다. 추가 NmeCas9 특징 및 PAM 서열은 문헌 (참조: Edraki et al. Mol. Cell. (2019) 73(4): 714-726)에 기재되어 있으며 상기 문헌은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
Nme1Cas9의 예시적인 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
II형 CRISPR RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 Cas9 [나이세리아 메닌기티디스] WP_002235162.1
Figure pct00102
Nme2Cas9의 예시적인 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
II형 CRISPR RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 Cas9 [나이세리아 메닌기티디스] WP_002230835.1　　　　
Figure pct00103
핵염기 편집기의 Cas12 도메인
전형적으로, 미생물 CRISPR-Cas 시스템은 부류 1 및 부류 2 시스템으로 분류된다. 부류 1 시스템은 멀티서브유닛 이펙터 복합체를 갖고, 부류 2 시스템은 단일 단백질 이펙터를 갖는다. 예를 들어, Cas9 및 Cpf1은 부류 2 이펙터이지만 상이한 유형 (각각 II형 및 V형)이다. Cpf1에 추가로, 부류 2, 유형 V CRISPR-Cas 시스템은 또한 Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i를 포함한다. 예를 들어, 문헌 (참조: Shmakov et al., "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems," Mol. Cell, 2015 Nov. 5; 60(3): 385-397; Makarova et al., "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?" CRISPR Journal, 2018, 1(5): 325-336; and Yan et al., "Functionally Diverse Type V CRISPR-Cas Systems," Science, 2019 Jan. 4; 363: 88-91; 이의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 유형 V Cas 단백질은 RuvC (또는 RuvC-유사) 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. 성숙한 CRISPR RNA (crRNA)의 생성은 일반적으로 tracrRNA-독립적이지만, Cas12b/C2c1은 예를 들어, crRNA의 생성을 위해 tracrRNA를 필요로 한다. Cas12b/C2c1은 DNA 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA 둘 다에 의존한다.
본원 개시내용에 고려되는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질은 부류 2, 유형 V (Cas12 단백질)로서 분류된 Cas 단백질을 포함한다. Cas 부류 2, 유형 V 단백질의 비제한적인 예는 Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i, 이의 상동체 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 Cas12 단백질은 또한 Cas12 뉴클레아제, Cas12 도메인, 또는 Cas12 단백질 도메인으로서 언급될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 Cas12 단백질은 데아미나제 도메인과 같은 내부적으로 융합된 단백질 도메인에 의해 중단된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas12 도메인은 뉴클레아제 불활성 Cas12 도메인 또는 Cas12 닉카제이다. 일부 구현예에서, Cas12 도메인은 뉴클레아제 활성 도메인이다. 예를 들어, Cas12 도메인은 듀플렉스 핵산의 하나의 가닥 (예를 들어, 듀플렉스 DNA 분자)을 절단하는 Cas12 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas12 도메인은 본원에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개, 적어도 1000개, 적어도 1100개, 또는 적어도 1200개 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas12의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질은 2개의 Cas12 도메인 중 하나를 포함한다: (1) Cas12의 gRNA 결합 도메인; 또는 (2) Cas12의 DNA 절단 도메인. 일부 구현예에서, Cas12 또는 이의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas12 변이체"로서 언급된다. Cas12 변이체는 Cas12 또는 이의 단편과 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas12 변이체는 야생형 Cas12와 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, Cas12 변이체는 야생형 Cas12와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Cas12 변이체는 Cas12의 단편 (예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA 절단 도메인)을 포함하여, 상기 단편은 야생형 Cas12의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, 상기 단편은 상응하는 야생형 Cas12의 아미노산 길이와 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하다. 일부 구현예에서, 단편은 적어도 100개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 상기 단편은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 또는 적어도 1300개 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, Cas12는 Cas12 뉴클레아제 활성을 변경하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 Cas12 아미노산 서열에 부분적으로 또는 전반적으로 상응하거나 포함한다. 상기 돌연변이는 예를 들어, Cas12의 RuvC 뉴클레아제 도메인 내 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12의 변이체 또는 동족체가 제공되고, 이는 야생형 Cas12와 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, Cas12의 변이체가 제공되고, 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 이상의 아미노산 만큼 더 짧거나 더 긴 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 Cas12 융합 단백질은 Cas12 단백질의 전장 아미노산 서열, 예를 들어, 본원에 제공된 Cas12 서열 중 하나를 포함한다. 다른 구현예에서, 그러나, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질은 전장 Cas12 서열을 포함하지 않고 단지 하나 이상의 이의 단편을 포함한다. 적합한 Cas12 도메인의 예시적인 아미노산 서열이 본원에 제공되고, Cas12 도메인 및 단편의 추가의 적합한 서열은 당업자에게 자명할 것이다.
일반적으로, 부류 2, 유형 V Cas 단백질은 단일 기능성 RuvC 엔도뉴클레아제 도메인을 갖는다 (참조: 예를 들어, Chen et al., "CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity," Science 360:436-439 (2018)). 일부 경우에, Cas12 단백질은 변이체 Cas12b 단백질이다 (참조: Strecker et al., Nature Communications, 2019, 10(1): Art. No.: 212). 하나의 구현예에서, 변이체 Cas12 폴리펩타이드는 야생형 Cas12 단백질의 아미노산 서열과 비교하는 경우 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산이 상이한 (예를 들어, 결실, 삽입, 치환, 융합을 갖는) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 Cas12 폴리펩타이드는 Cas12 폴리펩타이드의 활성을 감소시키는 아미노산 변화 (예를 들어, 결실, 삽입 또는 치환)를 갖는다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 Cas12는 상응하는 야생형 Cas12b 단백질의 닉카제 활성의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만을 갖는, Cas12b 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, 변이체 Cas12b 단백질은 실질적인 닉카제 활성을 갖지 않는다.
일부 경우에, 변이체 Cas12b 단백질은 감소된 닉카제 활성을 갖는다. 예를 들어, 변이체 Cas12b 단백질은 야생형 Cas12b 단백질의 닉카제 활성의 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.1% 미만을 나타낸다.
일부 구현예에서, Cas12 단백질은 포유동물 세포에서 활성을 나타내는 Cas12a/Cpf1 패밀리 기원의 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 포함한다. 프레보텔라 (Prevotella) 및 프란시셀라 1 (Francisella 1)로부터의 CRISPR (CRISPR/Cpf1)은 CRISPR/Cas9 시스템과 유사한 DNA 편집 기술이다. Cpf1은 부류 II CRISPR/Cas 시스템의 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제이다. 이와 같이 획득된 면역 기전은 프레보텔라 및 프란시셀라 세균에서 발견된다. Cpf1 유전자는 바이러스 DNA를 발견하고 절단하기 위해 가이드 RNA를 사용하는 엔도뉴클레아제를 암호화하는, CRISPR 유전자좌와 연합되어 있다. Cpf1은 Cas9 보다 소형이거나 보다 단순한 엔도뉴클레아제이고 CRISPR/Cas9 시스템 한계의 일부를 극복한다. Cas9 뉴클레아제와 달리, Cpf1-매개된 DNA 절단의 결과는 짧은 3' 오버행과 함께 이중 가닥 절단이다. Cpf1의 엇갈린 절단 패턴은 통상적인 제한 효소 클로닝과 유사하게, 방향성 유전자 전달 가능성을 열어 유전자 편집의 효율을 증가시킬 수 있다. 상기된 Cas9 변이체 및 오톨로그 처럼, Cpf1은 또한 CRISPR에 의해 SpCas9가 선호하는 NGG PAM 부위가 없는 AT-풍부 영역 또는 AT-풍부 게놈에 표적화될 수 있는 부위의 수를 증대시킬 수 있다. Cpf1 유전자좌는 혼합된 알파/베타 도메인, RuvC-I에 이어서 나선 영역, RuvC-II 및 아연 핑거 유사 도메인을 포함한다. Cpf1 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 갖는다. 추가로, Cas9와 다르게, Cpf1은 HNH 엔도뉴클레아제 도메인을 갖지 않고, Cpf1의 N-말단은 Cas9의 알파-나선 인지 돌출부를 갖지 않는다. Cpf1 CRISPR-Cas 도메인 구조는 Cpf1이 기능적으로 특유하고, 부류 2, V형 CRISPR 시스템으로서 분류됨을 보여준다. Cpf1 유전자좌는 II형 시스템 보다 I형 및 III형과 보다 유사한 Cas1, Cas2 및 Cas4 단백질을 암호화한다. 기능적 Cpf1은 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 요구하지 않고 따라서 CRISPR (crRNA)만이 요구된다. 이것은 게놈 편집에 이로운데 이는 Cpf1이 Cas9 보다 소형인 것 뿐만 아니라 이것은 보다 소형의 sgRNA 분자 (대략적으로 Cas9 만큼 많은 뉴클레오타이드의 절반)를 갖기 때문이다. Cpf1-crRNA 복합체는 Cas9에 의해 표적화된 G-풍부 PAM과는 대조적으로 프로토스페이서 인접 모티프 5'-YTN-3' 또는 5'-YTTN-3'의 동정에 의해 표적 DNA 또는 RNA를 표적화한다. PAM의 동정 후, Cpf1은 4 또는 5개 뉴클레오타이드 오버행을 갖는 점성 말단 유사 DNA 이중 가닥 절단을 도입한다.
본원 개시내용의 일부 양상에서, 상응하는 야생형 효소와 관련하여, 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 하나의 가닥 또는 가닥 둘 다를 절단하는 능력이 부재인 CRISPR 효소를 암호화하는 벡터가 사용될 수 있다. Cas12는 야생형 예시적인 Cas12 폴리펩타이드 (예를 들어, 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii)로부터의 Cas12)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 언급할 수 있다. Cas12는 야생형 예시적인 Cas12 폴리펩타이드 (예를 들어, 바실러스 히사시 (BhCas12b), 바실러스 종 V3-13 (BvCas12b) 및 알리사이클로바실러스 액시디필러스 (Alicyclobacillus acidiphilus) (AaCas12b)로부터)와 최대 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성 또는 최대 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 언급할 수 있다. Cas12는 야생형 또는 결실, 삽입, 치환, 변이체, 돌연변이, 융합, 키메라 또는 이의 임의의 조합과 같은 아미노산 변화를 포함할 수 있는 변형된 형태의 Cas12 단백질을 언급할 수 있다.
핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질
본원 개시내용의 일부 양상은 핵산 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질로서 작용하고, 이를 사용하여 염기 편집기와 같은 단백질을 특정 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열에 가이드할 수 있는, 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 도메인 및 데아미나제 도메인을 포함한다. 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질의 비제한적인 예는 Cas9 (예를 들어, dCas9 및 nCas9), Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i를 포함한다. Cas 효소의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9 (또한 Csn1 또는 Csx12로서 공지된), Cas10, Cas10d, Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csx11, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, II형 Cas 이펙터 단백질, V형 Cas 이펙터 단백질, VI형 Cas 이펙터 단백질, CARF, DinG, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 또는 가공된 버전을 포함한다. 다른 핵산 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 또한 본원 개시내용의 범위 내에 있지만, 이들은 구체적으로 본원 개시내용에 열거되지 않을 수 있다. 예를 들어, 문헌 (참조: Makarova et al. "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?" CRISPR 2018 2018 Oct;1:325-336. doi: 10.1089/crispr.2018.0033; Yan et al. "Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems" Science. 2019 Jan 4;363(6422):88-91. doi: 10.1126/science.aav7271)을 참조하고, 이의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
Cas9와는 상이한 PAM 특이성을 갖는 핵산 프로그램 가능한 DNA-결합 단백질의 하나의 예는 프레보텔라 (Prevotella) 및 프란시셀라 (Francisella　1) (Cpf1)로부터 클러스터링된 규칙적 사이공간의 짧은 팔린드롬 반복체이다. Cas9과 유사하게, Cpf1은 또한 부류 2 CRISPR 이펙터이다. Cpf1이 Cas9와는 별개의 특성으로 강한 DNA 간섭을 매개하는 것으로 나타났다. Cpf1은 tracrRNA 부재의 단일의 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제이고, 이것은 T-풍부 프로토스페이서-인접 모티프(TTN, TTTN, 또는 YTN)를 사용한다. 더욱이, Cpf1은 엇갈린 이중 가닥 절단을 통해 DNA를 절단한다. 16개 Cpf1-패밀리 단백질 중에서, 액시다미노코커스 (Acidaminococcus) 및 라크노스피라세아 (Lachnospiraceae)로부터의 2개의 효소는 인간 세포에서 효율적인 게놈-편집 활성을 갖는 것으로 나타난다. Cpf1 단백질은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 (참조: Yamano et al., "Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA."　Cell　(165) 2016, p. 949-962; 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 이전에 기재되었다.
본 발명의 조성물 및 방법에 또한 유용한 것은 가이드 뉴클레오타이드 서열 프로그래밍 가능한 DNA-결합 단백질 도메인으로서 사용될 수 있는 뉴클레아제-불활성 Cpf1 (dCpf1) 변이체이다. Cpf1 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사하지만 HNH 엔도뉴클레아제 도메인을 갖지 않는 RuvC-유사 엔도뉴클레아제를 갖고, Cpf1의 N-말단은 Cas9의 알파-나선 인지 돌출부를 갖지 않는다. 문헌 (참조: Zetsche et al.,　Cell,　163, 759-771, 2015 (이는 본원에 참조로 포함된다))에서는 Cpf1의 RuvC-유사 도메인이 DNA 가닥 둘 다를 절단하는데 관여하고 RucC-유사 도메인의 불활성화가 Cpf1 뉴클레아제 활성을 불활성화시킴을 보여주었다. 예를 들어, 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida) Cpf1에서 D917A, E1006A, 또는 D1255A에 상응하는 돌연변이는 Cpf1 뉴클레아제 활성을 불활성화시킨다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용의 dCpf1은 D917A, E1006A, D1255A, D917A/E1006A, D917A/D1255A, E1006A/D1255A, 또는 D917A/E1006A/D1255A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. Cpf1의 RuvC 도메인을 불활성화시키는 임의의 돌연변이, 예를 들어, 치환 돌연변이, 결실 또는 삽입이 본원 개시내용에 따라 사용될 수 있는 것으로 이해되어야만 한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 Cpf1 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, Cpf1 단백질은 Cpf1 닉카제 (nCpf1)이다. 일부 구현예에서, Cpf1 단백질은 뉴클레아제 불활성 Cpf1 (dCpf1)이다. 일부 구현예에서, Cpf1, nCpf1 또는 dCpf1은 본원에 기재된 Cpf1 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, dCpf1은 본원에 기재된 Cpf1 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, D917A, E1006A, D1255A, D917A/E1006A, D917A/D1255A, E1006A/D1255A, 또는 D917A/E1006A/D1255A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 다른 세균 종 기원의 Cpf1이 또한 본원 개시내용에 따라 사용될 수 있음을 인지해야 한다.
야생형 프란시셀라 노비시다 Cpf1 (D917, E1006, 및 D1255는 굵게 표시하고 밑줄 친다)
Figure pct00104
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A (A917, E1006, 및 D1255는 굵게 표시하고 밑줄 친다)
Figure pct00105
프란시셀라 노비시다 Cpf1 E1006A (D917, A1006, 및 D1255는 굵게 표시하고 밑줄 친다)
Figure pct00106
프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida) Cpf1 D1255A (D917, E1006, 및 A1255는 굵게 표시하고 밑줄 친다)
Figure pct00107
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A/E1006A (A917, A1006, 및 D1255는 굵게 표시하고 밑줄 친다)
Figure pct00108
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A/D1255A (A917, E1006, 및 A1255는 굵게 표시하고 밑줄 친다)
Figure pct00109
프란시셀라 노비시다 Cpf1 E1006A/D1255A (D917, A1006, 및 A1255는 굵게 표시하고 밑줄 친다)
Figure pct00110
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A/E1006A/D1255A (A917, A1006, 및 A1255는 굵게 표시하고 밑줄 친다)
Figure pct00111
일부 구현예에서, 융합 단백질에 존재하는 Cas9 도메인의 하나는 PAM 서열이 요구되지 않는 가이드 뉴클레오타이드 서열-프로그래밍 가능한 DNA-결합 단백질 도메인으로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 스타필로코커스 아우레우스로부터 기원하는 Cas9 도메인 (SaCas9)이다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SaCas9, 뉴클레아제 불활성 SaCas9 (SaCas9d), 또는 SaCas9 닉카제 (SaCas9n)이다. 일부 구현예에서, SaCas9는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 N579A 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인 또는 SaCas9n 도메인은 비-카노니칼 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인 또는 SaCas9n 도메인은 NNGRRT 또는 NNGRRT PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 E781X, N967X, 및 R1014X 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함하고, 여기서, X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 E781K, N967K, 및 R1014H 돌연변이, 또는 하나 이상의 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 E781K, N967K, 또는 R1014H 돌연변이 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다.
예시적인 SaCas9 서열
Figure pct00112
밑줄 치고 굵게 표시한 상기 잔기 N579는 돌연변이시켜 (예를 들어, A579로) SaCas9 닉카제를 생성할 수 있다.
예시적인 SaCas9n 서열
Figure pct00113
N579로부터 돌연변이되어 SaCas9 닉카제를 생성할 수 있는 상기 잔기 A579는 밑줄 치고 굵게 표시한다.
예시적인 SaKKH Cas9
Figure pct00114
N579로부터 돌연변이되어 SaCas9 닉카제를 생성할 수 있는 상기 잔기 A579는 밑줄 치고 굵게 표시한다. E781, N967, 및 R1014로부터 돌연변이되어 SaKKH Cas9를 생성할 수 있는 상기 잔기 K781, K967, 및 H1014는 밑줄 치고 이탤릭으로 나타낸다.
일부 구현예에서, napDNAbp는 환형 퍼뮤턴트이다. 하기의 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭한다.
CP5 (MSP "NGC" PID 및 "D10A" 닉카제와 함께):
Figure pct00115
일부 구현예에서, 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 이펙터이다. 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 이펙터는 제한 없이 Cas9, Cpf1, Cas12b/C2c1, 및 Cas12c/C2c3을 포함한다. 전형적으로, 미생물 CRISPR-Cas 시스템은 부류 1 및 부류 2 시스템으로 분류된다. 부류 1 시스템은 멀티서브유닛 이펙터 복합체를 갖고, 부류 2 시스템은 단일 단백질 이펙터를 갖는다. 예를 들어, Cas9 및 Cpf1은 부류 2 이펙터이다. Cas9 및 Cpf1에 추가로, 3개의 별개의 부류 2 CRISPR-Cas 시스템 (Cas12b/C2c1 및 Cas12c/C2c3)은 문헌 (참조: Shmakov et al., "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems",　Mol. Cell,　2015 Nov. 5; 60(3): 385-397, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다)에 기재되었다. 시스템의 2개의 이펙터, Cas12b/C2c1 및 Cas12c/C2c3은 Cpf1과 관련된 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. 제3 시스템은 2개의 예측된 HEPN RNase 도메인을 갖는 이펙터를 포함한다. 성숙한 CRISPR RNA의 생성은 Cas12b/C2c1에 의한 CRISPR의 생성과 달리 tracrRNA 독립적이다. Cas12b/C2c1은 DNA 절단을 위해 CRISPR RNA 및 tracrRNA 둘 다에 의존한다.
알리사이클로바실러스 액시도테라스트리스 Cas12b/C2c1 (AacC2c1)의 결정 구조는 키메라 단일 분자 가이드 RNA (sgRNA)와의 복합체로 보고되었다. 문헌 (예를 들어, Liu et al., "C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism",　Mol. Cell,　2017 Jan. 19; 65(2):310-322)을 참조하고 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 결정 구조는 3원 복합체로서 표적 DNA에 결합된 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) C2c1에서도 보고되었다. 문헌 (예를 들어, Yang et al., "PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease",　Cell,　2016 Dec. 15; 167(7):1814-1828)을 참조하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 표적 및 비-표적 DNA 가닥 둘 다와 함께 AacC2c1의 촉매 적격의 형태는 단일 RuvC 촉매 포켓 내에 독립적으로 위치하는 것으로 캡쳐되었고, Cas12b/C2c1-매개된 절단은 표적 DNA의 엇갈린 7개 뉴클레오타이드 절단을 유도한다. Cas12b/C2c1 3원 복합체와 이전에 동정된 Cas9 및 Cpf1 대응물 간의 구조적 비교는 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 사용되는 기전의 다양성을 입증한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 핵산 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 Cas12b/C2c1 또는 Cas12c/C2c3 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12b/C2c1 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12c/C2c3 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 천연적으로 발생하는 Cas12b/C2c1 또는 Cas12c/C2c3 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 천연적으로 발생하는 Cas12b/C2c1 또는 Cas12c/C2c3 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 본원에 제공된 napDNAbp 서열 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 세균 종 기원의 Cas12b/C2c1 또는 Cas12c/C2c3이 또한 본원 개시내용에 따라 사용될 수 있음을 인지해야 한다.
Cas12b/C2c1 ((uniprot.org/uniprot/T0D7A2#2) sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR-연합된 엔도뉴클레아제 C2c1 OS = 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스 (균주 ATCC 49025 / DSM 3922/ CIP 106132 / NCIMB 13137/GD3B) GN=c2c1 PE=1 SV=1) 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00116
AacCas12b (알리사이클로바실러스 액시디필러스) - WP_067623834
Figure pct00117
BhCas12b (바실러스 히사시) NCBI 참조 서열: WP_095142515
Figure pct00118
BvCas12b V4로 명명되는 변이체를 포함한다　(S893R/K846R/E837G는 상기 wt로 상대적으로 변경됨). BhCas12b (V4)는 다음과 같이 표현된다: 5' mRNA Cap---5'UTR---bhCas12b---정지 서열 --- 3'UTR --- 120polyA 테일
5'UTR:
Figure pct00119
3' UTR (TriLink 표준 UTR)
Figure pct00120
bhCas12b (V4)의 핵산 서열
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
일부 구현예에서, Cas12b는 BvCas12B이다. 일부 구현예에서, Cas12b는 아래에 제공된 예시적인 BvCas12B 서열에 넘버링된 바와 같이 아미노산 치환 S893R, K846R, 및 E837G를 포함한다.
BvCas12b (바실러스 종. V3-13) NCBI 참조 서열: WP_101661451.1
Figure pct00124
일부 구현예에서, Cas12b는 BTCas12b.BTCas12b (바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans)) NCBI 참조 서열: WP_041902512
Figure pct00125
일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12c를 언급한다. 일부 구현예에서, Cas12c 단백질은 Cas12c1 또는 Cas12c1의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12c2 또는 Cas12c2의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 올레이필러스 속 (Oleiphilus sp.) HI0009 (즉, OspCas12c) 기원의 Cas12c 단백질 또는 OspCas12c의 변이체이다. 이들 Cas12c 분자는 문헌 (참조: Yan et al., "Functionally Diverse Type V CRISPR-Cas Systems," Science, 2019 Jan. 4; 363: 88-91; 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 천연적으로 발생하는 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 천연적으로 발생하는 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 본원에 기재된 임의의 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 세균 종 기원의 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c가 또한 본원의 개시내용에 따라 사용될 수 있음을 인지해야 한다.
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i를 언급하고 이는, 예를 들어, 문헌 (참조: Yan et al., "Functionally Diverse Type V CRISPR-Cas Systems," Science, 2019 Jan. 4; 363: 88-91; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 10 테라바이트 초과의 서열 데이터를 집계하여, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i를 포함하여 이전에 특성화된 부류 V 단백질과 약한 유사성을 나타내는 V형 Cas 단백질의 새로운 분류가 동정되었다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12g 또는 Cas12g의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12h 또는 Cas12h의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12i 또는 Cas12i의 변이체이다. 다른 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질이 napDNAbp로서 사용될 수 있고, 본원 개시내용의 범위 내에 있음을 인지해야 한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 천연적으로 발생하는 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 천연적으로 발생하는 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 본원에 기재된 임의의 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 세균 종 기원의 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i가 또한 본원의 개시내용에 따라 사용될 수 있음을 인지해야 한다. 일부 구현예에서, Cas12i는 Cas12i1 또는 Cas12i2이다.
Figure pct00129
Figure pct00130
Figure pct00131
Figure pct00132
염기 편집기의 대표적인 핵산 및 단백질 서열은 다음과 같다:
P153에서 BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
K255에서 BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
Figure pct00139
D306에서 BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20
Figure pct00140
Figure pct00141
Figure pct00142
Figure pct00143
D980에서 BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
K1019에서 BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20
Figure pct00147
Figure pct00148
Figure pct00149
Figure pct00150
상기 서열에 대해, Kozak 서열은 굵게 표시하고 밑줄 치고; N-말단 핵 국소화 신호 (NLS)를 표시하고; 소문자는 GGGSGGS 링커를 지칭하고;
Figure pct00151
는 ABE8을 암호화하는 서열을 표시하고, 변형되지 않은 서열은 BhCas12b를 암호화하고; 두줄 밑줄은 Xten20 링커를 지칭하고; 한줄 밑줄은 C-말단 NLS를 지칭하고;
Figure pct00152
는 GS 링커를 지칭하고; 이탤릭 문자는 3x 헤마글루티닌 (HA) 태그의 암호화 서열을 나타낸다.
가이드 폴리뉴클레오타이드
하나의 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 가이드 RNA이다. RNA/Cas 복합체는 Cas 단백질의 표적 DNA로의 "가이딩"을 도와줄 수 있다. Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 환형 dsDNA 표적을 엔도핵산분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 엔도핵산분해적으로 절단됨에 이어서 3'-5' 엑소핵산분해적으로 절단 제거한다. 실제로, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 2개의 RNA를 요구한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA, 또는 단순히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 양상을 단일 RNA 종으로 혼입하기 위해 가공될 수 있다. 문헌 (예를 들어, Jinek M. et al., Science 337:816-821(2012))을 참조하고 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 자가 대 비-자가의 구분을 도와주기 위해 CRISPR 반복 서열 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)에서 짧은 모티프를 인지한다. Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, "Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti, J.J. et al., Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E. et al., Nature 471:602-607(2011); and "Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M.et al, Science 337:816-821(2012), 이의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다). Cas9 오톨로그는 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) 및 에스. 써모필러스 (S. thermophilus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 종에 기재되었다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본원 개시내용을 기준으로 당업자에게 자명할 수 있고, 상기 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 (참조: Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737)에 기재된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 불활성(예를 들어, 불활성화된) DNA 절단 도메인을 갖고, 즉, Cas9는 닉카제이다.
일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 단일 가이드 RNA ("sgRNA" 또는 "gRNA")이다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 tracrRNA이다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA-결합 도메인 (예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)을 표적 뉴클레오타이드 서열로 가이드하기 위해 PAM 서열을 요구하지 않는다.
본원에 기재된 염기 편집기의 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 (예를 들어, CRISPR-유래된 도메인)은 가이드 폴리뉴클레오타이드와 연합함에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열을 인지할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, gRNA)는 전형적으로 단일 가닥이고 폴리뉴클레오타이드의 표적 서열에 부위 특이적으로 결합 (즉, 상보적 염기 쌍 형성을 통해)하도록 프로그래밍되어 가이드 핵산과 접합된 염기 편집기를 표적 서열로 지시할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드는 DNA일 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드는 RNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드 (예를 들어, 아데노신)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 비-천연 (또는 비천연) 뉴클레오타이드 (예를 들어, 펩타이드 핵산 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 핵산 서열의 표적화 영역은 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 가이드 핵산의 표적화 영역은 10 내지 30개 뉴클레오타이드 길이, 또는 15-25개 뉴클레오타이드 길이 또는 15 내지 20개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 2개 이상의 개별 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 이는 예를 들어, 상보성 염기 쌍 형성 (예를 들어, 이중 가이드 폴리뉴클레오타이드)을 통해 서로 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 포함할 수 있다.
II형 CRISPR 시스템에서, CRISPR 단백질 (예를 들어, Cas9)에 의한 핵산의 표적화는 전형적으로 표적 서열을 인지하는 서열을 포함하는 제1 RNA 분자 (crRNA)와 가이드 RNA-CRISPR 단백질 복합체를 안정화시키는 스캐폴드 영역을 형성하는 반복체 서열을 포함하는 제2 RNA 분자 (trRNA) 간에 상보적 염기 쌍 형성을 요구한다. 상기 이중 가이드 RNA 시스템은 가이드로 폴리뉴클레오타이드로서 사용되어 본원에 기재된 염기 편집기를 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로 지시할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 단일 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, gRNA)를 사용한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 이중 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 이중 gRNA)를 사용한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 다중 gRNA)를 사용한다. 일부 구현예에서, 단일 가이드 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 상이한 염기 편집기에 대해 사용된다. 예를 들어, 단일 가이드 폴리뉴클레오타이드는 시티딘 염기 편집기 및 아데노신 염기 편집기를 위해 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 단일 분자 (즉, 단일 분자 가이드 핵산)로 핵산의 폴리뉴클레오타이드 표적화 부분 및 핵산의 스캐폴드 부분 둘 다를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 분자 가이드 폴리뉴클레오타이드는 단일 가이드 RNA (sgRNA 또는 gRNA)일 수 있다. 본원에서, 용어 가이드 폴리뉴클레오타이드 서열은 염기 편집기와 상호작용할 수 있고 염기 편집기를 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로 지시할 수 있는 임의의 단일, 이중 또는 다중-분자 핵산을 고려한다.
전형적으로, 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, crRNA/trRNA 복합체 또는 gRNA)는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 인지하고 이와 결합할 수 있는 서열을 포함하는 "폴리뉴클레오타이드-표적화 분절" 및 염기 편집기의 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 성분 내 가이드 폴리뉴클레오타이드를 안정화시키는 "단백질-결합 분절"을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 표적화 분절은 DNA 폴리뉴클레오타이드를 인지하고 이와 결합하여 DNA 내 염기의 편집을 촉진시킨다. 다른 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 표적화 분절은 RNA 폴리뉴클레오타이드를 인지하고 이와 결합하여 RNA 내 염기의 편집을 촉진시킨다. 본원에서 "분절"은 분자의 섹션 또는 영역, 예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드의 연속 스트레치를 언급한다. 분절은 또한 분절이 하나 초과의 분자의 영역을 포함할 수 있도록 하는 복합체의 영역/섹션을 언급할 수 있다. 예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오타이드가 다중 핵산 분자를 포함하는 경우, 이의 단백질-결합 분절은 예를 들어, 상보체 영역을 따라 하이브리드화하는 다중 분리된 분자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 2개의 분리된 분자를 포함하는 DNA-표적화 RNA의 단백질-결합 분절은 (i) 100개 염기쌍 길이인 제1 RNA 분자의 염기쌍 40-75개; 및 (ii) 50개 염기쌍 길이인 제2 RNA 분자의 염기쌍 10-25개를 포함할 수 있다. 특정 문맥에서 구체적으로 달리 정의되지 않는 경우 "분절"의 정의는 특정 수의 총 염기쌍으로 제한되지 않고, 소정의 RNA 분자로부터의 임의의 특정 수의 염기쌍으로 제한되지 않고, 복합체 내 특정 수의 분리된 분자로 제한되지 않고, 임의의 총 길이를 갖는 RNA 분자 영역을 포함할 수 있고 다른 분자와 상보성을 갖는 영역을 포함할 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 2개 이상의 RNA, 예를 들어, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA (tracrRNA)를 포함할 수 있다. 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 때로는 단일쇄 RNA, 또는 crRNA와 tracrRNA의 일부 (예를 들어, 기능성 부분)의 융합에 의해 형성된 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 포함할 수 있다. 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 또한 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA일 수 있다. 추가로, crRNA는 표적 DNA와 하이브리드화할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 발현 생성물일 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA를 암호화하는 DNA는 가이드 RNA를 암호화하는 서열을 포함하는 벡터일 수 있다. 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 가이드 RNA 및 프로모터를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 가이드 RNA 또는 플라스미드 DNA로 세포를 형질감염시킴에 의해 세포에 전달될 수 있다. 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 또한 바이러스-매개된 유전자 전달을 사용하는 것과 같은 다른 방식으로 세포에 전달될 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 단리될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 단리된 RNA 형태로 세포 또는 유기체에 형질감염될 수 있다. 가이드 RNA는 당업계에 공지된 임의의 시험관내 전사 시스템을 사용한 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 가이드 RNA는 가이드 RNA에 대한 암호화 서열을 포함하는 플라스미드 형태 보다는 단리된 RNA 형태로 세포에 전달될 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 3개의 영역을 포함할 수 있다: 염색체 서열에서 표적 부위에 상보적일 수 있는 5' 말단에서 제1 영역, 스템 루프 구조를 형성할 수 있는 제2 내부 영역 및 단일 가닥일 수 있는 제3의 3' 영역. 각각의 가이드 RNA의 제1 영역은 또한 각각의 가이드 RNA가 융합 단백질을 특정 표적 부위로 가이드하도록 상이할 수 있다. 추가로, 각각의 가이드 RNA의 제2 및 제3 영역은 모든 가이드 RNA에서 동일할 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드의 제1 영역은 가이드 RNA의 제1 영역이 표적 부위와 염기쌍을 형성할 수 있도록 염색체 서열에서 표적 부위에서 서열에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 제1 영역은 10개 뉴클레오타이드 내지 25개 뉴클레오타이드 이상 또는 약 10개 뉴클레오타이드 내지 25개 뉴클레오타이드 (즉, 10개 뉴클레오타이드 내지 뉴클레오타이드, 또는 약 10개 뉴클레오타이드 내지 약 25개 뉴클레오타이드; 또는 10개 뉴클레오타이드 내지 약 25개 뉴클레오타이드; 또는 약 10개 뉴클레오타이드 내지 25개 뉴클레오타이드) 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 제1 영역과 염색체 서열에서 표적 부위 간에 염기쌍을 형성하는 영역은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25개 이상 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25개 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 때로는, 가이드 RNA의 제1 영역은 19, 20, 또는 21개 또는 약 19, 20, 또는 21개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 또한 2차 구조를 형성하는 제2 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA에 의해 형성된 2차 구조는 스템 (또는 헤어핀) 및 루프를 포함할 수 있다. 루프 및 스템의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 루프는 3 내지 10개 또는 약 3 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 범위일 수 있고 스템은 6 내지 20개 또는 약 6 내지 20개 염기쌍 길이의 범위일 수 있다. 스템은 1 내지 10개 또는 약 10개 뉴클레오타이드의 하나 이상의 돌출부를 포함할 수 있다. 제2 영역의 전체 길이는 16 내지 60개 또는 약 16 내지 60개 뉴클레오타이드 길이의 범위일 수 있다. 예를 들어, 루프는 4개 또는 약 4개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고 스템은 12개 또는 약 12개 염기쌍일 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 또한 필수적으로 단일 가닥일 수 있는 3' 말단에서 제3 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제3 영역은 때로는 관심 대상의 세포에서 임의의 염색체 서열과 상보적이지 않고 때로는 가이드 RNA의 나머지와 상보적이지 않다. 추가로, 제3 영역의 길이는 다양할 수 있다. 제3 영역은 4개 또는 약 4개 초과의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 예를 들어, 제3 영역의 길이는 5 내지 60개 또는 약 5 내지 60개 뉴클레오타이드 범위일 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 유전자 표적의 임의의 엑손 또는 인트론을 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드는 유전자의 엑손 1 또는 2를 표적화할 수 있고; 다른 구현예에서, 가이드는 유전자의 엑손 3 또는 4를 표적화할 수 있다. 조성물은 모두 동일한 엑손을 표적화하는 다중 가이드 RNA 또는 일부 구현예에서 상이한 엑손을 표적화할 수 있는 다중 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 유전자의 엑손 및 인트론은 표적화될 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 20개 또는 약 20개 뉴클레오타이드의 핵산 서열을 표적화할 수 있다. 표적 핵산은 20개 미만 또는 약 20개 미만의 뉴클레오타이드일 수 있다. 표적 핵산은 적어도 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30개 길이 또는 1 내지 100개 뉴클레오타이드 길이 사이 또는 적어도 약 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30개 길이 또는 1-100개 뉴클레오타이드 길이 사이일 수 있다. 표적 핵산은 최대 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50개 길이 또는 1 내지 100개 뉴클레오타이드 길이 사이 또는 최대 약 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50개 길이 또는 1-100개 뉴클레오타이드 길이 사이일 수 있다. 표적 핵산 서열은 PAM의 첫번째 뉴클레오타이드의 5'에 바로 인접하게 20개 염기 또는 약 20개 염기일 수 있다. 가이드 RNA는 핵산 서열을 표적화할 수 있다. 표적 핵산은 적어도 약 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90, 또는 1-100개 또는 적어도 약 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90, 또는 1-100개 뉴클레오타이드일 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 가이드 RNA는 세포의 게놈에서 또 다른 핵산, 예를 들어, 표적 핵산 또는 프로토스페이서에 하이브리드화할 수 있는 핵산을 언급할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드는 RNA일 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드는 DNA일 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드는 핵산 서열에 부위 특이적으로 결합하도록 프로그래밍될 수 있거나 디자인될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함할 수 있고 단일 가이드 폴리뉴클레오타이드로 언급될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드는 2개의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함할 수 있고 이중 가이드 폴리뉴클레오타이드로 언급될 수 있다. 가이드 RNA는 RNA 분자로서 세포 또는 배아에 도입될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 시험관내 전사될 수 있고/있거나 화학적으로 합성될 수 있다. RNA는 합성 DNA 분자, 예를 들어, gBlocks® 유전자 단편으로부터 전사될 수 있다. 가이드 RNA는 이어서 RNA 분자로서 세포 또는 배아에 도입될 수 있다. 가이드 RNA는 또한 비-RNA 핵산 분자, 예를 들어, DNA 분자 형태로 세포 또는 배아에 도입될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA를 암호화하는 DNA는 관심 대상의 세포 또는 배아에서 가이드 RNA의 발현을 위해 프로모터 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. RNA 암호화 서열은 RNA 폴리머라제 III (Pol III)에 인지되는 프로모터 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 가이드 RNA를 발현하도록 사용될 수 있는 플라스미드 벡터는 px330 벡터 및 px333 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 플라스미드 벡터 (예를 들어, px333 벡터)는 적어도 2개의 가이드 RNA-암호화 DNA 서열을 포함할 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 가이드 RNA를 선택하고, 디자인하고 입증하고, 서열을 표적화하기 위한 방법은 본원에 기재되고 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 핵염기 편집기 시스템에서 데아미나제 도메인 (예를 들어, AID 도메인)의 잠재적 기질 혼잡의 영향을 최소화하기 위해, 탈아민화를 위해 의도치 않게 표적화될 수 있는 잔기 (예를 들어, 표적 핵산 유전자좌 내 ssDNA 상에 잠재적으로 위치할 수 있는 표적-이탈 C 잔기)의 수는 최소화될 수 있다. 추가로, 소프트웨어 도구를 사용하여 표적 핵산 서열에 상응하는 gRNA를 최적화할 수 있고, 예를 들어, 게놈에 걸쳐 총 표적-이탈 활성을 최소화할 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9를 사용한 각각의 가능한 표적화 도메인 선택을 위해, 모든 표적-이탈 서열 (이전의 선택된 PAM, 예를 들어, NAG 또는 NGG)은 최대 특정 수 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 미스매칭된 염기쌍을 함유하는 게놈에 걸쳐 동정될 수 있다. 표적 부위에 상보적인 gRNA의 제1 영역은 동정될 수 있고, 모든 제1 영역 (예를 들어, crRNA)은 이의 총 예측된 표적-이탈 스코어에 따라 등급화될 수 있고; 상위 등급의 표적화 도메인은 최대 표적-적중 및 최소 표적-이탈 활성을 가질 가능성이 있는 것들을 나타낸다. gRNA를 표적화하는 후보물은 당업계에 공지되고/되거나 본원에 제시된 바와 같은 방법을 사용함에 의해 기능적으로 평가될 수 있다.
비제한적인 예로서, Cas9과 함께 사용하기 위한 가이드 RNA의 crRNA 내 표적 DNA 하이브리드화 서열은 DNA 서열 검색 알고리즘을 사용하여 동정될 수 있다. gRNA 디자인은 문헌 (참조: Bae S., Park J., & Kim J.-S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014))에 기재된 바와 같이 공용 도구 cas-오핀더 (offinder)를 기반으로 하는 맞춤형 gRNA 디자인 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 소프트웨어는 게놈-와이드 표적-이탈 성향을 계산한 후 가이드를 스코어링한다. 전형적으로 완벽한 매칭에서 7개의 미스매칭 범위의 매칭은 17 내지 24개 길이 범위의 가이드를 위해 고려된다. 표적-이탈 부위가 계산적으로 결정되면, 합계 스코어가 각각의 가이드에 대해 계산되고 웹-인터페이스를 사용하여 표 형식으로 요약된다. PAM 서열에 인접한 잠재적 표적 부위를 동정하는 것에 추가로, 소프트웨어는 또한 선택된 표적 부위로부터 1, 2, 3개 또는 3개 초과의 뉴클레오타이드가 상이한 모든 PAM 인접한 서열을 동정한다. 표적핵산 서열, 예를 들어, 표적 유전자에 대한 게놈 DNA 서열이 수득될 수 있고, 반복 요소들은 공개적으로 가용한 도구, 예를 들어, RepeatMasker 프로그램을 사용하여 스크리닝될 수 있다. RepeatMasker는 반복적인 요소들 및 낮은 복잡성의 영역에 대한 인풋 DNA 서열을 검색한다. 아웃풋은 소정의 탐색 서열에 존재하는 반복체의 상세한 주석이다.
동정 후, 가이드 RNA, 예를 들어, crRNA의 제1 영역은 표적 부위까지의 이들의 거리, 이들의 직교성 및 관련 PAM 서열 (예를 들어, 에스. 피오게네스에 대해 NGG PAM 또는 에스. 아우레우스에 대한 NNGRRV PAM을 함유하는 인간 게놈 내 근접한 매칭의 동정을 기반으로 하는 5'G)과 함께 근접한 매칭에 대한 5' 뉴클레오타이드의 존재를 기준으로 하는 역가로 등급화된다. 본원에 사용된 바와 같은 직교성은 표적 서열에 대한 최소 수의 미스매칭을 함유하는 인간 게놈 내 서열의 수를 언급한다. "고수준의 직교성" 또는 "양호한 직교성"은 예를 들어, 의도된 표적 이외에 인간 게놈 내 동일한 서열을 갖지 않거나 표적 서열 내 1개 또는 2개 미스매칭을 함유한 서열을 갖지 않는 20량체 표적화 도메인을 언급할 수 있다. 양호한 직교성을 갖는 표적화 도메인은 표적-이탈 DNA 절단을 최소화하기 위해 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 리포터 시스템은 염기-편집 활성을 검출하고 후보 가이드 폴리뉴클레오타이드를 시험하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 리포터 시스템은 염기 편집 활성이 리포터 유전자의 발현을 유도하는 리포터 유전자-기반 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포터 시스템은 탈활성화된 개시 코돈, 예를 들어, 3'-TAC-5'에서 3'-CAC-5'로의 주형 가닥 상에 돌연변이를 포함하는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 표적 C의 성공적인 탈아민화 시, 상응하는 mRNA는 5'-GUG-3' 대신 5'-AUG-3'로서 전사될 것이고 이는 리포터 유전자의 해독을 가능하게 한다. 적합한 리포터 유전자는 당업자에게 자명할 것이다. 리포터 유전자의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 루시퍼라제, 분비된 알칼린 포스파타제 (SEAP)를 암호화하는 유전자, 또는 이의 발현이 검출 가능하고 당업자에게 자명한 임의의 다른 유전자를 포함한다. 리포터 시스템은 많은 상이한 gRNA를 시험하기 위해, 표적 DNA 서열과 관련하여 각각의 데아미나제가 표적화하는 잔기(들)가 어느 것인지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 비-주형 가닥을 표적화하는 sgRNA는 또한 특이적 염기 편집 단백질, 예를 들어, Cas9 데아미나제 융합 단백질의 표적-이탈 효과를 평가하기 위해 시험될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 gRNA는 돌연변이된 개시 코돈이 gRNA와 염기쌍을 형성하지 않도록 디자인될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드는 표준 리보뉴클레오타이드, 변형된 리보뉴클레오타이드 (예를 들어, 슈도우리딘), 리보뉴클레오타이드 이성체 및/또는 리보뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 검출 가능한 표지는 형광단 (예를 들어, FAM, TMR, Cy3, Cy5, 텍사스 레드, 오레곤 그린, 알렉사 플루오르, 할로 태그, 또는 적합한 형광성 염료), 검출 태그 (예를 들어, 비오틴, 디곡시게닌 등), 양자 도트 또는 골드 입자일 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 합성되거나, 효소적으로 합성될 수 있거나, 이의 조합일 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 표준 포스포르아미드트-기반 고체-상 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 대안적으로, 가이드 RNA는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 파아지 RNA 폴리머라제에 의해 인지되는 프로모터 제어 서열로 작동적으로 연결함에 의해 시험관내 합성될 수 있다. 적합한 파아지 프로모터 서열의 예는 T7, T3, SP6 프로모터 서열, 또는 이의 변이체를 포함한다. 가이드 RNA가 2개의 별도의 분자 (예를 들어, crRNA 및 tracrRNA)를 포함하는 구현예에서, crRNA는 화학적으로 합성되고 tracrRNA는 효소적으로 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 다중 가이드 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, gRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA는 염기 편집기 시스템에 포함되는 하나 이상의 표적 유전자좌 (예를 들어, 적어도 1개 gRNA, 적어도 2개 gRNA, 적어도 5개 gRNA, 적어도 10개 gRNA, 적어도 20개 gRNA, 적어도 30개 gRNA, 적어도 50개 gRNA)에 표적화될 수 있다. 다중 gRNA 서열은 반복적으로 정렬되고 바람직하게 직접 반복체에 의해 분리된다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 DNA 서열은 또한 벡터의 일부일 수 있다. 추가로, 벡터는 추가의 발현 제어 서열 (예를 들어, 인핸서 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선택가능한 마커 서열 (예를 들어, GFP 또는 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 푸로마이신), 복제 오리진 등을 포함할 수 있다. 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자는 또한 선형일 수 있다. 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 DNA 분자는 또한 환형일 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템의 하나 이상의 성분은 DNA 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 DNA 서열은 별도로 또는 함께 발현 시스템, 예를 들어, 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 서열은 세포에 도입될 수 있고, 각각의 DNA 서열은 별도의 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 암호화 서열을 함유하는 하나의 벡터 및 가이드 RNA 암호화 서열을 함유하는 제2 벡터)의 일부일 수 있거나 둘 다는 동일한 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 가이드 RNA 둘 다에 대한 암호화 (및 조절) 서열을 함유하는 하나의 벡터)의 일부일 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형을 포함하여 새롭거나 증진된 특성을 갖는 핵산을 제공할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드는 핵산 친화성 태그를 포함할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드는 합성 뉴클레오타이드, 합성 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오타이드 유도체, 및/또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 변형을 포함할 수 있다. 변형은 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드의 임의의 위치에서 가해질 수 있다. 하나 초과의 변형은 단일 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드에 가해질 수 있다. gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 변형 후 품질 관리를 거칠 수 있다. 일부 구현예에서, 품질 제어는 PAGE, HPLC, MS, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드의 변형은 치환, 삽입, 결실, 화학적 변형, 물리적 변형, 안정화, 정제, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' 아데닐레이트, 5' 구아노신-트리포스페이트 캡, 5' N7-메틸구아노신-트리포스페이트 캡, 5' 트리포스페이트 캡, 3' 포스페이트, 3' 티오포스페이트, 5' 포스페이트, 5' 티오포스페이트, Cis-Syn 티미딘 이량체, 삼량체, C12 스페이서, C3 스페이서, C6 스페이서, d스페이서, PC 스페이서, r스페이서, 스페이서 18, 스페이서 9,3'-3' 변형, 5'-5' 변형, 무염기성, 아크리딘, 아조벤젠, 비오틴, 비오틴 BB, 비오틴 TEG, 콜레스테릴 TEG, 데스티오비오틴 TEG, DNP TEG, DNP-X, DOTA, dT-비오틴, 이중 비오틴, PC 비오틴, 프소랄렌 C2, 프소랄렌 C6, TINA, 3'DABCYL, 블랙 홀 켄처 1, 블랙 홀 켄처 2, DABCYL SE, dT-DABCYL, IRDye QC-1, QSY-21, QSY-35, QSY-7, QSY-9, 카복실 링커, 티올 링커, 2'-데옥시리보뉴클레오사이드 유사체 퓨린, 2'-데옥시리보뉴클레오사이드 유사체 피리미딘, 리보뉴클레오타이드 유사체, 2'-O-메틸 리보뉴클레오사이드 유사체, 당 변형된 유사체, 워블 (wobble)/범용 염기, 형광성 염료 표지, 2'-플루오로 RNA, 2'-O-메틸 RNA, 메틸포스페이트, 포스포디에스테르 DNA, 포스포디에스테르 RNA, 포스포티오에이트 DNA, 포스포로티오에이트 RNA, UNA, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 5'-메틸시티딘-5'-트리포스페이트 또는 이들의 임의의 조합에 의해 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형은 영구적이다. 다른 구현예에서, 변형은 일과성이다. 일부 구현예에서, 다중 변형은 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드에 가해진다. gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드 변형은 뉴클레오타이드의 생리화학적 성질, 예를 들어, 이들의 형태, 극성, 소수성, 화학적 반응성, 염기쌍 형성 상호작용 또는 이들의 임의의 조합을 변경할 수 있다.
PAM 서열은 당업계에 공지된 임의의 PAM 서열일 수 있다. 적합한 PAM 서열은 NGG, NGA, NGC, NGN, NGT, NGCG, NGAG, NGAN, NGNG, NGCN, NGCG, NGTN, NNGRRT, NNNRRT, NNGRR(N), TTTV, TYCV, TYCV, TATV, NNNNGATT, NNAGAAW, 또는 NAAAAC를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Y는 피리미딘이고; N은 임의의 뉴클레오타이드 염기이고; W는 A 또는 T이다.
변형은 또한 포스포로티오에이트 치환체일 수 있다. 일부 구현예에서, 천연 포스포티에스테르 결합은 세포 뉴클레아제에 의한 신속한 분해에 민감해질 수 있고; 포스포로티오에이트 (PS) 결합 치환체를 사용한 뉴클레오타드 상호 연결의 변형은 세포 분해에 의한 가수분해에 대해 보다 안정할 수 있다. 변형은 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오타이드에서 안정성을 증가시킬 수 있다. 변형은 또한 생물학적 활성을 증진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 증진된 RNA gRNA는 RNase A, RNase T1, 소 혈청 뉴클레아제, 또는 이의 임의의 조합물을 저해할 수 있다. 이들 성질은 PS-RNA gRNA가, 뉴클레아제에 대한 노출이 생체내 또는 시험관내에서 가능성이 높은 적용에서 사용될 수 있게 한다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 (PS) 결합은 엑소뉴클레아제 분해를 저해할 수 있는 gRNA의 5'- 또는 ‘'-말단에서 마지막 3 내지 5개 뉴클레오타이드 사이에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 결합은 전체 gRNA에 걸쳐 부가되어 엔도뉴클레아제에 의한 공격을 감소시킬 수 있다.
프로토스페이서 인접 모티프
용어 "프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)" 또는 PAM-유사 모티프는 CRISPR 세균 후천성 면역계에서 Cas9 뉴클레아제에 의해 표적화된 DNA 서열 직후 2-6 염기 쌍 DNA 서열을 언급한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' PAM (즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 업스트림에 위치한)일 수 있다. 다른 구현예에서, PAM은 3' PAM (즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 다운스트림에 위치한)일 수 있다.
PAM 서열은 표적 결합을 위해 필수적이고, 정확한 서열은 Cas 단백질 유형에 의존한다.
본원에 제공된 염기 편집기는 카노니칼 또는 비-카노니칼 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있는 CRISPR 단백질 유래된 도메인을 포함할 수 있다 (도 2a). PAM 부위는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 인접한 뉴클레오타이드 서열이다. 본원 개시내용의 일부 양상은 상이한 PAM 특이성을 갖는 CRISPR 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 염기 편집기를 제공한다.
예를 들어, 전형적으로 Cas9 단백질, 예를 들어, 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) 기원의 Cas9 (spCas9)는 특정 핵산 영역에 결합하기 위해 카노니칼 NGG PAM 서열을 필요로 하고, 여기서, "NGG"에서 "N"은 아데닌 (A), 티민 (T), 구아닌 (G), 또는 시토신 (C)이고, G는 구아닌이다. PAM은 CRISPR 단백질-특이적일 수 있고 상이한 CRISPR 단백질 유래된 도메인을 포함하는 상이한 염기 편집기 간에 상이할 수 있다. PAM은 표적 서열의 5' 또는 3'일 수 있다. PAM은 표적 서열의 업스트림 또는 다운스트림일 수 있다. PAM은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 흔히, PAM은 2-6개 뉴클레오타이드 길이이다. 여러 PAM 변이체는 하기 표 2에 기재되어 있다.
[표 2] Cas9 단백질 및 상응하는 PAM 서열
Figure pct00153
일부 구현예에서, PAM은 NGT이다. 일부 구현예에서, NGC PAM은 Cas9 변이체에 의해 인지된다. 일부 구현예에서, NGC PAM 변이체는 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R (총체적으로 "MQKFRAER"로 호칭됨)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, PAM은 NGT이다. 일부 구현예에서, NGT PAM은 Cas9 변이체에 의해 인지된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하나 이상의 잔기 1335, 1337, 1135, 1136, 1218, 및/또는 1219에서 표적화된 돌연변이를 통해 생성된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하나 이상의 잔기 1219, 1335, 1337, 1218에서 표적화된 돌연변이를 통해 생성된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하나 이상의 잔기 1135, 1136, 1218, 1219, 및 1335에서 표적화된 돌연변이를 통해 생성된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하기 표 3A 및 3B에 제공된 표적화된 돌연변이 세트로부터 선택된다.
[표 3A] 잔기 1219, 1335, 1337, 1218에서 NGT PAM 변이체 돌연변이
Figure pct00154
[표 3B] 잔기 1135, 1136, 1218, 1219, 및 1335에서 NGT PAM 변이체 돌연변이
Figure pct00155
일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 표 2 및 3에서 변이체 5, 7, 28, 31 또는 36으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변이체는 개선된 NGT PAM 인지를 갖는다.
일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 잔기 1219, 1335, 1337, 및/또는 1218에서 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하기 표 4에 제공된 변이체로부터 개선된 인지에 대해 돌연변이로 선택된다.
[표 4] 잔기 1219, 1335, 1337, 및 1218에서 NGT PAM 변이체 돌연변이
Figure pct00156
일부 구현예에서, NGT PAM에 대해 특이성을 갖는 염기 편집기는 하기 표 5에 제공된 바와 같이 생성될 수 있다.
[표 5] NGT PAM 변이체
Figure pct00157
일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 1이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 2이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 3이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 4이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 5이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 6이다.
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 스타필로코커스 피오게네스 (Staphylococcus pyogenes)로부터 기원하는 Cas9 도메인 (SpCas9)이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SpCas9, 뉴클레아제 불활성 SpCas9 (SpCas9d), 또는 SpCas9 닉카제 (SpCas9n)이다. 일부 구현예에서, SpCas9는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D9X 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 D를 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D9A 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인, SpCas9d 도메인 또는 SpCas9n 도메인은 비-카노니칼 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인, SpCas9d 도메인 또는 SpCas9n 도메인은 NGG. NGA 또는 NGCG PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D1134X, R1335X, 및 T1336X 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함하고, 여기서, X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D1134E, R1335Q, 및 T1336R 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D1134E, R1335Q 및 T1336R 돌연변이 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D1134X, R1335X, 및 T1336X 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함하고, 여기서, X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D1134V, R1335Q, 및 T1336R 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D1134V, R1335Q 및 T1336R 돌연변이 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D1134X, G1217X, R1335X 및 T1336X 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함하고, 여기서, X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D1134V, G1217R, R1335Q, 및 T1336R 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D1134V, G1217R, R1335Q 및 T1336R 돌연변이 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 Cas9 도메인은 본원에 기재된 Cas9 폴리펩타이드와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 Cas9 도메인은 본원에 기재된 임의의 Cas9 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 Cas9 도메인은 본원에 기재된 임의의 Cas9 폴리펩타이드의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 예에서, 본원에 기재된 염기 편집기의 CRISPR 단백질-유래된 도메인에 의해 인지되는 PAM은 염기 편집기를 암호화하는 삽입체 (예를 들어, AAV 삽입체)에 대해 분리된 올리고뉴클레오타이드 상의 세포에 제공될 수 있다. 상기 구현예에서, 분리된 올리고뉴클레오타이드 상에 PAM 제공은 인접한 PAM이 표적 서열과 동일한 폴리뉴클레오타이드 상에 존재하지 않기 때문에 달리 절단될 수 없는 표적 서열의 절단을 가능하게 할 수 있다.
구현예에서, 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) Cas9 (SpCas9)는 게놈 가공을 위한 CRISPR 엔도뉴클레아제로서 사용될 수 있다. 그러나, 기타의 것들이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 엔도뉴클레아제는 특정 게놈 표적에 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-NGG PAM 서열을 갖는 합성 SpCas9-유래된 변이체가 사용될 수 있다. 추가로, 다양한 종 기원의 다른 Cas9 오톨로그가 동정되었고 이들 "비-SpCas9"는 또한 본원 개시내용을 위해 유용할 수 있는 다양한 PAM 서열에 결합할 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 대형 크기의 SpCas9 (대략적으로 4kb 암호화 서열)는 세포에서 효율적으로 발현될 수 없는 SpCas9 cDNA를 갖는 플라스미드를 유도할 수 있다. 역으로, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) Cas9 (SaCas9)에 대한 암호화 서열은 SpCas9 보다 대략적으로 1킬로베이스 짧아, 능히 이것이 세포에서 효율적으로 발현되도록 한다. SpCas9와 유사하게, SaCas9 엔도뉴클레아제는 시험관내 포유동물 세포에서 및 생체내 마우스에서 표적 유전자를 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 상이한 PAM 서열을 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 예를 들어, Cas9 PAM, 5'-NGG에 인접해 있을 수 있다. 다른 구현예에서, 다른 Cas9 오톨로그는 상이한 PAM 요건을 가질 수 있다. 예를 들어, 에스. 써모필러스 (S. Thermophilus)의 것들 (CRISPR1에 대해 5'-NNAGAA 및 CRISPR3에 대해 5'-NGGNG) 및 나이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningiditis)의 것들 (5'-NNNNGATT)과 같은 기타 PAM은 또한 표적 유전자에 인접해 있는 것으로 발견될 수 있다.
