KR20220076467A - 신규 핵염기 편집기 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
- C12Y305/04004—Adenosine deaminase (3.5.4.4)
Abstract
본 발명은 아데노신 데아미나제 도메인을 포함하는 신규 프로그램가능한 핵염기 편집기 및 폴리뉴클레오티드 편집을 위한 이의 사용 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 프로그램가능한 핵염기 편집기는 유전 질환과 연관된 병원성 돌연변이를 편집한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 9월 9일 출원된 미국 가출원 번호 제62/897,777호에 대한 우선권 및 이익을 주장하고; 2020년 2월 13일 출원된 국제 PCT 출원 번호 PCT/US2020/018195에 대한 우선권을 주장하는 국제 PCT 출원이며, 모두의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
핵산 서열의 표적화된 편집, 예를 들어, 표적화된 절단 또는 게놈 DNA 내로 특이적 변형의 표적화된 도입은 유전자 기능 연구에 대한 매우 유망한 접근법이며 또한 인간 유전 질환에 대한 신규 요법을 제공할 가능성이 있다. 현재 이용가능한 염기 편집기는 표적 CㆍG 염기 쌍을 TㆍA로 전환하는 사이티딘 염기 편집기(예를 들어, BE4) 및 AㆍT를 GㆍC로 전환하는 아데닌 염기 편집기(예를 들어, ABE7.10)를 포함한다. 더 큰 특이성 및 효율성으로 표적 서열 내에 변형을 도입할 수 있는 개선된 염기 편집기가 당업계에 필요하다.
하기 기재된 바와 같이, 본 발명은 아데노신 데아미나제 도메인(예를 들어, TadA*9 또는 ABE9)을 포함하는 신규 프로그램가능한 핵염기 편집기, 및 폴리뉴클레오티드 편집을 위해 이를 사용하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 ABE9는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 유전 질환와 연관된 병원성 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 편집한다.
일 측면에서, 서열번호: 1의 21, 23, 25, 38, 51, 54, 70, 71, 72, 73, 94, 124, 133, 139, 146, 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제가 제공된다:
(서열번호: 1). 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 서열번호: 1의 V82T 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 서열번호: 1의 21, 23, 25, 38, 51, 54, 70, 71, 72, 73, 94, 124, 133, 139, 146, 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 2 개 이상의 아미노산 위치에서 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함한다. 일 구현예에서, 이 측면 및 이의 구현예의 아데노신 데아미나제는 변경 중 2 개 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 이 측면 및 이의 구현예의 아데노신 데아미나제는 상기 변경 중 3 개 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 이 측면 및 이의 구현예의 아데노신 데아미나제는 하기 변경 중 하나 이상을 추가로 포함한다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및 Q154R. 일 구현예에서, 이 측면 및 이의 구현예의 아데노신 데아미나제는 하기 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함한다:
E25F + V82S + Y123H;
T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K;
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K_V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M_V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; 또는
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 표 14 또는 18에 기재된 바와 같은 임의의 변경 또는 변경의 그룹을 포함한다. 일 구현예에서, 이 측면 및 이의 구현예의 아데노신 데아미나제는 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 및 157로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에서 시작하는 C 말단의 결실을 포함한다. 일 구현예에서, 이 측면 및 이의 구현예의 아데노신 데아미나제는 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및 Q154R로 이루어진 군으로부터 선택된 변경을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 이 측면 및 이의 구현예의 아데노신 데아미나제는 표 14, 표 18, 또는 도 3a-3c에 기재된 아데노신 데아미나제 변이체이다.
또 다른 측면에서, 융합 단백질이 제공되며, 여기서 융합 단백질은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 하기 서열번호: 1의 21, 23, 25, 38, 51, 54, 70, 71, 72, 73, 94, 124, 133, 139, 146, 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체인 적어도 하나의 염기 편집기를 포함한다:
(서열번호: 1). 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함한다.
또 다른 측면에서, 융합 단백질이 제공되며, 여기서 융합 단백질은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체인 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질 중 임의의 것의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 서열번호: 1의 V82T 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 융합 단백질이 제공되며, 여기서 융합 단백질은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 변경 V82T 및 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체인 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 서열번호: 1의 21, 23, 25, 38, 51, 54, 70, 71, 72, 73, 94, 124, 133, 139, 146, 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 2 개 이상의 아미노산 위치에서 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 변경 중 2 개 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 변경 중 3 개 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 다음 변경 중 하나 이상을 추가로 포함한다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및 Q154R. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 및 157로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에서 시작하는 C 말단의 결실을 포함한다.
상기 기술된 융합 단백질 및 이의 구현예의 일 구현예에서, 염기 편집기 도메인은 아데노신 데아미나제 변이체 단량체를 포함하며, 여기서 아데노신 데아미나제 단량체는 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, V82T, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경을 포함한다. 일 구현예에서, 염기 편집기 도메인은 야생형 아데노신 데아미나제 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체를 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및 Q154R로 이루어진 군으로부터 선택된 변경을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 염기 편집기 도메인은 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체를 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 2 개 이상의 변경을 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 또 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 표 14, 표 18, 또는 도 3a-3c에 기재된 ABE9(TadA*9 데아미나제 변이체)이다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 또 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 전장 ABE9에 비해 1, 2, 3, 4, 5 ,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있는 절두된 ABE8 또는 ABE9이다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 Cas9, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 또는 Cas12j/CasΦ 도메인이다.
또 다른 측면에서, 융합 단백질이 제공되며, 여기서 융합 단백질은 하기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인, 및 서열번호: 1의 21, 23, 25, 38, 51, 54, 70, 71, 72, 73, 94, 124, 133, 138, 139, 146, 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함하며:
여기서 굵은 글씨 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타낸다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D138M, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 변경을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 서열번호: 1의 변경 V82T를 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 상기 변경 중 2 개 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 상기 변경 중 3 개 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및 Q154R로 이루어진 군으로부터 선택된 변경을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 다음 변경 중 2 개 이상을 포함한다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및 Q154R.
상기 기술된 융합 단백질 및 이의 구현예 중 임의의 것의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 히기 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함한다:
E25F + V82S + Y123H;
T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K;
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K;
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 표 14 또는 18, 또는 도 3a-3c에 기재된 바와 같은 임의의 다른 변경 또는 변경의 그룹을 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9(SaCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 1(Streptococcus thermophilus 1) Cas9(St1Cas9), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9), 또는 이의 변이체이다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 변경된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 특이성을 갖는 변형된 SaCas9를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 SaCas9는 아미노산 치환 E782K, N968K, 및 R1015H, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 변경된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 특이성을 갖는 SpCas9의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 변경된 PAM은 핵산 서열 5'-NGA-3', 5'-NGC-3', 5'-NGG-3', 5'-NGT-3', 또는 5'-NGN-3'에 대한 특이성을 갖는다. 일 구현예에서, 변이체 SpCas9는 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R로부터 선택된 아미노산 치환, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환; I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER) 또는 이의 상응하는 아미노산 치환; I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환; 또는 도 3a-3c에 제시된 바와 같은 아미노산 치환을 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 뉴클레아제 불활성 또는 닉카제 변이체이다. 일 구현예에서, 닉카제 변이체는 아미노산 치환 D10A 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 도메인은 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌을 탈아미노화할 수 있다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 자연에서 발생하지 않는 변형된 아데노신 데아미나제이다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예의 아데노신 데아미나제의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 데아미나제이다. 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 데아미나제이다. 일 구현예에서, TadA 데아미나제는 TadA*7.10 변이체이다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, 융합 단백질은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 아데노신 데아미나제 도메인 사이에 링커를 포함한다. 일 구현예에서, 링커는 아미노산 서열: SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES를 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 핵 국소화 신호를 포함한다. 일 구현예에서, 핵 국소화 신호는 이분 핵 국소화 신호이다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, Cas9는 StCas9이다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, Cas9는 SaCas9 또는 SpCas9이다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 것의 융합 단백질의 일 구현예에서, Cas9는 변형된 SaCas9 또는 변형된 SpCas9이다. 일 구현예에서, 변형된 SaCas9는 아미노산 치환 E782K, N968K, 및 R1015H, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 SaCas9는 다음 아미노산 서열을 포함한다:
또 다른 측면에서, 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 측면에서, 세포가 제공되며, 여기서 세포는 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 유전 질환과 연관된 SNP의 AㆍT에서 GㆍC로의 변경에 영향을 미치기 위해 염기 편집기를 표적화하는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 세포, 또는 이의 전구체 내로 도입함으로써 생성된다. 일 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일 구현예에서, 세포는 시험관내 또는 생체내에 있다. 일 구현예에서, 유전 질환은 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)이다. 일 구현예에서, 융합 단백질 및 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드는 세포에서 복합체를 형성한다.
또 다른 측면에서, 상기 기술된 측면 및 이의 구현예의 세포로부터 단리된 세포 또는 증식되거나 또는 확장된 세포 집단이 제공된다.
일 측면에서, 유전 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 세포, 단리된 세포, 또는 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 방법의 일 구현예에서, 세포, 단리된 세포, 또는 세포 집단은 대상체에 대해 자가, 동종이계, 또는 이종이계이다.
일 측면에서, 염기 편집기 시스템이 제공되며, 여기서 염기 편집기 시스템은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 하기 서열번호: 1의 21, 23, 25, 38, 51, 54, 70, 71, 72, 73, 82, 94, 124, 133, 139, 146, 및 158로 이루어진 구으로부터 선택된 위치에서 변경, 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체인 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함한다:
(서열번호: 1). 염기 편집기 시스템의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, V82T, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함한다. 일 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 유전 질환과 연관된 SNP의 AㆍT에서 GㆍC로의 변경에 영향을 미치기 위해 염기 편집기 도메인을 표적화하는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 염기 편집기 시스템의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌을 탈아미노화할 수 있다. 염기 편집기 시스템의 일 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 리보핵산(RNA), 또는 데옥시리보핵산(DNA)을 포함한다. 염기 편집기 시스템의 일 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 CRISPR RNA(crRNA) 서열, 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA) 서열, 또는 이의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 제2 가이드 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 제2 가이드 폴리뉴클레오티드는 리보핵산(RNA), 또는 데옥시리보핵산(DNA)을 포함한다. 일 구현예에서, 제2 가이드 폴리뉴클레오티드는 CRISPR RNA(crRNA) 서열, 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA) 서열, 또는 이의 조합을 포함한다. 상기 기술된 염기 편집기 시스템 및 이의 구현예의 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인은 Cas9, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 또는 Cas12j/CasΦ 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 사멸이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인은 닉카제이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인은 Cas9 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, Cas9 도메인 뉴클레아제 사멸 Cas9(dCas9), Cas9 닉카제(nCas9), 또는 뉴클레아제 활성 Cas9를 포함한다. 일 구현예에서, Cas9 도메인은 Cas9 닉카제를 포함한다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인은 조작된 또는 변형된 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인이다. 상기 기술된 염기 편집기 시스템 및 이의 구현예의 일 구현예에서, 유전 질환은 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)이다.
또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 교정하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 폴리뉴클레오티드 또는 이의 역 보체에 위치한 적어도 일부인 표적 뉴클레오티드 서열을, 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 융합 단백질, 또는 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 염기 편집기 시스템과 접촉시키는 단계; 및 표적 뉴클레오티드 서열에 염기 편집기의 표적화 시 SNP 또는 이의 보체 핵염기를 탈아미노화함으로써 SNP를 편집하는 단계를 포함하며, 여기서 SNP 또는 이의 보체 핵염기를 탈아미노화하는 것은 SNP를 교정한다. 일 구현예에서, SNP는 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)과 연관된다. 일 구현예에서, SNP는 SERPINA1 유전자 내에 있고 교정은 E342K(PiZ 대립유전자) 변경을 포함한다.
일 측면에서, 폴리뉴클레오티드를 편집하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 표적 뉴클레오티드 서열을 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 융합 단백질, 또는 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 염기 편집기 시스템과 접촉시켜, 폴리뉴클레오티드를 편집하는 단계를 포함한다. 방법의 일 구현예에서, 편집은 20% 미만의 indel 형성, 15% 미만의 indel 형성, 10% 미만의 indel 형성; 5% 미만의 indel 형성; 4% 미만의 indel 형성; 3% 미만의 indel 형성; 2% 미만의 indel 형성; 1% 미만의 indel 형성; 0.5% 미만의 indel 형성; 또는 0.1% 미만의 indel 형성을 초래한다. 방법의 일 구현예에서, 편집은 전좌를 초래하지 않는다.
또 다른 측면에서 하기로부터 선택된 TadA*7.10 아데노신 데아미나제 변이체 도메인 및 Cas9 엔도뉴클레아제 도메인을 포함하는 ABE9(TadA*9 데아미나제 변이체); 및 유전 질환과 연관된 SNP의 AㆍT에서 GㆍC로의 변경에 영향을 미치기 위해 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 표적화하는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 염기 편집기가 제공된다:
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+A109S를 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+T111R을 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+D119N을 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+H122N을 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147d+Q154S를 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+F149Y를 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+T166I를 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9; 및
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+D167N을 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9.
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+L36H+N157K를 갖는 모노 TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147D+Q154S+F149Y+D167N+L36H+N157K를 갖는 모노 TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147D+Q154S+F149Y+D167N+L36H+N157K+V106W를 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N을 갖는 모노 TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G, MQKFRAER을 갖는 spCas9; 및
서열번호: 1의 돌연변이 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N + V106W를 갖는 모노 TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9. 염기 편집기의 일 구현예에서, SNP는 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)과 연관된다.
또 다른 측면에서, 벡터가 제공되며 여기서 벡터는 하기로부터 선택된 TadA 아데노신 데아미나제 도메인 및 SpCas9 엔도뉴클레아제 도메인을 포함하는 ABE9 염기 편집기를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+A109S를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+T111R을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+D119N을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+H122N을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147d+Q154S를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+F149Y를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+T166I를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9; 및
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+D167N을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9.
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+L36H+N157K를 갖는 모노 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147D+Q154S+F149Y+D167N+L36H+N157K를 갖는 모노 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 SpCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147D+Q154S+F149Y+D167N+L36H+N157K+V106W를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G, (MQKFRAER)를 갖는 SpCas9
돌연변이 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N을 갖는 모노 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 SpCas9; 및
돌연변이 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N + V106W를 갖는 모노 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 SpCas9. 일 구현예에서, 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 mRNA 벡터이다.
또 다른 측면에서, 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 융합 단백질 또는 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 염기 편집기 시스템을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 또는 담체를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 가이드 RNA에 결합된 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 융합 단백질을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)과 연관된 SERPINA1 유전자에 상보적인 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 가이드 RNA에 결합된 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 염기 편집기 시스템을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)과 연관된 SERPINA1 유전자에 상보적인 핵산 서열을 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 조성물의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌을 탈아미노화할 수 있다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 조성물의 일 구현예에서, 융합 단백질 또는 염기 편집기 시스템은
(i) Cas9 닉카제를 포함하거나;
(ii) 뉴클레아제 불활성 Cas9를 포함하거나;
(iii) 도 3a-3c에 제시된 아미노산 치환의 조합을 포함하는 SpCas9 변이체를 포함하거나; 또는
(iv) I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER); 또는 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G, (MQKFRAER)로부터 선택된 아미노산 서열 치환의 조합을 포함하는 SpCas9 변이체를 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 조성물의 일 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 또는 담체, 즉, 약제학적 조성물을 추가로 포함한다.
일 측면에서, 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 또는 담체를 추가로 포함하는 조성물을 포함하는 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물의 일 구현예에서, 질환 또는 장애는 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)이다. 약제학적 조성물의 일 구현예에서, 융합 단백질 또는 염기 편집기 시스템은 가이드 RNA에 결합되며, 여기서 가이드 RNA는 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)과 연관된 SERPINA1 유전자에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 약제학적 조성물의 일 구현예에서, gRNA 및 염기 편집기는 함께 또는 별도로 제형화된다. 상기 기술된 약제학적 조성물 및 이의 구현예의 일 구현예에서, gRNA는 5'에서 3'으로, 다음 중 하나 이상으로부터 선택된 핵산 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 뉴클레오티드 5' 절두 단편을 포함한다:
상기 기술된 약제학적 조성물 및 이의 구현예의 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 포유류 세포에서 발현에 적합한 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 벡터는 염기 편집기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 약제학적 조성물의 일 구현예에서, 염기 편집기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다. 약제학적 조성물의 일 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 약제학적 조성물의 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 또는 아데노-연관 바이러스 벡터(AAV)이다. 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 약제학적 조성물의 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 포유류 세포에서 발현에 적합한 리보핵입자를 추가로 포함한다. 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 약제학적 조성물의 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 지질을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)의 치료에서 상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
상기 기술된 방법 또는 용도의 일 구현예에서, 대상체는 인간이다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예 중 임의의 하나의 융합 단백질 또는 염기 편집기 시스템의 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 하기 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함한다:
E25F + V82S + Y123H;
T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K;
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K;
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R.
일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체, 예를 들어, TadA*9 데아미나제 변이체)는 표 14 또는 18에 기재된 바와 같은 임의의 변경 또는 변경의 그룹을 포함한다.
상기 기술된 측면 및 이의 구현예의 아데노신 데아미나제와 관련하여 당업계의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 서열번호: 1에 제시된 아미노산 변경에 상응하는 다른 아데노신 데아미나제에서 아미노산 변경은 일상적인 서열 정렬을 수행하는 단계 및 상기 기재된 바와 같이, 서열번호: 1의 아미노산 서열 및 TadA 데아미나제 등과 같은 다른 아데노신 데아미나제(들)의 서열, 또는 이의 관련 부분의 관련성 및/또는 동일성을 평가하는 단계에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 또 다른 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열은 서열번호:1에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 포함한다. 일 구현예에서, 또 다른 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열은 서열번호:1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함한다. 일 구현예에서, 또 다른 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열은 서열번호:1에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함한다. 일 구현예에서, 또 다른 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열은 서열번호:1에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 포함한다. 일 구현예에서, 또 다른 아데노신 데아미나제의 아미노산 서열은 서열번호:1에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 포함한다.
또 다른 측면에서 아데노신 데아미나제 또는 다음 아미노산 변경 또는 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함하는 TadA*7.10 변이체인 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는, 상기 기술된 아데노신 데아미나제, 융합 단백질, 염기 편집기, 또는 염기 편집기 시스템 및 이의 구현예가 제공된다: V82T; I76Y + V82T; 또는 I76Y + V82T + Y147T + Q154S.
또 다른 측면에서 다음 아미노산 변경 또는 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함하는 TadA*7.10 변이체인 아데노신 데아미나제 변이체가 제공된다: V82T; I76Y + V82T; 또는 I76Y + V82T + Y147T + Q154S.
또 다른 측면에서, 융합 단백질이 제공되며, 여기서 융합 단백질은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 다음 아미노산 변경 또는 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함하는 TadA*7.10 아데노신 데아미나제 변이체인 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함한다: V82T; I76Y + V82T; 또는 I76Y + V82T + Y147T + Q154S. 융합 단백질의 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 Cas9 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다. 융합 단백질의 일 구현예에서, Cas9 엔도뉴클레아제 도메인은 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9를 포함한다.
상기 기술된 아데노신 데아미나제 변이체 및 이의 구현예, 또는 상기 기술된 융합 단백질 및 이의 구현예의 일 구현예에서, TadA*7.10은 단량체성이다.
또 다른 측면에서, 핵염기 편집기가 제공되며 여기서 핵염기 편집기는 하기로부터 선택된 TadA*7.10 아데노신 데아미나제 변이체 도메인 및 Cas9 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다:
돌연변이 V82T를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y + V82T를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9; 또는
돌연변이 I76Y + V82T + Y147T + Q154S를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9.
정의
하기 정의는 관련 기술의 정의를 보충하고 현재 출원에 관한 것이며 임의의 관련되거나 또는 관련되지 않은 경우, 예를 들어, 임의의 공통으로 소유된 특허 또는 출원에 귀속되어서는 안 된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 테스트를 위한 실행에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하려는 목적을 위한 것이며, 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 공통으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 본 발명에 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton 등, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger 등 (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 달리 명시되지 않는 한, 하기에 부여된 의미를 갖는다.
본 출원에서, 단수형의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 복수형을 포함한다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다는 점에 유의하여야 한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다.
본 명세서 및 청구범위(들)에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"(및 "포함한다" 및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는"(및 "갖다" 및 "갖는다"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하는"(및 "포함한다" 및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유한다" 및 "함유하다"와 같은 함유하는의 임의의 형태)은 포괄적 또는 개방형이고 추가적인 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의이 구현예는 본 개시내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있고, 그 반대도 마찬가지인 것으로 고려된다. 또한, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 한계에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계에서의 실행에 따라, 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 몇 배수 이내, 예를 들어, 값의 5-배 이내, 2-배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 이내를 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
명세서에서 "일부 구현예", "구현예", "일 구현예" 또는 "다른 구현예"에 대한 언급은 구현예와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조, 또는 특성이 적어도 일부 구현예에 포함되지만, 반드시 본 개시내용의 모든 구현예에 포함되지 않음을 의미한다.
"아데노신 데아미나제"란 아데닌 또는 아데노신의 가수분해성 탈아미노화를 촉매할 수 있는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 의미한다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 아데노신에서 이노신으로 또는 데옥시 아데노신에서 데옥시이노신으로의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌 또는 아데노신의 가수분해성 탈아미노화를 촉매화한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나제(예를 들어, 조작된 아데노신 데아미나제, 진화된 아데노신 데아미나제)는 박테리아와 같은 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트, 또는 마우스와 같은 유기체로부터의 자연 발생 데아미나제의 변이체이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 자연에서 발생하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 자연 발생 데아미나제와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 이. 콜라이(E. coli), 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 티피(S. typhi), 에스. 푸트레파시엔스(S. putrefaciens), 에이치. 인플루엔자(H. influenzae), 또는 씨. 크레센투스(C. crescentus)와 같은 박테리아로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 데아미나제이다. 일부 구현예에서, TadA 데아미나제는 이. 콜라이 TadA(ecTadA) 데아미나제 또는 이의 단편이다.
예를 들어, 데아미나제 도메인은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381(WO 2018/027078) 및 PCT/US2016/058344(WO 2017/070632)에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017) ), 및 Rees, H.A., 등, "Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells." Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
야생형 TadA(wt) 아데노신 데아미나제는 하기 서열(또한 TadA 참조 서열이라고 불림)을 갖는다:
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하기 서열에서 변경을 포함한다:
(또한 TadA*7.10이라고 함).
본 발명은 신규 핵염기 편집기를 특징으로 하며, 여기서 변경은 TadA*7.10 참조 서열과 관련하여 만들어진다.
일부 구현예에서, TadA*7.10은 적어도 하나의 변경을 포함한다. 일부 구현예에서, TadA*7.10은 아미노산 82 및/또는 166에서 변경을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 언급된 서열의 변이체는 하기 변경 중 하나 이상을 포함한다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R. 변경 Y123H는 Y123H TadA(wt)로 되돌아간 TadA*7.10에서 변경 H123Y를 지칭한다. 다른 구현예에서, TadA*7.10 서열의 변이체는 다음 변경 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, TadA*7.10 서열의 변이체는 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R로 이루어진 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 잔기 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 또는 157에서 시작하는 C-말단의 결실을 포함하는, 결실을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체, 예를 들어, TadA*8을 제공한다.
또한 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 각각이 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해 하기 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 갖는 2 개의 아데노신 데아미나제 도메인을 포함하는 동종이량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 각각이 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 갖는 2 개의 아데노신 데아미나제 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 동종이량체이다.
다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 하기 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 포함하는 야생형 TadA 아데노신 데아미나제 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 야생형 TadA 아데노신 데아미나제 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인(예를 들어 TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다.
다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 하기 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 포함하는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 하기 변경: Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 또는 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 조합을 포함하는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인(예를 들어 TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 TadA*8이다:
일부 구현예에서, TadA*8은 절두된다. 일부 구현예에서, 절두된 TadA*8은 전장 TadA*8에 비해 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20 개의 N-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있다. 일부 구현예에서, 절두된 TadA*8은 전장 TadA*8에 비해 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있다. 일부 구현예에서 아데노신 데아미나제 변이체는 전장 TadA*8이다.
특정 구현예에서, 아데노신 데아미나제 이종이량체는 TadA*8 도메인 및 하기 중 하나로부터 선택된 아데노신 데아미나제 도메인을 포함한다:
스타필로코쿠스 아우레우스(에스. 아우레우스) TadA:
바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(비. 서브틸리스(B. subtilis)) TadA:
살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)(에스. 티피무리움(S. typhimurium)) TadA:
셰와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens)(에스. 푸트레파시엔스) TadA:
헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) F3031(에이치. 인플루엔자) TadA:
카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus)(씨. 크레센투스) TadA:
지오박터 술푸레두센스(Geobacter sulfurreducens)(지. 술푸레두센스(G. sulfurreducens)) TadA:
TadA*7.10
"아데노신 데아미나제 염기 편집기 8(ABE8) 폴리펩티드"란 ABE8을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"아데노신 데아미나제 염기 편집기 9(ABE9) 폴리펩티드" 또는 "ABE9"란 하기 제시된 서열의 위치 sssssss에서 하나 이상의 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체(TadA*9)를 포함하는 본원에 정의된 바와 같은 염기 편집기를 의미한다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체(TadA*9)는 하기 참조 서열에서 다음 변경을 포함한다: R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, V82T, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K:
참조 서열에서 변경된 관련 염기는 밑줄 그어져 있고 굵은 글씨로 제시된다.
일부 구현예에서, ABE9는 참조 서열에 비해, 본원에 기재된 바와 같은 추가의 변경을 포함한다.
"아데노신 데아미나제 염기 편집기 9(ABE9) 폴리뉴클레오티드"란 ABE9를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"알파-1 항트립신(A1AT) 단백질"이란 UniProt 수탁 번호 P01009에 대해 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 의미한다. 특정 구현예에서, A1AT 단백질은 하기 참조 서열에 비해 하나 이상의 변경을 포함한다. 일 특정 구현예에서, A1AD와 연관된 A1AT 단백질은 E342K 돌연변이를 포함한다. 예시적인 A1AT 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 갖는 >sp|P01009|A1AT_인간 알파-1-항트립신 OS=호모 사피엔스 OX=9606 GN=SERPINA1 PE=1 SV=3이다:
이 A1AT 단백질 서열에서, 처음 24 개의 아미노산은 신호 펩티드(밑줄친 부분)를 구성한다. A1AD에서 돌연변이된 서열의 위치 342(즉, E342K)는 신호 서열 뒤에 아미노산 잔기 "E"를 아미노산 "1"로 설정하는 것에 기반하여 결정된다.
"투여하는"은 환자 또는 대상체에게 본원에 기재된 하나 이상의 조성물을 제공하는 것으로 본원에서 지칭된다. 예로서 및 제한 없이, 조성물 투여, 예를 들어, 주사는 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복강내(i.p.) 주사, 또는 근육내(i.m.) 주사에 의해 수행될 수 있다. 하나 이상의 이러한 경로가 이용될 수 있다. 비경구 투여는 예를 들어, 볼루스 주사 또는 시간 경과에 따른 점진적 관류에 의해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 또는 동시에, 투여는 경구 경로에 의해 이루어질 수 있다.
"제제"란 임의의 소분자 화학 화합물, 항체, 핵산 분자, 또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 의미한다.
"변경"이란 본원에 기재된 것과 같은 표준 기술 공지 방법에 의해 검출되는 바와 같은 유전자 또는 폴리펩티드의 서열, 발현 수준, 또는 활성의 변화(증가 또는 감소)를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 변경은 발현 수준의 10% 변화, 발현 수준의 25% 변화, 40% 변화, 및 50% 이상의 변화를 포함한다.
"개선하다"란 질환의 발달 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 축소, 저지, 또는 안정화시키는 것을 의미한다.
"유사체"란 동일하지 않지만, 유사한 기능적 또는 구조적 특징을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드 유사체는 상응하는 자연 발생 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유지하면서, 자연 발생 폴리펩티드에 비해 유사체의 기능을 향상시키는 특정 생화학적 변형을 갖는다. 이러한 생화학적 변형은 예를 들어, 리간드 결합을 변경하지 않고, 유사체의 프로테아제 내성, 막 투과성, 또는 반감기를 증가시킬 수 있다. 유사체는 비자연 아미노산을 포함할 수 있다.
"염기 편집기(BE)", 또는 "핵염기 편집기(NBE)"란 폴리뉴클레오티드에 결합하고 핵염기 변형 활성을 갖는 제제를 의미한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집기는 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)와 함께 핵염기 변형 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나제) 및 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함한다. 다양한 구현예에서, 제제는 염기 편집 활성을 갖는 단백질 도메인, 즉, 핵산 분자(예를 들어, DNA) 내에서의 염기(예를 들어, A, T, C, G, 또는 U)를 변형시킬 수 있는 도메인을 포함하는 생체분자 복합체이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 데아미나제 도메인에 융합되거나 또는 연결된다. 일 구현예에서, 제제는 염기 편집 활성을 갖는 하나 이상의 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 또 다른 구현예에서, 염기 편집 활성을 갖는 단백질 도메인은 가이드 RNA에 연결된다(예를 들어, 가이드 RNA 상의 RNA 결합 모티프 및 데아미나제에 융합된 RNA 결합 도메인을 통해). 일부 구현예에서, 염기 편집 활성을 갖는 도메인은 핵산 분자 내에서 염기를 탈아미노화할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 DNA 분자 내에서 하나 이상의 염기를 탈아미노화할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 DNA 내에서 사이토신(C) 또는 아데노신(A)을 탈아미노화할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 DNA 내의 사이토신(C) 및 아데노신(A)을 탈아미노화할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 염기 편집기(ABE)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 염기 편집기(ABE) 및 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas9(dCas9)이다. 일부 구현예에서, Cas9는 원형 치환체 Cas9(예를 들어, spCas9 또는 saCas9)이다. 원형 치환체 Cas9는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, Oakes 등, Cell 176, 254-267, 2019에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 염기 절제 복구의 억제제, 예를 들어, UGI 도메인, 또는 dISN 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 데아미나제 및 염기 절제 복구의 억제제, 예컨대 UGI 또는 dISN 도메인에 융합된 Cas9 닉카제를 포함한다. 다른 구현예에서 염기 편집기는 무염기성 염기 편집기이다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA로부터 진화된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 CRISPR 연관(예를 들어, Cas 또는 Cpf1) 효소이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 데아미나제 도메인에 융합된 촉매적으로 사멸된 Cas9(dCas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 데아미나제 도메인에 융합된 Cas9 닉카제(nCas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 염기 절제 복구(BER)의 억제제에 융합된다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 우라실 DNA 글리코실라제 억제제(UGI)이다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 이노신 염기 절제 복구 억제제이다. 염기 편집기의 상세한 사항은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344(WO2017/070632)에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017), 및 Rees, H.A., 등, "Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells." Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*8)를 원형 치환체 Cas9(예를 들어, spCAS9) 및 이분 핵 국소화 서열을 포함하는 스캐폴드 내로 클로닝함으로써 생성된다(예를 들어, ABE8 또는 ABE9). 원형 치환체 Cas9는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, Oakes 등, Cell 176, 254-267, 2019에 기재되어 있다. 예시적인 원형 치환체 서열은 하기에 제시되어 있으며, 여기서 굵은 글씨 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타낸다.
CP5(MSP "NGC=규칙적 Cas9 유사 NGG 돌연변이가 있는 Pam 변이체" PID=단백질 상호작용 도메인 및 "D10A" 닉카제 함유):
일부 구현예에서, ABE8은 하기 표 10, 11 또는 13으로부터의 염기 편집기로부터 선택된다. 일부 구현예에서, ABE8은 TadA로부터 진화된 아데노신 데아미나제 변이체를 함유한다. 일부 구현예에서, ABE8의 아데노신 데아미나제 변이체는 하기 표 8, 10, 11, 또는 13에 기재된 바와 같은 TadA*8 변이체이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R로 이루어진 군으로부터 선택된 변경 중 하나 이상을 포함하는 TadA*7.10 변이체(예를 들어, TadA*8)이다. 다양한 구현예에서, ABE8은 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 갖는 TadA*7.10 변이체(예를 들어 TadA*8)를 포함한다.
일부 구현예에서, ABE8은 TadA 데아미나제의 하나의 카피, 예를 들어, TadA*8 변이체를 함유하는 단량체성 작제물이다. 일부 구현예에서, ABE8은 동일하거나 또는 상이한 TadA 데아미나제의 하나 초과, 예를 들어, 2 개의 카피, 예를 들어, 야생형 TadA 및 TadA*8 변이체를 함유하는 이량체성 또는 이종이량체성 작제물이다.
일부 구현예에서, ABE9는 하기 표 14의 염기 편집기로부터 선택된다. 일부 구현예에서, ABE9는 TadA로부터 진화된 아데노신 데아미나제 변이체를 함유한다. 일부 구현예에서, ABE9의 아데노신 데아미나제 변이체는 표 14에 기재된 바와 같은 TadA*7.10 변이체이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, Q154R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경을 포함하는 TadA*7.10이다. 다양한 구현예에서, ABE9는 표 14에 나열된 것들 이외에, 다음으로부터 선택된 변경을 갖는 TadA*7.10을 포함한다: Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; V82S + Q154S; V82T + Q154S 및 Y123H + Y147R + Q154R + I76Y. 일부 구현예에서, ABE9는 TadA 데아미나제의 하나의 카피, 예를 들어, TadA*9 변이체를 함유하는 단랑체성 작제물이다. 일부 구현예에서, ABE9는 동일하거나 또는 상이한 TadA 데아미나제의 하나 초과, 예를 들어, 2 개의 카피, 예를 들어, 야생형 TadA 및 TadA*9 변이체를 함유하는 이량체성 또는 이종이량체성 작제물이다.
일부 구현예에서 ABE9 염기 편집기는 하기 서열을 포함한다:
예로서, 본원에 기재된 염기 편집 조성물, 시스템 및 방법에 사용되는 아데닌 염기 편집기 ABE는 하기 제공된 바와 같은 핵산 서열(8877 개의 염기 쌍)을 갖는다(Addgene, Watertown, MA.; Gaudelli NM, 등, Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471. doi: 10.1038/nature24644; Koblan LW, 등, Nat Biotechnol. 2018 Oct;36(9):843-846. doi: 10.1038/nbt.4172.). ABE 핵산 서열에 대해 적어도 95% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 포함된다.
"염기 편집 활성"이란 폴리뉴클레오티드 내에서 염기를 화학적으로 변경시키는 작업을 의미한다. 일 구현예에서, 제1 염기는 제2 염기로 전환된다. 일 구현예에서, 염기 편집 활성은 사이티딘 데아미나제 활성, 예를 들어, 표적 CㆍG를 TㆍA로 전환시키는 것이다. 또 다른 구현예에서, 염기 편집 활성은 아데노신 또는 아데닌 데아미나제 활성, 예를 들어, AㆍT를 GㆍC로 전환시키는 것이다. 또 다른 구현예에서, 염기 편집 활성은 사이티딘 데아미나제 활성, 예를 들어, 표적 CㆍG를 TㆍA로 전환시키는 것 및 아데노신 또는 아데닌 데아미나제 활성, 예를 들어, AㆍT를 GㆍC로 전환시키는 것이다.
용어 "염기 편집기 시스템"은 표적 뉴클레오티드 서열의 핵염기를 편집하기 위한 시스템을 지칭한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집기(BE) 시스템은 (1) 표적 뉴클레오티드 서열에서 핵염기를 탈아미노화하기 위한 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인, 데아미나제 도메인(예를 들어, 사이티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제); 및 (2) 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인과 함께 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집기(BE) 시스템은 아데노신 데아미나제 또는 사이티딘 데아미나제로부터 선택된 핵염기 편집기 도메인, 및 핵산 서열 특이적 결합 활성을 갖는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 (1) 표적 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 핵염기를 탈아미노화하기 위한 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나제 도메인을 포함하는 염기 편집기(BE); 및 (2) 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인과 함께 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데닌 또는 아데노신 염기 편집기(ABE)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데닌 또는 아데노신 염기 편집기(ABE) 또는 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다.
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 도메인"은 Cas9 단백질, 또는 이의 단편(예를 들어, Cas9의 활성, 불활성, 또는 부분적으로 활성 DNA 절단 도메인, 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 뉴클레아제는 또한 때때로 casnl 뉴클레아제 또는 CRISPR(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부) 연관 뉴클레아제를 지칭한다. 예시적인 Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9(spCas9)이며, 이의 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
용어 "Cas12b" 또는 "Cas12b 도메인"은 Cas12b/C2c1 단백질, 또는 이의 단편(예를 들어, Cas12b의 활성, 불활성, 또는 부분적으로 활성 DNA 절단 도메인, 및/또는 Cas12b의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드 뉴클레아제를 지칭한다. 각각의 내용이 본원에 참조로 포함된다). Cas12b 오솔로그(ortholog)는 알리사이클로바실루스 아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris), 알리사이클로바실루스 아시도필루스(Alicyclobacillus acidophilus)(Teng 등, Cell Discov. 2018 Nov 27;4:63), 바실루스 히사시(Bacillus hisashi), 및 바실루스 종 V3-13(Bacillus sp . V3- 13)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 종에 기재되었다. 추가의 적합한 Cas12b 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다.
일부 구현예에서, Cas12b 또는 이의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas12b 변이체"로 지칭된다. Cas12b 변이체는 Cas12b, 또는 이의 단편에 대한 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas12b 변이체는 야생형 Cas12b에 대해 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, Cas12b 변이체는 야생형 Cas12b와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 이상의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Cas12b 변이체는 Cas12b의 단편(예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하여, 단편이 야생형 Cas12b의 상응하는 단편에 대해 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하도록 한다. 일부 구현예에서, 단편은 상응하는 야생형 Cas12b의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다. 예시적인 Cas12b 폴리펩티드는 하기 나열되어 있다.
Cas12b/C2c1(uniprot.org/uniprot/T0D7A2#2) sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 C2c1 OS = 알리사이클로바실루스 아시도 - 테레스트리스(균주 ATCC 49025 / DSM 3922/ CIP 106132 / NCIMB 13137/GD3B) GN=c2c1 PE=1 SV=1
AacCas12b(알리사이클로바실루스 아시디필루스(Alicyclobacillus acidiphilus)) - WP_067623834
BhCas12b (바실루스 히사시) NCBI 참조 서열: WP_095142515
BvCas12b V4로 명명된 변이체는 상기 야생형 서열에 비해 변화 S893R, K846R, 및 E837G를 포함한다.
BvCas12b (바실루스 종 V3-13) NCBI 참조 서열: WP_101661451.1
용어 "보존적 아미노산 치환" 또는 "보존적 돌연변이"는 하나의 아미노산을 공통 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체한 것을 지칭한다. 개별 아미노산 사이의 공통 특성을 정의하는 기능적 방식은 상동 유기체의 상응하는 단백질 사이의 정규화된 아미노산 변화 빈도를 분석하는 것이다(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). 이러한 분석에 따르면, 아미노산의 그룹은 그룹 내의 아미노산이 서로 우선적으로 교환되고, 따라서 전반적인 단백질 구조에 대한 영향이 서로 가장 유사한 것으로 정의될 수 있다(상기 Schulz, G. E. 및 Schirmer, R. H.). 보존적 돌연변이의 비제한적인 예는 아미노산의 아미노산 치환, 예를 들어, 양전하가 유지될 수 있도록 아르기닌을 리신으로 및 그 반대로; 음전하가 유지될 수 있도록 아스파르트산을 글루탐산으로 및 그 반대로; 유리 -OH가 유지될 수 있도록 트레오닌을 세린으로; 및 유리 -NH2가 유지될 수 있도록 아스파라긴을 글루타민으로 치환하는 것을 포함한다.
본원에서 교환가능하게 사용된 바와 같은 용어 "코딩 서열" 또는 "단백질 코딩 서열"은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 분절을 지칭한다. 코딩 서열은 또한 오픈 리딩 프레임으로 지칭될 수 있다. 영역 또는 서열은 시작 코돈에 의해 5' 단부에 더 가깝고 종결 코돈에 따라 3' 단부에 더 가깝게 결합된다. 본원에 기재된 염기 편집기에 유용한 종결 코돈을 하기를 포함한다:
"사이티딘 데아미나제"란 아미노 기를 카르보닐 기로 전환하는 탈아미노화 반응을 촉매할 수 있는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 의미한다. 일 구현예에서, 사이티딘 데아미나제는 사이토신을 우라실로 또는 5-메틸사이토신을 티민으로 전환시킨다. 페트로마이존 마리누스(Petromyzon marinus)로부터 유래되는 PmCDA1(페트로마이존 마리누스 사이토신 데아미나제 1, "PmCDA1"), 포유동물(예를 들어, 인간, 돼지, 소, 말, 원숭이 등)로부터 유래되는 AID(활성화-유도된 사이티딘 데아미나제; AICDA), 및 APOBEC는 예시적인 사이티딘 데아미나제이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "데아미나제" 또는 "데아미나제 도메인"은 탈아미노화 반응을 촉매하는 단백질 또는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 사이티딘 또는 데옥시사이티딘의 우리딘 또는 데옥시우리딘으로의 가수분해성 탈아미노화를 각각 촉매하는 사이티딘 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 사이토신의 우라실로의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 사이토신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 아데닌의 하이포크산틴으로의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 아데노신 또는 아데닌(A)의 이노신(I)으로의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 아데노신 또는 데옥시아데노신의 이노신 또는 데옥시이노신으로의 가수분해성 탈아미노화를 각각 촉매하는 아데노신 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데노신의 가수분해성 탈아미노화를 촉매화한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나제(예를 들어, 조작된 아데노신 데아미나제, 진화된 아데노신 데아미나제)는 박테리아와 같은 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 이. 콜라이, 에스. 아우레우스, 에스. 티피, 에스. 푸트레파시엔스, 에이치. 인플루엔자, 또는 씨. 크레센투스와 같은 박테리아로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 데아미나제이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트, 또는 마우스와 같은 유기체로부터의 자연 발생 데아미나제의 변이체이다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 자연에서 발생하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 자연 발생 데아미나제와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 동일하다.