일부 구현예에서, 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) 시스템에 대해, 표적 유전자 서열은 5'-NGG PAM에 선행 (즉, 이에 대해 5')할 수 있고, 20-nt 가이드 RNA 서열은 반대 가닥과 염기쌍을 형성하여 PAM에 인접한 Cas9 절단을 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, 인접한 절단은 PAM의 업스트림에 있을 수 있거나 업스트림의 약 3개 염기쌍에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 인접한 절단은 PAM의 업스트림에 있을 수 있거나 업스트림의 약 10개 염기쌍에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 인접한 절단은 PAM의 업스트림에 있을 수 있거나 업스트림의 약 0-20개 염기쌍에 있을 수 있다. 예를 들어, 인접한 절단은 PAM의 업스트림에 있을 수 있거나 업스트림의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 염기쌍 다음에 있을 수 있다. 인접한 절단은 또한 PAM의 다운스트림의 1 내지 30개 염기쌍에 있을 수 있다. PAM 서열에 결합할 수 있는 예시적인 SpCas9 단백질의 서열은 다음과 같다:
예시적인 PAM-결합 SpCas9의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00158
예시적인 PAM-결합 SpCas9n의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00159
예시적인 PAM-결합 SpEQR Cas9의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00160
상기 서열에서, D1134, R1335 및 T1336으로부터 돌연변이되어 SpEQR Cas9를 생성할 수 있는 잔기 E1134, Q1334, 및 R1336은 밑줄 치고 굵게 표시한다.
예시적인 PAM-결합 SpVQR Cas9의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00161
상기 서열에서, D1134, R1335 및 T1336으로부터 돌연변이되어 SpVQR Cas9를 생성할 수 있는 잔기 V1134, Q1334, 및 R1336은 밑줄 치고 굵게 표시한다.
예시적인 PAM-결합 SpVRER Cas9의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00162
상기 서열에서, D1134, G1217, R1335 및 T1336으로부터 돌연변이되어 SpVRER Cas9를 생성할 수 있는 잔기 V1134, R1217, Q1334, 및 R1336은 밑줄 치고 굵게 표시한다.
일부 구현예에서, 가공된 SpCas9 변이체는 3'H (비-G PAM)에 의해 플랭킹된 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열을 인지할 수 있다 (표 1A-1D; 도 62를 참조한다). 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 NRNH PAM (여기서, R은 A 또는 G이고, H는 A, C 또는 T이다)을 인지한다. 일부 구현예에서, 비-G PAM은 NRRH, NRTH, 또는 NRCH이다 (참조: 예를 들어, Miller, S.M., et al. Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs, Nat. Biotechnol. (2020), 이의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다).
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 재조합 Cas9 도메인이다. 일부 구현예에서, 재조합 Cas9 도메인은 SpyMacCas9 도메인이다. 일부 구현예에서, SpyMacCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SpyMacCas9, 뉴클레아제 불활성 SpyMacCas9 (SpyMacCas9d), 또는 SpyMacCas9 닉카제 (SpyMacCas9n)이다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인 또는 SaCas9n 도메인은 비-카노니칼 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SpyMacCas9 도메인, SpCas9d 도메인 또는 SpCas9n 도메인은 NAA PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다.
고유 5'-NAAN-3' PAM 특이성을 갖는, 스트렙토코커스 마카카에 (Streptococcus macacae)에서 Spy Cas9의 예시적인 Cas9 A 동족체의 서열은 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, 문헌 (참조: Jakimo et al., (www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2018/09/27/429654.full.pdf)에 기재되어 있고, 하기에 제공된다.
Figure pct00163
일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1218A 돌연변이를 함유하여 폴리펩타이드는 표적 DNA 또는 RNA를 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 상기 Cas9 단백질은 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 감소된 능력을 갖지만 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 D10A, H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1218A 돌연변이를 함유하여 폴리펩타이드는 표적 DNA를 절단하는 감소된 능력을 갖는다. 상기 Cas9 단백질은 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 감소된 능력을 갖지만 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질이 W476A 및 W1126A 돌연변이를 함유하는 경우 또는 상기 변이체 Cas9 단백질이 P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1218A 돌연변이를 함유하는 경우, 변이체 Cas9 단백질은 효율적으로 PAM 서열에 결합하지 않는다. 따라서, 일부 상기 경우에, 상기 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용되는 경우, 상기 방법은 PAM 서열을 요구하지 않는다. 다시 말해, 일부 구현예에서, 상기 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용되는 경우, 상기 방법은 가이드 RNA를 포함할 수 있지만 상기 방법은 PAM 서열의 부재하에 수행될 수 있다 (그리고, 결합 특이성은 따라서 가이드 RNA의 표적화 분절에 의해 제공된다). 다른 잔기는 상기 효과를 성취하기 위해 돌연변이될 수 있다 (즉, 하나 또는 다른 핵염기 부분을 불활성화시킬 수 있다). 비제한적인 예로서, 잔기 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, 및/또는 A987은 변경 (즉, 치환된)될 수 있다. 또한, 알라닌 치환과는 다른 돌연변이가 적합하다.
일부 구현예에서, 염기 편집기의 CRISPR 단백질-유래된 도메인은 카노니칼 PAM 서열 (NGG)을 갖는 Cas9 단백질 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 염기 편집기의 Cas9-유래된 도메인은 비-카노니칼 PAM 서열을 사용할 수 있다. 상기 서열은 당업계에 보고되었고 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 비-카노니칼 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 문헌 (참조: Kleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015); and Kleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015); 이의 각각의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되었다.
PAM 독점성이 감소된 Cas9 도메인
전형적으로, Cas9 단백질, 예를 들어, 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) 기원의 Cas9 (spCas9)는 특정 핵산 영역에 결합하기 위해 카노니칼 NGG PAM 서열을 필요로 하고, 여기서, "NGG"에서 "N"은 아데노신 (A), 티미딘 (T), 또는 시토신 (C)이고, G는 구아노신이다. 이것은 게놈 내 목적하는 염기를 편집하는 능력을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집 융합 단백질은 정확한 위치에서, 예를 들어, PAM의 업스트림인 표적 염기를 포함하는 영역에 위치할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016), 이의 전체 내용은 본원에 참조로 본원에 포함됨)을 참조한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 카노니칼 (예를 들어, NGG) PAM 서열을 포함하지 않는 뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있는 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 비-카노니칼 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 당업계에 기재되었고 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 비-카노니칼 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 문헌 (참조: Kleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015); and Kleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015); 이의 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다)에 기재되었다.
고충실도 Cas9 도메인
본원 개시내용의 일부양상은 고충실도 Cas9 도메인을 제공한다. 일부 구현예에서, 고충실도 Cas9 도메인은 가공된 Cas9 도메인이고, 이는 상응하는 야생형 Cas9 도메인과 비교하여, Cas9 도메인과, DNA의 당-포스페이트 골격 간의 정전기 상호작용을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 임의의 특정 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, DNA의 당-포스페이트 골격과 감소된 정전기 상호작용을 갖는 고충실도 Cas9 도메인은 적은 표적-이탈 효과를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인 (예를 들어, 야생형 Cas9 도메인)은 Cas9 도메인과 DNA의 당-포스페이트 골격 간의 연합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 Cas9 도메인과 DNA의 당-포스페이트 골격 간의 연합을 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 또는 적어도 70%까지 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 Cas9 융합 단백질은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 N497X, R661X, Q695X 및/또는 Q926X 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함하고, 여기서, X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 Cas9 융합 단백질은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 N497A, R661A, Q695A, 및/또는 Q926A 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D10A 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다. 고충실도를 갖는 Cas9 도메인은 당업계에 공지되어 있고 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 고충실도를 갖는 Cas9 도메인은 문헌 (참조: Kleinstiver, B.P., et al. "High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects." Nature 529, 490-495 (2016); and Slaymaker, I.M., et al. "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity." Science 351, 84-88 (2015); 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 변형된 Cas9는 고충실도 Cas9 효소이다. 일부 구현예에서, 고충실도 Cas9 효소는 SpCas9(K855A), eSpCas9(1.1), SpCas9-HF1, 또는 하이퍼 정확한 Cas9 변이체 (HypaCas9)이다. 변형된 Cas9 eSpCas9(1.1)는 HNH/RuvC 그루브와 비-표적 DNA 가닥 간의 상호작용을 약화시키는 알라닌 치환을 함유하여 가닥 분리 및 표적-이탈 부위에서의 절단을 방지한다. 유사하게, SpCas9-HF1은 DNA 포스페이트 골격과 Cas9의 상호작용을 붕괴시키는 알라닌 치환을 통한 표적-이탈 편집을 저하시킨다. HypaCas9는 Cas9 교정 및 표적 식별을 증가시키는 REC3 도메인에서 돌연변이 (SpCas9 N692A/M694A/Q695A/H698A)를 함유한다. 모든 3개의 고충실도 효소는 야생형 Cas9 보다 적은 표적-이탈 편집을 생성한다.
예시적인 고충실도 Cas9는 하기에 제공된다.
Cas9에 상대적인 고충실도 Cas9 도메인 돌연변이는 굵게 표시하고 밑줄 쳐서 나타낸다.
Figure pct00164
핵 국소화 서열 (NLS)을 포함하는 융합 단백질
일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개)의 핵 표적화 서열, 예를 들어, 핵 국소화 서열 (NLS)을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 이분된 NLS가 사용된다. 일부 구현예에서, NLS는 NLS를 포함하는 단백질의 세포 핵 (예를 들어, 핵 수송에 의해)으로의 혼입을 촉진시키는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 핵 국소화 서열 (NLS)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, NLS는 융합 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 융합 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 Cas9 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 nCas9 도메인 또는 dCas9 도메인의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 데아미나제의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 데아미나제의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 하나 이상의 링커를 통해 융합 단백질에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 링커 없이 융합 단백질에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 본원에 제공되거나 참조된 NLS 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 핵 국소화 서열은 당업계에 공지되어 있고 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, NLS 서열은 문헌 (참조: Plank et al., PCT/EP2000/011690)에 기재되어 있고, 이의 내용은 예시적인 핵 국소화 서열에 대한 이의 기재를 위해 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, NLS는 아미노산 서열 PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV, KRTADGSEFESPKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, KKTELQTTNAENKTKKL, KRGINDRNFWRGENGRKTR, RKSGKIAAIVVKRPRKPKKKRKV, 또는 MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC를 포함한다.
일부 구현예에서, NLS는 링커에 존재하거나, NLS는 링커, 예를 들어, 본원에 기재된 링커에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, N-말단 또는 C-말단 NLS는 양분된 NLS이다. 이분된 NLS는 2개의 염기성 아미노산 클러스터를 포함하고, 이들은 상대적으로 짧은 스페이서 서열에 의해 분리되어 있다 (따라서 이분된- 2개 부분, 단일부분의 NLS가 아니다).　 뉴클레오플라스민, KR[PAATKKAGQA]KKKK의 NLS는 흔한 이분된 신호의 원형이다: 기본 아미노산의 2개의 클러스터는 약 10개 아미노산의 스페이서에 의해 분리되어 있다. 예시적인 양분된 NLS의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00165
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 융합 단백질은 링커 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 도메인 또는 단백질 사이에 링커 서열이 존재한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 또는 시티딘 데아미나제 및 Cas9 도메인과 함께 예시적인 Cas9 융합 단백질의 일반 구조는 하기의 구조 중 하나를 포함하고, 여기서, NLS는 핵 국소화 서열 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 NLS)이고, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다:
NH2-NLS-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-NLS [Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-NLS-COOH;
NH2-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-NLS-COOH.;
NH2-NLS-[시티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-NLS [Cas9 도메인]-[시티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-NLS-COOH; 또는
NH2-[Cas9 도메인]-[시티딘 데아미나제]-NLS-COOH.
본원 개시내용의 융합 단백질은 하나 이상의 추가의 특성을 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 가용화, 정제 또는 검출을 위해 유용한 서열 태그 뿐만 아니라 저해제, 세포질 국소화 서열, 배출 서열, 예를 들어, 핵 배출 서열 또는 다른 국소화 서열을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 적합한 단백질 태그는 비오틴 카복실라제 캐리어 단백질 (BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린 (calmodulin)-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌 (HA)-태그, 또한 히스티딘 태그 또는 His-태그로서 언급되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP)-태그, nus-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)-태그, 녹색 형광성 단백질 (GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프트태그 (예를 들어, 소프트태그 1, 소프트태그 3), strep-태그, 비오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그 및 SBP-태그를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가의 적합한 서열은 당업자에게 자명할 것이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 His 태그를 포함한다.
하나 이상의 핵 국소화 서열 (NLS)을 포함하는 CRISPR 효소를 암호화하는 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 NLS가 사용될 수 있다. CRISPR 효소는 아미노-말단에서 또는 이의 근처에서 NLS, 카복시 말단에서 또는 이의 근처에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 초과 NLS 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 아미노-말단에서 하나 이상의 NLS 및 카복시 말단에서 하나 이상의 NLS)을 포함할 수 있다. 하나 초과의 NLS가 존재하는 경우, 각각은 서로 독립적으로 선택될 수 있어 단일 NLS는 하나 초과의 카피로 및/또는 하나 이상의 카피로 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합하여 존재할 수 있다.
상기 방법에 사용되는 CRISPR 효소는 약 6개 NLS를 포함할 수 있다. NLS는 NLS에 최근접 아미노산이 N- 또는 C-말단으로부터 폴리펩타이드 쇄를 따라 약 50개 아미노산 내에, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50개 아미노산 내에 있는 경우 N- 또는 C-말단 근처에 고려된다.
핵염기 편집 도메인
본원에서는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 핵염기 편집 도메인 (예를 들어, 데아미나제 도메인)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 염기 편집기가 기재된다. 염기 편집기는 표적 서열을 인지할 수 있는 가이드 폴리뉴클레오타이드와 상호작용함에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 하나 이상의 염기를 편집하기 위해 프로그래밍될 수 있다. 표적 서열이 인지되면, 염기 편집기는 편집이 발생하는 폴리뉴클레오타이드 상에 부착되고 염기 편집기의 데아미나제 도메인 성분은 이어서 표적 염기를 편집할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 데아미나제 도메인을 포함한다. 특히 본원에 기재된 바와 같이, 데아미나제 도메인은 시토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "시토신 데아미나제" 및 "시토신 데아미나제"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "아데닌 데아미나제" 및 "아데노신 데아미나제"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 핵염기 편집 단백질의 세부사항은 문헌 (참조: 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381 (WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344 (WO2017/070632)에 기재되어 있고, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017))을 참조하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
A에서 G로의 편집
일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집기는 아데노신 데아미나제를 포함하는 데아미나제 도메인을 포함할 수 있다. 염기 편집기의 상기 아데노신 데아미나제 도메인은 아데닌 (A)를 탈아민화하여 구아닌 (G)의 염기쌍 형성 성질을 나타내는 이노신 (I)을 형성함에 의해 아데닌 (A) 핵염기의 구아닌 (G) 핵염기로의 편집을 촉진시킬 수 있다. 아데노신 데아미나제는 데옥시리보핵산 (DNA)에서 데옥시아데노신 잔기의 아데닌을 탈아민화 (즉 아민 그룹을 제거하는)할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 핵염기 편집기는 하나 이상의 단백질 도메인을 함께 융합함에 의해 융합 단백질을 생성시킴에 의해 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 융합 단백질의 염기 편집 활성 (예를 들어, 효율, 선택성 및 특이성)을 개선시키는 하나 이상의 특성을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 융합 단백질은 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9 도메인 (dCas9), 또는 듀플렉스 DNA 분자의 하나의 가닥을 절단하는, Cas9 닉카제로서 언급되는 Cas9 도메인 (nCas9)을 가질 수 있다. 특정 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, 촉매 잔기의 존재 (예를 들어, H840)는 표적화된 A의 반대편의 T를 함유하는 비편집된 (예를 들어, 비-탈아민화된) 가닥을 절단하는 Cas9의 활성을 유지한다. Cas9의 촉매 잔기의 돌연변이 (예를 들어, D10에서 A10으로)는 표적화된 A 잔기를 함유하는 편집된 가닥의 절단을 방지한다. 상기 Cas9 변이체는 gRNA-한정된 표적 서열을 기준으로 특정 위치에서 단일 가닥 DNA 절단(닉)을 생성하여 비-편집된 가닥의 복구를 유도하고 궁극적으로 비-편집된 가닥 상에 T에서 C로의 변화를 유도한다. 일부 구현예에서, A-에서-G로의 염기 편집기는 이노신 염기 절제 복구의 저해제, 예를 들어, 우라실 글리코실라제 저해제 (UGI) 도메인 또는 촉매적 불활성 이노신 특이적 뉴클레아제를 추가로 포함한다. 임의의 특정 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, UGI 도메인 또는 촉매적 불활성 이노신 특이적 뉴클레아제는 탈아민화된 아데노신 잔기 (예를 들어, 이노신)의 염기 절제 복구를 저해하거나 방지할 수 있고, 이는 염기 편집기의 활성 또는 효율을 개선시킬 수 있다.
아데노신 데아미나제를 포함하는 염기 편집기는 DNA, RNA 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함하는, 임의의 폴리뉴클레오타이드 상에 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, 아데노신 데아미나제를 포함하는 염기 편집기는 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 표적 A를 탈아민화할 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기는 RNA 폴리뉴클레오타이드 및/또는 DNA-RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 표적 A를 탈아민화할 수 있는 아데노신 데아미나제 도메인을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 아데노신 데아미나제는 RNA (ADAR, 예를 들어, ADAR1 또는 ADAR2)에 작용하는 아데노신 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 아데노신 데아미나제는 tRNA (ADAT)에 작용하는 아데노신 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 아데노신 데아미나제 도메인을 포함하는 염기 편집기는 또한 DNA 폴리뉴클레오타이드의 A 핵염기를 탈아민화할 수 있다. 하나의 구현예에서, 염기 편집기의 아데노신 데아미나제 도메인은 ADAT가 DNA 내 표적 A를 탈아민화하도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 ADAT의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, 염기 편집기는 하기의 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli) (EcTadA)로부터의 ADAT의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다: 또 다른 아데노신 데아미나제에서 D108N, A106V, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, 또는 상응하는 돌연변이.
아데노신 데아미나제는 임의의 적합한 유기체 (예를 들어, 이. 콜리)로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데닌 데아미나제는 천연적으로 발생하는 아데노신 데아미나제이고, 이는 본원에 제공된 임의의 돌연변이 (예를 들어, ecTadA 내 돌연변이)를 포함한다. 임의의 상동성 단백질 내 상응하는 잔기는 예를 들어, 상동성 잔기의 서열 정렬 및 결정에 의해 동정될 수 있다. 따라서, 임의의 천연적으로 발생하는 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA와 상동성을 갖는)에서 돌연변이를 생성할 수 있고, 이는 본원에 기재된 임의의 돌연변이 (예를 들어, ecTadA에서 동정된 임의의 돌연변이)에 상응한다.
C에서 T로의 편집
일부 구현예에서, 본원에 개시된 염기 편집기는 폴리뉴클레오타이드의 표적 시티딘 (C) 염기를 탈아민화하여 우리딘 (U)을 생성할 수 있는 시티딘 데아미나제를 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 이는 티민의 염기 쌍 형성 성질을 갖는다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드가 이중-가닥 (예를 들어, DNA)인 경우 우리딘 염기는 (예를 들어, 세포 복구 기구에 의해) 티미딘 염기로 치환되어 C:G에서 T:A로의 전이를 발생시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 염기 편집기에 의한 핵산에서 C에서 U로의 탈아민화는 U에서 T로의 치환을 동반할 수 없다.
U를 생성하기 위한 폴리뉴클레오티드에서 표적 C의 탈아민화는 본원에 기재된 염기 편집기에 의해 실행될 수 있는 염기 편집 유형의 비제한적 예이다. 또 다른 예에서, 시티딘 데아미나제 도메인을 포함하는 염기 편집기는 시토신 (C) 염기의 구아닌 (G) 염기로의 전환을 매개할 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기의 시티딘 데아미나제 도메인에 의한 시티딘의 탈아민화에 의해 생성된 폴리뉴클레오타이드의 U는 염기 절단 복구 기전 (예를 들어, 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG) 도메인에 의해)에 의해 폴리뉴클레오타이드로부터 절단되어 염기성 부위를 생성할 수 있다. 이어서, 비염기성 부위 반대편의 핵염기는 예를 들어, 전이 폴리머라제에 의해 C와 같은 또 다른 염기로 (예를 들어, 염기 복구 기구에 의해) 치환될 수 있다. 비염기성 부위 반대편의 핵염기가 C로 대체되는 것이 전형적이지만 다른 치환 (예를 들어, A, G 또는 T)이 발생할 수도 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집기는 폴리뉴클레오타이드에서 표적 C를 U로 탈아민화할 수 있는 탈아민화 도메인 (예를 들어, 시티딘 데아미나제 도메인)을 포함한다. 또한, 아래에 기재된 바와 같이, 염기 편집기는 일부 구현예에서, T 또는 G로 탈아민화로 인한 U의 전환을 촉진하는 추가 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 시티딘 데아미나제 도메인을 포함하는 염기 편집기는 T에 의한 U의 치환을 매개하기 위해 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 추가로 포함하여 C에서 T로의 염기 편집 이벤트를 완료할 수 있다. 또 다른 예에서, 염기 편집기는 전이 폴리머라제를 통합하여 C에서 G로의 염기 편집 효율을 향상시킬 수 있는데, 이는 전이 폴리머라제가 비염기성 부위 반대편에 있는 C의 통합을 촉진할 수 있기 때문이다 (즉, 비염기성 부위에서 G를 통합하여 C에서 G로의 염기 편집 이벤트를 완료한다).
도메인으로서 시티딘 데아미나제를 포함하는 염기 편집기는 DNA, RNA 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드에서 표적 C를 탈아민화할 수 있다. 전형적으로, 시티딘 데아미나제는 폴리뉴클레오타이드의 단일-가닥 부분의 맥락에서 위치하는 C 핵염기를 촉매화한다. 일부 구현예에서, 표적 C를 포함하는 전체 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥일 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기에 혼입된 시티딘 데아미나제는 단일-가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드에서 표적 C를 탈아민화할 수 있다. 다른 구현예에서, 시티딘 데아미나제 도메인을 포함하는 염기 편집기는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드에 작용할 수 있지만, 표적 C는 탈아민화 반응 시 단일-가닥 상태인 폴리뉴클레오타이드의 일부에 위치할 수 있다. 예를 들어, NAGPB 도메인이 Cas9 도메인을 포함하는 구현예에서, Cas9-gRNA-표적 DNA 복합체의 형성 동안 여러 뉴클레오타이드가 짝을 형성하지 않은 상태로 남아서 Cas9 "R-루프 복합체"를 형성할 수 있다. 이러한 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 단일-가닥 특이적 뉴클레오타이드 데아미나제 효소 (예를 들어, 시티딘 데아미나제)의 기질로서 역할을 할 수 있는 단일-가닥 DNA의 버블을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기의 시티딘 데아미나제는 아포지단백질 B mRNA 편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. APOBEC는 변화적으로 보존된 시티딘 데아미나제 패밀리이다. 상기 패밀리의 구성원은 C에서 U로의 편집 효소이다. APOBEC 유사 단백질의 N-말단 도메인은 촉매 도메인이고 C-말단 도메인은 유사촉매 도메인이다. 보다 구체적으로, 촉매 도메인은 아연 의존성 시티딘 데아미나제 도메인이며 시티딘 탈아민화에 중요하다. APOBEC 패밀리 구성원은 APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D ("APOBEC3E"는 이제 이를 참조함), APOBEC3F, APOBEC3G, APOBEC3H, APOBEC4, 및 활성화-유도된 (시티딘) 데아미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC1 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC2 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC3 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC3A 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC3B 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC3C 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC3D 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC3E 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC3F 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC3G 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC3H 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC4 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 활성화-유도된 데아미나제 (AID)의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 시티딘 데아미나제 1 (CDA1)의 전부 또는 일부를 포함한다. 염기 편집기는 임의의 적합한 유기체 (예를 들어, 인간 또는 래트)로부터의 데아미나제를 포함할 수 있음을 인지해야 한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 데아미나제 도메인은 인간, 침팬지, 고릴라, 몽키, 소, 개, 래트 또는 마우스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 데아미나제 도메인 래트로부터 유래된다 (예를 들어, 래트 APOBEC1). 일부 구현예에서, 염기 편집기의 데아미나제 도메인은 인간 APOBEC1이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 데아미나제 도메인 pmCDA1이다.
PmCDA1의 아미노산 및 핵산 서열은 본원에서 아래에 나타낸다.
>tr|A5H718|A5H718_PETMA 시토신 데아미나제 OS=페트로마이존 마리누스 OX=7757 PE=2 SV=1 아미노산 서열:
Figure pct00166
핵산 서열: >EF094822.1 페트로마이존 마리누스 단리물 PmCDA.21 시토신 데아미나제 mRNA, 완전한 cds:
Figure pct00167
인간 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 (AID)의 암호화 서열 (CDS)의 아미노산 및 핵산 서열은 아래에 나타낸다.
>tr|Q6QJ80|Q6QJ80_인간 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 OS=호모 사피엔스 OX=9606 GN=AICDA PE=2 SV=1 아미노산 서열:
Figure pct00168
인간 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 (AID)의 암호화 서열 (CDS)의 아미노산 및 핵산 서열은 아래에 나타낸다.
>tr|Q6QJ80|Q6QJ80_인간 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 OS=호모 사피엔스 OX=9606 GN=AICDA PE=2 SV=1 아미노산 서열:
Figure pct00169
핵산 서열: >NG_011588.1:5001-15681 호모 사피엔스 활성화 유도된 시티딘 데아미나제 (AICDA), 염색체 12의 RefSeqGene (LRG_17):
Figure pct00170
Figure pct00171
Figure pct00172
Figure pct00173
Figure pct00174
Figure pct00175
본 개시내용의 양상에 따라 Cas9에 융합될 수 있는 다른 예시적인 데아미나제가 아래에 제공된다. 구현예에서, 탈아미나제는 활성화-유도된 데아미나제 (AID)이다. 일부 구현예에서, 각각의 서열의 활성 도메인, 예를 들어 국소화 신호가 없는 도메인 (핵 국소화 서열, 핵 수송 신호 없음, 세포질 국소화 신호)이 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
인간 AID:
Figure pct00176
(밑줄: 핵 국소화 서열; 두줄 밑줄: 핵 수송 신호)
마우스 AID:
Figure pct00177
(밑줄: 핵 국소화 서열; 두줄 밑줄: 핵 수송 신호)
개 AID:
Figure pct00178
(밑줄: 핵 국소화 서열; 두줄 밑줄: 핵 수송 신호)
소 AID:
Figure pct00179
(밑줄: 핵 국소화 서열; 두줄 밑줄: 핵 수송 신호)
래트 AID:
Figure pct00180
(밑줄: 핵 국소화 서열; 두줄 밑줄: 핵 수송 신호)
마우스 APOBEC-3-(2):
Figure pct00181
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
래트 APOBEC-3:
Figure pct00182
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
레서스 마카쿠에 (Rhesus macaque) APOBEC-3 G:
Figure pct00183
(이탤릭: 핵산 편집 도메인; 밑줄: 세포질 국소화 신호)
침팬지 APOBEC-3 G:
Figure pct00184
(이탤릭: 핵산 편집 도메인; 밑줄: 세포질 국소화 신호)
그린 몽키 APOBEC-3G:
Figure pct00185
(이탤릭: 핵산 편집 도메인; 밑줄: 세포질 국소화 신호)
인간 APOBEC-3G:
Figure pct00186
(이탤릭: 핵산 편집 도메인; 밑줄: 세포질 국소화 신호)
인간 APOBEC-3F:
Figure pct00187
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3B:
Figure pct00188
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
래트 APOBEC-3B:
Figure pct00189
소 APOBEC-3B:
Figure pct00190
침팬지 APOBEC-3B:
Figure pct00191
인간 APOBEC-3C:
Figure pct00192
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
고릴라 APOBEC-3C
Figure pct00193
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3A:
Figure pct00194
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
레서스 마카쿠에 APOBEC-3A:
Figure pct00195
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
소 APOBEC-3A:
Figure pct00196
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3H:
Figure pct00197
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
레서스 마카쿠에 APOBEC-3H:
Figure pct00198
인간 APOBEC-3D:
Figure pct00199
(이탤릭: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-1:
Figure pct00200
마우스 APOBEC-1:
Figure pct00201
래트 APOBEC-1:
Figure pct00202
인간 APOBEC-2:
Figure pct00203
마우스 APOBEC-2:
Figure pct00204
래트 APOBEC-2:
Figure pct00205
소 APOBEC-2:
Figure pct00206
페트로마이존 마리누스 CDA1 (pmCDAl):
Figure pct00207
인간 APOBEC3G D316R D317R:
Figure pct00208
인간 APOBEC3G 쇄 A:
Figure pct00209
인간 APOBEC3G 쇄 A D120R D121R:
Figure pct00210
본원 개시내용의 일부 양상은 예를 들어, 데아미나제 도메인에서 점 돌연변이를 생성함으로써 본원에 기재된 임의의 융합 단백질의 데아미나제 도메인 촉매 활성을 조절하는 것이 융합 단백질 (예를 들어, 염기 편집기)의 진행성에 영향을 미친다는 인식에 기초한다. 예를 들어, 염기 편집 융합 단백질 내의 데아미나제 도메인의 촉매 활성을 감소시키지만 제거하지는 않는 돌연변이는 데아미나제 도메인이 표적 잔기에 인접한 잔기의 탈아민화를 촉매화하여 탈아민화 윈도우를 좁힐 가능성을 낮출 것이다. 탈아민화 윈도우를 좁히는 능력은 특정 표적 잔기에 인접한 잔기의 원치 않는 탈아민화를 방지할 수 있으며, 이는 표적-이탈 효과를 감소시키거나 방지할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는rAPOBEC1의 H121X, H122X, R26X, R118X, W90X, W90X, 및 R132X로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서, X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 H121R, H122R, R26A, R26E, R118A, W90A, W90Y, 및 R132E로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 D316X, D317X, R320X, R320X, R313X, W285X, W285X, R326X로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서, X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 hAPOBEC3G의 D316R, D317R, R320A, R320E, R313A, W285A, W285Y, R326E로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 H121R 및 H122R 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 R26A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 R26E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 R118A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 W90A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 W90Y 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 W90Y 및 R26E 돌연변이, 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 R26E 및 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 W90Y 및 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 rAPOBEC1의 W90Y, R26E, 및 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 D316R 및 D317R 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 hAPOBEC3G의 R320A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 R320E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 R313A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 W285A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 W285Y 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 W285Y 및 R320E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 R320E 및 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 W285Y 및 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나제는 hAPOBEC3G의 W285Y, R320E, 및 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함할 수 있다.
다수의 변형된 시티딘 데아미나제는 SaBE3, SaKKH-BE3, VQR-BE3, EQR-BE3, VRER-BE3, YE1-BE3, EE-BE3, YE2-BE3, 및 YEE-BE3을 포함하지만 이에 제한되지 않는 상업적으로 입수 가능하며, 이들은 Addgene (플라스미드 85169, 85170, 85171, 85172, 85173, 85174, 85175, 85176, 85177)으로부터 입수 가능하다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 데아미나제는 APOBEC1 데아미나제의 전부 또는 일부를 포함한다.
C에서 T로의 핵염기 편집 단백질의 세부 사항은 국제 PCT 출원 번호 PCT/US2016/058344 (WO2017/070632) 및 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016))에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
Cas9 도메인 및 아데노신 데아미나제 및/또는 시티딘 데아미나제를 포함하는 융합 단백질
본원 개시내용의 일부 양상은 Cas9 도메인 또는 다른 핵산 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질 및 하나 이상의 아데노신 데아미나제 도메인, 시티딘 데아미나제 도메인, 및/또는 DNA 글리코실라제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. Cas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 Cas9 도메인 또는 Cas9 단백질 (예를 들어, dCas9 또는 nCas9)일 수 있음을 인지해야 한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 Cas9 도메인 또는 Cas9 단백질 (예를 들어, dCas9 또는 nCas9)은 본원에 제공된 임의의 시티딘 디아미나제 및 아데노신 디아미나제와 융합될 수 있다. 본원에 기새된 염기 편집기의 도메인은 임의의 순서로 배열될 수 있다.
예를 들어, 그리고 제한 없이, 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하기 구조를 포함한다:
NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-[시티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[시티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-[시티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-[시티딘 데아미나제]-COOH; 또는
NH2-[Cas9 도메인]-[시티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-COOH.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 아데노신 데아미나제는 TadA*8 및 시티딘 데아미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, TadA*8은 TadA*8.1, TadA*8.2, TadA*8.3, TadA*8.4, TadA*8.5, TadA*8.6, TadA*8.7, TadA*8.8, TadA*8.9, TadA*8.10, TadA*8.11, TadA*8.12, TadA*8.13, TadA*8.14, TadA*8.15, TadA*8.16, TadA*8.17, TadA*8.18, TadA*8.19, TadA*8.20, TadA*8.21, TadA*8.22, TadA*8.23, 또는 TadA*8.24이다.
예시적인 융합 단백질 구조는 다음을 포함한다:
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas9]-[시티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[TadA*8]-[Cas9]-[시티딘 데아미나제]-COOH; 또는
NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9]-[TadA*8]-COOH.
일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제, 비염기성 편집기, 및 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp (예를 들어, Cas9 도메인)를 포함하는 융합 단백질은 링커 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 링커는 시티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 도메인 및 napDNAbp 사이에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 일반 구조에 사용된 "_"는 임의의 링커의 존재를 지적한다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp는 본원에 제공된 임의의 링커를 통해 융합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp는 "링커"라는 제목의 섹션에서 아래에 제공된 임의의 링커를 통해 융합된다.
일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제, 아데노신 데아미나제 및 Cas9 또는 Cas12 도메인을 갖는 예시적인 Cas9 또는 Cas12 융합 단백질의 일반적인 구조는 하기 구조 중 임의의 하나를 포함하고, NLS는 핵 국소화 서열 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 NLS)이고, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다.
NH2-NLS-[시티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-NLS-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-[시티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-NLS-[아데노신 데아미나제] [시티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-NLS-[시티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-NLS-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-[시티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-NLS-[Cas9 도메인]-[시티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-NLS-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-[시티딘 데아미나제]-NL2-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제] [시티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-NLS-COOH;
NH2-[시티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-NLS-COOH;
NH2-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-[시티딘 데아미나제]-NLS-COOH; 또는
NH2-[Cas9 도메인]-[시티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-NLS-COOH.
일부 구현예에서, NLS는 링커에 존재하거나 NLS는 예를 들어 본원에 기재된 링커에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, N-말단 또는 C-말단 NLS는 양분된 NLS이다. 양분된 NLS는 비교적 짧은 스페이서 서열에 의해 분리된 2개의 기본 아미노산 클러스터를 포함한다 (따라서, 양분된 - 2개 부분, 단분된 NLS는 그렇지 않음). 뉴클레오플라스민의 NLS인 KR[PAATKKAGQA]KKKK는 편재하는 양분된 신호의 원형이다: 약 10개 아미노산의 스페이서로 분리된 2개의 염기성 아미노산 클러스터. 예시적인 양분된 NLS의 서열은 다음과 같다:
PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV.
일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제, 아데노신 데아미나제, Cas9 도메인 및 NLS를 포함하는 융합 단백질은 링커 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 도메인 또는 단백질 (예를 들어, 시티딘 데아미나제, 아데노신 데아미나제, Cas9 도메인 또는 NLS) 중 하나 이상 사이에 링커 서열이 존재한다.
본원 개시내용의 융합 단백질은 하나 이상의 추가 특징을 포함할 수 있음이 인지되어야 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 가용화, 정제 또는 검출을 위해 유용한 서열 태그 뿐만 아니라 저해제, 세포질 국소화 서열, 배출 서열, 예를 들어, 핵 배출 서열 또는 다른 국소화 서열을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 적합한 단백질 태그는 비오틴 카복실라제 캐리어 단백질 (BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린 (calmodulin)-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌 (HA)-태그, 또한 히스티딘 태그 또는 His-태그로서 언급되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP)-태그, nus-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)-태그, 녹색 형광성 단백질 (GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프트태그 (예를 들어, 소프트태그 1, 소프트태그 3), strep-태그, 비오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그 및 SBP-태그를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가의 적합한 서열은 당업자에게 자명할 것이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 His 태그를 포함한다.
예시적이지만 비제한적인 융합 단백질은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/044935 및 PCT/US2020/016288에 기재되어 있으며, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
아데노신 데아미나제
일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집기는 아데노신 데아미나제를 포함하는 데아미나제 도메인을 포함할 수 있다. 염기 편집기의 상기 아데노신 데아미나제 도메인은 아데닌 (A)을 탈아민화하여 구아닌 (G)의 염기쌍 형성 성질을 나타내는 이노신 (I)을 형성함에 의해 아데닌 (A) 핵염기의 구아닌 (G) 핵염기로의 편집을 촉진시킬 수 있다. 아데노신 데아미나제는 데옥시리보핵산 (DNA)에서 데옥시아데노신 잔기의 아데닌을 탈아민화 (즉, 아민 그룹을 제거하는)할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 아데닌을 탈아민화할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 DNA의 데옥시아데노신 잔기에서 아데닌을 탈아민화할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데닌 데아미나제는 천연적으로 발생하는 아데노신 데아미나제이고, 이는 본원에 제공된 임의의 돌연변이에 상응하는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, ecTadA 내 돌연변이)를 포함한다. 당업자는 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 임의의 상동성 단백질에서 상응하는 잔기를 동정할 수 있을 것이다. 따라서, 당업자는 임의의 천연적으로 발생하는 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA와 상동성을 갖는)에서 돌연변이를 생성할 수 있고, 이는 본원에 기재된 임의의 돌연변이, 예를 들어, ecTadA에서 동정된 임의의 돌연변이에 상응한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 원핵세포 기원이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 세균 기원이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 에스케리치아 콜리, 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 타이피, 쉐와넬라 푸트레파시엔스, 해모필러스 인플루엔자, 콜로박터 크레슨투스, 또는 바실러스 서브틸리스)로부터 기원한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 이. 콜리 기원이다.
본원 개시내용은 효율 (>50-60%) 및 특이성을 증가시키는 아데노신 데아미나제 변이체를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 아데노신 데아미나제 변이체는 폴리뉴클레오타이드 내 목적하는 염기를 편집할 가능성이 높고 변경시키고자 하지 않은 염기 (즉, "방관자")를 편집할 가능성이 적다.
특정 구현예에서, TadA는 이의 전문이 참조로 본원에 참조된 PCT/US2017/045381 (WO2018/027078)에 기재된 TadA의 임의의 하나이다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 핵염기 편집기는 하기의 서열 중 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체이다:
Figure pct00211
(또한 TadA*7.10으로서 호칭됨).
특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일(예를 들어, 단량체로서 제공된) TadA*8 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, TadA*8은 Cas9 닉카제에 연결된다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 융합 단백질은 TadA*8 변이체에 연결된 야생형 TadA (TadA(wt))의 이종이량체로서 포함한다. 다른 구현예에서, 본원 개시내용의 융합 단백질은 TadA*8 변이체에 연결된 TadA*7.10의 이종이량체로서 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 변이체 단량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 변이체 및 TadA(wt)의 이종이량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 변이체 및 TadA*7.10의 이종이량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 변이체의 이종이량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, TadA*8 변이체는 표 7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, ABE8은 표 7로부터 선택된다. 관련 서열은 다음과 같다:
야생형 TadA (TadA(wt)) 또는 "TadA 참조 서열"
Figure pct00212
TadA*7.10:
Figure pct00213
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 본원의 개시내용은 특정 퍼센트 동일성 + 본원에 기재된 임의의 돌연변이 또는 이의 조합을 갖는 임의의 데아미나제 도메인을 제공한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 참조 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 또는 적어도 170개 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TadA 데아미나제는 전장 이. 콜리 TadA 데아미나제이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00214
그러나, 본원에 유용한 추가의 아데노신 데아미나제가 당업자에게 자명하고 본원 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 인지되어야 한다. 예를 들어, 아데노신 데아미나제는 tRNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAT)의 동족체일 수 있다. 제한 없이, 예시적인 AD AT 동족체의 아미노산 서열은 다음을 포함한다:
스타필로코커스 아우레우스 TadA:
Figure pct00215
바실러스 서브틸리스 TadA:
Figure pct00216
살모넬라 타이피무리움 (에스. 티피무리움) TadA:
Figure pct00217
쉐와넬라 푸트레파시엔스 (에스. 푸트레파시엔스) TadA:
Figure pct00218
해모필러스 인플루엔자 F3031 (에이취. 인플루엔자) TadA:
Figure pct00219
콜로박터 크레슨투스 (씨. 크레슨투스) TadA:
Figure pct00220
게오박터 설푸레두센스 (지. 설푸레두센스) TadA:
Figure pct00221
이. 콜리 (E. Coli) TadA (ecTadA)의 구현예는 하기를 포함한다:
Figure pct00222
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 원핵세포 기원이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 세균 기원이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 에스케리치아 콜리, 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 타이피, 쉐와넬라 푸트레파시엔스, 해모필러스 인플루엔자, 콜로박터 크레슨투스, 또는 바실러스 서브틸리스로부터 기원한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 이. 콜리 기원이다.
하나의 구현예에서, 본원 개시내용의 융합 단백질은 Cas9 닉카제에 연결된 TadA7.10에 연결된 야생형 TadA를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일 TadA7.10 도메인 (예를 들어, 단량체로서 제공된)을 포함한다. 다른 구현예에서, ABE7.10 편집기는 TadA7.10 및 TadA(wt)를 포함하고 이들은 이종이량체를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 본원의 개시내용은 특정 퍼센트 동일성 + 본원에 기재된 임의의 돌연변이 또는 이의 조합을 갖는 임의의 데아미나제 도메인을 제공한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 참조 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 또는 적어도 170개 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 돌연변이 (예를 들어, TadA 참조 서열을 기준으로)가 다른 아데노신 데아미나제, 예를 들어, 이. 콜리 TadA (ecTadA), 에스. 아우레우스 (S. aureus) TadA (saTadA), 또는 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, 세균 아데노신 데아미나제)로 도입될 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 추가의 데아미나제가 본원에 제공된 바와 같이 돌연변이될 수 있는 상동성 아미노산 잔기를 동정하기 위해 유사하게 정렬될 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, TadA 참조 서열에서 동정된 임의의 돌연변이는 상동성 아미노산 잔기를 갖는 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTada)에 만들어질 수 있다. 또한 본원에 제공된 임의의 돌연변이는 개별적으로 또는 TadA 참조 서열 또는 또 다른 아데노신 데아미나제와 임의의 조합으로 만들어질 수 있는 것으로 인지되어야 한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 D108X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 D108G, D108N, D108V, D108A, 또는 D108Y 돌연변이 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 A106X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A106V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, 야생형 TadA 또는 ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 E155X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 E155D, E155G 또는 E155V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 D147X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 D147Y 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 A106X, E155X 또는 D147X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 E155D, E155G, 또는 E155V 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 D147Y를 포함한다.
예를 들어, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 D108N, A106V, E155V, 및/또는 D147Y 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 하기의 돌연변이 그룹 (돌연변이 그룹은 ";"에 의해 분리된다), 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다: D108N 및 A106V; D108N 및 E155V; D108N 및 D147Y; A106V 및 E155V; A106V 및 D147Y; E155V 및 D147Y; D108N, A106V, 및 E155V; D108N, A106V, 및 D147Y; D108N, E155V, 및 D147Y; A106V, E155V, 및 D 147Y; 및 D108N, A106V, E155V, 및 D147Y. 그러나, 본원에 제공된 상응하는 돌연변이의 임의의 조합은 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에 만들어질 수 있음이 인지되어야 한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, T17X, L18X, W23X, L34X, W45X, R51X, A56X, E59X, E85X, M94X, I95X, V102X, F104X, A106X, R107X, D108X, K110X, M118X, N127X, A138X, F149X, M151X, R153X, Q154X, I156X, 및/또는 K157X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, T17S, L18E, W23L, L34S, W45L, R51H, A56E, 또는 A56S, E59G, E85K, 또는 E85G, M94L, I95L, V102A, F104L, A106V, R107C, 또는 R107H, 또는 R107P, D108G, 또는 D108N, 또는 D108V, 또는 D108A, 또는 D108Y, K110I, M118K, N127S, A138V, F149Y, M151V, R153C, Q154L, I156D, 및/또는 K157R 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, 및/또는 N127X 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 임의의 아미노산의 존재를 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N 및/또는 N127S 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, R26X, M61X, L68X, M70X, A106X, D108X, A109X, N127X, D147X, R152X, Q154X, E155X, K161X, Q163X, 및/또는 T166X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, R26W, M61I, L68Q, M70V, A106T, D108N, A109T, N127S, D147Y, R152C, Q154H 또는 Q154R, E155G 또는 E155V, 또는 E155D, K161Q, Q163H, 및/또는 T166P 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, N127X, D147X, R152X, 및 Q154X로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, M61X, M70X, D108X, N127X, Q154X, E155X 및 Q163X로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산이외의 임의의 아미노산의 존재를 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, N127X, E155X, 및 T166X로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산이외의 임의의 아미노산의 존재를 지적한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 H8X, A106X, 및 D108X로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 H8X, R26X, L68X, D108X, N127X, D147X 및 E155X로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산이외의 임의의 아미노산의 존재를 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, A109X, N127X, 및 E155X로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산이외의 임의의 아미노산의 존재를 지적한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, R152C, 및 Q154H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, M61I, M70V, D108N, N127S, Q154R, E155G 및 Q163H로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, E155V, 및 T166P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, A106T, D108N, N127S, E155D, 및 K161Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, R26W, L68Q, D108N, N127S, D147Y, 및 E155V로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, A109T, N127S, 및 E155G로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 돌연변이들 및 임의의 추가의 돌연변이들 (예를 들어, ecTadA 아미노산 서열을 기준으로)은 임의의 다른 아데노신 데아미나제에 도입될 수 있다. 또한 본원에 제공된 임의의 돌연변이는 개별적으로 또는 TadA 참조 서열 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)와 임의의 조합으로 만들어질 수 있다.
A에서 G로의 핵염기 편집 단백질의 세부사항은 문헌 (참조: 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381 (WO2018/027078) 및 Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature, 551, 464-471 (2017), 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 D108N, D108G 또는 D108V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A106V 또는 D108N 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R107C 및 D108N 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, 및 Q154H 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, 및 E155V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 D108N, D147Y 및 E155V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N 및 N127S 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A106V, D108N, D147Y, 및 E155V 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이들을 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S2X, H8X, I49X, L84X, H123X, N127X, I156X 및/또는 K160X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S2A, H8Y, I49F, L84F, H123Y, N127S, I156F 및/또는 K160S 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이들을 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 L84X 돌연변이 아데노신 데아미나제를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 L84F 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 H123X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H123Y 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 I156X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 I156F 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 L84X, A106X, D108X, H123X, D147X, E155X, 및 I156X로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S2X, I49X, A106X, D108X, D147X, 및 E155X로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, A106X, D108X, N127X, 및 K160X로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산이외의 임의의 아미노산의 존재를 지적한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 L84F, A106V, D108N, H123Y, D147Y, E155V, 및 I156F로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S2A, I49F, A106V, D108N, D147Y, 및 E155V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, A106T, D108N, N127S, 및 K160S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 E25X, R26X, R107X, A142X 및/또는 A143X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 E25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, E25Y, R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, R26K, R107P, R107K, R107A, R107N, R107W, R107H, R107S, A142N, A142D, A142G, A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q, 및/또는 A143R 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에 상응하는 본원에 기재된 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이들을 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 E25X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 E25M, E25D, E25A, E25R, E25S 또는 E25Y 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 R26X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L 또는 R26K 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 R107X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R107P, R107K, R107A, R107N, R107W, R107H 또는 R107S 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 A142X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A142N, A142D 또는 A142G 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 A143X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143S, A143Q 및/또는 A143R 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H36X, N37X, P48X, I49X, R51X, M70X, N72X, D77X, E134X, S146X, Q154X, K157X 및/또는 K161X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이들을 포함하고, 여기서, X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H36L, N37T, N37S, P48T, P48L, I49V, R51H, R51L, M70L, N72S, D77G, E134G, S146R, S146C, Q154H, K157N 및/또는 K161T 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이들을 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 H36X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H36L 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열 내 N37X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 N37T 또는 N37S 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 P48X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 P48T 또는 P48L 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R51X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R51H 또는 R51L 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S146X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S146R 또는 S146C 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 K157X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 K157N 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 P48X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 P48S, P48T 또는 P48A 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A142X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A142N 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 W23X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 W23R 또는 W23L 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R152X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지적한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R152P 또는 R52H 돌연변이 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 돌연변이 H36L, R51L, L84F, A106V, D108N, H123Y, S146C, D147Y, E155V, I156F 및 K157N을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에 상대적으로 하기의 돌연변이 조합을 포함하고, 여기서, 조합의 각각의 돌연변이는 "_"에 의해 분리되고 돌연변이의 각각의 조합은 괄호 사이에 있다:
Figure pct00223
Figure pct00224
Figure pct00225
Figure pct00226
특정 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 융합 단백질의 염기 편집 활성을 개선시키는 하나 이상의 특성을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9 도메인 (dCas9), 또는 듀플렉스 DNA 분자의 하나의 가닥을 절단하는, Cas9 닉카제로서 언급되는 Cas9 도메인 (nCas9)을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA*7.10이다. 일부 구현예에서, TadA*7.10은 적어도 하나의 변경을 포함한다. 특정 구현예에서, TadA*7.10은 하기의 변경 중 하나 이상을 포함한다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및 Q154R. 변경 Y123H는 또한 본원에서 H123H로서 언급된다 (TadA*7.10에서 변경 H123Y는 Y123H (wt)로 복귀함). 다른 구현예에서, TadA*7.10은 하기의 그룹으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R. 특정 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 잔기 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 및 157에서 시작하는 C 말단의 결실을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원 개시내용의 염기 편집기는 하기의 변경 중 하나 이상을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체 (예를 들어, TadA*8)를 포함하는 단량체이다: TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 TadA7.10 또는 TadA 참조 서열과 비교하여 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체 (TadA*8)는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 하기의 그룹으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 단량체이다: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 야생형 TadA 아데노신 데아미나제 및 하기의 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체 (예를 들어, TadA*8)를 포함하는 이종이량체이다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10 도메인 및 하기의 그룹으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이에 상대적으로 아데노신 데아미나제 변이체 도메인 (예를 들어 TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 TadA*8이다:
Figure pct00227
일부 구현예에서, TadA*8은 절단된다. 일부 구현예에서, 절단된 TadA*8은 전장 TadA*8에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 N-말단 아미노산 잔기가 결실된다. 일부 구현예에서, 절단된 TadA*8은 전장 TadA*8에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 C-말단 아미노산 잔기가 결실된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 전장 TadA*8이다.
일부 구현예에서, TadA*8은 TadA*8.1, TadA*8.2, TadA*8.3, TadA*8.4, TadA*8.5, TadA*8.6, TadA*8.7, TadA*8.8, TadA*8.9, TadA*8.10, TadA*8.11, TadA*8.12, TadA*8.13, TadA*8.14, TadA*8.15, TadA*8.16, TadA*8.17, TadA*8.18, TadA*8.19, TadA*8.20, TadA*8.21, TadA*8.22, TadA*8.23, 또는 TadA*8.24이다.
하나의 구현예에서, 본원 개시내용의 융합 단백질은 Cas9 닉카제에 연결된 본원에 기재된 아데노신 데아미나제 변이체 (예를 들어, TadA*8)에 연결된 야생형 TadA를 포함한다.　 특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일 TadA*8 도메인 (예를 들어, 단량체로서 제공된)을 포함한다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 및 TadA(wt)를 포함하고 이들은 이종이량체를 형성할 수 있다. 예시적인 서열은 다음과 같다:
TadA(wt) 또는 "TadA 참조 서열":
Figure pct00228
　TadA*7.10:
Figure pct00229
TadA*8:
Figure pct00230
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 본원의 개시내용은 특정 퍼센트 동일성 + 본원에 기재된 임의의 돌연변이 또는 이의 조합을 갖는 임의의 데아미나제 도메인을 제공한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 참조 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 또는 적어도 170개 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, TadA*8은 굵게 표시한 하기의 임의의 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, TadA*8은 밑줄로 표시한 임의의 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
Figure pct00231
예를 들어, TadA*8은 단독으로 또는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 상대적으로 하기 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및/또는 Q154R 중 임의의 하나 이상과 조합하여 아미노산 위치 82 및/또는 166 (예를 들어, V82S, T166R)에서 변경을 포함한다. 특정 구현예에서, 변경의 조합은 하기의 그룹으로부터 선택된다: TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 상대적으로 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; and I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 TadA*8이다:
Figure pct00232
일부 구현예에서, TadA*8은 절단된다. 일부 구현예에서, 절단된 TadA*8은 전장 TadA*8에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 N-말단 아미노산 잔기가 결실된다. 일부 구현예에서, 절단된 TadA*8은 전장 TadA*8에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 C-말단 아미노산 잔기가 결실된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 전장 TadA*8이다.
하나의 구현예에서, 본원 개시내용의 융합 단백질은 Cas9 닉카제에 연결된 본원에 기재된 아데노신 데아미나제 변이체 (예를 들어, TadA*8)에 연결된 야생형 TadA를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일 TadA*8 도메인 (예를 들어, 단량체로서 제공된)을 포함한다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 및 TadA(wt)을 포함하고 이들은 이종이량체를 형성할 수 있다.
시티딘 데아미나제
본원에 제공된 융합 단백질은 하나 이상의 시티딘 데아미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 시티딘 디아미나제는 시토신 또는 5-메틸시토신을 우라실 또는 티민으로 탈아민화할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 시티딘 데아미나제는 DNA에서 시토신을 탈아민화할 수 있다. 시티딘 데아미나제는 임의의 적합한 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 본원에 제공된 임의의 돌연변이에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 천연적으로 발생하는 시티딘 데아미나제이다. 당업자는 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 임의의 상동 단백질에서 상응하는 잔기를 동정할 수 있을 것이다. 따라서, 당업자는 본원에 기재된 임의의 돌연변이에 상응하는 임의의 천연적으로 발생하는 시티딘 데아미나제에서 돌연변이를 생성할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 원핵생물 기원이다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 세균 기원이다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 포유동물 (예를 들어, 인간) 기원이다.
일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 본원에 기재된 시티딘 데아미나제 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에서 제공된 시티딘 데아미나제는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 본원에서 제공되는 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음이 인지되어야 한다. 본원 개시내용은 특정 퍼센트 동일성을 갖는 임의의 데아미나제 도메인과 본원에 기재된 임의의 돌연변이 또는 이의 조합을 제공한다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 참조 서열, 또는 본원에서 제공된 임의의 시티딘 데아미나제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 또는 적어도 170개 동일한 연속 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원 개시내용의 융합 단백질은 2개 이상의 핵산 편집 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 편집 도메인은 C에서 U로의 염기 변화를 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 편집 도메인은 데아미나제 도메인, 특히, 2개의 데아미나제 도메인이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 시티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 시티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBECl 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC2 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC3 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC3A 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC3B 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC3C 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC3D 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC3E 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC3F 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC3G 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC3H 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 APOBEC4 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 활성화-유도된 데아미나제 (AID)이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 척추동물 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 무척추동물 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 인간, 침팬지, 고릴라, 몽키, 소, 개, 래트, 또는 마우스 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 인간 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 래트 데아미나제, 예를 들어, rAPOBECl이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 페트로마이존 마리누스 시티딘 데아미나제 1 (pmCDA1)이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G의 단편이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 D316R D317R 돌연변이를 포함하는 인간 APOBEC3G 변이체이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G의 단편이고, D316R D317R 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 편집 도메인은 본원에 기재된 임의의 데아미나제의 데아미나제 도메인과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 융합 단백질의 염기 편집 활성을 개선하는 하나 이상의 특징을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 뉴클레아제 활성이 감소된 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 Cas9 닉타제 (nCas9)로서 언급되는, 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9 도메인 (dCas9) 또는 이중가닥 DNA 분자의 한 가닥을 절단하는 Cas9 도메인 (nCas9)을 가질 수 있다.
추가의 도메인
본원에 기재된 염 편집기는 핵염기 편집, 폴리뉴클레오타이드의 핵염기의 변형 또는 변경의 촉진을 도와주는 임의의 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 (예를 들어, Cas9), 핵염기 편집 도메인 (예를 들어, 데아미나제 도메인) 및 하나 이상의 추가의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 도메인은 염기 편집기의 효소 또는 촉매 기능, 염기 편집기의 결합 기능을 촉진시킬 수 있거나 목적하는 염기 편집 결과를 방해할 수 있는 세포 기구 (예를 들어, 효소)의 저해제일 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 뉴클레아제, 닉카제, 리컴비나제, 데아미나제, 메틸트랜스퍼라제, 메틸라제, 아세틸라제, 아세틸트랜스퍼라제, 전사 활성화인자, 또는 전사 리프레서 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 우라실 글리코실라제 저해제 (UGI) 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, U의 존재에 대한 세포 DNA 복구 반응: G 헤테로듀플렉스 DNA는 세포에서 핵염기 편집 효율에서의 감소에 관여할 수 있다. 상기 구현예에서, 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)는 세포에서 DNA로부터 U의 제거를 촉매할 수 있고, 이는 염기 절제 복구 (BER)를 개시하여 대부분 U:G 쌍의 C:G 쌍으로의 복귀를 유도할 수 있다. 상기 구현예에서, BER은 단일 가닥에 결합하고, 편집된 염기를 차단하고, UGI를 저해하고, BER을 저해하고, 편집된 염기를 보호하고/하거나 비-편집된 가닥의 복구를 촉진시키는 하나 이상의 도메인을 포함하는 염기 편집기에서 저해될 수 있다. 따라서, 본원의 개시내용은 UGI 도메인을 포함하는 염기 편집기 융합 단백질을 고려한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 도메인으로서 이중 가닥 절단 (DSB) 결합 단백질의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, DSB 결합 단백질은 DSB의 말단에 결합할 수 있고 이들을 분해로부터 보호할 수 있는 박테리오파아지 Mu의 Gam 단백질을 포함할 수 있다. 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017))을 참조하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
추가로, 일부 구현예에서, Gam 단백질은 염기 편집기의 N 말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, Gam 단백질은 염기 편집기의 C-말단에 융합될 수 있다. 박테리오파아지 Mu의 Gam 단백질은 이중 가닥 절단 (DSB)의 말단에 결합하고 이들을 분해로부터 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, DSB의 유리된 말단에 결합하는 Gam을 사용하여 염기 편집 공정 동안에 삽입-결실 형성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 174개-잔기 Gam 단백질은 염기 편집기의 N 말단에 융합된다. 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017))을 참조한다. 일부 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 야생형 도메인과 비교하여 염기 편집기 도메인의 길이를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산의 결실은 염기 편집기의 길이를 감소시킬 수 있다. 또 다른 경우에, 돌연변이 또는 돌연변이들은 야생형 도메인과 비교하여 도메인의 길이를 변화시키지 않는다. 예를 들어, 임의의 도메인에서 치환(들)은 염기 편집기의 길이를 변화시키지 않는다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 도메인으로서 핵산 폴리머라제 (NAP) 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기는 진핵 세포 NAP의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 도입된 NAP 또는 이의 일부는 DNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 도입된 NAP 또는 이의 일부는 트랜스레젼 (translesion) 폴리머라제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 도입된 NAP 또는 이의 일부는 트랜스레젼 DNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 도입된 NAP 또는 이의 일부는 Rev7, Rev1 복합체, 폴리머라제 이오타, 폴리머라제 카파, 또는 폴리머라제 에타이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 도입되는 NAP 또는 이의 일부는 진핵 세포 폴리머라제 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론, 감마, 에타, 이오타, 카파, 람다, mu, 또는 nu 성분이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 도입되는 NAP 또는 이의 일부는 핵산 폴리머라제 (예를 들어, 트랜스레젼 DNA 폴리머라제)와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
기타 핵염기 편집기
본원 개시내용은 모듈식 멀티-이펙터 핵염기 편집기를 제공하며, 여기서, 당업계에 공지된 실질적으로 모든 핵염기 편집기는 본원에 기재된 융합 단백질에 삽입되거나 시티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제로 교체될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원 개시내용은 비염기성 핵염기 편집기 도메인을 포함하는 멀티-이펙터 핵염기 편집기를 특징으로 한다. 비염기성 핵염기 편집기는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 (참조: Kavli et al., EMBO J. 15:3442-3447, 1996)에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 멀티-이펙터 핵염기 편집기는 하기 도메인 A-C, A-D, 또는 A-E를 포함한다:
NH2-[A-B-C]-COOH,
NH2-[A-B-C-D]-COOH, 또는
NH2-[A-B-C-D-E]-COOH
여기서, A 및 C 또는 A, C, 및 E는 각각 다음 중 하나 이상을 포함한다: 아데노신 데아미나제 도메인 또는 이의 활성 단편, 시티딘 데아미나제 도메인 또는 이의 활성 단편, DNA 글리코실라제 도메인 또는 이의 활성 단편; B 또는 B 및 D는 각각 핵산 서열 특이적 결합 활성을 갖는 하나 이상의 도메인을 포함한다.
하나의 구현예에서, 멀티-이펙터 핵염기 편집기는 다음을 포함한다:
NH2-[An-Bo-Cn]-COOH,
NH2-[An-Bo-Cn-Do]-COOH, 또는
NH2-[An-Bo-Cp-Do-Eq]-COOH;
여기서, A 및 C 또는 A, C, 및 E는 각각 다음 중 하나 이상을 포함한다: 아데노신 데아미나제 도메인 또는 이의 활성 단편, 시티딘 데아미나제 도메인 또는 이의 활성 단편, ?? DNA 글리코실라제 도메인 또는 이의 활성 단편; 여기서, n은 정수: 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 여기서, p는 정수: 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; B 또는 B 및 D는 각각 핵산 서열 특이성 결합 활성을 갖는 도메인을 포함하고; 여기서, o는 정수: 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
염기 편집기 시스템
본원에 제공된 염기 편집기 시스템의 사용은 하기의 단계를 포함한다: (a) 대상체의 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 이중 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA)의 표적 뉴클레오타이드 서열을 핵염기 편집기 (예를 들어, 아데노신 염기 편집기) 및 가이드 핵산 (예를 들어, gRNA)을 포함하는 염기 편집기 시스템과 접촉시키는 단계로서, 상기 표적 뉴클레오타이드 서열이 표적화된 핵염기 쌍을 포함하는 단계; (b) 상기 표적 영역의 가닥 분리를 유도하는 단계; (c) 상기 표적 영역의 단일 가닥 내 상기 표적 핵염기 쌍의 제1 핵염기를 제2 핵염기로 전환시키는 단계; 및 (d) 상기 표적 영역의 하나 이하의 가닥을 절단하는 단계로서, 상기 제1 핵염기에 상보적인 제3 핵염기가 상기 제2 핵염기에 상보적인 제4 핵염기로 대체되는, 단계. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 생략되는 것으로 인지되어야 한다. 일부 구현예에서, 상기 표적화된 핵염기 쌍은 하나 이상의 유전자에서 다수의 핵염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 유전자에서 다수의 핵염기 쌍의 멀티플렉스 편집을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 다수의 핵염기 쌍은 동일한 유전자에 위치한다. 일부 구현예에서, 다수의 핵염기 쌍은 하나 이상의 유전자에 위치하고, 여기서, 적어도 하나의 유전자는 상이한 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 절단된 단일 가닥 (닉 가닥)은 가이드 핵산에 하이브리드화한다. 일부 구현예에서, 절단된 단일 가닥은 제1 핵염기를 포함하는 가닥에 반대편에 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 Cas9 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 염기는 아데닌이고 제2 염기는 G, C, A, 또는 T가 아니다. 일부 구현예에서, 제2 염기는 이노신이다.
본원에 제공된 바와 같은 염기 편집 시스템은 촉매 결함 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9, 아데노신 데아미나제, 및 이중 가닥 DNA 절단을 생성하지 않고 공여자 DNA 주형을 요구하지 않고 과량의 확률적 삽입 및 결실을 유도하지 않으면서 DNA에서 프로그래밍 가능한 단일 뉴클레오타이드 (C→T 또는 A→G) 변화를 유도하는 염기 절제 복구의 저해제를 함유하는 융합 단백질을 사용하는 게놈 편집에 대한 신규 접근법을 제공한다.
본원에서는 염기 편집기 시스템을 사용하는 핵염기를 편집하기 위한 시스템, 조성물 및 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 (1) 핵염기를 편집하기 위해 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 핵염기 편집 도메인 (예를 들어, 데아미나제 도메인)을 포함하는 염기 편집기 (BE); 및 (2) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인과 접합된 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다 (도 2a). 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 아데노신 염기 편집기 (ABE)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 RNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 데아미나제 도메인이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 도메인은 아데닌 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 아데노신 염기 편집기는 DNA에서 아데닌을 탈아민화할 수 있다. 일부 구현예에서, ABE는 변화된 TadA 변이체를 포함한다.
핵염기 편집 단백질의 세부사항은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381 (WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344 (WO2017/070632)에 기재되어 있고, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017))을 참조하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 단일 가이드 폴리뉴클레오타이드는 데아미나제를 표적 핵산 서열에 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 쌍의 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상이한 데아미나제를 표적 핵산 서열에 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
염기 편집기 시스템의 핵염기 성분 및 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 성분은 서로 공유적으로 또는 비공유적으로 연합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데아미나제 도메인은 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 데아미나제 도메인에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 데아미나제 도메인을 데아미나제 도메인과 비공유적으로 상호작용하거나 연합함에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 뉴클레아제 편집 성분, 예를 들어, 데아미나제 성분은 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인의 일부인 추가의 이종성 부분 또는 도메인과 상호작용하거나, 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있는 추가의 이종성 부분 또는 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩타이드에 결합하거나 이와 상호작용하거나 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드에 결합하거나 이와 상호작용하거나 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩타이드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드 링커에 결합할 수 있다. 추가의 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 K 상동성 (KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 무균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인지 모티프일 수 있다.
염기 편집기 시스템은 가이드 폴리뉴클레오타이드 성분을 추가로 포함할 수 있다. 염기 편집기 시스템의 성분들은 공유 결합, 비공유 상호작용, 또는 이의 연합과 상호작용의 임의의 조합을 통해 서로 연합될 수 있음이 인지되어야 한다. 일부 구현예에서, 데아미나제 도메인은 가이드 폴리뉴클레오타이드에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템의 핵염기 편집 성분, 예를 들어, 데아미나제 성분은 가이드 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 분절 (예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 모티프)과 상호작용하거나, 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있는 추가의 이종성 부분 또는 도메인 (예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오타이드 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분 또는 도메인 (예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오타이드 결합 도메인)은 데아미나제 도메인에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩타이드에 결합하거나 이와 상호작용하거나 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드에 결합하거나 이와 상호작용하거나 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩타이드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드 링커에 결합할 수 있다. 추가의 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 K 상동성 (KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 무균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인지 모티프일 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 염기 절제 복구 저해제 (BER)의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 염기 편집기 시스템의 성분들은 공유 결합, 비공유 상호작용, 또는 이의 연합과 상호작용의 임의의 조합을 통해 서로 연합될 수 있음이 인지되어야 한다. BER 성분의 저해제는 염기 절제 복구 저해제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 저해제는 우라실 DNA 글리코실라제 저해제 (UGI)일 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 저해제는 이노신 염기 절제 복구 저해제일 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 저해제는 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 염기 절제 복구의 저해제에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 데아미나제 도메인 및 염기 절제 복구의 저해제에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인은 염기 절제 복구의 저해제를 염기 절제 복구의 저해제와 비공유적으로 상호작용하거나 연합함에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 절제 복구 성분의 저해제는 폴리뉴클레오타이드 프로그램 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인의 일부인 추가의 이종성 부분 또는 도메인과 상호작용하거나, 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있는 추가의 이종성 부분 또는 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 저해제는 가이드 폴리뉴클레오타이드에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열에 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 저해제는 가이드 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 분절 (예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 모티프)과 상호작용하거나, 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있는 추가의 이종성 부분 또는 도메인 (예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오타이드 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오타이드의 추가의 이종성 부분 또는 도메인 (예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오타이드 결합 도메인)은 염기 절제 복구의 저해제에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드에 결합하거나 이와 상호작용하거나 이와 연합하거나 이와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩타이드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오타이드 링커에 결합할 수 있다. 추가의 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 K 상동성 (KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 무균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인지 모티프일 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 편집된 가닥의 염기 절제 복구 (BER)를 저해한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 비-편집된 가닥을 보호하거나 이에 결합한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 UGI 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 촉매적 불활성 이노신-특이적 뉴클레아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 닉카제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기쌍의 의도된 편집은 PAM 부위의 업스트림에 있다. 일부 구현예에서, 염기쌍의 의도된 편집은 PAM 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드 업스트림에 있다. 일부 구현예에서, 의도된 염기쌍의 편집은 PAM 부위의 다운스트림에 있다. 일부 구현예에서 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 다운스트림의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 카노니칼 (예를 들어, NGG) PAM 부위를 필요로하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집기는 링커 또는 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 1-25개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 5-20개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집 융합 단백질은 정확한 위치, 예를 들어, 표적 염기가 한정된 영역 (예를 들어, "탈아민화 윈도우") 내에 위치할 필요가 있다. 일부 구현예에서, 표적은 4개 염기 영역 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 한정된 표적 영역은 PAM의 대략적으로 15개 염기 업스트림에 있을 수 있다. 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017))을 참조하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 표적 영역은 표적 윈도우를 포함하고, 여기서, 상기 표적 윈도우는 표적 핵염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 1-10개 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 의도된 염기쌍의 편집은 표적 윈도우 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 의도된 염기쌍의 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 탈아민화 윈도우이다. 탈아민화 윈도우는 염기 편집기가 표적 뉴클레오타이드에 작용하여 탈아민화하는 한정된 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, 탈아민화 윈도우는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 염기 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 탈아민화 윈도우는 PAM의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 염기 업스트림에 있다.
본원 개시내용의 염기 편집기는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 편집을 촉진시키는, 임의의 도메인, 특성 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 편집기는 핵 국소화 서열 (NLS)을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 NLS는 데아미나제 도메인과 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 NLS는 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인의 C-말단에 위치한다.
본원에 개시된 바와 같이 염기 편집기에 존재할 수 있는 다른 예시적 특성은 융합 단백질의 가용화, 정제 또는 검출을 위해 유용한 서열 태그 뿐만 아니라 세포질 국소화 서열, 배출 서열, 예를 들어, 핵 배출 서열 또는 다른 국소화 서열과 같은 국소화 서열이다. 본원에 제공된 적합한 단백질 태그는 비오틴 카복실라제 캐리어 단백질 (BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌 (HA)-태그, 또한 히스티딘 태그 또는 His-태그로서 언급되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP)-태그, nus-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)-태그, 녹색 형광성 단백질 (GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프트태그 (예를 들어, 소프트태그 1, 소프트태그 3), strep-태그, 비오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그 및 SBP-태그를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가의 적합한 서열은 당업자에게 자명할 것이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 His 태그를 포함한다.
융합 단백질에 포함될 수 있는 단백질 도메인의 비제한적인 예는 데아미나제 도메인 (예를 들어, 아데노신 데아미나제), 우라실 글리코실라제 저해제 (UGI) 도메인, 에피토프 태그 및 수용체 유전자 서열을 포함한다.
에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가의 단백질 서열은 DNA 분자에 결합하거나 말토스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합, GAL4 DNA 결합 도메인 융합, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) BP16 단백질 융합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 세포 분자에 결합하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 염기 편집기 (ABE)는 DNA에서 아데닌을 탈아민화할 수 있다. 일부 구현예에서, ABE는 BE3의 APOBEC1 성분을 천연 또는 가공된 이. 콜리 (E. coli) TadA, 인간 ADAR2, 마우스 ADA, 또는 인간 ADAT2로 대체함에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, ABE는 변화된 TadA 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE 1.2 (TadA*-XTEN-nCas9-NLS)이다. 일부 구현예에서, TadA*는 A106V 및 D108N 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, ABE는 제2 세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE2.1이고, 이는 TadA*에서 추가의 돌연변이 D147Y 및 E155V (TadA*2.1)를 포함한다. 일부 구현예에서, ABE는 촉매 불활성화된 버전의 인간 알킬 아데닌 DNA 글리코실라제 (E125Q 돌연변이를 갖는 AAG)에 융합된 ABE2.1인 ABE2.2이다. 일부 구현예에서, ABE는 촉매 불활성화된 버전의 이. 콜리 Endo V(D35A 돌연변이로 불활성화된)에 융합된 ABE2.1인 ABE2.3이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE2.6이고, 이는 ABE2.1에서의 링커 보다 2배 긴 링커 (32개 아미노산, (SGGS)2-XTEN-(SGGS)2)를 갖는 ABE2.6이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE2.7이고, 이는 추가의 야생형 TadA 단량체로 테더링된 ABE2.1이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE2.8이고, 이는 추가의 TadA *2.1 단량체로 테더링된 ABE2.1이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE2.9이고, 이는 변화된 TadA (TadA*2.1)의 ABE2.1의 N-말단으로의 직접적인 융합체이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE2.10이고, 이는 야생형 TadA의 ABE2.1의 N-말단으로의 직접적인 융합체이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE2.11이고, 이는 TadA* 단량체의 N-말단에서 불활성화 E59A 돌연변이를 갖는 ABE2.9이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE2.12이고, 이는 내부 TadA* 단량체에서 불활성화 E59A 돌연변이를 갖는 ABE2.9이다.
일부 구현예에서, ABE는 제3 세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE3.1이고, 이는 3개의 추가의 TadA 돌연변이 (L84F, H123Y, 및 I156F)를 갖는 ABE2.3이다.
일부 구현예에서, ABE는 제4 세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE4.3이고, 이는 추가의 TadA 돌연변이 A142N (TadA*4.3)을 갖는 ABE3.1이다.
일부 구현예에서, ABE는 제5 세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE5.1이고, 이는 생존 클론 (H36L, R51L, S146C, 및 K157N)으로부터의 돌연변이의 컨센서스 세트의 ABE3.1에 수입함에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE5.3이고, 이는 내부 변화된 TadA*에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 ABE5.2, ABE5.4, ABE5.5, ABE5.6, ABE5.7, ABE5.8, ABE5.9, ABE5.10, ABE5.11, ABE5.12, ABE5.13, 또는 ABE5.14이다. 일부 구현예에서, ABE는 제6 세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 ABE6.1, ABE6.2, ABE6.3, ABE6.4, ABE6.5, 또는 ABE6.6이다. 일부 구현예에서, ABE는 제7 세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 ABE7.1, ABE7.2, ABE7.3, ABE7.4, ABE7.5, ABE7.6, ABE7.7, ABE7.8, ABE 7.9, 또는 ABE7.10이다.
[표 6] ABE의 유전자형
Figure pct00233
Figure pct00234
일부 구현예에서, 염기 편집기는 제8 세대 ABE(ABE8)이다. 일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체를 함유한다. 일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체 ("ABE8.x-m")를 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.1-m이고, 이는 Y147T 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.1)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.2-m이고, 이는 Y147R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.2)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.3-m이고, 이는 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.3)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.4-m이고, 이는 Y123H 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.4)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.5-m이고, 이는 V82S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.5)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.6-m이고, 이는 T166R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.6)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.7-m이고, 이는 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.7)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.8-m이고, 이는 Y147R, Q154R 및 Y123H 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.8)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.9-m이고, 이는 Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.9)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.10-m이고, 이는 Y147R, Q154R 및 T166R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.10)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.11-m이고, 이는 Y147T 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.11)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.12-m이고, 이는 Y147T 및 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.12)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.13-m이고, 이는 Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.13)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.14-m이고, 이는 I76Y 및 V82S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.14)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.15-m이고, 이는 V82S 및 Y147R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.15)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.16-m이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), Y147R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.16)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.17-m이고, 이는 V82S 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.17)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.18-m이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.18)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.19-m이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), Y147R 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.19)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.20-m이고, 이는 I76Y, V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), Y147R 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.20)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.21-m이고, 이는 Y147R 및 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.21)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.22-m이고, 이는 V82S 및 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.22)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.23-m이고, 이는 V82S 및 Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H) 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.18)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.24-m이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), 및 Y147T 돌연변이를 갖는 TadA*7.10 (TadA*8.24)을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다.
일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA ("ABE8.x-d")를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.1-d이고, 이는 Y147T 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.1)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.2-d이고, 이는 Y147R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.2)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.3-d이고, 이는 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.3)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.4-d이고, 이는 Y123H 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.4)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.5-d이고, 이는 V82S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.5)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.6-d이고, 이는 T166R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.6)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.7-d이고, 이는 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.7)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.8-d이고, 이는 Y147R, Q154R 및 Y123H 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.8)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.9-d이고, 이는 Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.9)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.10-d이고, 이는 Y147R, Q154R 및 T166R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.10)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.11-d이고, 이는 Y147T 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.11)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.12-d이고, 이는 Y147T 및 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.12)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.13-d이고, 이는 Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.13)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.14-d이고, 이는 I76Y 및 V82S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.14)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.15-d이고, 이는 V82S 및 Y147R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.15)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.16-d이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), 및 Y147R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.16)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.17-d이고, 이는 V82S 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.17)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.18-d이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.18)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.19-d이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), Y147 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.19)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.20-d이고, 이는 I76Y, V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), Y147R 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.20)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.21-d이고, 이는 Y147R 및 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.21)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.22-d이고, 이는 V82S 및 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.22)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.23-d이고, 이는 V82S 및 Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H)돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.23)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.24-d이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), 및 Y147T 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜리 TadA (TadA*8.24)를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다.
일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체에 융합된 TadA*7.10 ("ABE8.x -7")을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.1-7이고, 이는 Y147T 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.1)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.2-7이고, 이는 Y147R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.2)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.3-7이고, 이는 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.3)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.4-7이고, 이는 Y123H 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.4)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.5 -7이고, 이는 V82S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.5)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.6 -7이고, 이는 T166R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.6)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.7-7이고, 이는 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.7)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.8-7이고, 이는 Y147R, Q154R 및 Y123H 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.8)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.9 -7이고, 이는 Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.9)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.10-7이고, 이는 Y147R, Q154R 및 T166R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.10)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.11-7이고, 이는 Y147T 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.11)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.12 -7이고, 이는 Y147T 및 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.12)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.13-7, 이는 Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.13)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.14-7이고, 이는 I76Y 및 V82S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.14)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.15-7이고, 이는 V82S 및 Y147R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.15)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.16-7이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H) 및 Y147R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.16)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.17-7이고, 이는 V82S 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.17)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.18-7이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H) 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.18)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.19-7이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), Y147R 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.19)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.20-7이고, 이는 I76Y, V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H), Y147R 및 Q154R 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.20)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.21-7이고, 이는 Y147R 및 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.21)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.22-7이고, 이는 V82S 및 Q154S 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.22)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.23-7이고, 이는 V82S 및 Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H) 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.23)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8.24-7이고, 이는 V82S, Y123H (H123Y로부터 복귀된 Y123H) 및 Y147T 돌연변이를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10 (TadA*8.24)을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다.
일부 구현예에서, ABE는 하기 표 7에 나타낸 바와 같이ABE8.1-m, ABE8.2-m, ABE8.3-m, ABE8.4-m, ABE8.5-m, ABE8.6-m, ABE8.7-m, ABE8.8-m, ABE8.9-m, ABE8.10-m, ABE8.11-m, ABE8.12-m, ABE8.13-m, ABE8.14-m, ABE8.15-m, ABE8.16-m, ABE8.17-m, ABE8.18-m, ABE8.19-m, ABE8.20-m, ABE8.21-m, ABE8.22-m, ABE8.23-m, ABE8.24-m, ABE8.1-d, ABE8.2-d, ABE8.3-d, ABE8.4-d, ABE8.5-d, ABE8.6-d, ABE8.7-d, ABE8.8-d, ABE8.9-d, ABE8.10-d, ABE8.11-d, ABE8.12-d, ABE8.13-d, ABE8.14-d, ABE8.15-d, ABE8.16-d, ABE8.17-d, ABE8.18-d, ABE8.19-d, ABE8.20-d, ABE8.21-d, ABE8.22-d, ABE8.23-d, 또는 ABE8.24-d이다.
[표 7] 아데노신 데아미나제 염기 편집기 8 변이체
Figure pct00235
Figure pct00236
일부 구현예에서, 염기 편집기 (예를 들어, ABE8)는 아데노신 데아미나제 변이체 (예를 들어, TadA*8)를 환형의 퍼뮤턴트 Cas9 (예를 들어, CP5 또는 CP6) 및 양분된 핵 국소화 서열을 포함하는 스캐폴드에 클로닝함에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 (예를 들어, ABE7.9, ABE7.10, 또는 ABE8)는 NGC PAM CP5 변이체 (에스. 피로게네스 (S. pyrogenes) Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 (예를 들어, ABE7.9, ABE7.10, 또는 ABE8)는 AGA PAM CP5 변이체 (에스. 피로게네스 (S. pyrogenes) Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 (예를 들어, ABE7.9, ABE7.10, 또는 ABE8)는 NGC PAM CP6 변이체 (에스. 피로게네스 (S. pyrogenes) Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 (예를 들어, ABE7.9, ABE7.10, 또는 ABE8)는 AGA PAM CP6 변이체 (에스. 피로게네스 (S. pyrogenes) Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다.
일부 구현예에서, ABE는 하기 표 8에 나타낸 바와 같은 유전자형을 갖는다.
[표 8] ABE의 유전자형
Figure pct00237
하기 표 9에 나타낸 바와 같이, 40개 ABE8의 유전자형이 기재된다. ABE의 변화된 이. 콜리 TadA 부분에서 잔기 위치가 지적된다. ABE8에서 돌연변이 변화는 ABE7.10 돌연변이로부터 구분되는 경우 나타낸다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 9에 나타낸 바와 같은 ABE들 중 하나의 유전자형을 갖는다.
[표 9] 변화된 TadA에서 잔기 동일성
Figure pct00238
Figure pct00239
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.1이다:
ABE8.1_Y147T_CP5_NGC PAM_단량체
Figure pct00240
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.1이다:
pNMG-B335 ABE8.1_Y147T_CP5_NGC PAM_단량체
Figure pct00241
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.14이다:
NGC PAM CP5를 갖는 pNMG-357_ABE8.14
Figure pct00242
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.8-m이다:
ABE8.8-m
Figure pct00243
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭하고, 두줄 밑줄 친 서열은 돌연변이를 지적한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.8-d이다:
ABE8.8-d
Figure pct00244
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭하고, 두줄 밑줄 친 서열은 돌연변이를 지적한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.13-m이다:
ABE8.13-m
Figure pct00245
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭하고, 두줄 밑줄 친 서열은 돌연변이를 지적한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.13-d이다:
ABE8.13-d
Figure pct00246
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭하고, 두줄 밑줄 친 서열은 돌연변이를 지적한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.17-m이다:
ABE8.17-m
Figure pct00247
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭하고, 두줄 밑줄 친 서열은 돌연변이를 지적한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.17-d이다:
ABE8.17-d
Figure pct00248
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭하고, 두줄 밑줄 친 서열은 돌연변이를 지적한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.20-m이다:
ABE8.20-m
Figure pct00249
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭하고, 두줄 밑줄 친 서열은 돌연변이를 지적한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 ABE8.20-d이다:
ABE8.20-d
Figure pct00250
상기 서열에서, 일반 텍스트는 아데노신 데아미나제 서열을 지칭하고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열은 링커 서열을 지칭하고, 밑줄 친 서열은 양분된 핵 국소화 서열을 지칭하고, 두줄 밑줄 친 서열은 돌연변이를 지적한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 ABE8은 하기의 서열로부터 선택된다:
01. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147T
Figure pct00251
02. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147R
Figure pct00252
03. 모노ABE8.1_bpNLS + Q154S
Figure pct00253
04. 모노ABE8.1_bpNLS + Y123H
Figure pct00254
05. 모노ABE8.1_bpNLS + V82S
Figure pct00255
06. 모노ABE8.1_bpNLS + T166R
Figure pct00256
07. 모노ABE8.1_bpNLS + Q154R
Figure pct00257
08. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_Y123H
Figure pct00258
09. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_I76Y
Figure pct00259
10. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_T166R
Figure pct00260
11. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147T_Q154R
Figure pct00261
12. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147T_Q154S
Figure pct00262
13. 모노ABE8.1_bpNLS + H123Y123H_Y147R_Q154R_I76Y
Figure pct00263
14. 모노ABE8.1_bpNLS + V82S + Q154R
Figure pct00264
일부 구현예에서, 염기 편집기는 핵염기 편집 도메인 (예를 들어, 데아미나제 도메인의 전부 또는 일부)에 융합된 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 (예를 들어, Cas9 유래된 도메인)을 포함하는 융합 단백질이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 융합 단백질의 염기 편집 활성을 개선시키는 하나 이상의 특성을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9 도메인 (dCas9), 또는 듀플렉스 DNA 분자의 하나의 가닥을 절단하는, Cas9 닉카제로서 언급되는 Cas9 도메인 (nCas9)을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 우라실 글리코실라제 저해제 (UGI)의 전부 또는 일부를 포함하는 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)와 같은 우라실 결합 단백질 (UBP)의 전부 또는 일부를 포함하는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 핵산 폴리머라제의 전부 또는 일부를 포함하는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 도입된 핵산 폴리머라제 또는 이의 일부는 트랜스레젼 DNA 폴리머라제이다.
일부 구현예에서, 염기 편집기의 도메인은 다중 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Cas9로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기는 야생형 또는 천연 Cas9의 REC 엽 및 NUC 엽에 상응하는 REC 엽 (lobe) 및 NUC 엽을 포함한다. 또 다른 예에서, 염기 편집기는 RuvCI 도메인, BH 도메인, REC1 도메인, REC2 도메인, RuvCII 도메인, L1 도메인, HNH 도메인, L2 도메인, RuvCIII 도메인, WED 도메인, TOPO 도메인 또는 CTD 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 하나 이상의 도메인은 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 야생형 버전과 비교하여 돌연변이 (예를 들어, 치환, 삽입, 결실)를 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인의 HNH 도메인은 H840A 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인의 RuvCI 도메인은 D10A 치환을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 염기 편집기의 상이한 도메인 (예를 들어, 인접한 도메인)은 하나 이상의 링커 도메인 (예를 들어, XTEN 링커 도메인)을 사용하거나 사용하지 않고 서로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 결합 (예를 들어, 공유 결합), 화학적 그룹, 또는 2개의 분자 또는 모이어티를 연결하는 분자, 예를 들어, 융합 단백질의 2개의 도메인, 예를 들어, 제1 도메인 (예를 들어, Cas9-유래된 도메인) 및 제2 도메인 (예를 들어, 아데노신 데아미나제 도메인)일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 공유 결합 (예를 들어, 탄소-탄소 결합, 디설파이드 결합, 탄소-헤테로원자 결합 등)이다. 특정 구현예에서, 링커는 아미드 연결의 탄소 질소 결합이다. 특정 구현예에서, 링커는 환식 또는 비환식, 치환된 또는 비치환된, 분지된 또는 비분지된 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 특정 구현예에서, 링커는 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다. 특정 구현예에서, 링커는 단량체, 이량체 또는 아미노알칸산의 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노알칸산(예를 들어, 글라이신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 단량체, 이량체 또는 아미노헥산산 (Ahx)의 중합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 카보사이클릭 모이어티 (예를 들어, 사이클로펜탄, 사이클로헥산)를 기반으로 한다. 다른 구현예에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (PEG)를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 페닐 환을 기반으로 한다. 링커는 펩타이드로부터의 친핵체 (예를 들어, 티올, 아미노)의 링커로의 부착을 촉진시키기 위해 기능성화된 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 친전자체는 링커의 일부로서 사용될 수 있다. 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클 수용체, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드 및 이소티오시아네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 링커는 Cas9 뉴클레아제 도메인, 및 핵산 편집 단백질의 촉매 도메인을 포함하는 RNA-프로그래밍 가능한 뉴클레아제의 gRNA 결합 도메인을 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 dCas9와 제2 도메인 (예를 들어, UGI, 등)을 연결한다.
전형적으로, 링커는 2개의 그룹, 분자 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나 이에 의해 플랭킹되고 공유 결합을 통해 각각 하나에 연결됨에 따라 2개를 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 또는 다수의 아미노산 (예를 들어, 펩타이드 또는 단백질)이다. 일부 구현예에서, 링커는 유기 분자, 그룹, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 구현예에서, 링커는 2-100개 아미노산 길이, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 또는 150-200개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 약 3 내지 약 104개 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개) 아미노산 길이이다. 더 길거나 더 짧은 링커가 또한 고려된다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 또한 XTEN 링커로서 언급될 수 있는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES를 포함한다. 융합 단백질 도메인을 연결하기 위한 임의의 방법 (예를 들어, 매우 가요성 형태의 링커 (SGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n, 및 (G)n으로부터 보다 강성 형태의 링커 (EAAAK)n, (GGS)n, SGSETPGTSESATPES (참조: 예를 들어, Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82; 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨) 또는 (XP)n 모티프 범위)을 사용하여 핵염기 편집기에 대한 활성을 위한 최적의 길이를 성취할 수 있다. 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다. 일부 구현예에서, 링커는 (GGS)n 모티프를 포함하고, 여기서, n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질의 Cas9 도메인은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES를 포함하는 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 링커는 다수의 프롤린 잔기를 포함하고, 5-21, 5-14, 5-9, 5-7개 아미노산 길이, 예를 들어, PAPAP, PAPAPA, PAPAPAP, PAPAPAPA, P(AP)4, P(AP)7, P(AP)10이다 (참조: 예를 들어, Tan J, Zhang F, Karcher D, Bock R. Engineering of high-precision base editors for site-specific single nucleotide replacement. Nat Commun. 2019 Jan 25;10(1):439; 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). 상기 프롤린-풍부 링커는 또한 "강성" 링커로 호칭된다.
본원 개시내용의 융합 단백질은 핵산 편집 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 척추동물 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 무척추동물 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 인간, 침팬지, 고릴라, 몽키, 소, 개, 래트, 또는 마우스 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 인간 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 래트 데아미나제이다.
링커
특정 구현예에서, 링커는 본원 개시내용의 임의의 펩타이드 또는 펩타이드 도메인을 연결하기 위해 사용될 수 있다.　 링커는 공유 결합만큼 단순할 수 있거나 이것은 많은 원자 길이의 중합체 링커일 수 있다.　 특정 구현예에서, 링커는 폴리펩타이드이거나 아미노산을 기반으로 한다.　 다른 구현예에서, 링커는 펩타이드와 유사하지 않다.　 특정 구현예에서, 링커는 공유 결합 (예를 들어, 탄소-탄소 결합, 디설파이드 결합, 탄소-헤테로원자 결합 등)이다.　 특정 구현예에서, 링커는 아미드 연결의 탄소-질소 결합이다.　 특정 구현예에서, 링커는 환식 또는 비환식, 치환된 또는 비치환된, 분지된 또는 비분지된 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다.　 특정 구현예에서, 링커는 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다.　 특정 구현예에서, 링커는 단량체, 이량체 또는 아미노알칸산의 중합체를 포함한다.　 특정 구현예에서, 링커는 아미노알칸산(예를 들어, 글라이신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다.　 특정 구현예에서, 링커는 단량체, 이량체 또는 아미노헥산산의 중합체 (Ahx)를 포함한다.　 특정 구현예에서, 링커는 카보사이클릭 모이어티 (예를 들어, 사이클로펜탄, 사이클로헥산)를 기반으로 한다.　 다른 구현예에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (PEG)를 포함한다.　 다른 구현예에서, 링커는 아미노산을 포함한다.　 특정 구현예에서, 링커는 펩타이드를 포함한다.　 특정 구현예에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다.　 특정 구현예에서, 링커는 페닐 환을 기반으로 한다.　 링커는 펩타이드 기원의 친핵체 (예를 들어, 티올, 아미노)의 링커로의 접착을 촉진시키는 기능성화된 모이어티를 포함할 수 있다.　 임의의 친전자체는 링커의 일부로서 사용될 수 있다.　 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클 수용체, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드 및 이소티오시아네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 아미노산 또는 다수의 아미노산 (예를 들어, 펩타이드 또는 단백질)이다. 일부 구현예에서, 링커는 결합 (예를 들어, 공유 결합), 유기 분자, 그룹, 중합체 또는 화학적 모이어티이다. 일부 구현예에서, 링커는 약 3 내지 약 104개 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개) 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp는 4, 16, 32, 또는 104개 아미노산 길이인 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 링커는 약 3 내지 약 104개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 아데노신 데아미나제 및 Cas9 도메인을 포함하고 이들은 서로 링커를 통해 융합되어 있다. 데아미나제 도메인 (예를 들어, 가공된 ecTadA)와 Cas9 도메인 간에 다양한 링커 길이 및 가요성 (예를 들어, 매우 가요성 형태의 링커(GGGS)n, (GGGGS)n, 및 (G)n으로부터 보다 강성 형태의 링커 (EAAAK)n, (SGGS)n, SGSETPGTSESATPES (참조: 예를 들어, Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82; 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨) 및 (XP)n 범위)을 사용하여 핵염기 편집기에 대한 활성을 위한 최적의 길이를 성취할 수 있다. 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다. 일부 구현예에서, 링커는 (GGS)n 모티프를 포함하고, 여기서, n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 아데노신 데아미나제 및 Cas9 도메인은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES를 포함하는 링커 (예를 들어, XTEN 링커)를 통해 융합된다.
가이드 RNA와의 Cas9 복합체
본원 개시내용의 일부 양상은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질, 및 융합 단백질의 Cas9 도메인 (예를 들어, dCas9, 뉴클레아제 활성 Cas9, 또는 Cas9 닉카제)에 결합된 가이드 RNA (예를 들어, A 돌연변이를 표적화하는 가이드)를 포함하는 복합체를 제공한다. 융합 단백질 도메인을 연결하기 위한 임의의 방법 (예를 들어, 매우 가요성 형태의 링커 (GGGS)n, (GGGGS)n, 및 (G)n으로부터 보다 강성 형태의 링커 (EAAAK)n, (SGGS)n, SGSETPGTSESATPES (참조: 예를 들어, Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82; 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨) 및 (XP)n의 범위)을 사용하여 핵염기 편집기에 대한 활성을 위한 최적의 길이를 성취할 수 있다. 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다. 일부 구현예에서, 링커는 (GGS)n 모티프를 포함하고, 여기서, n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질의 Cas9 도메인은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES를 포함하는 링커를 통해 융합된다.
일부 구현예에서, 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 15-100개 뉴클레오타이드 길이이고 표적 서열에 상보적인 적어도 10개 인접 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 표적 서열과 상보적인 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 인접 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 DNA 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세균, 효모, 진균류, 곤충, 식물 또는 동물의 게놈에서의 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 인간의 게놈에서의 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 카노니칼 PAM 서열 (NGG)에 바로 인접해 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 비-카노니칼 PAM 서열 (예를 들어, 표 2 또는 5'-NAA-3'에 열거된 서열)에 바로 인접해 있다. 일부 구현예에서, 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 관심 대상의 유전자 (예를 들어, 질환 또는 장애와 연관된 유전자)에서 서열에 상보적이다.
본원 개시내용의 일부 양상은 본원에 제공된 융합 단백질 또는 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원 개시내용의 일부 양상은 DNA 분자를 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 및 적어도 하나의 가이드 RNA와 접촉시킴을 포함하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 가이드 RNA는 약 15-100개 뉴클레오타이드 길이이고 표적 서열과 상보적인 적어도 10개 인접 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 AGC, GAG, TTT, GTG, 또는 CAA 서열에 바로 인접해 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 NGA, NGCG, NGN, NNGRRT, NNNRRT, NGCG, NGCN, NGTN, NGTN, NGTN, 또는 5' (TTTV) 서열에 바로 인접해 있다.
각각의 서열에서 특정 위치 또는 잔기의 넘버링은 사용되는 특정 단백질 및 넘버링 기획에 의존하는 것으로 이해될 것이다. 넘버링은 예를 들어, 성숙한 단백질의 전구체 및 성숙한 단백질 자체에서 상이할 수 있고 종에 따른 서열에서의 차이는 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 임의의 상동성 단백질에서 및 각각의 암호화 핵산에서의 각각의 잔기를 동정할 수 있을 것이다.
본원에 개시된 바와 같이 임의의 융합 단백질을 표적 부위, 예를 들어, 편집될 돌연변이를 포함하는 부위에 표적화하기 위해, 가이드 RNA와 함께 융합 단백질을 전형적으로 동시 발현시킬 필요가 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이, 가이드 RNA는 전형적으로 Cas9 결합을 가능하게 하는 tracrRNA 프레임워크, 및 Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질에 서열 특이성을 부여하는 가이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 가이드 RNA 및 tracrRNA는 2개의 핵산 분자로서 별도로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 상기 가이드 서열이 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 구조를 포함한다. 가이드 서열은 전형적으로 20개 뉴클레오타이드 길이다. Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특이적 게놈 표적 부위에 표적화하기 위해 적합한 가이드 RNA의 서열은 본원의 개시내용을 토대로 당업자에게 자명할 것이다. 상기 적합한 가이드 RNA 서열은 전형적으로 편집될 표적 뉴클레오타이드의 업스트림 또는 다운스트림 50개 뉴클레오타이드 내의 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 임의의 제공된 융합 단백질을 특이적 표적 서열에 표적화하기 위해 적합한 일부 예시적인 가이드 RNA 서열은 본원에 제공된다.
가이드 RNA와의 Cas12 복합체
본원 개시내용의 일부 양상은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 및 가이드 RNA (예를 들어, 편집을 위해 표적 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 가이드)를 포함하는 복합체를 제공한다.
일부 구현예에서, 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 15-100개 뉴클레오타이드 길이이고 표적 서열에 상보적인 적어도 10개 인접 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 표적 서열과 상보적인 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 인접 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 DNA 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세균, 효모, 진균류, 곤충, 식물 또는 동물의 게놈에서의 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 인간의 게놈에서의 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 카노니칼 PAM 서열에 바로 인접해 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 비-카노니칼 PAM 서열에 바로 인접해 있다.
본원 개시내용의 일부 양상은 본원에 제공된 융합 단백질 또는 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원 개시내용의 일부 양상은 DNA 분자를 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 및 적어도 하나의 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 가이드 RNA는 약 15-100개 뉴클레오타이드 길이이고 표적 서열과 상보적인 적어도 10개 인접 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 예를 들어, TTN, DTTN, GTTN, ATTN, ATTC, DTTNT, WTTN, HATY, TTTN, TTTV, TTTC, TG, RTR, 또는 YTN PAM 부위에 바로 인접해 있다.
각각의 서열에서 특정 위치 또는 잔기의 넘버링은 사용되는 특정 단백질 및 넘버링 기획에 의존하는 것으로 이해될 것이다. 넘버링은 예를 들어, 성숙한 단백질의 전구체 및 성숙한 단백질 자체에서 상이할 수 있고 종에 따른 서열에서의 차이는 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 임의의 상동성 단백질에서 및 각각의 암호화 핵산에서의 각각의 잔기를 동정할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 바와 같이 임의의 융합 단백질을 표적 부위, 예를 들어, 편집될 돌연변이를 포함하는 부위에 표적화하기 위해, 가이드 RNA와 함께 융합 단백질을 동시 발현시킬 필요가 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이, 가이드 RNA는 전형적으로 Cas12 결합을 가능하게 하는 tracrRNA 프레임워크, 및 Cas12:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질에 서열 특이성을 부여하는 가이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 가이드 RNA 및 tracrRNA는 2개의 핵산 분자로서 별도로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 상기 가이드 서열이 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 구조를 포함한다. 가이드 서열은 전형적으로 20개 뉴클레오타이드 길이이다. Cas12:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특이적 게놈 표적 부위에 표적화하기 위해 적합한 가이드 RNA의 서열은 본원의 개시내용을 토대로 당업자에게 자명할 것이다. 상기 적합한 가이드 RNA 서열은 전형적으로 편집될 표적 뉴클레오타이드의 업스트림 또는 다운스트림 50개 뉴클레오타이드 내의 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 임의의 제공된 융합 단백질을 특이적 표적 서열에 표적화하기 위해 적합한 일부 예시적인 가이드 RNA 서열은 본원에 제공된다.
본원에 개시된 염기 편집기의 도메인은 데아미나제 도메인이 Cas12 단백질에 내재화된 이상 임의의 순서로 정렬될 수 있다. 예를 들어, Cas12 도메인 및 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 염기 편집기의 비제한적인 예는 다음과 같이 정렬될 수 있다:
NH2-[Cas12 도메인]-링커1-[ABE8]-링커2-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-링커1-[ABE8]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[ABE8]-링커2-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[ABE8]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-링커1-[ABE8]-링커2-[Cas12 도메인]-[이노신 BER 저해제]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-링커1-[ABE8]-[Cas12 도메인]-[이노신 BER 저해제]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[ABE8]-링커2-[Cas12 도메인]-[이노신 BER 저해제]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[ABE8]-[Cas12 도메인]-[이노신 BER 저해제]-COOH;
NH2-[이노신 BER 저해제]-[Cas12 도메인]-링커1-[ABE8]-링커2-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[이노신 BER 저해제]-[Cas12 도메인]-링커1-[ABE8]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[이노신 BER 저해제]-[Cas12 도메인]-[ABE8]-링커2-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[이노신 BER 저해제]NH2-[Cas12 도메인]-[ABE8]-[Cas12 도메인]-COOH;
추가로, 일부 경우에, Gam 단백질은 염기 편집기의 N 말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, Gam 단백질은 염기 편집기의 C 말단에 융합될 수 있다. 박테리오파아지 Mu의 Gam 단백질은 이중 가닥 절단 (DSB)의 말단에 결합하고 이들을 분해로부터 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, DSB의 유리된 말단에 결합하는 Gam을 사용하여 염기 편집 공정 동안에 삽입-결실 형성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 174개-잔기 Gam 단백질은 염기 편집기의 N 말단에 융합된다. 문헌 (참조: Komor, A.C., et al. "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017))을 참조한다. 일부 경우에, 돌연변이 또는 돌연변이들은 야생형 도메인과 비교하여 염기 편집기 도메인의 길이를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산의 결실은 염기 편집기의 길이를 감소시킬 수 있다. 또 다른 경우에, 돌연변이 또는 돌연변이들은 야생형 도메인과 비교하여 도메인의 길이를 변화시키지 않는다. 예를 들어, 임의의 도메인에서 치환(들)은 염기 편집기의 길이를 변화시키지 않는다. 모든 도메인의 길이가 야생형 도메인과 동일한 상기 염기 편집기의 비제한적인 예는 다음을 포함할 수 있다.
NH2-[Cas12 도메인]-링커1-[APOBEC1]-링커2-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-링커1-[APOBEC1]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[APOBEC1]-링커2-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[APOBEC1]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-링커1-[APOBEC1]-링커2-[Cas12 도메인]-[UGI]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-링커1-[APOBEC1]-[Cas12 도메인]-[UGI]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[APOBEC1]-링커2-[Cas12 도메인]-[UGI]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[APOBEC1]-[Cas12 도메인]-[UGI]-COOH;
NH2-[UGI]-[Cas12 도메인]-링커1-[APOBEC1]-링커2-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[UGI]-[Cas12 도메인]-링커1-[APOBEC1]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[UGI]-[Cas12 도메인]-[APOBEC1]-링커2-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[UGI]-[Cas12 도메인]-[APOBEC1]-[Cas12 도메인]-COOH;
일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집 융합 단백질은 정확한 위치, 예를 들어, 표적 염기가 한정된 영역 (예를 들어, "탈아민화 윈도우") 내에 위치할 필요가 있다. 일부 경우에, 표적은 4-염기 영역 내에 있을 수 있다. 일부 경우에, 상기 한정된 표적 영역은 PAM의 대략적으로 15개 염기 업스트림에 있을 수 있다. 문헌 (참조: Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); and Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017), 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
한정된 표적 영역은 탈아민화 윈도우일 수 있다. 탈아민화 윈도우는 염기 편집기가 표적 뉴클레오타이드에 작용하여 탈아민화하는 한정된 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, 탈아민화 윈도우는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 염기 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 탈아민화 윈도우는 PAM의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 염기 업스트림에 있다.
본원 개시내용의 염기 편집기는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 편집을 촉진시키는, 임의의 도메인, 특성 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 편집기는 핵 국소화 서열 (NLS)을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 NLS는 데아미나제 도메인과 napDNAbp 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 NLS는 napDNAbp 도메인의 C-말단에 위치한다.
융합 단백질에 포함된 단백질 도메인은 이종 기능성 도메인일 수 있다. 융합 단백질에 포함될 수 있는 단백질 도메인의 비제한적인 예는 데아미나제 도메인 (예를 들어, 시티딘 데아미나제 및/또는 아데노신 데아미나제, 참조: PCT/US2019/044935, PCT/US2020/016288, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함됨), 우라실 글리코실라제 저해제 (UGI) 도메인, 에피토프 태그 및 수용체 유전자 서열을 포함한다. 단백질 도메인은 예를 들어, 하기의 활성 중 하나 이상을 갖는 이종 기능성 도메인일 수 있다: 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 유전자 사일런싱 활성, 염색질 변형 활성, 후성적 변형 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성, 및 핵산 결합 활성. 상기 이종 기능성 도메인은 표적 DNA와 연합된 표적 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤, DNA 결합 단백질 등)의 변형과 같은 기능 활성을 부여하여 예를 들어, 히스톤 메틸화, 히스톤 아세틸화, 히스톤 유비퀴틴화 등을 유도할 수 있다. 부여된 다른 기능 및/또는 활성은 트랜스포사제 활성, 인테그라제 활성, 리컴비나제 활성, 리가제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모일화 (SUMOylation) 활성, 탈수모일화 (deSUMOylation) 활성, 또는 상기 임의의 조합을 포함할 수 있다.
도메인은 에피토프 태그, 리포터 단백질, 기타 결합 도메인을 사용하여 검출되거나 표지될 수 있다. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가의 단백질 서열은 DNA 분자에 결합하거나 말토스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합, GAL4 DNA 결합 도메인 융합, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) BP16 단백질 융합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 세포 분자에 결합하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, BhCas12b 가이드 폴리뉴클레오타이드는 하기의 서열을 갖는다:
BhCas12b sgRNA 스캐폴드 (밑줄 친) + 20nt 내지 23nt 가이드 서열 (Nn으로 지칭됨)　　　
Figure pct00265
일부 구현예에서, BvCas12b 및 AaCas12b 가이드 폴리뉴클레오타이드는 하기의 서열을 갖는다:
BvCas12b sgRNA 스캐폴드 (밑줄 친) + 20nt 내지 23nt 가이드 서열 (Nn으로 지칭됨)
Figure pct00266
AaCas12b sgRNA 스캐폴드 (밑줄 친) + 20nt 내지 23nt 가이드 서열 (Nn으로 지칭됨)
Figure pct00267
아데노신 데아미나제 변이체 및 Cas9 도메인을 포함하는 융합 단백질을 사용하는 방법
본원 개시내용의 일부 양상은 본원에 제공된 융합 단백질 또는 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원 개시내용의 일부 양상은 돌연변이 형태의 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 및 적어도 하나의 가이드 RNA와 접촉시킴을 포함하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 가이드 RNA는 약 15-100개 뉴클레오타이드 길이이고 표적 서열과 상보적인 적어도 10개 인접 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 카노니칼 PAM 서열 (NGG)에 바로 인접해 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 카노니칼 PAM 서열 (NGG)에 바로 인접해 있지 않다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 AGC, GAG, TTT, GTG, 또는 CAA 서열에 바로 인접해 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단은 NGA, NGCG, NGN, NNGRRT, NNNRRT, NGCG, NGCN, NGTN, NGTN, NGTN, 또는 5' (TTTV) 서열에 바로 인접해 있다.
각각의 서열에서 특정 위치 또는 잔기의 넘버링은 사용되는 특정 단백질 및 넘버링 기획에 의존하는 것으로 이해될 것이다. 넘버링은 예를 들어, 성숙한 단백질의 전구체 및 성숙한 단백질 자체에서 상이할 수 있고 종에 따른 서열에서의 차이는 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 임의의 상동성 단백질에서 및 각각의 암호화 핵산에서의 각각의 잔기를 동정할 수 있을 것이다.
본원에 개시된 바와 같이 Cas9 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 (예를 들어, ABE8)를 포함하는 임의의 융합 단백질을 표적 부위, 예를 들어, 편집될 돌연변이를 포함하는 부위에 표적화하기 위해, 가이드 RNA, 예를 들어, sgRNA와 함께 융합 단백질을 전형적으로 동시 발현시킬 필요가 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이, 가이드 RNA는 전형적으로 Cas9 결합을 가능하게 하는 tracrRNA 프레임워크, 및 Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질에 서열 특이성을 부여하는 가이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 가이드 RNA 및 tracrRNA는 2개의 핵산 분자로서 별도로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 상기 가이드 서열이 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 구조를 포함한다. 가이드 서열은 전형적으로 20개 뉴클레오타이드 길이다. Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특이적 게놈 표적 부위에 표적화하기 위해 적합한 가이드 RNA의 서열은 본원의 개시내용을 토대로 당업자에게 자명할 것이다. 상기 적합한 가이드 RNA 서열은 전형적으로 편집될 표적 뉴클레오타이드의 업스트림 또는 다운스트림 50개 뉴클레오타이드 내의 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 임의의 제공된 융합 단백질을 특이적 표적 서열에 표적화하기 위해 적합한 일부 예시적인 가이드 RNA 서열은 본원에 제공된다.
염기 편집기 효율
CRISPR-Cas9 뉴클레아제는 표적화된 게놈 편집을 매개하기 위해 광범위하게 사용되었다. 대부분의 게놈 편집 적용에서, Cas9는 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 단일 가이드 RNA (sgRNA))와의 복합체를 형성하고, sgRNA 서열에 의해 특정된 표적 부위에서 이중 가닥 DNA 절단 (DSB)을 유도한다. 세포는 주로 비-상동성 말단-연결 (NHEJ) 복구 경로를 통해 상기 DSB에 반응하여 유전자를 붕괴시키는 프레임쉬프트 돌연변이를 유발할 수 있는 확률적 삽입 또는 결실 (삽입-결실)을 초래한다. DSB를 플랭킹하는 서열과 고도의 상동성을 갖는 공여자 DNA 주형의 존재하에, 유전자 보정은 상동성 지시된 복구 (HDR)로서 공지된 대안 경로를 통해 성취될 수 있다. 불행하게도, 대부분의 비-섭동 (non-perturbative) 조건하에서, HDR은 세포 상태 및 세포 유형에 의존하여 비효율적이고, 보다 큰 삽입-결실의 빈도에 의해 지배된다. 인간 질환과 연관된 공지된 유전학적 변화의 대부분이 점 돌연변이임으로, 보다 효율적이고 명확하게 정확한 점 돌연변이를 제조할 수 있는 방법이 요구된다. 본원에 제공된 바와 같은 염기 편집 시스템은 이중 가닥 DNA 절단을 생성하지 않고 공여자 DNA 주형을 요구하지 않고 과도한 확률적 삽입 및 결실을 유도하지 않으면서 게놈 편집을 제공하는 새로운 방법을 제공한다.
본원 개시내용의 융합 단백질은 유의적 비율의 삽입-결실을 생성하는 것 없이 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화하는 특정 뉴클레오타이드 염기를 유리하게 변형시킨다. 본원에 사용된 바와 같은 "삽입-결실"은 핵산 내 뉴클레오타이드 염기의 삽입 또는 결실을 언급한다. 상기 삽입 또는 결실은 유전자의 암호화 영역 내 프레임 전환 돌연변이를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 내 대다수의 삽입 또는 결실 (예를 들어, 삽입-결실)을 생성시키지 않고 핵산 내 특정 뉴클레오타이드를 효율적으로 변형시키는 (예를 들어, 돌연변이시키는) 염기 편집기를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 삽입-결실에 비해 보다 큰 비율의 의도된 변형 (예를 들어, 돌연변이)을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 또는 0.01% 미만의 삽입-결실 형성을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 또는 0.01% 미만의 삽입-결실 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 0.8% 미만의 삽입-결실 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 최대 0.8%의 삽입-결실 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 0.3% 미만의 삽입-결실 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 보다 낮은 삽입-결실 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 보다 낮은 삽입-결실 형성을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 삽입-결실 빈도를 감소시켰다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 삽입-결실 빈도를 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소시켰다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템은 ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 삽입-결실 빈도를 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소시켰다.
본원 개시내용은 증가된 효율 및 특이성을 갖는 아데노신 데아미나제 변이체 (예를 들어, ABE8 변이체)를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 아데노신 데아미나제 변이체는 폴리뉴클레오타이드 내 목적하는 염기를 편집할 가능성이 높고 변경시키고자 하지 않은 염기 (예를 들어, "방관자")를 편집할 가능성이 적다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 방관자 편집 또는 돌연변이를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 의도되지 않은 편집 또는 돌연변이는 표적 뉴클레오타이드 서열의 표적 윈도우에서 의도되지 않거나 비-표적 위치에서 방관자 돌연변이 또는 방관자 편집, 예를 들어, 표적 염기의 염기 편집 (예를 들어, A 또는 C)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 방관자 편집 또는 돌연변이를 감소시켰다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 방관자 편집 또는 돌연변이를 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 또는 적어도 99% 감소시켰다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 방관자 편집 또는 돌연변이를 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 또는 적어도 3.0배 감소시켰다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 스퓨리어스 편집을 감소시켰다. 일부 구현예에서, 의도되지 않은 편집 또는 돌연변이는 게놈의 의도되지 않거나 비-표적 영역에서 스퓨리어스 돌연변이 또는 스퓨리어스 편집, 예를 들어, 표적 염기 (예를 들어, A 또는 C)의 비-특이적 편집 또는 가이드 독립적 편집이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 스퓨리어스 편집을 감소시켰다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 스퓨리어스 편집을 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 또는 적어도 99% 감소시켰다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 스퓨리어스 편집을 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 또는 적어도 3.0배 감소시켰다.