"검출"은 검출될 분석물의 존재, 부재 또는 양을 식별하는 것을 지칭한다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에서 서열 변경이 검출된다. 또 다른 구현예에서, indel의 존재가 검출된다.
"검출가능한 표지"란 관심 분자에 연결될 때, 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 또는 화학 수단을 통해 후자를 검출가능하게 만드는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 유용한 표지는 방사성 동위원소, 자기 비드, 금속성 비드, 콜로이드성 입자, 형광 염료, 전자-밀도 시약, 효소(예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA))), 비오틴, 디곡시게닌, 또는 합텐을 포함한다.
"질환"이란 세포, 조직, 또는 기관의 정상적인 기능을 손상시키거나 또는 방해하는 임의의 병태 또는 장애를 의미한다.
"유효량"은 제제 또는 활성 화합물, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기의 양을 의미하며, 즉 치료되지 않은 환자에 비해 질환의 증상을 개선하는 데 필요한 양을 의미한다. 질환의 치료적 치료를 위해 본 발명을 실행하는 데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중, 및 일반적인 건강에 따라 달라진다. 궁극적으로, 주치의 또는 수의사는 적절한 양 및 투여량 레지멘을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효"량으로 지칭된다. 일 구현예에서, 유효량은 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내 세포)에서 관심 유전자에 변경을 도입하기에 충분한 본 발명의 염기 편집기의 양이다. 일 구현예에서, 유효량은 치료적 효과를 달성하는 데 필요한 염기 편집기의 양이다. 이러한 치료적 효과는 대상체, 조직 또는 기관의 모든 세포에서 병원성 유전자를 변경하기에 충분할 필요는 없지만, 대상체, 조직 또는 기관에 존재하는 세포의 약 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% 이상에서 병원성 유전자를 변경하는 데만 충분하다. 일 구현예에서, 유효량은 질환의 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질, 예를 들어, nCas9 도메인 및 데아미나제 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제)을 포함하는 핵염기 편집기의 유효량은 본원에 기재된 핵염기 편집기에 의해 특이적으로 결합되고 편집된 표적 부위의 편집을 유도하기에 충분한 양을 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 제제, 예를 들어, 융합 단백질의 유효량은 예를 들어 원하는 생물학적 반응, 예를 들어, 편집될 특이적 대립유전자, 게놈, 또는 표적 부위, 표적화되고 있는 세포 또는 조직, 및/또는 사용되고 있는 제제와 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질, 예를 들어, nCas9 도메인 및 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질의 유효량은 융합 단백질에 의해 특이적으로 결합되고 편집된 표적 부위의 편집을 유도하기에 충분한 융합 단백질의 양을 지칭할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 제제, 예를 들어, 융합 단백질, 뉴클레아제, 하이브리드 단백질, 단백질 이량체, 단백질(또는 단백질 이량체) 및 폴리뉴클레오티드의 복합체, 또는 폴리뉴클레오티드의 유효량은 예를 들어 원하는 생물학적 반응, 예를 들어, 편집될 특이적 대립유전자, 게놈, 또는 표적 부위, 표적화되고 있는 세포 또는 조직, 및/또는 사용되고 있는 제제와 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
"단편"이란 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 일부를 의미한다. 이 부분은 바람직하게는 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 함유한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
"가이드 RNA" 또는 "gRNA"란 표적 서열에 특이적이고 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 단백질(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)과 복합체를 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA(gRNA)이다. gRNA는 2 개 이상의 RNA의 복합체, 또는 단일 RNA 분자로서 존재할 수 있다. 단일 RNA 분자로서 존재하는 gRNA는 단일-가이드 RNA(sgRNA)로 지칭될 수 있지만, "gRNA"는 단일 분자 또는 2 개 이상의 분자의 복합체로서 존재하는 가이드 RNA를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 전형적으로, 단일 RNA 종으로 존재하는 gRNA는 다음 2 개의 도메인을 포함한다: (1) 표적 핵산에 대한 상동성을 공유하는(예를 들어, 표적에 대한 Cas9 복합체의 결합을 지시하는) 도메인; 및 (2) Cas9 단백질에 결합하는 도메인. 일부 구현예에서, 도메인 (2)는 tracrRNA로 알려진 서열에 상응하고, 줄기-루프 구조를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 도메인 (2)는 Jinek 등, Science 337:816-821(2012)에 제공된 바와 같이 tracrRNA와 동일하거나 또는 상동성이며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. gRNA(예를 들어, 도메인 2 포함하는 것들)의 다른 예는 "전환가능한 Cas9 뉴클레아제 및 이의 용도"라는 발명의 명칭의 US20160208288, 및 "기능적 뉴클레아제에 대한 전달 시스템"이라는 발명의 명칭의 US 9,737,604에서 찾을 수 있으며, 각각의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, gRNA는 도메인 (1) 및 (2) 중 2 개 이상을 포함하고, "연장된 gRNA"로 지칭될 수 있다. 연장된 gRNA는 본원에 기재된 바와 같이, 2 개 이상의 Cas9 단백질에 결합하고 2 개 이상의 별개의 영역에서 표적 핵산에 결합할 것이다. gRNA는 표적 부위를 보완하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 표적 부위에 대한 뉴클레아제/RNA 복합체의 결합을 매개하여, 뉴클레아제:RNA 복합체의 서열 특이성을 제공한다.
"이종이량체"란 야생형 TadA 도메인 및 TadA 도메인의 변이체(예를 들어, TadA*8 또는 TadA*9) 또는 2 개의 변이체 TadA 도메인(예를 들어, TadA*7.10 및 TadA*8 또는 2 개의 TadA*8 도메인; 또는 TadA*7.10 및 TadA*9 또는 2 개의 TadA*9 도메인)과 같은 2 개의 도메인을 포함하는 융합 단백질을 의미한다.
"혼성화"는 수소 결합을 의미하며, 이는 상보적 핵염기 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합일 수 있다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 이루는 상보적 핵염기이다.
"증가"란 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 양의 변경을 의미한다.
용어 "염기 복구의 억제제", "염기 복구 억제제", "IBR" 또는 이의 문법적 등가물은 핵산 복구 효소, 예를 들어 염기 절제 복구 효소의 활성을 억제할 수 있는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, IBR은 이노신 염기 절제 복구의 억제제이다. 예시적인 염기 복구의 억제제는 APE1, Endo III, Endo IV, Endo V, Endo VIII, Fpg, hOGGl, hNEILl, T7 Endol, T4PDG, UDG, hSMUGl, 및 hAAG의 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 복구 억제제는 Endo V 또는 hAAG의 억제제이다. 일부 구현예에서, IBR은 Endo V 또는 hAAG의 억제제이다. 일부 구현예에서, IBR은 촉매적으로 불활성 EndoV 또는 촉매적으로 불활성 hAAG이다. 일부 구현예에서, 염기 복구 억제제는 촉매적으로 불활성 EndoV 또는 촉매적으로 불활성 hAAG이다. 일부 구현예에서, 염기 복구 억제제는 우라실 글리코실라제 억제제(UGI)이다. UGI는 우라실-DNA 글리코실라제 염기-절제 복구 효소를 억제할 수 있는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, UGI 도메인은 야생형 UGI 또는 야생형 UGI의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공되는 UGI 단백질은 UGI의 단편 및 UGI 또는 UGI 단편에 상동성인 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 복구 억제제는 이노신 염기 절제 복구의 억제제이다. 일부 구현예에서, 염기 복구 억제제는 "촉매적으로 불활성 이노신 특이적 뉴클레아제" 또는 "사멸된 이노신 특이적 뉴클레아제"이다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 촉매적으로 불활성 이노신 글리코실라제(예를 들어, 알킬 아데닌 글리코실라제 (AAG))는 이노신에 결합할 수 있지만, 무염기성 부위를 생성하거나 또는 이노신을 제거할 수 없으며, 이에 의해 DNA 손상/복구 메커니즘으로부터 새로 형성된 이노신 모이어티를 입체적으로 차단할 수 있다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성 이노신 특이적 뉴클레아제는 핵산에서 이노신에 결합할 수 있지만 핵산을 절단하지 않는다. 비제한적인 예시적인 촉매적으로 불활성 이노신 특이적 뉴클레아제는 예를 들어, 인간으로부터 촉매적으로 불활성 알킬 아데노신 글리코실라제(AAG 뉴클레아제), 및 예를 들어, 이. 콜라이로부터 촉매적으로 불활성 엔도뉴클레아제 V(EndoV 뉴클레아제)를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성 AAG 뉴클레아제는 또 다른 AAG 뉴클레아제에서 E125Q 돌연변이 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다.
"인테인(intein)"은 단백질 스플라이싱으로 알려진 과정에서 자체 절제하고 나머지 단편(엑스테인(extein))을 펩티드 결합으로 연결할 수 있는 단백질의 단편이다. 인테인은 또한 "단백질 인트론"으로 지칭된다. 인테인이 자체 절제하고 단백질의 나머지 부분을 연결하는 과정은 본원에서 "단백질 스플라이싱" 또는 "인테인-매개 단백질 스플라이싱"이라고 불린다. 일부 구현예에서, 전구체 단백질의 인테인(인테인-매개 단백질 스플라이싱 이전에 단백질을 함유하는 인테인)은 2 개의 유전자로부터 유래한다. 이러한 인테인은 본원에서 스플릿 인테인(예를 들어, 스플릿 인테인-N 및 스플릿 인테인-C)으로 지칭된다. 예를 들어, 시아노박테리아에서, DNA 폴리머라제 III의 촉매적 서브유닛인 DnaE는 2 개의 개별 유전자인 dnaE-n 및 dnaE-c에 의해 암호화된다. dnaE-n 유전자에 의해 암호화된 인테인은 본원에서 "인테인-N"으로 지칭될 수 있다. dnaE-c 유전자에 의해 암호화된 인테인은 본원에서 "인테인-C"로 지칭될 수 있다.
다른 인테인 시스템이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, dnaE 인테인, Cfa-N(예를 들어, 스플릿 인테인-N) 및 Cfa-C(예를 들어, 스플릿 인테인-C) 인테인 쌍을 기반으로 하는 합성 인테인이 기재되었다(예를 들어, 본원에 참조로 포함된, Stevens 등, J Am Chem Soc. 2016 Feb. 24; 138(7):2162-5). 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 인테인 쌍의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: Cfa DnaE 인테인, Ssp GyrB 인테인, Ssp DnaX 인테인, Ter DnaE3 인테인, Ter ThyX 인테인, Rma DnaB 인테인 및 Cne Prp8 인테인(예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 제8,394,604호에 기재된 바와 같음.
인테인의 예시적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 제공된다.
인테인-N 및 인테인-C는 스플릿 Cas9의 N-말단 부분 및 스플릿 Cas9의 C-말단 부분의 연결을 위해, 스플릿 Cas9의 N-말단 부분 및 스플릿 Cas9의 C-말단 부분에 각각 융합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인테인-N은 스플릿 Cas9의 N-말단 부분의 C-말단에 융합되어, 즉, N--[N 스플릿 Cas9의 N-말단 부분]-[인테인-N]--C의 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 인테인-C는 스플릿 Cas9의 C-말단 부분의 N-말단에 융합되어, 즉, N-[인테인-C]--[스플릿 Cas9의 C-말단 부분]-C의 구조를 형성한다. 인테인이 융합된 단백질(예를 들어, 스플릿 Cas9)을 연결하기 위한 인테인-매개 단백질 스플라이싱의 메커니즘은 본원에 참조로 포함된 Shah 등, Chem Sci . 2014; 5(1):446-461에 기재된 바와 같이, 당업계에 알려져 있다. 인테인을 설계 및 사용하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 WO2014004336, WO2017132580, US20150344549, 및 US20180127780에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
용어 "단리된", "정제된", 또는 "생물학적으로 순수한"은 천연 상태에서 발견되는 바와 같이 일반적으로 동반되는 구성요소로부터 다양한 정도로 자유로운 물질을 지칭한다. "단리"는 원래 공급원 또는 주변과의 분리 정도를 나타낸다. "정제"는 단리보다 더 높은 분리 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않거나 또는 다른 불리한 결과를 유발하지 않도록 다른 물질이 실질적으로 없다. 즉, 본 발명의 핵산 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 때 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 경우 정제된다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석적 화학 기술, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성하는 것으로 나타날 수 있다. 변형, 예를 들어, 인산화 또는 글리코실화에 적용될 수 있는 단백질의 경우, 상이한 변형은 개별적으로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 생성할 수 있다.
"단리된 폴리뉴클레오티드"란 본 발명의 핵산 분자가 유래된 유기체의 자연 발생 게놈에서 유전자를 플랭킹하는 유전자가 없는 핵산(예를 들어, DNA)을 의미한다. 따라서 용어는 예를 들어, 벡터 내로; 자체적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 내로; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 혼입되거나; 또는 다른 서열와 무관하게 별도의 분자(예를 들어, cDNA 또는 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 생성된 게놈 또는 cDNA 단편)로 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 용어는 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자, 뿐만 아니라 추가적인 폴리펩티드 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
"단리된 폴리펩티드"란 자연적으로 동반되는 구성요소로부터 분리된 본 발명의 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 단백질 및 자연적으로 회합되는 자연 발생 유기 분자로부터 중량 기준으로 적어도 60%가 없을 때 단리된다. 바람직하게는, 제제는 중량 기준으로 본 발명의 폴리펩티드의 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 99%이다. 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 예를 들어, 천연 공급원으로부터 추출, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 단백질을 화학적으로 합성함으로써 수득될 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해, 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "링커"는 공유 링커(예를 들어, 공유 결합), 비-공유 링커, 화학 기, 또는 2 개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어, 단백질 복합체 또는 리보뉴클레오복합체의 2 개의 구성요소, 또는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인(예를 들어, dCas9) 및 데아미나제 도메인((예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)와 같은 융합 단백질의 2 개의 도메인을 연결하는 분자를 지칭할 수 있다. 링커는 염기 편집기 시스템의 상이한 구성요소, 또는 구성요소의 상이한 부분을 연결할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 링커는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 가이드 폴리뉴클레오티드 결합 도메인 및 데아미나제의 촉매 도메인을 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 CRISPR 폴리펩티드 및 데아미나제를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 Cas9 및 데아미나제를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 dCas9 및 데아미나제를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 nCas9 및 데아미나제를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 가이드 폴리뉴클레오티드 및 데아미나제를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 염기 편집기 시스템의 탈아미노화 구성요소 및 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 구성요소를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 염기 편집기 시스템의 탈아미노화 구성요소의 RNA-결합 부분 및 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 구성요소를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 염기 편집기 시스템의 탈아미노화 구성요소의 RNA-결합 부분 및 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 구성요소의 RNA-결합 부분을 연결할 수 있다. 링커는 2 개의 기, 분자, 또는 다른 모이터티 사이에 위치하거나, 또는 이에 의해 플랭킹되고 공유 결합 또는 비-공유 상호작용을 통해 서로 연결되어, 2 개를 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학 모이어티일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 DNA 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 RNA 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 리간드에 결합할 수 있는 압타머를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 탄수화물, 펩티드, 단백질, 또는 핵산일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 리보스위치로부터 유래될 수 있는 압타머를 포함할 수 있다. 압타머가 유래되는 리보스위치는 테오필린 리보스위치, 티아민 피로포스페이트(TPP) 리보스위치, 아데노신 코발라민(AdoCbl) 리보스위치, S-아데노실 메티오닌(SAM) 리보스위치, SAH 리보스위치, 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN) 리보스위치, 테트라하이드로폴레이트 리보스위치, 리신 리보스위치, 글리신 리보스위치, 퓨린 리보스위치, GlmS 리보스위치, 또는 프리-퀘오신1(PreQ1) 리보스위치로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리펩티드 또는 단백질 도메인, 예컨대 폴리펩티드 리간드에 결합된 압타머를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 리간드는 K 상동성(KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 멸균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인식 모티프일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 리간드는 염기 편집기 시스템 구성요소의 일부일 수 있다. 예를 들어, 핵염기 편집 구성요소는 데아미나제 도메인 및 RNA 인식 모티프를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산(예를 들어, 펩티드 또는 단백질)일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 약 5-100 개의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 또는 90-100 개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 약 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 또는 450-500 개의 아미노산 길이일 수 있다. 더 길거나 또는 더 짧은 링커가 또한 사용될 수 있다. 더 길거나 또는 더 짧은 링커가 또한 고려된다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES를 포함하며, XTEN 링커로도 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 (SGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS) n, (G)n, (EAAAK)n, (GGS)n, SGSETPGTSESATPES, 또는 (XP)n 모티프, 또는 이들 중 임의의 것의 조합을 포함하며, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30 사이의 정수이고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다. 일부 구현예에서, 링커는 복수의 프롤린 잔기를 포함하며 5-21, 5-14, 5-9, 5-7 개의 아미노산 길이, 예를 들어, PAPAP, PAPAPA, PAPAPAP, PAPAPAPA, P(AP)4, P(AP)7, P(AP)10이다. 이러한 프롤린-풍부 링커는 또한 "강성(rigid)" 링커로 명명된다.
일부 구현예에서, 링커는 Cas9 뉴클레아제 도메인을 포함하는 RNA-프로그램가능한 뉴클레아제의 gRNA 결합 도메인, 및 핵산 편집 단백질의 촉매 도메인(예를 들어, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나제)을 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 dCas9 및 핵산 편집 단백질을 연결한다. 예를 들어, 링커는 2 개의 기, 분자, 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나, 또는 이에 의해 플랭킹되고 공유 결합을 통해 서로 연결되어, 2 개를 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산(예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 구현예에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학 모이어티이다. 일부 구현예에서, 링커는 5-200 개의 아미노산 길이, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35, 45, 50, 55, 60, 60, 65, 70, 70, 75, 80, 85, 90, 90, 95, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 175, 180, 190, 또는 200 개의 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 염기 편집기의 도메인은 SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS, SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, 또는 GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS의 아미노산 서열을 포함하는 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 도메인은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES를 포함하는 링커를 통해 융합되며, 이는 또한 XTEN 링커로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 24 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 40 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 64 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGS SGGS를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 92 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS를 포함한다.
"마커"란 질환 또는 장애와 연관된 발현 수준 또는 활성의 변경을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열 내에서 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내에서 하나 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는 전형적으로 원래 잔기 이어서 서열 내 잔기의 위치를 식별하고 새로 치환된 잔기의 정체를 식별함으로써 본원에 기재된다. 본원에 제공된 아미노산 치환(돌연변이)를 만드는 다양한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 현재 개시된 염기 편집기는 의도되지 않은 점 돌연변이와 같은 상당한 수의 의도되지 않은 돌연변이를 생성하지 않고 핵산(예를 들어, 대상체의 게놈 내 핵산)에서 점 돌연변이와 같은 "의도된 돌연변이"를 효율적으로 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 의도된 돌연변이를 생성하도록 특이적으로 설계된 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)에 결합된 특이적 염기 편집기(예를 들어, 사이티딘 염기 편집기 또는 아데노신 염기 편집기)에 의해 생성된 돌연변이이다.
일반적으로, 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열)에서 만들어지거나 또는 식별된 돌연변이는 참조(또는 야생형) 서열, 즉, 돌연변이를 함유하지 않는 서열과 관련하여 넘버링된다. 당업자는 참조 서열 대비 아미노산 및 핵산 서열에서 돌연변이의 위치를 결정하는 방법을 용이하게 이해할 것이다.
용어 "비-보존적 돌연변이"는 상이한 기 사이의 아미노산 치환, 예를 들어, 트립토판을 리신으로, 또는 세린을 페닐알라닌으로 등의 치환을 수반한다. 이 경우, 비-보존적 아미노산 치환이 기능적 변이체의 생물학적 활성을 방해하거나, 또는 억제하지 않는 것이 바람직하다. 비-보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있어서, 기능적 변이체의 생물학적 활성이 야생형 단백질에 비해 증가되도록 한다.
용어 "핵 국소화 서열", "핵 국소화 신호", 또는 "NLS"는 단백질의 세포 핵 내로의 유입을 촉진하는 아미노산 서열을 지칭한다. 핵 국소화 서열은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 2001년 5월 31일에 WO/2001/038547로 공개된 2000년 11월 23일 출원된 Plank 등의 국제 PCT 출원, PCT/EP2000/011690에 기재되어 있으며, 이의 내용은 예시적인 핵 국소화 서열의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함된다. 다른 구현예에서, NLS은 예를 들어, Koblan 등, Nature Biotech. 2018 doi:10.1038/nbt.4172에 의해 기재된 최적화된 NLS이다. 일부 구현예에서, NLS는 아미노산 서열 KRTADGSEFESPKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, KKTELQTTNAENKTKKL, KRGINDRNFWRGENGRKTR, RKSGKIAAIVVKRPRK, PKKKRKV, 또는 MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC를 포함한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "핵염기", "질소성 염기", 또는 "염기"는 결국 뉴클레오티드의 구성요소인 뉴클레오시드를 형성하는 질소-함유 생물학적 화합물을 지칭한다. 염기 쌍을 형성하고 겹겹이 쌓는 핵염기의 능력은 직접적으로 리보핵산(RNA) 및 데옥시리보핵산(DNA)과 같은 장쇄 나선 구조를 야기한다. 5 개의 핵염기 - 아데닌(A), 사이토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 우라실(U)은 1차 또는 표준이라고 불린다. 아데닌 및 구아닌은 퓨린으로부터 유래되고, 사이토신, 우라실, 및 티민은 피리미딘으로부터 유래된다. DNA 및 RNA는 또한 변형된 다른(비-1차) 염기를 함유할 수 있다. 비제한적인 예시적인 변형된 핵염기는 하이포크산틴, 크산틴, 7-메틸구아닌, 5,6-디하이드로우라실, 5-메틸사이토신(m5C), 및 5-하이드로메틸사이토신을 포함할 수 있다. 하이포크산틴 및 크산틴은 돌연변이원 존재를 통해 생성될 수 있으며, 이들 둘 다 탈아미노화(아민 기를 카르보닐 기로 대체)를 통해 생성될 수 있다. 하이포크산틴은 아데닌으로부터 변형될 수 있다. 크산틴은 구아닌으로부터 변형될 수 있다. 우라실은 사이토신의 탈아미노화를 초래할 수 있다. "뉴클레오시드"는 핵염기 및 5탄당(리보스 또는 데옥시리보스)으로 이루어진다. 뉴클레오시드의 예는 아데노신, 구아노신, 우리딘, 사이티딘, 5-메틸우리딘(m5U), 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 데옥시우리딘, 및 데옥시사이티딘을 포함한다. 변형된 핵염기가 있는 뉴클레오시드의 예는 이노신(I), 크산토신(X), 7-메틸구아노신(m7G), 디하이드로우리딘(D), 5-메틸사이티딘(m5C), 및 슈도우리딘(Ψ)을 포함한다. "뉴클레오티드"는 핵염기, 5탄당(리보스 또는 데옥시리보스), 및 적어도 하나의 포스페이트 기로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 핵염기 및 산성 모이어티, 예를 들어, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 중합체성 핵산, 예를 들어, 3 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 선형 분자이며, 여기서 인접한 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결을 통해 서로 연결된다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 3 개 이상의 개별 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체(예를 들어, 적어도 3 개의 뉴클레오티드의 스트링)를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 핵산은 예를 들어, 게놈, 전사체, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, snRNA, 플라스미드, 코스미드, 염색체, 염색분체, 또는 다른 자연 발생 핵산 분자의 맥락에서 자연 발생할 수 있다. 다른 한편으로, 핵산 분자는 비-자연 발생 분자, 예를 들어, 재조합 DNA 또는 RNA, 인공 염색체, 조작된 게놈, 또는 이의 단편, 또는 합성 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드일 수 있거나, 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 예를 들어, 포스포디에스테르 백본 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제되고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성되고 임의적으로 정제되고, 화학적으로 합성될 수 있다. 적절한 경우, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 및 백본 변형을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 나타내지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 뉴클레오시드(예를 들어 아데노신, 티미딘, 구아노신, 사이티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시사이티딘); 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸사이티딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-사이티딘, C5-메틸사이티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오사이티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예를 들어, 메틸화 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(2'-예를 들어,플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기(예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포라미다이트 연결)이거나 또는 포함한다.
용어 "핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질" 또는 "napDNAbp"는 napDNAbp를 특이적 핵산 서열로 가이드하는, 가이드 핵산과 같은 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 또는 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)와 회합하는 단백질을 지칭하기 위해 "폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 RNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 Cas9 단백질이다. Cas9 단백질은 Cas9 단백질을 가이드 RNA에 상보적인 특이적 DNA 서열로 가이드하는 가이드 RNA와 회합할 수 있다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas9 도메인, 예를 들어 뉴클레아제 활성 Cas9, Cas9 닉카제(nCas9), 또는 뉴클레아제 불활성 Cas9(dCas9)이다. 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질의 비제한적인 예는 Cas9(예를 들어, dCas9 및 nCas9), Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 및 Cas12j/CasΦ를 포함한다. Cas 효소의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12로도 알려짐), Cas10, Cas10d, Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j/CasΦ, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csx11, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, 유형 II Cas 효과기 단백질, 유형 V Cas 효과기 단백질, 유형 VI Cas 효과기 단백질, CARF, DinG, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 또는 조작된 버전을 포함한다. 다른 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은 또한 본 개시내용의 범위 내에 있지만, 이들은 본 개시내용에 구체적으로 나열되지 않을 수 있다. 예를 들어, Makarova 등 "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?" CRISPR J. 2018 Oct;1:325-336. doi: 10.1089/crispr.2018.0033; Yan 등, "Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems" Science. 2019 Jan 4;363(6422):88-91. doi: 10.1126/science.aav7271을 참조하며, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵염기 편집 도메인" 또는 "핵염기 편집 단백질"은 RNA 또는 DNA에서 핵염기 변형, 예컨대 사이토신(또는 사이티딘)에서 우라실(또는 우리딘) 또는 티민(또는 티미딘)으로, 및 아데닌(또는 아데노신)에서 하이포크산틴(또는 이노신)으로의 탈아미노화, 뿐만 아니라 비-주형 뉴클레오티드 부가 및 삽입을 촉매화할 수 있는 단백질 또는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 데아미나제 도메인(예를 들어, 아데닌 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제; 또는 사이티딘 데아미나제 또는 사이토신 데아미나제)이다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 하나 초과의 데아미나제 도메인(예를 들어, 아데닌 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 또는 사이토신 데아미나제)이다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 자연 발생 핵염기 편집 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 자연 발생 핵염기 편집 도메인으로부터 조작되거나 또는 진화된 핵염기 편집 도메인일 수 있다. 핵염기 편집 도메인은 박테리아, 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트, 또는 마우스와 같은 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "제제를 수득하는"에서와 같은 "수득하는"은 제제를 합성, 구매, 또는 달리 획득하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "환자" 또는 "대상체"는 질환 또는 장애로 진단되거나, 질환 또는 장애가 있거나 또는 발병할 위험이 있거나, 또는 질환 또는 장애가 있거나 또는 발병할 것으로 의심되는 포유동물 대상체 또는 개체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "환자"는 질환 또는 장애가 발병할 가능성이 평균보다 더 높은 포유동물 대상체를 지칭한다. 예시적인 환자는 인간, 비-인간 영장류, 고양이, 개, 돼지, 소, 고양이, 말, 낙타, 라마, 염소, 양, 설치류(예를 들어, 마우스, 토끼, 래트, 또는 기니 피그) 및 본원에 개시된 요법에서 이익을 얻을 수 있는 다른 포유동물일 수 있다. 예시적인 인간 환자는 남성 및/또는 여성일 수 있다.
"이를 필요로 하는 환자" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 본원에서 질환 또는 장애로 진단되거나, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 위험이 있거나, 질환 또는 장애를 가질 것으로 미리 결정되거나, 또는 질환 또는 장애를 가질 것으로 의심되는 환자로 지칭된다.
용어 "병원성 돌연변이", "병원성 변이체", "질환 유발 돌연변이", "질환 유발 변이체", "유해 돌연변이", 또는 "병인성 돌연변이"는 특정 질환 또는 장애에 대한 개체의 감수성 또는 성향을 증가시키는 유전적 변경 또는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구현예에서, 병원성 돌연변이는 유전자에 의해 암호화된 단백질에서 적어도 하나의 병원성 아미노산에 의해 치환된 적어도 하나의 야생형 아미노산을 포함한다.
용어 "단백질", "펩티드", "폴리펩티드", 및 이의 문법적 등가물은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 펩티드(아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 용어는 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 적어도 3 개의 아미노산 길이일 것이다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 개별 단백질 또는 단백질의 집합을 지칭할 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산은 예를 들어, 탄수화물 기, 하이드록실 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 접합, 기능화, 또는 다른 변형을 위한 링커 등과 같은 화학적 실체의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 또한 단일 분자일 수 있거나 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 단지 자연 발생 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 자연 발생, 재조합, 또는 합성, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 적어도 2 개의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 하이브리드 폴리펩티드를 지칭한다. 하나의 단백질은 융합 단백질의 아미노-말단(N-말단) 부분 또는 카르복시-말단(C-말단) 단백질에 위치하여 각각 아미노-말단 융합 단백질 또는 카르복시-말단 융합 단백질을 형성할 수 있다. 단백질은 상이한 도메인, 예를 들어, 핵산 결합 도메인(예를 들어, 단백질의 표적 부위에 대한 결합을 지시하는 Cas9의 gRNA 결합 도메인) 및 핵산 절단 도메인, 또는 핵산 편집 단백질의 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 단백질성 부분, 예를 들어, 핵산 결합 도메인을 구성하는 아미노산 서열, 및 유기 화합물, 예를 들어, 핵산 절단제로서 작용할 수 있는 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA와 복합체를 형성하거나 또는 회합되어 있다. 본원에 제공된 임의의 단백질은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 단백질은 특히 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질에 적합한 재조합 단백질 발현 및 정제를 통해 생성될 수 있다. 재조합 단백질 발현 및 정제 방법은 잘 알려져 있고, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))에 의해 기재된 것들을 포함하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 폴리펩티드 및 단백질(이의 기능적 부분 및 기능적 변이체 포함)은 하나 이상의 자연 발생 아미노산 대신에 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 아미노사이클로헥산 카르복실산, 노르류신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로페닐알라닌, 4-카르복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글리신, 인돌린-2-카르복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-리신, N',N'-디벤질-리신, 6-하이드록시리신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카르복실산, α-아미노사이클로헥산 카르복실산, α-아미노사이클로헵탄 카르복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카르복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌, 및 α-tert-부틸글리신을 포함한다. 폴리펩티드 및 단백질은 폴리펩티드 작제물의 하나 이상의 아미노산의 번역후 변형과 연관될 수 있다. 번역후 변형의 비제한적인 예는 인산화, 아세틸화 및 포르밀화를 포함한 아실화, 글리코실화(N-연결 및 O-연결 포함), 아미드화, 하이드록실화, 메틸화 및 에틸화를 포함한 알킬화, 유비퀴틸화, 피롤리돈 카르복실산의 첨가, 디술피드 가교의 형성, 황산화, 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화, 파르네실화, 게라닐화, 글리피칸화(glypiation), 리포일화 및 요오드화를 포함한다.
단백질 또는 핵산의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 자연에서 발생하지 않지만, 인간 조작의 산물인 단백질 또는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 단백질 또는 핵산 분자는 임의의 자연 발생 서열과 비교하여 적어도 1 개, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 또는 적어도 7 개의 돌연변이를 포함하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"감소"란 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 음의 변경을 의미한다.
"참조"란 표준 또는 제어 조건을 의미한다. 일 구현예에서, 참조는 야생형 또는 건강한 세포이다. 다른 구현예에서 그리고 제한없이, 참조는 테스트 조건에 적용되지 않거나, 또는 위약 또는 생리 식염수, 배지, 완충액, 및/또는 관심 폴리뉴클레오티드를 보유하지 않는 대조군 벡터에 적용된 처리되지 않은 세포이다.
"참조 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로 사용되는 정의된 서열이다. 참조 서열은 명시된 서열의 서브셋 또는 전체; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 분절, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다. 폴리펩티드의 경우, 참조 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16 개의 아미노산, 적어도 약 20 개의 아미노산, 적어도 약 25 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 또는 약 100 개의 아미노산일 것이다. 핵산의 경우, 참조 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 60 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 75 개의 뉴클레오티드, 약 100 개의 뉴클레오티드, 또는 약 300 개의 뉴클레오티드 또는 그 부근 또는 그 사이의 임의의 정수일 것이다. 일부 구현예에서, 참조 서열은 관심 단백질의 야생형 서열이다. 다른 구현예에서, 참조 서열은 야생형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
용어 "RNA-프로그램가능한 뉴클레아제", 및 "RNA-가이드 뉴클레아제"는 절단을 위한 표적이 아닌 하나 이상의 RNA(들)와 함께 사용된다(예를 들어, 이와 결합하거나 또는 회합한다). 일부 구현예에서, RNA-프로그램가능한 뉴클레아제는 RNA와 복합체를 형성할 때, 뉴클레아제:RNA 복합체로 지칭될 수 있다. 전형적으로, 결합된 RNA(들)는 가이드 RNA(gRNA)로 지칭된다. 일부 구현예에서, RNA-프로그램가능한 뉴클레아제는 (CRISPR-연관 시스템) Cas9 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9(Csnl)이다(예를 들어, "Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., 등, Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A . 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., 등, Nature 471:602-607(2011) 참조.
RNA-프로그램가능한 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)는 DNA 절단 부위를 표적화하기 위해 RNA:DNA 혼성화를 사용하기 때문에, 이러한 단백질은 원칙적으로 가이드 RNA에 의해 명시된 임의의 서열에 표적화될 수 있다. 부위-특이적 절단을 위해(예를 들어, 게놈을 변형시키기 위해) Cas9와 같은 RNA-프로그램가능한 뉴클레아제를 사용하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Cong, L. 등, Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P. 등, RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013); Hwang, W.Y. 등, Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013); Jinek, M. 등, RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. 등, Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013); Jiang, W. 등 RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013) 참조; 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
용어 "단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)"은 게놈의 특이적 위치에서 발생하는 단일 뉴클레오티드의 변경이며, 여기서 각각의 변경은 집단 내에서 일부 인식가능한 정도로 존재한다(예를 들어, > 1%). 예를 들어, 인간 게놈의 특이적 염기 위치에서, C 뉴클레오티드는 대부분의 개체에서 보일 수 있지만, 소수의 개체에서, 위치는 A가 차지하고 있다. 이는 이 특이적 위치에 SNP가 있으며, 2 개의 가능한 뉴클레오티드 변이인 C 또는 A가 이 위치에 대한 대립유전자가 된다는 것을 의미한다. SNP는 질환에 대한 감수성 차이에 기저를 이룬다. 질병의 심각성 및 우리의 몸이 치료에 반응하는 방식은 또한 유전적 변이의 징후이다. SNP는 유전자의 코딩 영역, 유전자의 비코딩 영역, 또는 유전자간 영역(유전자 사이의 영역) 내에 속할 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 서열 내의 SNP는 유전 코드의 축퇴로 인해, 생성된 단백질의 아미노산 서열을 반드시 변화시키지는 않는다. 코딩 영역 내의 SNP는 2 가지 유형이 있다: 동의 및 비동의 SNP. 동의 SNP는 단백질 서열에 영향을 미치지 않는 반면, 비동의 SNP는 단백질의 아미노산 서열을 변화시킨다. 비동의 SNP는 2 가지 유형이 있다: 미스센스 및 넌센스. 단백질-코딩 영역에 없는 SNP는 여전히 유전자 스플라이싱, 전사 인자 결합, 메신저 RNA 분해, 또는 비코딩 RNA 서열에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 유형의 SNP에 의해 영향을 받은 유전자 발현은 eSNP(발현 SNP)로 지칭되며 유전자의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)는 빈도의 임의의 제한없이 단일 뉴클레오티드에서의 변이이며 체세포에서 일어날 수 있다. 체세포 단일 뉴클레오티드 변이는 또한 단일-뉴클레오티드 변경으로 불릴 수 있다.
"특이적으로 결합한다"란 핵산 분자, 폴리펩티드, 또는 이의 복합체(예를 들어, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 가이드 핵산), 화합물, 또는 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자를 인식하고 결합하지만, 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인식하고 결합하지 않는 분자를 의미한다.
본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열에 대해 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열에 대해 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화할 수 있다.
"혼성화하다"란 다양한 엄격성 조건 하에, 상보적 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 유전자), 또는 이의 부분 사이에 이중-가닥 분자를 형성하는 쌍을 의미한다. (예를 들어, Wahl, G. M. 및 S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507 참조).
예를 들어, 엄격한 염 농도는 일반적으로 약 750 mM NaCl 및 75 mM 시트르산삼나트륨 미만, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 시트르산삼나트륨 미만, 보다 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 낮은 엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 부재 하에 수득될 수 있는 반면, 높은 엄격성 혼성화는 적어도 약 35% 포름아미드, 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 포름아미드의 존재 하에 수득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로 적어도 약 30℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 37℃, 가장 바람직하게는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 혼성화 시간, 세제, 예를 들어, 나트륨 도데실 술페이트(SDS)의 농도, 및 담체 DNA의 포함 또는 배제와 같은 다양한 추가적인 매개변수는 당업자에게 잘 알려져 있다. 필요에 따라 이러한 다양한 조건을 조합함으로써 다양한 수준의 엄격성이 달성된다. 바람직한 구현예에서, 혼성화는 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨, 및 1% SDS 중에서 30℃에서 발생할 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 혼성화는 500 mM NaCl, 50 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 35% 포름아미드, 및 100 mg/ml 변성된 연어 정자 DNA(ssDNA) 중에서 37℃에서 발생할 것이다. 가장 바람직한 구현예에서, 혼성화는 250 mM NaCl, 25 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 50% 포름아미드, 및 200 μg/ml ssDNA 중에서 42℃에서 발생할 것이다. 이러한 조건에 대한 유용한 변경은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
대부분의 적용의 경우, 혼성화 후 세척 단계에서 또한 엄격성이 다를 것이다. 세척 엄격성 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 상기와 같이, 세척 엄격성은 염 농도를 감소시키거나 또는 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에 대한 엄격한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 시트르산삼나트륨 미만, 가장 바람직하게는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 세척 단계에 대한 엄격한 온도 조건은 일반적으로 적어도 약 25℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 42℃, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 구현예에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS 중에서 25℃에서 발생할 것이다. 또 다른 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS 중에서 42℃에서 발생할 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS 중에서 68℃에서 발생할 것이다. 이러한 조건에 대한 추가적인 변경은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 혼성화 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고 예를 들어, Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel 등 (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); 및 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 기재되어 있다.
"스플릿"이란 2 개 이상의 단편으로 나눠지는 것을 의미한다.
"스플릿 Cas9 단백질" 또는 "스플릿 Cas9"는 2 개의 별개의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 N-말단 단편 및 C-말단 단편으로 제공되는 Cas9를 지칭한다. Cas9 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분에 상응하는 폴리펩티드는 스플릿되어 "재구축된" Cas9 단백질을 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, Cas9 단백질은 예를 들어, Nishimasu 등, Cell, Volume 156, Issue 5, pp. 935-949, 2014에 기재되거나, 또는 Jiang 등 (2016) Science 351: 867-871. PDB file: 5F9R에 기재된 바와 같이, 단백질의 무질서한 영역 내에서 2 개의 단편으로 나눠지며, 상기 문헌은 각각이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 단백질은 약 아미노산 A292-G364, F445-K483, 또는 E565-T637 사이의 SpCas9의 영역 내에서 임의의 C, T, A, 또는 S, 또는 임의의 다른 Cas9, Cas9 변이체(예를 들어, nCas9, dCas9), 또는 다른 napDNAbp의 상응하는 위치에서 2 개의 단편으로 나눠진다. 일부 구현예에서, 단백질은 SpCas9 T310, T313, A456, S469, 또는 C574에서 2 개의 단편으로 나눠진다. 일부 구현예에서, 단백질을 2 개의 단편으로 나누는 과정은 단백질을 "스플릿하는 것"으로 지칭된다.