본원 개시내용의 일부 양상은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기가 상당한 수의 비의도된 돌연변이, 예를 들어, 비의도된 점 돌연변이 (즉, 방관자의 돌연변이)를 생성하지 않고 핵산 (예를 들어, 대상체의 게놈 내 핵산)에서 의도된 돌연변이, 예를 들어, 점 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 적어도 0.01%의 의도된 돌연변이 (즉, 적어도 0.01% 염기 편집 효율)를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 적어도 0.01%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 의도된 돌연변이를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 염기 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 세포 집단에서 편집된 핵염기의 백분율을 계산하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 세포 집단에서 편집된 핵염기에 의한 측정시 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 염기 편집 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기와 비교하여 보다 높은 염기 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 더 높은 염기 편집 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3.0배, 적어도 3.1배, 적어도 3.2, 적어도 3.3배, 적어도 3.4배, 적어도 3.5배, 적어도 3.6배, 적어도 3.7배, 적어도 3.8배, 적어도 3.9배, 적어도 4.0배, 적어도 4.1배, 적어도 4.2배, 적어도 4.3배, 적어도 4.4배, 적어도 4.5배, 적어도 4.6배, 적어도 4.7배, 적어도 4.8배, 적어도 4.9배 또는 적어도 5.0배 더 높은 염기 편집 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 표적-적중 염기 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 세포 집단에서 편집된 표적 핵염기에 의한 측정시 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 표적-적중 염기 편집 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기와 비교하여 보다 높은 표적-적중 염기 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 더 높은 표적-적중 염기 편집 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3.0배, 적어도 3.1배, 적어도 3.2, 적어도 3.3배, 적어도 3.4배, 적어도 3.5배, 적어도 3.6배, 적어도 3.7배, 적어도 3.8배, 적어도 3.9배, 적어도 4.0배, 적어도 4.1배, 적어도 4.2배, 적어도 4.3배, 적어도 4.4배, 적어도 4.5배, 적어도 4.6배, 적어도 4.7배, 적어도 4.8배, 적어도 4.9배 또는 적어도 5.0배 더 높은 표적-적중 염기 편집 효율을 갖는다.
본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드, 벡터, LNP 복합체 또는 mRNA를 통해 숙주 세포에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 mRNA로서 숙주 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 기반 전달 시스템, 예를 들어, mRNA를 통해 전달된 ABE8 염기 편집기는 편집된 핵염기에 의한 측정시 적어도, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 표적-적중 염기 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 시스템에 의해 전달되는 ABE8 염기 편집기는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달되는 ABE8 염기 편집기와 비교하여 보다 높은 염기 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터에 의해 전달되는 경우와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달되는 경우 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500%의 표적-적중 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달되는 경우와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달되는 경우 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3.0배, 적어도 3.1배, 적어도 3.2, 적어도 3.3배, 적어도 3.4배, 적어도 3.5배, 적어도 3.6배, 적어도 3.7배, 적어도 3.8배, 적어도 3.9배, 적어도 4.0배, 적어도 4.1배, 적어도 4.2배, 적어도 4.3배, 적어도 4.4배, 적어도 4.5배, 적어도 4.6배, 적어도 4.7배, 적어도 4.8배, 적어도 4.9배 또는 적어도 5.0배 더 높은 표적-적중 염기 편집 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 또는 0.01% 미만의 표적-이탈 편집을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달되는 경우와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달되는 경우, 보다 낮은 가이드된 표적-이탈 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달되는 경우와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달되는 경우, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 낮은 가이드된 표적-이탈 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달되는 경우와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달되는 경우 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 또는 적어도 3.0배 더 낮은 가이드된 표적-이탈 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달되는 경우와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달되는 경우, 가이드 표적-이탈 편집 효율을 적어도 약 2.2배 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달되는 경우와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달되는 경우 보다 낮은 가이드 독립적 표적-이탈 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달되는 경우와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달되는 경우, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 낮은 가이드-독립적 표적-이탈 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달되는 경우와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달되는 경우 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3.0배, 적어도 5.0배, 적어도 10.0배, 적어도 20.0배, 적어도 50.0배, 적어도 70.0배, 적어도 100.0배, 적어도 120.0배, 적어도 130.0배, 또는 적어도 150.0배 더 낮은 가이드-독립적 표적-이탈 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달되는 경우와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달되는 경우 가이드-독립적 표적-이탈 편집 효율 (예를 들어, 스퓨리어스 RNA 탈아민화)을 134.0배 감소시켰다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체는 게놈 전반에 걸쳐 가이드-독립적 돌연변이율을 증가시키지 않는다.
본원 개시내용의 일부 양상은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기가 상당한 수의 비의도된 돌연변이 (예를 들어, 스퓨리어스 표적-이탈 편집 또는 방관자 편집)를 생성하지 않고 핵산 (예를 들어, 대상체의 게놈 내 핵산)에서 의도된 돌연변이, 예를 들어, 점 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있다는 인지를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 표적 유전자 내 돌연변이를 변경하거나 보정하도록 특이적으로 디자인된, gRNA에 결합하는 특이적 염기 편집기에 의해 생성되는 돌연변이이다. 본원 개시내용의 일부 양상은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기가 상당한 수의 비의도된 돌연변이를 생성하지 않고 핵산 (예를 들어, 대상체의 게놈 내 핵산)에서 의도된 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있다는 인지를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 의도된 돌연변이를 변경하거나 보정하도록 특이적으로 디자인된, gRNA에 결합하는 특이적 염기 편집기에 의해 생성되는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 정지 코돈, 예를 들어, 유전자의 암호화 영역 내 미성숙한 정지 코돈을 생성하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 정지 코돈을 제거하는 돌연변이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 스플라이싱을 변경하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 조절 서열 (예를 들어, 유전자 프로모터 또는 유전자 리프레서)을 변경하는 돌연변이이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 1:1 초과인 의도된 돌연변이 대 삽입-결실 (즉, 비의도된 돌연변이)의 비율을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 2.5:1, 적어도 3:1, 적어도 3.5:1, 적어도 4:1, 적어도 4.5:1, 적어도 5:1, 적어도 5.5:1, 적어도 6:1, 적어도 6.5:1, 적어도 7:1, 적어도 7.5:1, 적어도 8:1, 적어도 10:1, 적어도 12:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 40:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 200:1, 적어도 300:1, 적어도 400:1, 적어도 500:1, 적어도 600:1, 적어도 700:1, 적어도 800:1, 적어도 900:1, 또는 적어도 1000:1 이상인 의도된 돌연변이 대 삽입-결실의 비율을 생성시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기의 특징은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 또는 융합 단백질을 사용하는 방법에 적용될 수 있는 것으로 인지되어야 한다.
의도된 돌연변이 및 삽입-결실의 수는 예를 들어, 문헌 (참조: 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381 (WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344 (WO2017/070632); Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., et al., "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., et al., "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017), 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 삽입-결실 빈도를 계산하기 위해, 서열분석 판독은 삽입-결실이 발생할 수 있는 윈도우의 양 측면을 플랭킹하는 2개의 10-bp 서열과의 정확한 매칭에 대해 스캐닝한다. 정확한 매칭이 위치하지 않는 경우, 판독은 분석으로부터 배제된다. 상기 삽입-결실 윈도우의 길이가 정확하게 참조 서열과 매칭하는 경우, 상기 판독은 삽입-결실을 함유하지 않는 것으로서 분류된다. 삽입-결실 윈도우가 참조 서열 보다 2개 이상의 염기로 길거나 짧은 경우, 서열 분석 판독은 각각 삽입 또는 결실로서 분류된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 핵산 영역 내 삽입-결실의 형성을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 영역은 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오타이드에 있거나 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오타이드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오타이드 내 영역에 있다.
표적 뉴클레오타이드 영역에서 형성되는 삽입-결실의 수는 핵산 (예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)이 염기 편집기에 노출되는 시간의 양에 따를 수 있다. 일부 구현예에서, 삽입-결실의 수 또는 비율은 표적 뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)을 염기 편집기에 노출시키는 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 10일, 또는 적어도 14일 후 결정된다. 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기의 특징은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 또는 융합 단백질을 사용하는 방법에 적용될 수 있는 것으로 인지되어야 한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 핵산 영역 내 삽입-결실의 형성을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 영역은 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오타이드에 있거나 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오타이드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오타이드 내 영역에 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 핵산 영역에서 삽입-결실의 형성을 1% 미만, 1.5% 미만, 2% 미만, 2.5% 미만, 3% 미만, 3.5% 미만, 4% 미만, 4.5% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 또는 20% 미만으로 제한할 수 있다. 핵산 영역에서 형성되는 삽입-결실의 수는 핵산 (예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)이 염기 편집기에 노출되는 시간의 양에 따를 수 있다. 일부 구현예에서, 삽입-결실의 임의의 수 또는 비율은 핵산 (예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)을 염기 편집기에 노출시키는 적어도 1 시간, 적어도 2시간, 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 10일, 또는 적어도 14일 후 결정된다.
멀티플렉스 편집
일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 유전자에서 다수의 핵염기 쌍의 멀티플렉스 편집을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 다수의 핵염기 쌍은 동일한 유전자에 위치한다. 일부 구현예에서, 다수의 핵염기 쌍은 하나 이상의 유전자에 위치하고, 여기서, 적어도 하나의 유전자는 상이한 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 단일 가이드 폴리뉴클레오타이드와 함께 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 다수의 가이드 폴리뉴클레오타이드와 함께 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 단일 염기 편집기 시스템과 함께 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로의 표적 결합을 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로의 표적 결합을 위해 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로의 표적 결합을 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오타이드와 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로의 표적 결합을 위해 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 염기 편집기를 사용한 멀티플렉스 편집의 특징은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용한 방법의 임의의 조합에 적용될 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 염기 편집기를 사용한 멀티플렉스 편집은 다수의 핵염기 쌍의 순차적 편집을 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다.
일부 구현예에서, 다수의 핵염기 쌍은 하나 이상의 유전자에 위치한다. 일부 구현예에서, 다수의 핵염기 쌍은 동일한 유전자에 위치한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자에서 적어도 하나의 유전자는 상이한 유전자좌에 위치한다.
일부 구현예에서, 편집은 적어도 하나의 단백질 암호화 영역에서 다수의 핵염기 쌍의 편집이다. 일부 구현예에서, 편집은 적어도 하나의 단백질 비-암호화 영역에서 다수의 핵염기 쌍의 편집이다. 일부 구현예에서, 편집은 적어도 하나의 단백질 암호화 영역 및 적어도 하나의 단백질 비-암호화 영역에서 다수의 핵염기 쌍의 편집이다.
일부 구현예에서, 상기 편집은 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드와 연계한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 단일 가이드 폴리뉴클레오타이드와 함께 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 다수의 가이드 폴리뉴클레오타이드와 함께 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 편집은 단일 염기 편집기 시스템과 함께 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드와 연계한다. 일부 구현예에서, 편집은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로의 표적 결합을 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오타이드와 연계한다. 일부 구현예에서, 편집은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로의 표적 결합을 위해 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오타이드와 연계한다. 일부 구현예에서, 편집은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로의 표적 결합을 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오타이드와 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로의 표적 결합을 위해 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오타이드의 혼합물과 연계한다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 염기 편집기를 사용한 멀티플렉스 편집의 특징은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용한 방법의 임의의 조합에 적용될 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 또한 편집은 다수의 핵염기 쌍의 순차적 편집을 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자에서 다수의 핵염기 쌍의 멀티플렉스 편집을 수행할 수 있는 염기 편집기 시스템은 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자에서 다수의 핵염기 쌍의 멀티플렉스 편집을 수행할 수 있는 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집을 수행할 수 있는 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집을 수행할 수 있는 염기 편집기 시스템과 비교하여 보다 높은 멀티플렉스 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집을 수행할 수 있는 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집을 수행할 수 있는 염기 편집기 시스템과 비교하여 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 더 높은 멀티플렉스 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집을 수행할 수 있는 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집을 수행할 수 있는 염기 편집기 시스템과 비교하여 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3.0배, 적어도 3.1배, 적어도 3.2, 적어도 3.3배, 적어도 3.4배, 적어도 3.5배, 적어도 4.0배, 적어도 4.5배, 적어도 5.0배, 적어도 5.5배, 또는 적어도 6.0배 더 높은 멀티플렉스 편집 효율을 갖는다.
내부 삽입물을 갖는 융합 단백질
본원에서는 핵산 프로그래밍 가능한 핵산 결합 단백질, 예를 들어, napDNAbp에 융합된 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 이종성 폴리펩타이드는 본래의 또는 야생형 napDNAbp 폴리펩타이드 서열에서 발견되지 않는 폴리펩타이드일 수 있다. 이종성 폴리펩타이드는 napDNAbp의 C-말단에, napDNAbp의 N-말단에서 napDNAbp에 융합될 수 있거나, napDNAbp의 내부 위치에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩타이드는 napDNAbp의 내부 위치에 삽입된다.
일부 구현예에서, 이종성 폴리펩타이드는 데아미나제 또는 이의 기능성 단편이다. 예를 들어, 융합 단백질은 Cas9 또는 Cas12 (예를 들어, Cas12b/C2c1), 폴리펩타이드의 N-말단 단편 및 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 데아미나제를 포함할 수 있다. 융합 단백질 내 데아미나제는 아데노신 데아미나제일 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA (예를 들어, TadA7.10 또는 TadA*8)이다. 일부 구현예에서, TadA는 TadA*8이다. 본원에 기재된 바와 같은 TadA 서열 (예를 들어, TadA7.10 또는 TadA*8)은 상기된 융합 단백질을 위해 적합한 데아미나제이다.
데아미나제는 환형 퍼뮤턴트 데아미나제일 수 있다. 예를 들어, 데아미나제는 환형 퍼뮤턴트 아데노신 데아미나제일 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 TadA 참조 서열에 넘버링된 바와 같이 아미노산 잔기 116에서 환형으로 퍼뮤턴트화된 환형 퍼뮤턴트 TadA이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 TadA 참조 서열에 넘버링된 바와 같이 아미노산 잔기 136에서 환형으로 치환된 환형 퍼뮤턴트 TadA이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 TadA 참조 서열에 넘버링된 바와 같이 아미노산 잔기 65에서 환형으로 치환된 환형 퍼뮤턴트 TadA이다.
융합 단백질은 하나 초과의 데아미나제를 포함할 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나의 데아미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 2개의 데아미나제를 포함한다. 융합 단백질에서 2개 이상의 데아미나제는 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 2개 이상의 데아미나제는 동종이량체일 수 있다. 2개 이상의 데아미나제는 이종이량체일 수 있다. 2개 이상의 데아미나제는 napDNAbp에 탠덤으로 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 데아미나제는 napDNAbp에 탠덤으로 있을 수 없다.
일부 구현예에서, 융합 단백질 내 napDNAbp는 Cas9 폴리펩타이드 또는 이의 단편이다. Cas9 폴리펩타이드는 변이체 Cas9 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 Cas9 닉카제 (nCas9) 폴리펩타이드 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 뉴클레아제 데드 Cas9 (dCas9) 폴리펩타이드 또는 이의 단편이다. 융합 단백질 내 Cas9 폴리펩타이드는 전장 Cas9 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 경우에, 융합 단백질 내 Cas9 폴리펩타이드는 전장 Cas9 폴리펩타이드일 수 없다. Cas9 폴리펩타이드는 예를 들어, 천연적으로 발생하는 Cas9 단백질에 상대적으로 N-말단 또는 C-말단에서 절단될 수 있다. Cas9 폴리펩타이드는 환형으로 퍼뮤턴트화된 Cas9 단백질일 수 있다. Cas9 폴리펩타이드는 표적 폴리뉴클레오타이드 및 가이드 핵산 서열에 여전히 결합할 수 있는, Cas9 폴리펩타이드의 단편, 일부 또는 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) Cas9 (SpCas9), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) Cas9 (SaCas9), 스트렙토코커스 써모필러스 1 (Streptococcus thermophilus 1) Cas9 (St1Cas9), 또는 이의 단편 또는 변이체이다.
융합 단백질의 Cas9 폴리펩타이드는 천연적으로 발생하는 Cas9 폴리펩타이드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
융합 단백질의 Cas9 폴리펩타이드는 하기에 제시된 Cas9 아미노산 서열 (하기에서 "Cas9 참조 서열"로 호칭됨)과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
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Cas9 폴리펩티드의 N- 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 이종성 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질은 또한 본원에 기재된 방법에서 염기 편집에 유용하다. Cas9 및 하나 이상의 데아미나제 도메인, 예를 들어, 아데노신 데아미나제를 포함하거나, Cas9 서열에 의해 플랭킹된 아데노신 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질은 또한 표적 서열의 고도로 특이적이고 효율적인 염기 편집에 유용하다. 하나의 구현예에서, 키메라 Cas9 융합 단백질은 Cas9 폴리펩티드 내에 삽입된 이종성 촉매 도메인 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 내에 삽입된 아데노신 데아미나제 도메인 및 시티딘 데아미나제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 Cas9 내에서 융합되고 시티딘 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 Cas9 내에 융합되고 시티딘 데아미나제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 Cas9 내에서 융합되고 아데노신 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 Cas9 내에 융합되고 아데노신 데아미나제는 N-말단에 융합된다.
아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제 및 Cas9와의 융합 단백질의 예시적인 구조는 다음과 같이 제공된다:
NH2-[Cas9(아데노신 데아미나제)]-[시티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9(아데노신 데아미나제)]-COOH;
NH2-[Cas9(시티딘 데아미나제)]-[아데노신 데아미나제]-COOH; 또는
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas9(시티딘 데아미나제)]-COOH.
일부 구현예에서, 상기 일반 구조에서 사용된 "-"는 임의의 링커의 존재를 지적한다.
다양한 구현예에서, 촉매 도메인은 아데노신 데아미나제 활성과 같은 DNA 변형 활성 (예를 들어, 데아미나제 활성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA (예를 들어, TadA7.10)이다. 일부 구현예에서, TadA는 TadA*8이다. 일부 구현예에서, TadA*8은 Cas9 내에서 융합되고 시티딘 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, TadA*8은 Cas9 내에 융합되고 시티딘 데아미나제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 Cas9 내에서 융합되고 TadA*8은 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 Cas9 내에 융합되고 adA*8은 N-말단에 융합된다. TadA*8 및 시티딘 데아미나제 및 Cas9와의 융합 단백질의 예시적인 구조는 다음과 같이 제공된다:
NH2-[Cas9(TadA*8)]-[시티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9(TadA*8)]-COOH;
NH2-[Cas9(시티딘 데아미나제)]-[TadA*8]-COOH; 또는
NH2-[TadA*8]-[Cas9(시티딘 데아미나제)]-COOH.
일부 구현예에서, 상기 일반 구조에서 사용된 "-"는 임의의 링커의 존재를 지적한다.
이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 데아미나제)는 적합한 위치에서 napDNAbp (예를 들어, Cas9 또는 Cas12 (예를 들어, Cas12b/C2c1))에 삽입될 수 있어서, 상기 napDNAbp는 표적 폴리뉴클레오타이드 및 가이드 핵산에 결합하는 이의 능력을 보유한다. 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 데아미나제의 기능 (예를 들어, 염기 편집 활성) 또는 napDNAbp의 기능 (예를 들어, 표적 핵산 및 가이드 핵산에 결합하는 능력)을 손상시키지 않고 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 예를 들어 무질서 영역 또는 결정학적 연구에 의해 나타난 바와 같이 고온 인자 또는 B-인자를 포함하는 영역에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 덜 정렬되거나, 무질서하거나, 구조화되지 않은 단백질 영역, 예를 들어 용매 노출 영역 및 루프는 구조 또는 기능을 손상시키지 않고 삽입을 위해 사용될 수 있다. 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 가요성 루프 영역 또는 용매-노출된 영역에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 Cas9 또는 Cas12b/C2c1 폴리펩타이드의 가요성 루프에 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)의 삽입 위치는 Cas9 폴리펩타이드의 결정 구조의 B-인자 분석에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 평균 초과의 B-인자 (예를 들어, 무질서 영역을 포함하는 총 단백질 또는 단백질 도메인과 비교하여 보다 높은 B 인자)를 포함하는 Cas9 폴리펩타이드의 영역에 삽입된다. B-인자 또는 온도 인자는 이들의 평균 위치로부터의 원자의 변동 (예를 들어, 결정 격자에서 온도 의존성 원자 진동 또는 정체 무질서의 결과로서)을 지적할 수 있다. 골격 원자에 대한 높은 B-인자 (예를 들어, 평균 초과의 B-인자)는 상대적으로 높은 국소적 이동을 갖는 영역을 지적할 수 있다. 상기 영역은 구조 또는 기능을 손상시키지 않고 데아미나제를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 총 단백질에 대해 평균 B-인자 보다 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 또는 200% 초과인 B-인자와 함께 Cα 원자를 갖는 잔기를 갖는 위치에 삽입될 수 있다. 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 잔기를 포함하는 Cas9 단백질 도메인에 대한 평균 B-인자 보다 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 또는 200% 초과인 B-인자와 함께 Cα 원자를 갖는 잔기를 갖는 위치에 삽입될 수 있다. 평균 초과의 B-인자를 포함하는 Cas9 폴리펩타이드 위치는 예를 들어, 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같이 잔기 768, 792, 1052, 1015, 1022, 1026, 1029, 1067, 1040, 1054, 1068, 1246, 1247, 및 1248을 포함할 수 있다. 평균 초과의 B-인자를 포함하는 Cas9 폴리펩타이드 영역은 예를 들어, 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같이 잔기 792-872, 792-906, 및 2-791을 포함할 수 있다.
이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 데아미나제)는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 768, 791, 792, 1015, 1016, 1022, 1023, 1026, 1029, 1040, 1052, 1054, 1067, 1068, 1069, 1246, 1247, 및 1248, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩타이드는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 768-769, 791-792, 792-793, 1015-1016, 1022-1023, 1026-1027, 1029-1030, 1040-1041, 1052-1053, 1054-1055, 1067-1068, 1068-1069, 1247-1248, 또는 1248-1249, 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩타이드는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 769-770, 792-793, 793-794, 1016-1017, 1023-1024, 1027-1028, 1030-1031, 1041-1042, 1053-1054, 1055-1056, 1068-1069, 1069-1070, 1248-1249, 또는 1249-1250, 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 대체한다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 768, 791, 792, 1015, 1016, 1022, 1023, 1026, 1029, 1040, 1052, 1054, 1067, 1068, 1069, 1246, 1247, 및 1248, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. 삽입 위치와 관련하여, 상기 Cas9 참조 서열에 대한 언급은 설명을 목적으로 하는 것으로 이해되어야만 한다. 본원에 논의된 바와 같은 삽입은 상기 Cas9 참조 서열의 Cas9 폴리펩타이드 서열로 제한되지 않지만, 변이체 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어, Cas9 닉카제 (nCas9), 뉴클레아제 데드 Cas9 (dCas9), 뉴클레아제 도메인이 부재인 Cas9 변이체, 절단된 Cas9, 또는 부분적 또는 완전한 HNH 도메인이 부재인 Cas9 도메인에서 상응하는 위치에 삽입을 포함한다.
이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 데아미나제)는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 768, 792, 1022, 1026, 1040, 1068, 및 1247. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩타이드는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 768-769, 792-793, 1022-1023, 1026-1027, 1029-1030, 1040-1041, 1068-1069, 또는 1247-1248, 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩타이드는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 769-770, 793-794, 1023-1024, 1027-1028, 1030-1031, 1041-1042, 1069-1070, 또는 1248-1249, 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체한다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 768, 792, 1022, 1026, 1040, 1068, 및 1247.
이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 데아미나제)는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 잔기에서 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 데아미나제)는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1002, 1003, 1025, 1052-1056, 1242-1247, 1061-1077, 943-947, 686-691, 569-578, 530-539, 및 1060-1077, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 잔기의 N-말단 또는 C-말단에 삽입될 수 있거나 상기 잔기를 대체한다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 잔기의 C-말단에 삽입된다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 (예를 들어, TadA)는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기에 삽입된다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 (예를 들어, TadA)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 잔기 792-872, 792-906, 또는 2-791의 위치, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기의 위치에 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산의 N-말단에 삽입된다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산의 C-말단에 삽입된다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 대체한다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기.
일부 구현예에서, CBE (예를 들어, APOBEC1)는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 삽입된다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1016, 1023, 1029, 1040, 1069, 및 1247, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. 일부 구현예에서, ABE는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산의 N-말단에서 삽입된다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1016, 1023, 1029, 1040, 1069, 및 1247, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. 일부 구현예에서, ABE는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산의 C-말단에서 삽입된다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1016, 1023, 1029, 1040, 1069, 및 1247, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. 일부 구현예에서, ABE는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 대체하기 위해 삽입된다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1016, 1023, 1029, 1040, 1069, 및 1247, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기.
일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기의 N-말단에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768의 C-말단에, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 791에 삽입되거나, 아미노산 잔기 792에 삽입되거나 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 791의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 792의 N-말단에 삽입되거나 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 791의 C-말단에, 또는 아미노산 792의 N-말단에 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 791을 대체하기 위해 삽입되거나 아미노산 792를 대체하기 위해 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기의 N-말단에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016의 C-말단에, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1023에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1023의 N-말단에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1023의 C-말단에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022를 대체하기 위해 삽입되거나, 아미노산 잔기 1023을 대체하기 위해 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1029에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1029의 N-말단에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1029의 C-말단에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026을 대체하기 위해 삽입되거나, 아미노산 잔기 1029를 대체하기 위해 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기의 N-말단에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040의 C-말단에, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1054에 삽입되거나 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1054의 N-말단에 삽입되거나 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1054의 C-말단에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052를 대체하기 위해 삽입되거나 아미노산 잔기 1054를 대체하기 위해 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1068에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1069에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1068의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1069의 N-말단에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1068의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1069의 C-말단에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067을 대체하기 위해 삽입되거나, 아미노산 잔기 1068을 대체하기 위해 삽입되거나, 아미노산 잔기 1069를 대체하기 위해 삽입되거나 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1246에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1247에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1248에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1246의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1247의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1248의 N-말단에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1246의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1247의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1248의 C-말단에 삽입되거나, 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1246을 대체하기 위해 삽입되거나 아미노산 잔기 1247을 대체하기 위해 삽입되거나, 아미노산 잔기 1248을 대체하기 위해 삽입되거나 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 데아미나제)는 Cas9 폴리펩타이드의 가요성 루프에 삽입된다. 가요성 루프 부분은 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같이 530-537, 569-570, 686-691, 943-947, 1002-1025, 1052-1077, 1232-1247, 또는 1298-1300, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 가요성 루프 부분은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1-529, 538-568, 580-685, 692-942, 948-1001, 1026-1051, 1078-1231, 또는 1248-1297, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기.
이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 아데닌 데아미나제)는 아미노산 잔기에 상응하는 Cas9 폴리펩타이드 영역에 삽입될 수 있다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1017-1069, 1242-1247, 1052-1056, 1060-1077, 1002-1003, 943-947, 530-537, 568-579, 686-691,1242-1247, 1298-1300, 1066-1077, 1052-1056, 또는 1060-1077, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기.
이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 아데닌 데아미나제)는 Cas9 폴리펩타이드의 결실 영역의 위치에 삽입될 수 있다. 결실 영역은 Cas9 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 부분에 상응할 수 있다. 일부 구현예에서, 결실 영역은 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 잔기 792-872, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 구현예에서, 결실 영역은 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 잔기 792-906, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 구현예에서, 결실 영역은 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 잔기 2-791, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 구현예에서, 결실 영역은 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 잔기 1017-1069, 또는 이의 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다.
예시적인 내부 융합 염기 편집기는 하기 표 10A에 제공된다:
[표 10A] Cas9 단백질에서 삽입 유전자좌
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이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 데아미나제)는 Cas9 폴리펩타이드의 구조적 또는 기능성 도메인 내 삽입될 수 있다. 이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 데아미나제)는 Cas9 폴리펩타이드의 2개의 구조적 또는 기능성 도메인 사이에 삽입될 수 있다. 이종성 폴리펩타이드 (예를 들어, 데아미나제)는 예를 들어, Cas9 폴리펩타이드로부터 도메인을 결실시킨 후 Cas9 폴리펩타이드의 구조적 또는 기능성 도메인의 위치에 삽입될 수 있다. Cas9 폴리펩타이드의 구조적 또는 기능성 도메인은 예를 들어, RuvC I, RuvC II, RuvC III, Rec1, Rec2, PI, 또는 HNH를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 도메인이 부재이다: RuvC I, RuvC II, RuvC III, Rec1, Rec2, PI, 또는 HNH 도메인. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 뉴클레아제 도메인이 부재이다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 HNH 도메인이 부재이다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 HNH 도메인 부분이 부재여서 Cas9 폴리펩타이드는 감소되거나 폐지된 HNH 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 뉴클레아제 도메인의 결실을 포함하고, 데아미나제는 뉴클레아제 도메인을 대체하기 위해 삽입된다. 일부 구현예에서, HNH 도메인은 결실되고 데아미나제는 이의 위치에 삽입된다. 일부 구현예에서, RuvC 도메인의 하나 이상은 결실되고 데아미나제는 이의 위치에 삽입된다.
이종성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 napDNAbp의 N-말단 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 폴리펩타이드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 데아미나제를 포함한다. N 말단 단편 또는 C 말단 단편은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있다. N-말단 단편의 C-말단 또는 C 말단 단편의 N-말단은 Cas9 폴리펩타이드의 가요성 루프의 일부를 포함할 수 있다. N-말단 단편의 C-말단 또는 C 말단 단편의 N-말단은 Cas9 폴리펩타이드의 알파-나선 구조의 일부를 포함할 수 있다. N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 RuvC 도메인을 포함할 수 있다. N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 HNH 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, N-말단 단편 및 C-말단 단편의 어느 것도 HNH 도메인을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, N-말단 Cas9 단편의 C-말단은 융합 단백질이 표적 핵염기를 탈아민화하는 경우, 표적 핵염기에 인접해 있는 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, C-말단 Cas9 단편의 N-말단은 융합 단백질이 표적 핵염기를 탈아민화하는 경우, 표적 핵염기에 인접해 있는 아미노산을 포함한다. 상이한 데아미나제의 삽입 위치는 표적 핵염기와, N 말단 Cas9 단편의 C-말단 또는 C 말단 Cas9 단편의 N-말단에서 아미노산 사이가 인접하도록 상이할 수 있다. 예를 들어, ABE의 삽입 위치는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기에 있을 수 있다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기.
융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편 (즉, 융합 단백질에서 데아미나제를 플랭킹하는 N-말단 Cas9 단편)은 Cas9 폴리펩타이드의 N-말단을 포함할 수 있다. 융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 1300개 아미노산 길이를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편은 하기의 아미노산 잔기에 상응하는 서열을 포함할 수 있다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1-56, 1-95, 1-200, 1-300, 1-400, 1-500, 1-600, 1-700, 1-718, 1-765, 1-780, 1-906, 1-918 또는 1-1100, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. N-말단 Cas9 단편은 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1-56, 1-95, 1-200, 1-300, 1-400, 1-500, 1-600, 1-700, 1-718, 1-765, 1-780, 1-906, 1-918 또는 1-1100, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
융합 단백질의 C-말단 Cas9 단편 (즉, 융합 단백질에서 데아미나제를 플랭킹하는 C-말단 Cas9 단편)은 Cas9 폴리펩타이드의 C-말단을 포함할 수 있다. 융합 단백질의 C-말단 Cas9 단편은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 1300개 아미노산 길이를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 C-말단 Cas9 단편은 하기의 아미노산 잔기에 상응하는 서열을 포함할 수 있다: 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 1099-1368, 918-1368, 906-1368, 780-1368, 765-1368, 718-1368, 94-1368, 또는 56-1368, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기. N-말단 Cas9 단편은 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1099-1368, 918-1368, 906-1368, 780-1368, 765-1368, 718-1368, 94-1368, 또는 56-1368, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩타이드 내 상응하는 아미노산 잔기와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
함께 취해진 N-말단 Cas9 단편 및 C-말단 Cas9 단편은 예를 들어, 상기 Cas9 참조 서열에 제시된 바와 같이 전장의 천연적으로 발생하는 Cas9 폴리펩타이드 서열에 상응할 수 없다.
본원에 기재된 융합 단백질은 비-표적 부위 (예를 들어, 표적-이탈 부위)에서 감소된 탈아민화와 함께 표적화된 탈아민화, 예를 들어, 감소된 게놈 와이드 스퓨리어스 탈아민화를 수행할 수 있다. 본원에 기재된 융합 단백질은 비-표적 부위에서 감소된 방관자 탈아민화와 함께 표적화된 탈아민화를 수행할 수 있다. 목적하지 않은 탈아민화 또는 표적-이탈 탈아민화는 예를 들어, Cas9 폴리펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 융합된 데아미나제를 포함하는 말단 융합 단백질과 비교하여 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%까지 감소될 수 있다. 목적하지 않은 탈아민화 또는 표적-이탈 탈아민화는 예를 들어, Cas9 폴리펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 융합된 데아미나제를 포함하는 말단 융합 단백질과 비교하여 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배까지 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)는 R-루프 범위 내 2개 이하의 핵염기를 탈아민화한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 데아미나제는 R-루프 범위 내 3개 이하의 핵염기를 탈아민화한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 데아미나제는 R-루프 범위 내 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 핵염기를 탈아민화한다. R-루프는 DNA:RNA 하이브리드, DNA:DNA 또는 RNA:RNA 상보성 구조 및 단일 가닥의 dNA와 연합된 구조를 포함하는 3개 가닥의 핵산 구조이다. 본원에 사용된 바와 같은 R-루프는 표적 폴리뉴클레오타이드가 CRISPR 복합체 또는 염기 편집 복합체와 접촉되는 경우 형성될 수 있고, 여기서, 가이드 폴리뉴클레오타이드의 일부, 예를 들어. 가이드 RNA는 표적 폴리뉴클레오타이드의 일부, 예를 들어, 표적 DNA와 하이브리드화하고 이로 대체된다. 일부 구현예에서, R-루프는 스페이서 서열 및 표적 DNA 상보성 서열의 하이브리드화된 영역을 포함한다. R-루프 영역은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 핵염기 쌍의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, R-루프 영역은 약 20 핵염기 쌍의 길이이다. 본원에 사용된 바와 같은 R-루프 영역은 가이드 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 표적 DNA 가닥에 제한되지 않는 것으로 이해되어야만 한다. 예를 들어, R-루프 영역 내 표적 핵염기의 편집은 가이드 RNA에 상보적인 가닥을 포함하는 DNA 가닥에 대한 것일 수 있거나, 가이드 RNA에 상보적인 가닥의 반대 가닥인 DNA 가닥에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, R-루프의 영역 내 편집은 표적 DNA 서열에서 가이드 RNA에 대한 비-상보적 가닥 (프로토스페이서 가닥) 상에 핵염기의 편집을 포함한다.
본원에 기재된 융합 단백질은 카노니칼 염기 편집과는 상이한 편집 윈도우에서 표적 탈아민화를 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열 내 PAM 서열의 약 1 내지 약 20개 염기 업스트림에 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열 내 PAM 서열의 약 2 내지 약 12개 염기 업스트림에 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열로부터 약 1 내지 9개 염기쌍, 약 2 내지 10개 염기쌍, 약 3 내지 11개 염기쌍, 약 4 내지 12개 염기쌍, 약 5 내지 13개 염기쌍, 약 6 내지 14개 염기쌍, 약 7 내지 15개 염기쌍, 약 8 내지 16개 염기쌍, 약 9 내지 17개 염기쌍, 약 10 내지 18개 염기쌍, 약 11 내지 19개 염기쌍, 약 12 내지 20개 염기쌍, 약 1 내지 7개 염기쌍, 약 2 내지 8개 염기쌍, 약 3 내지 9개 염기쌍, 약 4 내지 10개 염기쌍, 약 5 내지 11개 염기쌍, 약 6 내지 12개 염기쌍, 약 7 내지 13개 염기쌍, 약 8 내지 14개 염기쌍, 약 9 내지 15개 염기쌍, 약 10 내지 16개 염기쌍, 약 11 내지 17개 염기쌍, 약 12 내지 18개 염기쌍, 약 13 내지 19개 염기쌍, 약 14 내지 20개 염기쌍, 약 1 내지 5개 염기쌍, 약 2 내지 6개 염기쌍, 약 3 내지 7개 염기쌍, 약 4 내지 8개 염기쌍, 약 5 내지 9개 염기쌍, 약 6 내지 10개 염기쌍, 약 7 내지 11개 염기쌍, 약 8 내지 12개 염기쌍, 약 9 내지 13개 염기쌍, 약 10 내지 14개 염기쌍, 약 11 내지 15개 염기쌍, 약 12 내지 16개 염기쌍, 약 13 내지 17개 염기쌍, 약 14 내지 18개 염기쌍, 약 15 내지 19개 염기쌍, 약 16 내지 20개 염기쌍, 약 1 내지 3개 염기쌍, 약 2 내지 4개 염기쌍, 약 3 내지 5개 염기쌍, 약 4 내지 6개 염기쌍, 약 5 내지 7개 염기쌍, 약 6 내지 8개 염기쌍, 약 7 내지 9개 염기쌍, 약 8 내지 10개 염기쌍, 약 9 내지 11개 염기쌍, 약 10 내지 12개 염기쌍, 약 11 내지 13개 염기쌍, 약 12 내지 14개 염기쌍, 약 13 내지 15개 염기쌍, 약 14 내지 16개 염기쌍, 약 15 내지 17개 염기쌍, 약 16 내지 18개 염기쌍, 약 17 내지 19개 염기쌍, 약 18 내지 20개 염기쌍 떨어져 있거나 이의 업스트림에 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 염기쌍 떨어져 있거나 이의 업스트림에 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 염기쌍 업스트림에 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 약 2, 3, 4, 또는 6개 염기쌍 업스트림에 있다.
융합 단백질은 하나 초과의 이종성 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 하나 이상의 UGI 도메인 및/또는 하나 이상의 핵 국소화 신호를 추가로 포함할 수 있다. 2개 이상의 이종성 도메인은 탠덤으로 삽입될 수 있다. 2개 이상의 이종성 도메인은 이들이 탠덤으로 NapDNAbp에 있지 않도록 하는 위치에 삽입될 수 있다.
융합 단백질은 데아미나제와 napDNAbp 폴리펩타이드 사이에 링커를 포함할 수 있다. 링커는 펩타이드 또는 비-펩타이드 링커일 수 있다. 예를 들어, 링커는 XTEN, (GGGS)n, (GGGGS)n, (G)n, (EAAAK)n, (GGS)n, SGSETPGTSESATPES일 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단 Cas9 단편과 데아미나제 사이에 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 C-말단 Cas9 단편과 데아미나제 사이에 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp의 N-말단 및 C-말단 단편은 링커를 사용하여 데아미나제에 연결된다. 일부 구현예에서, N-말단 및 C-말단 단편은 링커 없이 데아미나제 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단 Cas9 단편과 데아미나제 사이에 링커를 포함하지만, C-말단 Cas9 단편과 데아미나제 사이에 링커를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 C-말단 Cas9 단편과 데아미나제 사이에 링커를 포함하지만, N-말단 Cas9 단편과 데아미나제 사이에 링커를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 융합 단백질 내의 napDNAbp는 Cas12 폴리펩티드, 예를 들어, Cas12b/C2c1, 또는 이의 단편이다. Cas12 폴리펩타이드는 변이체 Cas12 폴리펩타이드일 수 있다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단 단편은 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인 또는 RuvC 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 Cas12 폴리펩타이드와 촉매 도메인 사이에 링커를 포함한다. 다른 구현예에서, 링커의 아미노산 서열은 GGSGGS 또는 GSSGSETPGTSESATPESSG이다. 다른 구현예에서, 링커는 강성 링커이다. 상기 양상의 다른 구현예에서, 링커는 GGAGGCTCTGGAGGAAGC 또는 GGCTCTTCTGGATCTGAAACACCTGGCACAAGCGAGAGCGCCACCCCTGAGAGCTCTGGC에 의해 암호화되어 있다.
Cas12 폴리펩타이드의 N- 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 이종성 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질은 또한 본원에 기재된 바와 같은 방법에서 염기 편집을 위해 유용하다. Cas12 및 하나 이상의 데아미나제 도메인, 예를 들어, 아데노신 데아미나제를 포함하거나 Cas12 서열에 의해 플랭킹된 아데노신 데아미나제를 포함하는 융합 단백질은 또한 표적 서열의 고도의 특이적 및 효율적 염기 편집을 위해 유용하다. 하나의 구현예에서, 키메라 Cas12 융합 단백질은 Cas12 폴리펩타이드 내에 삽입된 이종성 촉매 도메인 (예를 들어, 아데노신 데아미나제, 시티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas12 내에 삽입된 아데노신 데아미나제 도메인 및 시티딘 데아미나제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 시티딘 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 시티딘 데아미나제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 아데노신 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 아데노신 데아미나제는 N-말단에 융합된다. 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제 및 Cas12와의 융합 단백질의 예시적인 구조는 다음과 같이 제공된다:
NH2-[Cas12(아데노신 데아미나제)]-[시티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas12(아데노신 데아미나제)]-COOH;
NH2-[Cas12(시티딘 데아미나제)]-[아데노신 데아미나제]-COOH; 또는
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas12(시티딘 데아미나제)]-COOH;
일부 구현예에서, 상기 일반 구조에서 사용된 "-"는 임의의 링커의 존재를 지적한다.
다양한 구현예에서, 촉매 도메인은 아데노신 데아미나제 활성과 같은 DNA 변형 활성 예를 들어, 데아미나제 활성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA (예를 들어, TadA7.10)이다. 일부 구현예에서, TadA는 TadA*8이다. 일부 구현예에서, TadA*8은 Cas12 내에서 융합되고 시티딘 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, TadA*8은 Cas12 내에서 융합되고 시티딘 데아미나제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 TadA*8은 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 시티딘 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 TadA*8은 N-말단에 융합된다. TadA*8 및 시티딘 데아미나제 및 Cas12와의 융합 단백질의 예시적인 구조는 다음과 같이 제공된다:
N-[Cas12(TadA*8)]-[시티딘 데아미나제]-C;
N-[시티딘 데아미나제]-[Cas12(TadA*8)]-C;
N-[Cas12(시티딘 데아미나제)]-[TadA*8]-C; 또는
N-[TadA*8]-[Cas12(시티딘 데아미나제)]-C.
일부 구현예에서, 상기 일반 구조에서 사용된 "-"는 임의의 링커의 존재를 지적한다.
다른 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 촉매 도메인을 함유한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 촉매 도메인의 적어도 하나는 Cas12 폴리펩타이드 내에 삽입되거나 Cas12 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 촉매 도메인의 적어도 하나는 Cas12 폴리펩타이드의 루프, 알파 나선 영역, 비구조화된 부분, 또는 용매 접근 가능한 부분 내에 삽입된다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드는 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i이다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드는 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) Cas12b, 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) Cas12b, 바실러스 종 (Bacillus sp.) V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실러스 액시디필러스 (Alicyclobacillus acidiphilus) Cas12b와 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드는 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) Cas12b, 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) Cas12b, 바실러스 종 (Bacillus sp.) V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실러스 액시디필러스 (Alicyclobacillus acidiphilus) Cas12b와 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드는 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) Cas12b, 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) Cas12b, 바실러스 종 (Bacillus sp.) V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실러스 액시디필러스 (Alicyclobacillus acidiphilus) Cas12b와 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩타이드는 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) Cas12b, 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) Cas12b, 바실러스 종 (Bacillus sp.) V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실러스 액시디필러스 (Alicyclobacillus acidiphilus) Cas12b의 단편을 포함하거나 필수적으로 이들로 이루어진다.
다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 위치 153-154, 255-256, 306-307, 980-981, 1019-1020, 534-535, 604-605 또는 344-345, 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h 또는 Cas12i의 상응하는 아미노산 잔기 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 P153과 S154 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 K255과 E256 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 D980과 G981 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 K1019과 L1020 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 F534와 P535 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 K604와 G605 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 H344와 F345 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 위치 147과 148, 248과 249, 299와 300, 991과 992, 또는 1031과 1032 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i의 상응하는 아미노산 잔기 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 P147과 D148 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 G248과 G249 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 P299과 E300 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 G991과 E992 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 K1031과 M1032 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 위치 157과 158, 258과 259, 310와 311, 1008과 1009, 또는 1044와 1045 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i의 상응하는 아미노산 잔기 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 P157과 G158 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 V258과 G259 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 D310과 P311 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 G1008과 E1009 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 G1044와 K1045 사이에 삽입된다.
다른 구현예에서, 융합 단백질은 핵 국소화 신호(예를 들어, 양분된 핵 국소화 신호)를 포함한다. 다른 구현예에서, 핵 국소화 신호의 아미노산 서열은 MAPKKKRKVGIHGVPAA이다. 상기 양상의 다른 구현예에서, 핵 국소화 신호는 하기의 서열에 의해 암호화된다: ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCC. 다른 구현예에서, Cas12b 폴리펩타이드는 RuvC 도메인의 촉매 활성을 사일런싱시키는 돌연변이를 함유한다. 다른 구현예에서, Cas12b 폴리펩타이드는 D574A, D829A 및/또는 D952A 돌연변이를 함유한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 태그 (예를 들어, 인플루엔자 헤마글루티닌 태그)를 추가로 함유한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 내부적으로 융합된 핵염기 편집 도메인 (예를 들어, 데아미나제 도메인, 예를 들어, 아데노신 데아미나제 도메인 전부 또는 일부)과 함께 napDNAbp 도메인 (예를 들어, Cas12-유래된 도메인)을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12b이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 하기 표에 제공된 유전자좌에 삽입된 내부적으로 융합된 TadA*8 도메인과 함께 BhCas12b 도메인을 포함한다.
[표 10B] Cas12b 단백질에서 삽입 유전자좌
Figure pct00270
비제한적으로 예를 들면, 아데노신 데아미나제 (예를 들어, ABE8.13)는 BhCas12b에 삽입하여 핵산 서열을 효과적으로 편집하는 융합 단백질 (예를 들어, ABE8.13-BhCas12b)을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 시스템은 Cas9 내에 삽입된 TadA를 갖는 ABE를 포함한다. Cas9 내에 TadA가 삽입된 관련 ABE의 서열이 제공된다.
101 Cas9 TadAins 1015
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102 Cas9 TadAins 1022
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103 Cas9 TadAins 1029
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GITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRML
ASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
103 Cas9 TadAins 1040
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
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FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
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IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
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TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSGSSGSETPGT
SESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVI
GEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCA
GAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADEC
AALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIE
TNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKR
NSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELL
GITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRML
ASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
105 Cas9 TadAins 1068
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LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
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FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
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IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGEGSSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMR
HALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMAL
RQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGA
AGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQ
SSTDTGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKR
NSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELL
GITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRML
ASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
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LGGD
106 Cas9 TadAins 1247
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
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NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
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FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
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IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGGSS
GSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVL
VLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTF
EPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITE
GILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSPEDNEQKQLFVEQHKH
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LGGD
107 Cas9 TadAins 1054
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NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGSSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDERE
VPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLID
ATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMN
HRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDGEIRKRPLIE
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NSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELL
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YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
108 Cas9 TadAins 1026
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INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
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FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEGSSGSETPGTSESATPESSGSEVE
FSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPT
AHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFG
VRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQV
FNAQKKAQSSTDQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIE
TNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKR
NSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELL
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YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
109 Cas9 TadAins 768
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQGSSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMR
HALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMAL
RQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGA
AGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRTTQKGQKNSR
ERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQEL
DINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKK
MKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQIT
KHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI
NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQE
IGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGR
DFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDP
KKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNP
IDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELAL
PSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSK
RVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFD
TTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
110.1 Cas9 TadAins 1250
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPG
SSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGA
VLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYV
TFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEI
TEGILADECAALLCYFFRMPREDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSK
RVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFD
TTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
110.2 Cas9 TadAins 1250
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPG
SSGSSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVP
VGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDAT
LYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHR
VEITEGILADECAALLCYFFRMPREDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISE
FSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFK
YFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
110.3 Cas9 TadAins 1250
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPG
SSGSSGSETPGTSESATPESGSSSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDER
EVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLI
DATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGM
NHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPREDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQ
ISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPA
AFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
110.4 Cas9 TadAins 1250
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPG
SSGSSGSETPGTSESATPESGSSSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDER
EVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLI
DATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGM
NHRVEITEGILADECAALLCYFFRMRREDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQ
ISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPA
AFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
110.5 Cas9 TadAins 1249
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSGS
SGSSGSETPGTSESATPESGSSSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDERE
VPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLID
ATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMN
HRVEITEGILADECAALLCYFFRMRRPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQ
ISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPA
AFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
110.5 Cas9 TadAins delta 59-66 1250
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPG
SSGSSGSETPGTSESATPESGSSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDERE
VPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFE
PCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEG
ILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDEDNEQKQLFVEQHKHYLD
EIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTN
LGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGG
D
110.6 Cas9 TadAins 1251
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
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NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
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YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPE
GSSGSSGSETPGTSESATPESGSSSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDE
REVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRL
IDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPG
MNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMRRDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQ
ISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPA
AFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
110.7 Cas9 TadAins 1252
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPE
DGSSGSSGSETPGTSESATPESGSSSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARD
EREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYR
LIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYP
GMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMRRNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQ
ISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPA
AFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
110.8 Cas9 TadAins 델타 59-66 C-절단물 1250
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPG
SSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGA
VLVLNNRVIGEGWNRAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMC
AGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADE
CAALLCYFFRMPRQEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADA
NLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKR
YTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
111.1 Cas9 TadAins 997
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALSHE
YWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAE
IMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNA
KTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQ
KKAQSSTDGSSGSETPGTSESATPESSGIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVR
KMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGET
GEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKL
IARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIM
ERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGE
LQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEI
IEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLG
APAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
111.2 Cas9 TadAins 997
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALSHE
YWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAE
IMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNA
KTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQ
KKAQSSTDGSSGSSGSETPGTSESATPESSGGSSIKKYPKLESEFVYGDY
KVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLI
ETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPK
RNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKEL
LGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRM
LASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHK
HYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLF
TLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLS
QLGGD
112 델타 HNH TadA
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSEVEFSHE
YWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAE
IMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNA
KTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQ
KKAQSSTDGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDEND
KLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTAL
IKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFK
TEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKK
TEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVA
KVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIK
LPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKG
SPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKH
RDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATL
IHQSITGLYETRIDLSQLGGD
113 N-말단 단일 TadA 나선 절단물 165-말단
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIG
LHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIG
RVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFR
MPRSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSV
GWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKR
TARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERH
PIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRG
HFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARL
SKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQL
SKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAP
LSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGG
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GELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMT
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YFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKE
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EDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKL
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GDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARE
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SDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGF
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RKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVY
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DKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGI
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AGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYL
DEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLT
NLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLG
GD
114 N-말단 단일 TadA 나선 절단물 165-말단 델타 59-65
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRTAH
AEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVR
NAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRSGGS
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EYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYT
RRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV
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LNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLE
NLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDD
DLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIK
RYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFY
KFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAIL
RRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETI
TPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNE
LTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIE
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TLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDK
QSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEH
IANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKG
QKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMY
VDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSE
EVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVE
TRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFY
KVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIA
KSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIV
WDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARK
KDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSS
FEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKG
NELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQI
SEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAA
FKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
115.1 Cas9 TadAins1004
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKGSSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREV
PVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDA
TLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNH
RVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQ
EIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKG
RDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWD
PKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKN
PIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELA
LPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFS
KRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYF
DTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
115.2 Cas9 TadAins1005
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLGSSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDERE
VPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLID
ATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMN
HRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQ
EIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKG
RDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWD
PKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKN
PIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELA
LPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFS
KRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYF
DTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
115.3 Cas9 TadAins1006
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLEGSSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDER
EVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLI
DATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGM
NHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQSEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQ
EIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKG
RDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWD
PKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKN
PIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELA
LPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFS
KRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYF
DTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
115.4 Cas9 TadAins1007
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESGSSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDE
REVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRL
IDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPG
MNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQ
EIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKG
RDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWD
PKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKN
PIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELA
LPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFS
KRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYF
DTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
116.1 Cas9 TadAins C-말단 절단물2 792
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGGSSGSETP
GTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNR
VIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVM
CAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILAD
ECAALLCYFFRMPRQSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQE
LDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVK
KMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQI
TKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVRE
INNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQ
EIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKG
RDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWD
PKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKN
PIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELA
LPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFS
KRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYF
DTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
116.2 Cas9 TadAins C-말단 절단물2 791
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSSGSETPG
TSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRV
IGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMC
AGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADE
CAALLCYFFRMPRQGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQE
LDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVK
KMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQI
TKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVRE
INNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQ
EIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKG
RDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWD
PKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKN
PIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELA
LPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFS
KRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYF
DTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
116.3 Cas9 TadAins C-말단 절단물2 790
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKEGSSGSETPGT
SESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVI
GEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCA
GAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADEC
AALLCYFFRMPRQLGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQE
LDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVK
KMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQI
TKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVRE
INNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQ
EIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKG
RDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWD
PKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKN
PIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELA
LPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFS
KRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYF
DTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
117 Cas9 델타 1017-1069
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
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RYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
118 Cas9 TadA-CP116ins 1067
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
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MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQ
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YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
119 Cas9 TadAins 701
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
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LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SGSSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPV
GAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATL
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EITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDLTFKEDIQKAQVS
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NSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELL
GITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRML
ASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
120 Cas9 TadACP136ins 1248
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
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TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSMN
HRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDGSSGSETPGT
SESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVI
GEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCA
GAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
121 Cas9 TadACP136ins 1052
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
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YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLAMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDGSSGS
ETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVL
NNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEP
CVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGNGEIRKRPLIE
TNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKR
NSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELL
GITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRML
ASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
122 Cas9 TadACP136ins 1041
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
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ILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDGSSGSETPGTSESATPES
SGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAI
GLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRI
GRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIE
TNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKR
NSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELL
GITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRML
ASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
123 Cas9 TadACP139ins 1299
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
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LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
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IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI
TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV
QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE
KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPE
DNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRMN
HRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDGSSGSETPGT
SESATPESSGSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVI
GEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCA
GAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
124 Cas9 델타 792-872 TadAins
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSEVEFSHE
YWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAE
IMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNA
KTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQ
KKAQSSTDEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKA
GFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVS
DFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYK
VYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIE
TNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKR
NSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELL
GITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRML
ASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
125 Cas9 델타 792-906 TadAins
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSEVEFSHE
YWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAE
IMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNA
KTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQ
KKAQSSTDGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDK
LIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALI
KKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKT
EITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKT
EVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAK
VEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKL
PKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGS
PEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHR
DKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLI
HQSITGLYETRIDLSQLGGD
126 TadA CP65ins 1003
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI
LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI
FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR
KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY
YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK
NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD
LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ
LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD
SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV
MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD
SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI
REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGR
VVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRM
PRQVFNAQKKAQSSTDGSSGSETPGTSESATPESSGSEVEFSHEYWMRHA
LTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPLESEFVYGDYK
VYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIE
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LGGD
127 TadA CP65ins 1016
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LGGD
128 TadA CP65ins 1022
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LGGD
129 TadA CP65ins 1029
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LGGD
130 TadA CP65ins 1041
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131 TadA CP65ins 1054
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
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132 TadA CP65ins 1246
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LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP
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YLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFT
LTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQ
LGGD
일부 구현예에서, 동정된 위치에서 Cas9 폴리펩타이드 내로 TadA 또는 이의 변이체를 삽입하기 위해 아데노신 데아미나제 염기 편집기가 생성되었다.
비제한적이지만 예시적인 융합 단백질은 국제 PCT 출원 번호 PCT/US2020/016285 및 미국 가출원 번호 62/852,228 및 62/852,224에 기재되어 있고, 이의 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
핵산을 편집하기 위한 방법
본원 개시내용의 일부 양상은 핵산을 편집하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질을 암호화하는 핵산 분자 (예를 들어, 이중-가닥 DNA 서열의 염기쌍)의 핵염기를 편집하기 위한 방법이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: a) 핵산 (예를 들어, 이중-가닥 DNA 서열)의 표적 영역을 염기 편집기 및 가이드 핵산 (예를 들어, gRNA)을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계, b) 상기 표적 영역의 가닥 분리를 유도하는 단계, c) 상기 표적 영역의 단일 가닥 내 상기 표적 핵염기 쌍의 제1 핵염기를 제2 핵염기로 전환시키는 단계, 및 d) 상기 표적 영역의 하나 이하의 가닥을 절단하는 단계로서, 상기 제1 핵염기에 상보적인 제3 핵염기가 상기 제2 핵염기에 상보적인 제4 핵염기로 대체되는, 단계. 일부 구현예에서, 상기 방법은 핵산 내 20% 미만의 삽입-결실 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 단계 b는 생략된다는 것이 인지되어야 한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 19%, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 미만, 또는 0.1% 미만의 삽입-결실 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 제2 핵염기를 상기 제4 핵염기에 상보적인 제5 핵염기로 대체하여 의도된 편집된 염기 쌍을 생성 (예를 들어, GㆍC에서 AㆍT로)하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 의도된 염기쌍의 적어도 5%가 편집된다. 일부 구현예에서, 의도된 염기쌍의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%가 편집된다.