다른 구현예에서, Cas9 단백질의 N-말단 부분은 아미노산 1-573 또는 1-637 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 야생형(SpCas9)(NCBI 참조 서열: NC_002737.2, Uniprot 참조 서열: Q99ZW2)을 포함하고 Cas9 단백질의 C-말단 부분은 SpCas9 야생형의 아미노산 574-1368 또는 638-1368의 일부를 포함한다.
스플릿 Cas9의 C-말단 부분은 스플릿 Cas9의 N-말단 부분과 연결되어 완전한 Cas9 단백질을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질의 C-말단 부분은 Cas9 단백질의 N-말단 부분이 끝나는 곳에서 시작한다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 스플릿 Cas9의 C-말단 부분은 spCas9의 아미노산 (551-651)-1368의 일부를 포함한다. "(551-651)-1368"은 아미노산 551-651(포함) 사이의 아미노산에서 시작하고 아미노산 1368에서 끝나는 것을 의미한다. 예를 들어, 스플릿 Cas9의 C-말단 부분은 spCas9의 아미노산 551-1368, 552-1368, 553-1368, 554-1368, 555-1368, 556-1368, 557-1368, 558-1368, 559-1368, 560-1368, 561-1368, 562-1368, 563-1368, 564-1368, 565-1368, 566-1368, 567-1368, 568-1368, 569-1368, 570-1368, 571-1368, 572-1368, 573-1368, 574-1368, 575-1368, 576-1368, 577-1368, 578-1368, 579-1368, 580-1368, 581-1368, 582-1368, 583-1368, 584-1368, 585-1368, 586-1368, 587-1368, 588-1368, 589-1368, 590-1368, 591-1368, 592-1368, 593-1368, 594-1368, 595-1368, 596-1368, 597-1368, 598-1368, 599-1368, 600-1368, 601-1368, 602-1368, 603-1368, 604-1368, 605-1368, 606-1368, 607-1368, 608-1368, 609-1368, 610-1368, 611-1368, 612-1368, 613-1368, 614-1368, 615-1368, 616-1368, 617-1368, 618-1368, 619-1368, 620-1368, 621-1368, 622-1368, 623-1368, 624-1368, 625-1368, 626-1368, 627-1368, 628-1368, 629-1368, 630-1368, 631-1368, 632-1368, 633-1368, 634-1368, 635-1368, 636-1368, 637-1368, 638-1368, 639-1368, 640-1368, 641-1368, 642-1368, 643-1368, 644-1368, 645-1368, 646-1368, 647-1368, 648-1368, 649-1368, 650-1368, 또는 651-1368 중 임의의 하나의 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스플릿 Cas9 단백질의 C-말단 부분은 SpCas9의 아미노산 574-1368 또는 638-1368의 일부를 포함한다.
"대상체"란 비인간 영장류(원숭이), 소, 말, 개, 양, 또는 고양이와 같은 인간 또는 비인간 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물을 의미한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 대상체는 폴리뉴클레오티드 서열에 병원성 돌연변이를 포함한다.
"실질적으로 동일한"이란 참조 아미노산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나) 또는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열 중 임의의 하나)에 대해 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 일 구현예에서, 이러한 서열은 아미노산 수준 또는 핵산에서 비교를 위해 사용되는 서열과 적어도 60%, 80% 또는 85%, 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.
서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, Genetics Computer Group의 Sequence Analysis Software Package, 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 위스콘신 대학 생물공학 센터 소재, BLAST, BESTFIT, COBALT, EMBOSS Needle, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 대한 상동성 정도를 할당함으로써 동일하거나 또는 유사한 서열을 일치시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 기 내에서 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, 밀접하게 관련된 서열을 나타내는 e-3 및 e-100 사이의 확률 점수와 함께 BLAST 프로그램이 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 매개변수와 함께 COBALT가 사용된다:
a) 정렬 매개변수: Gap 패널티-11,-1 및 End-Gap 패널티-5,-1,
b) CDD 매개변수: RPS BLAST 사용; 블라스트 E-값 0.003; 보존된 열 발견 및 재계산, 및
c) 쿼리 클러스터링 매개변수: 쿼리 클러스터 사용; 글자 크기 4; 최대 클러스터 거리 0.8; 알파벳 규칙.
예를 들어, 다음 매개변수와 함께 EMBOSS Needle이 사용된다:
a) 매트릭스: BLOSUM62;
b) GAP 개방: 10;
c) GAP 확장: 0.5;
d) 출력 형식: 쌍;
e) END GAP 패널티: 거짓;
f) END GAP 개방: 10; 및
g) END GAP 확장: 0.5.
용어 "표적 부위"는 데아미나제(예를 들어, 사이티딘 또는 아데닌 데아미나제) 또는 데아미나제를 포함하는 융합 단백질(예를 들어, dCas9-아데노신 데아미나제 융합 단백질 또는 본원에 개시된 염기 편집기)에 의해 탈아미노화된 핵산 분자 를 내의 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", 치료하는", "치료" 등은 장애 및/또는 이와 연관된 증상을 감소시키거나 또는 개선하거나 또는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것은 장애, 병태 또는 이와 연관된 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하지 않는 것으로 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 효과는 치료적이며, 즉, 제한 없이, 효과는 질환 및/또는 질환에 기인하는 유해 증상의 강도, 또는 치료를 부분적으로 또는 완전히 축소, 경감, 폐지, 약화, 개선, 감소시킨다. 일부 구현예에서, 효과는 예방적이며, 즉 효과는 질환 또는 병태의 발생 또는 재발을 보호 또는 방지한다. 이를 위해, 현재 개시된 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
"우라실 글리코실라제 억제제" 또는 "UGI"란 우라실-절제 복구 시스템을 억제하는 제제를 의미한다. 일 구현예에서, 제제는 숙주 우라실-DNA 글리코실라제에 결합하고 DNA로부터 우라실 잔기의 제거를 방지하는 단백질 또는 이의 단편이다. 구현예에서, UGI는 우라실-DNA 글리코실라제 염기-절제 복구 효소를 억제할 수 있는 단백질, 이의 단편, 또는 도메인이다. 일부 구현예에서, UGI 도메인은 야생형 UGI 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 일부 구현예에서, UGI 도메인은 하기 제시된 예시적인 아미노산 서열의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, UGI 단편은 하기 제공된 예시적인 UGI 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, UGI는 하기 제시된 바와 같이, 예시적인 UGI 아미노산 서열 또는 이의 단편에 대해 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, UGI, 또는 이의 일부는 하기 제시된 바와 같이, 야생형 UGI 또는 UGI 서열, 또는 이의 부분과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 동일하다. 예시적인 UGI는 하기와 같은 아미노산 서열을 포함한다:
>splP14739IUNGI_BPPB2 우라실-DNA 글리코실라제 억제제
본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군의 임의의 숫자, 숫자의 조합, 또는 하위범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 화학 기의 목록의 인용은 해당 변수를 임의의 단일 기 또는 나열된 기의 조합으로 정의하는 것을 포함한다. 본원의 변수 또는 측면에 대한 구현예의 언급은 해당 구현예를 임의의 단일 구현예로 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 부분과 조합하여 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에 제공된 임의의 다른 조성물 및 방법 중 하나 이상과 조합될 수 있다.
본원의 설명 및 실시예는 본 개시내용의 구현예를 상세하게 예시한다. 이 개시내용은 본원에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않고 이와 같이 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 당업자는 본 개시내용의 다양한 변경 및 변형이 있으며, 범위 내에 포함된다는 것을 인식할 것이다.
모든 용어는 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이 이해되도록 의도된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자에 의해 공통으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 개시된 일부 구현예의 실행은 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 게놈 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 이용한다. 예를 들어 Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012); the series Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, 등 eds.); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R.I. Freshney, ed. (2010))을 참조한다.
본 개시내용의 다양한 특징이 단일 구현예의 맥락에서 기재될 수 있지만, 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공될 수 있다. 반대로, 본 개시내용은 명료성을 위해 별도의 구현예의 맥락에서 본원에 기재될 수 있지만, 본 개시내용은 또한 단일 구현예로 구현될 수 있다. 본원에 사용되는 섹션 제목은 구성 목적으로만 해석되고 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시내용의 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 개시내용의 원리가 활용되는 예시적 구현예를 제시하는 하기 상세한 설명을 참조하고, 이하에서 설명되는 첨부 도면을 고려하여 수득될 것이다.
도 1은 지정된 아데노신 염기 편집기에 대한 퍼센트 A>G 편집 활성을 나타내는 일련의 그래프를 제시한다. 각각의 편집기는 숫자로 지칭되며, 여기서 예를 들어, 433은 ABE8.32인 pNMG-B433을 나타낸다. 그래프에 참조된 각각의 편집기를 gRNA HRB03, HRB04, HRB08, HRB12, 및 ng-424 각각으로 테스트하였다. gRNA 서열은 실시예 3에 제공되어 있다.
도 2는 표 14에 기재된 바와 같은 지정된 아데노신 염기 편집기(ABE8 및 ABE9)에 대한 퍼센트 A>G 편집 활성을 회색 음영으로 도시한 히트 맵을 제공한다. 도면에 나열된 각각의 편집기를 상이한 gRNA, HRB03, HRB04, HRB08, HRB12, 및 ng-424로 테스트하였다.
도 3a-3c는 본원에 기재된 아데노신 염기 편집기의 TadA 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*9; ABE9) 및 Cas9(예를 들어, SpCas9) 변이체 구성성분을 나타내는 표를 제공한다. 이러한 ABE9 염기 편집기는 A>G 편집 활성을 가지며 SERPINA1 유전자에서의 PiZ 돌연변이와 같은 알파-1 항트립신 질환(A1AD)과 연관된 SNP 돌연변이를 교정하는 데 유용하다. 일부 경우에, SpCas9 변이체는 5'-NGC-3' PAM에 대한 특이성을 갖는다. 도 3a는 아데노신 염기 편집기를 플라스미드 번호로 지칭한다. 도 3b 및 3c는 Tad*7.10 아미노산 서열에 포함된 다양한 TadA 데아미나제 변이체 및 아미노산 돌연변이, 뿐만 아니라 PAM 변이체 및 이들에 포함된 아미노산 돌연변이를 제시한다.
도 4a-4d는 염기 편집기 조작을 통한 개선된 핵염기 교정 속도의 생성과 관련된 핵산 서열, 표 및 그래프를 제시한다. 도 4a 및 4b는 도 4c 및 4d에 기재된 바와 같은 염기 편집기 조작을 통한 1차 PiZZ 섬유모세포에서의 개선된 핵염기 교정 속도의 생성과 관련되고 하기 도 5a 및 5b에 기재된 바와 같은 NSG-PiZ 유전자이식 마우스에서 지질 나노입자(LNP)-매개 전달 및 염기 편집에 의해 생성된 혈청 알파-1 항트립신(A1AT) 증가와 관련된 핵산 서열 및 표를 제시한다. 특히, 도 4a는 A1AD와 연관된 PiZZ 돌연변이를 암호화하는 표적 부위(표적 DNA 서열의 위치 7에서 A)를 포함한 표적 DNA 서열을 나타낸다. 이 서열은 20 개의 뉴클레오티드 프로토스페이서 및 비표준 spCas9 NGC PAM을 포함한다. 또한 위치 A7 = 야생형(WT)에서 유익한 편집 및 위치 A5 및 A7 = WT + D341G에서 편집이 제시된다. 도 4b는 PiZ 돌연변이를 교정하기 위해 사용된 다양한 염기 편집기의 TadA 데아미나제 변이체 및 Cas9 PAM 변이체 구성요소를 설명하는 표를 제시한다. 표는 도 4c, 4d, 5a 및 5b에 제공된 결과를 수득하기 위해 사용된 바와 같은 변이체(예를 들어, 변이체(Vars) 1-9)를 나타낸다. 표에서, SpCas9의 아미노산 돌연변이(SpCas9 변이체)는 표의 가장 오른쪽 열에 도시된다(PAM 변이체). "RVRFRAR" SpCas9 변이체는 다음 돌연변이를 포함한다: L1111R + D1135V + G1218R + E1219F + A1322R + R1335A + T1337R. 도 4c 및 4d는 Neon 전기천공 시스템을 사용하여 염기 편집 시약으로 형질감염된 환자-유래 PiZZ 섬유모세포(GM11423 Corriel Biorepository)에서 관찰된 편집 속도를 도시하는 막대 그래프를 제시한다. 각각의 처리는 70,000 개의 섬유모세포를 함유하는 전기천공 완충액 10μl, 염기 편집기를 암호화하는 mRNA 100ng 및 및 알파-1 교정 gRNA 50ng으로 이루어진다. 48 시간 회복 후, 세포를 용해시키고, 관심 유전자좌의 정보를 표적화된 앰플리콘 서열분석에 의해 얻었다. 데이터를 2 가지 독립적인 실험으로부터 수득하였다. 이들 데이터 및 결과는 NGC PAM 인식의 최적화(변이체 1-3, 도 4b 및 4c) 및 TadA 데아미나제, 예를 들어, ABE9에서 돌연변이의 혼입을 통한 TadA 데아미나제의 최적화(변이체 4-9, 도 4b-4d) 둘 다로부터 표적 염기 편집 효율의 개선을 입증한다.
도 5a 및 5b는 NSG-PiZ 유전자이식 마우스에서 지질 나노입자(LNP)-매개 전달 및 염기 편집에 의해 생성된 혈청 A1AT의 증가와 관련된 그래프를 제시한다. 표적 부위 DNA 서열 및 PiZ 돌연변이를 교정하기 위해 사용되는 다양한 편집기의 TadA 데아미나제 변이체 및 Cas9 PAM 변이체 구성요소의 표는 상기 도 4a 및 4b에 기재된 바와 같다. 도 5a는 1:1 중량비의 gRNA 및 mRNA 암호화 염기 편집기를 함유하는 1.5 mg/kg의 LNP로 처리한지 7 일 후에 NSG-PiZ 유전자이식 마우스 모델의 총 간 gDNA에서 관찰된 편집 속도를 도시하는 그래프를 제시한다. 상업적으로 이용가능한 NSG-PiZ 마우스(The Jackson Laboratory, 메인주 마운트 데저트 섬 소재)는 부분 간절제술 후에 인간 간세포에 대해 안정한 배경을 제공하는 면역결핍 NOD-SCID 감마(NSG) 배경에서 돌연변이체 인간 SERPINA1(Glu342Lys 돌연변이)을 발현한다. 결과는 ngcABEvar9(도 4b)가 앞선 버전 변이체 8보다 더 높은 편집 속도를 산출하였음을 입증한다. 도 5b는 편집 속도가 MSD 샌드위치 면역검정에 의해 측정된 바와 같이, 전처리 샘플, (채혈 전)에 비해, 혈청 알파-1 항트립신(A1AT), (채혈 후)에서의 증가와 상관관계가 있다는 것을 나타내는 그래프를 제시한다. 이러한 결과에 기반하여, 본원에 기재된 TadA 데아미나제 변이체를 사용한 염기 편집은 알파-1 항트립신의 결핍 및 이의 잠재적인 폐 후유증을 설명할 수 있다.
도 2는 표 14에 기재된 바와 같은 지정된 아데노신 염기 편집기(ABE8 및 ABE9)에 대한 퍼센트 A>G 편집 활성을 회색 음영으로 도시한 히트 맵을 제공한다. 도면에 나열된 각각의 편집기를 상이한 gRNA, HRB03, HRB04, HRB08, HRB12, 및 ng-424로 테스트하였다.
도 3a-3c는 본원에 기재된 아데노신 염기 편집기의 TadA 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*9; ABE9) 및 Cas9(예를 들어, SpCas9) 변이체 구성성분을 나타내는 표를 제공한다. 이러한 ABE9 염기 편집기는 A>G 편집 활성을 가지며 SERPINA1 유전자에서의 PiZ 돌연변이와 같은 알파-1 항트립신 질환(A1AD)과 연관된 SNP 돌연변이를 교정하는 데 유용하다. 일부 경우에, SpCas9 변이체는 5'-NGC-3' PAM에 대한 특이성을 갖는다. 도 3a는 아데노신 염기 편집기를 플라스미드 번호로 지칭한다. 도 3b 및 3c는 Tad*7.10 아미노산 서열에 포함된 다양한 TadA 데아미나제 변이체 및 아미노산 돌연변이, 뿐만 아니라 PAM 변이체 및 이들에 포함된 아미노산 돌연변이를 제시한다.
도 4a-4d는 염기 편집기 조작을 통한 개선된 핵염기 교정 속도의 생성과 관련된 핵산 서열, 표 및 그래프를 제시한다. 도 4a 및 4b는 도 4c 및 4d에 기재된 바와 같은 염기 편집기 조작을 통한 1차 PiZZ 섬유모세포에서의 개선된 핵염기 교정 속도의 생성과 관련되고 하기 도 5a 및 5b에 기재된 바와 같은 NSG-PiZ 유전자이식 마우스에서 지질 나노입자(LNP)-매개 전달 및 염기 편집에 의해 생성된 혈청 알파-1 항트립신(A1AT) 증가와 관련된 핵산 서열 및 표를 제시한다. 특히, 도 4a는 A1AD와 연관된 PiZZ 돌연변이를 암호화하는 표적 부위(표적 DNA 서열의 위치 7에서 A)를 포함한 표적 DNA 서열을 나타낸다. 이 서열은 20 개의 뉴클레오티드 프로토스페이서 및 비표준 spCas9 NGC PAM을 포함한다. 또한 위치 A7 = 야생형(WT)에서 유익한 편집 및 위치 A5 및 A7 = WT + D341G에서 편집이 제시된다. 도 4b는 PiZ 돌연변이를 교정하기 위해 사용된 다양한 염기 편집기의 TadA 데아미나제 변이체 및 Cas9 PAM 변이체 구성요소를 설명하는 표를 제시한다. 표는 도 4c, 4d, 5a 및 5b에 제공된 결과를 수득하기 위해 사용된 바와 같은 변이체(예를 들어, 변이체(Vars) 1-9)를 나타낸다. 표에서, SpCas9의 아미노산 돌연변이(SpCas9 변이체)는 표의 가장 오른쪽 열에 도시된다(PAM 변이체). "RVRFRAR" SpCas9 변이체는 다음 돌연변이를 포함한다: L1111R + D1135V + G1218R + E1219F + A1322R + R1335A + T1337R. 도 4c 및 4d는 Neon 전기천공 시스템을 사용하여 염기 편집 시약으로 형질감염된 환자-유래 PiZZ 섬유모세포(GM11423 Corriel Biorepository)에서 관찰된 편집 속도를 도시하는 막대 그래프를 제시한다. 각각의 처리는 70,000 개의 섬유모세포를 함유하는 전기천공 완충액 10μl, 염기 편집기를 암호화하는 mRNA 100ng 및 및 알파-1 교정 gRNA 50ng으로 이루어진다. 48 시간 회복 후, 세포를 용해시키고, 관심 유전자좌의 정보를 표적화된 앰플리콘 서열분석에 의해 얻었다. 데이터를 2 가지 독립적인 실험으로부터 수득하였다. 이들 데이터 및 결과는 NGC PAM 인식의 최적화(변이체 1-3, 도 4b 및 4c) 및 TadA 데아미나제, 예를 들어, ABE9에서 돌연변이의 혼입을 통한 TadA 데아미나제의 최적화(변이체 4-9, 도 4b-4d) 둘 다로부터 표적 염기 편집 효율의 개선을 입증한다.
도 5a 및 5b는 NSG-PiZ 유전자이식 마우스에서 지질 나노입자(LNP)-매개 전달 및 염기 편집에 의해 생성된 혈청 A1AT의 증가와 관련된 그래프를 제시한다. 표적 부위 DNA 서열 및 PiZ 돌연변이를 교정하기 위해 사용되는 다양한 편집기의 TadA 데아미나제 변이체 및 Cas9 PAM 변이체 구성요소의 표는 상기 도 4a 및 4b에 기재된 바와 같다. 도 5a는 1:1 중량비의 gRNA 및 mRNA 암호화 염기 편집기를 함유하는 1.5 mg/kg의 LNP로 처리한지 7 일 후에 NSG-PiZ 유전자이식 마우스 모델의 총 간 gDNA에서 관찰된 편집 속도를 도시하는 그래프를 제시한다. 상업적으로 이용가능한 NSG-PiZ 마우스(The Jackson Laboratory, 메인주 마운트 데저트 섬 소재)는 부분 간절제술 후에 인간 간세포에 대해 안정한 배경을 제공하는 면역결핍 NOD-SCID 감마(NSG) 배경에서 돌연변이체 인간 SERPINA1(Glu342Lys 돌연변이)을 발현한다. 결과는 ngcABEvar9(도 4b)가 앞선 버전 변이체 8보다 더 높은 편집 속도를 산출하였음을 입증한다. 도 5b는 편집 속도가 MSD 샌드위치 면역검정에 의해 측정된 바와 같이, 전처리 샘플, (채혈 전)에 비해, 혈청 알파-1 항트립신(A1AT), (채혈 후)에서의 증가와 상관관계가 있다는 것을 나타내는 그래프를 제시한다. 이러한 결과에 기반하여, 본원에 기재된 TadA 데아미나제 변이체를 사용한 염기 편집은 알파-1 항트립신의 결핍 및 이의 잠재적인 폐 후유증을 설명할 수 있다.
본 발명은 신규 아데닌 염기 편집기(예를 들어, ABE9) 및 표적 서열을 편집하기 위한 이러한 아데노신 데아미나제 변이체의 사용 방법을 특징으로 한다.
핵염기
편집기
본원에는 폴리뉴클레오티드의 표적 뉴클레오티드 서열을 편집하거나, 변형시키거나 또는 변경하기 위한 신규 염기 편집기(예를 들어, ABE8 및 ABE9) 또는 핵염기 편집기가 개시되어 있다. 특히, 신규 ABE9 염기 편집기 및 이의 구성성분은 하기 표 14 및 18에 기재되어 있다. 본원에는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나제)을 포함하는 핵염기 편집기 또는 염기 편집기가 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 결합된 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)와 함께일 때 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하여(즉, 결합된 가이드 핵산의 염기 및 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 염기 사이의 상보적 염기 쌍형성을 통해) 편집되기를 원하는 표적 핵산 서열에 염기 편집기를 국소화할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 단일-가닥 DNA 또는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA-RNA 하이브리드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드
프로그램가능한
뉴클레오티드 결합 도메인
폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 또한 RNA에 결합하는 핵산 프로그램가능한 단백질을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 RNA에 가이드하는 핵산과 회합될 수 있다. 다른 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은 또한 본 개시내용의 범위 내에 있지만, 본 개시내용에 구체적으로 나열되지는 않는다.
염기 편집기의 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 그 자체로 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 하나 이상의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있다. 본원에서 용어 "엑소뉴클레아제"는 자유 단부로부터 핵산(예를 들어, RNA 또는 DNA)을 소화할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭하고, 용어 "엔도뉴클레아제"는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 내부 영역을 촉매(예를 들어, 절단)할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 핵산의 단일 가닥을 절단할 수 있다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 핵산 분자의 두 가닥을 절단할 수 있다. 일부 구현예에서 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 데옥시리보뉴클레아제일 수 있다. 일부 구현예에서 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 리보뉴클레아제일 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 뉴클레아제 도메인은 표적 폴리뉴클레오티드의 0, 1, 또는 2 개의 가닥을 절단할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 닉카제 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 용어 "닉카제"는 이중체화 핵산 분자(예를 들어, DNA)에서 2 개의 가닥 중 1 개의 가닥만을 절단할 수 있는 뉴클레아제 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 지칭한다. 일부 구현예에서, 닉카제는 하나 이상의 돌연변이를 활성 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 내로 도입함으로써 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 완전히 촉매적으로 활성(예를 들어, 천연) 형태로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인이 Cas9로부터 유래된 닉카제 도메인을 포함하는 경우, Cas9-유래 닉카제 도메인은 D10A 돌연변이 및 위치 840에 히스티딘을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 잔기 H840은 촉매 활성을 유지하여 핵산 이중체의 단일 가닥을 절단할 수 있다. 또 다른 예에서, Cas9-유래 닉카제 도메인은 H840A 돌연변이를 포함할 수 있는 반면, 위치 10에서 아미노산 잔기는 D를 유지한다. 일부 구현예에서, 닉카제는 닉카제 활성에 필요하지 않은 뉴클레아제 도메인의 전부 또는 일부를 제거함으로써 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 완전히 촉매적으로 활성(예를 들어, 천연) 형태로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인이 Cas9로부터 유래된 닉카제 도메인을 포함하는 경우, Cas9-유래 닉카제 도메인은 RuvC 도메인 또는 HNH 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 포함할 수 있다.
예시적인 촉매적으로 활성 Cas9의 아미노산 서열은 하기와 같다:
따라서 닉카제 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기는 특이적 폴리뉴클레오티드 표적 서열(예를 들어, 결합된 가이드 핵산의 상보적 서열에 의해 결정됨)에서 단일-가닥 DNA 파괴(닉)를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 닉카제 도메인(예를 들어, Cas9-유래 닉카제 도메인)을 포함하는 염기 편집기에 의해 절단되는 핵산 이중체 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 가닥은 염기 편집기에 의해 편집되지 않는 가닥이다(즉, 염기 편집기에 의해 절단되는 가닥은 편집될 염기를 포함하는 가닥과 반대이다). 다른 구현예에서, 닉카제 도메인(예를 들어, Cas9-유래 닉카제 도메인)을 포함하는 염기 편집기는 편집을 위해 표적화되는 DNA 분자의 가닥을 절단할 수 있다. 이러한 경우에, 비-표적화된 가닥은 절단되지 않는다.
또한 본원에는 촉매적으로 사멸된(즉, 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 절단할 수 없는) 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기가 제공된다. 본원에서 용어 "촉매적으로 사멸된" 및 "뉴클레아제 사멸된"은 핵산의 가닥을 절단할 수 없는 능력을 초래하는 하나 이상의 돌연변이 및/또는 결실을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 사멸된 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 염기 편집기는 하나 이상의 뉴클레아제 도메인에서 특이적 점 돌연변이의 결과로서 뉴클레아제 활성이 결여될 수 있다. 예를 들어, Cas9 도메인을 포함하는 염기 편집기의 경우, Cas9는 D10A 돌연변이 및 H840A 돌연변이 둘 다를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 두 뉴클레아제 도메인을 불활성화하여, 뉴클레아제 활성의 손실을 초래한다. 다른 구현예에서, 촉매적으로 사멸된 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 촉매 도메인(예를 들어, RuvC1 및/또는 HNH 도메인)의 전부 또는 일부의 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 촉매적으로 사멸된 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 점 돌연변이(예를 들어, D10A 또는 H840A) 뿐만 아니라 뉴클레아제 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 포함한다.
또한 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 이전 기능적 버전으로부터 촉매적으로 사멸된 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 생성할 수 있는 돌연변이가 본원에서 고려된다. 예를 들어, 촉매적으로 사멸된 Cas9("dCas9")의 경우, D10A 및 H840A 이외의 돌연변이를 갖는 변이체가 제공되며, 이는 뉴클레아제 불활성화 Cas9를 초래한다. 이러한 돌연변이는 예로서, D10 및 H840에서 다른 아미노산 치환, 또는 Cas9의 뉴클레아제 도메인 내에서 다른 치환(예를 들어, HNH 뉴클레아제 하위도메인 및/또는 RuvC1 하위도메인에서 치환)을 포함한다. 추가적인 적합한 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본 개시내용 및 당해 분야의 지식에 기초하여 당업자에게 명백할 수 있으며, 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이러한 추가적인 예시적인 적합한 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 D10A/H840A, D10A/D839A/H840A, 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이체 도메인을 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Prashant 등, CAS9 transcriptional activators for target specificity creening and paired nickasess for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
염기 편집기 내로 혼입될 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 비제한적인 예는 CRISPR 단백질-유래 도메인, 제한 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, TAL 뉴클레아제(TALEN), 및 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함한다. 일부 경우에, 염기 편집기는 결합된 가이드 핵산을 통해 핵산의 CRISPR(즉, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부)-매개 변형 동안 핵산 서열에 결합할 수 있는 천연 또는 변형된 단백질 또는 이의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함한다. 이러한 단백질은 본원에서 "CRISPR 단백질"로 지칭된다. 따라서, 본원에는 CRISPR 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기(즉, 염기 편집기의 "CRISPR 단백질-유래 도메인"으로도 지칭되는 CRISPR 단백질의 전부 또는 일부를 도메인으로 포함하는 염기 편집기)가 개시되어 있다. 염기 편집기 내로 혼입된 CRISPR 단백질-유래 도메인은 CRISPR 단백질의 야생형 또는 천연 버전과 비교하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 하기 기재된 바와 같이 CRISPR 단백질-유래 도메인은 CRISPR 단백질의 야생형 또는 천연 버전에 비해 하나 이상의 돌연변이, 삽입, 결실, 재배열 및/또는 재조합을 포함할 수 있다.
CRISPR은 이동성 유전 요소(바이러스, 전이성 요소 및 접합성 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응 면역 시스템이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동성 요소에 상보적인 서열, 및 표적 침입 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA(crRNA) 내로 전사되고 처리된다. 유형 II CRISPR 시스템에서, 프리-crRNA의 정확한 처리는 트랜스-암호화된 작은 RNA(tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3(rnc) 및 Cas9 단백질을 필요로 한다. tracrRNA는 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 3-지원 처리를 위한 가이드로서 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 엔도뉴클레오적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 엔도뉴클레오적으로 절단된 다음, 3'-5' 엑소뉴클레오적으로 다듬어진다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 두 RNA를 필요로 한다. 그러나, 단일 가이드 RNA("sgRNA", 또는 간단히 "gNRA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종 내로 통합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 CRISPR 반복 서열에서 짧은 모티프(PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식하여 자기-대-비자기를 구별하는 데 도움이 된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 조작된 Cas 단백질을 활용할 수 있다. 가이드 RNA(gRNA)는 Cas-결합에 필요한 스캐폴드 서열 및 변형될 게놈(또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA) 표적을 정의하는 사용자-정의된 ∼20 개의 뉴클레오티드 스페이서로 구성된 짧은 합성 RNA이다. 따라서, 당업자는 gRNA에 존재하는 표적 서열을 변경함으로써 Cas 단백질의 게놈 또는 폴리뉴클레오티드 표적을 변경할 수 있다. Cas 단백질의 특이성은 gRNA 표적화 서열이 게놈의 나머지과 비교하여 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 서열에 대해 얼마나 특이적인지에 의해 부분적으로 결정된다. 구현예에서, Cas 단백질은 SpCas9이다.
일부 구현예에서, gRNA 스캐폴드 서열은 하기와 같다:
일부 구현예에서, gRNA 스캐폴드 서열은 하기와 같다:
일 구현예에서, 상기 gRNA 스캐폴드의 말단 우라실(U)은 임의적으로 "mU*mU*mU*U"를 포함할 수 있으며, 이는 2'OMe를 나타내고 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.
구현예에서, RNA 스캐폴드는 줄기 루프를 포함한다. 구현예에서, RNA 스캐폴드는 하기 핵산 서열을 포함한다:
구현예에서, 에스. 피로게네스(S. pyrogenes) sgRNA 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
구현예에서, 에스. 아우레우스 sgRNA 스캐폴드 폴리뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
구현예에서, BhCas12b sgRNA 스캐폴드는 하기 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다:
구현예에서, BvCas12b sgRNA 스캐폴드는 하기 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다:
일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 CRISPR 단백질-유래 도메인은 결합된 가이드 핵산과 함께일 때 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는 엔도뉴클레아제(예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제 또는 리보뉴클레아제)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 CRISPR 단백질-유래 도메인은 결합된 가이드 핵산과 함께일 때 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는 닉카제이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 CRISPR 단백질-유래 도메인은 결합된 가이드 핵산과 함께일 때 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는 촉매적으로 사멸된 도메인이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 CRISPR 단백질 유래 도메인에 의해 결합된 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 CRISPR 단백질-유래 도메인에 의해 결합된 표적 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
본원에 사용될 수 있는 Cas 단백질은 클래스 1 및 클래스 2를 포함한다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 또는 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 및 Cas12j/CasΦ, CARF, DinG, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 변형되지 않은 CRISPR 효소는 2 개의 기능적 엔도뉴클레아제 도메인: RuvC 및 HNH를 갖는 Cas9와 같은 DNA 절단 활성을 가질 수 있다. CRISPR 효소는 표적 서열 내에서 및/또는 표적 서열의 보체 내에서와 같은 표적 서열에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소는 표적 서열의 첫번째 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 개 이상의 염기 쌍 내에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 지시할 수 있다.
돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 뉴클레오티드의 하나 또는 두 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화하는 벡터가 사용될 수 있다. Cas9는 야생형 예시적인 Cas9 폴리펩티드(예를 들어, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9)에 대해 적어도 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. Cas9는 야생형 예시적인 Cas9 폴리펩티드(예를 들어, 에스. 피오게네스로부터 유래)에 대해 최대 또는 최대 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. Cas9는 결실, 삽입, 치환, 변이체, 돌연변이, 융합, 키메라, 또는 이의 임의의 조합과 같은 아미노산 변화를 포함할 수 있는 Cas9 단백질의 야생형 또는 변형된 형태를 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기의 CRISPR 단백질-유래 도메인은 코리네박테리움 울세란스(Corynebacterium ulcerans)(NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)(NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라(Spiroplasma syrphidicola)(NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 인테르메디아(Prevotella intermedia)(NCBI Ref: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와넨세(Spiroplasma taiwanense)(NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코쿠스 이니에(Streptococcus iniae)(NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카(Belliella baltica)(NCBI Ref: NC_018010.1); 사이크로플렉수스 토르퀴스(Psychroflexus torquis)(NCBI Ref: NC_018721.1); 스트렙토코쿠스 써모필루스(NCBI Ref: YP_820832.1); 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)(NCBI Ref: NP_472073.1); 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)(NCBI Ref: YP_002344900.1); 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)(NCBI Ref: YP_002342100.1), 스트렙토코쿠스 피오게네스, 또는 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
핵염기
편집기의
Cas9
도메인
Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, "Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E. 등, Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M. 등, Science 337:816-821(2012)을 참조하며, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다). Cas9 오솔로그는 에스. 피오게네스 및 에스. 써모필루스(S. thermophilus)를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 종에 기재되었다. 추가적인 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이며, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함하며; 상기 문헌의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
일부 측면에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)은 Cas9 도메인이다. 비제한적인 예시적인 Cas9 도메인이 본원에 제공된다. Cas9 도메인은 뉴클레아제 활성 Cas9 도메인, 뉴클레아제 불활성 Cas9 도메인, 또는 Cas9 닉카제일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 뉴클레아제 활성 도메인이다. 예를 들어, Cas9 도메인은 이중체화 핵산의 두 가닥(예를 들어, 이중체화 DNA 분자의 두 가닥)을 절단하는 Cas9 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 구현예에서 Cas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 적어도 10 개, 적어도 15 개, 적어도 20 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 적어도 100 개, 적어도 150 개, 적어도 200 개, 적어도 250 개, 적어도 300 개, 적어도 350 개, 적어도 400 개, 적어도 500 개, 적어도 600 개, 적어도 700 개, 적어도 800 개, 적어도 900 개, 적어도 1000 개, 적어도 1100 개, 또는 적어도 1200 개의 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas9의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질은 다음의 2 개의 Cas9 도메인: (1) Cas9의 gRNA 결합 도메인; 또는 (2) Cas9의 DNA 절단 도메인 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 또는 이의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로 지칭된다. Cas9 변이체는 Cas9, 또는 이의 단편에 대한 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 이상의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체는 Cas9의 단편(예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하여, 단편이 야생형 Cas9의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하게 한다. 일부 구현예에서, 단편은 상응하는 야생형 Cas9의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다. 일부 구현예에서, 단편은 적어도 100 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 단편은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250 개, 또는 적어도 1300 개의 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 융합 단백질은 Cas9 단백질의 전장 아미노산 서열, 예를 들어, 본원에 제공된 Cas9 서열 중 하나를 포함한다. 그러나, 다른 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질은 전장 Cas9 서열을 포함하지 않지만, 하나 이상의 이의 단편만을 포함한다. 적합한 Cas9 도메인 및 Cas9 단편의 예시적인 아미노산 서열이 본원에 제공되고, Cas9 도메인 및 단편의 추가적인 적합한 서열은 당업자에게 명백할 것이다.
Cas9 단백질은 가이드 RNA에 상보적인 특이적 DNA 서열에 Cas9 단백질을 가이드하는 가이드 RNA와 회합될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 Cas9 도메인, 예를 들어 뉴클레아제 활성 Cas9, Cas9 닉카제(nCas9), 또는 뉴클레아제 불활성 Cas9(dCas9)이다. 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질의 예는 Cas9(예를 들어, dCas9 및 nCas9), Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 및 Cas12j/CasΦ를 포함하나 이에 제한되지 않는다. Cas 효소의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12로도 알려짐), Cas10, Cas10d, Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j/CasΦ, Csy1 , Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csx11, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, 유형 II Cas 효과기 단백질, 유형 V Cas 효과기 단백질, 유형 VI Cas 효과기 단백질, CARF, DinG, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 또는 조작된 버전을 포함한다.
일부 구현예에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스(NCBI 참조 서열: NC_017053.1, 하기와 같은 뉴클레오티드 및 아미노산 서열)로부터의 Cas9에 상응한다:
(단일 밑줄: HNH 도메인; 이중 밑줄: RuvC 도메인)
일부 구현예에서, 야생형 Cas9는 하기 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열에 상응하거나, 또는 포함한다:
(단일 밑줄: HNH 도메인; 이중 밑줄: RuvC 도메인).
일부 구현예에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스(NCBI 참조 서열: NC_002737.2(하기와 같은 뉴클레오티드 서열); 및 Uniprot 참조 서열: Q99ZW2 (하기와 같은 아미노산 서열)로부터의 Cas9에 상응한다:
일부 구현예에서, Cas9는 코리네박테리움 울세란스(NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아(NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라(NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 인테르메디아(NCBI Ref: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와넨세(NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코쿠스 이니에(NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카(NCBI Ref: NC_018010.1); 사이크로플렉수스 토르퀴스I(NCBI Ref: NC_018721.1); 스트렙토코쿠스 써모필루스(NCBI Ref: YP_820832.1), 리스테리아 이노쿠아(NCBI Ref: NP_472073.1), 캄필로박터 제주니(NCBI Ref: YP_002344900.1) 또는 네이세리아 메닝기티디스(NCBI Ref: YP_002342100.1)로부터의 Cas9 또는 임의의 다른 유기체로부터의 Cas9를 지칭한다.
이의 변이체 및 상동체를 포함한 추가적인 Cas9 단백질(예를 들어, 뉴클레아제 사멸된 Cas9(dCas9), Cas9 닉카제(nCas9), 또는 뉴클레아제 활성 Cas9)은 본 개시내용의 범위 내에 있음이 이해되어야 한다. 예시적인 Cas9 단백질은 하기 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 뉴클레아제 사멸된 Cas9(dCas9)이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 Cas9 닉카제(nCas9)이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 뉴클레아제 활성 Cas9이다.
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인(dCas9)이다. 예를 들어, dCas9 도메인은 이중체화 핵산 분자의 어느 한쪽 가닥을 절단하지 않으면서 이중체화 핵산 분자에 결합할 수 있다(예를 들어, gRNA 분자를 통해). 일부 구현예에서, 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열의 D10X 돌연변이 및 H840X 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산 변화이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열의 D10A 돌연변이 및 H840A 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일 예로서, 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 클로닝 벡터 pPlatTET-gRNA2(수탁 번호 BAV54124)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 촉매적으로 불활성 Cas9(dCas9)의 아미노산 서열은 다음과 같다:
(예를 들어, Qi 등, "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression." Cell. 2013; 152(5):1173-83을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
추가의 적합한 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본 개시내용 및 당해 분야의 지식에 기반하여 당업자에게 명백할 것이고, 본 개시내용이 범위 내에 있다. 이러한 추가의 예시적인 적합한 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 D10A/H840A, D10A/D839A/H840A, 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이체 도메인을 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Prashant 등, CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838 참조, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 불활성(예를 들어, 불활성화) DNA 절단 도메인을 가지며, 즉, Cas9는 "nCas9" 단백질("닉카제" Cas9의 경우)로 지칭되는 닉카제이다. 뉴클레아제-불활성화 Cas9 단백질은 "dCas9" 단백질(뉴클레아제-"사멸된" Cas9의 경우) 또는 촉매적으로 불활성 Cas9로 상호교환가능하게 지칭될 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 단백질(또는 이의 단편)을 생성하기 위한 방법이 알려져 있다(예를 들어, Jinek 등, Science. 337:816-821(2012); Qi 등, "Repurposing CRISPR as an RNA-guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28;152(5):1173-83을 참조하며, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다). 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 2 개의 하위도메인인 HNH 뉴클레아제 하위도메인 및 RuvC1 하위도메인을 포함하는 것으로 알려져 있다. HNH 하위도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하는 반면, RuvC1 하위도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. 이들 하위도메인 내에서 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 침묵시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 D10A 및 H840A는 에스. 피오게네스 Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킨다(Jinek 등, Science. 337:816-821(2012); Qi 등, Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)).
일부 구현예에서, dCas9 도메인은 본원에 제공된 dCas9 도메인 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 이상 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 적어도 10 개, 적어도 15 개, 적어도 20 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 적어도 100 개, 적어도 150 개, 적어도 200 개, 적어도 250 개, 적어도 300 개, 적어도 350 개, 적어도 400 개, 적어도 500 개, 적어도 600 개, 적어도 700 개, 적어도 800 개, 적어도 900 개, 적어도 1000 개, 적어도 1100 개, 또는 적어도 1200 개의 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, dCas9는 Cas9 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 Cas9 아미노산 서열에 상응하거나, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열의 D10X 돌연변이 및 H840X 돌연변이, 또는 본원에 제공된 아미노산 서열 중 임의의 것의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산 변화이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열의 D10A 돌연변이 및 H840A 돌연변이, 또는 본원에 제공된 아미노산 서열 중 임의의 것의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 클로닝 벡터 pPlatTET-gRNA2(수탁 번호 BAV54124)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, dCas9는 dCas9(D10A 및 H840A)의 아미노산 서열을 포함한다:
일부 구현예에서, 예시적인 촉매적으로 불활성 Cas9(dCas9)의 아미노산 서열을 하기와 같다:
(예를 들어, Qi 등, "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression." Cell. 2013; 152(5):1173-83 참조, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
일부 구현예에서, 예시적인 촉매적으로 불활성 Cas9(dCas9)의 아미노산 서열은 하기와 같다:
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 D10A 돌연변이를 포함하는 반면, 위치 840에서 잔기는 상기 제공된 아미노산 서열, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열의 상응하는 위치에 히스티딘이 남아있다.
다른 구현예에서, 예를 들어, 뉴클레아제 불활성화 Cas9(dCas9)를 초래하는, D10A 및 H840A 이외의 돌연변이를 갖는 dCas9 변이체가 제공된다. 이러한 돌연변이는 예로서, D10 및 H840에서 다른 아미노산 치환, 또는 Cas9의 뉴클레아제 도메인 내의 다른 치환(예를 들어, HNH 뉴클레아제 하위도메인 및/또는 RuvC1 하위도메인에서 치환)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 dCas9의 변이체 또는 상동체가 제공된다. 일부 구현예에서, 약 5 개의 아미노산, 약 10 개의 아미노산, 약 15 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 75 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산 또는 그 이상만큼 더 짧거나, 또는 더 긴 아미노산 서열을 갖는 dCas9의 변이체가 제공된다.
추가의 적합한 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본 개시내용 및 당해 분야의 지식에 기반하여 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이러한 추가의 예시적인 적합한 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 D10A/H840A, D10A/D839A/H840A, 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이체 도메인을 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Prashant 등, CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838 참조, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 Cas9 닉카제이다. Cas9 닉카제는 이중체화 핵산 분자(예를 들어, 이중체화 DNA 분자)의 하나의 가닥만을 절단할 수 있는 Cas9 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 이중체화 핵산 분자의 표적 가닥을 절단하며, 이는 Cas9 닉카제가 Cas9에 결합되어 있는 gRNA(예를 들어, sgRNA)에 염기 쌍을 이루는(상보적인) 가닥을 절단함을 의미한다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 D10A 돌연변이를 포함하고 위치 840에서 히스티딘을 갖는다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 이중체화 핵산 분자의 비-표적, 비-염기-편집된 가닥을 절단하며, 이는 Cas9 닉카제가 Cas9에 결합되어 있는 gRNA(예를 들어, sgRNA)에 염기 쌍을 이루지 않는 가닥을 절단함을 의미한다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 H840A 돌연변이를 포함하고 위치 10에서 아스파르트산 잔기, 또는 상응하는 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 본원에 제공된 Cas9 닉카제 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 추가적인 적합한 Cas9 닉카제는 본 개시내용 및 당해 분야의 지식에 기초하여 당업자에게 명백할 것이고, 본 개시내용의 범위 내에 있다.
예시적인 촉매적으로 Cas9 닉카제(nCas9)의 아미노산 서열을 하기와 같다:
일부 구현예에서, Cas9는 단일-세포 원핵생물 미생물의 도메인 및 계를 구성하는 고세균류(예를 들어, 나노고세균류)로부터의 Cas9를 지칭한다. 일부 구현예에서, 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 단백질은 CasX 또는 CasY 단백질일 수 있으며, 이는 예를 들어, Burstein 등, "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21에 기재되었으며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 게놈-분해 메타게놈을 사용하여, 생물의 고세균 도메인에서 처음으로 보고된 Cas9를 포함하여 다수의 CRISPR-Cas 시스템을 식별하였다. 이 분기 Cas9 단백질은 활성 CRISPR-Cas 시스템의 일부로서 거의 연구되지 않은 나노고세균류에서 발견되었다. 박테리아에서, 이전에 알려지지 않은 2 가지 시스템인 CRISPR-CasX 및 CRISPR-CasY가 발견되었으며, 이는 아직은 발견된 가장 컴팩트한 시스템 중 하나이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집기 시스템에서 Cas9는 CasX, 또는 CasX의 변이체로 대체된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집기 시스템에서 Cas9는 CasY, 또는 CasY의 변이체로 대체된다. 다른 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질은 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)로서 사용될 수 있고, 본 개시내용의 범위 내에 있음이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)은 CasX 또는 CasY 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 CasX 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 CasY 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 CasX 또는 CasY 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 쉽게 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 단백질은 자연 발생 CasX 또는 CasY 단백질이다. 일부 구현예에서, 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 단백질은 본원에 기재된 임의의 CasX 또는 CasY 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 쉽게 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 CasX 및 CasY는 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
예시적인 CasX((uniprot.org/uniprot/F0NN87; uniprot.org/uniprot/F0NH53) tr|F0NN87|F0NN87_SULIHCRISPR-연관Casx 단백질 OS = 술폴로부스 이슬란디쿠스(Sulfolobus islandicus)(균주 HVE10/4) GN = SiH_0402 PE=4 SV=1) 아미노산 서열은 다음과 같다:.
예시적인 CasX(>tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR 연관 단백질, Casx OS = 술폴로부스 이슬란디쿠스(균주 REY15A) GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1) 아미노산 서열은 다음과 같다:
델타프로테오박테리아 CasX
예시적인 CasY((ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1) >APG80656.1 CRISPR-연관 단백질 CasY [배양되지 않은 파르쿠박테리아 그룹 박테리아]) 아미노산 서열은 다음과 같다:
Cas9 뉴클레아제는 2 개의 기능적 엔도뉴클레아제 도메인: RuvC 및 HNH를 갖는다. Cas9는 표적 결합 시 뉴클레아제 도메인을 표적 DNA의 반대 가닥을 절단하도록 위치시키는 형태 변화를 겪는다. Cas9-매개 DNA 절단의 최종 결과는 표적 DNA 내의 이중-가닥 파괴(DSB)(PAM 서열의 상류에 있는 ~3-4 개의 뉴클레오티드)이다. 그런 다음 생성된 DSB는 2 가지 일반적인 복구 경로 중 하나에 의해 복구된다: (1) 효율적이지만 오류가 발생하기 쉬운 비-상동성 말단 연결(NHEJ) 경로; 또는 (2) 덜 효율적이지만 고충실도 상동성 지정 복구(HDR) 경로.
비-상동성 말단 연결(NHEJ) 및/또는 상동성 지정 복구(HDR)의 "효율"은 임의의 편리한 방법에 의해 계산될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 효율은 성공적인 HDR의 백분율 측면으로 표현될 수 있다. 예를 들어, 측량자 뉴클레아제 검정을 사용하여 절단 생성물을 생성할 수 있고 생성물 대 기질의 비를 사용하여 백분율을 계산할 수 있다. 예를 들어, 성공적인 HDR의 결과로 새로 통합된 제한 서열을 함유하는 DNA를 직접 절단하는 측량자 뉴클레아제 효소가 사용될 수 있다. 더 많이 절단된 기질은 더 큰 HDR 퍼센트(HDR의 더 큰 효율)를 나타낸다. 예시적 예로서, HDR의 분율(백분율)은 하기 방정식 [(절단 생성물)/(기질 + 절단 생성물)](예를 들어, (b+c)/(a+b+c), 여기서 "a"는 DNA 기질의 밴드 강도이고 "b" 및 "c"는 절단 생성물임)을 사용하여 계산될 수 있다.
일부 경우에, 효율은 성공적인 NHEJ의 백분율 측면으로 표현될 수 있다. 예를 들어, T7 엔도뉴클레아제 I 검정을 사용하여 절단 생성물을 생성할 수 있고 생성물 대 기질의 비를 사용하여 NHEJ 백분율을 계산할 수 있다. T7 엔도뉴클레아제 I은 야생형 및 돌연변이체 DNA 가닥의 혼성화로부터 발생하는 불일치 이종이중체 DNA를 절단한다(NHEJ는 원래 파괴 부위에서 작은 무작위 삽입 또는 결실(indel)을 생성한다). 더 많은 절단은 더 큰 NHEJ 퍼센트(NHEJ의 더 큰 효율)를 나타낸다. 예시적 예로서, NHEJ의 분율(백분율)은 하기 방정식을 사용하여 계산될 수 있다: (1-(1-(b+c)/(a+b+c))1/2)x100, 여기서 "a"는 DNA 기질의 밴드 강도이고 "b" 및 "c"는 절단 생성물임(Ran 등, Cell. 2013 Sep. 12; 154(6):1380-9; 및 Ran 등, Nat Protoc. 2013 Nov.; 8(11): 2281-2308).
NHEJ 복구 경로는 가장 활성인 복구 메커니즘이며, DSB 부위에서 작은 뉴클레오티드 삽입 또는 결실(indel)을 빈번하게 유발한다. NHEJ-매개 DSB 복구의 무작위성은 중요한 실용적 암시를 가지고 있는데, Cas9 및 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포의 집단이 돌연변이의 다양한 어레이를 초래할 수 있기 때문이다. 대부분의 경우, NHEJ는 표적 DNA에서 작은 indel을 일으켜 아미노산 결실, 삽입, 또는 프레임시프트 돌연변이를 초래하여 표적화된 세포의 오픈 리딩 프레임(ORF) 내에서 조기 종결 코돈을 야기한다. 이상적인 최종 결과는 표적화된 유전자 내에서 기능 상실 돌연변이이다.
NHEJ-매개 DSB 복구는 종종 유전자의 오픈 리딩 프레임을 방해하는 반면, 상동성 지정 복구(HDR)를 사용하여 단일 뉴클레오티드 변화에서 형광단 또는 태그의 첨가와 같은 큰 삽입에 이르는 특이적 뉴클레오티드 변화를 생성할 수 있다. 유전자 편집을 위해 HDR을 활용하기 위해, 원하는 서열을 함유하는 DNA 복구 주형이 gRNA(들) 및 Cas9 또는 Cas9 닉카제를 사용하여 관심 세포 유형으로 전달될 수 있다. 복구 주형은 원하는 편집 뿐만 아니라 표적의 바로 상류 및 하류에 추가적인 상동성 서열(좌측 및 우측 상동성 아암(arm)이라 함)을 함유할 수 있다. 각 상동성 아암의 길이는 도입되는 변화의 크기에 따라 달라질 수 있으며, 더 큰 삽입은 더 긴 상동성 아암을 필요로 한다. 복구 주형은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 또는 이중-가닥 DNA 플라스미드일 수 있다. HDR의 효율은 일반적으로 Cas9, gRNA 및 외인성 복구 주형을 발현하는 세포에서도 낮다(변형된 대립유전자의 10% 미만). HDR의 효율은 세포를 동기조정함으로써 향상될 수 있는 데, HDR이 세포 주기의 S 및 G2 기 동안 발생하기 때문이다. NHEJ에 수반되는 유전자를 화학적으로 또는 유전적으로 억제하는 것은 또한 HDR 빈도를 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9는 변형된 Cas9이다. 주어진 gRNA 표적화 서열은 부분적 상동성이 존재하는 게놈 전반에 걸쳐 추가적인 부위를 가질 수 있다. 이들 부위는 표적외(off-target)라 불리며 gRNA를 설계할 때 고려되어야 한다. gRNA 설계를 최적화하는 것 외에도, CRISPR 특이성은 또한 Cas9에 대한 변형을 통해 증가될 수 있다. Cas9는 2 개의 뉴클레아제 도메인인 RuvC 및 HNH의 조합된 활성을 통해 이중-가닥 파괴(DSB)를 생성한다. SpCas9의 D10A 돌연변이체인 Cas9 닉카제는 하나의 뉴클레아제 도메인을 유지하고 DSB 보다 DNA 닉을 생성한다. 닉카제 시스템은 또한 특이적 유전자 편집을 위해 HDR-매개 편집과 조합될 수 있다.
일부 경우에, Cas9는 변이체 Cas9 단백질이다. 변이체 Cas9 폴리펩티드는 야생형 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 비교할 때 하나의 아미노산이 상이한(예를 들어, 결실, 삽입, 치환, 융합을 가짐) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 Cas9 폴리펩티드의 뉴클레아제 활성을 감소시키는 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 삽입, 또는 치환)를 갖는다. 예를 들어, 일부 예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cas9 단백질의 뉴클레아제 활성의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 실질적인 뉴클레아제 활성이 없다. 대상체 Cas9 단백질이 실질적인 뉴클레아제 활성이 없는 변이체 Cas9 단백질인 경우, "dCas9"로 지칭될 수 있다.
일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는다. 예를 들어, 변이체 Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질, 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질의 엔도뉴클레아제 활성의 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.1% 미만을 나타낸다.
일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 가이드 표적 서열의 상보적 가닥을 절단할 수 있지만 이중 가닥 가이드 표적 서열의 비-상보적 가닥을 절단하는 능력은 감소된다. 예를 들어, 변이체 Cas9 단백질은 RuvC 도메인의 기능을 감소시키는 돌연변이(아미노산 치환)을 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 D10A(아미노산 위치 10에서 아스파르테이트에서 알라닌으로)를 가지며 따라서 이중 가닥 가이드 표적 서열의 상보적 가닥을 절단할 수 있지만 이중 가닥 가이드 표적 서열의 비-상보적 가닥을 절단하는 능력은 감소된다(따라서 변이체 Cas9 단백질이 이중 가닥 표적 핵산을 절단할 때 이중 가닥 파괴(DSB) 대신에 단일 가닥 파괴(SSB)를 초래한다)(예를 들어, Jinek 등, Science. 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21 참조).
일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 이중 가닥 가이드 표적 서열의 비-상보적 가닥을 절단할 수 있지만 가이드 표적 서열의 상보적 가닥을 절단하는 능력은 감소된다. 예를 들어, 변이체 Cas9 단백질은 HNH 도메인(RuvC/HNH/RuvC 도메인 모티프)의 기능을 감소시키는 돌연변이(아미노산 치환)를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A(아미노산 위치 840에서 히스티딘에서 알라닌으로) 돌연변이를 가지며 따라서 가이드 표적 서열의 비-상보적 가닥을 절단할 수 있지만 가이드 표적 서열의 상보적 가닥을 절단하는 능력은 감소된다(따라서 변이체 Cas9 단백질이 이중 가닥 가이드 표적 서열을 절단할 때 DSB 대신에 SSB를 초래한다). 이러한 Cas9 단백질은 가이드 표적 서열(예를 들어, 단일 가닥 가이드 표적 서열)을 절단하는 능력이 감소되지만 가이드 표적 서열(예를 들어, 단일 가닥 가이드 표적 서열)을 결합하는 능력은 유지한다.
일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 이중 가닥 표적 DNA의 상보적 및 비-상보적 가닥 둘 다를 절단하는 능력이 감소된다. 비제한적인 예로서, 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 D10A 및 H840A 돌연변이 둘 다를 보유하여 폴리펩티드가 이중 가닥 표적 DNA의 상보적 및 비-상보적 가닥 둘 다를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 유지한다.
또 다른 비제한적인 예로서, 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 W476A 및 W1126A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 유지한다.
또 다른 비제한적인 예로서, 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 유지한다.
또 다른 비제한적인 예로서, 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질 H840A, W476A, 및 W1126A, 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 유지한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, D10A, W476A, 및 W1126A, 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 유지한다. 일부 구현예에서, 변이체 Cas9는 Cas9 HNH 도메인의 위치 840에서 촉매 His 잔기를 복원하였다(A840H).
또 다른 비제한적인 예로서, 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 유지한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 D10A, H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 유지한다. 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질이 W476A 및 W1126A 돌연변이를 보유하거나 또는 변이체 Cas9 단백질이 P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 보유할 때, 변이체 Cas9 단백질은 PAM 서열에 효율적으로 결합하지 않는다. 따라서, 일부 이러한 경우에, 이러한 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용될 때, 방법은 PAM 서열이 필요하지 않다. 다시 말해서, 일부 경우에, 이러한 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용될 때, 방법은 가이드 RNA를 포함할 수 있지만, 방법은 PAM 서열의 부재 하에 수행될 수 있다(그리고 따라서 결합의 특이성은 가이드 RNA의 표적화 분절에 의해 제공된다). 다른 잔기가 돌연변이되어 상기 효과를 달성할 수 있다(즉, 하나 또는 다른 뉴클레아제 부분을 불활성화시킨다). 비제한적인 예로서, 잔기 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, 및/또는 A987은 변경(즉, 치환)될 수 있다. 또한, 알라닌 치환 이외의 돌연변이가 적합하다.
일부 구현예에서, 촉매 활성이 감소된 변이체 Cas9 단백질(예를 들어, Cas9 단백질이 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, 및/또는 A987 돌연변이, 예를 들어, D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A, 및/또는 D986A를 가질 때), 변이체 Cas9 단백질은 가이드 RNA와 상호작용하는 능력을 유지하는 한 여전히 부위-특이적 방식으로 표적 DNA에 결합할 수 있다(이는 여전히 가이드 RNA에 의해 표적 DNA 서열로 가이드되기 때문이다).
일부 구현예에서, 변이체 Cas 단백질은 spCas9, spCas9-VRQR, spCas9-VRER, xCas9(sp), saCas9, saCas9-KKH, SpCas9-MQKFRAER, spCas9-MQKSER, spCas9-LRKIQK, 또는 spCas9-LRVSQL일 수 있다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R(SpCas9-MQKFRAER)을 포함하고 변경된 PAM 5'-NGC-3'에 대해 특이성을 갖는 변형된 SpCas9가 사용된다.
에스. 피오게네스 Cas9에 대한 대안은 포유류 세포에서 절단 활성을 나타내는 Cpf1 패밀리로부터의 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 프레보텔라(Prevotella) 및 프란시셀라(Francisella) 1(CRISPR/Cpf1)로부터의 CRISPR는 CRISPR/Cas9 시스템과 유사한 DNA-편집 기술이다. Cpf1은 클래스 II CRISPR/Cas 시스템의 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제이다. 이 후천적 면역 메커니즘은 프레보텔라 및 프란시셀라 박테리아에서 발견된다. Cpf1 유전자는 가이드 RNA를 사용하여 바이러스 DNA를 발견하고 절단하는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 CRISPR 유전자좌와 연관된다. Cpf1은 Cas9보다 더 작고 더 단순한 엔도뉴클레아제로, 일부 CRISPR/Cas9 시스템 한계를 극복한다. Cas9 뉴클레아제와 달리, Cpf1-매개 DNA 절단의 결과는 짧은 3' 돌출부가 있는 이중-가닥 파괴이다. Cpf1의 시차를 둔 절단 패턴은 전통적인 제한 효소 클로닝과 유사한 양방향 유전자 전달의 가능성을 열 수 있으며, 이는 유전자 편집의 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 기재된 Cas9 변이체 및 오솔로그와 마찬가지로, Cpf1은 또한 CRISPR에 의해 표적화될 수 있는 부위의 수를 SpCas9에 의해 선호되는 NGG PAM 부위가 결여되어 있는 AT-풍부 영역 또는 AT-풍부 게놈으로 확장할 수 있다. Cpf1 유전자좌는 혼합된 알파/베타 도메인, RuvC-I 이어서 나선 영역, RuvC-II 및 아연 핑거-유사 도메인을 함유한다. Cpf1 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 갖는다. 또한, Cpf1은 HNH 엔도뉴클레아제 도메인을 갖지 않고, Cpf1의 N-말단은 Cas9의 알파-나선 인식 엽을 갖지 않는다. Cpf1 CRISPR-Cas 도메인 구조는 Cpf1이 기능적으로 고유하고, 클래스 2, 유형 V CRISPR 시스템으로 분류되고 있다는 것을 나타낸다. Cpf1 유전자좌는 유형 II 시스템보다 유형 I 및 III과 더 유사한 Cas1, Cas2 및 Cas4 단백질을 암호화한다. 기능적 Cpf1은 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)가 필요하지 않으며, 따라서 CRISPR(crRNA)만이 필요하다. 이는 게놈 편집에 유리한데, Cpf1이 Cas9보다 작을 뿐만 아니라, 더 작은 sgRNA 분자(Cas9만큼 많은 뉴클레오티드의 대략 절반)를 갖기 때문이다. Cpf1-crRNA 복합체는 Cas9에 의해 표적화된 G-풍부 PAM과 대조적으로 프로토스페이서 인접 모티프 5'-YTN-3'의 식별에 의해 표적 DNA 또는 RNA를 절단한다. PAM의 식별 후, Cpf1은 4 또는 5 개의 뉴클레오티드 돌출부의 점착-단부-유사 DNA 이중-가닥 파괴를 도입한다.
일부 구현예에서, Cas9는 변경된 PAM 서열에 대한 특이성을 갖는 Cas9 변이체이다. 일부 구현예에서, 추가의 Cas9 변이체 및 PAM 서열은 Miller, S.M., 등 Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs, Nat. Biotechnol. (2020)에 기재되어 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체는 특이적 PAM 요건을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체, 예를 들어 SpCas9 변이체는 NRNH PAM에 대한 특이성을 가지며, 여기서 R은 A 또는 G이고 H는 A, C, 또는 T이다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 PAM 서열 AAA, TAA, CAA, GAA, TAT, GAT, 또는 CAC에 대한 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 위치 1114, 1134, 1135, 1137, 1139, 1151, 1180, 1188, 1211, 1218, 1219, 1221, 1249, 1256, 1264, 1290, 1318, 1317, 1320, 1321, 1323, 1332, 1333, 1335, 1337, 또는 1339 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 위치 1114, 1135, 1218, 1219, 1221, 1249, 1320, 1321, 1323, 1332, 1333, 1335, 또는 1337 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 위치 1114, 1134, 1135, 1137, 1139, 1151, 1180, 1188, 1211, 1219, 1221, 1256, 1264, 1290, 1318, 1317, 1320, 1323, 1333 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 위치 1114, 1131, 1135, 1150, 1156, 1180, 1191, 1218, 1219, 1221, 1227, 1249, 1253, 1286, 1293, 1320, 1321, 1332, 1335, 1339 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 위치 1114, 1127, 1135, 1180, 1207, 1219, 1234, 1286, 1301, 1332, 1335, 1337, 1338, 1349 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. SpCas9 변이체의 예시적인 아미노산 치환 및 PAM 특이성은 표 1a-1d에 제시되어 있다.
표 1a
표 1b
표 1c
표 1d
일부 구현예에서, Cas9는 네이세리아 메닝기티디스 Cas9(NmeCas9) 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNGAYW PAM에 대한 특이성을 가지며, 여기서 Y는 C 또는 T이고 W는 A 또는 T이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNGYTT PAM에 대한 특이성을 가지며, 여기서 Y는 C 또는 T이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNGTCT PAM에 대한 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 Nme1 Cas9이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNGATT PAM, NNNNCCTA PAM, NNNNCCTC PAM, NNNNCCTT PAM, NNNNCCTG PAM, NNNNCCGT PAM, NNNNCCGGPAM, NNNNCCCA PAM, NNNNCCCT PAM, NNNNCCCC PAM, NNNNCCAT PAM, NNNNCCAG PAM, NNNNCCAT PAM, 또는 NNNGATT PAM에 대한 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, Nme1Cas9는 NNNNGATT PAM, NNNNCCTA PAM, NNNNCCTC PAM, NNNNCCTT PAM, 또는 NNNNCCTG PAM에 대한 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 CAA PAM, CAAA PAM, 또는 CCA PAM에 대한 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 Nme2 Cas9이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNCC (N4CC) PAM에 대한 특이성을 가지며, 여기서 N은 A, G, C, 또는 T 중 임의의 하나이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNCCGT PAM, NNNNCCGGPAM, NNNNCCCA PAM, NNNNCCCT PAM, NNNNCCCC PAM, NNNNCCAT PAM, NNNNCCAG PAM, NNNNCCAT PAM, 또는 NNNGATT PAM에 대한 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 Nme3Cas9이다. 일부 구현예에서, NmeCas9는 NNNNCAAA PAM, NNNNCC PAM, 또는 NNNNCNNN PAM에 대한 특이성을 갖는다. Edraki 등 Mol. Cell. (2019) 73(4): 714-726에 기재된 바와 같은 추가의 NmeCas9 특징 및 PAM 서열은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
Nme1Cas9의 예시적인 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
유형 II CRISPR RNA-가이드 엔도뉴클레아제 Cas9 [네이세리아 메닝기티디스] WP_002235162.1
Nme2Cas9의 예시적인 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
유형 II CRISPR RNA-가이드 엔도뉴클레아제 Cas9 [네이세리아 메닝기티디스] WP_002230835.1
핵염기
편집기의
Cas12
도메인
전형적으로, 미생물 CRISPR-Cas 시스템은 클래스 1 및 클래스 2 시스템으로 나눠진다. 클래스 1 시스템은 다중서브유닛 효과기 복합체를 갖는 반면, 클래스 2 시스템은 단일 단백질 효과기를 갖는다. 예를 들어, Cas9 및 Cpf1은 상이한 유형이기는 하나(각각 유형 II 및 유형 V), 클래스 2 효과기이다. Cpf1 이외에, 클래스 2, 유형 V CRISPR-Cas 시스템은 또한 Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i 및 Cas12j/CasΦ를 포함한다). 예를 들어, Shmakov 등, "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems," Mol. Cell, 2015 Nov. 5; 60(3): 385-397; Makarova 등, "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?" CRISPR Journal, 2018, 1(5): 325-336; 및 Yan 등, "Functionally Diverse Type V CRISPR-Cas Systems," Science, 2019 Jan. 4; 363: 88-91을 참조하며; 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 유형 V Cas 단백질은 RuvC(또는 RuvC-유사) 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. 성숙 CRISPR RNA(crRNA)의 생산은 일반적으로 tracrRNA-독립적인 반면, 예를 들어, Cas12b/C2c1은 crRNA의 생산을 위해 tracrRNA가 필요하다. Cas12b/C2c1은 DNA 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA 둘 다에 의존한다.
본 발명에서 고려되는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은 클래스 2, 유형 V(Cas12 단백질)로 분류된 Cas 단백질을 포함한다. Cas 클래스 2, 유형 V 단백질의 비제한적인 예는 Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 및 Cas12j/CasΦ 이의 상동체, 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, Cas12 단백질은 또한 Cas12 뉴클레아제, Cas12 도메인, 또는 Cas12 단백질 도메인으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 Cas12 단백질은 데아미나제 도메인과 같은 내부적으로 융합된 단백질 도메인에 의해 중단된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas12 도메인은 뉴클레아제 불활성 Cas12 도메인 또는 Cas12 닉카제이다. 일부 구현예에서, Cas12 도메인은 뉴클레아제 활성 도메인이다. 예를 들어, Cas12 도메인은 이중체 핵산(예를 들어, 이중체 DNA 분자)의 한쪽 가닥에 닉을 형성하는 Cas12 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas12 도메인은 본원에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 구현예에서 Cas12 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 적어도 10 개, 적어도 15 개, 적어도 20 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 적어도 100 개, 적어도 150 개, 적어도 200 개, 적어도 250 개, 적어도 300 개, 적어도 350 개, 적어도 400 개, 적어도 500 개, 적어도 600 개, 적어도 700 개, 적어도 800 개, 적어도 900 개, 적어도 1000 개, 적어도 1100 개, 또는 적어도 1200 개의 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas12의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질은 2 개의 Cas12 도메인 중 하나를 포함한다: (1) Cas12의 gRNA 결합 도메인; 또는 (2) Cas12의 DNA 절단 도메인. 일부 구현예에서, Cas12를 포함하는 단백질 또는 이의 단편은 "Cas12 변이체"로 지칭된다. Cas12 변이체는 Cas12, 또는 이의 단편과 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas12 변이체는 야생형 Cas12와 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, Cas12 변이체는 야생형 Cas12와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 이상의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Cas12 변이체는 Cas12의 단편(예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA 절단 도메인)을 포함하여, 단편이 야생형 Cas12의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하도록 한다. 일부 구현예에서, 단편은 상응하는 야생형 Cas12의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일한, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다. 일부 구현예에서, 단편은 적어도 100 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 단편은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 또는 적어도 1300 개의 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, Cas12는 부분적으로 또는 전체적으로 Cas12 뉴클레아제 활성을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 Cas12 아미노산 서열에 상응하거나, 또는 이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 예로서, Cas12의 RuvC 뉴클레아제 도메인 내에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 Cas12와 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 Cas12의 변이체 또는 상동체가 제공된다. 일부 구현예에서, 약 5 개의 아미노산, 약 10 개의 아미노산, 약 15 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 75 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산 또는 그 이상만큼 더 짧거나 또는 더 긴 아미노산 서열을 갖는 Cas12의 변이체가 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 Cas12 융합 단백질은 Cas12 단백질의 전장 아미노산 서열, 예를 들어, 본원에 제공된 Cas12 서열 중 하나를 포함한다. 그러나, 다른 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질은 전장 Cas12 서열을 포함하지 않지만, 이의 하나 이상의 단편만을 포함한다. 적합한 Cas12 도메인의 예시적인 아미노산 서열이 본원에 제공되며, Cas12 도메인의 추가의 적합한 서열 및 단편은 당업자에게 명백할 것이다.
일반적으로, 클래스 2, 유형 V Cas 단백질은 단일 기능적 RuvC 엔도뉴클레아제 도메인을 갖는다(예를 들어, Chen 등, "CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity," Science 360:436-439 (2018) 참조). 일부 경우에, Cas12 단백질은 변이체 Cas12b 단백질이다. (Strecker 등, Nature Communications, 2019, 10(1): Art. No.: 212 참조). 일 구현예에서, 변이체 Cas12 폴리펩티드는 야생형 Cas12 단백질의 아미노산 서열과 비교할 때 1, 2, 3, 4, 5 개 이상의 아미노산에 의해 상이한(예를 들어, 결실, 삽입, 치환, 융합을 갖는) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 Cas12 폴리펩티드는 Cas12 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 삽입, 또는 치환)가 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 Cas12는 상응하는 야생형 Cas12b 단백질의 닉카제 활성의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만을 갖는 Cas12b 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 변이체 Cas12b 단백질은 실질적인 닉카제 활성이 없다.
일부 경우에, 변이체 Cas12b 단백질은 닉카제 활성이 감소된다. 예를 들어, 변이체 Cas12b 단백질은 야생형 Cas12b 단백질의 닉카제 활성의 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.1% 미만을 나타낸다.
일부 구현예에서, Cas12 단백질은 포유류 세포에서 활성을 나타내는 Cas12a/Cpf1 패밀리로부터의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 포함한다. 프레보텔라 및 프란시셀라 1(CRISPR/Cpf1)로부터의 CRISPR은 CRISPR/Cas9 시스템과 유사한 DNA 편집 기술이다. Cpf1은 클래스 II CRISPR/Cas 시스템의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제이다. 이 후천적 면역 메커니즘은 프레보텔라 및 프란시셀라 박테리아에서 발견된다. Cpf1 유전자는 바이러스 DNA를 찾고 절단하기 위해 가이드 RNA를 사용하는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 CRISPR 유전자좌와 연관된다. Cpf1은 Cas9보다 더 작고 더 단순한 엔도뉴클레아제이며, CRISPR/Cas9 시스템 한계의 일부를 극복한다. Cas9 뉴클레아제와 달리, Cpf1-매개 DNA 절단의 결과는 짧은 3' 돌출부가 있는 이중 가닥 파괴이다. Cpf1의 시차를 둔 절단 패턴은 전통적인 제한 효소 클로닝과 유사한 방향성 유전자 전달의 가능성을 열 수 있으며, 유전자 편집의 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 기재된 Cas9 변이체 및 오솔로그와 마찬가지로, Cpf1은 또한 CRISPR에 의해 표적화될 수 있는 부위의 수를 SpCas9에 의해 선호되는 NGG PAM 부위가 결여된 AT-풍부 영역 또는 AT-풍부 게놈으로 확장할 수 있다. Cpf1 유전자좌는 혼합 알파/베타 도메인, RuvC-I 이어서 나선 영역, RuvC-II 및 아연 핑거-유사 도메인을 함유한다. Cpf1 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인이 있다. 더욱이, Cas9와 달리, Cpf1은 HNH 엔도뉴클레아제 도메인이 없고, Cpf1의 N-말단은 Cas9의 알파-나선 인식 엽이 없다. Cpf1 CRISPR-Cas 도메인 구조는 Cpf1이 기능적으로 고유하며, 클래스 2, 유형 V CRISPR 시스템으로 분류되고 있음을 나타낸다. Cpf1 유전자좌는 유형 II 시스템보다 유형 I 및 III에 더 유사한 Cas1, Cas2, 및 Cas4 단백질을 암호화한다. 기능적 Cpf1은 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)가 필요하지 않으며, 따라서, CRISPR(crRNA)만이 필요하다. 이는 Cpf1이 Cas9보다 더 작을 뿐만 아니라, 더 작은 sgRNA 분자(대략적으로 Cas9의 절반의 뉴클레오티드)를 갖기 때문에 게놈 편집에 이익이 된다. Cpf1-crRNA 복합체는 Cas9에 의해 표적화된 G-풍부 PAM과 대조적으로 프로토스페이서 인접 모티프 5'-YTN-3' 또는 5'-TTTN-3'의 인식에 의해 표적 DNA 또는 RNA를 절단한다. PAM의 식별 후, Cpf1은 4 또는 5 개의 뉴클레오티드 돌출부를 갖는 점착-단부-유사 DNA 이중 가닥 파괴를 도입한다.
본 발명의 일부 측면에서, 벡터는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 두 가닥을 절단하는 능력이 사용될 수 있는 돌연변이된 CRISPR 효소가 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 비해 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화한다. Cas12는 야생형 예시적인 Cas12 폴리펩티드(예를 들어, 바실루스 히사시로부터의 Cas12)에 대해 적어도 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. Cas12는 야생형 예시적인 Cas12 폴리펩티드(예를 들어, 바실루스 히사시(BhCas12b), 바실루스 종 V3-13(BvCas12b), 및 알리사이클로바실루스 아시디필루스(AaCas12b)로부터 유래)에 대해 최대 또는 최대 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. Cas12는 결실, 삽입, 치환, 변이체, 돌연변이, 융합, 키메라, 또는 이의 임의의 조합과 같은 아미노산 변화를 포함할 수 있는 Cas12 단백질의 야생형 또는 변형된 형태를 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, BhCas12b 가이드 폴리뉴클레오티드는 하기 서열을 갖는다:
BhCas12b sgRNA 스캐폴드(밑줄 그어져 있음) + 20nt 내지 23nt 가이드 서열(Nn으로 표시됨)
일부 구현예에서, BvCas12b 및 AaCas12b 가이드 폴리뉴클레오티드는 하기 서열을 갖는다:
BvCas12b sgRNA 스캐폴드(밑줄 그어져 있음) + 20nt 내지 23nt 가이드 서열(Nn으로 표시됨)
AaCas12b sgRNA 스캐폴드(밑줄 그어져 있음) + 20nt 내지 23nt 가이드 서열(Nn으로 표시됨)
핵산
프로그램가능한
DNA 결합 단백질
본 개시내용의 일부 측면은 염기 편집기와 같은 단백질을 특이적 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열로 가이드하는 데 사용될 수 있는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질로 작용하는 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 도메인 및 데아미나제 도메인을 포함한다. 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질의 비제한적인 예는 Cas9(예를 들어, dCas9 및 nCas9), Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i 및 Cas12j/CasΦ를 포함한다. Cas 효소의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12로도 알려져 있음), Cas10, Cas10d, Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j/CasΦ, Csy1 , Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csx11, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, 유형 II Cas 효과기 단백질, 유형 V Cas 효과기 단백질, 유형 VI Cas 효과기 단백질, CARF, DinG, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 또는 조작된 버전을 포함한다. 다른 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질이 본 개시내용의 범위 내에 있지만, 이들은 본 개시내용에 구체적으로 나열되지 않을 수 있다. 예를 들어, Makarova 등 "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?" CRISPR J. 2018 Oct;1:325-336. doi: 10.1089/crispr.2018.0033; Yan 등, "Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems" Science. 2019 Jan 4;363(6422):88-91. doi: 10.1126/science.aav7271을 참조하며, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
Cas9와 상이한 PAM 특이성을 갖는 핵산 프로그램가능한 DNA-결합 단백질의 일 예는 프레보텔라 및 프란시셀라 1(Cpf1)로부터의 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부이다. Cas9와 유사하게, Cpf1은 또한 클래스 2 CRISPR 효과기이다. Cpf1은 Cas9와 구별되는 특징으로 강력한 DNA 간섭을 매개하는 것으로 나타났다. Cpf1은 tracrRNA가 결여된 단일 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제이며, T-풍부 프로토스페이서 인접 모티프(TTN, TTTN, 또는 YTN)를 활용한다. 더욱이, Cpf1은 시차를 둔 DNA 이중-가닥 파괴를 통해 DNA를 절단한다. 16 개의 Cpf1-패밀리 단백질 중, 아시드아미노코쿠스(Acidaminococcus) 및 라크로스피라새애(Lachnospiraceae)로부터의 2 개의 효소가 인간 세포에서 효율적인 게놈-편집 활성을 갖는 것으로 나타났다. Cpf1 단백질은 당업계에 알려져 있고 이전에, 예를 들어 Yamano 등, "Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA." Cell (165) 2016, p. 949-962에 기재되었으며; 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 것은 가이드 뉴클레오티드 서열-프로그램가능한 DNA-결합 단백질 도메인으로 사용될 수 있는 뉴클레아제-불활성 Cpf1(dCpf1) 변이체이다. Cpf1 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사하지만 HNH 엔도뉴클레아제 도메인을 갖지 않는 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 갖고, Cpf1의 N-말단은 Cas9의 알파-나선 인식 엽을 갖지 않는다. Zetsche 등, Cell, 163, 759-771, 2015(이는 본원에 참조로 포함됨)에서, Cpf1의 RuvC-유사 도메인은 두 DNA 가닥을 절단하는 것을 담당하고 RuvC-유사 도메인의 불활성화는 Cpf1 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) Cpf1에서 D917A, E1006A, 또는 D1255A에 상응하는 돌연변이는 Cpf1 뉴클레아제 활성을 불활성화시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 dCpf1은 D917A, E1006A, D1255A, D917A/E1006A, D917A/D1255A, E1006A/D1255A, 또는 D917A/E1006A/D1255A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. Cpf1의 RuvC 도메인을 불활성화시키는 임의의 돌연변이, 예를 들어, 치환 돌연변이, 결실, 또는 삽입은 본 개시내용에 따라 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)은 Cpf1 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, Cpf1 단백질은 Cpf1 닉카제(nCpf1)이다. 일부 구현예에서, Cpf1 단백질은 뉴클레아제 불활성 Cpf1(dCpf1)이다. 일부 구현예에서, Cpf1, nCpf1, 또는 dCpf1은 본원에 개시된 Cpf1 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, dCpf1은 본원에 개시된 Cpf1 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 쉽게 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, D917A, E1006A, D1255A, D917A/E1006A, D917A/D1255A, E1006A/D1255A, 또는 D917A/E1006A/D1255A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 Cpf1이 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
야생형 프란시셀라 노비시다 Cpf1(D917, E1006, 및 D1255는 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있다)
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A(A917, E1006, 및 D1255는 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있다)
프란시셀라 노비시다 Cpf1 E1006A(D917, A1006, 및 D1255는 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있다)
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D1255A(D917, E1006, 및 A1255는 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있다)
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A/E1006A(A917, A1006, 및 D1255는 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있다)
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A/D1255A(A917, E1006, 및 A1255는 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있다)
프란시셀라 노비시다 Cpf1 E1006A/D1255A(D917, A1006, 및 A1255는 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있다)
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A/E1006A/D1255A(A917, A1006, 및 A1255는 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있다)
일부 구현예에서, 융합 단백질에 존재하는 Cas9 도메인 중 하나는 PAM 서열에 대한 요건이 없는 가이드 뉴클레오티드 서열-프로그램가능한 DNA-결합 단백질 도메인으로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9 도메인(SaCas9)이다. 일부 구현예에서, SaCas9는 도메인은 뉴클레아제 활성 SaCas9, 뉴클레아제 불활성 SaCas9(SaCas9d), 또는 SaCas9 닉카제(SaCas9n)이다. 일부 구현예에서, SaCas9는 N579A 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인, 또는 SaCas9n 도메인은 비-표준 PAM를 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인, 또는 SaCas9n 도메인은 NNGRRT 또는 NNGRRT PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 E781X, N967X, 및 R1014X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 E781K, N967K, 및 R1014H 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 E781K, N967K, 또는 R1014H 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
예시적인 SaCas9 서열
밑줄이 그어져 있고 굵은 글씨로 표시된 상기 잔기 N579는 돌연변이되어(예를 들어, A579로) SaCas9 닉카제를 산출할 수 있다.