일부 구현예에서, 표적 뉴클레오타이드에서 의도된 생성물 대 비의도된 생성물의 비율은 적어도 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 또는 200:1 이상이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이 대 삽입-결실 형성의 비율은 1:1, 10:1, 50:1, 100:1, 500:1 초과, 또는 1000:1 이상이다. 일부 구현예에서, 절단된 단일 가닥 (닉 가닥)은 가이드 핵산에 하이브리드화한다. 일부 구현예에서, 절단된 단일 가닥은 제1 핵염기를 포함하는 가닥에 반대편에 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 dCas9 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 비-편집된 가닥을 보호하거나 이에 결합한다. 일부 구현예에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 업스트림이다. 일부 구현예에서, 의도된 편집된 염기쌍은 PAM 부위의 업스트림의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 다운스트림이다. 일부 구현예에서 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 다운스트림의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 카노니칼 (예를 들어, NGG) PAM 부위를 필요로하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집기는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 1-25개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 5-20개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산 길이이다. 하나의 구현예에서, 링커는 32개 아미노산 길이이다. 또 다른 구현예에서, "긴 링커"는 적어도 약 60개 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 링커는 약 3-100개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 영역은 표적 윈도우를 포함하고, 여기서, 상기 표적 윈도우는 표적 핵염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 1-10개 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 또는 1개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 표적 윈도우 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 의도된 편집된 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 뉴클레오타이드 (예를 들어, 단백질을 암호화하는 유전자에서 SNP)를 편집하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 이중-가닥 DNA 서열의 핵염기 쌍을 편집하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 a) 이중-가닥 DNA 서열의 표적 영역을 염기 편집기 및 가이드 핵산 (예를 들어, gRNA)을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계로서, 상기 표적 영역이 표적 핵염기 쌍을 포함하는, 단계, b) 상기 표적 영역의 가닥 분리를 유도하는 단계, c) 상기 표적 영역의 단일 가닥 내 상기 표적 핵염기 쌍의 제1 핵염기를 제2 핵염기로 전환시키는 단계, d) 상기 표적 영역의 하나 이하의 가닥을 절단하는 단계로서 상기 제1 핵염기에 상보적인 제3 핵염기가 상기 제2 핵염기에 상보적인 제4 핵염기로 대체되고, 상기 핵염기가 상기 제4 핵염기에 상보적인 제5 핵염기로 대체되어 의도된 편집된 염기쌍을 생성하고, 상기 의도된 편집된 염기쌍의 효율이 적어도 5%인, 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 b는 생략되는 것으로 인지되어야 한다. 일부 구현예에서, 의도된 염기쌍의 적어도 5%가 편집된다. 일부 구현예에서, 의도된 염기쌍의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%가 편집된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 19%, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 미만, 또는 0.1% 미만의 삽입-결실 형성을 유발한다. 일부 구현예에서, 표적 뉴클레오타이드에서 의도된 생성물 대 비의도된 생성물의 비율은 적어도 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 또는 200:1 이상이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이 대 삽입-결실 형성의 비율은 1:1, 10:1, 50:1, 100:1, 500:1 초과, 또는 1000:1 이상이다. 일부 구현예에서, 절단된 단일 가닥은 가이드 핵산에 하이브리드화한다. 일부 구현예에서, 절단된 단일 가닥은 제1 핵염기를 포함하는 가닥에 반대편에 있다. 일부 구현예에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 업스트림이다. 일부 구현예에서, 의도된 편집된 염기쌍은 PAM 부위의 업스트림의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 다운스트림이다. 일부 구현예에서 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 다운스트림의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 카노니칼 (예를 들어, NGG) PAM 부위를 필요로하지 않는다. 일부 구현예에서, 링커는 1-25개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 5-20개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 영역은 표적 윈도우를 포함하고, 여기서, 상기 표적 윈도우는 표적 핵염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 1-10개 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 또는 1개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 표적 윈도우 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 의도된 편집된 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집기는 본원에 제공된 염기 편집기의 임의의 하나이다.
숙주 세포에서 융합 단백질의 발현
아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 본원 개시내용의 융합 단백질은 실제로 세균, 효모, 진균류, 곤충, 식물 및 동물 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 관심 대상의 임의의 숙주 세포에서 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 발현될 수 있다. 예를 들어, 본원 개시내용의 아데노신 데아미나제를 암호화하는 DNA는 cDNA 서열을 기준으로 CDS의 업스트림 및 다운스트림에 대해 적합한 프라이머를 디자인함에 의해 클로닝될 수 있다. 클로닝된 DNA는 직접적으로 또는 경우에 따라 제한 효소를 사용한 분해 후, 또는 염기 편집 시스템의 하나 이상의 추가의 성분을 암호화하는 DNA로 연결된 적합한 링커 및/또는 핵 국소화 신호의 첨가 후 일 수 있다. 염기 편집 시스템은 숙주 세포에서 해독되어 복합체를 형성한다.
본원에 기재된 단백질 도메인을 암호화하는 DNA는 DNA를 화학적으로 합성함에 의해 또는 PCR 방법 및 깁슨 어셈블리 방법을 사용하여 전장을 암호화하는 DNA를 작제함에 의해 합성된 부분적 중첩 올리고DNA 단쇄를 연결하여 수득될 수 있다. 화학적 합성 또는 PCR 방법 또는 깁슨 어셈블리 방법의 조합에 의해 전장 DNA를 작제하는 이점은 사용될 코돈이 DNA가 도입되는 숙주에 따라 CDS 전장에서 디자인될 수 있다는 것이다. 이종성 DNA의 발현에서, 단백질 발현 수준은 이의 DNA 서열을 숙주 유기체에서 고도로 흔하게 사용되는 코돈으로 전환시킴에 의해 증가하는 것으로 예상된다. 사용될 숙주에서의 코돈 사용 빈도의 데이터로서, 예를 들어, Kazusa DNA 연구소의 홈페이지에 기재된 유전자 코드 사용 빈도 데이터베이스 (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)가 사용될 수 있거나, 각각의 숙주에서 코돈 사용 빈도를 보여주는 문헌이 참조될 수 있다. 수득된 데이터 및 도입될 DNA 서열을 참조하여, DNA 서열을 위해 사용되는 것들 중에서 숙주에서 낮은 사용 빈도를 보여주는 코돈은 동일한 아미노산을 암호화하고 높은 사용 빈도를 보여주는 코돈으로 전환될 수 있다.
핵산 서열-인지 모듈 및/또는 핵산 염기 전환 효소를 암호화하는 DNA를 함유하는 발현 벡터는 예를 들어, DNA를 적합한 발현 벡터 내 프로모터의 다운스트림에 연결함에 의해 생성될 수 있다.
발현 벡터로서, 에스케리치아 콜리-유래된 플라스미드 (예를 들어, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); 바실러스 서브틸리스-유래된 플라스미드 (예를 들어, pUB110, pTP5, pC194); 효모-유래된 플라스미드 (예를 들어, pSH19, pSH15); 곤충 세포 발현 플라스미드 (예를 들어, pFast-Bac); 동물 세포 발현 플라스미드 (예를 들어, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo); 박테리오파아지, 예를 들어, 람다.파아지 등; 곤충 바이러스 벡터, 예를 들어, 바쿨로바이러스 등 (예를 들어, BmNPV, AcNPV); 동물 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 등이 사용된다.
프로모터로서, 유전자 발현을 위해 사용될 숙주에 적당한 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. DSB를 사용하는 통상적인 방법에서, 숙주 세포의 생존율은 때로는 독성으로 인해 현저하게 감소하기 때문에, 유도성 프로모터를 사용함에 의한 유도의 개시에 의해 세포 수를 증가시키는 것이 요구될 수 있다. 그러나, 충분한 세포 증식은 또한 본원 개시내용의 핵산 변형 효소 복합체를 발현시킴에 의해 부여될 수 있기 때문에, 항시성 프로모터는 또한 제한 없이 사용될 수 있다.
예를 들어, 숙주가 동물 세포인 경우, SR.알파. 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV (시토메갈로바이러스) 프로모터, RSV (라우스 사코마 바이러스) 프로모터, MoMuLV (몰로니 마우스 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK (심플 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제) 프로모터 등이 사용된다. 이들 중에서, CMV 프로모터, SR.알파. 프로모터 등이 바람직할 수 있다.
숙주가 에스케리치아 콜리인 경우, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, 람다.P.sub.L 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이 바람직할 수 있다.
숙주가 바실러스 속인 경우, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등이 바람직할 수 있다.
숙주가 효모인 경우, Gal1/10 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직할 수 있다.
숙주가 곤충 세포인 경우, 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터 등이 바람직할 수 있다.
숙주가 식물 세포인 경우, CaMV35S 프로모터, CaMV19S 프로모터, NOS 프로모터 등이 바람직할 수 있다.
상기 언급된 것들 외에 발현 벡터로서, 인핸서, 스플라이싱 신호, 종결인자, 폴리A 부가 신호, 선택 마커, 예를 들어, 약물 내성 유전자, 영양요구성 상보성 유전자 등, 복제 오리진 등을 함유하는 것이 사용될 수 있다.
본원에 기재된 단백질 도메인을 암호화하는 RNA는 예를 들어, 주형으로서 상기 언급된 핵산 서열-인지 모듈 및/또는 핵산 염기 전환 효소를 암호화하는 DNA를 암호화하는 벡터를 사용함에 의해 공지된 시험관내 전사 시스템 자체에서 mRNA로의 전사에 의해 제조될 수 있다.
본원 개시내용의 융합 단백질은 핵산 서열-인지 모듈 및/또는 핵산 염기 전환 효소를 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고 상기 숙주 세포를 배양함으로써 세포내 발현될 수 있다.
숙주로서, 에스케리치아 속, 바실러스 속, 효모, 곤충 세포, 곤충, 동물 세포 등이 사용된다.
에스케리치아 속으로서, 에스케리치아 콜리 K12.cndot.DH1 [Proc. Natl. Acad. sci. USA, 60, 160 (1968)], 에스케리치아 콜리 JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], 에스케리치아 콜리 JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], 에스케리치아 콜리 HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], 에스케리치아 콜리 C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] 등이 사용된다.
바실러스 속으로서, 바실러스 서브틸리스 M1114 [Gene, 24, 255 (1983)], 바실러스 서브틸리스 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] 등이 사용된다.
효모로서, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R.sup.-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913, NCYC2036, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) KM71 등이 사용된다.
바이러스가 AcNPV인 경우 곤충 세포로서, 양배추 군벌레 유충-유래된 확립된 계통의 세포 (스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포; Sf 세포), 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni)의 중간 장으로부터 유래된 MG1 세포, 하이 파이브 (High Five).TM. 트리코플루시아 니의 란으로부터 유래된 세포, 마메스트라 브라시카 (Mamestra brassicae)-유래된 세포, 에스티그메나 아크레아 (Estigmena acrea)-유래된 세포 등이 사용된다. 바이러스가 BmNPV인 경우, 봄빅스 모리 (Bombyx mori)-유래된 확립된 주의 세포 (봄빅스 모리 N 세포; BmN 세포) 등은 곤충 세포로서 사용된다. sf 세포, 예를 들어, Sf9 세포 (ATCC CRL1711), Sf21 세포 [상기 모두, 생체내, 13, 213-217 (1977)] 등이 사용된다.
곤충으로서, 예를 들어, 봄믹스 모리, 드로소필라, 크리켓 등의 유충이 사용된다 [참조: Nature, 315, 592 (1985)].
동물 세포로서, 몽키 COS-7 세포, 몽키 베로 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, dhfr 유전자-결핍 CHO 세포, 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20 세포, 마우스 골수종 세포, 래트 GH3 세포, 인간 FL 세포 등, 만능 줄기 세포, 예를 들어, iPS 세포, 인간 및 다른 포유류의 ES 세포 등, 및 다양한 조직으로부터 제조된 1차 배양된 세포가 사용된다. 추가로, 제브라피시 배아, 제노푸스 난모세포 등이 또한 사용될 수 있다.
식물 세포로서, 현탁 배양된 세포, 캘러스, 원형질체, 다양한 식물로부터 제조된 잎 분절, 뿌리 분절 등 (예를 들어, 낟알, 예를 들어, 쌀, 밀, 옥수수 등, 제품 작물, 예를 들어, 토마토, 오이, 가지 등, 정원 식물, 예를 들어, 카네이션, 유스토마 루셀리아눔 (Eustoma russellianum) 등, 실험 식물, 예를 들어, 토바코, 아라비도프시스 탈리아나 (arabidopsis thaliana) 등)이 사용된다.
상기 언급된 모든 숙주 세포는 반수체 (단배체) 또는 다배체 (예를 들어, 이배체, 삼배체, 사배체 등)일 수 있다. 통상적인 돌연변이 도입 방법에서, 돌연변이는 원칙적으로 헤테로 유전자 유형을 생성하기 위해 단지 하나의 상동성 염색체에 도입된다. 따라서, 목적하는 표현형은 우성 돌연변이가 존재하지 않는 경우 발현되지 않고 동형접합은 불편하게 노동 및 시간을 필요로 한다. 대조적으로, 본원 개시내용에 따라, 돌연변이는 게놈 내 상동성 염색체 상에 임의의 대립유전자에 도입될 수 있기 때문에, 목적하는 표현형은 열성 돌연변이의 경우에도 단일 생성으로 발현될 수 있고, 이는 통상적인 방법의 문제가 해결될 수 있으므로 극히 유용하다.
발현 벡터는 숙주의 종류에 따라 공지된 방법 (예를 들어, 리소자임 방법, 컴피턴트 방법, PEG 방법, CaCl2 공침전 방법, 전기천공 방법, 미세주사 방법, 입자 총 방법, 지질감염 방법, 아그로박테리움 방법 등)에 의해 도입될 수 있다.
에스케리치아 콜리는 예를 들어, 문헌 (참조: Proc. Natl. Acad. sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) 등)에 기재된 방법에 따라 형질전환될 수 있다.
바실러스 속은 예를 들어, 문헌 (참조: Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) 등)에 기재된 방법에 따라 벡터에 도입될 수 있다.
효모에는 예를 들어, 문헌 (참조: Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. sci. USA, 75, 1929 (1978) 등)에 기재된 방법에 따라 벡터가 도입될 수 있다.
곤충 세포 및 곤충에는 예를 들어, 문헌 (참조: Bio/Technology, 6, 47-55 (1988) 등)에 기재된 방법에 따라 벡터가 도입될 수 있다.
동물 세포에는 예를 들어, 문헌 (참조: Cell Engineering additional volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), and Virology, 52, 456 (1973))에 기재된 방법에 따라 벡터가 도입될 수 있다.
벡터가 도입된 세포는 숙주의 종류에 따라 공지된 방법에 따라 배양될 수 있다.
예를 들어, 에스케리치아 콜리 또는 바실러스 속이 배양된 경우, 액체 배지는 배양을 위해 사용될 배지로서 바람직할 수 있다. 배지는 바람직하게 형질전환체의 성장을 위해 필요한 탄소원, 질소원, 무기 물질 등을 함유한다. 탄소원의 예는 글루코스, 덱스트린, 가용성 전분, 슈크로스 등을 포함하고; 질소원의 예는 무기 또는 유기 물질, 예를 들어, 암모늄 염, 니트레이트 염, 옥수수 침지액, 펩톤, 카세인, 육류 추출물, 대두 케이크, 감자 추출물 등을 포함하고; 무기 물질의 예는 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 등을 포함한다. 배지는 효모 추출물, 비타민, 성장 촉진 인자 등을 함유할 수 있다. 배지의 pH는 바람직하게 약 5-약 8이다.
에스케리치아 콜리를 배양하기 위한 배지로서, 예를 들어, 글루코스, 카사미노산 [Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]을 함유하는 M9 배지가 바람직할 수 있다. 필요한 경우, 예를 들어, 3.베타.-인돌릴아크릴산과 같은 제제는 배지에 첨가하여 프로모터의 효율적인 기능을 보장할 수 있다. 에스케리치아 콜리는 일반적으로 약 15-약 43℃에서 배양된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
바실러스 속은 일반적으로 약 30-약 40℃에서 배양된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
효모를 배양하기 위한 배지의 예는 버크홀더 (Burkholder) 최소 배지 [Proc. Natl. Acad. sci. USA, 77, 4505 (1980)], 0.5% 카사미노산 [Proc. Natl. Acad. sci. USA, 81, 5330 (1984)] 등을 함유하는 SD 배지를 포함한다. 배지의 pH는 바람직하게 약 5-약 8이다. 배양은 일반적으로 약 20℃-약 35℃에서 수행된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
곤충 세포 또는 곤충을 배양하기 위한 배지로서, 예를 들어, 적절하게 불활성화된 10% 소 혈청 등과 같은 첨가제를 함유하는 그레이스 (Grace) 곤충 배지 [Nature, 195, 788 (1962)]가 사용된다. 배지의 pH는 바람직하게 약 6.2 내지 약 6.4이다. 배양은 일반적으로 약 27℃에서 수행된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
동물 세포를 배양하기 위한 배지로서, 예를 들어, 약 5-약 20%의 태아 소 혈청을 함유하는 최소 필수 배지 (MEM) [Science, 122, 501 (1952)], 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 배지 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] 등이 사용된다. 배지의 pH는 바람직하게 약 6-약 8이다. 배양은 일반적으로 약 30℃-약 40℃에서 수행된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
식물 세포를 배양하기 위한 배지로서, 예를 들어, MS 배지, LS 배지, B5 배지 등이 사용된다. 배지의 pH는 바람직하게 약 5-약 8이다. 배양은 일반적으로 약 20℃-약 30℃에서 수행된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
고등 진핵 세포, 예를 들어, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등이 숙주 세포로서 사용되는 경우, 본원 개시내용의 염기 편집 시스템을 암호화하는 DNA (예를 들어, 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는)는 유도성 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터 (중금속 이온에 의해 유도된), 열 쇼크 단백질 프로모터 (열 쇼크에 의해 유도된), Tet-온/Tet-오프 시스템 프로모터 (테트라사이클린 또는 이의 유도체의 부가 또는 제거에 의해 유도된), 스테로이드-반응성 프로모터(스테로이드 호르몬 또는 이의 유도체에 의해 유도된) 등)의 조절하에 숙주 세포에 도입되고, 유도 물질은 적절한 단계에서 배지에 첨가되어 (또는 배지로부터 제거되어) 핵산-변형 효소 복합체의 발현을 유도하고, 배양은 소정의 기간동안 수행하여 염기 편집 및 돌연변이의 표적 유전자로의 도입을 수행하고, 염기 편집 시스템의 일과성 발현이 실현될 수 있다.
원핵 세포, 예를 들어, 에스코리치아 콜리 등은 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터 (IPTG에 의해 유도된), cspA 프로모터 (냉 쇼크에 의해 유도된), araBAD 프로모터 (아라비노스에 의해 유도된) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
대안적으로, 상기 언급된 유도성 프로모터는 또한 고등 진핵 세포, 예를 들어, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등이 숙주 세포로서 사용되는 경우 벡터 제거 기전으로서 사용될 수 있다. 즉, 벡터에는 숙주 세포에서 기능하는 복제 오리진이 탑재되고, 단백질을 암호화하는 핵산의 발현의 복제에 필요한 단백질 (예를 들어, 동물 세포에 대해 SV40 및 대형 T 항원, oriP 및 EBNA-1 등)을 암호화하는 핵산은 상기 언급된 유도성 프로모터에 의해 조절된다. 결과로서, 벡터는 유도 물질이 제거되는 경우 유도 물질의 존재하에 자가 복제될 수 있고, 자가 복제는 가용하지 않고, 벡터는 천연적으로 세포 분열과 함께 감소한다 (자가 복제는 Tet-오프 시스템 벡터에서 테트라사이클린 및 독시사이클린의 첨가에 의해 가능하지 않다).
전달 시스템
핵염기 편집기 및 gRNA의 핵산-기반 전달
본원 개시내용에 따라 염기 편집 시스템을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 대상체에게 투여될 수 있거나, 세포에 전달될 수 있다. 하나의 구현예에서, 핵염기 편집기는 예를 들어, 벡터 (예를 들어, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터), 비-벡터-기반 방법 (예를 들어, 나출형 DNA, DNA 복합체, 지질 나노입자를 사용하여) 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다.
핵염기 편집기를 암호화하는 핵산은 예를 들어, 형질감염 또는 전기천공에 의해 나출형 DNA 또는 RNA로서 세포 (예를 들어, 조혈 세포 또는 이들의 선조체, 조혈 줄기 세포 및/또는 유도된 만능 줄기 세포)에 직접 전달될 수 있거나, 표적 세포에 의한 취득을 촉진시키는 분자 (예를 들어, N-아세틸갈락토사민)에 접합될 수 있다. 핵산 벡터, 예를 들어, 본원에 기재된 벡터가 또한 사용될 수 있다.
핵산 벡터는 본원에 기재된 융합 단백질의 도메인을 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 단백질을 암호화하는 서열과 연합된 (예를 들어, 이에 삽입된 또는 융합된) 신호 펩타이드 (예를 들어, 핵 국소화, 핵소체 국소화 또는 미토콘드리아 국소화를 위해)를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 하나의 예로서, 핵산 벡터는 하나 이상의 핵 국소화 서열 (예를 들어, SV40으로부터 핵 국소화 서열), 및 아데노신 데아미나제 변이체 (예를 들어, ABE8)를 포함하는 Cas9 암호화 서열을 포함할 수 있다.
핵산 벡터는 또한 임의의 적합한 수의 조절/제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, Kozak 컨센서스 서열, 또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함할 수 있다. 이들 요소들은 당업계에 널리 공지되어 있다. 조혈 세포에 대해, 적합한 프로모터는 IFN베타 또는 CD45를 포함할 수 있다.
본원 개시내용에 따른 핵산 벡터는 재조합 바이러스 벡터를 포함한다. 예시적인 바이러스 벡터는 본원에 제시된다. 당업계에 공지된 다른 바이러스 벡터가 또한 사용될 수 있다. 추가로, 바이러스 입자는 핵산 및/또는 펩타이드 형태로 염기 편집 시스템 성분을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, "속빈" 바이러스 입자는 임의의 적합한 카고 (cargo)를 함유하도록 어셈블리될 수 있다. 바이러스 벡터 및 바이러스 입자는 또한 표적 조직 특이성을 변경하기 위해 표적화 리간드를 혼입하도록 가공될 수 있다.
바이러스 벡터에 추가로, 비-바이러스 벡터는 본원의 개시내용에 따른 게놈 편집 시스템을 암호화하는 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 비-바이러스 핵산 벡터의 하나의 중요한 카테고리는 유기 또는 무기일 수 있는 나노입자이다. 나노입자는 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 적합한 나노입자 디자인을 사용하여 게놈 편집 시스템 성분 또는 상기 성분을 암호화하는 핵산을 전달할 수 있다. 예를 들어, 유기 (예를 들어, 지질 및/또는 중합체) 나노입자는 본원 개시내용의 특정 구현예에서 전달 비히클로서 사용하기 위해 적합할 수 있다. 나노입자 제형, 및/또는 유전자 전달에 사용하기 위한 예시적인 지질은 표 11 (하기)에 나타낸다.
[표 11]
Figure pct00271
표 12는 유전자 전달 및/또는 나노입자 제형에 사용하기 위한 예시적인 중합체를 열거한다.
[표 12]
Figure pct00272
표 13은 본원에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 전달 방법을 요약한다.
[표 13]
Figure pct00273
또 다른 양상에서, 게놈 편집 시스템 성분 또는 상기 성분, 예를 들어, 핵산 결합 단백질, 예를 들어, Cas9 또는 이의 변이체 및 관심 대상의 게놈 핵산 서열을 표적화하는 gRNA를 암호화하는 핵산의 전달은 리보핵산단백질 (RNP)을 세포에 전달함에 의해 성취될 수 있다.　 RNP는 핵산 결합 단백질, 예를 들어, 표적화 gRNA와 복합체 형태의 Cas9를 포함한다.　 RNP는 공지된 방법, 예를 들어, 문헌 (참조: Zuris, J.A. et al., 2015, Nat. Biotechnology, 33(1):73-80)에 보고된 바와 같이 전기천공, 핵감염 또는 양이온성 지질-매개된 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있다.　 RNP는 CRISPR 염기 편집 시스템에 사용하기 위해, 특히 1차 세포와 같이 형질감염시키기가 어려운 세포에 사용하기 위해 유리하다.　 추가로, RNP는 또한 특히 진핵 세포 프로모터, 예를 들어, CRISPR 플라스미드에 사용될 수 있는 CMV 또는 EF1A가 잘 발현되지 않는 경우 세포에서 단백질 발현과 함께 일어날 수 있는 어려움을 완화시킬 수 있다.　 유리하게, RNP의 사용은 외래 DNA의 세포로의 전달을 필요로 하지 않는다.　 더욱이, 핵산 결합 단백질 및 gRNA 복합체를 포함하는 RNP는 시간 경과에 따라 분해되기 때문에, RNP의 사용은 표적-이탈 효과를 제한하기 위한 잠재력을 갖는다.　 플라스미드 기반 기술의 것과 유사한 방식으로, RNP를 사용하여 결합 단백질 (예를 들어, Cas9 변이체)을 전달하고 상동성 지시된 복구 (HDR)을 지시할 수 있다.　
염기 편집기 암호화 핵산 분자 발현을 구동시키기 위해 사용되는 프로모터는 AAV ITR을 포함할 수 있다. 이것은 벡터 내 공간을 차지할 수 있는 추가의 프로모터 요소에 대한 필요성을 제거하기 때문에 유리할 수 있다. 확보된 추가의 공간을 사용하여 가이드 핵산 또는 선택가능한 마커와 같은 추가의 요소의 발현을 구동시킬 수 있다. ITR 활성은 상대적으로 약하여 선택된 뉴클레아제의 과발현으로 인한 잠재적 독성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
임의의 적합한 프로모터를 사용하여 염기 편집기 및 경우에 따라 가이드 핵산의 발현을 구동시킬 수 있다. 보편적 발현을 위해, 사용될 수 있는 프로모터는 CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, 페리틴 중쇄 또는 경쇄 등을 포함한다. 뇌 또는 다른 CNS 세포 발현을 위해, 적합한 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: 모든 뉴런에 대해 시냅신I (SynapsinI), 흥분성 뉴런에 대해 CaMKII알파, GABA성 (GABAergic) 뉴런에 대해 GAD67 또는 GAD65 또는 VGAT 등. 간 세포 발현을 위해, 적합한 프로모터는 알부민 프로모터를 포함한다. 폐 세포 발현을 위해, 적합한 프로모터는 SP-B를 포함할 수 있다. 내피 세포를 위해 적합한 프로모터는 ICAM을 포함할 수 있다. 조혈 세포에 대해, 적합한 프로모터는 IFN베타 또는 CD45를 포함할 수 있다. 골아세포를 위해 적합한 프로모터는 OG-2를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 염기 편집기는 별도의 프로모터가 동일한 핵산 분자 내 염기 편집기 및 상용성 가이드 핵산의 발현을 구동시키도록 하기에 충분히 작은 크기를 갖는다. 예를 들어, 벡터 또는 바이러스 벡터는 염기 편집기를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 제1 프로모터 및 가이드 핵산에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함할 수 있다.
가이드 핵산의 발현을 구동시키기 위해 사용되는 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: Pol III 프로모터, 예를 들어, U6 또는 H1, gRNA 아데노 연관된 바이러스 (AAV)를 발현시키기 위해 Pol II 프로모터 및 인트론 카세트의 사용.
바이러스 벡터
따라서, 본원에 기재된 염기 편집기는 바이러스 벡터와 함께 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 염기 편집기는 바이러스 벡터에 함유된 핵산 상에 암호화될 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템의 하나 이상의 성분은 하나 이상의 바이러스 벡터 상에 암호화될 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기 및 가이드 핵산은 단일 바이러스 벡터 상에 암호화될 수 있다. 다른 구현예에서, 염기 편집기 및 가이드 핵산은 상이한 바이러스 벡터 상에 암호화된다. 어느 경우에나, 염기 편집기 및 가이드 핵산은 각각 프로모터 및 터미네이터에 작동적으로 연결될 수 있다. 바이러스 벡터 상에 암호화된 성분의 조합은 선택된 바이러스 벡터의 카고 (cargo) 크기 제한에 의해 결정될 수 있다.
염기 편집기의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 배양물 중에 또는 숙주에서 바이러스를 특이적 세포에 표적화시키고 바이러스 페이로드를 핵 또는 숙주 세포 게놈으로 트래픽킹하기 위해 고도로 변화된 공정을 이용한다. 바이러스 벡터는 배양물 중에 세포에 또는 환자 (생체내)에 직접 투여될 수 있거나, 이들은 시험관내에서 세포를 처리하기 위해 사용될 수 있고, 변형된 세포는 임의로 환자 (생체외)에게 투여될 수 있다. 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위해 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 숙주 게놈 내 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 연관된 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하고 이는 흔히 삽입된 전이유전자의 장기 발현을 유도한다. 추가로, 높은 형질도입 효율은 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.
바이러스 벡터는 렌티바이러스 (예를 들어, HIV 및 FIV-기반 벡터), 아데노바이러스 (예를 들어, AD100), 레트로바이러스 (예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, MML-V), 헤르페스바이러스 벡터 (예를 들어, HSV-2), 및 아데노 연합된 바이러스 (AAV), 또는 다른 플라스미드 또는 바이러스 벡터 유형을 포함할 수 있고 이는 특히, 예를 들어, 미국 특허 제8,454,972호 (아데노바이러스에 대한 제형, 용량), 미국 특허 제8,404,658호 (AAV에 대한 제형, 용량) 및 미국 특허 제5,846,946호 (DNA 플라스미드에 대한 제형, 용량)로부터 및 임상 시험, 및 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스를 포함하는 임상 시험에 관한 공보로부터의 제형 및 용량을 사용한다. 예를 들어, AAV에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제8,454,972호 및 AAV를 포함하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 아데노바이러스에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제8,404,658호 및 아데노바이러스를 포함하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 플라스미드 전달에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제5,846,946호 및 플라스미드를 포함하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 용량은 평균 70 kg 개체 (예를 들어, 남성 성인 인간)를 기준으로 하거나 추정될 수 있고, 상이한 체중 및 종의 환자, 대상체, 포유류에 대해 조정될 수 있다. 투여 빈도는 연령, 성별, 일반적인 건강, 환자 또는 대상체의 기타 상태, 다루어지는 특정 상태 또는 증상을 포함한 일반적인 요인에 따라 의료 또는 수의사 (예: 의사, 수의사)의 범위 내이다. 바이러스 벡터는 관심 대상의 조직에 주사될 수 있다. 세포-유형 특이적 염기 편집을 위해, 염기 편집기 및 임의의 가이드 핵산의 발현은 세포-유형 특이적 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
레트로바이러스의 지향성은 외래 외피 단백질을 통합하여 표적 세포의 잠재적인 표적 집단을 확장함으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입하거나 감염시킬 수 있고 일반적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 따라서 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6-10 kb의 외래 서열에 대한 패키징 용량을 갖는 시스 작용 긴 말단 반복체로 구성된다. 최소 시스 작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 상기 벡터는 치료학적 유전자를 표적 세포에 통합하여 영구적인 전이유전자 발현을 제공하기 위해 사용된다. 광범위하게 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV), 기본 에이프 백혈병 바이러스 (GaLV: gibbon ape leukemia virus), 시미안 면역 결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 및 이들의 조합을 기반으로 하는 것들을 포함한다 (참조: 예를 들어, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).
레트로바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터는 표적 세포로의 효율적인 통합을 위해 소정의 길이 보다 작은 폴리뉴클레오타이드 서열을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 9 kb 초과 길이의 레트로바이러스 벡터는 보다 작은 크기의 것들과 비교하여 낮은 바이러스 역가를 유도할 수 있다. 일부 양상에서, 본원 개시내용의 염기 편집기는 레트로바이러스 벡터를 통한 표적 세포로의 효율적인 패키징 및 전달을 가능하게 하기 위해 충분한 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 가이드 핵산 및/또는 표적화할 수 있는 뉴클레아제 시스템의 기타 성분들과 함께 발견되는 경우에도 효율적인 팩킹 및 전달을 가능하게 하기 위한 크기를 갖는다.
일과성 발현이 바람직한 적용에서 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 효율로 형질도입할 수 있고 세포 분열을 요구하지 않는다. 상기 벡터를 사용하여 고역가 및 고수준의 발현이 수득되었다. 상기 벡터는 상대적으로 단순한 시스템에서 대량으로 생성될 수 있다. 아데노 연관된 바이러스 ("AAV") 벡터는 또한 예를 들어, 핵산 및 펩타이드의 시험관내 생성에서 그리고 생체내 및 생체외 유전자 치료요법 과정을 위해 표적 핵산을 세포에 형질도입하기 위해 사용될 수 있다 (참조: 예를 들어, West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. Patent No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)). 재조합 AAV 벡터의 작제는 문헌 (참조: 미국 특허 제5,173,414호; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); and Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989))을 포함하는 다수의 공보에 기재되어 있다.
AAV는 파르보바이러스 패밀리에 속하는 작은 단일 가닥의 DNA 의존성 바이러스이다. 4.7 kb 야생형 (wt) AAV 게놈은 각각 4개의 복제 단백질과 3개의 캡시드 단백질을 암호화하는 2개의 유전자로 구성되고, 145-bp 역위 말단 반복체 (ITR)에 의해 양측면 상에 플랭킹된다. 비리온은 동일한 개방 판독 프레임의로부터 이지만 상이한 스플라이싱 (Vp1) 및 대안적 해독 개시 부위 (각각 Vp2 및 Vp3)로부터 1:1:10의 비율로 생성되는 3개의 캡시드 단백질인 Vp1, Vp2, 및 Vp3으로 구성된다. Vp3은 비리온에서 가장 풍부한 서브유닛이고 바이러스의 지향성을 한정하는 세포 표면에서 수용체 인지에 관여한다. 바이러스 감염성에 기능하는 포스포리파제 도메인은 Vp1의 고유 N 말단에서 동정되었다.
wt AAV와 유사하게, 재조합 AAV (rAAV)는 벡터 전이유전자 카세트를 플랭킹하기 위해 시스-작용- 145-bp ITR을 사용하고 외래 DNA의 패키징을 위해 최대 4.5 kb를 제공한다. 감염에 이어서, rAAV는 본원 개시내용의 융합 단백질을 발현할 수 있고 환형 헤드 투 테일 컨카테머로 에피좀적으로 존재함에 의해 숙주 게놈으로의 통합 없이 지속할 수 있다. 상기 시험관내 및 생체내 시스템을 사용한 다수의 rAAV 성공 사례가 있지만, 제한된 패키징 능력은 유전자의 암호화 서열의 길이가 wt AAV 게놈과 크기에 동일하거나 이 보다 큰 경우 AAV-매개된 유전자 전달의 용도를 제한하였다.
바이러스 벡터는 상기 적용을 기준으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 생체내 유전자 전달을 위해, AAV는 다른 바이러스 벡터 보다 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV는 낮은 독성을 가능하게 하고, 이는 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 세포 입자의 초원심분리를 필요로 하지 않는 정제 방법으로 인한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, AAV는 이것이 숙주 게놈에 통합하지 않기 때문에 삽입 돌연변이를 유발할 가능성을 낮게 한다. 아데노바이러스는 통상적으로 이들이 유도하는 강한 면역원성 반응 때문에 백신으로서 사용된다. 바이러스 벡터의 패키징 능력은 벡터에 패키징될 수 있는 염기 편집기의 크기를 제한할 수 있다.
AAV는 2개의 145개 염기 역위 말단 반복체 (ITR)를 포함하는 약 4.5 Kb 또는 4.75 Kb의 패키징 능력을 갖는다. 이것은 프로모터 뿐만 아니라 기재된 염기 편집기를 의미하고 전사 터미네이터는 단일 바이러스 벡터에 피팅될 수 있다. 4.5 또는 4.75 Kb보다 큰 작제물은 유의적으로 감소된 바이러스 생성을 유도할 수 있다. 예를 들어, SpCas9는 매우 크고, 유전자 자체는 4.1 Kb 초과이고, 이는 AAV에 팩킹되기 어렵게 한다. 따라서, 본원 개시내용의 구현예는 통상적인 염기 편집기 보다 길이가 보다 짧은 기재된 염기 편집기를 사용함을 포함한다. 일부 예에서, 염기 편집기는 4 kb 미만이다. 기재된 염기 편집기는 4.5 kb, 4.4 kb, 4.3 kb, 4.2 kb, 4.1 kb, 4 kb, 3.9 kb, 3.8 kb, 3.7 kb, 3.6 kb, 3.5 kb, 3.4 kb, 3.3 kb, 3.2 kb, 3.1 kb, 3 kb, 2.9 kb, 2.8 kb, 2.7 kb, 2.6 kb, 2.5 kb, 2 kb, 또는 1.5 kb 미만일 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 염기 편집기는 4.5 kb 이하의 길이이다.
AAV는 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 당업자는 표적화될 세포에 관련하여 AAV의 유형을 선택할 수 있고; 예를 들어, 당업자는 뇌 또는 신경 세포를 표적화하기 위해 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합을 선택할 수 있고; 당업자는 심장 조직을 표적화하기 위해 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간으로의 전달을 위해 유용하다. 이들 세포에 관한 특정 AAV 혈청형의 목록은 문헌 (참조: Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008))에서 찾을 수 있다.
렌티바이러스는 유사분열 및 유사분열 후 세포 둘 다에서 이들의 유전자를 감염시키고 발현하는 능력을 갖는 복합 레트로바이러스이다. 가장 통상적으로 공지된 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)이고, 이는 광범위한 세포 유형을 표적화하기 위해 기타 바이러스의 외피 당단백질을 사용한다.
렌티바이러스는 다음과 같이 제조될 수 있다. pCasES10 (렌티바이러스 전달 플라스미드 골격을 함유하는)을 클로닝 한 후, 낮은 계대 (p=5)에서 HEK293FT는 T-75 플라스크에 씨딩하고 10% 태아 소 혈청을 갖고 항생제가 없는 DMEM에서 형질감염시키기전 날에 50% 컨플루언스하도록 하였다. 20시간 후, 배지는 OptiMEM (무혈청) 배지로 갈아주고 형질감염은 4시간 후 수행하였다. 세포는 10 μg의 렌티바이러스 전달 플라스미드 (pCasES10) 및 하기의 패키징 플라스미드로 형질감염시킨다: 5 μg의 pMD2.G (VSV-g 슈도타입), 및 7.5 μg의 psPAX2 (gag/pol/rev/tat). 형질감염은 양이온성 지질 전달제 (50 μl의 리포펙타민 2000 및 100 ul의 플러스 시약 (Plus reagent))을 갖는 4 mL OptiMEM에서 수행할 수 있다. 6시간 후, 배지는 10% 태아 소 혈청을 갖는 무항생제 DMEM으로 갈아준다. 이들 방법은 세포 배양 동안에 혈청을 사용하지만 무혈청 방법이 바람직하다.
렌티바이러스는 다음과 같이 정제될 수 있다. 바이러스 상등액은 48시간 후 수거한다. 상등액은 먼저 파쇄물을 제거하고 0.45 μm 낮은 단백질 결합 (PVDF) 필터를 통해 여과하였다. 이어서, 이들을 24,000 rpm에서 2시간 동안 원심분리에서 회전시킨다. 바이러스 펠렛은 4℃에서 밤새 50μl의 DMEM에서 재현탁시킨다. 이어서, 이들을 분취하고 즉시 -80℃에서 동결시킨다.
또 다른 구현예에서, 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV)를 기반으로 하는 최소 비-영장류 렌티바이러스 벡터가 또한 고려된다. 또 다른 구현예에서, RetinoStat.RTM은 망막하 주사를 통해 전달되는 것으로 고려되는 혈관신생 억제 단백질 엔도스타틴 및 안지오스타틴을 발현하는 말 감염성 빈혈 바이러스 기반 렌티바이러스 유전자 치료요법 벡터이다. 또 다른 구현예에서, 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터의 사용이 고려된다.
시스템의 임의의 RNA, 예를 들어, 가이드 RNA 또는 염기 편집기-암호화 mRNA는 RNA 형태로 전달될 수 있다. 염기 편집기-암호화 mRNA는 시험관내 전사를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 mRNA는 하기의 요소들을 함유하는 PCR 카세트를 사용하여 합성될 수 있다: T7 프로모터, 선택적 kozak 서열 (GCCACC), 뉴클레아제 서열, 및 3' UTR, 예를 들어, 베타 글로빈-폴리A 테일로부터의 3' UTR. 카세트는 T7 폴리머라제에 의한 전사를 위해 사용될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, gRNA)는 또한 T7 프로모터에 이어서 서열 "GG", 및 가이드 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 카세트로부터의 시험관내 전사를 사용하여 전사될 수 있다.
발현을 증진시키고 가능한 독성을 감소시키기 위해, 염기 편집기-암호화 서열 및/또는 가이드 핵산은 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하도록, 예를 들어, 슈도-U 또는 5-메틸-C를 사용하여 변형될 수 있다.
AAV 벡터의 작은 패키징 능력은 상기 크기를 초과하는 다수의 유전자의 전달 및/또는 큰 생리학적 조절 요소들의 사용을 어렵게 한다. 이들 과제는 예를 들어, 전달될 단백질(들)을 2개 이상의 단편으로 나눔으로써 해결될 수 있고, 여기서, 상기 N-말단 단편은 스플릿 인테인-N으로 융합되고, C-말단 단편은 스플릿 인테인-C에 융합된다. 이어서, 이들 단편은 2개 이상의 AAV 벡터로 패키징된다. 본원에 사용된 바와 같은, "인테인"은 플랭킹 N-말단 및 C-말단 익스테인 (예를 들어, 연결될 단편)을 연결하는 자가 스플라이싱 인트론 (예를 들어, 펩타이드)을 언급한다. 이종성 단백질 단편을 연결하기 위한 특정 인테인의 용도는 예를 들어, 문헌 (참조: Wood et al., J. Biol. Chem. 289(21); 14512-9 (2014))에 기재되어 있다. 예를 들어, 단백질 단편을 분리하기 위해 융합되는 경우, 인테인 IntN 및 IntC는 서로 인지하고, 이들 자체를 스플라이스 제거하고 이들이 융합된 단백질 단편의 플랭킹 N- 및 C-말단 엑스테인을 동시 연결하여 2개의 단백질 단편으로부터 전장 단백질을 재구성한다. 다른 적합한 인테인은 당업자에게 자명할 것이다.
본원 개시내용의 융합 단백질의 단편은 길이가 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 2개 아미노산 내지 약 1000개 아미노산 길이의 범위이다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 약 5개 아미노산 내지 약 500개 아미노산 길이의 범위이다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 약 20개 아미노산 내지 약 200개 아미노산 길이의 범위이다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 약 10개 아미노산 내지 약 100개 아미노산 길이의 범위이다. 다른 길이의 적합한 단백질 단편은 당업자에게 자명할 것이다.
하나의 구현예에서, 이중 AAV 벡터는 대형 전이유전자 발현 카세트를 2개의 개별 반쪽 (5' 및 3' 말단, 또는 헤드 및 테일)으로 스플릿팅함에 의해 생성하고, 여기서, 상기 카세트의 각각의 반쪽은 단일 AAV 벡터 (<5 kb)에 패키징된다. 이어서 전장 전이유전자 발현 카세트의 재어셈블리는 이중 AAV 벡터 둘 다에 이어서 다음과 같은 것들에 의한 동일한 세포의 동시 감염시 성취된다: (1) 5' 및 3' 게놈 (이중 AAV 중첩 벡터) 간의 상동성 재조합 (HR); (2) 5' 및 3' 게놈의 ITR-매개된 테일 투 헤드 컨카테머화 (이중 AAV 트랜스-스플라이싱 벡터); 또는 (3) 이들 2개의 기전의 조합 (이중 AAV 하이브리드 벡터). 생체내 이중 AAV 벡터의 사용은 전장 단백질의 발현을 유도한다. 이중 AAV 벡터 플랫폼의 사용은 크기가 >4.7 kb인 전이유전자에 대해 효율적이고 실행 가능한 유전자 전달 전략을 제공한다.
인테인
일부 구현예에서, 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)의 일부 또는 단편은 인테인에 융합된다. 뉴클레아제는 인테인의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 부분 또는 단편은 인테인에 융합되고 AAV 캡시드 단백질에 융합된다. 인테인, 뉴클레아제 및 캡시드 단백질은 함께 임의의 정렬(예를 들어, 뉴클레아제-인테인-캡시드, 인테인-뉴클레아제-캡시드, 캡시드-인테인-뉴클레아제 등)로 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 인테인의 N-말단은 융합 단백질의 C-말단에 융합되고 인테인의 C-말단은 AAV 캡시드 단백질의 N-말단에 융합된다.
인테인 (개재 단백질)은 다양한 유기체에서 발견되는 자동 처리 도메인으로, 단백질 스플라이싱으로 공지된 공정을 수행한다. 단백질 스플라이싱은 펩타이드 결합의 절단 및 형성 둘 다로 구성된 다단계 생화학적 반응이다. 단백질 스플라이싱의 내인성 기질은 인테인 함유 유기체에서 발견되는 단백질이지만, 인테인은 또한 실제로 임의의 폴리펩타이드 골격을 화학적으로 조작하기 위해 사용될 수 있다.
단백질 스플라이싱에서, 인테인은 그 자체를 2개의 펩타이드 결합을 절단함에 의해 전구체 폴리펩타이드로부터 절제 제거됨으로써 새로운 펩타이드 결합의 형성을 통해 플랭킹 익스테인 (외부 단백질) 서열을 연결한다. 상기 재정렬은 해독 후 (또는 능히 해독과 동시에) 일어난다. 인테인-매개된 단백질 스플라이싱은 자발적으로 일어나고 단지 인테인 도메인의 폴딩을 요구한다.
인테인의 약 5%는 스플릿 인테인이고, 이는 전사되어 2개의 별도의 폴리펩타이드인 N-인테인 및 C-인테인으로서 해독되고, 이의 각각은 하나의 익스테인에 융합된다. 해독 시, 인테인 단편은 자발적으로 및 비공유적으로 카노니칼 인테인 구조로 어셈블리하여 트랜스로 단백질 스플라이싱을 수행한다. 단백질 스플라이싱의 기전은 일련의 아실-전달 반응을 가능하게 하여 이는 인테인-익스테인 접합부에서 2개의 펩타이드 결합의 절단 및 N- 및 C-익스테인 간의 새로운 펩타이드 결합의 형성을 유도한다. 상기 공정은 N-익스테인과 인테인의 N-말단을 연결하는 펩타이드 결합의 활성화에 의해 개시된다. 실제로 모든 인테인은 C-말단 N-익스테인 잔기의 카보닐 탄소를 공격하는 이들의 N-말단에서 시스테인 또는 세린을 갖는다. 상기 N의 O/S 아실로의 전환은 통상적으로 발견되는 아스파르테이트와 함께 보존된 트레오닌 및 히스티딘 (TXXH 모티프로서 언급됨)에 의해 촉진되어, 선형 (티오)에스테르 중간체의 형성을 초래한다. 이어서, 상기 중간체는 시스테인, 세린 또는 트레오닌인 제1 C-익스테인 잔기 (+1)의 친핵성 공격에 의한 트랜스-(티오) 에스테르화에 적용한다. 수득한 분지된 (티오)에스테르 중간체는 고유 전환을 통해 분리된다: 인테인의 고도로 보존된 C-말단 아스파라긴의 폐환. 상기 공정은 히스티딘 (고도로 보존된 HNF 모티프에서 발견되는) 및 끝에서 두번째 히스티딘에 의해 촉진되고, 또한 아스파르테이트를 포함할 수 있다. 이러한 숙신이미드 형성 반응은 인테인을 반응 복합체로부터 절제하고 비-펩타이드 연결을 통해 부탁된 익스테인을 잔류시킨다. 상기 구조는 신속하게 인테인-독립적 양상으로 안정한 펩타이드 결합으로 재정렬한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기 (예를 들어, ABE, CBE)의 N-말단 단편은 스플릿 인테인-N에 융합되고, C-말단 단편은 스플릿 인테인-C에 융합된다. 이어서 이들 단편은 2개 이상의 AAV 벡터로 패키징된다. 이종성 단백질 단편을 연결하기 위한 특정 인테인의 용도는 예를 들어, 문헌 (참조: Wood et al., J. Biol. Chem. 289(21); 14512-9 (2014))에 기재되어 있다. 예를 들어, 단백질 단편을 분리하기 위해 융합되는 경우, 인테인 IntN 및 IntC는 서로 인지하고, 이들 자체를 스플라이스 제거하고 이들이 융합된 단백질 단편의 플랭킹 N- 및 C-말단 엑스테인을 동시 연결하여 2개의 단백질 단편으로부터 전장 단백질을 재구성한다. 다른 적합한 인테인은 당업자에게 자명할 것이다.
일부 구현예에서, ABE는 SpCas9의 선택된 영역 내 Ala, Ser, Thr, 또는 Cys 잔기에서 N- 및 C-말단 단편으로 스플릿하였다. 이들 영역은 Cas9 결정 구조 분석에 의해 동정된 루프 영역에 상응한다. 각각의 단편의 N-말단은 인테인-N에 융합되고, 각각의 단편의 C-말단은 하기 서열 중 굵은 대문자로 지적된 아미노산 위치 S303, T310, T313, S355, A456, S460, A463, T466, S469, T472, T474, C574, S577, A589, 및 S590에서 인테인 C에 융합된다.
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돌연변이를 표적화하기 위한 핵염기 편집기의 용도
돌연변이를 표적화하는 핵염기 편집기의 적합성은 본원에 기재된 바와 같이 평가한다. 하나의 구현예에서, 관심 대상의 단일 세포에는 리포터 (예를 들어, GFP)를 암호화하는 소량의 벡터와 함께 염기 편집 시스템을 형질도입하였다. 이들 세포는 불멸화된 인간 세포주, 예를 들어, 293T, K562 또는 U20S을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 세포주일 수 있다. 대안적으로, 1차 세포 (예를 들어, 인간)가 사용될 수 있다. 상기 세포는 궁극적인 세포 표적과 관련될 수 있다.
전달은 바이러스 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 형질감염은 지질 형질감염(예를 들어, 리포펙타민 또는 푸겐)을 사용하여 또는 전기천공에 의해 수행될 수 있다. 형질감염 후, GFP의 발현은 형광성 현미경 또는 유동 세포측정에 의해 결정되어 일정하고 고수준의 형질감염을 확인할 수 있다. 이들 예비 형질감염은 상이한 핵염기 편집기를 포함하여 편집기의 어느 조합이 최대 활성을 부여하는지를 결정할 수 있다.
핵염기 편집기의 활성은 본원에 기재된 바와 같이, 즉 세포의 게놈을 서열분석하여 표적 서열 내 변경을 검출함에 의해 평가한다. 생거 서열분석을 위해, 정제된 PCR 앰플리콘은 플라스미드 골격에 클로닝하고, 형질전환시키고, 소량분리하고 단일 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 서열분석은 또한 차세대 서열분석 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 차세대 서열분석을 사용하는 경우, 앰플리콘은 300-500bp일 수 있고 의도된 절단 부위는 비대칭으로 위치한다. PCR 후, 차세대 서열분석 어댑터 및 바코드 (예를 들어, 일루미나 멀티플렉스 어댑터 및 인덱스)는 앰플리콘의 말단에, 예를 들어, 고속처리 서열분석 (예를 들어, 일루미나 MiSeq 상에서)에 사용하기 위해 부가될 수 있다.
초기 시험에서 최대 수준의 표적 특이적 변경을 유도하는 융합 단백질은 추가의 평가를 위해 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 핵염기 편집기를 사용하여 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 표적화한다. 하나의 구현예에서, 본원 개시내용의 핵염기 편집기는 세포의 게놈 내 관심 대상의 돌연변이를 표적화하기 위해 사용되는 가이드 RNA와 함께 세포 (예를 들어, 조혈 세포 또는 이들의 선조체, 조혈 줄기 세포 및/또는 유도된 만능 줄기 세포)에 전달되어 돌연변이를 변경한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 가이드 RNA에 의해 표적화되어 관심 대상의 유전자 서열에 하나 이상의 편집을 도입한다.
시스템은 하나 이상의 상이한 벡터를 포함할 수 있다. 하나의 양상에서, 염기 편집기는 목적하는 세포 유형, 바람직하게 진핵 세포, 바람직하게 포유동물 세포 또는 인간 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
일반적으로, 코돈 최적화는 본래의 서열의 적어도 하나의 코돈 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을 본래의 아미노산 서열을 유지하면서 숙주 세포의 유전자에 보다 흔하게 또는 가장 흔하게 사용되는 코돈으로 대체함에 의해 관심 대상의 숙주 세포에서 증진된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 공정을 언급한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향 (유기체 간의 코돈 용법에서의 차이)은 흔히 전령 RNA(mRNA)의 해독 효율과 상관관계가 있고, 이는 이어서 무엇 보다 해독되는 코돈의 성질 및 특정 운반 RNA(tRNA) 분자의 가용성에 의존하는 것으로 사료된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 흔하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 소정의 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다. 코돈 용법 표는 예를 들어, 웹사이트 (www.kazusa.orjp/codon/ (visited Jul. 9, 2002))에 가용한 "코돈 용법 데이터베이스"에서 용이하게 가용하고, 이들 표는 다수의 방식으로 적용될 수 있다. 문헌 (Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000))을 참조한다. 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화하기 위한 컴퓨터 알고리즘 또한 가용하고, 예를 들어, 유전자 포르지 (Gene Forge) (Aptagen; Jacobus, Pa.) 또한 가용하다. 일부 구현예에서, 가공된 뉴클레아제를 암호화하는 서열에서 하나 이상의 코돈 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 자주 사용되는 코돈에 상응한다.
패키징 세포는 전형적으로 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하기 위해 사용된다. 상기 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293개 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 psi.2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료요법에 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자에 패키징하는 세포주를 생성함에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주로의 후속 통합을 위해 요구되는 최소 바이러스 서열을 포함하고, 기타 바이러스 서열은 발현된 폴리뉴클레오타이드(들)에 대한 발현 카세트에 의해 대체된다. 상실된 바이러스 기능은 전형적으로 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 게놈으로의 통합을 위해 요구되는 AAV 게놈으로부터의 ITR 서열만을 갖는다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉, rep 및 cap를 암호화하지만 ITR 서열이 부재인 헬퍼 플라스미드를 포함하는 세포주에 패키징될 수 있다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있다. 헬퍼 플라스미드는 일부 경우에 ITR 서열의 부재로 인해 상당량으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV 보다 더 민감한 열처리에 의해 감소될 수 있다.
멀티-이펙터 핵염기 편집기를 위한 적용
멀티-이펙터 핵염기 편집기를 사용하여 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 표적화하여 단백질 발현을 변형하는 변경을 생성할 수 있다. 하나의 구현예에서, 멀티-이펙터 핵염기 편집기는 스플라이스 부위, 인핸서, 및 전사 조절 요소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 비-암호화 또는 조절 서열을 변형시키는 데 사용된다. 이어서, 조절 요소에 의해 제어되는 유전자의 발현에 대한 변경의 효과는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검정된다. 특정 구현예에서, 멀티-이펙터 핵염기 편집기는 조절 서열을 실질적으로 변경함으로써 유전자 발현을 조절하는 이의 능력을 없앨 수 있다. 유리하게는, 이것은 다른 RNA-프로그래밍 가능한 뉴클레아제와 대조적으로 게놈 표적 서열에서 이중-가닥 파손을 생성하지 않고 수행될 수 있다.
멀티-이펙터 핵염기 편집기는를 사용하여 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 표적화하여 단백질 활성을 변형하는 변경을 생성할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발의 맥락에서, 멀티-이펙터 핵염기 편집기는 오류가 발생하기 쉬운 PCR 및 기타 폴리머라제-기반 방법에 비해 많은 이점이 있다. 본원 개시내용의 멀티-이펙터 핵염기 편집기는 표적 영역에서의 다중 염기에서 변경을 생성하기 때문에, 상기 돌연변이는 오류가 발생하기 쉬운 PCR에 의해 도입된 돌연변이에 비해 단백질 수준에서 발현될 가능성이 더 높으며, 이는 코돈에서의 단일 뉴클레오타이드 변화가 여전히 동일한 아미노산을 암호화할 수 있다는 점을 감안할 때 단백질 수준에서 발현될 가능성이 적다 (예를 들어, 코돈 축퇴성). 폴리뉴클레오타이드 전반에 걸쳐 무작위 변경을 유도하는 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 달리, 본원 개시내용의 멀티-이펙터 핵염기 편집기는 관심 대상의 단백질의 작거나 정의된 영역 내의 특정 아미노산을 표적화하는 데 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원 개시내용의 멀티-이펙터 핵염기 편집기는 유기체의 게놈 내의 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는데 사용된다. 하나의 구현예에서, 유기체는 미생물군집 (microbiome)의 세균 (예를 들어, 박테리오데테스 (Bacteriodetes), 베루코마이크로비아 (Verrucomicrobia), 피르미쿠테스 (Firmicutes); 감마프로테오박테리아 (Gammaproteobacteria), 알파프로테오박테리아 (Alphaproteobacteria), 박테리오데테스 (Bacteriodetes), 클로스트리디아 (Clostridia), 에리시펠로트리키아 (Erysipelotrichia), 바실리 (Bacilli); 엔테로박테리알레스 (Enterobacteriales), 박테리오달레스 (Bacteriodales), 베루코마이크로바이알레스 (Verrucomicrobiales), 클로스트리디알레스 (Clostridiales), 에리시오펠로트리칼레스 (Erysiopelotrichales), 락토바실라레스 (Lactobacillales); 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 박테리오다세아에 (Bacteroidaceae), 에리시오펠로트리카세아에 (Erysiopelotrichaceae), 프레보텔라세아에 (Prevotellaceae), 코리오박테리아세아에 (Coriobacteriaceae), 및 알칼리게나세아에 (Alcaligenaceae), 에스케리키아 (Escherichia), 박테로이데스 (Bacteroides), 알리스트리페스 (Alistipes), 아케르만시아 (Akkermansia), 클로스트리듐 (Clostridium), 락토바실러스 (Lactobacillus))이다. 또 다른 구현예에서, 유기체는 농업적으로 중요한 동물 (예를 들어, 소, 양, 염소, 말, 닭, 칠면조) 또는 식물 (예를 들어, 대두, 밀, 옥수수, 쌀, 담배, 사과, 포도, 복숭아, 자두, 체리)이다. 하나의 구현예에서, 본원 개시내용의 멀티-이펙터 핵염기 편집기는 세포의 게놈 내의 다양한 서열을 타일링하는 데 사용되는 가이드 RNA 라이브러리와 함께 세포에 전달되어 게놈 전체에 걸쳐 서열을 체계적으로 변경한다.
돌연변이는 구조 기능 분석을 용이하게 하거나 단백질의 내인성 활성을 변경하기 위해 다양한 단백질에서 이루어질 수 있다. 돌연변이는 예를 들어, 효소 (예를 들어, 키나제, 포스파타제, 카복실라제, 포스포디에스테라제) 또는 효소 기질, 수용체 또는 이의 리간드, 및 항체 및 이의 항원에서 이루어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 멀티-이펙터 핵염기 편집기는 효소의 활성 부위, 수용체의 리간드 결합 부위, 또는 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)을 암호화하는 핵산 분자를 표적으로 한다. 효소의 경우, 활성 부위에 돌연변이를 유도하면 효소의 활성이 증가, 감소 또는 소멸될 수 있다. 효소에 대한 돌연변이의 효과는 당업계에 공지된 및/또는 당업자에게 자명할 임의의 다수의 검정을 포함하는 효소 활성 검정을 특징으로 한다. 수용체의 경우, 리간드 결합 부위에서 이루어진 돌연변이는 이의 리간드에 대한 수용체 친화성을 증가, 감소 또는 폐지할 수 있다. 상기 돌연변이의 효과는 당업계에 공지된 및/또는 숙련가에게 자명할 다수의 검정을 포함하는 수용체/리간드 결합 검정에서 검정된다.
합성 라이브러리
본원에서는 융합 단백질 라이브러리 및 카노니칼 염기 편집기와 비교하여 또 다른 바람직한 염기 편집 윈도우를 가능하게 하는 염기 편집을 최적화하기 위해 융합 단백질 라이브러리를 사용하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 다수의 융합 단백질을 포함하는 최적화된 염기 편집을 위한 단백질 라이브러리를 제공하고, 여기서, 상기 다수의 융합 단백질 각각의 하나는 Cas9 폴리펩타이드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 데아미나제를 포함하고, 상기 융합 단백질의 각각의 하나의 N-말단 단편은 상기 다수의 나머지 융합 단백질의 N-말단 단편과는 상이하거나 상기 융합 단백질의 각각의 하나의 C-말단 단편은 상기 다수의 나머지 융합 단백질의 C-말단 단편과는 상이하고, 상기 융합 단백질의 각각의 하나의 데아미나제는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열 내 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열에 근접한 표적 핵염기를 탈아민화시키고, N 말단 단편 또는 C 말단 단편은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, CRISPR R-루프 내 각각의 핵염기에 대해, 다수의 융합 단백질 중 적어도 하나는 핵염기를 탈아민화시킨다. 일부 구현예에서, PAM으로부터 1 내지 20개 염기 쌍으로 떨어진 표적 폴리뉴클레오타이드 내 각각의 핵염기에 대해, 다수의 융합 단백질 중 적어도 하나는 핵염기를 탈아민화시킨다. 일부 구현예에서, 본원에서는 최적화된 염기 편집을 가능하게 하는 융합 단백질 라이브러리를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 대립유전자, 에를 들어, TadA 대립유전자의 합성 라이브러리는 변형된 염기 편집 효율 및/또는 특이성으로 아데노신 염기 편집기를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 라이브러리로부터 생성된 아데노신 염기 편집기는 보다 높은 염기 편집 효율 및/또는 특이성을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 라이브러리로부터 생성된 아데노신 염기 편집기는 야생형 TadA를 갖는 아데노신 염기 편집기와 비교하여 증가된 염기 편집 효율, 증가된 염기 편집 특이성, 감소된 표적-이탈 편집, 감소된 방관자 편집, 감소된 삽입-결실 형성, 및/또는 감소된 스퓨리어스 편집을 나타낸다. 일부 구현예에서, 합성 라이브러리로부터 생성된 아데노신 염기 편집기는 TadA*7.10을 갖는 아데노신 염기 편집기와 비교하여 증가된 염기 편집 효율, 증가된 염기 편집 특이성, 감소된 표적-이탈 편집, 감소된 방관자 편집, 감소된 삽입-결실 형성, 및/또는 감소된 스퓨리어스 편집을 나타낸다. 일부 구현예에서, 합성 라이브러리는 ABE의 무작위화된 TadA 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 라이브러리는 TadA의 각각의 위치에서 모든 20개 카노니칼 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 라이브러리는 라이브러리 구성원 당 1-2개 뉴클레오타이드 치환 돌연변이의 평균 빈도를 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 라이브러리는 TadA*7.10에서 발견된 기본 돌연변이를 포함한다.
약제학적 조성물
본원 개시내용의 다른 양상은 본원에 기재된 임의의 염기 편집기, 융합 단백질 또는 융합 단백질-가이드 폴리뉴클레오타이드 복합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적 조성물"은 약제학적 용도를 위해 제형화된 조성물을 언급한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 추가의 제제 (예를 들어, 특이적 전달을 위해, 반감기를 증가시키기 위해 또는 다른 치료학적 화합물을 위해)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 신체의 하나의 부위 (예를 들어, 전달 부위)로부터 또 다른 부위 (예를 들어, 신체의 기관, 조직 또는 일부)로 화합물을 운반하거나 수송하는데 관여하는, 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제 (예를 들어, 윤활제, 탈크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이고 대상체의 조직에 해롭지 않다 (예를 들어, 생리학적 상용성, 멸균 또는 생리학적 pH 등)는 의미에서 "허용되는"이다.
약제학적으로 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예를 들어, 락토스, 글루코스 및 슈크로스; (2) 전분, 예를 들어, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 겔라틴; (7) 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 및 탈크; (8) 부형제, 예를 들어, 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예를 들어, 땅콩유, 면화씨유, 잇꽃유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); (12) 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열성 물질 제거수; (17) 등장성 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 다중무수물; (22) 벌크제, 예를 들어, 폴리펩타이드 및 아미노산; (23) 혈청 알콜, 예를 들어, 에탄올; 및 (23) 약제학적 제형에 사용되는 다른 비독성 상용성 물질. 습윤화제, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제, 방향제, 보존제 및 항산화제는 또한 제형 중에 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "약제학적으로 허용되는 담체", "비히클" 등과 같은 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
약제학적 조성물은 약 5.0 내지 약 8.0 범위에서와 같이 생리학적 pH를 반영하는 소정의 수준에서 제형의 pH를 유지하기 위해 하나 이상의 pH 완충 화합물을 포함할 수 있다. 수성 액체 제형에 사용되는 pH 완충 화합물은 아미노산 또는 아미노산의 혼합물, 예를 들어, 히스티딘, 또는 히스티딘 및 글라이신과 같은 아미노산의 혼합물일 수 있다. 대안적으로, pH 완충 화합물은 바람직하게는 약 5.0 내지 약 8.0의 범위에서와 같이 소정의 수준에서 제형의 pH를 유지하고 칼슘 이온을 킬레이팅하지 않는 제제이다. 상기 pH 완충 화합물의 예시적 예는 이미다졸 및 아세테이트 이온을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. pH 완충 화합물은 소정의 수준에서 제형의 pH를 유지하기에 적합한 임의의 양으로 존재할 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 삼투 조절제, 즉, 제형의 삼투 성질 (예를 들어, 등장성, 삼투압 및/또는 삼투 압력)을 수용자 개체의 혈류 및 혈액 세포에 허용되는 수준까지 조절하는 화합물을 함유할 수 있다. 삼투 조절제는 칼슘 이온을 킬레이팅하지 않는 제제일 수 있다. 삼투 조절제는 제형의 삼투 성질을 조절하는 당업자에게 공지되거나 가용한 임의의 화합물일 수 있다. 당업자는 경험적으로 본 발명의 제형에 사용하기 위해 소정의 삼투 조절제의 적합성을 결정할 수 있다. 삼투 조절제의 적합한 유형의 예시적인 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 염, 예를 들어, 염화나트륨 및 나트륨 아세테이트; 당, 예를 들어, 슈크로스, 덱스트로스, 및 만니톨; 아미노산, 예를 들어, 글라이신; 및 하나 이상의 이들 제제의 혼합물 및/또는 제제의 유형. 삼투 조절제(들)는 제형의 삼투 성질을 조절하기에 충분한 임의의 농도로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체에게 전달히기 위해, 예를 들어, 유전자 편집을 위해 제형화된다. 본원에 기재된 약제학적 조성물을 투여하는 적합한 경로는 제한 없이 다음을 포함한다: 국소, 피하, 경피, 피내, 병변내, 관절내, 복막내, 혈관내, 경점막, 잇몸, 치아내, 와우내, 경고막, 기관내, 경막외, 척수강내, 근육내, 정맥내, 혈관내, 골내, 안주변, 종양내, 뇌내 및 뇌실내 투여.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 국소적으로 환부 (예를 들어, 종양 부위)에 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 이식체에 의해 대상체에게 투여되고, 이식체는 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질이고, 이는 막, 예를 들어, 시알라스틱 막 또는 섬유를 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 조절 방출 시스템으로 전달된다. 하나의 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (참조: 예를 들어, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 또 다른 구현예에서, 중합체 물질을 사용할 수 있다 (참조: 예를 들어, Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61.). 또한 문헌 (참조: Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et ah, 1989, J. Neurosurg. 71: 105.)을 참조한다. 다른 조절 방출 시스템은 예를 들어, 상기 문헌 (Langer)에서 논의된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체, 예를 들어, 인간에게 정맥내 또는 피하 투여를 위해 적합한 조성물로서 통상의 과정에 따라 제형화된다. 일부 구현예에서, 주사에 의한 투여용 약제학적 조성물은 가용화제로서 멸균 등장성 용도에서의 용제 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 리도카인과 같은 국소 마취제이다. 일반적으로, 성분은 별도로 또는 단일 투여 형태로 함께 혼합되어 공급되고, 예를 들어, 활성제의 양을 지적하는 앰푸울 또는 샤쉐와 같은 기밀하게 밀봉된 컨테이너에 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 공급된다. 약제가 주입에 의해 투여되어야만 하는 경우, 멸균 약제학적 등급수 또는 식염수를 함유하는 주입병으로 분배될 수 있다. 약제학적 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰푸울이 제공되어 성분들은 투여 전 혼합될 수 있다.
전신 투여를 위한 약제학적 조성물은 액체, 예를 들어, 멸균 식염수, 락테이트화된 링거 또는 행크 용액일 수 있다. 추가로, 약제학적 조성물은 고체 형태일 수 있고 사용 직전 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태가 또한 고려된다. 약제학적 조성물은 또한 비경구 투여를 위해 적합한 리포좀 또는 미세결정과 같은 지질 입자 또는 소포 내에 함유될 수 있다. 입자는 조성물이 그 안에 함유되어 있는 한, 단층 또는 다층과 같은 임의의 적합한 구조일 수 있다. 화합물은 푸소겐성 지질 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 저수준 (5-10 mol%)의 양이온성 지질을 함유하는 "안정화된 플라스미드-지질 입자" (SPLP)에 포집될 수 있고, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 코팅에 의해 안정화될 수 있다 (참조: Zhang Y. P. et ah, Gene Ther. 1999, 6: 1438-47). 양전하 지질, 예를 들어, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸설페이트, 또는 "DOTAP"는 특히 상기 입자 및 소포를 위해 바람직하다. 상기 지질 입자의 제조는 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,880,635호; 제4,906,477호; 제4,911,928호; 제4,917,951호; 제4,920,016호; 및 제4,921,757호를 참조하고; 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 예를 들어, 유닛 용량으로서 투여되거나 패키징될 수 있다. 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 참조로 사용되는 경우 용어 "유닛 용량"은 대상체에 대한 유닛 용량으로서 적합한 물리적으로 구분된 유닛을 언급하고, 각각의 유닛은 요구되는 희석제; 즉, 담체 또는 비히클과 연합된 목적하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다.
추가로, 약제학적 조성물은 (a) 동결건조된 형태로 본원 개시내용의 화합물을 함유하는 컨테이너 및 (b) 약제학적으로 허용되는 희석제 (예를 들어, 본원 개시내용의 동결건조된 화합물의 재구성 또는 희석을 위해 사용되는 멸균성)를 함유하는 제2 컨테이너를 포함하는 약제학적 키트로서 제공될 수 있다. 임의로 이러한 용기(들)는, 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지와 관련되어 있으며, 당해 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영한다.
또 다른 양상에서, 상기된 질환의 치료를 위해 유용한 물질을 함유하는 제품이 포함된다. 일부 구현예에서, 제품은 컨테이너 및 표지를 포함한다. 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 시험 튜브를 포함한다. 상기 컨테이너들은 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 컨테이너는 본원에 기재된 질환을 치료하기 위해 효과적인 조성물을 유지하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 컨테이너는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다. 조성물 중에 활성제는 본원 개시내용의 화합물이다. 일부 구현예에서, 컨테이너 상에 또는 이와 연합된 표지는 조성물이 선택된 질환을 치료하기 위해 사용됨을 지적한다. 제품은 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액, 또는 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 융합 단백질, gRNA, 및/또는 복합체는 약제학적 조성물의 일부로서 제공된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 제공된 임의의 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 gRNA와 양이온성 지질과 복합체를 형성하는 RNA-가이드된 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)를 포함하는 리보핵산단백질 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 gRNA, 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질, 양이온성 지질, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 약제학적 조성물은 임의로 하나 이상의 추가의 치료학적 활성 물질을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 대상체에, 예를 들어, 인간 대상체에 투여되어 대상체 내 표적화된 게놈 변형을 수행한다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 수득되고 본원에 제공된 임의의 약제학적 조성물과 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 대상체로부터 제거되고 약제학적 조성물과 생체외 접촉된 세포는 임의로 목적하는 게놈 변형이 세포에서 수행되거나 검출된 후 대상체에 재도입한다. 뉴클레아제를 포함하는 약제학적 조성물을 전달하는 방법은 공지되어 있고 예를 들어, 미국 특허 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호에 기재되어 있고, 상기 문헌의 모든 개시내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 비록 본원에 제공된 약제학적 조성물의 기재가 원칙적으로 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물 또는 유기체에 수의학적 용도로 투여하기에 적합하다는 것은 당업자라면 이해할 것이다.
각종 동물에게 투여하기에 적합한 조성물을 제공하기 위해서 사람에게 투여하는데 적합한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되고, 통상의 수의학 약리학자는 존재하는 경우 단지 통상적인 실험으로 이러한 변형을 디자인 및/또는 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 래트와 같은 포유류, 가정용 동물, 애완동물 및 상업 관련 포유동물; 및/또는 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조와 같은 상업 관련 조류를 포함한 조류를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에 공지되거나 이후에 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분(들)을 부형제 및/또는 하나 이상의 기타 보조 성분과 연관시키고, 이어서 필요에 따라 및/또는 경우에 따라 생성물을 목적하는 단일 또는 다중 복용량 단위로 성형 및/또는 패키징하는 단계를 포함한다. 약제학적 제형은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이것은 목적하는 특정 투여 형태에 적합한, 본원에서 사용되는 바와 같이 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산물 또는 현탁액 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함한다. 문헌 (참조: Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; 이의 전문은 본원에 참조로 포함됨))은 약제학적 조성물을 제형화하는데 사용되는 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시한다. 또한, 문헌 (PCT 출원 PCT/US2010/055131 (공개번호 WO2011/053982 A8, 2010년 11월 2일 출원됨)은 뉴클레아제를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 추가의 적합한 방법, 시약, 부형제 및 용매에 대해 본원에 참조로 포함된다.
임의의 통상적인 부형제 매질이, 예를 들면, 임의의 바람직하지 못한 생물학적 효과를 생성하거나 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 물질 또는 이의 유도체와 상용성이 아닌 경우를 제외하고는 이의 용도는 본원의 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
상기된 바와 같은 조성물은 유효량으로 투여될 수 있다. 유효량은 투여 방식, 치료받는 특정 병태 및 목적하는 결과에 의존한다. 이것은 또한 병태 단계, 대상체의 연령 및 신체 조건, 존재하는 경우 동시 치료요법의 특성, 및 개업 의사에게 널리 공지된 유사 인자에 의존할 수 있다. 치료학적 적용을 위해, 이것은 의학적으로 목적하는 결과를 성취하기에 충분한 양이다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용에 따른 조성물은 임의의 다양한 질환, 장애 및/또는 병태의 치료를 위해 사용될 수 있다.
키트
본원 개시내용의 다양한 양상은 염기 편집기 시스템을 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 키트는 핵염기 편집기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함한다. 융합 단백질은 데아미나제 (예를 들어, 아데닌 데아미나제) 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 관심 대상의 핵산 분자를 표적화할 수 있는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 적어도 하나의 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함한다.
키트는 일부 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이를 편집하기 위해 키트를 사용하기 위한 지침서를 제공한다. 상기 지침서는 일반적으로 핵산 분자를 편집하기 위한 키트의 용도에 대한 정보를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 지침서는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 주의사항; 경고; 임상 연구; 및/또는 참조. 지침서는 컨테이너 (존재하는 경우) 상에 직접 인쇄될 수 있거나, 표지로서 컨테이너에 적용되거나 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로서 컨테이너 내 또는 이와 함께 공급될 수 있다. 추가의 구현예에서, 키트는 적합한 작동 파라미터를 위해 표지 또는 별도의 삽입물 (패키지 삽입물)의 형태로 지침서를 포함할 수 있다. 여전히 또 다른 구현예에서, 키트는 검출, 계산 또는 정규화를 위해 표준물(들)로서 사용될 적당한 양성 및 음성 대조군 또는 대조군 샘플을 갖는 하나 이상의 컨테이너를 포함할 수 있다. 키트는 (멸균) 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액, 또는 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본원 개시내용의 수행은 달리 지적되지 않는 경우 통상적인 분자 생물학 기술 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기술을 사용하고, 이들 기술들은 당업자의 범위 내에 있다. 상기 기술은 문헌 (참조: 예를 들어, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)에 자세히 설명되어 있다. 이들 기술은 본원 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 생성에 적용될 수 있고, 예를 들어, 본원 개시내용을 제조하고 수행하는데 고려될 수 있다. 특정 구현예에 대해 특히 유용한 기술은 하기의 섹션에서 논의될 것이다.
하기 실시예들은 본 발명의 검정, 스크리닝 및 치료학적 방법을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시내용 및 기재를 사용하여 당업자에게 제공하기 위해 제시하는 것이지, 본 발명자들이 본 발명으로 간주하는 범위를 한정하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 증가된 편집 효율을 갖는 아데노신 염기 편집기
Tad7.10-dCas9 융합 단백질을 포함하는 염기 편집 시스템은 대략 10-20% 효율로 표적 폴리뉴클레오타이드를 편집할 수 있지만 보다 높은 효율을 요구하는 용도에 대해서는 이들의 사용이 제한될 수 있다. 증가된 효율 및 특이성을 갖는 아데닌 염기 편집기를 동정하기 위해, 아데노신 데아미나제 TadA 7.10을 포함하는 작제물은 오류 성향 PCR로 돌연변이유발시키고 이어서 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질인 dCas9를 암호화하는 핵산 서열에 인접한 발현 벡터에 클로닝하였다 (도 1a, 도 2b). 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 발현 벡터는 클로람페니콜 내성 (CamR) 및 스트렙토마이신 내성 (SpectR)을 암호화하고 2개 점 돌연변이 (변화 라운드 7 전략)에 의해 비기능성이된 가나마이신 내성 유전자를 갖는 선택 플라스미드와 함께 컴피턴트 세균 세포에 동시 형질감염시켰다 (도 1b, 도 2b). 세포는 가나마이신 내성의 복구에 대해 선택되었고 이는 아데노신 데아미나제 활성에 대해 판독되었다. 후속 라운드의 선택에서, 발현 벡터는 클로람페니콜 내성 (CamR) 및 스트렙토마이신 내성 (SpectR)을 암호화하고 3개 점 돌연변이 (변화 라운드 8 전략)에 의해 비기능성이된 가나마이신 내성 유전자를 갖는 플라스미드와 함께 컴피턴트 세포에 동시 형질감염시켰다 (도 1c, 도 2b). 불활성화된 가나마이신 내성 유전자 핵산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00275
상기 서열에서, 소문자는 가나마이신 내성 프로모터 영역을 나타내고, 굵게 표시된 서열은 표적화된 불활성화 부분 (Q4* 및 W15*)을 지적하고, 이탤릭 서열은 가나마이신 내성 유전자 (D208N)의 표적화된 불활성 부위를 지칭하고, 밑줄친 서열은 PAM 서열을 지칭한다.
다시, 세포는 증가하는 가나마이신 농도와 함께 일련의 아가로스 플레이트 상에 분주하였다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, 효율적인 염기 편집 활성을 갖는 아데노신 데아미나제 변이체는 가나마이신 내성 유전자에 존재하는 돌연변이를 보정할 수 있었고 추가의 분석을 위해 선택되었다. 세균 세포에서 효율적인 염기 편집을 보여주는 아데노신 데아미나제 변이체 염기 편집기는 표 14에 기재되어 있다. 선택된 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 염기 편집기를 암호화하는 포유동물 발현 벡터를 제조하였다.
E6V (또한 E7V로 호칭됨) 돌연변이를 함유하는 겸상 혈구 세포 질환과 연관된 β-글로빈 단백질을 발현하는 Hek293T 세포를 사용하여 아데노신 데아미나제 변이체의 편집 효율을 시험하였다 (도 3a 및 3b). "Hek293T/HBBE6V" 세포로 호칭되는 이들 세포에는 표 14에 열거된 ABE8을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 염기 편집 시스템을 발현하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하였다. ABE8은 아데노신 데아미나제 변이체를 환형의 퍼뮤턴트 Cas9 및 양분된 핵 국소화 서열을 포함하는 스캐폴드에 클로닝함에 의해 생성되었다. 환형의 퍼뮤턴트 Cas9는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 (참조: Oakes et al., Cell 176, 254-267, 2019)에 기재되어 있다. 이들 서열은 하기 본원에 제공된다.
태아 헤모글로빈의 상향조절은 겸상 혈구 세포 질환을 극복하기 위한 치료학적 접근법이다. 도 3a는 태아 헤모글로빈의 상향조절을 위한 치료학적 관련 부위를 보여준다. 잔기 5 및 8에서 아데노신 편집은 BCL11A 결합을 유의적으로 감소시킴으로써 태아 헤모글로빈의 발현을 증가시킬 수 있다. 도 3a를 참조하면, ABE8은 ABE7.10 보다 대략 2-3배 보다 높은 염기 편집 활성을 나타내었다.
[표 14] 신규 아데닌 염기 편집기 ABE8
Figure pct00276
도 4를 참조하면, ABE8은 HBB E6V를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 18, 19, 20, 21, 또는 22개 뉴클레오타이드 가이드 RNA와 함께 Hek293T/HBBE6V 세포에 도입하였다. ABE8 편집기는 환형 퍼뮤턴트 (Cp)-Cas9에 융합된 경우 증가된 편집 효율을 보여주었다. 총체적으로, 40개의 상이한 ABE8 작제물 (표 15) 및 3개의 ABE7.10 작제물은 Hek293T/HBBE6V 세포에서 편집 활성을 위해 시험하였다. 예시적인 작제물의 서열은 다음과 같다. 편집 특이성을 평가하기 위해, 표적 및 비의도되거나 방관자 돌연변이를 모니터링하였다 (도 5). 코돈 5에서 아데노신의 비의도된 편집은 사일런트하였다. 그러나, 코돈 9의 비의도된 편집은 세린의 프롤린으로의 돌연변이를 유도하였다. 다시 도 5를 참조하면, 다중 ABE8은 ABE7.10 편집기와 비교하여 증가된 편집 효율 및 특이성을 보여주었고, 편집기의 어떠한 것도 세린의 프롤린으로의 미스센스 돌연변이를 유도하는 유의적 방관자 편집을 갖지 않았다.
선택된 ABE8 및 ABE7.10 대조군의 추가의 분석은 겸상 혈구 세포 돌연변이를 함유하는 섬유아세포에서 수행하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, ABE8 편집기는 ABE7.10과 비교하여 증가된 염기 편집 활성을 가졌다. ABE8.18은 대략 70% 효율을 보여주었다. 선택된 ABE8 편집기는 또한 전례없는 특이성을 나타냈다. 중요하게, 모든 ABE8 편집기에 대한 평균 삽입-결실 형성은 0.1% 미만이었다.
[표 15]
Figure pct00277
Figure pct00278
실시예 2: ABE8 디자인을 위한 코돈 최적화 및 NLS 선택
Cas9 코돈 용법 및 핵 국소화 서열이 진핵 세포에서 게놈 편집 효율을 급격히 변경할 수 있음이 확립되었다 (참조: 예를 들어, Kim, S. et al., Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides. Genome Biol 18, 218, doi:10.1186/s13059-017-1355-3 (2017); Mikami, M. et al., Comparison of CRISPR/Cas9 expression constructs for efficient targeted mutagenesis in rice. Plant Mol Biol 88, 561-572, doi:10.1007/s11103-015-0342-x (2015); Jinek, M. et al., RNA-programmed genome editing in human cells. Elife 2, e00471, doi:10.7554/eLife.00471 (2013)). 염기 편집기의 본래의 Cas9n 성분은 6개의 잠재적 폴리아데닐화 부위를 함유하여, 진핵 세포에서 불량한 발현을 유도한다 (참조: 예를 들어, Kim, S. et al., Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides. Genome Biol 18, 218, doi:10.1186/s13059-017-1355-3 (2017); Komor, A. C. et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946 (2016); Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017)). 이를 광범위하게 최적화된 코돈 서열로의 대체는 염기 편집 효율을 개선시킨다 (참조: 예를 들어, Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823, doi:10.1126/science.1231143 (2013); Koblan, L. W. et al. Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nat Biotechnol, doi:10.1038/nbt.4172 (2018); Zafra, M. P. et al. Optimized base editors enable efficient editing in cells, organoids and mice. Nat Biotechnol, doi:10.1038/nbt.4194 (2018)).
이 모두가 코돈-최적화된 Cas9 (D10A)를 함유하는, 4개의 ABE 작제물과 연관된 DNA 표적-적중 (도 9a, 9b), DNA 표적-이탈 (도 9c, 9d) 및 RNA 표적-이탈 (도 9e) 염기 편집 빈도를 평가하였다 (참조: Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823, doi:10.1126/science.1231143 (2013)): i) 단일 C-말단 BP-SV40 NLS를 갖는 ABE7.10; ii) ABE7.10의 5' TadA 야생형 부분이 부재인 모노BE7.10; iii) 코돈-최적화된 TadA 영역 및 2개의 BPNLS 서열을 함유하는 ABEmax; 및 iv) ABEmax로서 TadA 코돈 최적화를 갖지만 C-말단 BP-SV40 NLS를 함유하는 ABEmax(-BPNLS).
모든 4개의 작제물은 현저히 유사한 표적-적중 편집 효율을 나타냈고, 이는 NLS 구조 및 TadA 코돈 최적화가 표적-적중 편집 효율을 결정하지 않음을 지적한다 (도 9a, 9b). 표적-이탈 프로필은 또한 고도로 유사하지만 ABEmax는 ABE7.10과 비교하는 경우 하나의 부위에서 유의적으로 보다 큰 DNA 표적-이탈 편집 (p=0.00027, 스튜던트 양측 T 시험 (Students' two-tailed T test))을 나타냈다 (도 9c, 9d). ABEmax(-NBPNLS)는 ABE7.10 보다 1.6배 큰 RNA 표적-이탈 편집의 평균 빈도를 나타냈다 (도 9e). 2x BPNLS와 함께 표적-적중 편집 효율에는 어떠한 차이도 없었다.
실시예 3: 확장된 표적화 범위를 갖는 보다 우수한 아데닌 염기 편집기
아데닌 염기 편집기 (ABE)는 이중 가닥 절단 (DSB)을 생성하는 것 없이 표적 DNA에서 아데닌의 구아닌으로의 효율적인 프로그래밍 가능한 전환을 가능하게 한다 (참조: Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017); Komor, A. C., et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946 (2016); Rees, H. A. & Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet 19, 770-788, doi:10.1038/s41576-018-0059-1 (2018)). ABE는 촉매적으로-손상된 Cas9 단백질(D10A 닉카제 Cas9, nCas9)에 공유적으로 융합된 변화된 이. 콜리 tRNAARG 변형 효소인 TadA를 포함하는 분자 기구이다 (도 7a 및 7b). 가이드 RNA (gRNA)는 ABE를 표적 게놈 DNA 서열로 지시하고, 결합 및 안정한 R-루프 형성시, 짧은 스트레치의 단일 가닥의 뉴클레오타이드는 TadA에 접근가능하게 되고, 이는 화학적으로 아데닌을 이노신으로 전환시킨다. 이노신은 배타적으로 DNA 폴리머라제 결합 포켓에서 시토신과 염기쌍을 형성하여 (참조: Yasui, M. et al. Miscoding properties of 2'-deoxyinosine, a nitric oxide-derived DNA Adduct, during translesion synthesis catalyzed by human DNA polymerases. J Mol Biol 377, 1015-1023, doi:10.1016/j.jmb.2008.01.033 (2008)), DNA 복제 또는 가닥 절제 및 닉 복구 후 사용자-한정된 염기-쌍에서 ABE-촉매된 AㆍT에서 GㆍC로의 전환 돌연변이를 유도한다 (도 7a).
제7 세대 ABE (ABE7)는 인간 (참조: Zeng, Y. et al. Correction of the Marfan Syndrome Pathogenic FBN1 Mutation by Base Editing in Human Cells and Heterozygous Embryos. Molecular Therapy, doi:10.1016/j.ymthe.2018.08.007 (2018)), 마우스 (참조: Liu, Z. et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nat Commun 9, 2717, doi:10.1038/s41467-018-05232-2 (2018); Song, C.-Q. et al. Adenine base editing in an adult mouse model of tyrosinaemia. Nature Biomedical Engineering, doi:10.1038/s41551-019-0357-8 (2019); Ryu, S. M. et al. Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Nat Biotechnol, doi:10.1038/nbt.4148 (2018)), 세균 (참조: Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017)), 식물 (참조: Hua, K., et al. Precise A.T to G.C Base Editing in the Rice Genome. Mol Plant 11, 627-630, doi:10.1016/j.molp.2018.02.007 (2018); Yan, F. et al. Highly Efficient A.T to G.C Base Editing by Cas9n-Guided tRNA Adenosine Deaminase in Rice. Mol Plant 11, 631-634, doi:10.1016/j.molp.2018.02.008 (2018)), 및 다양한 다른 종 (참조: Rees, H. A. & Liu, D. R. Publisher Correction: Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet 19, 801, doi:10.1038/s41576-018-0068-0 (2018))의 게놈에서 효율적인 AㆍT에서 GㆍC로의 전환을 가능하게 하였다. 그러나, 일부 경우에, 예를 들어, 변형된 염기 편집 윈도우 비-NGG Cas9 변이체와의 개선된 상용성을 갖도록 (참조: 예를 들어, Huang, T. P. et al. Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors. Nat Biotechnol 37, 626-631, doi:10.1038/s41587-019-0134-y (2019); Hua, K., Tao, X. & Zhu, J. K. Expanding the base editing scope in rice by using Cas9 variants. Plant Biotechnol J, doi:10.1111/pbi.12993 (2018); Yang, L. et al. Increasing targeting scope of adenosine base editors in mouse and rat embryos through fusion of TadA deaminase with Cas9 variants. Protein Cell 9, 814-819, doi:10.1007/s13238-018-0568-x (2018)), 예를 들어, 인간 세포주에서 개선된 염기 편집 효율을 갖도록 (참조: 예를 들어, Rees, H. A., et al. Development of hRad51-Cas9 nickase fusions that mediate HDR without double-stranded breaks. Nat Commun 10, 2212, doi:10.1038/s41467-019-09983-4 (2019)) 또는 생체내 사용되는 경우 (참조: 예를 들어, Ryu, S. M. et al. Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Nat Biotechnol, doi:10.1038/nbt.4148 (2018)) 및/또는 표적 아데닌이 카노니칼 ABE 편집 윈도우의 외부 엣지 상에 위치하는 경우 (위치 3, 4, 7 및 8) ABE7과 같은 염기 편집기를 가공하는 것이 이로울 수 있다.
이전의 아데닌 염기 편집기를 개선하기 위해, 세균 선택 시스템의 엄중도 (참조: Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017))는 항생제 선택으로부터 생존하기 위해 3개의 동시 AㆍT에서 GㆍC로의 복귀 편집을 만들어야 하는 ABE를 디자인함에 의해 증가되었다 (도 2b 및 2c). 선행 기술의 ABE 변화에서, TadA 라이브러리는 오류 성향 PCR을 통해 생성되었다. 대조적으로, TadA의 각각의 위치에서 모든 20개 카노니칼 아미노산 치환을 함유하는 TadA 대립유전자의 합성 라이브러리가 사용되었고, 라이브러리 구성원 당 1-2개 뉴클레오타이드 치환 돌연변이의 평균 빈도를 갖는다 (도 7c). 상기 합성적으로-합성된 라이브러리는 오류-성향 PCR 기술로 성취할 수 있는 것 보다 큰 서열 공간으로의 접근을 가능하게 하였다 (참조: Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017)).
약 300개 클론을 단리하였고 후속적으로 서열분석하였다. 수득한 서열분석 데이터로부터, 8개의 돌연변이는 높은 빈도로 집적된 TadA* 내에서 동정되었다 (표 7 및 9). 8개의 동정된 아미노산 돌연변이 중 6개는 코돈 당 적어도 2개의 핵염기 변화를 요구하였고, 이는 선행 기술의 오류 성향 라이브러리를 사용해서는 관찰되지 않았다. 집적된 돌연변이 중 2개는 아데닌 탈아민화의 활성 부위 (I76 및 V82)에 근접한 잔기를 변경한다 (도 7d). TadA*7.10의 C-말단 알파 나선에서 4개의 이전에 보고된 돌연변이에 추가로, 2개의 새로운 돌연변이는 동일한 알파-나선 (Y147R 및 Q154R) 내에서 관찰되었다 (도 7d). 상기 고도로 돌연변이된 알파-나선은 절단 시 염기 편집 효율이 실질적으로 감소되기 때문에 강한 생성물 형성을 위해 필요하다 (도 10a-10d).
포유동물 세포에서 TadA* 변이체의 활성을 시험하기 위해, ABE 코돈 최적화 및 NLS 배향은 가장 선호될 수 있는 온- 및 표적-이탈 프로필과 함께 사용되었다 (실시예 2; 도 9a-9e 참조). 8개 편집된 TadA* 돌연변이는 다양한 조합으로 ABE7.10에 혼입하여, 40개의 새로운 ABE8 변이체를 생성한다 (표 7 및 9). ABE8 작제물의 2개의 구조적 변이체는 ABE의 TadA 영역이 야생형 (TadA) 및 변화된 (TadA*) 프로모터 또는 가공된 TadA*의 단일 프로모터의 이종이량체 융합인 경우 제조하여 약 500개 염기쌍의 보다 작은 편집기를 수득하였다. 이들 구조적 변이체는 각각 ABE8.x-d 및 ABE8.x-m으로서 언급된다 (표 7 및 9).
첫 째, 이들 40개 작제물은 카노니칼 20-nt 에스. 피오게네스 프로토스페이서 내 2 내지 20개 범위의 위치 (여기서, NGG PAM= 위치 21, 22, 23)에서 표적 "A" 염기를 함유하는 8개 게놈 부위에 걸쳐 ABE7.10에 상대적인 이들의 표적-적중 DNA 편집 효율에 대해 평가하였다 (도 11a 및 11b). N-말단 야생형 TadA 작제물은 ABE8을 사용한 강한 DNA 편집을 위해 필요하지 않았다 (참조: Grunewald, J. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nat Biotechnol 37, 1041-1048, doi:10.1038/s41587-019-0236-6 (2019); Rees, H. A., et al. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717, doi:10.1126/sciadv.aax5717 (2019); Hua, K. et al. Simplified adenine base editors improve adenine base editing efficiency in rice. Plant Biotechnol J, doi:10.1111/pbi.13244 (2019)). N-말단의 야생형 TadA (ABE8.x-d)를 함유하는 작제물은 이의 경제화된 구조 (ABE8.x-m)에 상대적으로 편집 윈도우 선호도, 총 DNA 편집 결과 및 삽입-결실 빈도 모두의 측면에서 유사하게 수행한다 (도 7e, 도 11a 및 11b, 도 12). 내부-작제물 TadA(wt):TadA*8 이량체화는 ABE8 활성을 위해 필요할 수 없지만, 식물 핵에서 관찰된 바와 같이 ABE8 발현된 염기 편집기 사이에 존재하는 인 트랜스 TadA*8:TadA*8 이량체화의 가능성을 배제하지 않는다 (참조: Hua, K. et al. Simplified adenine base editors improve adenine base editing efficiency in rice. Plant Biotechnol J, doi:10.1111/pbi.13244 (2019)).
NGG-PAM 부위에서, ABE8은 ABE7.10과 비교하여, 카노니칼 위치 (A5-A7)에서 약 1.5x 보다 높은 편집 및 비-카노니칼 위치 (A3-A4, A8-A10)에서 약 3.2x 보다 높은 편집을 유도한다 (도 13). 비-NGG PAM 변이체를 사용한 ABE8 편집은 ABE7.10 보다 약 4.2배의 전체 표적-적중 편집을 유도하였다. 표적의 서열, 표적 윈도우 내 "A"의 위치, 및 ABE8 작제물 자체의 서열 동일성은 편집 효율에 영향을 미칠 수 있는 모든 인자이다 (도 7e, 도 11a 및 11b, 도 13). 종합적으로, 시험된 모든 부위에서 모든 위치에 걸쳐 편빚에서의 메디안 변화는 ABE7.10과 비교하여 1.94배 (1.34-4.49의 범위)이다. 편집 윈도우에 걸친 ABE8의 증가된 활성은 ClinVar 데이터베이스에서 동정된 추가의 ~3000 초과의 질환-연관된 돌연변이의 복귀를 가능하게 한다 (도 54c).
이어서, 40개 작제물의 대형 ABE8 풀로부터, ABE8 작제물 (ABE8.8-m, ABE8.13-m, ABE8.17-m, ABE8.20-m, ABE8.8-d, ABE8.13-m, ABE8.17-d 및 ABE8.20-d)의 서브 세트는 보다 상세하게 평가하기 위해 선택되었다. 이들 작제물은 계층적 클러스터링 분석을 통한 결정시 8개 게놈 부위 중에 편집 수행능에서의 특유의 차이를 갖는 ABE8을 나타낸다 (도 14). 이들 ABE8은 시험된 모든 게놈 부위에서 ABE7.10을 능가하고 (P-값 = 0.0006871, 양측면 윌콕손 랭크 합계 시험 (two-tailed Wilcoxon rank sum test)) ABE8 지시된 변화 캠페인으로부터 동정된 다양한 돌연변이 조합을 포함한다 (도 15a 및 도 15b 및 도 16a 및 16b).
비-NGG PAM을 인지하는 ABE 변이체가 기재되었지만, 이들 작제물의 편집 효율은 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) Cas9 표적화 NGG PAM 서열을 사용하여 관찰된 결과와 비교하는 경우 많은 경우에 감소한다 (참조: 예를 들어, Huang, T. P. et al. Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors. Nat Biotechnol 37, 626-631, doi:10.1038/s41587-019-0134-y (2019); Hua, K. et al., Expanding the base editing scope in rice by using Cas9 variants. Plant Biotechnol J, doi:10.1111/pbi.12993 (2018); Yang, L. et al., Increasing targeting scope of adenosine base editors in mouse and rat embryos through fusion of TadA deaminase with Cas9 variants. Protein Cell 9, 814-819, doi:10.1007/s13238-018-0568-x (2018)). 변화된 데아미나제가 또한 비-NGG PAM을 함유하는 표적 부위에서 편집 효율을 증가시키는지의 여부를 결정하기 위해, 에스. 피오게네스 (S. Pyogenes) Cas9가 가공된 에스 피 (S. py.) 변이체, NG-Cas9 (PAM: NG)로 대체된 ABE8 편집기를 생성하였다 (참조: Nishimasu, H. et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science (2018)) or Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9, PAM: NNGRRT) (Ran, F. A. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186-191, doi:10.1038/nature14299 (2015)). 메디안 증가는 SpCas9-NG (NG-ABE8.x-m/d) 및 SaCas9 (Sa-ABE8.x-m/d) 둘 다에 대해 ABE8 변이체를 ABE7.10과 비교하는 경우, 각각 1,6배 및 2.0배의 AㆍT에서 GㆍC로의 편집 빈도에서 관찰되었다 (도 8a, 8b, 및 17-20). SpCas9-ABE8과 유사하게, 비-NGG PAM 변이체에 대한 ABE7.10과 ABE8 작제물 간의 편집 효율에서의 최대 차이는 편집 윈도우 내 바람직한 위치의 주변에 위치한 표적 A 위치에서 관찰된다 (에스. 피오게네스 (S. Pyogenes): 위치 4-8; 에스. 아우레우스 (S. Aureus): 위치 6-13; 참조: 또한 Rees, H. A. & Liu, D. R., Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet 19, 770-788, doi:10.1038/s41576-018-0059-1 (2018)). 비-NGG PAM을 사용하는 ABE8 오톨로그는 효율적인 A 염기 편집을 위한 표적화 범위를 광범위하게 한다.
최소의 삽입-결실 형성이 필요한 적용을 위해, Cas9의 촉매적으로 손상된 D10A 닉카제 돌연변이체의 촉매적으로 "데드" 버젼의 Cas9 (D10A + H840A)로의 대체 효과 (참조: Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821, doi:10.1126/science.1225829 (2012))는 코어 8개 ABE8 작제물 ("dC9-ABE8.x-m/d")에서 연구되었다. ABE에서 닉카제의 데드 Cas9로의 대체에 의해, 삽입-결실 빈도에서의 >90% 감소는 ABE7.10에 상대적으로 dC9-ABE8 변이체에 대해 관찰되었지만 상당히 보다 높은 (2.1배), 표적-적중 DNA 편집 효율 (도 8c, 21a 및 22b, 22a 및 22b, 23a-23d)을 유지한다. 기본 초과의 삽입-결실이 관찰되었지만, 빈도는 시험된 부위에서 단지 0.3-0.8% 범위이다. dC9-ABE8 변이체는 카노니칼 ABE8에 상대적으로 표적-적중 DNA 편집 효율에서 메디안 14% 감소했다.
표적-적중 유전자좌에서 또 다른 부류의 목적하지 않은 ABE-매개된 게놈 편집은 ABE-의존성 시토신에서 우라실로 (CㆍG에서 TㆍA로)의 전환일 수 있다 (참조: Grunewald, J. et al., CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nat Biotechnol 37, 1041-1048, doi:10.1038/s41587-019-0236-6 (2019); Lee, C. et al. CRISPR-Pass: Gene Rescue of Nonsense Mutations Using Adenine Base Editors. Mol Ther 27, 1364-1371, doi:10.1016/j.ymthe.2019.05.013 (2019)). 시험된 8개 표적 부위에서, C-에서 T-로의 편집의 95 퍼센트는 ABE8 변이체와 함께 0.45%이고, ABE7.10-d 또는 -m과 함께 0.15%인 것으로 측정되었고, 이는 ABE를 사용한 표적-적중 시토신 탈아민화가 일어날 수 있지만, 빈도는 일반적으로 매우 낮음을 지적한다 (도 24). 따라서, ABE8은 A에서 T로의 전환을 위해 높은 활성을 보유한다.
실시예 4: ABE8 작제물에 의한 DNA 표적-적중 및 sgRNA-의존성 DNA 표적-이탈 편집은 DNA에 대한 특이성을 개선시킨다
모든 염기 편집기와 관련하여, ABE8은 게놈 및 전사체에서 표적-이탈 유전자좌에서 작용하는 잠재력을 갖는다 (참조: 예를 들어, Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017); Komor, A. C., et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946 (2016); Grunewald, J. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nat Biotechnol 37, 1041-1048, doi:10.1038/s41587-019-0236-6 (2019); Rees, H. A., et al., Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717, doi:10.1126/sciadv.aax5717 (2019); Rees, H. A. et al. Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery. Nat Commun 8, 15790, doi:10.1038/ncomms15790 (2017); Jin, S. et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science 364, 292-295, doi:10.1126/science.aaw7166 (2019); Zuo, E. et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science 364, 289-292, doi:10.1126/science.aav9973 (2019); Lee, H. K., et al., Cytosine but not adenine base editor generates mutations in mice. Biorxiv, doi:https://doi.org/10.1101/731927 (2019); Grunewald, J. et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature 569, 433-437, doi:10.1038/s41586-019-1161-z (2019); Zhou, C. et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature 571, 275-278, doi:10.1038/s41586-019-1314-0 (2019)).
게놈 DNA 내 4개의 표적-적중에서 (도 25a 및 25b) 및 12개의 이전에 동정된 sgRNA-연합된 표적-이탈 유전자좌에서의 염기 편집 (참조: Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol 33, 187-197, doi:10.1038/nbt.3117 (2015)) (도 25e 및 25f)을 측정하였고, 이 모두는 HEK293T 세포에서 진정한 Cas9 표적-이탈 유전자좌인 것으로 확인되었다 (도 26). 표적-적중 유전자좌에서 이들의 증가된 활성으로부터 예상된 바와 같이, ABE8 작제물은 ABE7.10 보다 3-6배 큰 DNA 표적-이탈 편집 빈도를 나타낸다. 이것은 ABE8 작제물에 대한 주의 사항이지만, sgRNA의 신중한 선택과 분석은 sgRNA 의존적 표적-이탈 편집을 상당히 감소시킬 수 있다 (참조: Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol 33, 187-197, doi:10.1038/nbt.3117 (2015); Yeh, W. H., et al., In vivo base editing of post-mitotic sensory cells. Nat Commun 9, 2184, doi:10.1038/s41467-018-04580-3 (2018)). 다양한 sgRNA의 사용이 필요한 응용의 경우, DNA- 및 RNA-특이성 증진 V106W 돌연변이 (참조: Rees, H. A., Wilson, C., Doman, J. L. & Liu, D. R. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717, doi:10.1126/sciadv.aax5717 (2019))의 ABE8.17m의 TadA 도메인으로의 장착은 ABE7.10의 것들을 초과하는 표적-적중 편집의 수준을 유지하면서 DNA 표적-이탈 편집을 감소시킬 수 있다 (도 25c, 25d, 25g 및 25h).
ABE8의 sgRNA-독립적 표적-이탈 활성을 측정하기 위해, 세포 RNA의 표적화된 증폭 및 고속처리 서열 분석은 ABE로 처리된 HEK293T 세포에서 수행하였다 (참조: Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017); Rees, H. A., et al., Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717, doi:10.1126/sciadv.aax5717 (2019)). 본 검정에서, ABE8은 ABE7.10과 비교하여 세포성 RNA 아데노신 탈아민화의 2.3 - 5.3배 큰 평균 빈도를 나타냈다 (도 25a).
ABE8의 표적-이탈 탈아민화 효과는 스퓨리어스 RNA 오프 표적 편집을 완화시키기 위해 디자인된, 이전에 공개된 돌연변이 (참조: Grunewald, J. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nat Biotechnol 37, 1041-1048, doi:10.1038/s41587-019-0236-6 (2019); Rees, H. A., et al., Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717, doi:10.1126/sciadv.aax5717 (2019); Grunewald, J. et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature 569, 433-437, doi:10.1038/s41586-019-1161-z (2019); Zhou, C. et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature 571, 275-278, doi:10.1038/s41586-019-1314-0 (2019))를 통합함으로써 평가하였다. 이들 돌연변이는 ABE8.17-m의 데아미나제 효소의 TadA 부분으로 통합하였다. 장착된 RNA 표적-이탈 돌연변이 모두는 ABE8를 최소로 손상시키는 V106W 및 F148A와 함께 상이한 정도로 ABE8.17-m의 표적-적중 편집 빈도를 감소시켰다 (도 25c 및 25d). 이들 중에서, V106W만이 표적-이탈 RNA 및 DNA 편집의 수준을 상당히 감소시킬 수 있다 (도 25b). 따라서, V106W 돌연변이의 ABE8로의 내포는 감소된 DNA- 및 RNA-표적-이탈 탈아민화 이벤트와 함께 높은 표적-적중 편집 효율을 가능하게 할 수 있고, 세포 전사체가 회피되어야만 하거나 잡다한 sgRNA와 함께 사용하기 위한 경우 적용될 수 있다.
ABE8과 연합된 표적-이탈 편집을 포괄적으로 평가하기 위해, 온- 및 표적-이탈 편집은 게놈 DNA에서 (참조: Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol 33, 187-197, doi:10.1038/nbt.3117 (2015); 도 55c 및 55d), 및 HEK293T 세포 (도 61)에서 높은 sgRNA 연합된 Cas9 표적-이탈 활성에 대해 이전에 특징 분석된 12개 유전자좌를 표적화함에 의해 ABE7 및 ABE8에서 비교하였다. 게놈 편집 제제의 플라스미드 전달이 염기 편집 연구 목적을 위해 광범위하게 사용되지만, mRNA 전달은 1차 인간 세포를 편집하기 위해 보다 효과적이고 (참조: Hendel, A. et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol 33, 985-989, doi:10.1038/nbt.3290 (2015)), 염기 편집기에 대한 전달 방법은 이의 표적-이탈 프로필의 중요한 결정인자이다 (참조: Rees, H. A. et al. Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery. Nat Commun 8, 15790, doi:10.1038/ncomms15790 (2017)). 따라서, 플라스미드 또는 mRNA 전달의 영향은 온- 및 표적-이탈 활성에 대해 시험되었다. ABE7 및 ABE8 둘 다의 표적-적중 효율은 플라스미드 과발현에 비해 mRNA의 보다 일과성 수명에도 불구하고 ABE의 플라스미드와 mRNA 절단 간에 상응하였다. 중요하게, ABE의 세포로의 mRNA 전달은 플라스미드 전달과 비교하여 (도 55a), 특히, 표적 아데닌 염기가 편집 윈도우의 중앙 (위치 5 및 6)에 있는 경우 증가된 편집 효율 (도. 55e)을 유도하였다.
플라스미드 과발현이 염기 편집기를 위한 전달 방식으로서 사용된 경우, ABE8 작제물은 ABE7.10 보다 3 내지 6배 큰 sgRNA-의존성 DNA 표적-이탈 편집 빈도를 나타냈다 (도 55c). 현저하게, ABE가 mRNA를 사용하여 전달된 경우, ABE8 작제물과 연합된 가이드-의존성 DNA 표적-이탈 편집은 (ABE7.10-d에 대해) 평균 1.5 배 및 (ABE8.20-m에 대해, ABE7.10-d에 상대적으로 가장 과중하게 변형된 ABE8) 평균 2.2배로 감소하였다. 주지할 만하게, 비-반복 sgRNA HEK2 및 HEK3과 연합된 표적-이탈 염기 편집 활성은 mRNA 전달에 의한 0.4% 미만으로의 플라스미드 전달과 함께 상기 14%로부터 감소하였다 (도 55c 및 55d). 따라서, 높은 DNA 편집 편집 특이성을 필요로 하는 치료제 및 다른 적용을 위해, mRNA 전달, sgRNA의 주의 깊은 선택(참조: Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol 33, 187-197, doi:10.1038/nbt.3117 (2015); Yeh, W. H., et al. In vivo base editing of post-mitotic sensory cells. Nat Commun 9, 2184, doi:10.1038/s41467-018-04580-3 (2018)), 및 DNA 표적-이탈 편집 빈도를 상당히 감소시키기 위한 TadA에서 V106W 내포의 고려는 비-반복 sgRNAs HEK2 및 HEK3에 대한 음성 대조군에 유리하다 (도 55e).
이어서, ABE8과 연합된 세포성 mRNA의 스퓨리어스 탈아민화의 수준을 측정하였다. 고속 처리 방식에서 관심 대상의 모든 작제물에 대한 데이터를 생성하기 위해, 본원 발명자는 ABE로 처리된 HEK293T 세포에서 2개의 세포 RNA의 표적화된 증폭 및 고속 처리 서열분석을 개시하였다. 이전의 공개 문헌과 일치되게 (참조: Grunewald, J. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nat Biotechnol 37, 1041-1048, doi:10.1038/s41587-019-0236-6 (2019); Rees, H. A., et al. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717, doi:10.1126/sciadv.aax5717 (2019); Grunewald, J. et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature 569, 433-437, doi:10.1038/s41586-019-1161-z (2019); Zhou, C. et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature 571, 275-278, doi:10.1038/s41586-019-1314-0 (2019)), ABE7를 사용한 처리, 및 보다 큰 정도로 ABE8은 플라스미드 과발현에 의해 전달되는 경우 세포성 RNA에서 검출가능한 A-에서 I-로의 탈아민화를 유도한다 (도 55e). 그러나, mRNA 작제물로서 전달되는 경우, mRNA 탈아민화의 수준은 평균 34배 (ABE7.10-d의 경우에) 내지 134배 (ABE8.17-m)로 급격히 감소하였고 (도 55e), 이는 mRNA 전달이 세포성 RNA 편집의 빈도를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 지적한다.
실시예 5: 혈액학적 장애의 치료를 위한 아데닌 염기 편집기
ABE8 작제물은 인간 조혈 줄기 세포 (HSC)에서 평가하였다. 세포 치료요법으로서 환자로의 투여 전, HSC의 생체외 조작 및/또는 편집은 혈액학적 장애의 치료를 위해 유망한 접근법이다. ABE가 HBG1/2의 프로모터 영역의 -198 위치에서 HBG1/2의 프로모터 영역의 -198 위치에서 T에서 C로의 치환을 도입할 수 있다는 것은 이전에 입증되었다 (참조: Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017)). 상기 천연적으로 발생하는 대립유전자는 태아 헤모글로빈의 유전적 지속성 (HPFH)을 생성하여 성인기에 γ-글로빈의 수준을 증가시켜 겸상 혈구 세포 질환 및 β-지중해 빈혈에서 볼 수 있는 β-글로빈의 결함을 완화시킬 수 있다 (참조: Wienert, B. et al. KLF1 drives the expression of fetal hemoglobin in British HPFH. Blood 130, 803-807, doi:10.1182/blood-2017-02-767400 (2017)). HPFH 표현형을 재현하고 ABE8의 임상적 관련성을 평가할 목적으로, CD34+ 조혈 줄기 세포를 2명의 공여자로부터 단리하고 ABE8 편집기를 암호화하는 mRNA와 프로토스페이서 내의 위치 7에 표적 A를 위치시키는 말단 변형된 sgRNA로 형질감염시켰다.
-198 HBG1/2 프로모터 표적 부위에서 평균 ABE8 편집 효율은 조기 시점 (48h)에서 ABE7.10 작제물 보다 2-3x 높았고, 후기 시점 (144h)에서 ABE7.10 보다 1.3-2-배 높았다 (도 27b, 도 28a 및 도 28b, 도 29a 및 29b). 이러한 동력학적 차이는 세포 치료요법을 적용하기 전에 세포 배양을 최소한으로 유지해야 하는 생체외 치료요법을 위해 임상적으로 중요하다.
이어서, ABE 처리 및 적혈구 분화 후 생성된 γ-글로빈 단백질의 양은 UPLC에 의해 정량하였다 (도 30-50). ABE8 치료 그룹으로부터 유래된 적혈구에서 % γ-글로빈/α-글로빈 발현에서 3.5배 평균 증가는 모방체 처리된 세포와 비교하는 경우 관찰되었고 ABE7.10-m/d를 사용하여 성취된 수준에 대해 ABE8.13-d와 비교하는 경우 약 1.4배 증가가 관찰되었다 (도 27c). 적어도 약
Figure pct00279
20% HbF-발현 세포는 겸상 혈구 세포 질환의 증상을 개선시키기 위해 요구되고 β-지중해 빈혈 환자들은 능히 보다 높은 최소 수준을 요구한다 (참조: 예를 들어, Canver, M. C. & Orkin, S. H. Customizing the genome as therapy for the beta-hemoglobinopathies. Blood 127, 2536-2545, doi:10.1182/blood-2016-01-678128 (2016); Fitzhugh, C. D. et al. At least 20% donor myeloid chimerism is necessary to reverse the sickle phenotype after allogeneic HSCT. Blood 130, 1946-1948, doi:10.1182/blood-2017-03-772392 (2017)). ABE8 편집 후 관찰된 γ-글로빈 수준은 이들 역치 보다 높은 HbF 수준과 일치하고 ABE7.10으로 성취된 수준 보다 높았다.
전반적으로, ABE8은 γ-글로빈 유전자 HBG1 및 HBG2의 프로모터에서 천연적으로 존재하는 태아 헤모글로빈(HPFH) 대립유전자의 유전적 지속성을 재생성하여 (도 27a 참조) 인간 CD34+ 세포 배양에서 최대 60%의 편집 효율 및 분화된 적혈구에서 감마 글로빈 발현의 상응하는 상향 조절을 성취하였다.
실시예 6: 겸상 혈구 세포 질환 및 베타 지중해 빈혈의 치료를 위한 상보적 염기 편집 접근법
겸상 혈구 세포 질환 (SCD) 및 베타 지중해 빈혈은 다수의 기관 시스템에 걸쳐 중증의 빈혈 및 유의적 질환 합병증을 유도하는 베타 글로빈 생성 및 기능의 장애이다. 태아 헤모글로빈 (HbF)의 상향조절 또는 베타 글로빈 유전자의 보정을 통해 가공된 줄기 세포의 자가 이식은 베타 헤모글로빈병증을 갖는 환자에서 질환 부담을 감소시킬 잠재력을 갖는다. 염기 편집은 최근에 개발된 기술이고 이는 이중 가닥 DNA 절단의 도입 없이 게놈의 정확한 변형을 가능하게 한다.