예시적인 SaCas9n 서열
N579로부터 돌연변이되어 SaCas9 닉카제를 산출할 수 있는 상기 잔기 A579는 밑줄이 그어져 있고 굵은 글씨로 표시된다.
예시적인 SaKKH Cas9
N579로부터 돌연변이되어 SaCas9 닉카제를 산출할 수 있는 상기 잔기 A579는 밑줄이 그어져 있고 굵은 글씨로 표시된다. E781, N967, 및 R1014로부터 돌연변이되어 SaKKH Cas9를 산출할 수 있는 상기 잔기 K781, K967, 및 H1014는 밑줄이 그어져 있고 이탤릭체로 표시된다.
일부 구현예에서, napDNAbp는 원형 치환체이다. 하기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 글씨 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타내고, 이중 밑줄 친 서열은 돌연변이를 나타낸다.
CP5 (MSP "NGC" PID 및 "D10A" 닉카제 있음):
일부 구현예에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)은 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 효과기이다. 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 효과기는 Cas9, Cpf1, Cas12b/C2c1, 및 Cas12c/C2c3을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 미생물 CRISPR-Cas 시스템은 클래스 1 및 클래스 2 시스템으로 나눠진다. 클래스 1 시스템은 다중 하위단위 효과기 복합체를 갖는 반면, 클래스 2 시스템은 단일 단백질 효과기를 갖는다. 예를 들어, Cas9 및 Cpf1은 클래스 2 효과기이다. Cas9 및 Cpf1 외에도, 3 개의 별도의 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템(Cas12b/C2c1, 및 Cas12c/C2c3)이 Shmakov 등, "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems", Mol . Cell, 2015 Nov. 5; 60(3): 385-397에 기재되었으며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 2 개의 시스템인 Cas12b/C2c1, 및 Cas12c/C2c3의 효과기는 Cpf1과 관련된 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. 세번째 시스템은 2 개의 예측된 HEPN RNase 도메인을 갖는 효과기를 함유한다. 성숙 CRISPR RNA의 생산은 Cas12b/C2c1에 의한 CRISPR RNA의 생산과 달리, tracrRNA-독립적이다. Cas12b/C2c1은 DNA 절단을 위해 CRISPR RNA 및 tracrRNA 둘 다에 따라 달라진다.
알리사이클로바실루스 아시도테라스트리스(Alicyclobaccillus acidoterrastris) Cas12b/C2c1(AacC2c1)의 결정 구조는 키메라 단일-분자 가이드 RNA(sgRNA)와의 복합체로 보고되었다. 예를 들어, Liu 등, "C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism", Mol . Cell, 2017 Jan. 19; 65(2):310-322를 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 결정 구조는 또한 삼원 복합체로서 표적 DNA에 결합된 알리사이클로바실루스 아시도테레스트리스 C2c1에서 보고되었다. 예를 들어, Yang 등, "PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease", Cell, 2016 Dec. 15; 167(7):1814-1828을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 표적 및 비-표적 DNA 가닥 둘 다를 갖는 AacC2c1의 촉매적으로 적격한 형태는 독립적으로 단일 RuvC 촉매 포켓 내에 위치하도록 포획되었으며, Cas12b/C2c1-매개 절단은 표적 DNA의 시차를 둔 7-뉴클레오티드 파괴를 초래한다. Cas12b/C2c1 삼원 복합체 및 이전에 식별된 Cas9 및 Cpf1 대응물 사이의 구조적 비교는 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 사용되는 메커니즘의 다양성을 입증한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)은 Cas12b/C2c1, 또는 Cas12c/C2c3 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12b/C2c1 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12c/C2c3 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12b/C2c1 또는 Cas12c/C2c3 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 쉽게 99.5% 동일한 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12b/C2c1 또는 Cas12c/C2c3 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 본원에 제공된 napDNAbp 서열 중 임의의 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 쉽게 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 Cas12b/C2c1 또는 Cas12c/C2c3은 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
Cas12b/C2c1((uniprot.org/uniprot/T0D7A2#2) sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 C2c1 OS = 알리사이클로바실루스 아시도-테레스트리스(Alicyclobacillus acido - terrestris)(균주 ATCC 49025 / DSM 3922/ CIP 106132 / NCIMB 13137/GD3B) GN=c2c1 PE=1 SV=1) 아미노산 서열은 다음과 같다:
AacCas12b (알리사이클로바실루스 아시디필루스) - WP_067623834
BhCas12b (바실루스 히사시) NCBI 참조 서열: WP_095142515
일부 구현예에서, Cas12b는 BvCas12b(V4)이며, BhCas12b의 변이체이고 BhCas12b에 비해 다음 변화를 포함한다: S893R, K846R, 및 E837G. BhCas12b(V4)는 다음과 같이 표현된다: 5' mRNA Cap---5'UTR---bhCas12b---종결 서열---3'UTR-- 120polyA 꼬리.
5'UTR:
3' UTR(Tri링크 표준 UTR)
bhCas12b(V4)의 핵산 서열
일부 구현예에서, Cas12b는 BvCas12B이다. 일부 구현예에서, Cas12b는 하기 제공된 BvCas12b 예시적인 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 치환 S893R, K846R, 및 E837G를 포함한다.
BvCas12b (바실루스 종 V3-13) NCBI 참조 서열: WP_101661451.1
일부 구현예에서, Cas12b는 BTCas12b이다.BTCas12b(바실루스 써모아밀로보란스(Bacillus thermoamylovorans)) NCBI 참조 서열: WP_041902512
일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12c를 지칭한다. 일부 구현예에서, Cas12c 단백질은 Cas12c1 또는 Cas12c1의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12c2 또는 Cas12c2의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 올레이필루스 종(Oleiphilus sp.) HI0009로부터의 Cas12c 단백질(즉, OspCas12c) 또는 OspCas12c의 변이체이다. 이들 Cas12c 분자는 Yan 등, "Functionally Diverse Type V CRISPR-Cas Systems," Science, 2019 Jan. 4; 363: 88-91에 기재되어 있으며; 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 본원에 기재된 임의의 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 용이하게 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c가 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
Cas12c1
Cas12c2
OspCas12c
일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i를 지칭하고, 예를 들어, Yan 등, "Functionally Diverse Type V CRISPR-Cas Systems," Science, 2019 Jan. 4; 363: 88-91에 기재되어 있으며; 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 10 테라바이트 초과의 서열 데이터를 종합하면, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i를 포함하여 이전에 특성화된 클래스 V 단백질에 대해 약한 유사성을 나타내는 유형 V Cas 단백질의 신규 분류가 확인되었다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12g 또는 Cas12g의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12h 또는 Cas12h의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12i 또는 Cas12i의 변이체이다. 다른 RNA-가이드 DNA 결합 단백질이 napDNAbp로서 사용될 수 있고, 본 개시내용의 범위 내에 있음이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 본원에 기재된 임의의 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 용이하게 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i가 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, Cas12i는 Cas12i1 또는 Cas12i2이다.
Cas12g1
Cas12h1
Cas12i1
Cas12i2
염기 편집기의 대표적인 핵산 및 단백질 서열을 하기와 같다:
P153에서 BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20
K255에서 BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20
D306에서 BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20
D980에서 BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20
K1019에서 BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20
상기 서열에 대해, Kozak 서열은 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있으며; 밑줄.점.밑줄(-.-.-)은 N-말단 핵 국소화 신호(NLS) 이어서 Kozak 서열을 표시하고; 소문자는 GGGSGGS 링커를 나타내고;_____은 ABE8을 암호화하는 서열을 표시하고, 비변형된 서열은 BhCas12b를 암호화하고; 이중 밑줄은 Xten20 링커를 나타내고; 단일 밑줄은 C-말단 NLS를 나타내고; 는 GS 링커를 나타내고; 이탤릭체 글자는 3x 헤마글루티닌(HA) 태그의 코딩 서열을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)은 Cas12j/CasΦ 단백질일 수 있다. Cas12j/CasΦ는 Pausch 등, "CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor," Science, 17 July 2020, Vol. 369, Issue 6501, pp. 333-337에 기재되어 있으며, 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12j/CasΦ 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 용이하게 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12j/CasΦ 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 뉴클레아제 불활성("사멸") Cas12j/CasΦ 단백질이다. 다른 종으로부터의 Cas12j/CasΦ가 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
예시적인 Cas12j/CasΦ 아미노산 서열은 하기와 같다:
>CasΦ-1
>CasΦ-2
>CasΦ-3
>CasΦ-4
>CasΦ-5
>CasΦ-6
>CasΦ-7
>CasΦ-8
>CasΦ-9
>CasΦ-10
상기 서열에서 별표(*)는 종결 코돈을 나타낸다. 대안적으로, CasΦ-1은 또한 Cas12j 오솔로그 1로 명명된다. 따라서, CasΦ-1-CasΦ-10은 또한 각각 Cas12j 오솔로그 1-10을 지칭할 수 있다.
가이드
폴리뉴클레오티드
구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "가이드 RNA(gRNA)" 및 이의 문법적 등가물은 표적 DNA에 특이적일 수 있고 Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 RNA를 지칭할 수 있다. RNA/Cas 복합체는 Cas 단백질을 표적 DNA로 "가이드"하는 데 도움이 될 수 있다. Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 엔도뉴클레오적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 엔도뉴클레오적으로 절단된 다음, 3'-5' 엑소뉴클레오적으로 다듬어진다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 두 RNA를 필요로 한다. 그러나, 단일 가이드 RNA("sgRNA", 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종 내로 혼입하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, Jinek M. 등, Science 337:816-821(2012)을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 CRISPR 반복 서열에서 짧은 모티프(PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식하여 자기-대-비자기를 구별하는 데 도움이 된다. Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, "Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti, J.J. 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E. 등, Nature 471:602-607(2011); 및 "Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M. 등, Science 337:816-821(2012)를 참조하며, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다). Cas9 오솔로그는 에스. 피오게네스 및 에스. 써모필루스를 포함하나 이제 제한되지 않는 다양한 종에서 기재되었다. 추가적인 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 수 있고, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity sustems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함하며; 상기 문헌의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 불활성(예를 들어, 불활성화) DNA 절단 도메인을 가지며, 즉, Cas9는 닉카제이다.
일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 단일 가이드 RNA("sgRNA" 또는 "gRNA")이다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 tracrRNA이다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)을 표적 뉴클레오티드 서열로 가이드하기 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는다.
본원에 개시된 염기 편집기의 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인(예를 들어, CRISPR-유래 도메인)은 가이드 폴리뉴클레오티드와 회합함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 인식할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)는 전형적으로 단일-가닥이고 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 부위-특이적으로 결합하도록(즉, 상보적 염기 쌍형성을 통해) 프로그램될 수 있어서, 가이드 핵산과 함께 염기 편집기를 표적 서열로 지시할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 RNA일 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열에서 우라실(U)은 서열에서 티민(T)을 대체한다. 일부 경우에, 가이드 폴리뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신)를 포함한다. 일부 경우에, 가이드 폴리뉴클레오티드는 비-천연(또는 비천연) 뉴클레오티드(예를 들어, 펩티드 핵산 또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함한다. 일부 경우에, 가이드 핵산 서열의 표적화 영역은 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 가이드 핵산의 표적화 영역은 10 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 25 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 20 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 특히 5' 단부에서 1, 2, 3, 4 개 등의 뉴클레오티드에 의해 절두될 수 있다. 비제한적인 예로서, 20 개 뉴클레오티드 길이의 가이드 폴리뉴클레오티드는 특히 5' 단부에서 1, 2, 3, 4 개 등의 뉴클레오티드에 의해 절두될 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 2 개 이상의 개별 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이는 예를 들어 상보적 염기 쌍형성(예를 들어, 이중 가이드 폴리뉴클레오티드)을 통해 서로 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오티드는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 트랜스- 활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다.
유형 II CRISPR 시스템에서, CRISPR 단백질(예를 들어, Cas9)에 의해 핵산을 표적화하는 것은 전형적으로 표적 서열을 인식하는 서열을 포함하는 제1 RNA 분자(crRNA) 및 가이드 RNA-CRISPR 단백질 복합체를 안정화시키는 스캐폴드 영역을 형성하는 반복 서열을 포함하는 제2 RNA 분자(trRNA) 사이에 상보적 염기 쌍형성을 필요로 한다. 이러한 이중 가이드 RNA 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드로 이용되어 본원에 개시된 염기 편집기를 표적 폴리뉴클레오티드 서열로 지시할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 단일 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, sgRNA)를 활용한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 이중 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 이중 gRNA)를 활용한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 다중 gRNA)를 활용한다. 일부 구현예에서, 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 상이한 염기 편집기에 활용된다. 예를 들어, 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 사이티딘 염기 편집기 및 아데노신 염기 편집기에 활용될 수 있다.
다른 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 핵산의 뉴클레오티드 표적화 부분 및 단일 분자에서 핵산(즉, 단일-분자 가이드 핵산)의 스캐폴드 부분 둘 다를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-분자 가이드 폴리뉴클레오티드는 단일 가이드 RNA(sgRNA 또는 gRNA)일 수 있다. 본원에서 용어 가이드 폴리뉴클레오티드 서열은 염기 편집기를 표적 폴리뉴클레오티드 서열로 지시하고 상호작용할 수 있는 임의의 단일, 이중, 또는 다중-분자 핵산을 고려한다.
전형적으로, 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, crRNA/trRNA 복합체 또는 gRNA)는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하고 인식할 수 있는 서열을 포함하는 "폴리뉴클레오티드-표적화 분절", 및 염기 편집기의 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 구성요소 내에서 가이드 폴리뉴클레오티드를 안정화시키는 "단백질-결합 분절"을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 표적화 분절은 DNA 폴리뉴클레오티드에 결합하고 인식하여, DNA에서 염기의 편집을 용이하게 한다. 다른 경우에, 가이드 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 표적화 분절은 RNA 폴리뉴클레오티드에 결합하고 인식하여, RNA에서 염기의 편집을 용이하게 한다. 본원에서 "분절"은 분자의 섹션 또는 영역, 예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 인접 스트레치를 지칭한다. 또한 분절이 하나 초과의 분자의 영역을 포함할 수 있도록 분절은 복합체의 영역/섹션을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오티드가 다중 핵산 분자를 포함하는 경우, 단백질-결합 분절은 예를 들면 상보성 영역을 따라 혼성화되는 다중 개별 분자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2 개의 개별 분자를 포함하는 DNA-표적화 RNA의 단백질-결합 분절은 (i) 100 개의 염기 쌍 길이인 제1 RNA 분자의 염기 쌍 40-75 개; 및 (ii) 50 개의 염기 쌍 길이인 제2 RNA 분자의 염기 쌍 10-25 개를 포함할 수 있다. "분절"의 정의는, 특정 문맥에서 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 총 염기 쌍의 특정 수로 제한되지 않고, 주어진 RNA 분자로부터의 염기 쌍의 임의의 특정 수로 제한되지 않고, 복합체 내에서 개별 분자의 특정 수로 제한되지 않고, 임의의 총 길이의 것이고 다른 분자에 상보성을 갖는 영역을 포함할 수 있는 RNA 분자의 영역을 포함할 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 2 개 이상의 RNA, 예를 들어, CRISPR RNA(crRNA) 및 전사촉진 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 때때로 단일-쇄 RNA, 또는 crRNA 및 tracrRNA의 일부(예를 들어, 기능적 부분)의 융합에 의해 형성된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함할 수 있다. 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 또한 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA일 수 있다. 또한, crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 발현 생성물일 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA를 암호화하는 DNA는 가이드 RNA를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터일 수 있다. 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA 및 프로모터를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 가이드 RNA 또는 플라스미드 DNA로 세포를 형질감염시킴으로써 세포 내로 전달될 수 있다. 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 또한 다양한-매개 유전자 전달을 사용하는 것과 같이, 다른 방식으로 세포 내로 전달될 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 단리될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 단리된 RNA의 형태로 세포 또는 유기체 내로 형질감염될 수 있다. 가이드 RNA는 당업계에 알려진 임의의 시험관내 전사 시스템을 사용하여 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 가이드 RNA는 가이드 RNA에 대한 암호화된 서열을 포함하는 플라스미드의 형태보다는 단리된 RNA의 형태로 세포에 전달될 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 3 개의 영역을 포함할 수 있다: 염색체 서열에서 표적 부위에 상보적일 수 있는 5' 단부의 제1 영역, 줄기 루프 구조를 형성할 수 있는 제2 내부 영역, 및 단일-가닥일 수 있는 제3 3' 영역. 각각의 가이드 RNA의 제1 영역은 또한 각각의 가이드 RNA가 융합 단백질을 특이적 표적 부위로 가이드하도록 상이할 수 있다. 또한, 각각의 가이드 RNA의 제2 및 제3 영역은 모든 가이드 RNA에서 동일할 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드의 제1 영역은 가이드 RNA의 제1 영역이 표적 부위와 염기 쌍을 이룰 수 있도록 염색체 서열에서 표적 부위의 서열과 상보적일 수 있다. 일부 경우에, 가이드 RNA의 제1 영역은 약 10 개의 뉴클레오티드 내지 25 개의 뉴클레오티드(즉, 10 개의 뉴클레오티드 내지 뉴클레오티드; 또는 약 10 개의 뉴클레오티드 내지 약 25 개의 뉴클레오티드; 또는 10 개의 뉴클레오티드 내지 약 25 개의 뉴클레오티드; 또는 약 10 개의 뉴클레오티드 내지 25 개의 뉴클레오티드) 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 제1 영역 및 염색체 서열에서 표적 부위 사이의 염기 쌍형성의 영역은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25 개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있거나 또는 일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 제1 영역은 약 19, 20, 또는 21 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있거나 또는 일 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 또한 2차 구조를 형성하는 제2 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA에 의해 형성된 2차 구조는 줄기(또는 헤어핀) 및 루프를 포함할 수 있다. 루프 및 줄기의 길이는 달라질 수 있다. 예를 들어, 루프는 약 3 내지 10 개의 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있고, 줄기는 약 6 내지 20 개의 염기 쌍 길이 범위일 수 있다. 줄기는 1 내지 10 개 또는 약 10 개 뉴클레오티드의 하나 이상의 융기를 포함할 수 있다. 제2 영역의 전체 길이는 약 16 내지 60 개의 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다. 예를 들어, 루프는 약 4 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있거나 일 수 있고 줄기는 약 12 개의 염기 쌍일 수 있거나 또는 일 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 또한 본질적으로 단일-가닥일 수 있는 3' 단부에 제3 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제3 영역은 때때로 관심 세포에서 임의의 염색체 서열에 상보적이 아니고 때때로 나머지 가이드 RNA에 상보성이 아니다. 또한, 제3 영역의 길이는 달라질 수 있다. 제3 영역은 약 4 개 초과 또는 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 제3 영역의 길이는 약 5 내지 60 개의 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 유전자 표적의 임의의 엑손 또는 인트론을 표적화할 수 있다. 일부 경우에, 가이드는 유전자의 엑손 1 또는 2를 표적화할 수 있으며, 다른 경우에; 가이드는 유전자의 엑손 3 또는 4를 표적화할 수 있다. 조성물은 동일한 엑손을 모두 표적화하는 다중 가이드 RNA 또는 일부 경우에, 상이한 엑손을 표적화할 수 있는 다중 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 유전자의 엑손 및 인트론은 표적화될 수 있다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 약 20 개 뉴클레오티드의 핵산 서열을 표적화할 수 있다. 표적 핵산은 약 20 개 미만 또는 미만의 뉴클레오티드일 수 있다. 표적 핵산은 적어도 또는 적어도 약 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 개, 또는 1 내지 100 개 중 어딘가의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 표적 핵산은 최대 또는 최대 약 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 개, 또는 1 내지 100 개 중 어딘가의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 표적 핵산 서열은 PAM의 제1 뉴클레오티드의 5' 바로 옆에 있는 약 20 개의 염기일 수 있거나 또는 일 수 있다. 가이드 RNA는 핵산 서열을 표적화할 수 있다. 표적 핵산은 적어도 또는 적어도 약 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90, 또는 1-100 개의 뉴클레오티드일 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 가이드 RNA는 또 다른 핵산, 예를 들어, 세포의 게놈에서 표적 핵산 또는 프로토스페이서에 혼성화할 수 있는 핵산을 지칭할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 RNA일 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 핵산의 서열에 부위-특이적으로 결합하도록 프로그램 또는 설계될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 쇄를 포함할 수 있고 단일 가이드 폴리뉴클레오티드라고 불릴 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 2 개의 폴리뉴클레오티드 쇄를 포함할 수 있고 이중 가이드 폴리뉴클레오티드라고 불릴 수 있다. 가이드 RNA는 RNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 시험관 내에서 전사될 수 있고/있거나 화학적으로 합성될 수 있다. RNA는 합성 DNA 분자, 예를 들어, gBlocks® 유전자 단편으로부터 전사될 수 있다. 그런 다음 가이드 RNA는 RNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 가이드 RNA는 또한 비-RNA 핵산 분자, 예를 들어, DNA 분자의 형태로 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA를 암호화하는 DNA는 관심 세포 또는 배아에서 가이드 RNA의 발현을 위한 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. RNA 코딩 서열은 RNA 폴리머라제 III(Pol III)에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 가이드 RNA를 발현하도록 사용될 수 있는 플라스미드 벡터는 px330 벡터 및 px333 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 플라스미드 벡터(예를 들어, px333 벡터)는 적어도 2 개의 가이드 RNA-암호화 DNA 서열을 포함할 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 가이드 RNA 및 표적화 서열을 선택, 설계, 및 검증하기 위한 방법은 본원에 기재되어 있고 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 핵염기 편집기 시스템에서 데아미나제 도메인(예를 들어, AID 도메인)의 잠재적 기질 혼란의 영향을 최소화하기 위해, 탈아미노화에 대해 의도적이지 않게 표적화될 수 있는 다수의 잔기(예를 들어, 표적 핵산 유전자좌 내에서 ssDNA에 잠재적으로 존재할 수 있는 표적외 C 잔기)는 최소화될 수 있다. 또한, 소프트웨어 도구를 사용하여 표적 핵산 서열에 상응하는 gRNA를 최적화할 수 있으며, 예를 들어, 게놈에 걸쳐 총 표적외 활성을 최소화할 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9를 사용한 각각의 가능한 표적화 도메인 선택을 위해, 모든 표적외 서열(선택된 PAM, 예를 들어, NAG 또는 NGG에 선행)은 불일치 염기쌍의 최대 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)를 함유하는 게놈에 걸쳐 식별될 수 있다. 표적 부위에 상보적인 gRNA의 제1 영역이 식별될 수 있고, 모든 제1 영역(예를 들어, crRNA)은 이의 총 예측된 표적외 점수에 따라 순위가 매겨질 수 있으며; 상위 순위의 표적화 도메인은 가장 큰 표적내 및 가장 적은 표적외 활성을 가질 가능성을 나타낸다. 후보 표적화 gRNA는 당업계에 알려지고/지거나 본원에 제시된 바와 같은 방법을 사용하여 기능적으로 평가될 수 있다.
비제한적인 예로서, Cas9와 함께 사용하기 위한 가이드 RNA의 crRNA에서 표적 DNA 하이브리드화 서열은 DNA 서열 검색 알고리즘을 사용하여 식별될 수 있다. gRNA 설계는 Bae S., Park J., & Kim J.-S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014)에 기재된 바와 같은 공공 도구 cas-offinder에 기초한 맞춤형 gRNA 설계 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 이 소프트웨어는 게놈-와이드 표적외 경향을 계산한 후 가이드를 점수화한다. 전형적으로 17 내지 24 길이 범위의 가이드에 대해 완벽한 일치에서 7 개의 불일치에 이르는 일치가 고려된다. 일단 표적외 부위가 컴퓨터를 사용하여 결정되면, 각 가이드에 대해 누계 점수가 계산되고 웹-인터페이스를 사용하여 표 형식 출력으로 요약된다. PAM 서열에 인접한 잠재적인 표적 부위를 식별하는 것 이외에도, 소프트웨어는 또한 선택된 표적 부위와 1, 2, 3 개 또는 3 개 초과의 뉴클레오티드가 상이한 모든 PAM 인접 서열을 식별한다. 표적 핵산 서열, 예를 들어, 표적 유전자에 대한 게놈 DNA 서열이 수득될 수 있고 반복 요소는 공개적으로 이용가능한 도구, 예를 들어, RepeatMasker 프로그램을 사용하여 스크리닝될 수 있다. RepeatMasker는 반복된 요소 및 복잡성이 낮은 영역에 대한 입력 DNA 서열을 검색한다. 출력은 주어진 쿼리 서열에 존재하는 반복의 상세한 주석이다.
식별 후, 가이드 RNA, 예를 들어, crRNA의 제1 영역은 표적 부위까지의 거리, 직교성 및 관련 PAM 서열과의 근접 일치에 대한 5' 뉴클레오티드(예를 들어, 관련 PAM 예를 들어, 에스. 피오게네스의 경우 NGG PAM, 에스. 아우레우스의 경우 NNGRRT 또는 NNGRRV PAM을 함유하는 인간 게놈에서 근접 일치의 식별에 기초한 5'G)의 존재에 기초하여 계단식으로 점수가 매겨질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 직교성은 표적 서열에 대한 최소 수의 불일치를 함유하는 인간 게놈에서 서열의 수를 지칭한다. "높은 수준의 직교성" 또는 "우수한 직교성"은 예를 들어, 의도된 표적 이외에 인간 게놈에서 동일하지 않는 서열, 또는 표적 서열에서 1 또는 2 개의 불일치를 함유하는 임의의 서열을 갖는 20-mer 표적화 도메인을 지칭할 수 있다. 우수한 직교성을 갖는 표적화 도메인은 표적외 DNA 절단을 최소화하도록 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 리포터 시스템은 염기-편집 활성을 검출하고 후보 가이드 폴리뉴클레오티드를 테스트하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 리포터 시스템은 염기 편집 활성이 리포터 유전자의 발현을 야기하는 리포터 유전자 기반 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포터 시스템은 탈활성화된 시작 코돈, 예를 들어, 3'-TAC-5'에서 3'-CAC-5'로의 주형 가닥의 돌연변이를 포함하는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 표적 C의 성공적인 탈아미노화 시, 상응하는 mRNA는 5'-GUG-3' 대신에 5'-AUG-3'으로 전사되어, 리포터 유전자의 번역을 가능하게 할 것이다. 적합한 리포터 유전자는 당업자에게 명백할 것이다. 리포터 유전자의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 루시퍼라제, 분비된 알칼리성 포스페이트(SEAP), 또는 발현이 검출가능하고 당업자에게 명백한 임의의 다른 유전자를 암호화하는 유전자를 포함한다. 리포터 시스템은 예를 들어, 각각의 데아미나제가 표적할 표적 DNA 서열과 관련하여 잔기(들)를 결정하기 위해 많은 상이한 gRNA를 테스트하는 데 사용될 수 있다. 비-주형 가닥을 표적화 하는 sgRNA는 또한 특이적 염기 편집 단백질, 예를 들어, Cas9 데아미나제 융합 단백질의 표적외 효과를 평가하기 위해 테스트될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 gRNA는 돌연변이된 시작 코돈이 gRNA와 염기쌍을 이루지 않도록 설계될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 표준 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드(예를 들어, 슈도우리딘), 리보뉴클레오티드 이성질체, 및/또는 리보뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 검출가능한 표지는 형광단(예를 들어, FAM, TMR, Cy3, Cy5, Texas Red, Oregon Green, Alexa Fluors, Halo 태그, 또는 적합한 형광 염료), 검출 태그(예를 들어, 비오틴, 디곡시게닌 등), 양자점, 또는 금 입자일 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성되거나, 효소적으로 합성되거나, 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 표준 포스포라미다이트-기반 고체-상 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 대안적으로, 가이드 RNA는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 파지 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결함으로써 시험관 내에서 합성될 수 있다. 적합한 파지 프로모터 서열의 예는 T7, T3, SP6 프로모터 서열, 또는 이의 변이체를 포함한다. 가이드 RNA가 2 개의 별개의 분자(예를 들어, crRNA 및 tracrRNA)를 포함하는 구현예에서, crRNA는 화학적으로 합성될 수 있고 tracrRNA는 효소적으로 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 다중 가이드 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, gRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA는 염기 편집기 시스템에 포함된 하나 이상의 표적 유전자좌(예를 들어, 적어도 1 개의 gRNA, 적어도 2 개의 gRNA, 적어도 5 개의 gRNA, 적어도 10 개의 gRNA, 적어도 20 개의 gRNA, 적어도 30 개의 g RNA, 적어도 50 개의 gRNA)를 표적화할 수 있다. 다중 gRNA 서열은 나란히 배열될 수 있고 바람직하게는 직접 반복에 의해 분리된다.
가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 DNA 서열은 또한 벡터의 일부일 수 있다. 또한, 벡터는 추가적인 발현 제어 서열(예를 들어, 인핸서 서열, Kozak 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선택가능한 마커 서열(예를 들어, GFP 또는 퓨로마이신과 같은 항생제 내성 유전자), 복제 기점 등을 포함할 수 있다. 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 분자는 또한 선형일 수 있다. 가이드 RNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 DNA 분자는 또한 원형일 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템의 하나 이상의 구성요소는 DNA 서열에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 DNA 서열은 함께 또는 별도로 발현 시스템, 예를 들어, 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 서열은 세포 내로 도입될 수 있으며, 각각의 DNA 서열은 별개의 분자의 일부일 수 있거나(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 코딩 서열을 함유하는 하나의 벡터 및 가이드 RNA 코딩 서열을 함유하는 제 벡터)일 수 있거나 또는 둘 다 동일한 분자의 일부일 수 있다(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및 가이드 RNA 둘 다에 대한 코딩(및 조절) 서열을 함유하는 하나의 벡터).
가이드 폴리뉴클레오티드는 새롭거나 또는 향상된 특징을 갖는 핵산을 제공하도록 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 핵산 친화성 태그를 포함할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 합성 뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드 유도체, 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 경우에, gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 변형을 포함할 수 있다. 변형은 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드의 임의의 위치에서 이루어질 수 있다. 하나 초과의 변형은 단일 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 변형 후 품질 관리를 겪을 수 있다. 일부 경우에, 품질 관리는 PAGE, HPLC, MS, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드의 변형은 치환, 삽입, 결실, 화학적 변형, 물리적 변형, 안정화, 정제, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 또한 5'아데닐레이트, 5'구아노신-트리포스페이트 캡, 5'N7-메틸구아노신-트리포스페이트 캡, 5'트리포스페이트 캡, 3'포스페이트, 3'티오포스페이트, 5'포스페이트, 5'티오포스페이트, Cis-Syn 티미딘 이량체, 삼량체, C12 스페이서, C3 스페이서, C6 스페이서, dSpacer, PC 스페이서, rSpacer, Spacer 18, Spacer 9,3'-3' 변형, 5'-5' 변형, 무염기성, 아크리딘, 아조벤젠, 비오틴, 비오틴 BB, 비오틴 TEG, 콜레스테릴 TEG, 데스티오비오틴 TEG, DNP TEG, DNP-X, DOTA, dT-비오틴, 이중 비오틴, PC 비오틴, 소랄렌 C2, 소랄렌 C6, TINA, 3'DABCYL, 블랙 홀 퀀처 1, 블랙 홀 퀀서 2, DABCYL SE, dT-DABCYL, IRDye QC-1, QSY-21, QSY-35, QSY-7, QSY-9, 카르복실 링커, 티올 링커, 2'-데옥시리보뉴클레오시드 유사체 퓨린, 2'-데옥시리보뉴클레오시드 유사체 피리미딘, 리보뉴클레오시드 유사체, 2'-O-메틸 리보뉴클레오시드 유사체, 당 변형된 유사체, 워블(wobble)/보편적 염기, 형광 염료 라벨, 2'-플루오로 RNA, 2'-O-메틸 RNA, 메틸포스포네이트, 포스포디에스테르 DNA, 포스포디에스테르 RNA, 포스포티오에이트 DNA, 포스포로티오에이트 RNA, UNA, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 5'-메틸사이티딘-5'-트리포스페이트, 또는 이의 임의의 조합에 의해 변형될 수 있다.
일부 경우에, 변형은 영구적이다. 다른 경우에, 변형은 일시적이다. 일부 경우에, 다중 변형은 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드 변형은 형태, 극성, 소수성, 화학적 반응성, 염기-쌍형성 상호작용, 또는 이의 임의의 조합과 같은 뉴클레오티드의 물리화학적 특성을 변경시킬 수 있다.
변형은 또한 포스포로티오에이트 대체물일 수 있다. 일부 경우에, 천연 포스포디에스테르 결합은 세포 뉴클레아제에 의한 빠른 분해에 민감할 수 있고; 포스포로티오에이트(PS) 결합 대체물을 사용한 뉴클레오티드간 연결의 변형은 세포 분해에 의한 가수분해에 대해 보다 안정될 수 있다. 변형은 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드에서 안정성을 증가시킬 수 있다. 변형은 또한 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다. 일부 경우에, 포스포로티오에이트 향상된 RNA gRNA는 RNase A, RNase T1, 송아지 혈청 뉴클레아제, 또는 이의 임의의 조합을 억제할 수 있다. 이러한 특성은 뉴클레아제에 대한 노출이 생체내 또는 시험관 내에서 높은 확률로 이루어지는 적용에서 사용되도록 PS-RNA gRNA의 사용을 허용할 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트(PS) 결합은 엑소뉴클레아제 분해를 억제할 수 있는 gRNA의 5'- 또는 "-단부에서 마지막 3-5 개의 뉴클레오티드 사이에 도입될 수 있다. 일부 경우에, 포스포로티오에이트 결합은 엔도뉴클레아제에 의한 공격을 줄이기 위해 전체 gRNA 전반에 걸쳐 첨가될 수 있다.
프로토스페이서
인접 모티프
용어 "프로토스페이서 인접 모티프(PAM)" 또는 PAM-유사 모티프는 CRISPR 박테리아 적응 면역 시스템에서 Cas9 뉴클레아제에 의해 표적화된 DNA 서열 바로 다음에 있는 2-6 개의 염기 쌍 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' PAM(즉, 프로토스페이서의 5' 단부의 상류에 위치)일 수 있다. 다른 구현예에서, PAM은 3' PAM(즉, 프로토스페이서의 5' 단부의 하루에 위치)일 수 있다.
PAM 서열은 표적 결합에 필수적이지만, 정확한 서열은 Cas 단백질의 유형에 따라 달라진다. PAM 서열은 당업계에 알려진 임의의 PAM 서열일 수 있다. 적합한 PAM 서열은 NGG, NGA, NGC, NGN, NGT, NGTT, NGCG, NGAG, NGAN, NGNG, NGCN, NGCG, NGTN, NNGRRT, NNNRRT, NNGRR(N), TTTV, TYCV, TYCV, TATV, NNNNGATT, NNAGAAW, 또는 NAAAAC를 포함하나 이에 제한되지 않는다. Y는 피리미딘이고; N은 임의의 뉴클레오티드 염기이고; W는 A 또는 T이다.
본원에 제공된 염기 편집기는 표준 또는 비-표준 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 결합할 수 있는 CRISPR 단백질-유래 도메인을 포함할 수 있다. PAM 부위는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 근접한 뉴클레오티드 서열이다. 본원의 일부 측면은 상이한 PAM 특이성을 갖는 CRISPR 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 염기 편집기를 제공한다. 예를 들어, 전형적으로 에스. 피오게네스로부터의 Cas9(spCas9)와 같은 Cas9 단백질은 특정 핵산 영역에 결합하기 위해 표준 NGG PAM 서열을 필요로 하며, 여기서 "NGG"의 "N"은 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 또는 사이토신(C)이고, G는 구아닌이다. PAM은 CRISPR 단백질-특이적일 수 있고 상이한 CRISPR 단백질-유래 도메인을 포함하는 상이한 염기 편집기 사이에 상이할 수 있다. PAM은 표적 서열의 5' 또는 3'일 수 있다. PAM은 표적 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. PAM은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 종종, PAM은 2 내지 6 개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, PAM은 "NRN" PAM이며 여기서 "NRN"의 "N"은 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 또는 사이토신(C)이고, R은 아데닌(A) 또는 구아닌(G)이거나; PAM은 "NYN" PAM이며, 여기서 NYN의 "N"은 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 또는 사이토신(C)이고, Y는 사이티딘(C) 또는 티민(T)이며, 예를 들어, R.T. Walton 등, 2020, Science, 10.1126/science.aba8853 (2020)에 기재된 바와 같고, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 여러 PAM 변이체는 표 1e에 기재되어 있다.
표 1e.
Cas9
단백질 및 상응하는 PAM 서열
일부 구현예에서, PAM은 NGC이다. 일부 구현예에서, NGC PAM은 Cas9 변이체, 예를 들어, SpCas9 변이체에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, NGC PAM 변이체는 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R(집합적으로 "MQKFRAER"이라고 불림)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, PAM은 NGT이다. 일부 구현예에서, NGT PAM은 Cas9 변이체에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하나 이상의 잔기 1335, 1337, 1135, 1136, 1218, 및/또는 1219에서 표적화된 돌연변이를 통해 생성된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하나 이상의 잔기 1219, 1335, 1337, 1218에서 표적화된 돌연변이를 통해 생성된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하나 이상의 잔기 1135, 1136, 1218, 1219, 및 1335에서 표적화된 돌연변이를 통해 생성된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하기 표 2 및 3에 제공된 표적화된 돌연변이의 세트로부터 선택된다.
표 2:
잔기
1219, 1335, 1337, 1218에서
NGT
PAM
변이체
돌연변이
표 3: 잔기 1135, 1136, 1218, 1219, 및 1335에서 NGT PAM 변이체 돌연변이
일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 표 2 및 3에서 변이체 5, 7, 28, 31, 또는 36으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변이체는 개선된 NGT PAM 인식을 갖는다.
일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 잔기 1219, 1335, 1337, 및/또는 1218에서 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하기 표 4에 제공된 변이체로부터 개선된 인식을 위한 돌연변이로 선택된다.
표 4:
잔기
1219, 1335, 1337, 및
1218에서
NGT
PAM
변이체
돌연변이
일부 구현예에서, NGT PAM은 하기 표 5에 제공된 변이체로부터 선택된다.
표 5.
NGT
PAM
변이체
일부 구현예에서 NGTN 변이체는 변이체 1이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 2이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 3이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 4이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 5이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 6이다.
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 도메인(SpCas9)이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SpCas9, 뉴클레아제 불활성 SpCas9(SpCas9d), 또는 SpCas9 닉카제(SpCas9n)이다. 일부 구현예에서, SpCas9는 D9X 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 D를 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9는 D9A 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인, SpCas9d 도메인, 또는 SpCas9n 도메인은 비-표준 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인, SpCas9d 도메인, 또는 SpCas9n 도메인은 NGG, NGA, 또는 NGCG PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135X, R1335X, 및 T1337X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135E, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135E, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135X, R1335X, 및 T1337X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135V, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135V, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135X, G1218X, R1335X, 및 T1337X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135V, G1218R, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135V, G1218R, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 Cas9 도메인은 본원에 기재된 Cas9 폴리펩티드와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 Cas9 도메인은 본원에 기재된 임의의 Cas9 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 Cas9 도메인은 본원에 기재된 임의의 Cas9 폴리펩티드의 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 예에서, 본원에 개시된 염기 편집기의 CRISPR 단백질-유래 도메인에 의해 인식된 PAM은 염기 편집기를 암호화하는 삽입물(예를 들어, AAV 삽입물)에 대한 별개의 올리고뉴클레오티드 상의 세포에 제공될 수 있다. 이러한 구현예에서, 별개의 올리고뉴클레오티드 상에 PAM을 제공하는 것은 달리 절단될 수 없는 표적 서열의 절단을 허용할 수 있는데, 표적 서열과 동일한 폴리뉴클레오티드 상에 인접한 PAM이 존재하지 않기 때문이다.