감마 글로빈 유전자 프로모터는 HbF를 침체시키는 변화의 동정을 위해 시토신 및 아데닌 염기 편집기 (ABE)로 포괄적으로 스크리닝되었다. HbF를 유의적으로 상향 조절하는 3개 영역이 동정되었고, 가장 효과적인 뉴클레오티드 잔기 전환은 유전적 태아 헤모글로빈 (HPFH) 지속성이 있는 환자에서 볼 수 있는 천연 변이에 의해 지지된다. HBG1 및 HBG2 프로모터 내의 주요 조절 모티프에서 뉴클레오타이드 전환 후 HbF 수준을 상당히 증가시키는 ABE가 개발되었다. CD34+ 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)를 임상 규모에서 정제하고 자가 재생 능력을 보존하도록 디자인된 공정을 사용하여 편집하였다. 상이한 ABE를 사용한 2개의 독립적 부위에서의 편집은 94%에 도달하였고 UPLC에 의해 최대 63% 감마 글로빈을 유도하였다 (도 51a-51e). 관찰된 HbF의 수준은 HPFH의 임상 관찰 및 더 높은 HbF 용량과 더 약한 질병을 연결하는 비중재 치료요법에 기초하여 대다수의 SCD 및 베타 지중해 빈혈 환자를 보호해야 한다 (참조: Ngo et al., 2011 Brit J Hem; Musallam et al., 2012 Blood).
SCD의 Glu6Val 돌연변이의 직접적인 보정은 SCD 집단에 해 디자인된 유전학적 치료요법의 최근 목표였다. 현재의 염기 편집 기술은 아직 겸상 혈구 베타 글로빈에서 A-T 전환으로부터 비롯된 것들과 같은 돌연변이를 전환시킬 수 없지만, ABE 변이체는 발린의 반대쪽 가닥 아데닌 잔기를 인지하고 편집하도록 디자인되었다. 이것은 발린의 알라닌으로의 전환 및 Hb G-마카사르 (Makassar)로서 공지된 천연적으로 존재하는 변이체의 생성을 유도한다. 이 위치에 알라닌이 있는 베타 글로빈은 중합체 형성에 기여하지 않으며 Hb G-마카사르 환자는 정상적인 혈액학적 파라미터와 적혈구 형태를 나타낸다. ABE 변이체로 편집된 SCD 환자 섬유아세포는 표적 아데닌의 최대 70% 전환을 성취한다 (도 52a). 이어서, 건강한 공여자로부터의 CD34 세포는 편집 윈도우 내에 존재하고 SCD 돌연변이 편집을 위한 프록시 역할을 하는 인접 프롤린에서 동조 (synonymous) 돌연변이를 표적화하는, 리드 (lead) ABE 변이체로 편집시켰다. 평균 편집 빈도는 40%이다 (도 52b). 동종이계 이식 세팅에서 이러한 수준으로 보고된 공여자 골수 키메라 현상은 겸상 혈구 표현형을 역전시키는데 필요한 20%를 초과한다 (참조: Fitzhugh et al, 2017 Blood).
실시예 7: 전체 게놈 서열 분석
전체 게놈 서열분석 (WGS)을 수행하여 (도 56) sgRNA-독립적 방식에서 게놈-와이드 점 돌연변이 (여기서, '스퓨리어스 탈아민화'로서 언급되는)를 유도할 수 있는 정도를 평가하였고, 이는 ABE7.10 또는 Cas9가 아닌 CBE에 대해 이전에 보고된 바와 같다 (참조: Jin, S. et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science 364, 292-295, doi:10.1126/science.aaw7166 (2019); Zuo, E. et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science 364, 289-292, doi:10.1126/science.aav9973 (2019); Lee, H. K., et al. Cytosine base editor 4 but not adenine base editor generates off-target mutations in mouse embryos. Commun Biol 3, 19, doi:10.1038/s42003-019-0745-3 (2020); McGrath, E. et al. Targeting specificity of APOBEC-based cytosine base editor in human iPSCs determined by whole genome sequencing. Nat Commun 10, 5353, doi:10.1038/s41467-019-13342-8 (2019)). 따라서, HEK293T 세포는 염기 편집기-암호화 mRNA 및 sgRNA 표적화 B2M (부위 21)으로 형질감염시켰다 (도 56). 항온처리 72시간 후, 형광성 활성화된 세포 분류 (FACS)를 사용하여 성공적으로 편집된 B2M-음성 단일 세포를 단리하였다 (도 56). 단일-분류된 세포는 개별적으로 클론적으로 확장하여 충분한 게놈 DNA를 생성하여 Illumina-기반 전체 게놈 서열분석을 수행하였다. 모든 처리된 샘플은 바이-대립유전자적으로 표적-적중 B2M 유전자좌에서 편집되는 것으로 확인되었고 이는 활성 염기 편집기 또는 Cas9의 수용을 지적한다.
배아 주사 마우스 실험에서 ABE7.10-d-처리된 동물로부터의 이전의 결과와 일치하여 (참조: Jin, S. et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science 364, 292-295, doi:10.1126/science.aaw7166 (2019); Zuo, E. et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science 364, 289-292, doi:10.1126/science.aav9973 (2019); Lee, H. K., et al. Cytosine base editor 4 but not adenine base editor generates off-target mutations in mouse embryos. Commun Biol 3, 19, doi:10.1038/s42003-019-0745-3 (2020); McGrath, E. et al. Targeting specificity of APOBEC-based cytosine base editor in human iPSCs determined by whole genome sequencing. Nat Commun 10, 5353, doi:10.1038/s41467-019-13342-8 (2019)), 어떠한 검출가능한 증가 (P-값 = 0.911, 일측면 윌콕손-만-휘트니 U 시험 (Wilcoxon-Mann-Whitney U test), 표 16)가 ABE7.10-d를 사용한 처리 시 게놈 와이드 A-에서 G-로의 돌연변이에서 발견되지 않았다 (도 57 및 FIG. 58). 동시에, 통계적학적으로 유의적인 증가는 비처리된 대조군과 비교하여 BE4-처리된 샘플에서 C-에서 T로의 돌연변이에서 발견되었고 (P-값 = 0.010, 일측면 윌콕손-만-휘트니 U 시험, 표 16), 이는 이전의 보고와 일치하였다 (참조: Jin, S. et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science 364, 292-295, doi:10.1126/science.aaw7166 (2019); Zuo, E. et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science 364, 289-292, doi:10.1126/science.aav9973 (2019); Lee, H. K., et al. Cytosine base editor 4 but not adenine base editor generates off-target mutations in mouse embryos. Commun Biol 3, 19, doi:10.1038/s42003-019-0745-3 (2020); McGrath, E. et al. Targeting specificity of APOBEC-based cytosine base editor in human iPSCs determined by whole genome sequencing. Nat Commun 10, 5353, doi:10.1038/s41467-019-13342-8 (2019)). 어떠한 통계학적으로 유의적인 증가가 비처리된 샘플과 비교하는 경우 ABE8.17-m, ABE8.20-m 또는 Cas9 그룹에 걸쳐 A->G% 돌연변이율에서 관찰되지 않았다 (P-값 = 각각 0.375, 0.643, 및 0.27, 일측면 윌콕손-만-휘트니 U 시험, 도 57, 도 58, 표 16). 그러나, 대부분의 처리 그룹에서 개별 샘플은 Cas9-처리된 그룹에서 상승된 A-에서 G-로의 돌연변이율을 갖는 샘플을 포함하여 유의적으로 보다 높거나 낮은 상대적 비율의 A에서 G로 또는 C-에서 T-로의 돌연변이를 나타냈다.
ABE7.10-d, ABE8.20-m, ABE8.17-m, Cas9 및 BE4-처리된 세포로부터 전체 게놈 서열분석 데이터를 생성하기 위해, 게놈 DNA는 게놈의 >20X 범위로 5개 (BE4, Cas9, 무처리, ABE7.10-d 및 ABE8.20-m) 또는 6개 (ABE8.17-m) 단일 세포 HEK293T 세포 클론으로부터 서열분석되었다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, 각각의 샘플에 대한 돌연변이 프로필은 배경 대조군으로서 언급되는 하나의 무처리 샘플에 상대적으로 계산하였고 이는 상대적 돌연변이의 절대 수와 함께 도 57에 나타낸다 (표 17).
염기 편집기 처리가 검출가능한 수준의 가이드되지 않은 스퓨리어스 DNA 탈아민화를 유도하는지를 결정하기 위해, 고도로 형질전환된 세포주 HEK293T를 사용하여 고도의 염색질 접근성을 추정하였다. 이와 같이, 상기 시스템을 사용하여 진정한 돌연변이율의 반영으로서 절대수에 의존하기 보다는 돌연변이의 상대적 비율을 비교하였다. 이들 실험에서, 각각의 샘플이 배경 대조군에 상대적으로 C-에서 T-로의 돌연변이 (BE4의 경우에) 또는 A-에서 G-로의 돌연변이에서 (ABE 및 Cas9-처리된 샘플의 경우에서) 통계학으로 유의한 (피셔의 정확 검정 (Fisher's Exact Test), 도 58) 증가 또는 감소를 나타내는지 여부가 계산되었다. 이전의 연구와 일치하여 (참조: 예를 들어, Rees, H. A., Wilson, C., Doman, J. L. & Liu, D. R. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717, doi:10.1126/sciadv.aax5717 (2019); Grunewald, J. et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature 569, 433-437, doi:10.1038/s41586-019-1161-z (2019); Grunewald, J. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nat Biotechnol 37, 1041-1048, doi:10.1038/s41587-019-0236-6 (2019); Zhou, C. et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature 571, 275-278, doi:10.1038/s41586-019-1314-0 (2019)), 상기 분석은 5/5 BE4 클론이 게놈-와이드 C-에서 T-로의 돌연변이 (도 57에서 **로 나타냄)에서 유의적 증가를 나타내고, 0/5 ABE7.10-d, 0/4 무처리, 1/6 ABE8.17-m, 2/5 ABE8.20-m 및 1/5 Cas9-처리된 클론이 A-에서 G-로의 돌연변이 (도 57에서 **로 나타냄)에서 증가를 나타냄을 확인하였다. 배경 대조군에 상대적으로 증가된 수의 A-에서 G-로의 돌연변이를 갖는 Cas9-처리된 샘플은 서열 샘플의 나머지와 비교하는 경우 크게 증가된 수의 검출된 돌연변이 (9,532)를 보여주고; 29개의 나머지 샘플은 3,043-6,056 범위에 있다. 1/5 ABE8.20-m-처리된 클론은 게놈-와이드 A-에서 G-로의 돌연변이의 빈도에서 유의적 감소 (도 57에서 *로 나타냄)를 나타냈다. A-에서 G-로의 볼연변에서 통계학적으로 유의적인 증가를 보여주는 Cas9-처리된 샘플과 함께, 이들 2개의 예상치 않은 데이터 포인트는 세포간에 가변성이 있을 수 있음을 지적하고, 이는 mRNA로 형질감염된 HEK293T 세포의 초기 그룹 내에 기존의 유전학적 변화에 의해 유발될 수 있다. 이러한 이유 때문에, 상기 데이터는 데이터 세트에서 가능한 이상점의 영향을 완화시키기 위해 평균 보다는 차라리 메디안으로서 나타낸다.
사용된 프로토콜 (실시예 8 참조)은 단일 세포 클론으로부터 성장한 HEK293T 세포를 사용하지 않도록 조정되었고 (참조: McGrath, E. et al. Targeting specificity of APOBEC-based cytosine base editor in human iPSCs determined by whole genome sequencing. Nat Commun 10, 5353, doi:10.1038/s41467-019-13342-8 (2019)); 대신, ATCC로부터 수득된 HEK293T 세포의 샘플을 사용하고 형질감염 전 대략 4주 동안 배양물 중에 유지하였다.
분석은 만-휘트니 U 시험을 사용하여 처리 그룹 간의 시토신 또는 아데닌 잔기의 탈아민화 빈도에서 통계학적으로 유의적인 차이에 대해 수행되었다 (표 16). 상기 유형의 유의적인 편집 (비처리된 대조군 그룹과 상대적으로)을 갖는 유일한 그룹은 BE4 처리 그룹이고, 이는 비처리된 대조군과 상대적으로 C:G-에서 T:A-로의 (또는 G:C-에서 A:T-로의) 돌연변이에서 유의적인 (p= 0.018) 증가를 보여준다. 상기 검정은 여기서 시험된 ABE 염기 편집기가 BE4에 대해 상응하는 수준에 대한 게놈 내 스퓨리어스 탈아민화를 유발하지 않음을 시사한다. 그러나, 세포 이종성 또는 일부 다른 실험 제한이 가양성 또는 가음성 결과를 유발할 수 있음이 가능하다.
전반적으로, 이들 결과는 ABE7 또는 ABE8을 사용한 처리가 BE3 및 BE4와 같은 CBE에 대해 관찰된 바와 같이 상당히 상승된 돌연변이를 유도하지 않음을 지적한다. 이들 발견은 추가로 ABE의 DNA 특이성을 특징분석하고 연구 도구로서 이들의 사용 및 치료학적 적용 둘 다를 위해 고무적이다.
[표 16] 전체 게놈 서열분석에 적용된 처리 그룹 중에서 상대적 시토신 및 아데닌 탈아민화-유도된 돌연변이 빈도 간의 비교로부터 비롯된 P-값
Figure pct00280
[표 17] 각각의 전체 게놈 서열분석 샘플에서 검출된, 비처리된 대조군에 상대적인 돌연변이의 총수
Figure pct00281
실시예 8: 재료 및 방법
일반적인 방법:
모든 클로닝은 USER 효소 (New England Biolabs) 클로닝 방법 (참조: Geu-Flores et al., USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Res 35, e55, doi:10.1093/nar/gkm106 (2007)) 및 PCR 증폭을 위한 주형들은 세균 또는 포유동물 코돈 최적화된 유전자 단편 (GeneArt)으로서 구입하였다. 생성된 벡터로 Mach T1R 컴피턴트 세포 (Thermo Fisher Scientific)를 형질전환시키고 장기 저장을 위해 -80℃에서 유지하였다. 본 연구에 사용된 모든 프라이머는 제조원 (Integrated DNA Technologies)으로부터 구입하고, PCRS는 푸션 (Phusion) U DNA 폴리머라제 그린 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스 (ThermoFisher) 또는 Q5 핫 개시 고-충실도 (Hot Start High-Fidelity) 2x 마스터 믹스 (Master Mix) (New England Biolabs)를 사용하여 수행하였다. 본 연구에서 사용된 모든 플라스미드는 내독소 제거 과정에 관여하는 ZymoPURE 플라스미드 미디프렙 (Midiprep) (Zymo Research Corporation)을 사용하여 50 mL의 Mach1 배양물로부터 새롭게 제조하였다. 분자 생물학 등급의 하이클론 물 (Hyclone water) (제조원: GE Healthcare Life Sciences)은 모든 검정, 형질감염 및 PCR 반응에 사용하여 DNAase 활성을 확실히 배제하였다.
Hek293T 포유동물 세포 형질감염을 위해 사용되는 sgRNA의 아미노산 서열은 하기 표 18에 제공된다. 20-nt 표적 프로토스페이서는 굵은 폰트로 나타낸다. 표적 DNA 서열이 'G'로 시작하지 않는 경우, 'G'는 인간 U6 프로모터가 전사 개시 부위에서 'G'를 선호하는 것으로 보고되었기 때문에 프라이머의 5' 말단에 부가하였다 (참조: Cong, L. et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823, doi:10.1126/science.1231143 (2013)). 이전에 기재된 pFYF sgRNA 플라스미드는 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다.
[표 18]
Hek293T 포유동물 세포 형질감염을 위해 사용되는 sgRNA의 서열.
Figure pct00282
sgRNA 스캐폴드 서열은 다음과 같다:
에스. 피오게네스 ( S. pyogenes ):
Figure pct00283
에스. 아우레우스 ( S. aureus ):
Figure pct00284
지시된 변형를 위한 인풋 세균 TadA* 라이브러리의 생성
TadA*8.0 라이브러리는 TadA*7.10 개방 판독 프레임에서 각각의 아미노산 위치에서 모든 20개 아미노산을 암호화하도록 디자인하였다 (참조: Gaudelli, N. M. et al., Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017)). 각각의 TadA*8.0 라이브러리 구성원은 약 1-2개의 새로운 암호화 돌연변이를 함유하였고 화학적으로 합성하고 제조원 (Ranomics Inc (Toronto, Canada))으로부터 구입하였다. TadA*8.0 라이브러리는 푸션 U 그린 멀티플렉스 PCT 마스터 믹스를 사용하여 PCR 증폭시키고 ABE 지시된 변화를 위해 최적화된 세균 벡터에 USER-어셈블리하였다 (참조: Gaudelli. M. et al., Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017)).
TadA 변이체의 세균 변화
TadA*8 라이브러리를 함유하는 ABE의 지시된 변화는 이전에 기재된 바와 같이 수행하였고 (참조: Gaudelli, N. M. et al., Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage.Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017)), 하기의 변화를 갖는다: i) 이. 콜리 (E. coli) 10 베타스 (New England Biolabs)는 변화 숙주로서 사용하였고; ii) 가나마이신 상에서의 생존은 3개의 유전학적 불활성화 성분의 보정 (예를 들어, 가나마이신에서 2개의 정지 돌연변이 및 하나의 활성 부위 돌연변이의 생존 요구되는 복귀)에 의존하였다. 가나마이신 내성 유전자 서열(하기)은 ABE8 변화를 위해 선택 돌연변이를 함유한다. 선택 플라스미드와 편집기를 10 베타 숙주 세포에서 밤새 동시-배양 후, 라이브러리 배양물을 플라스미드 유지 항생제 및 증가하는 농도의 선택 항생제, 가나마이신 (64-512 μg/mL)이 보충된 2xYT-한천 배지 상에 분주하였다. 세균은 1일 동안 성장하도록 방치하였고, 생존 클론의 TadA*8 부분은 집적 후 생검 서열분석하였다. 이어서, 관심 대상의 동정된 TadA*8은 USER 어셈블리를 통해 포유동물 발현 벡터에 도입하였다.
하기의 서열에서, 소문자는 가나마이신 내성 프로모터 영역을 나타내고, 굵게 표시된 서열은 표적화된 불활성화 부분 (Q4* 및 W15*)을 지적하고, 이탤릭 서열은 가나마이신 내성 유전자 (D208N)의 표적화된 불활성 부위를 지칭하고, 밑줄친 서열은 PAM 서열을 지칭한다.
불활성화된 가나마이신 내성 유전자:
Figure pct00285
일반 HEK293T 및 RPMI-8226 포유동물 배양 조건
세포는 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. HEK293T 세포 [CLBTx013, American Type Cell Culture Collection (ATCC)]는 10% (v/v) 태아 소 혈청 (A31606-02, Thermo Fisher Scientific)을 갖는 듈베코 변형된 이글 배지 + 글루타맥스 (Glutamax) (10566-016, Thermo Fisher Scientific)에 배양하였다. RPMI-8226 (CCL-155, ATCC) 세포는 10% (v/v) 태아 소 혈청 (Gibco)을 갖는 RPMI-1640 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 세포는 공급업체로부터 접수 후 마이코플라스마가 음성임을 시험하였다.
Hek293T 플라스미드 형질감염 및 gDNA 추출
HEK293T 세포는 35,000개 세포/웰의 밀도로 48-웰 폴리-D-라이신 처리된 BioCoat 플레이트 (Corning) 상에 씨딩하고 분주 후 18-24시간에 형질감염시켰다. 세포는 뉴클레오카운터 (NucleoCounter) NC-200 (Chemometec)을 사용하여 계수하였다. 이들 세포에 Opti-MEM 환원 혈청 배지 (ThermoFisher Scientific)에서 12.5 μL 총 용적으로 희석된 750 ng의 염기 편집기 또는 뉴클레아제 대조군, 250 ng의 sgRNA, 및 10 ng의 GFP-맥스 플라스미드 (max plasmid) (Lonza)를 첨가하였다. 용액을 11 μL의 Opti-MEM 환원 혈청 배지 중에서 1.5 μL의 리포펙타민 2000 (ThermoFisher)과 합하고 15분 동안 실온에 있도록 방치하였다. 이어서, 전체 25 μL의 혼합물은 씨딩 전 Hek293T 세포로 전달하고 약 120시간 동안 항온처리하기 하기 위해 방치하였다. 항온처리 후, 배지는 흡인 제거하고 세포는 250 μL의 1x PBS 용액 (ThermoFisher Scientific)으로 2회 세척하고, 100 μL의 새롭게 제조된 용해 완충액을 첨가하였다 (100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 0.05% SDS, 25 μg/mL 프로테이나제 K (Thermo Fisher Scientific)). 용해 완충액을 함유하는 형질감염 플레이트는 1시간 동안 37℃에서 항온처리하고, 혼합물은 96-웰 PCR 플레이트로 전달하고 30분 동안 80℃에서 가열하였다.
Hek293T mRNA 지질감염
HEK293T 세포는 항생제가 없는 DMEM + Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에서 웰당 30,000개 세포의 밀도로 지질감염 전 16 내지 20시간에 48웰 폴리-D-라이신 코팅된 플레이트 (Corning)에 분주하였다. 500 ng Cas9 또는 염기 편집기 발현 mRNA는 OPTIMEM + Glutamax과 함께 15 μl의 총 용적으로 100 ng의 화학적으로 변형된 합성 sgRNA (처음 3개의 5' 및 최종 3개의 3' 말단 RNA 잔기들에서 2'-O-메틸 유사체 및 3' 포스포로티오에이트 연결. Synthego)와 합하였다. 이것은 웰당 1.0 μl 리포펙타민 MessengerMax 및 9.0 μl의 OPTIMEM + Glutamax를 포함하는 10 μl의 지질 혼합물과 조합하였다. 세포는 형질감염 후 3일에 수거하고 DNA 또는 RNA를 수거하고 하기된 바와 같이 가공하였다.
게놈 DNA의 제조 및 편집된 세포의 클론 단리를 포함하는, 전체 게놈 서열분석을 위한 HEK293T 세포의 처리
세포는 염기 편집기 또는 B2M 내 영역을 표적화는 sgRNA와 조합된 Cas9-암호화 mRNA로 형질감염시키고, 상기 sgRNA는 ABE, CBE 또는 Cas9에 의해 성공적으로 표적화된 경우, 본원에 기재된 바와 같이 스플라이스 부위 붕괴 (ABE, Cas9) 또는 정지 코돈의 혼입 (CBE)을 통해 B2M의 붕괴 (sgRNA 표적 서열: 5'-CTTACCCCACTTAACTATCT-3', Synthego) (참조: Qasim, W. et al. Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells. Sci Transl Med 9, doi:10.1126/scitranslmed.aaj2013 (2017))를 유도한다. 형질감염 후 24시간 째에, 세포는 새로운 플레이트에 3:8로 분할하여 세포 성장을 고무시켰다. 형질감염 후 3일 째에, HEK293T 세포는 TryplE Express (ThermoFisher)로 수거하고, FACS 완충액 (PBS, 1% BSA, 둘 다 ThermoFisher)으로 1X 세척하고 15분 동안 4℃에서 냉각시켰다. 이어서, 세포는 펠렛화하고 (1500 *g, 5분) PE 항-인간 B2-마이크로글로빈 (Biolegend 316306)의 1:100 희석으로 FACS 완충액 용액 중에 재현탁시켰다. 세포는 4℃에서 암실에서 30분 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포는 원심분리(1500 *g, 5분)에 의해 FACS 완충액으로 3회 세척하고 FACS 완충액 중에 재현탁시켰다. 단일, B2M-음성 세포는 B2M-양성 세포가 96-웰 플레이트에 분류된 비처리된 세포를 제외하고 96-웰 플레이트에 분류하였다. 대표적인 FACS 풀롯은 도 59a 및 59b에 나타낸다. 분류 후 9일 째에, 웰을 조사하고 단일 콜로니를 함유하는 것들을 표시하고 TryplE Express로 처리하여 세포 성장을 촉진시켰다. 추가 성장의 4일 후, 게놈 DNA는 제조업자의 지침에 따라 Agincourt DNAdvance 키트 (Beckmann Coulter)를 사용하여 세포로부터 수거하였다.
게놈 DNA는 제조업자의 지침에 따라 96-웰 플레이트 넥스테라 인덱싱 프라이머 (Nextra indexing primer) (illumina)를 사용한 넥스테라 DNA 플렉스 라이브러리 프렙 키트 (Illumina)를 사용하여 단편화하고 어댑터-연결하였다. 라이브러리 크기 및 농도는 단편 분석기 (Agilent)에 의해 확인하였고 Illumina HiSeq를 사용한 전체 게놈 서열분석을 위해 Novogene으로 전송하였다.
전체 전사체 및 전체 게놈 서열분석 데이터의 분석
모든 표적화된 NGS 데이터는 4개의 일반 단계를 수행함에 의해 분석하였다: (1) 정렬, (2) 복제 마킹, (3) 변이체 호출 (4) 인공물 및 생식선 돌연변이를 제거하기 위한 변이체의 배경 여과. 각각의 단계는 하기에 기재된다. 돌연변이 참조 및 대안적 대립유전자는 참조 게놈의 + 가닥에 상대적으로 보고한다.
전체 전사체 분석 세부사항
1. 레인 수준 FASTQ 파일은 게놈 정렬된 BAM 파일 및 전사체 정렬된 BAM 파일 둘 다의 판독 그룹 및 아웃풋을 특정하기 위한 파라미터 세트와 함께 STAR (v2.7.2a)를 사용한 인간 게놈 (Gencode GRCh38v31 1차 어셈블리)에 별도로 정렬시켰다.
2. 단계 (1)에서 생성된 각각의 샘플에 대한 레인 수준 게놈 정렬은 병합하고, 좌표에 의해 분류하고 Picard( v2.20.5)를 사용하여 복제 표시하였다.
3. 스플라이싱 접합부에 걸쳐 있기 때문에 이들의 시가 스트링에서 Ns를 함유하는 판독은 GATK (v4.1.3.0) SplitNCigarRead를 사용하여 분할하였다.
4. 염기 품질 스코어는 디폴트 세팅과 함께 Picard를 사용하여 재보정하였다.
5. 변이체는 GATK HaplotypeCaller를 사용하여 명명되었다. ≥ 30의 맵핑 품질을 갖는 유일한 판독이 고려되었고 비-참조 염기를 계수하기 위한 최소 염기 품질 (Phred 스코어)은 20으로 설정하였다. RNA-seq에서 변이체 명명을 위한 표준 세팅을 사용하였다: 최소-염기-품질 = 20, 최소-맵핑-질 = 30은 돈트-유스-소프트-클립된-염기 (don't-use-soft-clipped-bases), 표준-명명-conf = 20.
6. 염기 편집기 처리 샘플에 대한 개별 돌연변이는 배경 여과를 사용하여 동정되었다. 최고 높은 범위의 '비처리' 샘플은 배경 샘플로 사용하였다. 표준 염색체에 대한 치환만 고려되었다. 돌연변이는 다음 기준을 충족하는 경우 염기 편집기 처리 샘플에 대해 개벌적인 것으로 공개되었다.
a. 돌연변이의 게놈 위치는 처리된 샘플에서 ≥ 30 판독 및 비처리된 샘플에서 ≥ 20 판독의 범위를 갖는다.
b. 비처리된 샘플은 돌연변이의 위치에서 참조, 비-돌연변이체, 염기를 지지하는 판독의 ≥ 99%를 가졌다.
c. 처리된 샘플에서 돌연변이의 변이체 대립유전자 빈도는 ≥ 20%였다.
전체 게놈 서열분석 세부사항
1. 레인 수준 FASTQ 파일은 별도로 판독그룹을 특정하기 위한 파라미터 세트와 함께 BWA (0.7.17-r1188) mem을 사용한 인간 게놈 (Gencode GRCh38v31 1차 어셈블리)에 별도로 정렬시켰다. -M 플래그는 또한 단축된 스플릿 히트 2차 정렬을 표시하도록 설정하였다.
2. 단계 (1)에서 생성된 각각의 샘플에 대한 레인 수준 게놈 정렬은 병합하고, 좌표에 의해 분류하고 디폴트 세팅을 사용한 Picard (v2.20.5)를 사용하여 복제 표시하였다.
3. 변이체는 GATK (v4.1.3.0) HaplotypeCaller를 사용하여 명명되었다. ≥ 30의 맵핑 품질을 갖는 유일한 판독이 고려되었고 비-참조 염기를 계수하기 위한 최소 염기 품질 (Phred 스코어)은 20으로 설정하였다. DNA-seq에서 변이체 명명을 위한 표준 세팅을 사용하였다.
4. 염기 편집기 처리 샘플에 대한 개별 돌연변이는 배경 여과를 사용하여 동정되었다. 최고 높은 범위의 '비처리' 샘플은 배경 샘플로 사용하였다. 표준 염색체에 대한 치환만 고려되었다. 돌연변이는 다음 기준을 충족하는 경우 염기 편집기 처리 샘플에 대해 개벌적인 것으로 공개되었다.
a. 돌연변이의 게놈 위치는 처리된 및 비처리된 샘플에서 ≥ 10 판독의 범위를 갖는다.
b. 비처리된 샘플은 돌연변이의 위치에서 참조, 비-돌연변이체, 염기를 지지하는 판독의 ≥ 99%를 가졌다.
ABE 구조 및 ABE8 작제물에 대한 DNA 및 RNA 표적-이탈 편집의 분석
HEK293T 세포는 항생제가 없는 DMEM + Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific) 중에서 웰당 30,000개 세포의 밀도로 지질감염 전 16 내지 20시간에 48웰 폴리-D-라이신 코팅된 플레이트 (Corning)에 분주하였다. 750 ng 닉카제 또는 염기 편집기 발현 플라스미드 DNA는 15 μl OPTIMEM + Glutamax 중에 250 ng의 sgRNA 발현 플라스미드 DNA와 조합하였다. 이것은 웰당 1.5 μl 리포펙타민 2000 및 8.5 μl의 OPTIMEM + Glutamax를 포함하는 10 μl의 지질 혼합물과 조합하였다. 세포는 형질감염 후 3일에 수거하고 DNA 또는 RNA를 수거하였다. DNA 분석을 위해, 세포는 1X PBS 중에서 1회 세척하고, 이어서 제조업자의 지침에 따라 100 μl의 QuickExtract™ 완충액 (Lucigen)에서 용해시켰다. RNA 수거를 위해, MagMAX™ mirVana™ 총 RNA 단리 키트 (Thermo Fisher Scientific)는 제조업자의 지침에 따라 KingFisher™ Flex 정제 시스템과 함께 사용하였다.
표적화된 RNA 서열분석은 대부분 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (참조: Rees, H. A. et al., Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717, doi:10.1126/sciadv.aax5717 (2019)). cDNA는 제조업자의 지침에 따라 EZDnase (Thermo Fisher Scientific)와 함께 SuperScript IV 1단계 (One-Step) RT-PCR 시스템을 사용하여 단리된 RNA로부터 제조하였다. 하기의 프로그램을 사용하였다: 12분 동안 58℃; 2분 동안 98℃; 이어서 앰플리콘에 의해 다양한 PCR 사이클: CTNNB1 및 IP90에 대해: [10초 동안 98℃; 10초 동안 60℃; 30초 동안 72℃]의 32 사이클 및 RSL1D1에 대해, [10초 동안 98℃; 10초 동안 58℃; 30초 동안 72℃]의 35 사이클. 어떠한 RT 대조군도 샘플과 동시에 전개하지 않았다. 조합된 RT-PCR 후, 앰플리콘을 바코드화하고 본원에 기재된 바와 같이 Illumina Miseq를 사용하여 서열 분석하였다. 각각의 앰플리콘에서 정배향 프라이머의 종점 후 제1 염기에서 개시하는 각각의 앰플리콘에서 첫번째 125nt는 참조 서열과 정렬시키고 각각의 앰플리콘에서 A-에서 I-로의 평균 및 최대 빈도의 분석을 위해 사용하였다 (도 53a - 53c).
표적-이탈 DNA 서열분석은 상기된 illumina Miseq 서열을 사용한 서열분석을 위해 샘플을 제조하기 위한 2단계 PCR 및 바코드화 방법을 사용하여 표 19에 열거된 이전에 공개된 프라이머를 사용하여 수행하였다 (참조: Komor, A. C. et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946 (2016); Rees, H. A. et al., Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717, doi:10.1126/sciadv.aax5717 (2019)).
[표 19] 게놈 부위를 증폭시키기 위해 사용되는 HTS 프라이머
Figure pct00286
Figure pct00287
Figure pct00288
Figure pct00289
CD34+ 세포에 사용되는 ABE 편집기를 위한 mRNA 생성
편집기는 dT7 프로모터에 이어서 5' UTR, Kozak 서열, ORF, 및 3' UTR을 암호화하는 플라스미드에 클로닝하였다. 　dT7 프로모터는 환형 플라스미드로부터 전사를 방지하는 T7 프로모터 내 불활성화 점 돌연변이를 갖는다. 　상기 플라스미드는 PCR 반응 (Q5 Hot Start 2X 마스터 믹스)을 템플릿화하였고, 여기서, 정배향 프라이머는 T7 프로모터 내의 SNP를 보정하였고, 역배향 프라이머는 120A 꼬리를 3' UTR에 첨부시켰다. 　상기 수득한 PCR 생성물은 Zymo Research 25 μg DCC 컬럼 상에서 정제하였고 후속 시험관내 전사에서 mRNA 주형으로서 사용하였다. 　NEB HiScribe 고수율 키트는 지침 메뉴얼에 따라 사용하였지만 N1-메틸-슈도우리딘을 우리딘으로 완전히 대체하고 클린캡 (CleanCap) AG (Trilink)를 사용하여 동시-전사 캡핑하였다. 　반응 클린업은 염화리튬 침전에 의해 수행하였다. 증폭을 위해 사용된 프라이머는 표 20에서 찾을 수 있다. Cas9 mRNA는 Trilink (CleanCap Cas9 mRNA 5moU)로부터 구입하였다.
[표 20]
Figure pct00290
CD34+ 세포 제조
고정화된 말초 혈액을 수득하고 인간 CD34+ HSPC에 대해 집적하였다 (HemaCare, M001F-GCSF/MOZ-2). CD34+ 세포는 해동시키고 전기천공 전 48시간에 1% 글루타맥스 (Gibco), 100 ng/mL의 TPO (Peprotech), SCF (Peprotech) 및 Flt-3 (Peprotech)을 함유하는 X-VIVO 10 (Lonza)에 투입한다.
CD34+ 세포의 전기천공
해동 후 48시간에, 세포는 회전 하강시켜 X-VIVO 10 배지를 제거하고, 0.1% HSA (Akron Biotechnologies)를 갖는 MaxCyte 완충액 (HyClone) 중에서 세척하였다. 이어서 세포는 mL당 1,250,000개 세포로 냉 MaxCyte 완충액 중에 재현탁시키고 다수의 20 μL 분취량으로 분할하였다. 이어서, ABE mRNA (0.15 μM) 및 -198 HBG1/2 sgRNA (4.05 μM)를 실험 조건에 따라 분취하였고 MaxCyte 완충액 중에 총 5 μL로 상승시켰다. sgRNA의 서열은 표 21에 제공된다. 20 μL의 세포는 3개의 그룹에서 5 μL RNA 혼합물에 첨가하고, 전기천공을 위해 OC25x3 MaxCyte 큐벳의 각각의 챔버에 부하하였다. 충전시킨 후, 챔버에서 25 μL를 수거하고 24-웰 비처리 배양 플레이트의 웰 중앙에 위치시켰다. 세포는 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 20분 동안 회수하였다. 20분 회수 후, 1% 글루타맥스, 100 ng/mL의 TPO, SCF 및 Flt-3을 함유하는 X-VIVO 10을 mL당 1,000,000개 세포의 농도를 위해 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포는 48시간 동안 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 추가로 회수하기 위해 방치하였다.
[표 21] CD34+ 형질감염을 위해 사용되는 sgRNA의 서열
Figure pct00291
a,c,g,u: 2'-O-메틸 잔기
s: 포스포로티오에이트
sgRNA 스캐폴드 서열:
에스. 피오게네스 ( S. pyogenes ):
Figure pct00292
ABE 전기천공 후 적혈구 분화
전기천공 휴지기 (배양 0일째) 48시긴 후, 세포는 회전 하강시키고, mL당 20,000개 세포로 5% 인간 혈청, 330 μg/mL 트랜스페린 (Sigma), 10 μg/mL 인간 인슐린 (Sigma), 2 U/mL 헤파린 나트륨 (Sigma), 3 U/mL EPO (Peprotech), 100 ng/mL SCF (Peprotech), 5 μg/mL IL3 및 50 μM 하이드로코르티손 (Sigma)을 함유하는 "단계 1" IMDM 배지 (ATCC)에 옮겼다. 배양 4일 째에, 세포에는 4x 용적의 동일한 배지를 공급하였다. 7일 째에, 세포는 회전 하강시키고 mL당 200,000개 세포로 5% 인간 혈청 (Sigma), 330 μg/mL 트랜스페린, 10 μg/mL 인간 인슐린, 2 U/mL 헤파린 나트륨, 3 U/mL EPO 및 100 ng/mL SCF를 함유하는 "단계 2" IMDM 배지로 옮겼다. 11일 째에, 세포는 회전 하강시키고 mL당 1,000,000개 세포로 5% 인간 혈청 (Sigma), 330 μg/mL의 트랜스페린, 10 μg/mL의 인간 인슐린, 2 U/mL의 헤파린 나트륨 및 3 U/mL의 EPO를 함유하는 "단계 3" IMDM 배지로 옮겼다. 14일 째에, 세포를 회전 하강시키고, 11일째와 동일한 배지에서 재현탁시키지만 mL당 5,000,000개 세포로 재현탁하였다. 18일 째에, 분화된 적혈구 세포는 500,000개 세포 분취량으로 수거하고, 500 μL DPBS (Gibco) 중에서 1회 세척하고, UHPLC 가공 전 24시간 동안 -80℃에서 동결시켰다.
UHPLC 분석을 위한 적혈구 세포 샘플의 제조
동결된 적혈구 세포 펠렛은 실온에서 해동시켰다. 펠렛은 ACK 용해 완충액으로 5 x 104 세포/mL의 최종 농도로 희석하였다. 샘플은 피펫에 의해 혼합하고 5분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서, 샘플은 5분 동안 -80℃에서 동결시키고, 해동시키고, 10분 동안 6,700 g에서 원심분리 전 피펫에 의해 혼합하였다. 상등액을 주의깊게 제거하고 (세포 파쇄물 펠렛 부재) 새로운 플레이트로 옮기고 UHPLC 분석을 위해 초순수 중에서 5 x 103 세포/mL로 희석하였다.
초고속 수행능 액체 크로마토그래피(UHPLC) 분석
글로빈 쇄의 역상 분리는 양분된 펌프 및 UV 검출기 (Thermo Fisher Scientific, Vanquish Horizon)로 구성된 UHPLC 시스템 상에서 수행하였다. 정지상은 60℃의 컬럼 온도와 함께 AQUITY 펩타이드 BEH C18 VanGuard 프레-컬럼 (2.1 x 5 mm, 1.7 μm 비드, 300A 공극) (둘 다 Waters Corp) 후 ACQUITY 펩타이드 BEH C18 컬럼 (2.1 x 150 mm, 1.7 μm 비드, 300A 공극)으로 이루어졌다. 용출은 0.25 mL/min의 유속으로, 물 (A) 중에서 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA) 및 아세토니트릴 (B) 중에 0.08% TFA를 사용하여 수행하였다. 글로빈 쇄의 분리는 0-10분으로부터 40-52% B; 10 내지 10.5분으로부터 52-40% B; 12분까지 40% B의 선형 농도구배를 사용하여 성취하였다. 샘플 주사 용적은 10 μL였고, 5 Hz의 데이터율과 함께 220 nm의 파장에서 UV 스펙트럼은 분석 전반에 걸쳐 수집하였다. 글로빈 쇄 정체는 헤모글로빈 표준물의 LC/MS 분석을 통해 확인하였다.
CD34+ 세포에 대한 게놈 DNA 추출
ABE 전기천공 후 (48h 후), 세포 분취량을 1% 글루타맥스 (Gibco), 100 ng/mL의 TPO (Peprotech), SCF (Peprotech) 및 Flt-3 (Peprotech)을 함유하는 X-VIVO 10 배지 (Lonza)에서 배양하였다. 배양 48h 및 144h 후, 100,000개의 세포를 수거하고 회전 하강시켰다. 50 μL의 퀵 추출물 (Lucigen)을 세포 펠렛에 첨가하고, 세포 혼합물을 96-웰 PCR 플레이트 (Bio-Rad)에 옮겼다. 용해물을 65℃에서 15분 동안 이어서 98℃에서 10분 동안 가열하였다. 세포 용해물을 -20℃에서 저장하였다.
게놈 DNA 샘플의 차세대 서열분석 (NGS)
게놈 DNA 샘플을 증폭시키고 고속처리 서열분석을 위해 제조하였다 (참조: Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017)). 1 μL의 gDNA는 퓨션 (Phusion) U 그린 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스 및 0.5 μM의 각각의 정배향 및 역배향 프라이머를 함유하는 25 μL PCR 반응에 첨가하였다. 증폭 후, PCR 생성물은 고유 바코드화 프라이머 쌍을 사용하여 바코드화하였다. 바코드화 반응물은 총 25 μL 용적으로 0.5 μM의 각각의 illumina 정배향 및 역배향 프라이머, 관심 대상의 증폭된 게놈 부위를 함유하는 2 μL의 PCR 혼합물, 및 Q5 핫 스타트 고-충실도 2x 마스터 믹스를 함유하였다. 모든 PCR 조건은 이전에 공개된 바와 같이 수행하였다 (참조: Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471, doi:10.1038/nature24644 (2017)). 부위-특이적 포유동물 세포 게놈 DNA 증폭을 위해 사용되는 프라이머는 표 19에 열거한다. DNA 농도는 제조업자의 프로토콜에 따라, NanoDrop 1000 분광측정기 (ThermoFisher Scientific)를 사용하여 정량하고 Illumina MiSeq 장비 상에서 서열 분석하였다.
표적화된 NGS 데이터 분석
모든 표적화된 NGS 데이터는 4개의 일반 단계를 수행하여 분석하였다: (1) Illumina 탈멀티플렉싱 (demultiplexing), (2) 판독 트리밍 및 필터링, (3) 모든 판독의 예상된 앰플리콘 서열로의 정렬, 및 (4) 편집율의 정렬 통계 및 정량. 각각의 단계는 하기에서 보다 상세히 기재된다:
1. MiSeq에 의해 생성된 염기 호출 파일 (BCF)로부터 FASTQ 파일을 생성하기 위해, 탈멀티플렉싱은 하기의 파라미터와 함께 Illumina bcl2fastq (v2.20.0.422)를 전개함에 의해 수행하였다:
bcl2fastq＼
--무시 (ignore)-결실 (missing)-bcls＼
--무시-결실-필터＼
--무시-결실-위치＼
--무시-결실-대조군＼
--자동-세트-투-제로-바코드-미스매치＼
--모색-어댑터-위드-슬라이딩-윈도우＼
--어댑터-엄중도 0.9＼
--마스크-단축-어댑터-판독 35＼
--최소-트리밍된-판독-길이 35＼
2. 단계 (1)에서 작성된 FASTQ 파일은 clip Illumina TruSeq 어댑터를 클립하기 위한 파라미터 셋업과 함께 트리모마틱 (v0.39)14를 사용하여 가공처리하였고, 20염기 보다 짧은 판독을 배제하고 4bp 슬라이딩 윈도우에서 평균 염기 품질 (Phred 스코어)이 15 미만으로 떨어진 경우 판독의 나머지 3' 말단을 트리밍한다. 추가로, 판독의 말단에서 3 이하의 질 스코어를 갖는 임의의 염기를 제거하였다. 최종적으로, 라운드 1 PCR 프라이머는 판독 1 프라이머 서열 후 4개의 무작위화된 염기를 포함하기 때문에, 각각의 판독의 첫번째 4개의 염기를 트리밍하였다. 트리모마틱을 수행하기 위해 사용되는 명령은 하기에 나타낸다:
트리모마틱 SE -phred33 $input_fastq $output_fastq＼
ILLUMINACLIP:illumine_어댑터.fa:2:30:10＼
LEADING:3 TRAILING:3＼
SLIDINGWINDOW:4:15＼
MINLEN:20＼
HEADCROP:4
3. 판독은 매우 민감한 플래그에 의해 특정된 정렬 파라미터와 함께 엔드-투-엔드 방식으로 bowtie2 (v2.35)15를 사용한 앰플리콘 서열에 정렬시켰다. 참조 서열은 인간 게놈 (GRCh38)을 기준으로 각각의 프라이머 쌍에 대해 예상된 앰플리콘 서열 (프라이머를 포함하는)로서 결정하였다. bowtie2에 의해 생성된 SAM 파일은 BAM 파일로 전환시키고, 분류하고 samtools 팩키지 (v1.9)16을 사용하여 색인화하였다. 적어도 5,000개 정렬된 판독을 갖는 샘플만이 분석을 위해 고려되었다.
4. 단계 (3)에서 작성된 BAM 파일은 bam-판독계수 도구 (https://github.com/genome/bam-readcount)를 사용하여 가공처리하여 정렬 내 각각의 위치에서 비-참조 염기의 수, 결실 및 삽입을 요약하는 플레인 텍스트 파일을 생성하였다. 비-참조 염기를 계수하기 위한 최소 염기 품질 (Phred 스코어)은 29로 설정하여 대략 편집율의 통계로부터 낮은 신뢰도의 염기 호출을 배제하였다. 염기 편집기 표적 부위 (이의 프로토스페이서 + PAM 서열로서 규정된)와 중첩하는 삽입 및/또는 결실을 갖는 판독만이 삽입 및 결실율에 대해 계수하였다. 표적 부위 내 각각의 위치에 대한 편집율은 정렬 내 소정의 위치에서 염기 품질 역치를 통과한 염기의 총 수에 대한 소정의 유형의 비-참조 염기 (예를 들어, G)의 분수로서 계산하였다.
동일한 컴퓨터 분석 접근법을 사용하여 수행된 추가의 분석에서, 상이한 유전학적 유전자좌에서 ABE7 및 ABE8에 의해 생성된 일배체형은 도 60에 나타낸다.
다른 구현예
이전의 기재로부터, 변화 및 변형이 본원에 기재된 발명에 가해져 이를 다양한 용법 및 조건에 적응하도록 수행될 수 있음은 자명할 것이다. 상기 구현예는 또한 하기의 청구범위 내에 있다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 요소들 목록의 언급은 임의의 단일 요소 또는 열거된 요소의 조합 (또는 서브조합)으로서 상기 변수의 정의를 포함한다. 본원의 구현예의 언급은 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 일부와 조합된 구현예를 포함한다.
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본원에서 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 달리 지적되지 않는 경우, 본 명세서에 언급된 공보, 특허 및 특허 출원은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원 개시내용의 방법 및 조성물을 포괄하는 하기의 넘버링된 추가의 구현예는 본원에서 고려된다:
1. 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 아미노산 위치 82 또는 166에서의 변형, 또는 또 다른 아데노신 데이마나제에서 상응하는 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나제로서, 상기 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열은 서열번호 2와 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제가 데옥시리보핵산 (DNA) 서열의 핵염기를 탈아민화시키는, 아데노신 데아미나제.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열이 서열번호 2와 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
4. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열이 서열번호 2와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
5. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열이 서열번호 2와 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 위치 82에서 변형, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변형을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
7. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 위치 166에서 변형, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변형을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
8. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 위치 82 및 166에서 변형, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변형을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
9. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 V82S 변형을 포함하고, 위치 82가 서열번호 2에서 넘버링된 바와 같은, 아데노신 데아미나제.
10. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 V82X 변형을 포함하고, 위치 82가 서열번호 2에서 넘버링된 바와 같고, X가 V 이외의 임의의 아미노산인, 아데노신 데아미나제,
11. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 T166R 변형을 포함하고, 위치 166이 서열번호 2에서 넘버링된 바와 같은, 아데노신 데아미나제.
12. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 T166X 변형을 포함하고, 위치 166이 서열번호 2에서 넘버링된 바와 같고, X가 T 이외의 임의의 아미노산인, 아데노신 데아미나제,
13. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 V82S 및 T166R 변형을 포함하고, 위치 82 및 166이 서열번호 2에서 넘버링된 바와 같은, 아데노신 데아미나제.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 76, 82, 123, 147, 154, 및 166으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 변형을 추가로 포함하는, 아데노신 데아미나제.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 V82S, Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, Q154R, 및 T166R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하는, 아데노신 데아미나제.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 변형의 조합을 추가로 포함하는, 아데노신 데아미나제: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156 및 157로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 개시하는 C-말단의 결실을 추가로 포함하는, 아데노신 데아미나제.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신 데아미자제가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인과 복합체화된, 아데노신 데아미나제.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신 데아미자제가 표적 데옥시리보핵산에서 A-에서 G-로의 변형을 수행하는, 아데노신 데아미나제.
20. 구현예 18 또는 19에 있어서, 상기 복합체가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 단백질 복합체 보다 큰 염기 편집 효율을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
21. 구현예 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 적어도 50% 염기 편집 효율을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
22. 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 적어도 70% 염기 편집 효율을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
23. 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 단백질 복합체 보다 적어도 5배 큰 염기 편집 효율을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
24. 구현예 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기 편집 효율이 상기 아데노신 데아미나제에 의해 수행된 표적 핵염기의 변형을 포함하는 총 서열분석 판독 백분율에 의해 결정되는, 아데노신 데아미나제.
25. 구현예 18 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 단백질 복합체 보다 낮은 삽입-결실 형성율을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
26. 구현예 18 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 단백질 복합체 보다 표적 폴리뉴클레오타이드에서 10% 미만의 삽입-결실 형성을 유도하는, 아데노신 데아미나제.
27. 구현예 18 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 세포의 게놈에서 10% 미만의 삽입-결실을 유도하는, 아데노신 데아미나제.
28. 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 삽입-결실 형성이 표적 핵염기 변형 및 비변형된 서열을 플랭킹하는 서열 간에 미스매치 빈도에 의해 측정되는, 아데노신 데아미나제.
29. 구현예 18 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 단백질 복합체 보다 표적 핵염기에 대해 큰 특이성을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
30. 구현예 18 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 단백질 복합체 보다 낮은 표적-이탈 탈아민화를 유도하는, 아데노신 데아미나제.
31. 구현예 30에 있어서, 상기 표적-이탈 탈아민화가 스퓨리어스 핵염기의 탈아민화를 포함하는, 아데노신 데아미나제.
32. 구현예 30에 있어서, 상기 표적-이탈 탈아민화가 방관자 핵염기의 탈아민화를 포함하는, 아데노신 데아미나제.
33. 구현예 18 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 단백질 복합체 보다 큰 염기 편집 범위를 포함하는, 아데노신 데아미나제.
34. 구현예 18 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 단백질 복합체와 비교하여, 카노니칼 PAM 서열의 업스트림에 5, 6 또는 7개 염기쌍인 표적 핵염기에서 적어도 1.5배 큰 염기 편집 효율을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
35. 구현예 18 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 복합체가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 단백질 복합체와 비교하여, 표적 폴리뉴클레오타이드에서 비-카노니칼 PAM 서열의 업스트림에 3, 4, 8, 9 또는 10개 염기쌍인 표적 핵염기에서 적어도 3배 큰 염기 편집 효율을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 단백질이 Cas9 폴리펩타이드 또는 이의 단편인, 아데노신 데아미나제.
37. 구현예 36에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 Cas9 닉카제 (nCas9)인, 아데노신 데아미나제.
38. 구현예 36에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 뉴클레아제 데드 Cas9 (dCas9)인, 아데노신 데아미나제.
39. 구현예 36 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 SpCas9 폴리펩타이드를 포함하는, 아데노신 데아미나제.
40. 구현예 39에 있어서, 상기 SpCas9 폴리펩타이드가 D10A 및/또는 H840A 아미노산 치환을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
41. 구현예 36 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 SaCas9 폴리펩타이드를 포함하는, 아데노신 데아미나제.
42. 구현예 36 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 변경된 PAM에 대해 특이성을 갖는, 아데노신 데아미나제.
43. 구현예 36 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 NGG, NGA, NGCG, NGN, NNGRRT, NNNRRT, NGCG, NGCN, NGTN, 및 NGC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PAM 서열에 대해 특이성을 갖고, 여기서, N이 A, G, C, 또는 T이고, R이 A 또는 G인, 아데노신 데아미나제.
44. 다음을 포함하는 융합 폴리펩타이드:
a) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인;
b) 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 아미노산 위치 82 또는 166에서의 변형, 또는 또 다른 아데노신 데이마나제에서 상응하는 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나제로서, 상기 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열은 서열번호 2와 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
45. 융합 폴리펩타이드로서, 상기 융합 폴리펩타이드는:
a) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인; 및
b) 아데노신 데아미나제를 포함하고,
상기 융합 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 제2 융합 폴리펩타이드 보다 큰 염기 편집 효율을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
46. 구현예 45에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드가 적어도 50% 염기 편집 효율을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
47. 구현예 45에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드가 적어도 70% 염기 편집 효율을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
48. 구현예 45에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 단백질 복합체 보다 적어도 5배 큰 염기 편집 효율을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
49. 구현예 45 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 염기 편집 효율이 상기 아데노신 데아미나제에 의해 수행된 표적 핵염기의 변형을 포함하는 총 서열분석 판독 백분율에 의해 결정되는, 융합 폴리펩타이드.
50. 감소된 삽입-결실 형성율을 갖는 융합 폴리펩타이드로서, 상기 융합 폴리펩타이는:
a) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인; 및
b) 아데노신 데아미나제를 포함하고,
상기 융합 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 제2 융합 폴리펩타이드와 비교하여 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 보다 낮은 삽입-결실 형성을 유도하는, 아데노신 데아미나제.
51. 구현예 50에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 제2 융합 폴리펩타이드와 비교하여 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 5% 미만의 삽입-결실 형성을 유도하는, 융합 폴리펩타이드.
52. 구현예 44 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드가 세포의 게놈에서 10% 미만의 삽입-결실을 유도하는, 융합 폴리펩타이드.
53. 구현예 51 또는 52에 있어서, 상기 삽입-결실 형성이 표적 핵염기 변형 및 비변형된 서열을 플랭킹하는 서열 간에 미스매치 빈도에 의해 측정되는, 융합 폴리펩타이드.
54. 보다 큰 특이성을 갖는 융합 폴리펩타이드로서, 상기 융합 폴리펩타이드는:
a) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인; 및
b) 아데노신 데아미나제를 포함하고,
상기 융합 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 융합 폴리펩타이드 보다 표적 핵염기에 대해 큰 특이성을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
55. 융합 폴리펩타이드로서, 상기 융합 폴리펩타이드:
a) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인; 및
b) 아데노신 데아미나제를 포함하고, 상기 융합 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 제2 융합 폴리펩타이드 보다 낮은 표적-이탈 탈아민화를 유도하는, 아데노신 데아미나제.
56. 구현예 55에 있어서, 상기 표적-이탈 탈아민화가 스퓨리어스 핵염기의 탈아민화를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
57. 구현예 55에 있어서, 상기 표적-이탈 탈아민화가 방관자 핵염기의 탈아민화를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
58. 융합 폴리펩타이드로서, 상기 융합 폴리펩타이드는:
a) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인; 및
b) 아데노신 데아미나제를 포함하고, 상기 융합 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 융합 폴리펩타이드 보다 큰 염기 편집 범위를 포함하는, 아데노신 데아미나제.
59. 구현예 58에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 융합 폴리펩타이드와 비교하여, 카노니칼 PAM 서열의 업스트림에 5, 6 또는 7개 염기쌍인 표적 핵염기에서 적어도 1.5배 큰 염기 편집 효율을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
60. 구현예 58 또는 59에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인 및 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 포함하는 융합 폴리펩타이드와 비교하여, 표적 폴리뉴클레오타이드에서 비-카노니칼 PAM 서열의 업스트림에 3, 4, 8, 9 또는 10개 염기쌍인 표적 핵염기에서 적어도 3배 큰 염기 편집 효율을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
61. 구현예 44 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제가 데옥시리보핵산 (DNA) 서열의 핵염기를 탈아민화시키는, 융합 폴리펩타이드.
62. 구현예 44 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열이 서열번호 2와 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
63. 구현예 44 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열이 서열번호 2와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
64. 구현예 44 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열이 서열번호 2와 적어도 99% 서열 동일성을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
65. 구현예 44 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 위치 82에서 변형, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변형을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
66. 구현예 44 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 위치 166에서 변형, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변형을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
67. 구현예 44 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 위치 82 및 166에서 변형, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변형을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
68. 구현예 44 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 V82S 변형을 포함하고, 위치 82가 서열번호 2에서 넘버링된 바와 같은, 융합 폴리펩타이드.
69. 구현예 44 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 V82X 변형을 포함하고, 위치 82가 서열번호 2에서 넘버링된 바와 같고, X가 V이외의 임의의 아미노산인, 융합 폴리펩타이드.
70. 구현예 44 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 T166R 변형을 포함하고, 위치 166이 서열번호 2에서 넘버링된 바와 같은, 융합 폴리펩타이드.
71. 구현예 44 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 T166X 변형을 포함하고, 위치 166이 서열번호 2에서 넘버링된 바와 같고, X가 T 이외의 임의의 아미노산인, 융합 폴리펩타이드.
72. 구현예 44 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 V82S 및 T166R 변형을 포함하고, 위치 82 및 166이 서열번호 2에서 넘버링된 바와 같은, 융합 폴리펩타이드.
73. 구현예 44 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 76, 82, 123, 147, 154, 및 166으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 변형을 추가로 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
74. 구현예 44 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 V82S, Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, Q154R, 및 T166R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
75. 구현예 44 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 변형의 조합을 추가로 포함하는, 융합 폴리펩타이드: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
76. 구현예 44 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156 및 157로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 개시하는 C-말단의 결실을 추가로 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
77. 구현예 44 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신 데아미자제가 표적 데옥시리보핵산에서 A-에서 G-로의 변형을 수행하는, 융합 폴리펩타이드.
78. 구현예 44 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인이 어떠한 상당한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는, 융합 폴리펩타이드.
79. 구현예 44 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인이 촉매적 데드 Cas9 (dCas9)를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
80. 구현예 79에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드의 삽입-결실 형성 빈도가 닉카제 Cas9 및 아데노신 데아미나제를 포함하는 융합 폴리펩타이드 보다 낮은, 융합 폴리펩타이드.
81. 구현예 80에 있어서, 상기 삽입-결실 형성 빈도가 닉카제 Cas9 및 아데노신 데아미나제를 포함하는 융합 폴리펩타이드 보다 적어도 약 90% 낮은, 융합 폴리펩타이드.
82. 구현예 44 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드가 하기 구조를 포함하는, 융합 폴리펩타이드:
NH2-[폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 단백질의 N-말단 단편]-[폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 단백질의 C-말단 단편]-COOH, 여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다.
83. 구현예 44 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 단백질이 Cas9 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
84. 구현예 83에 있어서, N-말단 단편의 C-말단 또는 C 말단 단편의 N-말단이 Cas9 폴리펩타이드의 가요성 루프의 일부를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
85. 구현예 83 또는 84에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 Cas9 닉카제 (nCas9)인, 융합 폴리펩타이드.
86. 구현예 83 또는 84에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 뉴클레아제 데드 Cas9 (dCas9)인, 융합 폴리펩타이드.
87. 구현예 83 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 SpCas9 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
88. 구현예 87에 있어서, 상기 SpCas9 폴리펩타이드가 D10A 및/또는 H840A 아미노산 치환을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
89. 구현예 83 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 SaCas9 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
90. 구현예 83 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 변경된 PAM에 대해 특이성을 갖는, 융합 폴리펩타이드.
91. 구현예 83 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 NGG, NGA, NGCG, NGN, NNGRRT, NNNRRT, NGCG, NGCN, NGTN, 및 NGC로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 PAM 서열에 대해 특이성을 갖고, 여기서, N이 A, G, C, 또는 T이고, R이 A 또는 G인, 융합 폴리펩타이드.
92.하기를 포함하는 아데노신 데아미나제 이량체:
a) 구현예 1 내지 43 중 어느 하나의 아데노신 데아미나제를 포함하는 제1 아데노신 데아미나제 단량체; 및
b) 제2 아데노신 데아미나제 단량체.
93. 구현예 92에 있어서, 상기 제2 아데노신 데아미나제 단량체가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 아데노신 데아미나제 이량체.
94. 구현예 92 또는 93에 있어서, 상기 제2 아데노신 데아미나제 단량체가 야생형 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열을 포함하는, 아데노신 데아미나제 이량체.
95. 구현예 92 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 아데노신 데아미나제 단량체가 서열번호 2에 넘버링된 바와 같이 위치 82 또는 166에서 변형, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제 단량체에서 상응하는 변형을 포함하는, 아데노신 데아미나제 이량체.
96. 구현예 92 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 아데노신 데아미나제 단량체가 제1 아데노신 데아미나제 단량체의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 아데노신 데아미나제 이량체.
97. 다음을 포함하는 염기-편집기 시스템:
a) 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 뉴클레오타이드 결합 도메인; 및
b) 구현예 1 내지 43 중 어느 하나의 아데노신 데아미나제.
98. 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 표적 핵염기를 편집하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 구현예 1 내지 43 중 어느 하나의 아데노신 데아미나제를 접촉시키는 단계로서, 상기 아데노신 데아미나제가 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 상기 표적 핵염기를 탈아민화시켜 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 상기 표적 핵염기를 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
99. 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 표적 핵염기를 편집하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 구현예 44 내지 91 중 어느 하나의 융합 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계로서, 상기 아데노신 데아미나제가 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 상기 표적 핵염기를 탈아민화시켜 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 상기 표적 핵염기를 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
100. 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 표적 핵염기를 편집하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 구현예 97의 염기 편집기 시스템을 접촉시키는 단계로서, 상기 아데노신 데아미나제가 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 상기 표적 핵염기를 탈아민화시켜 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 상기 표적 핵염기를 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
101. 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 구현예 1 내지 43 중 어느 하나의 아데노신 데아미나제를 접촉시키는 단계로서, 상기 아데노신 데아미나제가 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 표적 핵염기를 탈아민화시켜 상기 대상체에서 상기 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
102. 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 구현예 44 내지 91 중 어느 하나의 융합 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계로서, 상기 아데노신 데아미나제가 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 표적 핵염기를 탈아민화시켜 상기 대상체에서 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
103. 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 구현예 97의 염기 편집기 시스템을 접촉시키는 단계로서, 상기 아데노신 데아미나제가 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 표적 핵염기를 탈아민화시켜, 상기 대상체에서 상기 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
104. 구현예 101 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 장애가 점 돌연변이로부터 비롯되는, 방법.
105. 구현예 104에 있어서, 상기 점 돌연변이가 G에서 A로의 점 돌연변이인, 방법.
106. 구현예 105에 있어서, 상기 표적 핵염기가 돌연변이체 A 염기인, 방법.
107. 구현예 106에 있어서, 상기 돌연변이체 A 염기의 탈아민화가 장애와 연관되지 않은 서열을 유도하는, 방법.
108. 구현예 98 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 핵염기의 탈아민화가 상기 표적 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 코돈의 변화를 유도하는, 방법.
109. 구현예 98 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 탈아민화가 스플라이스 부위의 도입을 유도하는, 방법.
110. 구현예 98 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 탈아민화가 스플라이스 부위의 제거를 유도하는, 방법.
111. 구현예 98 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 탈아민화가 정지 코돈의 제거를 유도하는, 방법.
112. 구현예 98 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 탈아민화가 유전자 프로모터 서열에서 변형의 도입을 유도하는, 방법.
113. 구현예 112에 있어서, 상기 변형이 상기 유전자 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 유전자의 전사에서 증가를 유도하는, 방법.
114. 구현예 112에 있어서, 상기 변형이 상기 유전자 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 유전자의 전사에서 감소를 유도하는, 방법.
115. 구현예 98 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 탈아민화가 유전자 리프레서 서열에서 변형의 도입을 유도하는, 방법.
116. 구현예 115에 있어서, 상기 변형이 상기 유전자 리프레서 서열에 작동적으로 연결된 유전자의 전사에서 증가를 유도하는, 방법.
117. 구현예 115에 있어서, 상기 변형이 상기 유전자 리프레서 서열에 작동적으로 연결된 유전자의 전사에서 감소를 유도하는, 방법.
118. 구현예 98 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉이 생체내에서 일어나는, 방법.
119. 구현예 98 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉이 생체외에서 일어나는, 방법.
120. 구현예 98 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉이 세포에서 일어나는, 방법.
121. 구현예 120에 있어서, 상기 방법이 세포의 게놈에서 15% 미만의 삽입-결실을 유도하는, 방법.
122. 구현예 120에 있어서, 상기 방법이 세포의 게놈에서 5% 미만의 삽입-결실을 유도하는, 방법.
123. 구현예 120에 있어서, 상기 방법이 세포의 게놈에서 2% 미만의 삽입-결실을 유도하는, 방법.
124. 구현예 120 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포 또는 인간 세포인, 방법.
125. 구현예 98 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉이 세포 집단에서 일어나는, 방법.
126. 구현예 125에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 40%가 상기 접촉 후 탈아민화된 표적 핵염기를 포함하는, 방법.
127. 구현예 125에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 50%가 상기 접촉 후 탈아민화된 표적 핵염기를 포함하는, 방법.
128. 구현예 125에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 60%가 접촉 후 상기 탈아민화된 표적 핵염기 를 포함하는, 방법.
129. 구현예 125 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 85%가 상기 접촉 후 생존가능한, 방법.
130. 구현예 125 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 집단이 포유동물 세포 또는 인간 세포인, 방법.
131. 구현예 98 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신 데아미자제가 표적 데옥시리보핵산에서 A-에서 G-로의 변형을 수행하는, 방법.
132. 구현예 98 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 사용한 방법 보다 큰 편집 효율을 유도하는, 방법.
133. 구현예 98 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 사용한 방법 보다 적어도 5배 큰 염기 편집 효율을 유도하는, 방법.
134. 구현예 98 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 적어도 50% 염기 편집 효율을 유도하는, 방법.
135. 구현예 98 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 적어도 70% 염기 편집 효율을 유도하는, 방법.
136. 구현예 98 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 사용한 방법 보다 작은 삽입-결실 형성율을 유도하는, 방법.
137. 구현예 98 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 사용한 방법 보다 표적 핵염기에 대해 큰 특이성을 유도하는, 방법.
138. 구현예 98 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 서열번호 2의 아데노신 데아미나제를 사용한 방법 보다 작은 표적-이탈 탈아민화를 유도하는, 방법.
139. 구현예 99 내지 138 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 가이드 폴리뉴클레오타이드를 접촉시키는 단계로서, 상기 가이드 폴리뉴클레오타이드가, 상기 융합 폴리펩타이드가 상기 표적 핵염기의 탈아민화를 수행하도록 지시하는, 단계를 추가로 포함하는, 방법.
140. 구현예 139에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
SEQUENCE LISTING <110> BEAM THERAPEUTICS INC. <120> ADENOSINE DEAMINASE BASE EDITORS AND METHODS OF USING SAME TO MODIFY A NUCLEOBASE IN A TARGET SEQUENCE <130> 52885-789.601 <140> PCT/US2020/018192 <141> 2020-02-13 <150> 62/966,526 <151> 2020-01-27 <150> 62/941,523 <151> 2019-11-27 <150> 62/941,569 <151> 2019-11-27 <150> 62/931,722 <151> 2019-11-06 <150> 62/931,747 <151> 2019-11-06 <150> 62/912,992 <151> 2019-10-09 <150> 62/888,867 <151> 2019-08-19 <150> 62/876,354 <151> 2019-07-19 <150> 62/873,138 <151> 2019-07-11 <150> 62/873,140 <151> 2019-07-11 <150> 62/873,144 <151> 2019-07-11 <150> 62/852,228 <151> 2019-05-23 <150> 62/852,224 <151> 2019-05-23 <150> 62/805,238 <151> 2019-02-13 <150> 62/805,271 <151> 2019-02-13 <150> 62/805,277 <151> 2019-02-13 <160> 395 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 1 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 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<213> Bacillus subtilis <400> 6 Met Thr Gln Asp Glu Leu Tyr Met Lys Glu Ala Ile Lys Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Ala Glu Glu Lys Gly Glu Val Pro Ile Gly Ala Val Leu Val Ile 20 25 30 Asn Gly Glu Ile Ile Ala Arg Ala His Asn Leu Arg Glu Thr Glu Gln 35 40 45 Arg Ser Ile Ala His Ala Glu Met Leu Val Ile Asp Glu Ala Cys Lys 50 55 60 Ala Leu Gly Thr Trp Arg Leu Glu Gly Ala Thr Leu Tyr Val Thr Leu 65 70 75 80 Glu Pro Cys Pro Met Cys Ala Gly Ala Val Val Leu Ser Arg Val Glu 85 90 95 Lys Val Val Phe Gly Ala Phe Asp Pro Lys Gly Gly Cys Ser Gly Thr 100 105 110 Leu Met Asn Leu Leu Gln Glu Glu Arg Phe Asn His Gln Ala Glu Val 115 120 125 Val Ser Gly Val Leu Glu Glu Glu Cys Gly Gly Met Leu Ser Ala Phe 130 135 140 Phe Arg Glu Leu Arg Lys Lys Lys Lys Ala Ala Arg Lys Asn Leu Ser 145 150 155 160 Glu <210> 7 <211> 183 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <400> 7 Met Pro Pro Ala Phe Ile Thr Gly Val Thr Ser Leu Ser Asp Val Glu 1 5 10 15 Leu Asp His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg 20 25 30 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 aguauggaca cuguccaaag 20 <210> 20 <211> 125 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 guuuuuguac ucucaagauu uaaguaacug uacaacgaaa cuuacacagu uacuuaaauc 60 uugcagaagc uacaaagaua aggcuucaug ccgaaaucaa cacccuguca uuuuauggca 120 gggug 125 <210> 21 <211> 304 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Gly Val Phe Cys Leu Gly Pro Trp Gly Leu Gly Arg Lys Leu Arg 1 5 10 15 Thr Pro Gly Lys Gly Pro Leu Gln Leu Leu Ser Arg Leu Cys Gly Asp 20 25 30 His Leu Gln Ala Ile Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala Gly Gln Glu Glu 35 40 45 Pro Gly Thr Pro Pro Ser Ser Pro Leu Ser Ala Glu Gln Leu Asp Arg 50 55 60 Ile Gln Arg Asn Lys Ala Ala Ala Leu Leu Arg Leu Ala Ala Arg Asn 65 70 75 80 Val Pro Val Gly Phe Gly Glu Ser Trp Lys Lys His Leu Ser Gly Glu 85 90 95 Phe Gly Lys Pro Tyr Phe Ile Lys Leu Met Gly Phe Val Ala Glu Glu 100 105 110 Arg Lys His Tyr Thr Val Tyr Pro Pro 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ataacttaac taaagctgag 3900 aggggtggct tgtctgaact tgacaaggcc ggatttatta aacgtcagct cgtggaaacc 3960 cgccaaatca caaagcatgt tgcacagata ctagattccc gaatgaatac gaaatacgac 4020 gagaacgata agctgattcg ggaagtcaaa gtaatcactt taaagtcaaa attggtgtcg 4080 gacttcagaa aggattttca attctataaa gttagggaga taaataacta ccaccatgcg 4140 cacgacgctt atcttaatgc cgtcgtaggg accgcactca ttaagaaata cccgaagcta 4200 gaaagtgagt ttgtgtatgg tgattacaaa gtttatgacg tccgtaagat gatcgcgaaa 4260 agcgaacagg agataggcaa ggctacagcc aaatacttct tttattctaa cattatgaat 4320 ttctttaaga cggaaatcac tctggcaaac ggagagatac gcaaacgacc tttaattgaa 4380 accaatgggg agacaggtga aatcgtatgg gataagggcc gggacttcgc gacggtgaga 4440 aaagttttgt ccatgcccca agtcaacata gtaaagaaaa ctgaggtgca gaccggaggg 4500 ttttcaaagg aatcgattct tccaaaaagg aatagtgata agctcatcgc tcgtaaaaag 4560 gactgggacc cgaaaaagta cggtggcttc gatagcccta cagttgccta ttctgtccta 4620 gtagtggcaa aagttgagaa gggaaaatcc aagaaactga agtcagtcaa agaattattg 4680 gggataacga ttatggagcg ctcgtctttt gaaaagaacc ccatcgactt ccttgaggcg 4740 aaaggttaca aggaagtaaa aaaggatctc ataattaaac taccaaagta tagtctgttt 4800 gagttagaaa atggccgaaa acggatgttg gctagcgccg gagagcttca aaaggggaac 4860 gaactcgcac taccgtctaa atacgtgaat ttcctgtatt tagcgtccca ttacgagaag 4920 ttgaaaggtt cacctgaaga taacgaacag aagcaacttt ttgttgagca gcacaaacat 4980 tatctcgacg aaatcataga gcaaatttcg gaattcagta agagagtcat cctagctgat 5040 gccaatctgg acaaagtatt aagcgcatac aacaagcaca gggataaacc catacgtgag 5100 caggcggaaa atattatcca tttgtttact cttaccaacc tcggcgctcc agccgcattc 5160 aagtattttg acacaacgat agatcgcaaa cgatacactt ctaccaagga ggtgctagac 5220 gcgacactga ttcaccaatc catcacggga ttatatgaaa ctcggataga tttgtcacag 5280 cttgggggtg actctggtgg ttctggagga tctggtggtt ctactaatct gtcagatatt 5340 attgaaaagg agaccggtaa gcaactggtt atccaggaat ccatcctcat gctcccagag 5400 gaggtggaag aagtcattgg gaacaagccg gaaagcgata tactcgtgca caccgcctac 5460 gacgagagca ccgacgagaa tgtcatgctt ctgactagcg acgcccctga atacaagcct 5520 tgggctctgg tcatacagga tagcaacggt gagaacaaga 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gcattaatga atcggccaac 6420 gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 6480 tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 6540 tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 6600 ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 6660 agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 6720 accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 6780 ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 6840 gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 6900 ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 6960 gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 7020 taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 7080 tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 7140 gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 7200 cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 7260 agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 7320 cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 7380 cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 7440 ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 7500 taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 7560 tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 7620 ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 7680 atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 7740 gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 7800 tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 7860 cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 7920 taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 7980 ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 8040 ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 atgagctcag agactggccc agtggctgtg gaccccacat tgagacggcg gatcgagccc 60 catgagtttg aggtattctt cgatccgaga gagctccgca aggagacctg cctgctttac 120 gaaattaatt gggggggccg gcactccatt tggcgacata catcacagaa cactaacaag 180 cacgtcgaag tcaacttcat cgagaagttc acgacagaaa gatatttctg tccgaacaca 240 aggtgcagca ttacctggtt tctcagctgg agccgcgaat gtagtagggc catcactgaa 300 ttcctgtcaa ggtatcccca cgtcactctg tttatttaca tcgcaaggct gtaccaccac 360 gctgaccccc gcaatcgaca aggcctgcgg gatttgatct cttcaggtgt gactatccaa 420 attatgactg agcaggagtc aggatactgc tggagaaact ttgtgaatta tagcccgagt 480 aatgaagccc actggcctag gtatccccat ctgtgggtac gactgtacgt tcttgaactg 540 tactgcatca tactgggcct gcctccttgt ctcaacattc tgagaaggaa gcagccacag 600 ctgacattct ttaccatcgc tcttcagtct tgtcattacc agcgactgcc cccacacatt 660 ctctgggcca ccgggttgaa atctggtggt tcttctggtg gttctagcgg cagcgagact 720 cccgggacct cagagtccgc cacacccgaa agttctggtg gttcttctgg tggttctgat 780 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<211> 8811 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 60 cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 120 ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 180 cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 240 atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 300 ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct 360 agagatccgc ggccgctaat acgactcact atagggagag ccgccaccat gaaacggaca 420 gccgacggaa gcgagttcga gtcaccaaag aagaagcgga aagtctctga agtcgagttt 480 agccacgagt attggatgag gcacgcactg accctggcaa agcgagcatg ggatgaaaga 540 gaagtccccg tgggcgccgt gctggtgcac aacaatagag tgatcggaga gggatggaac 600 aggccaatcg gccgccacga ccctaccgca cacgcagaga tcatggcact gaggcaggga 660 ggcctggtca tgcagaatta ccgcctgatc gatgccaccc tgtatgtgac actggagcca 720 tgcgtgatgt gcgcaggagc aatgatccac 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<400> 111 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val 20 25 30 Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala 35 40 45 Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ala Ile Tyr Glu 50 55 60 His His Glu Gln Asp Pro Lys Asn Pro Lys Lys Val Ser Lys Ala Glu 65 70 75 80 Ile Gln Ala Glu Leu Trp Asp Phe Val Leu Lys Met Gln Lys Cys Asn 85 90 95 Ser Phe Thr His Glu Val Asp Lys Asp Glu Val Phe Asn Ile Leu Arg 100 105 110 Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Val Pro Ser Ser Val Glu Lys Lys Gly Glu 115 120 125 Ala Asn Gln Leu Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn 130 135 140 Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ala Ser Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp 145 150 155 160 Tyr Asn Leu Lys Ile Ala Gly Asp Pro Ser Trp Glu Glu Glu Lys Lys 165 170 175 Lys Trp Glu Glu Asp Lys Lys Lys Asp Pro Leu Ala Lys Ile Leu Gly 180 185 190 Lys Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Pro Tyr Thr Asp 195 200 205 Ser Asn Glu 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ggtctttaac 3600 gcccagaaaa aagcacaatc ctctactgac ggctcttctg gatctgaaac acctggcaca 3660 agcgagagcg ccacccctga gagctctggc ctgaaaatca agaagggcag ctccaagcag 3720 agcagcagcg agctggtgga tagcgacatc ctgaaagaca gcttcgacct ggcctccgag 3780 ctgaaaggcg aaaagctgat gctgtacagg gaccccagcg gcaatgtgtt ccccagcgac 3840 aaatggatgg ccgctggcgt gttcttcgga aagctggaac gcatcctgat cagcaagctg 3900 accaaccagt actccatcag caccatcgag gacgacagca gcaagcagtc tatgaaaagg 3960 ccggcggcca cgaaaaaggc cggccaggca aaaaagaaaa agggatccta cccatacgat 4020 gttccagatt acgcttatcc ctacgacgtg cctgattatg catacccata tgatgtcccc 4080 gactatgcct aa 4092 <210> 113 <211> 1361 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 113 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val 20 25 30 Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala 35 40 45 Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg 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tatatgctaa tatagtaata gtaatggtgg 2100 ttggtactat ggtaattacc ataaaaatta ttatcctttt aaaataaagc taattattat 2160 tggatctttt ttagtattca ttttatgttt tttatgtttt tgatttttta aaagacaatc 2220 tcaccctgtt acccaggctg gagtgcagtg gtgcaatcat agctttctgc agtcttgaac 2280 tcctgggctc aagcaatcct cctgccttgg cctcccaaag tgttgggata cagtcatgag 2340 ccactgcatc tggcctagga tccatttaga ttaaaatatg cattttaaat tttaaaataa 2400 tatggctaat ttttacctta tgtaatgtgt atactggcaa taaatctagt ttgctgccta 2460 aagtttaaag tgctttccag taagcttcat gtacgtgagg ggagacattt aaagtgaaac 2520 agacagccag gtgtggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctctgggagg ctgaggtggg 2580 tggatcgctt gagccctgga gttcaagacc agcctgagca acatggcaaa acgctgtttc 2640 tataacaaaa attagccggg catggtggca tgtgcctgtg gtcccagcta ctagggggct 2700 gaggcaggag aatcgttgga gcccaggagg tcaaggctgc actgagcagt gcttgcgcca 2760 ctgcactcca gcctgggtga caggaccaga ccttgcctca aaaaaataag aagaaaaatt 2820 aaaaataaat ggaaacaact acaaagagct gttgtcctag atgagctact tagttaggct 2880 gatattttgg tatttaactt ttaaagtcag 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gtagaaaacc acgaaagaac tttcaaagcc 7980 tgggaagggc tgcatgaaaa ttcagttcgt ctctccagac agcttcggcg catccttttg 8040 gtaaggggct tcctcgcttt ttaaattttc tttctttctc tacagtcttt tttggagttt 8100 cgtatatttc ttatattttc ttattgttca atcactctca gttttcatct gatgaaaact 8160 ttatttctcc tccacatcag ctttttcttc tgctgtttca ccattcagag ccctctgcta 8220 aggttccttt tccctccctt ttctttcttt tgttgtttca catctttaaa tttctgtctc 8280 tccccagggt tgcgtttcct tcctggtcag aattcttttc tccttttttt tttttttttt 8340 tttttttttt aaacaaacaa acaaaaaacc caaaaaaact ctttcccaat ttactttctt 8400 ccaacatgtt acaaagccat ccactcagtt tagaagactc tccggcccca ccgaccccca 8460 acctcgtttt gaagccattc actcaatttg cttctctctt tctctacagc ccctgtatga 8520 ggttgatgac ttacgagacg catttcgtac tttgggactt tgatagcaac ttccaggaat 8580 gtcacacacg atgaaatatc tctgctgaag acagtggata aaaaacagtc cttcaagtct 8640 tctctgtttt tattcttcaa ctctcacttt cttagagttt acagaaaaaa tatttatata 8700 cgactcttta aaaagatcta tgtcttgaaa atagagaagg aacacaggtc tggccaggga 8760 cgtgctgcaa ttggtgcagt tttgaatgca acattgtccc ctactgggaa taacagaact 8820 gcaggacctg ggagcatcct aaagtgtcaa cgtttttcta tgacttttag gtaggatgag 8880 agcagaaggt agatcctaaa aagcatggtg agaggatcaa atgtttttat atcaacatcc 8940 tttattattt gattcatttg agttaacagt ggtgttagtg atagattttt ctattctttt 9000 cccttgacgt ttactttcaa gtaacacaaa ctcttccatc aggccatgat ctataggacc 9060 tcctaatgag agtatctggg tgattgtgac cccaaaccat ctctccaaag cattaatatc 9120 caatcatgcg ctgtatgttt taatcagcag aagcatgttt ttatgtttgt acaaaagaag 9180 attgttatgg gtggggatgg aggtatagac catgcatggt caccttcaag ctactttaat 9240 aaaggatctt aaaatgggca ggaggactgt gaacaagaca ccctaataat gggttgatgt 9300 ctgaagtagc aaatcttctg gaaacgcaaa ctcttttaag gaagtcccta atttagaaac 9360 acccacaaac ttcacatatc ataattagca aacaattgga aggaagttgc ttgaatgttg 9420 gggagaggaa aatctattgg ctctcgtggg tctcttcatc tcagaaatgc caatcaggtc 9480 aaggtttgct acattttgta tgtgtgtgat gcttctccca aaggtatatt aactatataa 9540 gagagttgtg acaaaacaga atgataaagc tgcgaaccgt ggcacacgct catagttcta 9600 gctgcttggg aggttgagga gggaggatgg cttgaacaca ggtgttcaag gccagcctgg 9660 gcaacataac aagatcctgt ctctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagaaag agagagggcc 9720 gggcgtggtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggga ggccgagccg ggcggatcac 9780 ctgtggtcag gagtttgaga ccagcctggc caacatggca aaaccccgtc tgtactcaaa 9840 atgcaaaaat tagccaggcg tggtagcagg cacctgtaat cccagctact tgggaggctg 9900 aggcaggaga atcgcttgaa cccaggaggt ggaggttgca gtaagctgag atcgtgccgt 9960 tgcactccag cctgggcgac aagagcaaga ctctgtctca gaaaaaaaaa aaaaaaagag 10020 agagagagag aaagagaaca atatttggga gagaaggatg gggaagcatt gcaaggaaat 10080 tgtgctttat ccaacaaaat gtaaggagcc aataagggat ccctatttgt ctcttttggt 10140 gtctatttgt ccctaacaac tgtctttgac agtgagaaaa atattcagaa taaccatatc 10200 cctgtgccgt tattacctag caacccttgc aatgaagatg agcagatcca caggaaaact 10260 tgaatgcaca actgtcttat tttaatctta ttgtacataa gtttgtaaaa gagttaaaaa 10320 ttgttacttc atgtattcat ttatatttta tattattttg cgtctaatga ttttttatta 10380 acatgatttc cttttctgat atattgaaat ggagtctcaa agcttcataa atttataact 10440 ttagaaatga ttctaataac aacgtatgta attgtaacat tgcagtaatg gtgctacgaa 10500 gccatttctc ttgattttta gtaaactttt atgacagcaa atttgcttct ggctcacttt 10560 caatcagtta aataaatgat aaataatttt ggaagctgtg aagataaaat accaaataaa 10620 ataatataaa agtgatttat atgaagttaa aataaaaaat cagtatgatg gaataaactt 10680 g 10681 <210> 127 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Met Asp Ser Leu Leu Met Asn Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Gln Phe Lys 1 5 10 15 Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg Arg Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val 20 25 30 Val Lys Arg Arg Asp Ser Ala Thr Ser Phe Ser Leu Asp Phe Gly Tyr 35 40 45 Leu Arg Asn Lys Asn Gly Cys His Val Glu Leu Leu Phe Leu Arg Tyr 50 55 60 Ile Ser Asp Trp Asp Leu Asp Pro Gly Arg Cys Tyr Arg Val Thr Trp 65 70 75 80 Phe Thr Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Arg His Val Ala Asp 85 90 95 Phe Leu Arg Gly Asn Pro Asn Leu Ser Leu Arg Ile Phe Thr Ala Arg 100 105 110 Leu Tyr Phe Cys Glu Asp Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gly Leu Arg Arg 115 120 125 Leu His Arg Ala Gly Val Gln Ile Ala Ile Met Thr Phe Lys Asp Tyr 130 135 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<400> 189 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 190 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 190 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 191 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 191 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 192 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(21) <223> This sequence may encompass 1, 3 or 7 "Gly Gly Ser" repeating units <400> 192 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser 20 <210> 193 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 193 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 194 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 194 Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 <210> 195 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 195 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 196 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 196 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 <210> 197 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 197 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 198 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 198 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 <210> 199 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 199 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Ala Pro Ala Pro 20 <210> 200 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (98)..(117) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 200 guucugtcuu uuggucagga caaccgucua gcuauaagug cugcagggug ugagaaacuc 60 cuauugcugg acgaugucuc uuacgaggca uuagcacnnn nnnnnnnnnn nnnnnnn 117 <210> 201 <211> 108 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (89)..(108) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 201 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggagcaccug aaaacaggug cuuggcacnn nnnnnnnnnn nnnnnnnn 108 <210> 202 <211> 119 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (100)..(119) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 202 gucuaaagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggcc acuuuccagg uggcaaagcc 60 cguugaacuu cucaaaaaga acgaucugag aaguggcacn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 119 <210> 203 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 203 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 204 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 204 Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro 1 5 10 15 Glu Ser Ser Gly 20 <210> 205 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 ggaggctctg gaggaagc 18 <210> 206 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 ggctcttctg gatctgaaac acctggcaca agcgagagcg ccacccctga gagctctggc 60 <210> 207 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 207 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala <210> 208 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc c 51 <210> 209 <211> 1554 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 209 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 210 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val 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<211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 256 gaacacaaag cauagacugc 20 <210> 257 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 257 gggaaagacc cagcauccgu 20 <210> 258 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 gcucccauca caucaaccgg 20 <210> 259 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 259 ggugagugag ugugugcgug 20 <210> 260 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 260 ggcuucaggu ucuaaaugag 20 <210> 261 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 261 gcagagaguc gccgucucca 20 <210> 262 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 262 guguaagacc ucaaaagcac 20 <210> 263 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 263 gaugagaagg agaaguucuu 20 <210> 264 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 264 gaggacaaag uacaaacggc 20 <210> 265 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 265 gccaccacag ggaagcuggg 20 <210> 266 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 266 gcucucaggc ccuguccgca 20 <210> 267 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 gagcaaauac cagagauaag 20 <210> 268 <211> 20 <212> RNA <213> 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Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 284 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntga gggagagccg tgtagtt 57 <210> 285 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 285 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg cctctcaaag tgctgggat 49 <210> 286 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 286 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncca tcaggctctc agctcag 57 <210> 287 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 287 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc tcgtgggttt gtggttgc 48 <210> 288 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 288 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngcc cattccctct ttagcca 57 <210> 289 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 289 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg agccgttccc tctttgcta 49 <210> 290 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 290 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnaac ctgtgtgaca cttggca 57 <210> 291 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 291 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg tctggcccaa gatcacaca 49 <210> 292 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(36) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 292 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnncacg 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 297 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt ctgatgggga ggaacgagt 49 <210> 298 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 298 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncag ctcagcctga gtgttga 57 <210> 299 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 299 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg cccaccctag tcattggag 49 <210> 300 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 300 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngtc agagggacac actgtgg 57 <210> 301 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 301 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Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 310 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntcc gcacagcctt agttcaa 57 <210> 311 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 311 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta acttgaagag acggcagca 49 <210> 312 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 312 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnccc ccagctacag aaaggtc 57 <210> 313 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 313 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta tttccaccgc aaaatggcc 49 <210> 314 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, 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tctnnnnggg aggtggagag aggatgt 57 <210> 319 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 319 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta ctcttcctga ggtctaggaa cccg 54 <210> 320 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 320 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnccc tgttcctaaa gcccacc 57 <210> 321 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 321 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta ctctctggtt ctgtttgtgg cca 53 <210> 322 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 322 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnatt tgatggagtt ggacatggcc 60 <210> 323 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 323 tggagttcag acgtgtgctc tccagctact tgttcttgag tgaagg 46 <210> 324 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 324 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntgg ctttccaaat cagtgggtc 59 <210> 325 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 325 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc tcataagctt agaccaacaa gc 52 <210> 326 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 326 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnctg gttgaccaat ctgtggtg 58 <210> 327 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 327 tggagttcag acgtgtgctc tctgcgtctg gatcaggtac g 41 <210> 328 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 328 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngtg tggagagtga gtaagcca 58 <210> 329 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 329 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta cggtaggatg atttcaggca 50 <210> 330 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 330 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncac aaagcagtgt agctcagg 58 <210> 331 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 331 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt ttttggtact cgagtgttat 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 336 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntga gagggaacag aagggct 57 <210> 337 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 337 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg tccaaaggcc caagaacct 49 <210> 338 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 338 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntcc tagcactttg gaaggtcg 58 <210> 339 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 339 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg ctcatcttaa tctgctcagc c 51 <210> 340 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> 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344 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnttt ggcaatggag gcattgg 57 <210> 345 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 345 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg aagaggctgc ccatgagag 49 <210> 346 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 346 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnggt ctgaggctcg aatcctg 57 <210> 347 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 347 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc tgtggcctcc atatccctg 49 <210> 348 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 348 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnttt ccaccagaac tcagccc 57 <210> 349 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 349 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc ctcggttcct ccacaacac 49 <210> 350 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 350 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncac gggaaggaca ggagaag 57 <210> 351 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 351 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg caggggaggg ataaagcag 49 <210> 352 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 352 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngga aacgcccatg caattagtc 59 <210> 353 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 353 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc ttgtcaacca gtatcccggt g 51 <210> 354 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 354 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntga atggattcct tggaaacaat 60 g 61 <210> 355 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 355 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc cagccccatc tgtcaaact 49 <210> 356 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 356 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt cctttcaacc cgaacggag 49 <210> 357 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 357 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngct ggtcttcttt cccctcc 57 <210> 358 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (34)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 358 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngcc ctgcttcttt ttctctggt 59 <210> 359 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 359 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta ccattaacgc agccaacttc a 51 <210> 360 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 360 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcatgagg tctatggact tcaagagcaa 60 <210> 361 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 361 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc atcattgacc agagctctgg gcagaa 56 <210> 362 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 362 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgcactta ccagcattac ttcctaaacc 60 <210> 363 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 363 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta tgggctccac ttttcagctc tgtaa 55 <210> 364 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 364 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagttca ggcacatgta ggaggga 57 <210> 365 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 365 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta ccgcctgcag ctgtcggaca ctggca 56 <210> 366 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 366 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaaaagat gagtatgcct gccgtg 56 <210> 367 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 367 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc agattgttta tatcagatgg gatggg 56 <210> 368 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 368 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctatgcaag tttggtcctg agccctccc 59 <210> 369 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 369 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg atgtgggttc cctgcgctct gca 53 <210> 370 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 370 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctccaggga ctgagggtgg aaggtcc 57 <210> 371 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 371 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta cctccgcctg agcagtggag aa 52 <210> 372 <211> 120 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 372 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 <210> 373 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 373 tcgagctcgg tacctaatac gactcac 27 <210> 374 <211> 149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 374 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 cttcctactc aggctttatt caaagacca 149 <210> 375 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 375 cuuaccccac uuaacuaucu 20 <210> 376 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 376 cccuaccugu caccaggacc 20 <210> 377 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 377 caccuaccua agaaccaucc 20 <210> 378 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 378 cacucaccuu agccugagca 20 <210> 379 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 379 cuuaccuggg cuggggaaga 20 <210> 380 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 380 auuauaccug ccaugccgua 20 <210> 381 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 381 guggggaagg ggcccccaag 20 <210> 382 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 382 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 383 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 383 ttgaccaata gcc 13 <210> 384 <211> 67 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 384 tggctaaact ccacccatgg gttggccagc cttgccttga ccaatagcct tgacaaggca 60 aacttga 67 <210> 385 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Val or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser or Pro <400> 385 His Leu Thr Pro Xaa Glu Lys Xaa 1 5 <210> 386 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 386 gcatctgact cctgtggaga agtct 25 <210> 387 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 387 agacttctcc acaggagtca gatgc 25 <210> 388 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 388 His Leu Thr Pro Val Glu Lys Ser 1 5 <210> 389 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 389 gaacacaaag catagactgc 20 <210> 390 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 390 gggaaagacc cagcatccgt 20 <210> 391 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 391 gctcccatca catcaaccgg 20 <210> 392 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 392 ggcttcaggt tctaaatgag 20 <210> 393 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 393 gcagagagtc gccgtctcca 20 <210> 394 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 394 gtgtaagacc tcaaaagcac 20 <210> 395 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 395 gtggggaagg ggcccccaag agg 23

Claims (134)

  1. 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인 및 MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSST의 아미노산 위치 82 및/또는 166에서의 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 아미노산 위치 82 및 166에서의 변경을 포함하는, 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아데노신 데아마니제 변이체가 V82S 변경을 포함하는, 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 T166R 변경을 포함하는, 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 V82S 및 T166R 변경을 포함하는, 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 하기의 변경 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 융합 단백질: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및 Q154R.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는, 융합 단백질: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 및 157로 이루어진 그룹으로부터 선택된 잔기에서 시작하는 C말단의 결실을 포함하는, 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기 도메인이 아데노신 데아미나제 변이체 단량체를 포함하는, 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기 도메인이 ABE8.1-m, ABE8.2-m, ABE8.3-m, ABE8.4-m, ABE8.5-m, ABE8.6-m, ABE8.7-m, ABE8.8-m, ABE8.9-m, ABE8.10-m, ABE8.11-m, ABE8.12-m, ABE8.13-m, ABE8.14-m, ABE8.15-m, ABE8.16-m, ABE8.17-m, ABE8.18-m, ABE8.19-m, ABE8.20-m, ABE8.21-m, ABE8.22-m, ABE8.23-m, 또는 ABE8.24-m인, 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기 도메인이 야생형 아데노신 데아미나제 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체를 포함하는, 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제8항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기 도메인이 ABE8.1-d, ABE8.2-d, ABE8.3-d, ABE8.4-d, ABE8.5-d, ABE8.6-d, ABE8.7-d, ABE8.8-d, ABE8.9-d, ABE8.10-d, ABE8.11-d, ABE8.12-d, ABE8.13-d, ABE8.14-d, ABE8.15-d, ABE8.16-d, ABE8.17-d, ABE8.18-d, ABE8.19-d, ABE8.20-d, ABE8.21-d, ABE8.22-d, ABE8.23-d, 또는 ABE8.24-d인, 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기 도메인이 TadA7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체를 포함하는, 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 TadA*8.1, TadA*8.2, TadA*8.3, TadA*8.4, TadA*8.5, TadA*8.6, TadA*8.7, TadA*8.8, TadA*8.9, TadA*8.10, TadA*8.11, TadA*8.12, TadA*8.13, TadA*8.14, TadA*8.15, TadA*8.16, TadA*8.17, TadA*8.18, TadA*8.19, TadA*8.20, TadA*8.21, TadA*8.22, TadA*8.23, 또는 TadA*8.24인, 융합 단백질.
  15. 제1항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 아데노신 데아미나제 활성을 갖는, 하기의 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진, 융합 단백질:
    Figure pct00293
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가, 전장 아데노신 데아미나제에 상대적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20개 N-말단 아미노산 잔기가 결실된, 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 전장 아데노신 데아미나제에 상대적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 C-말단 아미노산 잔기가 결실된 절단된 아데노신 데아미나제인, 융합 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인이 하기의 서열을 포함하는, 융합 단백질:
    Figure pct00294
    (여기서, 상기 굵게 표시한 서열이 Cas9로부터 유래된 서열을 지적하고, 이탤릭 서열이 링커 서열을 지칭하고, 상기 밑줄친 서열이 양분된 핵 국소화 서열을 지칭한다).
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 Y147R + Q154R +Y123H를 포함하는, 융합 단백질.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 Y147R + Q154R + I76Y를 포함하는, 융합 단백질.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 Y147R + Q154R + T166R을 포함하는, 융합 단백질.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 Y147T + Q154R을 포함하는, 융합 단백질.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 Y147T + Q154S를 포함하는, 융합 단백질.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 Y147R + Q154S를 포함하는, 융합 단백질.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 V82S + Q154S를 포함하는, 융합 단백질.
  26. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 V82S + Y147R을 포함하는, 융합 단백질.
  27. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 V82S + Q154R을 포함하는, 융합 단백질.
  28. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 V82S + Y123H를 포함하는, 융합 단백질.
  29. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 I76Y + V82S를 포함하는, 융합 단백질.
  30. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 V82S + Y123H + Y147T를 포함하는, 융합 단백질.
  31. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 V82S + Y123H + Y147R을 포함하는, 융합 단백질.
  32. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 V82S + Y123H + Q154R을 포함하는, 융합 단백질.
  33. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 Y123H+ Y147R + Q154R + I76Y를 포함하는, 융합 단백질.
  34. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 V82S + Y123H + Y147R + Q154R을 포함하는, 융합 단백질.
  35. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R을 포함하는, 융합 단백질.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인이 Cas9인, 융합 단백질.
  37. 제36항에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 하기의 아미노산 서열 (Cas9 참조 서열) 또는 이의 상응하는 영역을 포함하는, 융합 단백질:
    Figure pct00295
    (한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인; (Cas9 참조 서열).
  38. 제36항에 있어서, 상기 Cas9가 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) Cas9 (SaCas9), 스트렙토코커스 써모필러스 1 (Streptococcus thermophilus 1) Cas9 (St1Cas9), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) Cas9 (SpCas9), 또는 이의 변이체인, 융합 단백질.
  39. 제38항에 있어서, 상기 Cas9가 변경된 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM) 특이성을 갖거나 비-G PAM에 대해 특이성을 갖는 SpCas9인, 융합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, 상기 변경된 PAM이 상기 핵산 서열 5'-NGC-3'에 대해 특이성을 갖는, 융합 단백질.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 SpCas9가 아미노산 치환 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인이 뉴클레아제 불활성 또는 닉카제 변이체인, 융합 단백질.
  43. 제42항에 있어서, 상기 닉카제 변이체가 아미노산 치환 D10A 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기 도메인이 아연 핑거 도메인을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 데옥시리보핵산 (DNA)에서 아데닌을 탈아민화시킬 수 있는, 융합 단백질.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) TadA, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) TadA, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) TadA, 슈와넬라 푸트레파시엔스 (Shewanella putrefaciens) TadA, 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) F3031 TadA, 콜로박터 크레슨투스 (Caulobacter crescentus) (씨. 크레센투스 (C. crescentus)) TadA, 또는 게오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens) TadA, 또는 이의 단편인, 융합 단백질.
  47. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 자연에서 발생하지 않는 아데노신 데아미나제인, 융합 단백질.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인과 상기 아데노신 데아미나제 변이체 사이에 링커를 포함하는, 융합 단백질.
  49. 제48항에 있어서, 상기 링커가 하기 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질:
    SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 핵 국소화 신호를 포함하는, 융합 단백질.
  51. 제50항에 있어서, 상기 핵 국소화 신호가 양분된 핵 국소화 신호인, 융합 단백질.
  52. 제38항에 있어서, 상기 Cas9가 변형된 SaCas9인, 융합 단백질.
  53. 제51항에 있어서, 상기 변경된 SaCas9가 아미노산 치환 E781K, N967K, 및 R1014H, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
  54. 제51항에 있어서, 상기 변형된 SaCas9가 하기 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질:
    Figure pct00296
  55. 하기를 포함하는 융합 단백질:
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체 도메인: MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSST, 또는 이의 변이체 (여기서, 상기 아미노산 서열은 적어도 하나의 변경을 포함한다), 및
    Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드 (여기서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드 내에 삽입된다).
  56. 제55항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 아미노산 위치 82 및/또는 166에서 변경을 포함하는, 융합 단백질.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변경이 V82S, T166R, Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및/또는 Q154R을 포함하는, 융합 단백질.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 하기의 변경의 조합 중 하나를 포함하는, 융합 단백질: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 TadA*8.1, TadA*8.2, TadA*8.3, TadA*8.4, TadA*8.5, TadA*8.6, TadA*8.7, TadA*8.8, TadA*8.9, TadA*8.10, TadA*8.11, TadA*8.12, TadA*8.13, TadA*8.14, TadA*8.15, TadA*8.16, TadA*8.17, TadA*8.18, TadA*8.19, TadA*8.20, TadA*8.21, TadA*8.22, TadA*8.23, 또는 TadA*8.24인, 융합 단백질.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 및 157로 이루어진 그룹으로부터 선택된 잔기에서 시작하는 C말단의 결실을 포함하는, 융합 단백질.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 TadA*8 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 포함하는 아데노신 데아미나제 단량체인, 융합 단백질.
  62. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 야생형 아데노신 데아미나제 도메인 및 TadA*8 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체인, 융합 단백질.
  63. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 TadA 도메인 및 TadA*8 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체인, 융합 단백질.
  64. 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드의 가요성 루프, 알파 나선 영역, 비구조화된 부분 또는 용매 접근 가능한 부분 내에 삽입되는, 융합 단백질.
  65. 제64항에 있어서, 상기 가요성 루프가 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드의 알파 나선 구조의 일부를 포함하는, 융합 단백질.
  66. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 Cas9 폴리펩타이드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹되는, 융합 단백질.
  67. 제65항에 있어서, 상기 융합 단백질이 하기 구조를 포함하는, 융합 단백질:
    NH2-[Cas9의 N-말단 단편]-[아데노신 데아미나제 변이체]-[Cas9의 C-말단 단편]-COOH (여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다).
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드의 N-말단 단편 또는 C-말단 단편이 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하는, 융합 단백질.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-말단 단편의 C-말단 또는 상기 C 말단 단편의 N-말단이 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드의 가요성 루프의 일부를 포함하는, 융합 단백질.
  70. 제69항에 있어서, 상기 가요성 루프가, 상기 융합 단백질이 표적 핵염기를 탈아민화시키는 경우, 표적 핵염기에 근접한 아미노산을 포함하는, 융합 단백질.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵염기가 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열로부터 1 내지 20개 핵염기로 이격되어 있는, 융합 단백질.
  72. 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵염기가 PAM 서열의 2 내지 12개 핵염기 업스트림에 있는, 방법.
  73. 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 N-말단 단편 또는 상기 C-말단 단편이 RuvC 도메인을 포함하거나;
    상기 N-말단 단편 또는 상기 C-말단 단편이 HNH 도메인을 포함하거나;
    상기 N-말단 단편 및 상기 C-말단 단편의 어느 것도 HNH 도메인을 포함하지 않거나;
    상기 N-말단 단편 및 상기 C-말단 단편의 어느 것도 RuvC 도메인을 포함하지 않는, 융합 단백질.
  74. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드가 하나 이상의 구조적 도메인에서 부분적 또는 완전한 결실을 포함하고, 상기 아데노신 데아미나제가 Cas9 또는 Cas12 폴리펩타이드의 부분적 또는 완전한 결실 위치에 삽입되는, 융합 단백질.
  75. 제74항에 있어서,
    상기 결실이 RuvC 도메인 내에 있거나;
    상기 결실이 HNH 도메인 내에 있거나;
    상기 결실이 RuvC 도메인과 C-말단 도메인을 브릿징하는, 융합 단백질.
  76. 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 상기 Cas12 폴리펩타이드에 삽입되는, 융합 단백질.
  77. 제76항에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) Cas9 (SpCas9), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) Cas9 (SaCas9), 스트렙토코커스 써모필러스 1 (Streptococcus thermophilus 1) Cas9 (St1Cas9), 또는 이의 변이체인, 융합 단백질.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 Cas9가 하기의 아미노산 서열 (Cas9 참조 서열), 또는 이의 상응하는 영역을 포함하는, 융합 단백질:
    Figure pct00297
    (한줄 밑줄: HNH 도메인; 두줄 밑줄: RuvC 도메인; ("Cas9 참조 서열").
  79. 제78항에 있어서,
    상기 Cas9 폴리펩타이드가 Cas9 폴리펩타이드 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 1017-1069 또는 이의 상응하는 아미노산의 결실을 포함하거나;
    상기 Cas9 폴리펩타이드가 Cas9 폴리뉴클레오타이드 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 792-872 또는 이의 상응하는 아미노산의 결실을 포함하거나;
    상기 Cas9 폴리펩타이드가 Cas9 폴리뉴클레오타이드 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 792-906 또는 이의 상응하는 아미노산의 결실을 포함하는, 융합 단백질.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 상기 Cas9 폴리펩타이드의 가요성 루프 내에 삽입되는, 융합 단백질.
  81. 제80항에 있어서, 상기 가요성 루프가 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 위치 530-537, 569-579, 686-691, 768-793, 943-947, 1002-1040, 1052-1077, 1232-1248, 및 1298-1300에서 또는 이의 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 영역을 포함하는, 융합 단백질.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 768-769, 791-792, 792-793, 1015-1016, 1022-1023, 1026-1027, 1029-1030, 1040-1041, 1052-1053, 1054-1055, 1067-1068, 1068-1069, 1247-1248, 또는 1248-1249 또는 이의 상응하는 위치 사이에 삽입되는, 융합 단백질.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 768-769, 792-793, 1022-1023, 1026-1027, 1040-1041, 1068-1069, 또는 1247-1248 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입되는, 융합 단백질.
  84. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 상기 Cas9 참조 서열에 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 1016-1017, 1023-1024, 1029-1030, 1040-1041, 1069-1070, 또는 1247-1248 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입되는, 융합 단백질.
  85. 제76항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 표 10A에서 동정된 유전자좌에서 Cas9 폴리펩타이드 내에 삽입되는, 융합 단백질.
  86. 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-말단 단편이 Cas9 참조 서열의 아미노산 잔기 1-529, 538-568, 580-685, 692-942, 948-1001, 1026-1051, 1078-1231, 및/또는 1248-1297 또는 이의 상응하는 잔기를 포함하는, 융합 단백질.
  87. 제78항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 단편이 Cas9 참조 서열의 아미노산 잔기 1301-1368, 1248-1297, 1078-1231, 1026-1051, 948-1001, 692-942, 580-685, 및/또는 538-568 또는 이의 상응하는 잔기를 포함하는, 융합 단백질.
  88. 제78항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 닉카제이거나, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 뉴클레아제 불활성인, 융합 단백질.
  89. 제78항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9 폴리펩타이드가 변형된 Cas9 폴리펩타이드이고, 변경된 PAM에 대한 특이성 또는 비-G PAM에 대한 특이성을 갖는, 융합 단백질.
  90. 제89항에 있어서, 상기 변형된 SpCas9 폴리펩타이드가 아미노산 치환 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R (SpCas9-MQKFRAER)을 포함하고, 변경된 PAM 5'-NGC-3'에 대해 특이성을 갖는, 융합 단백질.
  91. 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 Cas12 폴리펩타이드에 삽입되는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 Cas12 폴리펩타이드가 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i인, 융합 단백질.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 Cas12 폴리펩타이드가 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) Cas12b, 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) Cas12b, 바실러스 종 (Bacillus sp.) V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실러스 액시디필러스 (Alicyclobacillus acidiphilus) Cas12b와 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는, 융합 단백질.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas12 폴리펩타이드가 바실러스 히사시 (Bacillus hisashii) Cas12b, 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) Cas12b, 바실러스 종 (Bacillus sp.) V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실러스 액시디필러스 (Alicyclobacillus acidiphilus) Cas12b의 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진, 융합 단백질.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 하기의 아미노산 위치 사이에 삽입되는, 융합 단백질:
    a) BhCas12b의 153-154, 255-256, 306-307, 980-981, 1019-1020, 534-535, 604-605 또는 344-345, 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i의 상응하는 아미노산 잔기;
    b) BvCas12b의 147 및 148, 248 및 249, 299 및 300, 991 및 992 또는 1031 및 1032, 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i의 상응하는 아미노산 잔기; 또는
    c) AaCas12b의 157 및 158, 258 및 259, 310 및 311, 1008 및 1009 또는 1044 및 1045, 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i의 상응하는 아미노산 잔기.
  96. 제91항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 표 10B에서 동정된 유전자좌에 삽입되는, 융합 단백질.
  97. 제91항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas12 폴리펩타이드가 Cas12b인, 융합 단백질.
  98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas12 폴리펩타이드가 BhCas12b 도메인, BvCas12b 도메인, 또는 AACas12b 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 상기 Cas12b 폴리펩타이드가 RuvC 도메인의 촉매 활성을 사일런싱시키는 돌연변이를 포함하는, 융합 단백질.
  100. 제99항에 있어서, 상기 Cas12b 폴리펩타이드가 D574A, D829A 및/또는 D952A 돌연변이를 포함하는, 융합 단백질.
  101. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) TadA, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) TadA, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) TadA, 슈와넬라 푸트레파시엔스 (Shewanella putrefaciens) TadA, 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) F3031 TadA, 콜로박터 크레슨투스 (Caulobacter crescentus) (씨. 크레센투스 (C. crescentus)) TadA, 또는 게오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens) TadA, 또는 이의 변이체 또는 단편인, 융합 단백질.
  102. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제가 자연적으로 발생하지 않는 아데노신 데아미나제인, 융합 단백질.
  103. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 시티딘 데아미나제를 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  104. 하기 구조를 포함하는 융합 단백질:
    NH2-[TadA*8]-[Cas9]-[시티딘 데아미나제]-COOH; 또는
    NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9]-[TadA*8]-COOH
    (여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다).
  105. 하기 구조를 포함하는 융합 단백질:
    NH2-[Cas9(TadA*8)]-[시티딘 데아미나제]-COOH;
    NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas9(TadA*8)]-COOH;
    NH2-[Cas9(시티딘 데아미나제)]-[TadA*8]-COOH; 또는
    NH2-[TadA*8]-[Cas9(시티딘 데아미나제)]-COOH
    (여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다).
  106. 하기 구조를 포함하는 융합 단백질:
    NH2-[Cas12(아데노신 데아미나제)]-[시티딘 데아미나제]-COOH;
    NH2-[시티딘 데아미나제]-[Cas12(아데노신 데아미나제)]-COOH;
    NH2-[Cas12(시티딘 데아미나제)]-[아데노신 데아미나제]-COOH; 또는
    NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas12(시티딘 데아미나제)]-COOH
    (여기서, 각각의 경우 "]-["는 임의의 링커이다).
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵염기의 탈아민화를 수행하기 위해 하나 이상의 가이드 핵산 서열과 복합체화된 융합 단백질.
  108. 제107항에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오타이드와 추가로 복합체화된 융합 단백질.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  110. 제109항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  111. 제110항에 있어서, 상기 발현 벡터가 포유동물 발현 벡터인, 발현 벡터.
  112. 제111항에 있어서, 상기 벡터가 아데노-연관된 바이러스 (AAV), 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 및 헤르페스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이러스 벡터인, 발현 벡터.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 상기 벡터가 프로모터를 포함하는, 발현 벡터.
  114. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제109항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  115. 제114항에 있어서, 상기 세포가 세균 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 인간 세포, 또는 포유동물 세포인, 세포.
  116. 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드와 복합체화된 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 염기 편집기.
  117. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제109항의 폴리뉴클레오타이드, 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항의 벡터, 제114항 또는 제115항의 세포, 또는 제116항의 염기 편집기 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  118. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제109항의 폴리뉴클레오타이드, 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제116항의 염기 편집기를 포함하는 키트.
  119. 폴리뉴클레오타이드 서열과 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 접촉시키는 단계를 포함하는 염기 편집을 위한 방법으로서, 상기 융합 단백질의 상기 아데노신 데아미나제 변이체 도메인이 상기 폴리뉴클레오타이드 내 핵염기를 탈아민화시켜 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 표적 핵염기의 탈아민화를 수행하기 위해 상기 표적 폴리뉴클레오타이드와 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  121. 표적 폴리뉴클레오타이드를 편집하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 내 AㆍT에서 GㆍC로의 변경을 수행하기 위해 상기 표적 폴리뉴클레오타이드와 제116항의 염기 편집기를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  122. 제120항 또는 제121항에서, 상기 접촉이 세포, 진핵 세포, 포유동물 세포 또는 인간 세포 내에서 일어나는, 방법.
  123. 제122항에 있어서, 상기 세포가 생체내인, 방법.
  124. 제122항에 있어서, 상기 세포가 생체외인, 방법.
  125. 대상체에서 유전적 결함을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 염기 편집기, 또는 상기 염기 편집기를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 염기 편집기가 대상체의 표적 뉴클레오타이드 서열에서 표적 핵염기를 탈아민화시키도록 지시하는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드를 상기 대상체에게 투여하여 상기 유전적 결함을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  126. 제116항, 제120항, 제121항 또는 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오타이드가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 방법:
    a) GACCUAGGCGAGGCAGUAGG;
    b) CCAGUAUGGACACUGUCCAAA;
    c) CAGUAUGGACACUGUCCAAA; 및
    d) AGUAUGGACACUGUCCAAAG.
  127. 제116항, 제120항, 제121항, 제125항 또는 제126항 중 어느 한 한에 있어서, 상기 gRNA가 하기 핵산 서열을 포함하는, 방법:
    Figure pct00298
  128. 제116항, 제120항, 제121항 또는 제125항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)를 포함하는, 방법.
  129. 제125항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기, 또는 상기 염기 편집기를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오타이드를 대상체의 세포에 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  130. 제125항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 포유류 또는 인간인, 방법.
  131. 제125항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵염기의 탈아민화가 상기 표적 핵염기를 야생형 핵염기로 대체하는, 방법.
  132. 제125항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵염기의 탈아민화가 상기 표적 핵염기를 비-야생형 핵염기로 대체하고, 상기 표적 핵염기의 탈아민화가 유전학적 병태의 증상을 개선시키는, 방법.
  133. 제125항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 서열이 상기 표적 핵염기 이외의 핵염기에서 유전학적 병태와 연관된 돌연변이를 포함하는, 방법.
  134. 폴리뉴클레오타이드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인 및 MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQST의 아미노산 위치 82 및/또는 166에서 변경 또는 MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSST의 변이체에서 위치 82 및/또는 166에 상응하는 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함하는 융합 단백질.
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