구현예에서, 에스. 피오게네스 Cas9(SpCas9)는 게놈 조작을 위한 CRISPR 엔도뉴클레아제로 사용될 수 있다. 그러나, 다른 것이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 엔도뉴클레아제를 사용하여 특정 게놈 표적을 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-NGG PAM 서열을 갖는 합성 SpCas9-유래 변이체가 사용될 수 있다. 추가적으로, 다양한 종으로부터의 다른 Cas9 오솔로그가 식별되었고 이러한 "비-SpCas9"는 또한 본 개시내용에 유용할 수 있는 다양한 PAM 서열에 결합할 수 있다. 예를 들어, SpCas9의 비교적 큰 크기(대략 4kb 코딩 서열)는 세포에서 효율적으로 발현될 수 없는 SpCas9 cDNA를 운반하는 플라스미드를 야기할 수 있다. 반대로, 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9(SaCas9)에 대한 코딩 서열은 SpCas9보다 대략 1 킬로염기 더 짧으며, 아마 세포에서 효율적으로 발현되게 한다. SpCas9와 유사하게, SaCas9 엔도뉴클레아제는 시험관내에서 포유류 세포 및 생체내에서 마우스의 표적 유전자를 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 상이한 PAM 서열을 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 예를 들어 Cas9 PAM, 5'-NGG에 인접할 수 있다. 다른 구현예에서, 다른 Cas9 오솔로그는 상이한 PAM 요건을 가질 수 있다. 예를 들어, 에스. 써모필루스(CRISPR1의 경우 5'-NNAGAA 및 CRISPR3의 경우 5'-NGGNG) 및 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningiditis)(5'-NNNNGATT)의 PAM과 같은 다른 PAM가 또한 표적 유전자에 인접한 것으로 밝혀질 수 있다.
일부 구현예에서, 에스. 피오게네스 시스템의 경우, 표적 유전자 서열은 5'-NGG PAM에 선행할 수 있고(즉, 5'으로), 20-nt 가이드 RNA 서열은 반대 가닥과 염기 쌍을 이루어 PAM에 인접한 Cas9를 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, 인접한 절단은 PAM의 상류에 있는 약 3 개의 염기 쌍일 수 있거나 또는 일 수 있다. 일부 구현예에서, 인접한 절단은 PAM의 상류에 있는 약 10 개의 염기 쌍일 수 있거나 또는 일 수 있다. 일부 구현예에서, 인접한 절단은 PAM의 상류에 있는 약 0-20 개의 염기 쌍일 수 있거나 또는 일 수 있다. 예를 들어, 인접한 절단은 PAM의 상류에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개의 염기 쌍 옆에 있을 수 있다. 인접한 절단은 또한 1 내지 30 개의 염기 쌍에 의해 PAM의 하류에 있을 수 있다. PAM 서열을 결합할 수 있는 예시적인 SpCas9 단백질의 서열은 하기와 같다:
예시적인 PAM-결합 SpCas9의 아미노산 서열을 하기와 같다:
예시적인 PAM-결합 SpCas9n의 아미노산 서열은 하기와 같다:
예시적인 PAM-결합 SpEQR Cas9의 아미노산 서열은 하기와 같다:
이 서열에서, D1135, R1335, 및 T1337로부터 돌연변이되어 SpEQR Cas9를 산출할 수 있는 잔기 E1135, Q1335 및 R1337은 밑줄 그어져 있고 굵은 글씨로 표시된다.
예시적인 PAM-결합 SpVQR Cas9의 아미노산 서열은 하기와 같다:
이 서열에서, D1135, R1335, 및 T1337로부터 돌연변이되어 SpVQR Cas9를 산출하는 잔기 V1135, Q1335, 및 R1337은 밑줄 그어져 있고 굵은 글씨로 표시된다.
예시적인 PAM-결합 SpVRER Cas9의 아미노산 서열은 하기와 같다:
상기 서열에서, D1134, G1218, R1335, 및 T1337로부터 돌연변이되어 SpVRER Cas9를 산출하는 잔기 V1135, R1218, Q1335, 및 R1337은 밑줄 그어져 있고 굵은 글씨로 표시된다.
일부 구현예에서, 조작된 SpCas9 변이체는 3'H(비-G PAM)에 의해 플랭킹된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있다(표 1a-1e 참조). 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 NRNH PAM(여기서 R은 A 또는 G이고 H는 A, C 또는 T임)을 인식한다. 일부 구현예에서, 비-G PAM은 NRRH, NRTH, 또는 NRCH이다(예를 들어, Miller, S.M., 등 Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs, Nat. Biotechnol . (2020)를 참조하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다).
일부 구현예에서, Cas9 도메인은 재조합 Cas9 도메인이다. 일부 구현예에서, 재조합 Cas9 도메인은 SpyMacCas9 도메인이다. 일부 구현예에서, SpyMacCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SpyMacCas9, 뉴클레아제 불활성 SpyMacCas9(SpyMacCas9d), 또는 SpyMacCas9 닉카제(SpyMacCas9n)이다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인, 또는 SaCas9n 도메인은 비-표준 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SpyMacCas9 도메인, SpCas9d 도메인, 또는 SpCas9n 도메인은 NAA PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다.
천연 5'-NAAN-3' PAM 특이성을 갖는 스트렙토코쿠스 마카카에(Streptococcus macacae)에서 Spy Cas9의 예시적인 Cas9 A 상동체의 서열은 당업계에 알려져 있고 예를 들어, Jakimo 등, (www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2018/09/27/429654.full.pdf)에 의해 기재되어 있으며, 하기에 제공된다.
SpyMacCas9
일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1218A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA 또는 RNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 유지한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질은 D10A, H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1218A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 유지한다. 일부 경우에, 변이체 Cas9 단백질이 W476A 및 W1126A 돌연변이를 보유하거나 또는 변이체 Cas9 단백질이 P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1218A 돌연변이를 보유할 때, 변이체 Cas9 단백질은 PAM 서열에 효율적으로 결합하지 않는다. 따라서, 일부 이러한 경우에, 이러한 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용될 때, 방법은 PAM 서열을 필요로 하지 않는다. 다시 말해서, 일부 경우에, 이러한 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용될 때, 방법은 가이드 RNA를 포함할 수 있지만, 방법은 PAM 서열의 부재 하에 수행될 수 있다(그리고 따라서 결합의 특이성은 가이드 RNA의 표적화 분절에 의해 제공된다). 다른 잔기는 상기 효과를 달성하기 위해 돌연변이될 수 있다(즉, 하나 또는 다른 뉴클레아제 부분을 불활성화시킨다). 비제한적인 예로서, 잔기 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, 및/또는 A987은 변경(즉, 치환)될 수 있다. 또한, 알라닌 치환 이외의 돌연변이가 적합하다.
일부 구현예에서, 염기 편집기의 CRISPR 단백질-유래 도메인은 표준 PAM 서열(NGG)을 갖는 Cas9 단백질의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 염기 편집기의 Cas9-유래 도메인은 비-표준 PAM 서열을 이용할 수 있다. 이러한 서열은 당업계에 기재되어 있고 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 비-표준 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 Kleinstiver, B. P., 등, "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015); 및 Kleinstiver, B. P., 등, "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015); R.T. Walton 등 "Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants" Science 10.1126/science.aba8853 (2020); Hu 등 "Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity," Nature, 2018 Apr. 5, 556(7699), 57-63; S. Miller 등, "Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs" Nat. Biotechnol., 2020 Apr;38(4):471-481에 기재되어 있으며; 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 예로서, S. Miller 등(상기 2020)은 NRNH PAM(여기서 R은 A 또는 G이고 H는 A, C 또는 T임)과 같은 비-G PAM을 종합적으로 인식하는 SpCas9 변이체를 기재하고 있다.
Cas9
도메인 및
사이티딘
데아미나제
및/또는 아데노신
데아미나제를
포함하는 융합 단백질
본 개시내용의 일부 측면은 Cas9 도메인 또는 다른 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 및 하나 이상의 아데노신 데아미나제 도메인, 사이티딘 데아미나제 도메인, 및/또는 DNA 글리코실라제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. Cas9 도메인은 본원에 제공된 Cas9 도메인 또는 Cas9 단백질(예를 들어, dCas9 또는 nCas9) 중 임의의 것일 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 Cas9 도메인 또는 Cas9 단백질(예를 들어, dCas9 또는 nCas9) 중 임의의 것은 본원에 기재된 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제 중 임의의 것과 융합될 수 있다. 본원에 개시된 염기 편집기의 도메인은 임의의 순서로 배열될 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 하기 도메인 A-C, A-D, 또는 A-E를 포함한다:
NH2-[A-B-C]-COOH;
NH2-[A-B-C-D]-COOH; 또는
NH2-[A-B-C-D-E]-COOH;
여기서 A 및 C 또는 A, C, 및 E는 각각 하기 중 하나 이상을 포함하고:
아데노신 데아미나제 도메인 또는 이의 활성 단편,
사이티딘 데아미나제 도메인 또는 이의 활성 단편,
DNA 글리코실라제 도메인 또는 이의 활성 단편;
여기서 B 또는 B 및 D는 각각 핵산 서열 특이적 결합 활성을 갖는 하나 이상의 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 하기 구조를 포함한다:
NH2-[An-Bo-Cn]-COOH;
NH2-[An-Bo-Cn-Do]-COOH; 또는
NH2-[An-Bo-Cp-Do-Eq]-COOH;
여기서 A 및 C 또는 A, C, 및 E는 각각 하기 중 하나 이상을 포함하고:
아데노신 데아미나제 도메인 또는 이의 활성 단편,
사이티딘 데아미나제 도메인 또는 이의 활성 단편,
DNA 글리코실라제 도메인 또는 이의 활성 단편;
여기서 n은 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수이고, 여기서 p는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수이고; 여기서 q는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수이고; 여기서 B 또는 B 및 D는 각각 핵산 서열 특이적 결합 활성을 갖는 도메인을 포함하고; 여기서 o는 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수이다.
예를 들어, 그리고 제한 없이, 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하기 구조를 포함한다:
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-[Cas9 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[사이티딘 데아미나제]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나제]-[사이티딘 데아미나제]-COOH; 또는
NH2-[Cas9 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-COOH.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 Cas12 도메인 또는 Cas12 단백질 중 임의의 것은 본원에 제공된 사이티딘 또는 아데노신 데아미나제 중 임의의 것과 융합될 수 있다. 예를 들어, 그리고 제한 없이, 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하기 구조를 포함한다:
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[Cas12 도메인]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas12 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[사이티딘 데아미나제]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[아데노신 데아미나제]-[사이티딘 데아미나제]-COOH; 또는
NH2-[Cas12 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-COOH.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 아데노신 데아미나제는 TadA*8 및 사이티딘 데아미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, TadA*8은 TadA*8.1, TadA*8.2, TadA*8.3, TadA*8.4, TadA*8.5, TadA*8.6, TadA*8.7, TadA*8.8, TadA*8.9, TadA*8.10, TadA*8.11, TadA*8.12, TadA*8.13, TadA*8.14, TadA*8.15, TadA*8.16, TadA*8.17, TadA*8.18, TadA*8.19, TadA*8.20, TadA*8.21, TadA*8.22, TadA*8.23, 또는 TadA*8.24이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 아데노신 데아미나제는 TadA*9 및 사이티딘 데아미나제를 포함한다.
예시적인 융합 단백질 구조는 하기를 포함한다:
NH2-[TadA*8]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-[Cas9 도메인]-[TadA*8]-COOH;
NH2-[TadA*8]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[TadA*8]-COOH;
NH2-[TadA*9]-[Cas9 도메인]-COOH;
NH2-[Cas9 도메인]-[TadA*9]-COOH;
NH2-[TadA*9]-[Cas12 도메인]-COOH;
NH2-[Cas12 도메인]-[TadA*9]-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas9/12]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[Cas9/12]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[TadA*8]-[Cas9/12]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[Cas9/12]-[TadA*8]-COOH;
NH2-[TadA*9]-[Cas9/12]-[사이티딘 데아미나제]-COOH; 또는
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[Cas9/12]-[TadA*9]-COOH.
일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제, 무염기성 편집기, 및/또는 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp(예를 들어, Cas9 도메인)를 포함하는 융합 단백질은 링커 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 링커는 사이티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 도메인 및 napDNAbp 사이에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 일반적인 구조에 사용되는 "-"는 임의적인 링커의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp는 본원에 제공된 임의의 링커를 통해 융합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 사이티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp는 본원에 제공된 임의의 링커를 통해 융합된다.
본 개시내용의 융합 단백질은 하나 이상의 추가적인 특징을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 융합 단백질은 억제제, 세포질 국소화 서열, 핵 외수송 서열과 같은 외수송 서열, 또는 다른 국소화 서열, 뿐만 아니라 융합 단백질의 가용화, 정제, 또는 검출에 유용한 서열 태그를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 적합한 단백질 태그는 비오틴 카르복실라제 운반체 단백질(BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌(HA)-태그, 히스티딘 태그 또는 His-태그로도 지칭되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질(MBP)-태그, nus-태그, 글루타니온-S-트랜스퍼라제(GST)-태그, 녹색 형광 단백질(GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, Softag(예를 들어, Softag 1, Softag 3), strep-태그, 비오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그, 및 SBP-태그를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가적인 적합한 서열은 당업자에게 명백할 것이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 His 태그를 포함한다.
예시적이지만, 비제한적인 융합 단백질은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/044935, PCT/US2019/044935 및 PCT/US2020/016288에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
핵
국소화
서열(
NLS
)을 포함하는 융합 단백질
일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5 개)의 핵 표적화 서열, 예를 들어 핵 국소화 서열(NLS)을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 이분 NLS가 사용된다. 일부 구현예에서, NLS는 NLS를 포함하는 단백질의 세포 핵 내로의 유입(예를 들어, 핵 수송체에 의함)을 용이하게 하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 핵 국소화 서열(NLS)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, NLS는 융합 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 융합 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 Cas9 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 nCas9 도메인 또는 dCas9 도메인의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 데아미나제의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 데아미나제의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 하나 이상의 링커를 통해 융합 단백질에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 링커 없이 융합 단백질에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 본원에 제공되거나 또는 참조된 NLS 서열 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 추가적인 핵 국소화 서열은 당업계에 알려져 있고 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, NLS 서열은 Plank 등의 PCT/EP2000/011690에 기재되어 있으며, 이의 내용은 예시적인 핵 국소화 서열의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, NLS는 아미노산 서열 PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV, KRTADGSEFESPKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, KKTELQTTNAENKTKKL, KRGINDRNFWRGENGRKTR, RKSGKIAAIVVKRPRKPKKKRKV, 또는 MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC를 포함한다.
일부 구현예에서, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나제, Cas9 도메인, 및 NLS을 포함하는 융합 단백질은 링커 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 도메인 또는 단백질(예를 들어, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나제, Cas9 도메인 또는 NLS) 중 하나 이상 사이에 링커 서열이 존재한다. 일부 구현예에서, 링커는 사이티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 도메인 및 napDNAbp 사이에 존재한다. 일부 구현예에서, 하기 일반적인 구조에 사용되는 "-"는 임의적인 링커의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp는 본원에 제공된 링커 중 임의의 것을 통해 융합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 사이티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp는 본원에 제공된 링커 중 임의의 것을 통해 융합된다.
일부 구현예에서, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp(예를 들어, Cas9 또는 Cas12) 도메인이 있는 예시적인 napDNAbp(예를 들어, Cas9 또는 Cas12) 융합 단백질의 일반적인 구조는 하기 구조 중 임의의 하나를 포함하며, 여기서 NLS은 핵 국소화 서열(예를 들어, 본원에 제공된 임의의 NLS)이고, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다:
NH2-NLS-[사이티딘 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-COOH;
NH2-NLS [napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-NLS-COOH;
NH2-[napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-NLS-COOH;
NH2-NLS-[아데노신 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-COOH;
NH2-NLS [napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-NLS-COOH;
NH2-[napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나제]-NLS-COOH;
NH2-NLS-[사이티딘 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-NLS-[아데노신 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-NLS-[아데노신 데아미나제] [사이티딘 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-COOH;
NH2-NLS-[사이티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-COOH;
NH2-NLS-[napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나제]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-NLS-[napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나제]-NLS-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-NLS-COOH;
NH2-[아데노신 데아미나제] [사이티딘 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-NLS-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-[napDNAbp 도메인]-NLS-COOH;
NH2-[napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나제]-[사이티딘 데아미나제]-NLS-COOH; 또는
NH2-[napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나제]-[아데노신 데아미나제]-NLS-COOH.
일부 구현예에서, NLS는 링커에 존재하거나 또는 NLS는 링커, 예를 들어, 본원에 기재된 링커에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, N-말단 또는 C-말단 NLS는 이분 NLS이다. 이분 NLS는 비교적 짧은 스페이서 서열에 의해 분리된 2 개의 염기성 아미노산 클러스터를 포함한다(따라서 이분 - 2 부분, 반면에 단분 NLS는 아니다). 뉴클레오플라스민의 NLS인 KR[PAATKKAGQA]KKKK는 보편적인 이분 신호의 원형이다: 약 10 개 아미노산의 스페이서에 의해 분리되는 염기성 아미노산의 2 개의 클러스터. 예시적인 이분 NLS의 서열은 하기와 같다:
PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV.
하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함하는 CRISPR 효소를 암호화하는 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개의 NLS가 사용될 수 있거나 또는 사용된다. CRISPR 효소는 암모-말단에서 또는 근처에서 NLS, 카르복시-말단에서 또는 근처에서 약 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 초과의 NLS, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어, 아미노-말단에서 하나 이상의 NLS 및 카르복시 말단에서 하나 이상의 NLS)을 포함할 수 있다. 하나 초과의 NLS가 존재하는 경우, 각각은 서로 독립적으로 선택될 수 있어서, 단일 NLS가 하나 초과의 카피에 및/또는 하나 이상의 카피에 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합하여 존재할 수 있도록 한다.
방법에 사용되는 CRISPR 효소는 약 6 개의 NLS를 포함할 수 있다. NLS는 NLS에 가장 가까운 아미노산이 N- 또는 C-말단으로부터 폴리펩티드 쇄를 따라 약 50 개 아미노산 이내, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50 개 아미노산 이내에 있을 때 N- 또는 C-말단 근처로 간주된다.
내부 삽입이 있는 융합 단백질
본원에는 핵산 프로그램가능한 핵산 결합 단백질, 예를 들어, napDNAbp에 융합된 이종 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 이종 폴리펩티드는 천연 또는 야생형 napDNAbp 폴리펩티드 서열에서 발견되지 않는 폴리펩티드일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 napDNAbp의 C-말단 단부, napDNAbp의 N-말단 단부에서 napDNAbp에 융합되거나, 또는 napDNAbp의 내부 위치에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 napDNAbp의 내부 위치에 삽입된다.
일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 데아미나제 또는 기능적 이의 단편이다. 예를 들어, 융합 단백질은 Cas9 또는 Cas12(예를 들어, Cas12b/C2c1), 폴리펩티드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 데아미나제를 포함할 수 있다. 융합 단백질에서 데아미나제는 아데노신 데아미나제일 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA(예를 들어, TadA*7.10, TadA*8 또는 TadA*9)이다. 일부 구현예에서, TadA는 TadA*8이다. 본원에 기재된 바와 같은 TadA 서열(예를 들어, TadA7.10, TadA*8 또는 TadA*9)은 상기 기재된 융합 단백질에 적합한 데아미나제이다.
데아미나제는 원형 치환체 데아미나제일 수 있다. 예를 들어, 데아미나제는 원형 치환체 아데노신 데아미나제일 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 넘버링된 바와 같이 아미노산 잔기 116에서 원형으로 치환된 원형 치환체 TadA이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 넘버링된 바와 같이 아미노산 잔기 136에서 원형으로 치환된 원형 치환체 TadA이다. 일부 구현예에서, 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 넘버링된 바와 같이 아미노산 잔기 65에서 원형으로 치환된 원형 치환체 TadA이다.
융합 단백질은 하나 초과의 데아미나제를 포함할 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 개 이상의 데아미나제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나의 데아미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 2 개의 데아미나제를 포함한다. 융합 단백질에서 2 개 이상의 데아미나제는 아데노신 데아미나제. 사이티딘 데아미나제, 또는 이의 조합일 수 있다. 2 개 이상의 데아미나제는 동종이량체일 수 있다. 2 개 이상의 데아미나제는 이종이량체일 수 있다. 2 개 이상의 데아미나제는 napDNAbp에서 나란히 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 데아미나제는 napDNAbp에서 나란히 있지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질에서 napDNAbp는 Cas9 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. Cas9 폴리펩티드는 변이체 Cas9 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 Cas9 닉카제(nCas9) 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 뉴클레아제 사멸된 Cas9(dCas9) 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 융합 단백질에서 Cas9 폴리펩티드는 전장 Cas9 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 융합 단백질에서 Cas9 폴리펩티드는 전장 Cas9 폴리펩티드가 아닐 수 있다. Cas9 폴리펩티드는 자연 발생 Cas9 단백질에 비해 예를 들어, N-말단 또는 C-말단 단부에서 절두될 수 있다. Cas9 폴리펩티드는 원형으로 치환된 Cas9 단백질일 수 있다. Cas9 폴리펩티드는 여전히 표적 폴리뉴클레오티드 및 가이드 핵산 서열에 결합할 수 있는 Cas9 폴리펩티드의 단편, 일부, 또는 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9(SpCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9(SaCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 1 Cas9(St1Cas9), 또는 이의 단편 또는 변이체이다.
융합 단백질의 Cas9 폴리펩티드는 자연 발생 Cas9 폴리펩티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
융합 단백질의 Cas9 폴리펩티드는 하기 제시된 Cas9 아미노산 서열(하기 "Cas9 참조 서열"로 불림)과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
Cas9 폴리펩티드의 N- 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 이종 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질은 또한 본원에 기재된 바와 같은 방법에서 염기 편집에 유용하다. Cas9 및 하나 이상의 데아미나제 도메인, 예를 들어, 아데노신 데아미나제를 포함하거나, 또는 Cas9 서열에 의해 플랭킹된 아데노신 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질은 또한 표적 서열의 고도로 특이적이고 효율적인 염기 편집에 유용하다. 구현예에서, 키메라 Cas9 융합 단백질은 Cas9 폴리펩티드 내에 삽입된 이종 촉매 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)를 함유한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 내에 삽입된 아데노신 데아미나제 도메인 및 사이티딘 데아미나제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 Cas9 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 Cas9 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제는 Cas9 내에서 융합되고 아데노신 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제는 Cas9 내에서 융합되고 아데노신 데아미나제는 N-말단에 융합된다.
아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제 및 Cas9를 갖는 융합 단백질의 예시적인 구조는 하기와 같이 제공된다:
NH2-[Cas9(아데노신 데아미나제)]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[Cas9(아데노신 데아미나제)]-COOH;
NH2-[Cas9(사이티딘 데아미나제)]-[아데노신 데아미나제]-COOH; 또는
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas9(사이티딘 데아미나제)]-COOH.
일부 구현예에서, 상기 일반적인 구조에서 사용되는 "-"는 임의적인 링커의 존재를 나타낸다.
다양한 구현예에서, 촉매 도메인은 DNA 변형 활성(예를 들어, 데아미나제 활성), 예컨대 아데노신 데아미나제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA(예를 들어, TadA*7.10)이다. 일부 구현예에서, TadA는 TadA*8 또는 TadA*9이다. 일부 구현예에서, TadA*8 또는 TadA*9는 Cas9 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, TadA*8 또는 TadA*9는 Cas9 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제는 Cas9 내에서 융합되고 TadA*8 또는 TadA*9는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제는 Cas9 내에서 융합되고 TadA*8 또는 TadA*9는 N-말단에 융합된다. TadA*8 또는 TadA*9 및 사이티딘 데아미나제 및 Cas9를 갖는 융합 단백질의 예시적인 구조는 하기와 같이 제공된다:
NH2-[Cas9(TadA*8 또는 TadA*9)]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[Cas9(TadA*8 또는 TadA*9)]-COOH;
NH2-[Cas9(사이티딘 데아미나제)]-[TadA*8 또는 TadA*9]-COOH; 또는
NH2-[TadA*8 또는 TadA*9]-[Cas9(사이티딘 데아미나제)]-COOH.
일부 구현예에서, 상기 일반적인 구조에서 사용되는 "-"는 임의적인 링커의 존재를 나타낸다.
이종 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나제)는 예를 들어 적합한 위치에서 napDNAbp(예를 들어, Cas9 또는 Cas12(예를 들어, Cas12b/C2c1))에 삽입될 수 있어서, napDNAbp가 표적 폴리뉴클레오티드 및 가이드 핵산에 결합하는 능력을 유지하도록 한다. 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 데아미나제의 기능(예를 들어, 염기 편집 활성) 또는 napDNAbp(예를 들어, 표적 핵산 및 가이드 핵산에 결합하는 능력)를 손상시키지 않고 napDNAbp 내로 삽입될 수 있다. 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 예를 들어, 무질서한 영역 또는 결정학 연구에 의해 제시된 바와 같이 고온 인자 또는 B-인자를 포함하는 영역에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 질서가 적거나, 무질서하거나, 또는 구조화되지 않은 단백질의 영역, 예를 들어 용매 노출된 영역 및 루프는 구조 또는 기능을 손상시키지 않고 삽입에 사용될 수 있다. 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 유연한 루프 영역 또는 용매-노출된 영역에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 Cas9 또는 Cas12b/C2c1 폴리펩티드의 유연한 루프에 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)의 삽입 위치는 Cas9 폴리펩티드의 결정 구조의 B-인자 분석에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 평균보다 더 높은 B-인자(예를 들어, 총 단백질 또는 무질서한 영역을 포함하는 단백질 도메인과 비교하여 더 높은 B 인자)를 포함하는 Cas9 폴리펩티드의 영역에 삽입된다. B-인자 또는 온도 인자는 평균 위치에서 원자의 변동을 나타낼 수 있다(예를 들어, 온도-의존적 원자 진동 또는 결정 격자에서 정적 무질서의 결과). 백본 원자에 대한 높은 B-인자(예를 들어, 평균보다 더 높은 B-인자)는 비교적 높은 국소 이동성을 갖는 영역을 나타낼 수 있다. 이러한 영역은 구조 또는 기능을 손상시키지 않으면서 데아미나제를 삽입하는 데 사용될 수 있다. 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 총 단백질에 대한 평균 B-인자보다 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 또는 200% 초과인 B-인자를 갖는 Cα 원자를 갖는 잔기가 있는 위치에 삽입될 수 있다. 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 잔기를 포함하는 Cas9 단백질 도메인에 대한 평균 B-원자보다 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 또는 200% 초과인 B-원자를 갖는 Cα 원자를 갖는 잔기가 있는 위치에 삽입될 수 있다. 평균보다 더 큰 B-원자를 포함하는 Cas9 폴리펩티드 위치는 예를 들어, 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 768, 792, 1052, 1015, 1022, 1026, 1029, 1067, 1040, 1054, 1068, 1246, 1247, 및 1248을 포함할 수 있다. 평균보다 더 큰 B-인자를 포함하는 Cas9 폴리펩티드 영역은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같이 예를 들어, 잔기 792-872, 792-906, 및 2-791을 포함할 수 있다.
이종 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 768, 791, 792, 1015, 1016, 1022, 1023, 1026, 1029, 1040, 1052, 1054, 1067, 1068, 1069, 1246, 1247, 및 1248로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 768-769, 791-792, 792-793, 1015-1016, 1022-1023, 1026-1027, 1029-1030, 1040-1041, 1052-1053, 1054-1055, 1067-1068, 1068-1069, 1247-1248, 또는 1248-1249 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 769-770, 792-793, 793-794, 1016-1017, 1023-1024, 1027-1028, 1030-1031, 1041-1042, 1053-1054, 1055-1056, 1068-1069, 1069-1070, 1248-1249, 또는 1249-1250 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 768, 791, 792, 1015, 1016, 1022, 1023, 1026, 1029, 1040, 1052, 1054, 1067, 1068, 1069, 1246, 1247, 및 1248로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체한다. 삽입 위치와 관련하여 상기 Cas9 참조 서열에 대한 언급은 예시적인 목적을 위한 것임이 이해되어야 한다. 본원에 논의된 바와 같은 삽입은 상기 Cas9 참조 서열의 Cas9 폴리펩티드 서열로 제한되지 않지만, 변이체 Cas9 폴리펩티드, 예를 들어 Cas9 닉카제(nCas9), 뉴클레아제 사멸된 Cas9(dCas9), 뉴클레아제 도메인이 결여되어 있는 Cas9 변이체, 절두된 Cas9, 또는 부분적 또는 완전한 HNH 도메인이 결여되어 있는 Cas9 도메인에서 상응하는 위치에 삽입을 포함한다.
이종 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 768, 792, 1022, 1026, 1040, 1068, 및 1247로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 768-769, 792-793, 1022-1023, 1026-1027, 1029-1030, 1040-1041, 1068-1069, 또는 1247-1248 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 769-770, 793-794, 1023-1024, 1027-1028, 1030-1031, 1041-1042, 1069-1070, 또는 1248-1249 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 768, 792, 1022, 1026, 1040, 1068, 및 1247로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체한다.
이종 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나제)는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 구현예에서, 이종 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1002, 1003, 1025, 1052-1056, 1242-1247, 1061-1077, 943-947, 686-691, 569-578, 530-539, 및 1060-1077로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 잔기의 N-말단 또는 C-말단에 삽입되거나 또는 잔기를 대체할 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 잔기의 C-말단에 삽입된다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어, TadA)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어, TadA)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 792-872, 792-906, 또는 2-791, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기 대신에 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어, TadA*9)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1016, 1023, 1029, 1040, 1069, 및 1247로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어, TadA*9)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1016, 1023, 1029, 1040, 1069, 및 1247로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어, TadA*9)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1016, 1023, 1029, 1040, 1069, 및 1247로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어, TadA*9)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1016, 1023, 1029, 1040, 1069, 및 1247로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 791 또는 아미노산 잔기 792, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 791의 N-말단 또는 아미노산 792의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 791의 C-말단 또는 아미노산 792의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 791, 또는 아미노산 792, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제) 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022, 또는 아미노산 잔기 1023, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022의 N-말단 또는 아미노산 잔기 1023의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022의 C-말단 또는 아미노산 잔기 1023의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022, 또는 아미노산 잔기 1023, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026, 또는 아미노산 잔기 1029, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026의 N-말단 또는 아미노산 잔기 1029의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026의 C-말단 또는 아미노산 잔기 1029의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026, 또는 아미노산 잔기 1029, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052, 또는 아미노산 잔기 1054, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052의 N-말단 또는 아미노산 잔기 1054의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052의 C-말단 또는 아미노산 잔기 1054의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052, 또는 아미노산 잔기 1054, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067, 또는 아미노산 잔기 1068, 또는 아미노산 잔기 1069, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067의 N-말단 또는 아미노산 잔기 1068의 N-말단 또는 아미노산 잔기 1069의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067의 C-말단 또는 아미노산 잔기 1068의 C-말단 또는 아미노산 잔기 1069의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067, 또는 아미노산 잔기 1068, 또는 아미노산 잔기 1069, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1246, 또는 아미노산 잔기 1247, 또는 아미노산 잔기 1248, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1246의 N-말단 또는 아미노산 잔기 1247의 N-말단 또는 아미노산 잔기 1248의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1246의 C-말단 또는 아미노산 잔기 1247의 C-말단 또는 아미노산 잔기 1248의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1246, 또는 아미노산 잔기 1247, 또는 아미노산 잔기 1248, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.
일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나제)는 Cas9 폴리펩티드의 유연한 루프에 삽입된다. 유연한 루프 부분은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 530-537, 569-570, 686-691, 943-947, 1002-1025, 1052-1077, 1232-1247, 또는 1298-1300, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다다. 유연한 루프 부분은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1-529, 538-568, 580-685, 692-942, 948-1001, 1026-1051, 1078-1231, 또는 1248-1297, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이종 폴리펩티드(예를 들어, 아데닌 데아미나제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기: 1017-1069, 1242-1247, 1052-1056, 1060-1077, 1002 - 1003, 943-947, 530-537, 568-579, 686-691, 1242-1247, 1298 - 1300, 1066-1077, 1052-1056, 또는 1060-1077, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응하는 Cas9 폴리펩티드 영역 내로 삽입될 수 있다.
이종 폴리펩티드(예를 들어, 아데닌 데아미나제)는 Cas9 폴리펩티드의 결실된 영역 대신에 삽입될 수 있다. 결실된 영역은 Cas9 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 부분에 상응할 수 있다. 일부 구현예에서, 결실된 영역은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 792-872, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 구현예에서, 결실된 영역은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 792-906, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 구현예에서, 결실된 영역은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 2-791, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 구현예에서, 결실된 영역은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 1017-1069, 또는 이의 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다.
예시적인 내부 융합 염기 편집기는 하기 표 6에 제공된다:
표 6:
Cas9
단백질의 삽입
유전자좌
이종 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나제)는 Cas9 폴리펩티드의 구조적 또는 기능적 도메인 내에 삽입될 수 있다. 이종 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나제)는 Cas9 폴리펩티드의 2 개의 구조적 또는 기능적 도메인 사이에 삽입될 수 있다. 이종 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나제)는 예를 들어, Cas9 폴리펩티드로부터 도메인을 결실시킨 후, Cas9 폴리펩티드의 구조적 또는 기능적 도메인 대신에 삽입될 수 있다. Cas9 폴리펩티드의 구조적 또는 기능적 도메인은 예를 들어, RuvC I, RuvC II, RuvC III, Rec1, Rec2, PI, 또는 HNH를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 RuvC I, RuvC II, RuvC III, Rec1, Rec2, PI, 또는 HNH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 뉴클레아제 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 HNH 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 Cas9 폴리펩티드가 HNH 활성을 감소시키거나 또는 폐지하도록 HNH 도메인의 일부가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 뉴클레아제 도메인의 결실을 포함하고, 데아미나제는 뉴클레아제 도메인을 대체하기 위해 삽입된다. 일부 구현예에서, HNH 도메인은 결실되고 데아미나제가 그 자리에 삽입된다. 일부 구현예에서, RuvC 도메인 중 하나 이상은 결실되고 데아미나제가 그 자리에 삽입된다.
이종 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질은 napDNAbp의 N-말단 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 폴리펩티드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 데아미나제를 포함한다. N 말단 단편 또는 C 말단 단편은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있다. N 말단 단편의 C-말단 또는 C 말단 단편의 N-말단은 Cas9 폴리펩티드의 유연한 루프의 일부를 포함할 수 있다. N 말단 단편의 C-말단 또는 C 말단 단편의 N-말단은 Cas9 폴리펩티드의 알파-나선 구조의 일부를 포함할 수 있다. N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 RuvC 도메인을 포함할 수 있다. N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 HNH 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, N-말단 단편 및 C-말단 단편 중 어느 것도 HNH 도메인을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, N 말단 Cas9 단편의 C-말단은 융합 단백질이 표적 핵염기를 탈아미노화할 때 표적 핵염기에 근접한 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, C 말단 Cas9 단편의 N-말단은 융합 단백질이 표적 핵염기를 탈아미노화할 때 표적 핵염기에 근접한 아미노산을 포함한다. 상이한 데아미나제의 삽입 위치는 표적 핵염기 및 N 말단 Cas9 단편의 C-말단 또는 C 말단 Cas9 단편의 N-말단에서의 아미노산 사이에 근접성을 갖기 위해 상이할 수 있다. 예를 들어, 아데노신 데아미나제의 삽입 위치는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 있을 수 있다.
융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편(즉, 융합 단백질에서 데아미나제를 플랭킹하는 N-말단 Cas9 단편)은 Cas9 폴리펩티드의 N-말단을 포함할 수 있다. 융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편은 적어도 약: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 1300 개 아미노산의 길이를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기: 1-56, 1-95, 1-200, 1-300, 1-400, 1-500, 1-600, 1-700, 1-718, 1-765, 1-780, 1-906, 1-918, 또는 1-1100, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. N-말단 Cas9 단편은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기: 1-56, 1-95, 1-200, 1-300, 1-400, 1-500, 1-600, 1-700, 1-718, 1-765, 1-780, 1-906, 1-918, 또는 1-1100, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 대해 적어도: 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
융합 단백질의 C-말단 Cas9 단편(즉, 융합 단백질에서 데아미나제를 플랭킹하는 C-말단 Cas9 단편)은 Cas9 폴리펩티드의 C-말단을 포함할 수 있다. 융합 단백질의 C-말단 Cas9 단편은 적어도 약: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 1300 개 아미노산의 길이를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 C-말단 Cas9 단편은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기: 1099-1368, 918-1368, 906-1368, 780-1368, 765-1368, 718-1368, 94-1368, 또는 56-1368, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. N-말단 Cas9 단편은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기: 1099-1368, 918-1368, 906-1368, 780-1368, 765-1368, 718-1368, 94-1368, 또는 56-1368, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 대해 적어도: 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
함께 취해진 융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편 및 C-말단 Cas9 단편은 예를 들어, 상기 Cas9 참조 서열에 제시된 바와 같은 전장 자연 발생 Cas9 폴리펩티드 서열에 상응하지 않을 수 있다.
본원에 기재된 융합 단백질은 감소된 게놈 와이드 허위 탈아미노화와 같은, 비-표적 부위(예를 들어, 표적외 부위)에서 감소된 탈아미노화로 표적화된 탈아미노화에 영향을 미칠 수 있다. 본원에 기재된 융합 단백질은 비-표적 부위에서 감소된 방관자 탈아미노화로 표적화된 탈아미노화에 영향을 미칠 수 있다. 바람직하지 않은 탈아미노화 또는 표적외 탈아미노화는 예를 들어, Cas9 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 융합된 데아미나제를 포함하는 단부 말단 융합 단백질과 비교하여 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%까지 감소될 수 있다. 바람직하지 않은 탈아미노화 또는 표적외 탈아미노화는 예를 들어, Cas9 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 융합된 데아미나제를 포함하는 단부 말단 융합 단백질과 비교하여, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10배, 적어도 15 배, 적어도 20 배, 적어도 30 배, 적어도 40 배, 적어도 50 배, 적어도 60 배, 적어도 70 배, 적어도 80 배, 적어도 90 배, 또는 적어도 100 배까지 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)는 R-루프의 범위 내에서 2 개 이하의 핵염기를 탈아미노화한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 데아미나제는 R-루프의 범위 내에서 3 개 이하의 핵염기를 탈아미노화한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 데아미나제는 R-루프의 범위 내에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 이하의 핵염기를 탈아미노화한다. R-루프는 DNA:RNA 하이브리드, DNA:DNA 또는 RNA: RNA 상보적 구조를 포함하는 3-가닥 핵산 구조이며 단일-가닥 DNA와 회합된다. 본원에 사용된 바와 같이, R-루프는 표적 폴리뉴클레오티드가 CRISPR 복합체 또는 염기 편집 복합체와 접촉될 때 형성될 수 있으며, 여기서 가이드 폴리뉴클레오티드의 일부, 예를 들어 가이드 RNA는 표적 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 표적 DNA의 일부와 혼성화하고 대체한다. 일부 구현예에서, R-루프는 스페이서 서열 및 표적 DNA 상보적 서열의 혼성화된 영역을 포함한다. R-루프 영역은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 개의 핵염기 쌍 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, R-루프 영역은 약 20 개의 핵염기 쌍 길이이다. 본원에 사용된 바와 같이, R-루프 영역은 가이드 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 표적 DNA 가닥으로 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 예를 들어, R-루프 영역 내에서 표적 핵염기의 편집은 가이드 RNA에 대한 상보적 가닥을 포함하는 DNA 가닥에 대한 것일 수 있거나, 또는 가이드 RNA에 상보적인 가닥의 반대 가닥인 DNA 가닥에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, R-루프의 영역에서 편집은 표적 DNA 서열에서 비-상보적 가닥(프로토스페이서 가닥) 상의 핵염기를 가이드 RNA로 편집하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 융합 단백질은 표준 염기 편집과 상이한 편집 창에서 표적 탈아미노화에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 PAM 서열의 상류에 있는 약 1 내지 약 20 개의 염기이다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 PAM 서열의 상류에 있는 약 2 내지 약 12 개의 염기이다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 상류에 있거나 떨어져 있는 약 1 내지 9 개의 염기 쌍, 약 2 내지 10 개의 염기 쌍, 약 3 내지 11 개의 염기 쌍, 약 4 내지 12 개의 염기 쌍, 약 5 내지 13 개의 염기 쌍, 약 6 내지 14 개의 염기 쌍, 약 7 내지 15 개의 염기 쌍, 약 8 내지 16 개의 염기 쌍, 약 9 내지 17 개의 염기 쌍, 약 10 내지 18 개의 염기 쌍, 약 11 내지 19 개의 염기 쌍, 약 12 내지 20 개의 염기 쌍, 약 1 내지 7 개의 염기 쌍, 약 2 내지 8 개의 염기 쌍, 약 3 내지 9 개의 염기 쌍, 약 4 내지 10 개의 염기 쌍, 약 5 내지 11 개의 염기 쌍, 약 6 내지 12 개의 염기 쌍, 약 7 내지 13 개의 염기 쌍, 약 8 내지 14 개의 염기 쌍, 약 9 내지 15 개의 염기 쌍, 약 10 내지 16 개의 염기 쌍, 약 11 내지 17 개의 염기 쌍, 약 12 내지 18 개의 염기 쌍, 약 13 내지 19 개의 염기 쌍, 약 14 내지 20 개의 염기 쌍, 약 1 내지 5 개의 염기 쌍, 약 2 내지 6 개의 염기 쌍, 약 3 내지 7 개의 염기 쌍, 약 4 내지 8 개의 염기 쌍, 약 5 내지 9 개의 염기 쌍, 약 6 내지 10 개의 염기 쌍, 약 7 내지 11 개의 염기 쌍, 약 8 내지 12 개의 염기 쌍, 약 9 내지 13 개의 염기 쌍, 약 10 내지 14 개의 염기 쌍, 약 11 내지 15 개의 염기 쌍, 약 12 내지 16 개의 염기 쌍, 약 13 내지 17 개의 염기 쌍, 약 14 내지 18 개의 염기 쌍, 약 15 내지 19 개의 염기 쌍, 약 16 내지 20 개의 염기 쌍, 약 1 내지 3 개의 염기 쌍, 약 2 내지 4 개의 염기 쌍, 약 3 내지 5 개의 염기 쌍, 약 4 내지 6 개의 염기 쌍, 약 5 내지 7 개의 염기 쌍, 약 6 내지 8 개의 염기 쌍, 약 7 내지 9 개의 염기 쌍, 약 8 내지 10 개의 염기 쌍, 약 9 내지 11 개의 염기 쌍, 약 10 내지 12 개의 염기 쌍, 약 11 내지 13 개의 염기 쌍, 약 12 내지 14 개의 염기 쌍, 약 13 내지 15 개의 염기 쌍, 약 14 내지 16 개의 염기 쌍, 약 15 내지 17 개의 염기 쌍, 약 16 내지 18 개의 염기 쌍, 약 17 내지 19 개의 염기 쌍, 약 18 내지 20 개의 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 상류에 있거나 또는 떨어져 있는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 이상의 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 상류에 있는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 개의 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 상류에 있는 약 2, 3, 4, 또는 6 개의 염기 쌍이다.
융합 단백질은 하나 초과의 이종 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 하나 이상의 UGI 도메인 및/또는 하나 이상의 핵 국소화 신호를 추가적으로 포함할 수 있다. 2 개 이상의 이종 도메인은 나란히 삽입될 수 있다. 2 개 이상의 이종 도메인은 NapDNAbp에서 나란히 있지 않도록 하는 위치에 삽입될 수 있다.
융합 단백질은 데아미나제 및 napDNAbp 폴리펩티드 사이에 링커를 포함할 수 있다. 링커는 펩티드 또는 비-펩티드 링커일 수 있다. 예를 들어, 링커는 XTEN, (GGGS)n, (GGGGS)n, (G)n, (EAAAK)n, (GGS)n, SGSETPGTSESATPES일 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단 Cas9 단편 및 데아미나제 사이에 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 C-말단 Cas9 단편 및 데아미나제 사이에 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp의 N-말단 및 C-말단 단편은 링커를 사용하여 데아미나제에 연결된다. 일부 구현예에서, N-말단 및 C-말단 단편은 링커 없이 데아미나제 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단 Cas9 단편 및 데아미나제 사이에 링커를 포함하지만, C-말단 Cas9 단편 및 데아미나제 사이에 링커를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 C-말단 Cas9 단편 및 데아미나제 사이에 링커를 포함하지만, N-말단 Cas9 단편 및 데아미나제 사이에 링커를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 융합 단백질에서 napDNAbp는 Cas12 폴리펩티드, 예를 들어, Cas12b/C2c1, 또는 이의 단편이다. Cas12 폴리펩티드는 변이체 Cas12 폴리펩티드일 수 있다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단 단편은 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 또는 RuvC 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 Cas12 폴리펩티드 및 촉매 도메인 사이에 링커를 함유한다. 다른 구현예에서, 링커의 아미노산 서열은 GGSGGS 또는 GSSGSETPGTSESATPESSG이다. 다른 구현예에서, 링커는 강성 링커이다. 상기 측면의 다른 구현예에서, 링커는 GGAGGCTCTGGAGGAAGC 또는 GGCTCTTCTGGATCTGAAACACCTGGCACAAGCGAGAGCGCCACCCCTGAGAGCTCTGGC에 의해 암호화된다.
Cas12 폴리펩티드의 N- 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 이종 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질은 또한 본원에 기재된 바와 같은 방법에서 염기 편집에 유용하다. Cas12 및 하나 이상의 데아미나제 도메인, 예를 들어, 아데노신 데아미나제를 포함하거나, 또는 Cas12 서열에 의해 플랭킹된 아데노신 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질은 또한 표적 서열의 고도로 특이적이고 효율적인 염기 편집에 유용하다. 구현예에서, 키메라 Cas12 융합 단백질은 Cas12 폴리펩티드 내에 삽입된 이종 촉매 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나제, 사이티딘 데아미나제, 또는 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제)을 함유한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas12 내에 삽입된 아데노신 데아미나제 도메인 및 사이티딘 데아미나제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 아데노신 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 아데노신 데아미나제는 N-말단에 융합된다. 아데노신 데아미나제 및 사이티딘 데아미나제 및 Cas12가 있는 융합 단백질의 예시적인 구조는 하기와 같이 제공된다:
NH2-[Cas12(아데노신 데아미나제)]-[사이티딘 데아미나제]-COOH;
NH2-[사이티딘 데아미나제]-[Cas12(아데노신 데아미나제)]-COOH;
NH2-[Cas12(사이티딘 데아미나제)]-[아데노신 데아미나제]-COOH; 또는
NH2-[아데노신 데아미나제]-[Cas12(사이티딘 데아미나제)]-COOH;
일부 구현예에서, 상기 일반적인 구조에서 사용되는 "-"는 임의적인 링커의 존재를 나타낸다.
다양한 구현예에서, 촉매 도메인은 아데노신 데아미나제 활성과 같은 DNA 변형 활성(예를 들어, 데아미나제 활성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA(예를 들어, TadA*7.10)이다. 일부 구현예에서, TadA는 TadA*8 또는 TadA*9이다. 일부 구현예에서, TadA*8 또는 TadA*9는 Cas12 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, TadA*8 또는 TadA*9는 Cas12 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 TadA*8 또는 TadA*9는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나제는 Cas12 내에서 융합되고 TadA*8 또는 TadA*9는 N-말단에 융합된다. TadA*8 또는 TadA*9 및 사이티딘 데아미나제 및 Cas12가 있는 융합 단백질의 예시적인 구조는 하기와 같이 제공된다:
N-[Cas12(TadA*8 또는 TadA*9)]-[사이티딘 데아미나제]-C;
N-[사이티딘 데아미나제]-[Cas12(TadA*8 또는 TadA*9)]-C;
N-[Cas12(사이티딘 데아미나제)]-[TadA*8 또는 TadA*9]-C; 또는
N-[TadA*8 또는 TadA*9]-[Cas12(사이티딘 데아미나제)]-C.
일부 구현예에서, 상기 일반적인 구조에서 사용되는 "-"는 임의적인 링커의 존재를 나타낸다.
다른 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 촉매 도메인을 함유한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 촉매 도메인 중 적어도 하나는 Cas12 폴리펩티드 내에 삽입되거나 또는 Cas12 N-말단 또는 C-말단에서 융합된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 촉매 도메인 중 적어도 하나는 Cas12 폴리펩티드의 루프, 알파 나선 영역, 비구조화 부분, 또는 용매 허용가능한 부분 내에 삽입된다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 또는 Cas12j/CasΦ이다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 바실루스 히사시이 Cas12b, 바실루스 써모아밀로보란스 Cas12b, 바실루스 종 V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실루스 아시디필루스(알리사이클로바실루스 아시디필루스) Cas12b에 대해 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 바실루스 히사시이 Cas12b, 바실루스 써모아밀로보란스 Cas12b, 바실루스 종 V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실루스 아시디필루스 Cas12b에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 바실루스 히사시이 Cas12b, 바실루스 써모아밀로보란스 Cas12b, 바실루스 종 V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실루스 아시디필루스 Cas12b에 대해 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 바실루스 히사시이 Cas12b, 바실루스 써모아밀로보란스 Cas12b, 바실루스 종 V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실루스 아시디필루스 Cas12b의 단편을 함유하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다.
다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 위치 153-154, 255-256, 306-307, 980-981, 1019-1020, 534-535, 604-605, 또는 344-345 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 또는 Cas12j/CasΦ의 상응하는 아미노산 잔기 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 P153 및 S154 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 K255 및 E256 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 D980 및 G981 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 K1019 및 L1020 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 F534 및 P535 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 K604 및 G605 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 H344 및 F345 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 위치 147 및 148, 248 및 249, 299 및 300, 991 및 992, 또는 1031 및 1032 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 또는 Cas12j/CasΦ의 상응하는 잔기 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 P147 및 D148 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 G248 및 G249 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 P299 및 E300 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 G991 및 E992 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 K1031 및 M1032 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 위치 157 및 158, 258 및 259, 310 및 311, 1008 및 1009, 또는 1044 및 1045 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 또는 Cas12j/CasΦ의 상응하는 아미노산 잔기 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 P157 및 G158 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 V258 및 G259 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 D310 및 P311 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 G1008 및 E1009 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 G1044 및 K1045 사이에 삽입된다.
다른 구현예에서, 융합 단백질은 핵 국소화 신호(예를 들어, 이분 핵 국소화 신호)를 함유한다. 다른 구현예에서, 핵 국소화 신호의 아미노산 서열은 MAPKKKRKVGIHGVPAA이다. 상기 측면의 다른 구현예에서, 핵 국소화 신호는 하기 서열에 의해 암호화된다: ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCC. 다른 구현예에서, Cas12b 폴리펩티드는 RuvC 도메인의 촉매 활성을 침묵시키는 돌연변이를 함유한다. 다른 구현예에서, Cas12b 폴리펩티드는 D574A, D829A 및/또는 D952A 돌연변이를 함유한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 태그(예를 들어, 인플루엔자 헤마글루티닌 태그)를 추가로 함유한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 내부로 융합된 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 데아미나제 도메인, 예를 들어, 아데노신 데아미나제 도메인의 전부 또는 일부)을 갖는 napDNAbp 도메인(예를 들어, Cas12-유래 도메인)을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12b이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 하기 표 7에 제공된 유전자좌에 삽입된 내부로 융합된 TadA*8 도메인을 갖는 BhCas12b 도메인을 포함한다.
표 7:
Cas12b
단백질의 삽입
유전자좌
비제한적인 예로서, 아데노신 데아미나제(예를 들어, ABE8.13)는 BhCas12b 내로 삽입되어 핵산 서열을 효과적으로 편집하는 융합 단백질(예를 들어, ABE8.13-BhCas12b)을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 시스템은 Cas9 내로 삽입된 TadA를 갖는 ABE를 포함한다. Cas9 단백질 내로 삽입된 TadA를 갖는 관련 ABE의 예시적인 서열은 2020년 8월 28일 출원된 국제 PCT 출원 번호 PCT/US2020/048586에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
배타성이
감소된
Cas9
도메인
전형적으로, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9(SpCas9)와 같은 Cas9 단백질은 특정 핵산 영역에 결합하기 위해 표준 NGG PAM 서열을 필요로 하며, 여기서 "NGG"의 "N"은 아데노신(A), 티미딘(T), 또는 사이토신(C)이고, G는 구아노신이다. 이는 게놈 내에서 원하는 염기를 편집하는 능력을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공되는 염기 편집 융합 단백질은 정확한 위치, 예를 들어 PAM의 상류에 있는 표적 염기를 포함하는 영역에 배치될 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016)를 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 표준(예를 들어, NGG) PAM 서열을 함유하지 않는 뉴클레오티드 서열을 결합할 수 있는 Cas9 도메인을 함유할 수 있다. 비-표준 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 당업계에 기재되어 있고 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 비-표준 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 Kleinstiver, B. P., 등, "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015); 및 Kleinstiver, B. P., 등, "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015); Nishimasu, H., 등, "Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space" Science. 2018 Sep 21;361(6408):1259-1262, Chatterjee, P., 등, Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog" Sci Adv. 2018 Oct 24;4(10):eaau0766. doi: 10.1126/sciadv.aau0766에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
핵염기
편집 도메인
본원에는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 데아미나제 도메인)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 염기 편집기가 기재된다. 염기 편집기는 표적 서열을 인식할 수 있는 가이드 폴리뉴클레오티드와 상호작용함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 염기를 편집하도록 프로그래밍될 수 있다. 일단 표적 서열이 인식되면, 염기 편집기는 편집이 발생하는 폴리뉴클레오티드 상에 고정된 다음 염기 편집기의 데아미나제 도메인 구성요소가 표적 염기를 편집할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 데아미나제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 표적 CㆍG 염기 쌍을 TㆍA로 전환하는 사이티딘 염기 편집기(예를 들어, BE4)를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 AㆍT를 GㆍC로 전환하는 아데닌 염기 편집기(예를 들어, ABE7.10)를 포함한다. 특히 본원에 기재된 바와 같이, 데아미나제 도메인은 아데노신 데아미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "아데닌 데아미나제" 및 "아데노신 데아미나제"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 핵염기 편집 단백질의 상세한 내용은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344(WO2017/070632)에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)를 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
A에서 G로의 편집
일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집기는 아데노신 데아미나제를 포함하는 데아미나제 도메인을 포함할 수 있다. 염기 편집기의 이러한 아데노신 데아미나제 도메인은 A를 탈아미노화하여 G의 염기 쌍형성 특성을 나타내는 이노신(I)을 형성함으로써 아데닌(A) 핵염기의 구아닌(G) 핵염기로의 편집을 용이하게 할 수 있다. 아데노신 데아미나제는 데옥시리보핵산(DNA)에서 데옥시아데노신 잔기의 아데닌을 탈아미노화(즉, 아민 기를 제거)할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 핵염기 편집기는 하나 이상의 단백질 도메인과 함께 융합하여, 융합 단백질을 생성함으로써 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 융합 단백질의 염기 편집 활성(예를 들어, 효율, 선택성, 및 특이성)을 개선하는 하나 이상의 특징을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 융합 단백질은 뉴클레아제 활성이 감소된 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 뉴클레아제 활성(dCas9)을 갖지 않는 Cas9 도메인, 또는 Cas9 닉카제(nCas9)로 지칭되는 이중체화 DNA 분자의 하나의 가닥을 절단하는 Cas9 도메인을 가질 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 촉매 잔기(예를 들어, H840)의 존재는 표적화된 A에 반대되는 T를 함유하는 편집되지 않은(예를 들어, 탈아미노화되지 않은) 가닥을 절단하는 Cas9의 활성을 유지한다. Cas9의 촉매 잔기의 돌연변이(예를 들어, D10에서 A10로)는 표적화된 A 잔기를 함유하는 편집된 가닥의 절단을 방지한다. 이러한 Cas9 변이체는 gRNA-정의된 표적 서열에 기초하여 특이적 위치에서 단일-가닥 DNA 파괴(닉)를 생성하며, 편집되지 않은 가닥의 복구를 야기하여, 궁극적으로 편집되지 않은 가닥 상에서 T에서 C로의 변화를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, A에서 G로의 염기 편집기는 이노신 염기 절제 복구의 억제제, 예를 들어, 우라실 글리코실라제 억제제(UGI) 도메인 또는 촉매적으로 불활성 이노신 특이적 뉴클레아제를 추가로 포함한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, UGI 도메인 또는 촉매적으로 불활성 이노신 특이적 뉴클레아제는 탈아미노화된 아데노신 잔기(예를 들어, 이노신)의 염기 절제 복구를 억제하거나 또는 방지할 수 있으며, 이는 염기 편집기의 활성 또는 효율을 개선시킬 수 있다.
아데노신 데아미나제를 포함하는 염기 편집기는 DNA, RNA 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한 임의의 폴리뉴클레오티드에서 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, 아데노신 데아미나제를 포함하는 염기 편집기는 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 표적 A를 탈아미노화할 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기는 RNA 폴리뉴클레오티드 및/또는 DNA-RNA 하이브리드 폴리뉴클레오티드의 표적 A를 탈아미노화할 수 있는 아데노신 데아미나제 도메인을 포함할 수 있다. 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 아데노신 데아미나제는 RNA에서 작용하는 아데노신 데아미나제(ADAR, 예를 들어, ADAR1 또는 ADAR2)의 전부 또는 일부를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 아데노신 데아미나제는 tRNA에서 작용하는 아데노신 데아미나제(ADAT)의 전부 또는 일부를 포함한다. 아데노신 데아미나제 도메인을 포함하는 염기 편집기는 또한 DNA 폴리뉴클레오티드의 A 핵염기를 탈아미노화할 수 있다. 구현예에서 염기 편집기의 아데노신 데아미나제 도메인은 ADAT가 DNA에서 표적 A를 탈아미노화하도록 허용하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 ADAT의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, 염기 편집기는 하기 돌연변이 중 하나 이상: D108N, A106V, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 돌연변이를 포함하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 ADAT(EcTadA)의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
아데노신 데아미나제는 임의의 적합한 유기체(예를 들어, 이. 콜라이)로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 아데닌 데아미나제는 본원에 제공된 임의의 돌연변이(예를 들어, ecTadA에서의 돌연변이)에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 자연 발생 아데노신 데아미나제이다. 임의의 상동성 단백질에서 상응하는 잔기는 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 식별될 수 있다. 따라서 본원에 기재된 임의의 돌연변이(예를 들어, ecTadA에서 식별된 임의의 돌연변이)에 상응하는 임의의 자연 발생 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA에 대한 상동성을 가짐)에서 돌연변이가 생성될 수 있다.
아데노신
데아미나제
일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 아데노신 데아미나제를 포함하는 데아미나제 도메인을 포함할 수 있다. 염기 편집기의 이러한 아데노신 데아미나제 도메인은 A를 탈아미노화하여 G의 염기 쌍형성 특성을 나타내는 이노신(I)을 형성함으로써 아데닌(A) 핵염기의 구아닌(G) 핵염기로의 편집을 용이하게 할 수 있다. 아데노신 데아미나제는 데옥시리보핵산(DNA)에서 데옥시아데노신 잔기의 아데닌을 탈아미노화(즉, 아민 기를 제거)할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 아데닌을 탈아미노화할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 DNA의 데옥시아데노신 잔기에서 아데닌을 탈아미노화할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데닌 데아미나제는 본원에 제공된 임의의 돌연변이(예를 들어, ecTadA에서의 돌연변이)에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 자연 발생 아데노신 데아미나제이다. 당업자는 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 임의의 상동성 단백질에서 상응하는 잔기를 식별할 수 있을 것이다. 따라서, 당업자는 본원에 기재된 임의의 돌연변이, 예를 들어, ecTadA에서 식별된 임의의 돌연변이에 상응하는 임의의 자연 발생 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA에 대한 상동성을 가짐)에서 돌연변이를 생성할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 원핵생물로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 박테리아로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 에스케리키아 콜라이, 스타필로코쿠스 아우레우스, 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 셰와넬라 푸트레파시엔스, 헤모필루스 인플루엔자, 카울로박터 크레센투스, 또는 바실루스 서브틸리스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 이. 콜라이로부터 유래된다.
본 개시내용은 효율(>50-60%) 및 특이성이 증가된 아데노신 데아미나제 변이체를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 아데노신 데아미나제 변이체는 폴리뉴클레오티드 내에서 원하는 염기를 편집할 가능성이 더 높고, 변경되도록 의도되지 않은 염기(즉, "방관자")를 편집할 가능성이 적다.
특정 구현예에서, TadA는 PCT/US2017/045381(WO 2018/027078)에 기재된 TadA 중 임의의 하나이며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 야생형 TadA(TadA(wt)) 또는 "TadA 참조 서열"은 하기와 같다:
일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵염기 편집기는 하기 서열에서 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체이다:
특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일(예를 들어, 단량체로서 제공됨) TadA*8 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, TadA*8은 Cas9 닉카제에 연결된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 TadA*8 변이체에 연결된 야생형 TadA(TadA(wt))의 이종이량체로서 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 TadA*8 변이체에 연결된 TadA*7.10의 이종이량체로서 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 변이체 단량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 변이체 및 TadA(wt)의 이종이량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 변이체 및 TadA*7.10의 이종이량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 변이체의 이종이량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, TadA*8 변이체는 표 8, 10, 11, 12, 또는 13으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*9 변이체를 포함하는 ABE9이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*9 변이체 단량체를 포함하는 ABE9이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*9 변이체 및 TadA(wt)의 이종이량체를 포함하는 ABE9이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*9 변이체 및 또 다른 TadA 변이체(예를 들어, TadA*7.10)의 이종이량체를 포함하는 ABE9이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*9 변이체의 동종이량체를 포함하는 ABE9이다. 일부 구현예에서, TadA*9 변이체는 본원의 표 14 및 18에 제공된 바와 같다. 일부 구현예에서, TadA*9 변이체는 하기 서열(TadA*7.10으로 명명됨)을 참조하여 하기 기재된 변이체로부터 선택된다:
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어, TadA*9)는 서열번호: 1의 21, 23, 25, 38, 51, 54, 70, 71, 72, 73, 94, 124, 133, 139, 146, 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어, TadA*9)는 다음 변경 중 하나 이상: R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, V82T, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함한다. 참조 서열에서 변경된 관련 염기는 밑줄 및 굵은 글씨로 제시된다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 다음 변경의 조합 중 하나 이상을 포함한다: V82S + Q154R + Y147R; V82S + Q154R + Y123H; V82S + Q154R + Y147R+ Y123H; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y+ V82S; V82S + I76Y; V82S + Y147R; V82S + Y147R + Y123H; V82S + Q154R + Y123H; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y; V82S + Y147R; V82S + Y147R + Y123H; V82S + Q154R + Y123H; V82S + Q154R + Y147R; V82S + Q154R + Y147R; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y + V82S; I76Y_V82S_Y123H_Y147R_Q154R; Y147R + Q154R + H123H; 및 V82S + Q154R.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 다음 변경의 조합 중 하나 이상을 포함한다: E25F + V82S + Y123H, T133K + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R; Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R; L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R; P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K; N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; 및 M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 다음 변경의 조합 중 하나 이상을 포함한다: Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Q154R; N72K_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Q71M_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Q71M_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; 및 M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 단량체로 발현된다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 이종이량체로 발현된다. 일부 구현예에서, 데아미나제 또는 다른 폴리펩티드 서열은 예를 들어 융합 단백질의 구성성분으로 포함될 때 메티오닌이 결여되어 있다. 이는 위치 번호를 변경할 수 있다. 그러나, 당업자는 이러한 상응하는 돌연변이가 동일한 돌연변이, 예를 들어, Y73S 및 Y72S 및 D139M 및 D138M을 지칭함을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본원에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 개시내용은 특정 퍼센트 동일성을 갖는 임의의 데아미나제 도메인 및 본원에 기재된 임의의 돌연변이 또는 이의 조합을 제공한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 참조 서열, 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 당업계에 알려져 있거나 또는 본원에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 적어도 5 개, 적어도 10 개, 적어도 15 개, 적어도 20 개, 적어도 25 개, 적어도 30 개, 적어도 35 개, 적어도 40 개, 적어도 45 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 적어도 100 개, 적어도 110 개, 적어도 120 개, 적어도 130 개, 적어도 140 개, 적어도 150 개, 적어도 160 개, 또는 적어도 170 개의 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서 TadA 데아미나제는 전장 이. 콜라이 TadA 데아미나제이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
그러나, 본 출원에 유용한 추가적인 아데노신 데아미나제는 당업자에게 명백할 것이고 본 개시내용의 범위 내에 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 아데노신 데아미나제는 tRNA에서 작용하는 아데노신 데아미나제(ADAT)의 상동체일 수 있다. 제한 없이, 예시적인 AD AT 상동체의 아미노산 서열은 하기를 포함한다:
스타필로코쿠스 아우레우스 TadA:
바실루스 서브틸리스 TadA:
살모넬라 티피무리움(에스. 티피무리움) TadA:
셰와넬라 푸트레파시엔스(에스. 푸트레파시엔스) TadA:
헤모필루스 인플루엔자 F3031 (에이치. 인플루엔자) TadA:
카울로박터 크레센투스 (씨. 크레센투스) TadA:
지오박터 술푸레두센스 (지. 술푸레두센스) TadA:
이. 콜라이 TadA(ecTadA)의 구현예는 하기를 포함한다:
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 원핵생물로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 박테리아로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 에스케리키아 콜라이, 스타필로코쿠스 아우레우스, 살모넬라 티피, 셰와넬라 푸트레파시엔스, 헤모필루스 인플루엔자, 카울로박터 크레센투스, 또는 바실루스 서브틸리스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 이. 콜라이로부터 유래된다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 Cas9 닉카제에 연결된 TadA*7.10에 연결된 야생형 TadA를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일 TadA*7.10 도메인(예를 들어, 단량체로서 제공됨)을 포함한다. 다른 구현예에서, ABE7.10 편집기는 이종이량체를 형성할 수 있는 TadA*7.10 및 TadA(wt)를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본원에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 개시내용은 특정 퍼센트 동일성을 갖는 임의의 데아미나제 도메인 및 본원에 기재된 임의의 돌연변이 또는 이의 조합을 제공한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 참조 서열, 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 당업계에 알려져 있거나 또는 본원에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 적어도 5 개, 적어도 10 개, 적어도 15 개, 적어도 20 개, 적어도 25 개, 적어도 30 개, 적어도 35 개, 적어도 40 개, 적어도 45 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 적어도 100 개, 적어도 110 개, 적어도 120 개, 적어도 130 개, 적어도 140 개, 적어도 150 개, 적어도 160 개, 또는 적어도 170 개의 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 돌연변이(예를 들어, TadA 참조 서열에 기초함)는 이. 콜라이 TadA(ecTadA), 에스. 아우레우스 TadA(saTadA), 또는 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, 박테리아 아데노신 데아미나제)와 같은 다른 아데노신 데아미나제 내로 도입될 수 있음이 이해되어야 한다. 추가적인 데아미나제는 본원에 제공된 바와 같이 돌연변이될 수 있는 상동성 아미노산 잔기를 식별하도록 정렬될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다. 따라서, TadA 참조 서열에서 식별된 임의의 돌연변이는 상동성 아미노산 잔기를 갖는 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTada)에서 만들어질 수 있다. 또한 본원에 제공된 임의의 돌연변이는 개별적으로 또는 TadA 참조 서열 또는 또 다른 아데노신 데아미나제와의 임의의 조합으로 만들어질 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 D108X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 D108G, D108N, D108V, D108A, 또는 D108Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A106X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A106V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, 야생형 TadA 또는 ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 E155X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 E155D, E155G, 또는 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 D147X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 D147Y, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A106X, E155X, 또는 D147X, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 E155D, E155G, 또는 E155V 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 D147Y를 포함한다.
예를 들어, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 D108N, A106V, E155V, 및/또는 D147Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 하기 돌연변이의 군(돌연변이의 군은 ";"에 의해 구분됨), 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다: D108N 및 A106V; D108N 및 E155V; D108N 및 D147Y; A106V 및 E155V; A106V 및 D147Y; E155V 및 D147Y; D108N, A106V, 및 E155V; D108N, A106V, 및 D147Y; D108N, E155V, 및 D147Y; A106V, E155V, 및 D147Y; 및 D108N, A106V, E155V, 및 D147Y. 그러나, 본원에 제공된 상응하는 돌연변이의 임의의 조합은 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 만들어질 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, T17X, L18X, W23X, L34X, W45X, R51X, A56X, E59X, E85X, M94X, I95X, V102X, F104X, A106X, R107X, D108X, K110X, M118X, N127X, A138X, F149X, M151X, R153X, Q154X, I156X, 및/또는 K157X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, T17S, L18E, W23L, L34S, W45L, R51H, A56E, 또는 A56S, E59G, E85K, 또는 E85G, M94L, I95L, V102A, F104L, A106V, R107C, 또는 R107H, 또는 R107P, D108G, 또는 D108N, 또는 D108V, 또는 D108A, 또는 D108Y, K110I, M118K, N127S, A138V, F149Y, M151V, R153C, Q154L, I156D, 및/또는 K157R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, 및/또는 N127X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, 및/또는 N127S 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, R26X, M61X, L68X, M70X, A106X, D108X, A109X, N127X, D147X, R152X, Q154X, E155X, K161X, Q163X, 및/또는 T166X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, R26W, M61I, L68Q, M70V, A106T, D108N, A109T, N127S, D147Y, R152C, Q154H 또는 Q154R, E155G 또는 E155V 또는 E155D, K161Q, Q163H, 및/또는 T166P 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, N127X, D147X, R152X, 및 Q154X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, M61X, M70X, D108X, N127X, Q154X, E155X, 및 Q163X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, N127X, E155X, 및 T166X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 H8X, A106X 및 D108X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 H8X, P26X, L68X, D108X, N127X, D147X, 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, R126X, L68X, D108X, N127X, D147X, 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, A109X, N127X, 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, R152C, 및 Q154H로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, M61I, M70V, D108N, N127S, Q154R, E155G 및 Q163H로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, E155V, 및 T166P로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, A106T, D108N, N127S, E155D, 및 K161Q로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, R26W, L68Q, D108N, N127S, D147Y, 및 E155V로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, A109T, N127S, 및 E155G로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 돌연변이 및 임의의 추가적인 돌연변이(예를 들어, ecTadA 아미노산 서열에 기초함)는 임의의 다른 아데노신 데아미나제 내로 도입될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 돌연변이는 개별적으로 또는 TadA 참조 서열 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)와 임의의 조합으로 만들어질 수 있다.
A에서 G로의 핵염기 편집 단백질의 상세한 내용은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature, 551, 464-471 (2017)에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 D108N, D108G, 또는 D108V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A106V 및 D108N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R107C 및 D108N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, 및 Q154H 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, 및 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 D108N, D147Y, 및 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, 및 N127S 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A106V, D108N, D147Y 및 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S2X, H8X, I49X, L84X, H123X, N127X, I156X 및/또는 K160X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S2A, H8Y, I49F, L84F, H123Y, N127S, I156F 및/또는 K160S 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 L84X 돌연변이 아데노신 데아미나제를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 L84F 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H123X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H123Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 I156X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 I156F 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 L84X, A106X, D108X, H123X, D147X, E155X, 및 I156X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S2X, I49X, A106X, D108X, D147X, 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8X, A106X, D108X, N127X, 및 K160X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 L84F, A106V, D108N, H123Y, D147Y, E155V, 및 I156F로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S2A, I49F, A106V, D108N, D147Y, 및 E155V로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, A106T, D108N, N127S, 및 K160S로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 E25X, R26X, R107X, A142X, 및/또는 A143X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 E25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, E25Y, R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, R26K, R107P, R107K, R107A, R107N, R107W, R107H, R107S, A142N, A142D, A142G, A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q 및/또는 A143R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에 상응하는 본원에 기재된 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 E25X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 E25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, 또는 E25Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R26X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, 또는 R26K 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R107X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R107P, R107K, R107A, R107N, R107W, R107H, 또는 R107S 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A142X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A142N, A142D, A142G, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A143X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q 및/또는 A143R 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H36X, N37X, P48X, I49X, R51X, M70X, N72X, D77X, E134X, S146X, Q154X, K157X, 및/또는 K161X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H36L, N37T, N37S, P48T, P48L, I49V, R51H, R51L, M70L, N72S, D77G, E134G, S146R, S146C, Q154H, K157N, 및/또는 K161T 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H36X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 H36L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 N37X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 N37T, 또는 N37S 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 P48X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 P48T, 또는 P48L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R51X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R51H, 또는 R51L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S146X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 S146R, 또는 S146C 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 K157X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 K157N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 P48X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 P48S, P48T, 또는 P48A 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A142X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 A142N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 W23X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 W23R, 또는 W23L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R152X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에서 R152P, 또는 R52H 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 돌연변이 H36L, R51L, L84F, A106V, D108N, H123Y, S146C, D147Y, E155V, I156F, 및 K157N를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA 참조 서열에 비해 하기 돌연변이 조합을 포함하며, 여기서 조합의 각각의 돌연변이는 "_"에 의해 구분되고 각각의 돌연변이 조합은 괄호 사이에 있다:
(A106V_D108N),
(R107C_D108N),
(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H),
(H8Y_D108N_N127S_D147Y_E155V),
(D108N_D147Y_E155V),
(H8Y_D108N_N127S),
(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H),
(A106V_D108N_D147Y_E155V),
(D108Q_D147Y_E155V),
(D108M_D147Y_E155V),
(D108L_D147Y_E155V),
(D108K_D147Y_E155V),
(D108I_D147Y_E155V),
(D108F_D147Y_E155V),
(A106V_D108N_D147Y),
(A106V_D108M_D147Y_E155V),
(E59A_A106V_D108N_D147Y_E155V),
(E59A cat dead_A106V_D108N_D147Y_E155V),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156Y),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(D103A_D104N),
(G22P_D103A_D104N),
(D103A_D104N_S138A),
(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),
(E25G_R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),
(E25D_R26G_L84F_A106V_R107K_D108N_H123Y_A142N_A143G_D147Y_E155V_I156F),
(R26Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),
(E25M_R26G_L84F_A106V_R107P_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),
(R26C_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_A143L_D147Y_E155V_I156F),
(R26G_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),
(E25A_R26G_L84F_A106V_R107N_D108N_H123Y_A142N_A143E_D147Y_E155V_I156F),
(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),
(A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),
(R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),
(E25D_R26G_A106V_R107K_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V),
(R26G_A106V_D108N_R107H_A142N_A143D_D147Y_E155V),
(E25D_R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),
(A106V_R107K_D108N_A142N_D147Y_E155V),
(A106V_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V),
(A106V_D108N_A142N_A143L_D147Y_E155V),
(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(N37T_P48T_M70L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_I49V_E155V_I156F),
(N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_Q154H_E155V_I156F),
(N72S_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F),
(H36L_P48L_L84F_A106V_D108N_H123Y_E134G_D147Y_E155V_I156F),
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N),
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(N37S_R51H_D77G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N),
(D24G_Q71R_L84F_H96L_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K160E),
(H36L_G67V_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146T_D147Y_E155V_I156F),
(Q71L_L84F_A106V_D108N_H123Y_L137M_A143E_D147Y_E155V_I156F),
(E25G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L),
(L84F_A91T_F104I_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(N72D_L84F_A106V_D108N_H123Y_G125A_D147Y_E155V_I156F),
(P48S_L84F_S97C_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(W23G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(D24G_P48L_Q71R_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),
(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N), (N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(L84F_A106V_D108N_D147Y_E155V_I156F),
(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K161T),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E_K161T),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E),
(R74Q-_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(R74A_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(L84F_R98Q_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_R129Q_D147Y_E155V_I156F),
(P48S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),
(P48S_A142N),
(P48T_I49V_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_L157N),
(P48T_I49V_A142N),
(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),
(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F
(H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),
(H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F _K161T),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152H_E155V_I156F _K157N),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F _K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N),
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N),
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N).
특정 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 융합 단백질의 염기 편집 활성을 개선시키는 하나 이상의 특징을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 뉴클레아제 활성이 감소된 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 뉴클레아제 활성(dCas9)을 갖지 않는 Cas9 도메인, 또는 Cas9 닉카제(nCas9)로 지칭되는 이중체화 DNA 분자의 하나의 가닥을 절단하는 Cas9 도메인을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 TadA*7.10이다. 일부 구현예에서, TadA*7.10은 적어도 하나의 변경을 포함한다. 특정 구현예에서, TadA*7.10은 하기 변경 중 하나 이상을 포함한다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및 Q154R. 변경 Y123H는 또한 본원에서 H123H로 지칭된다(TadA*7.10에서 변경 H123Y는 Y123H(wt)로 되돌아감). 다른 구현예에서, TadA*7.10은 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 잔기 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 및 157에서 시작하는 C 말단의 결실을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 개시내용의 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 하기 변경: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*8)를 포함하는 단량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체(TadA*8)는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 단량체이다.
다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 다음 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 포함하는 야생형 아데노신 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*8)를 포함하는 이종이량체이다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 야생형 아데노신 데아미나제 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체를 포함한다.
다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 하기 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 포함하는 TAdA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체를 포함한다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 야생형 아데노신 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이다.
다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 다음 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 포함하는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*8)를 포함하는 이종이량체이다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다.
일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 TadA*8이다:
일부 구현예에서, TadA*8은 절두된다. 일부 구현예에서, 절두된 TadA*8은 전장 TadA*8에 비해 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20 개의 N-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있다. 일부 구현예에서, 절두된 TadA*8은 전장 TadA*8에 비해 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있다. 일부 구현예에서 아데노신 데아미나제 변이체는 전장 TadA*8이다.
일부 구현예에서 TadA*8은 TadA*8.1, TadA*8.2, TadA*8.3, TadA*8.4, TadA*8.5, TadA*8.6, TadA*8.7, TadA*8.8, TadA*8.9, TadA*8.10, TadA*8.11, TadA*8.12, TadA*8.13, TadA*8.14, TadA*8.15, TadA*8.16, TadA*8.17, TadA*8.18, TadA*8.19, TadA*8.20, TadA*8.21, TadA*8.22, TadA*8.23, 또는 TadA*8.24이다.
다른 구현예에서, 본 개시내용의 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 다음 변경: R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N 중 하나 이상을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*8)를 포함하는 단량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제 변이체(TadA*8)는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 단량체이다.
다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 다음 변경 R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N 중 하나 이상을 포함하는 야생형 아데노신 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*8)를 포함하는 이종이량체이다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 야생형 아데노신 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다.
다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 다음 변경 R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N 중 하나 이상을 포함하는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*8)를 포함하는 이종이량체이다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 이종이량체이다.
일부 구현예에서, TadA*8은 표 8에 제시된 바와 같은 변이체이다. 표 8은 TadA 아미노산 서열에서 특정 아미노산 위치 번호 및 TadA-7.10 아데노신 데아미나제에서 이들 위치에 존재하는 아미노산을 나타낸다. 표 8은 또한 M. Richter 등, 2020, Nature Biotechnology, doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z에 기재된 바와 같이, 파지-보조 비연속 진화(PANCE) 및 파지-보조 연속 진화(PACE) 후 TadA*7.10에 비해 TadA 변이체에서 아미노산 변화를 나타내며, 상기 문헌의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, TadA*8은 TadA*8a, TadA*8b, TadA*8c, TadA*8d, 또는 TadA*8e이다. 일부 구현예에서, TadA*8은 TadA*8e이다.
표 8. 추가적인
TadA
*8
변이체
일 구현예에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 Cas9 닉카제에 연결된 본원에 기재된 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*8)에 연결된 야생형 TadA를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일 TadA*8 도메인(예를 들어, 단량체로 제공됨)을 포함한다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 이종이량체를 형성할 수 있는 TadA*8 및 TadA(wt)를 포함한다. 예시적인 서열은 다음과 같다:
TadA(wt) 또는 "TadA 참조 서열":
TadA*7.10:
TadA*8:
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본원에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 개시내용은 특정 퍼센트 동일성을 갖는 임의의 데아미나제 도메인 및 본원에 기재된 임의의 돌연변이 또는 이의 조합을 제공한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 참조 서열, 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 당업계에 알려져 있거나 또는 본원에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 적어도 5 개, 적어도 10 개, 적어도 15 개, 적어도 20 개, 적어도 25 개, 적어도 30 개, 적어도 35 개, 적어도 40 개, 적어도 45 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 적어도 100 개, 적어도 110 개, 적어도 120 개, 적어도 130 개, 적어도 140 개, 적어도 150 개, 적어도 160 개, 또는 적어도 170 개의 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, TadA*8은 굵은 글씨로 제시된 임의의 하기 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, TadA*8은 밑줄로 제시된 임의의 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다:
예를 들어, TadA*8은 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, 아미노산 위치 82 및/또는 166(예를 들어, V82S, T166R)에서 단독으로 또는 하기 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및/또는 Q154R 중 임의의 하나 이상과 조합하여 변경을 포함한다. 특정 구현예에서, 변경의 조합은 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이에 비해, Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 TadA*8이다:
일부 구현예에서, TadA*8은 절두된다. 일부 구현예에서, 절두된 TadA*8은 전장 TadA*8에 비해 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20 개의 N-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있다. 일부 구현예에서, 절두된 TadA*8은 전장 TadA*8에 비해 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있다. 일부 구현예에서 아데노신 데아미나제 변이체는 전장 TadA*8이다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 Cas9 닉카제에 연결된 본원에 기재된 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*8)에 연결된 야생형 TadA를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일 TadA*8 도메인(예를 들어, 단량체로서 제공됨)을 포함한다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 이종이량체를 형성할 수 있는 TadA*8 및 TadA(wt)를 포함한다.
가이드 RNA가 있는
Cas9
복합체
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질, 및 융합 단백질의 Cas9 도메인(예를 들어, dCas9, 뉴클레아제 활성 Cas9, 또는 Cas9 닉카제)에 결합된 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 제공한다. 일부 구현예에서, 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 15 내지 100 개의 뉴클레오티드 길이이며 표적 서열에 상보적인 적어도 10 개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 표적 서열에 상보적인 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 DNA 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 박테리아, 효모, 진균, 곤충, 식물, 또는 동물의 게놈 내의 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 인간의 게놈 내의 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 단부는 표준 PAM 서열(NGG)에 바로 인접한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 단부는 비-표준 PAM 서열(예를 들어, 표 1 또는 5'-NAA-3'에 나열된 서열)에 바로 인접한다. 일부 구현예에서, 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 관심 유전자(예를 들어, 질환 또는 장애와 연관된 유전자) 내의 서열에 상보적이다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 융합 단백질, 또는 복합체의 사용 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 측면은 DNA 분자를 본원에 제공된 임의의 융합 단백질, 및 적어도 하나의 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 가이드 RNA는 약 15-100 개의 뉴클레오티드 길이이며 표적 서열에 상보적인 적어도 10 개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 단부는 AGC, GAG, TTT, GTG, 또는 CAA 서열에 바로 인접한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 단부는 NGA, NGCG, NGN, NNGRRT, NNNRRT, NGCG, NGCN, NGTN, NGTN, NGTN, 또는 5'(TTTV) 서열에 바로 인접한다.
각각의 서열에서 특이적 위치 및 잔기의 넘버링은 사용되는 특정 단백질 및 넘버링 방식에 따라 달라짐이 이해될 것이다. 넘버링은 예를 들어, 성숙 단백질의 전구체 및 성숙 단백질 자체에서 상이할 수 있고, 종 간의 서열 차이는 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 임의의 상동성 단백질 및 각각의 암호화 핵산에서 각각의 잔기를 식별할 수 있을 것이다.
표적 부위, 예를 들어, 편집될 돌연변이를 포함하는 부위에 본원에 개시된 임의의 융합 단백질을 표적화하기 위해, 전형적으로 가이드 RNA와 함께 융합 단백질을 공발현하는 것이 필요함이 당업자에게 명백할 것이다. 본원의 다른 곳에서 보다 상세히 설명된 바와 같이, 가이드 RNA는 전형적으로 Cas9 결합을 허용하는 tracrRNA 프레임워크, 및 Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질에 서열 특이성을 부여하는 가이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 가이드 RNA 및 tracrRNA는 2 개의 핵산 분자로서 개별적으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 구조를 포함하며, 여기서 가이드 서열은 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 가이드 서열운 전형적으로 20 개의 뉴클레오티드 길이이다. Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특이적 게놈 표적 부위로 표적화하기에 적합한 가이드 RNA의 서열은 본 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 적합한 가이드 RNA 서열은 전형적으로 편집될 표적 뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 있는 50 개의 뉴클레오티드 내에서 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 임의의 제공된 융합 단백질을 특이적 표적 서열에 표적화하기에 적합한 일부 예시적인 가이드 RNA 서열이 본원에 제공된다.
추가적인 도메인
본원에 기재된 염기 편집기는 폴리뉴클레오티드의 핵염기의 핵염기 편집, 변형 또는 변경을 용이하게 하는 데 도움이 되는 임의의 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인(예를 들어, Cas9), 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 데아미나제 도메인), 및 하나 이상의 추가적인 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 추가적인 도메인은 염기 편집기의 효소적 또는 촉매적 기능, 염기 편집기의 결합 기능을 용이하게 하거나, 또는 원하는 염기 편집 결과를 방해할 수 있는 세포 기구(예를 들어, 효소)의 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 뉴클레아제, 닉카제, 재조합효소, 데아미나제, 메틸트랜스퍼라제, 메틸라제, 아세틸라제, 아세틸트랜스퍼라제, 전사 활성인자, 또는 전사 억제인자 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 우라실 글리코실라제 억제제(UGI) 도메인을 포함할 수 있다. UGI 도메인은 예를 들어 C의 탈아미노화에 의해 형성된 U를 C 핵염기로 되돌리는 전환을 억제함으로써 사이티딘 데아미나제 도메인을 포함하는 염기 편집기의 효율을 개선시킬 수 있다. 일부 경우에, U:G 이종이중체 DNA의 존재에 대한 세포 DNA 복구 반응은 세포에서 핵염기 편집 효율의 감소를 담당할 수 있다. 이러한 경우에, 우라실 DNA 글리코실라제(UDG)는 세포의 DNA에서 U의 제거를 촉매화할 수 있으며, 이는 염기 절제 복구(BER)를 개시하여, 대부분 U:G 쌍에서 C:G 쌍으로의 복귀를 초래할 수 있다. 이러한 경우에, BER은 단일 가닥에 결합하고/하거나, 편집된 염기를 차단하고/하거나, UGI를 억제하고/하거나, BER을 억제하고/하거나, 편집된 염기를 보호하고/하거나, 편집되지 않은 가닥의 복구를 촉진하는 하나 이상의 도메인을 포함하는 염기 편집기에서 억제될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 UGI 도메인을 포함하는 염기 편집기 융합 단백질을 고려한다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 도메인으로서 이중-가닥 파괴(DSB) 결합 단백질의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, DSB 결합 단백질은 DSB의 단부에 결합할 수 있고 분해로부터 이들을 보호할 수 있는 박테리오파지 Mu의 Gam 단백질을 포함할 수 있다. Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
추가적으로, 일부 구현예에서, Gam 단백질은 염기 편집기의 N 말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, Gam 단백질은 염기 편집기의 C-말단에 융합될 수 있다. 박테리오파지 Mu의 Gam 단백질은 이중 가닥 파괴(DSB)의 단부에 결합하고 분해로부터 이들을 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, DSB의 자유 단부를 결합하기 위해 Gam을 사용하는 것은 염기 편집 과정 동안 indel 형성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 174-잔기 Gam 단백질은 염기 편집기의 N 말단에 융합된다. Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017) 참조. 일부 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 야생형 도메인에 비해 염기 편집기 도메인의 길이를 변경할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산의 결실은 염기 편집기의 길이를 감소시킬 수 있다. 또 다른 경우에, 돌연변이 또는 돌연변이들은 야생형 도메인에 비해 도메인의 길이를 변경하지 않는다. 예를 들어, 임의의 도메인에서 치환(들)은 염기 편집기의 길이를 변경하지 않는다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 도메인으로서 핵산 폴리머라제(NAP)의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기는 진핵생물 NAP의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 DNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 손상통과 폴리머라제 활성을 갖는다. 일부 경우에, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 손상통과 DNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 Rev7, Rev1 복합체, 폴리머라제 이오타, 폴리머라제 카파, 또는 폴리머라제 에타이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 진핵생물 폴리머라제 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론, 감마, 에타, 이오타, 카파, 람다, 뮤, 또는 누 구성요소이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 핵산 폴리머라제(예를 들어, 손상통과 DNA 폴리머라제)와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
염기 편집기 시스템
본원에 제공된 염기 편집기 시스템은 (a) 대상체의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 이중-가닥 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 DNA 또는 RNA)의 표적 뉴클레오티드 서열을 아데노신 데아미나제 도메인을 포함하는 염기 편집기 시스템과 접촉시키며, 여기서 상기 언급된 도메인은 폴리뉴클레오티드 결합 도메인에 융합되어 있는 것이며, 이에 의해 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 및 적어도 하나의 가이드 다핵산(예를 들어, gRNA) 내의 하나 이상의 염기에서 변화를 유도할 수 있는 핵 염기 편집기를 형성하며, 여기서 표적 뉴클레오티드 서열은 표적화된 핵염기 쌍을 포함하는 것인, 단계; (b) 표적 영역의 가닥 분리를 유도하는 단계; (c) 표적 영역의 단일 가닥에서 표적 핵염기 쌍의 제1 핵염기를 제2 핵염기로 전환시키는 단계; 및 (d) 표적 영역의 하나 이하의 가닥을 절단하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 핵염기 염기에 상보적인 제3 핵염기는 제2 핵염기에 상보적인 제4 핵염기로 대체된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 생략됨이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 표적화된 핵염기 쌍은 하나 이상의 유전자에서 복수의 핵염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 유전자에서 복수의 핵염기 쌍의 다중 편집을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 핵염기 쌍은 동일한 유전자에 위치한다. 일부 구현예에서, 복수의 핵염기 쌍은 하나 이상의 유전자에 위치하며, 여기서 적어도 하나의 유전자는 상이한 유전자좌에 위치한다.
일부 구현예에서, 절단된 단일 가닥(닉 가닥)은 가이드 핵산에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 절단된 단일 가닥은 제1 핵염기를 포함하는 가닥의 반대편에 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 Cas9 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 염기는 아데닌이고, 제2 염기는 G, C, A, 또는 T가 아니다. 일부 구현예에서, 제2 염기는 이노신이다.
본원에는 염기 편집기 시스템을 사용하여 핵염기를 편집하기 위한 시스템, 조성물, 및 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및 핵염기를 편집하기 위한 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 데아미나제 도메인)을 포함하는 염기 편집기(BE); 및 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인과 함께 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및 핵염기를 편집하기 위한 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 데아미나제 도메인)을 포함하는 염기 편집기(BE), 및 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인과 함께 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 RNA 결합 도메인이다. 일부 경우에, 데아미나제 도메인은 아데닌 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제일 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "아데닌 데아미나제" 및 "아데노신 데아미나제"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 일부 경우에, 데아미나제 도메인은 아데닌 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제일 수 있다. 핵염기 편집 단백질의 상세한 내용은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344(WO2017/070632)에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)을 참조하여, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 데아미나제를 표적 핵산 서열에 표적화하기 위해 활용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 쌍의 가이드 폴리뉴클레오티드를 활용하여 상이한 데아미나제를 표적 핵산 서열에 표적화할 수 있다.
염기 편집기 시스템의 핵염기 구성요소 및 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 구성요소는 서로 공유적 또는 비-공유적으로 회합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데아미나제 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 데아미나제 도메인에 연결되거나 또는 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 데아미나제 도메인과 비-공유적으로 상호작용하거나 또는 회합함으로써 데아미나제 도메인을 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵염기 편집 구성요소, 예를 들어, 데아미나제 구성요소는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 일부인 추가적인 이종성 부분 또는 도메인과 상호작용하거나, 회합하거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있는 추가적인 이종성 부분 또는 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리펩티드에 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 회합하거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드에 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 회합하거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리펩티드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드 링커에 결합할 수 있다. 추가적인 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 K 상동성(KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 멸균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인식 모티프일 수 있다.
염기 편집기 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 염기 편집기 시스템의 구성요소는 공유 결합, 비공유 상호작용, 또는 이의 회합 및 상호작용의 임의의 조합을 통해 서로 회합될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 데아미나제 도메인은 가이드 폴리뉴클레오티드에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템의 핵염기 편집 구성요소, 예를 들어, 데아미나제 구성요소는 가이드 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 분절(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 모티프)와 상호작용하거나, 회합하거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있는 추가적인 이종성 부분 또는 도메인(예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오티드 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분 또는 도메인(예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오티드 결합 도메인)은 데아미나제 도메인에 연결되거나 또는 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리펩티드에 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 회합하거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드에 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 회합하거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리펩티드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드 링커에 결합할 수 있다. 추가적인 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 K 상동성(KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 멸균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인식 모티프일 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 염기 절제 복구(BER) 구성요소의 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 염기 편집기 시스템의 구성요소는 공유 결합, 비공유 상호작용, 또는 이의 회합 및 상호작용의 임의의 조합을 통해 서로 회합될 수 있음이 이해되어야 한다. BER 구성요소의 억제제는 염기 절제 복구 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 우라실 DNA 글리코실라제 억제제(UGI)일 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 이노신 염기 절제 복구 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 염기 절제 복구의 억제제에 연결되거나 또는 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 데아미나제 도메인 및 염기 절제 복구의 억제제에 연결되거나 또는 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 염기 절제 복구의 억제제와 비-공유적으로 상호작용하거나 또는 회합함으로써 염기 절제 복구의 억제제를 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제 구성요소는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 일부인 추가적인 이종성 부분 또는 도메인과 상호작용하거나, 회합하거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있는 추가적인 이종성 부분 또는 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 가이드 폴리뉴클레오티드에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 가이드 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 분절(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 모티프)과 상호작용하거나, 회합하거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있는 추가적인 이종성 부분 또는 도메인(예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오티드 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드의 추가적인 이종성 부분 또는 도메인(예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오티드 결합 도메인)은 염기 절제 복구의 억제제에 연결되거나 또는 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드에 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 회합하거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리펩티드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드 링커에 결합할 수 있다. 추가적인 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 K 상동성(KH) 도메인, MS2 코트 단백질 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 멸균 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인식 모티프일 수 있다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 편집된 가닥의 염기 절제 복구를 억제한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 편집되지 않은 가닥을 보호하거나 또는 결합한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 UGI 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 촉매적으로 불활성 이노신-특이적 뉴클레아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 닉카제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 쌍의 의도된 편집은 PAM 부위의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 염기 쌍의 의도된 편집은 PAM 부위의 상류에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 염기-쌍의 의도된 편집은 PAM 부위의 하류에 있다. 일부 구현예에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 하류 스트림에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 방법은 표준(예를 들어, NGG) PAM 부위를 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집기는 링커 또는 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 1-25 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 5-20 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 표적 영역은 표적 창을 포함하며, 여기서 표적 창은 표적 핵염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 창은 1- 10 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 창은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 염기 쌍의 의도된 편집은 표적 창 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 창은 염기 쌍의 의도된 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 창은 탈아미노화 창이다.
일부 구현예에서, 아데노신 염기 편집기(ABE)는 DNA에서 아데닌을 탈아미노화할 수 있다. 일부 구현예에서, ABE는 BE3의 APOBEC1 구성요소를 천연 또는 조작된 이. 콜라이 TadA, 인간 ADAR2, 마우스 ADA, 또는 인간 ADAT2로 대체함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, ABE는 진화된 TadA 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE 1.2(TadA*-XTEN-nCas9-NLS)이다. 일부 구현예에서, TadA*는 A106V 및 D108N 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, ABE는 2세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 TadA*(TadA*2.1)에서 추가적인 돌연변이 D147Y 및 E155V를 포함하는 ABE2.1이다. 일부 구현예에서, ABE는 인간 알킬 아데닌 DNA 글리코실라제의 촉매적으로 불활성화 버전(E125Q 돌연변이가 있는 AAG)에 융합된 ABE2.1인 ABE2.2이다. 일부 구현예에서, ABE는 이. 콜라이 Endo V의 촉매적으로 불활성화 버전(D35A 돌연변이로 불활성화)에 융합된 ABE2.1인 ABE2.3이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE2.1에서 링커보다 2 개 긴 링커(32 개의 아미노산, (SGGS)2-XTEN-(SGGS)2)를 갖는 ABE2.6이다. 일부 구현예에서, ABE는 추가적인 야생형 TadA 단량체로 테더링된 ABE2.1인 ABE2.7이다. 일부 구현예에서, ABE는 추가적인 TadA*2.1 단량체로 테더링된 ABE2.1인 ABE2.8이다. 일부 구현예에서, ABE는 진화된 TadA(TadA*2.1)가 ABE2.1의 N-말단에 직접 융합된 ABE2.9이다. 일부 구현예에서, ABE는 야생형 TadA가 ABE2.1의 N-말단에 직접 융합된 ABE2.10이다. 일부 구현예에서, ABE는 TadA* 단량체의 N-말단에서 불활성화 E59A 돌연변이가 있는 ABE2.9인 ABE2.11이다. 일부 구현예에서, ABE는 내부 TadA* 단량체에 불활성화 E59A 돌연변이가 있는 ABE2.9인 ABE2.12이다.
일부 구현예에서, ABE는 3세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 3 개의 추가적인 TadA 돌연변이(L84F, H123Y, 및 I156F)가 있는 ABE2.3인 ABE3.1이다.
일부 구현예에서, ABE는 4세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 추가적인 TadA 돌연변이 A142N(TadA*4.3)이 있는 ABE3.1인 ABE4.3이다.
일부 구현예에서, ABE는 5세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 생존 클론(H36L, R51L, S146C, 및 K157N)으로부터 ABE3.1 내로 돌연변이의 컨센서스 세트를 유입함으로써 생성된 ABE5.1이다. 일부 구현예에서, ABE는 내부 진화된 TadA*에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물을 갖는 ABE5.3이다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 9에 제시된 바와 같이, ABE5.2, ABE5.4, ABE5.5, ABE5.6, ABE5.7, ABE5.8, ABE5.9, ABE5.10, ABE5.11, ABE5.12, ABE5.13, 또는 ABE5.14이다. 일부 구현예에서, ABE는 6세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 9에 제시된 바와 같이, ABE6.1, ABE6.2, ABE6.3, ABE6.4, ABE6.5, 또는 ABE6.6이다. 일부 구현예에서, ABE는 7세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 9에 제시된 바와 같이, ABE7.1, ABE7.2, ABE7.3, ABE7.4, ABE7.5, ABE7.6, ABE7.7, ABE7.8, ABE 7.9, 또는 ABE7.10이다.
표 9. ABE의 유전자형
일부 구현예에서, 염기 편집기는 8세대 ABE(ABE8)이다. 일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체를 함유한다. 일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체를 함유하는 단량체성 작제물을 포함한다("ABE8.x-m"). 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.1)을 갖는 ABE8.1-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단랑체성 작제물(TadA*8.2)을 갖는 ABE8.2-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.3)을 갖는 ABE8.3-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.4)을 갖는 ABE8.4-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.5)을 갖는 ABE8.5-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.6)을 갖는 ABE8.6-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.7)을 갖는 ABE8.7-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.8)을 갖는 ABE8.8-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.9)을 갖는 ABE8.9-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.10)을 갖는 ABE8.10-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.11)을 갖는 ABE8.11-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.12)을 갖는 ABE8.12-m이다.
일부 구현예에서, ABE8은 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.13)을 갖는 ABE8.13-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y 및 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.14)을 갖는 ABE8.14-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.15)을 갖는 ABE8.15-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.16)을 갖는 ABE8.16-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.17)을 갖는 ABE8.17-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.18)을 갖는 ABE8.18-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.19)을 갖는 ABE8.19-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y, V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.20)을 갖는 ABE8.20-이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.21)을 갖는 ABE8.21-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.22)을 갖는 ABE8.22-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.23)을 갖는 ABE8.23-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), 및 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.24을 갖는 ABE8.24-m이다.
일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물을 갖는다("ABE8.x-d"). 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.1)을 갖는 ABE8.1-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.2)을 갖는 ABE8.2-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.3)을 갖는 ABE8.3-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.4)을 갖는 ABE8.4-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.5)을 갖는 ABE8.5-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.6)을 갖는 ABE8.6-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.7)을 갖는 ABE8.7-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.8)을 갖는 ABE8.8-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.9)을 갖는 ABE8.9-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.10)을 갖는 ABE8.10-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.11)을 갖는 ABE8.11-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.12)을 갖는 ABE8.12-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.13)을 갖는 ABE8.13-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y 및 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.14)을 갖는 ABE8.14-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.15)을 갖는 ABE8.15-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.16)을 갖는 ABE8.16-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.17)을 갖는 ABE8.17-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.18)을 갖는 ABE8.18-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.19)을 갖는 ABE8.19-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y, V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.20)을 갖는 ABE8.20-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.21)을 갖는 ABE8.21-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.22)을 갖는 ABE8.22-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.23)을 갖는 ABE8.23-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), 및 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.24)을 갖는 ABE8.24-d이다.
일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물을 갖는다("ABE8.x-7"). 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.1)을 갖는 ABE8.1-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.2)을 갖는 ABE8.2-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.3)을 갖는 ABE8.3-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.4)을 갖는 ABE8.4-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.5)을 갖는 ABE8.5-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.6)을 갖는 ABE8.6-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.7)을 갖는 ABE8.7-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.8)을 갖는 ABE8.8-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.9)을 갖는 ABE8.9-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.10)을 갖는 ABE8.10-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.11)을 갖는 ABE8.11-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.12)을 갖는 ABE8.12-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.13)을 갖는 ABE8.13-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y 및 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.14)을 갖는 ABE8.14-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.15)을 갖는 ABE8.15-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.16)을 갖는 ABE8.16-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.17)을 갖는 ABE8.17-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.18)을 갖는 ABE8.18-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.19)을 갖는 ABE8.19-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y, V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.20)을 갖는 ABE8.20-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.21)을 갖는 ABE8.21-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.22)을 갖는 ABE8.22-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.23)을 갖는 ABE8.23-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), 및 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.24)을 갖는 ABE8.24-7이다.
일부 구현예에서, ABE는 하기 표 10에 나타낸 바와 같은 ABE8.1-m, ABE8.2-m, ABE8.3-m, ABE8.4-m, ABE8.5-m, ABE8.6-m, ABE8.7-m, ABE8.8-m, ABE8.9-m, ABE8.10-m, ABE8.11-m, ABE8.12-m, ABE8.13-m, ABE8.14-m, ABE8.15-m, ABE8.16-m, ABE8.17-m, ABE8.18-m, ABE8.19-m, ABE8.20-m, ABE8.21-m, ABE8.22-m, ABE8.23-m, ABE8.24-m, ABE8.1-d, ABE8.2-d, ABE8.3-d, ABE8.4-d, ABE8.5-d, ABE8.6-d, ABE8.7-d, ABE8.8-d, ABE8.9-d, ABE8.10-d, ABE8.11-d, ABE8.12-d, ABE8.13-d, ABE8.14-d, ABE8.15-d, ABE8.16-d, ABE8.17-d, ABE8.18-d, ABE8.19-d, ABE8.20-d, ABE8.21-d, ABE8.22-d, ABE8.23-d, 또는 ABE8.24-d이다.
표 10:
ABE8
염기 편집기
일부 구현예에서, ABE8은 R26C, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8a)을 갖는 ABE8a-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8b)을 갖는 ABE8b-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 R26C, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8c)을 갖는 ABE8c-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V88A, T111R, D119N, 및 F149Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8d)을 갖는 ABE8d-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8e)을 갖는 ABE8e-m이다.
일부 구현예에서, ABE8은 R26C, A109S, T111R, D119, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8a)을 갖는 ABE8a-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8b)을 갖는 ABE8b-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 R26C, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8c)을 갖는 ABE8c-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V88A, T111R, D119N, 및 F149Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8d)을 갖는 ABE8d-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8e)을 갖는 ABE8e-d이다.
일부 구현예에서, ABE8은 R26C, A109S, T111R, D119, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8a)을 갖는 ABE8a-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8b)을 갖는 ABE8b-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 R26C, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8c)을 갖는 ABE8c-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V88A, T111R, D119N, 및 F149Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8d)을 갖는 ABE8d-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8e)을 갖는 ABE8e-7이다.
일부 구현예에서, ABE는 하기 표 11에 제시된 바와 같이, ABE8a-m, ABE8b-m, ABE8c-m, ABE8d-m, ABE8e-m, ABE8a-d, ABE8b-d, ABE8c-d, ABE8d-d, 또는 ABE8e-d이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE8e-m 또는 ABE8e-d이다. ABE8e는 SpCas9 이외의 Cas 상동체, 예를 들어, SaCas9, SaCas9-KKH, Cas12a 상동체, 예를 들어, LbCas12a, enAs-Cas12a, SpCas9-NG 및 원형으로 치환된 CP1028-SpCas9 및 CP1041-SpCas9와 함께 사용될 때 효율적인 아데닌 염기 편집 활성 및 낮은 indel 형성을 나타낸다. 표 11에서 ABE8e에 대해 제시된 돌연변이 이외에, 표적외 RNA 및 DNA 편집은 TadA 도메인에 V106W 치환을 도입함으로써 감소되었다(M. Richter 등, 2020, Nature Biotechnology, doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z에 기재된 바와 같으며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
표 11: 추가적인 아데노신
데아미나제
염기 편집기 8
변이체
일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, ABE9)는 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, TadA*9)를 원형 치환체 Cas9(예를 들어, CP5 또는 CP6) 및 이분 핵 국소화 서열을 포함하는 스캐폴드 내로 클로닝함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, ABE7.9, ABE7.10, ABE8, 또는 ABE9)는 NGC PAM CP5 변이체(에스. 피로게네스 Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, ABE7.9, ABE7.10, ABE8, 또는 ABE9)는 AGA PAM CP5 변이체(에스. 피로게네스 Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, ABE7.9, ABE7.10, 또는 ABE8)는 NGC PAM CP6 변이체(에스. 피로게네스 Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어 ABE7.9, ABE7.10, 또는 ABE8)는 AGA PAM CP6 변이체(에스. 피로게네스 Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다.
일부 구현예에서, ABE는 하기 표 12에 제시된 바와 같은 유전자형을 갖는다.
표 12. ABE의 유전자형
하기 표 13에 제시된 바와 같이, 40 개의 ABE8의 유전자형이 기재되어 있다. ABE의 진화된 이. 콜라이 TadA 부분에서의 잔기 위치가 표시된다. ABE7.10 돌연변이와 구별될 때 ABE8의 돌연변이 변화가 제시된다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 13에 제시된 바와 같은 ABE 중 하나의 유전자형을 갖는다.
표 13. 진화된
TadA의
잔기
식별
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.1이다:
ABE8.1_Y147T_CP5_NGC PAM_단량체
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타낸다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.1이다:
pNMG-B335 ABE8.1_Y147T_CP5_NGC PAM_단량체:
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타낸다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.14이다:
NGC PAM CP5가 있는 pNMG-357_ABE8.14
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타낸다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.8-m이다:
ABE8.8-m
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타내고, 이중 밑줄 친 서열은 돌연변이를 나타낸다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.8-d이다:
ABE8.8-d
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타내고, 이중 밑줄 친 서열은 돌연변이를 나타낸다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.13-m이다:
ABE8.13-m
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타내고, 이중 밑줄 친 서열은 돌연변이를 나타낸다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.13-d이다:
ABE8.13-d
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타내고, 이중 밑줄 친 서열은 돌연변이를 나타낸다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.17-m이다:
ABE8.17-m
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타내고, 이중 밑줄 친 서열은 돌연변이를 나타낸다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.17-d이다:
ABE8.17-d
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타내고, 이중 밑줄 친 서열은 돌연변이를 나타낸다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.20-m이다:
ABE8.20-m
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타내고, 이중 밑줄 친 서열은 돌연변이를 나타낸다.
일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.20-d이다:
ABE8.20-d
상기 서열에서, 평문은 아데노신 데아미나제 서열을 나타내고, 굵은 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타내고, 이중 밑줄 친 서열은 돌연변이를 나타낸다.
일부 구현예에서, ABE8은 하기 서열로부터 선택된다:
01. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147T
02. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147R
03. 모노ABE8.1_bpNLS + Q154S
04. 모노ABE8.1_bpNLS + Y123H
05. 모노ABE8.1_bpNLS + V82S
06. 모노ABE8.1_bpNLS + T166R
07. 모노ABE8.1_bpNLS + Q154R
08. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_Y123H
09. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_I76Y
10. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_T166R
11. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147T_Q154R
12. 모노ABE8.1_bpNLS + Y147T_Q154S
13. 모노ABE8.1_bpNLS + H123Y123H_Y147R_Q154R_I76Y
14. 모노ABE8.1_bpNLS + V82S + Q154R
ABE9
본원에는 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 9세대 염기 편집기가 제공된다. 본원에서 표 14 및 18은 신규 ABE9 핵염기 편집기를 제시하며 여기서 아데노신 데아미나제 변이체(TadA*9)는 본원에 기재된 바와 같은 ABE 7*10 참조 서열에 비해 변경을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 표 14 및 18에 사용된 바와 같은 용어 "단량체"는 표 14 및 18에 기재된 변경을 포함하는 TadA*7.10의 단량체성 형태를 지칭한다. 표 14 및 18에 사용된 바와 같은 용어 "이종이량체"는 표 14 및 18에 기재된 변경을 포함하고 본원에 기재된 바와 같은 TadA*7.10에 융합된 명시된 야생형 이. 콜라이 TadA 아데노신 데아미나제를 지칭한다.
표 14
일부 구현예에서, 염기 편집기는 우라실 글리코실라제 억제제(UGI)의 전부 또는 일부를 포함하는 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 우라실 DNA 글리코실라제(UDG)와 같은 우라실 결합 단백질(UBP)의 전부 또는 일부를 포함하는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 핵산 폴리머라제의 전부 또는 일부를 포함하는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 핵산 폴리머라제 또는 이의 부분은 손상통과 DNA 폴리머라제이다.
일부 구현예에서, 염기 편집기의 도메인은 다중 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Cas9로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기는 야생형 또는 천연 Cas9의 REC 엽 및 NUC 엽에 상응하는 REC 엽 및 NUC 엽을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 염기 편집기는 RuvCI 도메인, BH 도메인, REC1 도메인, REC2 도메인, RuvCII 도메인, L1 도메인, HNH 도메인, L2 도메인, RuvCIII 도메인, WED 도메인, TOPO 도메인 또는 CTD 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 하나 이상의 도메인은 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 야생형 버전에 비해 돌연변이(예를 들어, 치환, 삽입, 결실)를 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인의 HNH 도메인은 H840A 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인의 RuvCI 도메인은 D10A 치환을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 염기 편집기의 상이한 도메인(예를 들어, 인접한 도메인)은 하나 이상의 링커 도메인(예를 들어, XTEN 링커 도메인)을 사용하거나 또는 사용하지 않고 서로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 결합(예를 들어, 공유 결합), 화학 기, 또는 2 개의 분자 또는 모이어티를 연결하는 분자, 예를 들어, 융합 단백질의 2 개의 도메인, 예컨대, 예를 들어, 제1 도메인(예를 들어, Cas9-유래 도메인) 및 제2 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나제 도메인)일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 공유 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합, 디술피드 결합, 탄소-헤테로 원자 결합 등)이다. 특정 구현예에서, 링커는 아미드 결합의 탄소 질소 결합이다. 특정 구현예에서, 링커는 환형 또는 비환형, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 특정 구현예에서, 링커는 중합체성(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노알칸산의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노알칸산(예를 들어, 글리신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노헥산산(Ahx)의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 탄소환형 모이어티(예를 들어, 사이클로펜탄, 사이클로헥산)를 기반으로 한다. 다른 구현예에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(PEG)를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 페닐 고리를 기반으로 한다. 링커는 펩티드에서 링커까지 친핵체(예를 들어, 티올, 아미노)의 부착을 용이하게 하는 작용화된 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 친전자체가 링커의 일부로 사용될 수 있다. 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클(Michael) 수용체, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드, 및 이소티오시아네이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 링커는 Cas9 뉴클레아제 도메인을 포함하는 RNA-프로그램가능한 뉴클레아제의 gRNA 결합 도메인, 및 핵산 편집 단백질의 촉매 도메인을 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 dCas9 및 제2 도메인(예를 들어, UGI, 사이티딘 데아미나제 등)을 연결한다.
전형적으로, 링커는 2 개의 기, 분자, 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나, 또는 이에 의해 플랭킹되고 공유 결합을 통해 서로 연결되어, 2 개를 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산(예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 구현예에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학 모이어티이다. 일부 구현예에서, 링커는 2-100 개의 아미노산 길이, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 또는 150-200 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 약 3 내지 약 104 개(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개)의 아미노산 길이이다. 더 길거나 또는 더 짧은 링커가 또한 고려된다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 XTEN 링커로도 지칭될 수 있는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES를 포함한다. 핵염기 편집기에 대한 활성을 위한 최적의 길이를 달성하기 위해, 융합 단백질 도메인을 연결하기 위한 임의의 방법이 이용될 수 있다(예를 들어, (SGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n, 및 (G)n을 형성하는 매우 유연한 링커에서, (EAAAK)n, (GGS)n, SGSETPGTSESATPES(예를 들어, Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82를 참조하며; 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨), 또는 (XP)n 모티프를 형성하는 보다 강성 링커까지. 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다. 일부 구현예에서, 링커는 (GGS)n 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질의 Cas9 도메인은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES를 포함하는 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 링커는 복수의 프롤린 잔기를 포함하며 5-21, 5-14, 5-9, 5-7 개의 아미노산 길이, 예를 들어, PAPAP, PAPAPA, PAPAPAP, PAPAPAPA, P(AP)4, P(AP)7, P(AP)10이다(예를 들어, Tan J, Zhang F, Karcher D, Bock R. Engineering of high-precision base editors for site-specific single nucleotide replacement. Nat Commun. 2019 Jan 25;10(1):439를 참조하며; 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다). 이러한 프롤린-풍부 링커는 또한 "강성" 링커로 불린다.
또 다른 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 데아미나제(DNA 데아미나제), 예를 들어, 아데노신 또는 사이티딘 데아미나제와 비공유적으로 상호작용하고, 최소 또는 감소된 방관자 또는 표적-인접 효과로 아데노신 또는 사이티딘 데아미나제를 특이적 편집을 위한 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 핵염기에 일시적으로 유인하는 구성성분(단백질)을 포함한다. 데아미나제-상호작용 단백질을 수반하는 이러한 비공유 시스템 및 방법은 DNA 데아미나제를 특정 게놈 표적 핵염기에 유인하는 역할을 하고 표적내 및 표적-인접 편집의 이벤트를 분리하여, 더 정확한 단일 염기 치환 돌연변이의 달성을 향상시킨다. 일 구현예에서, 데아미나제-상호작용 단백질은 데아미나제의 활성(촉매적) 부위가 표적 핵염기(예를 들어, 각각 아데노신 또는 사이티딘)와 결합하는 것을 차단하거나 또는 방해하지 않고 데아미나제(예를 들어, 아데노신 데아미나제 또는 사이티딘 데아미나제)에 결합한다. "MagnEdit"라 불리는 이러한 시스템은 Cas9 및 gRNA 복합체에 묶인 단백질 상호작용을 수반하고 공동-발현된 아데노신 또는 사이티딘 데아미나제(외인성 또는 내인성)를 끌어들여 특이적 게놈 표적 부위를 편집할 수 있고, McCann, J. 등, 2020, "MagnEdit - interacting factors that recruit DNA-editing enzymes to single base targets," Life-Science-Alliance, Vol. 3, No. 4 (e201900606), (doi 10.26508/Isa.201900606)에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일 구현예에서, DNA 데아미나제는 본원에 기재된 바와 같은 ABE9 아데노신 데아미나제 변이체이다. 또 다른 구현예에서, "Suntag"라고 명명되는 시스템은 예를 들어, Tanenbaum, M.E. 등, "A protein tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging," Cell. 2014 October 23; 159(3): 635-646. doi:10.1016/j.cell.2014.09.039; 및 Huang, Y.-H. 등, 2017, "DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A," Genome Biol 18: 176. doi:10.1186/s13059-017-1306-z에 기재된 바와 같이, 염기 편집기의 단백질(예를 들어, 아데노신 데아미나제 또는 사이티딘 데아미나제) 구성성분, 또는 이의 다중 카피를 폴리뉴클레오티드 표적 부위에 모집하여 인접한 표적 편집이 감소된 부위에서 염기 편집을 달성하기 위해 사용되는 비공유 상호작용 구성성분을 수반하며, 상기 문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일 구현예에서, DNA 데아미나제는 본원에 기재된 바와 같은 ABE9 아데노신 데아미나제 변이체이다
링커
특정 구현예에서, 링커는 본 발명의 임의의 펩티드 또는 펩티드 도메인을 연결하는 데 사용될 수 있다. 링커는 공유 결합만큼 단순할 수 있거나, 또는 많은 원자 길이의 중합체성 링커일 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 폴리펩티드이거나 또는 아미노산을 기반으로 한다. 다른 구현예에서, 링커는 펩티드와 유사하지 않다. 특정 구현예에서, 링커는 공유 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합, 디술피드 결합, 탄소-헤테로원자 결합 등)이다. 특정 구현예에서, 링커는 아미드 결합의 탄소-질소 결합이다. 특정 구현예에서, 링커는 환형 또는 비환형, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 특정 구현예에서, 링커는 중합체성(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노알칸산의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노알칸산(예를 들어, 글리신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노헥산산(Ahx)의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 탄소환형 모이어티(예를 들어, 사이클로펜탄, 사이클로헥산)를 기반으로 한다. 다른 구현예에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(PEG)를 포함한다. 다른 구현예에서, 링커는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 페닐 고리를 기반으로 한다. 링커는 펩티드에서 링커까지 친핵체(예를 들어, 티올, 아미노)의 부착을 용이하게 하는 작용화된 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 친전자체는 링커의 일부로 사용될 수 있다. 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클 수용체, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드, 및 이소티오시아네이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산(예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 구현예에서, 링커는 결합(예를 들어, 공유 결합), 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학 모이어티이다. 일부 구현예에서, 링커는 약 3 내지 약 104 개(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개)의 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제 및 napDNAbp는 4, 16, 32, 또는 104 개의 아미노산 길이인 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 링커는 약 3 내지 약 104 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 링커를 통해 서로 융합된 아데노신 데아미나제 및 Cas9 도메인을 포함한다. 핵염기 편집기에 대한 활성을 위한 최적의 길이를 달성하기 위해 데아미나제 도메인(예를 들어, 조작된 ecTadA) 및 Cas9 도메인 사이의 다양한 링커 길이 및 유연성이 이용될 수 있다(예를 들어, (GGGS)n, (GGGGS)n, 및 (G)n을 형성하는 매우 유연한 링커에서 (EAAAK)n, (SGGS)n, SGSETPGTSESATPES(예를 들어, Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82를 참조하며; 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨) 및 (XP)n을 형성하는 보다 강성 링커까지). 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다. 일부 구현예에서, 링커는 (GGS)n 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 사이티딘 데아미나제 및 아데노신 데아미나제 및 Cas9 도메인은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES를 포함하는 링커(예를 들어, XTEN 링커)를 통해 융합된다.
일부 구현예에서, 표적 영역은 표적 창을 포함하며, 여기서 표적 창은 표적 핵염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 창은 1- 10 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 창은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 염기 쌍의 의도된 편집은 표적 창 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 창은 염기 쌍의 의도된 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 창은 탈아미노화 창이다.
추가적으로, 일부 경우에, Gam 단백질은 염기 편집기의 N 말단에 융합될 수 있다. 일부 경우에, Gam 단백질은 염기 편집기의 C-말단에 융합될 수 있다. 박테리오파지 Mu의 Gam 단백질은 이중 가닥 파괴(DSB)의 단부에 결합하고 분해로부터 이들을 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, DSB의 자유 단부를 결합하기 위해 Gam을 사용하는 것은 염기 편집 과정 동안 indel 형성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 174-잔기 Gam 단백질은 염기 편집기의 N 말단에 융합된다. Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017) 참조. 일부 경우에, 돌연변이 또는 돌연변이들은 야생형 도메인에 비해 염기 편집기 도메인의 길이를 변경할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산의 결실은 염기 편집기의 길이를 감소시킬 수 있다. 또 다른 경우에, 돌연변이 또는 돌연변이들은 야생형 도메인에 비해 도메인의 길이를 변경하지 않는다. 예를 들어, 임의의 도메인에서 치환(들)은 염기 편집기의 길이를 변경하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 제공되는 염기 편집 융합 단백질은 예를 들어, 표적 염기가 정의된 영역(예를 들어, "탈아미노화 창") 내에 배치되는 정확한 위치에 위치할 필요가 있다. 일부 경우에, 표적은 4 개의 염기 영역 내에 있을 수 있다. 일부 경우에, 이러한 정의된 표적 영역은 PAM의 상류에 있는 대략 15 개의 염기일 수 있다. Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
정의된 표적 영역은 탈아미노화 창일 수 있다. 탈아미노화 창은 염기 편집기가 표적 뉴클레오티드에 작용하고 탈아미노화하는 정의된 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, 탈아미노화 창은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 염기 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 탈아미노화 창은 PAM의 상류에 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개의 염기이다.
본 개시내용의 염기 편집기는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 편집을 용이하게 하는 임의의 도메인, 특징 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 편집기는 핵 국소화 서열(NLS)을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 NLS는 데아미나제 도메인 및 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 NLS는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인에 C-말단에 위치한다.
본원에 개시된 바와 같은 염기 편집기에 존재할 수 있는 다른 예시적인 특징은 세포질 국소화 서열과 같은 국소화 서열, 핵 외수송 서열과 같은 외수송 서열, 또는 다른 국소화 서열, 뿐만 아니라 융합 단백질의 가용화, 정제, 또는 검출에 유용한 서열 태그이다. 본원에 제공된 적합한 단백질 태그는 비오틴 카르복실라제 운반체 단백질(BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌(HA)-태그, 히스티딘 태그 또는 His-태그로도 지칭되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질(MBP)-태그, nus-태그, 글루타니온-S-트랜스퍼라제(GST)-태그, 녹색 형광 단백질(GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, Softag(예를 들어, Softag 1, Softag 3), strep-태그, 비오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그, 및 SBP-태그를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가적인 적합한 서열은 당업자에게 명백할 것이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 His 태그를 포함한다.
융합 단백질에 포함될 수 있는 단백질 도메인의 비제한적인 예는 데아미나제 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나제), 우라실 글리코실라제 억제제(UGI) 도메인, 에피토프 태그, 및 리포터 유전자 서열을 포함한다.
에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제(GST), 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함한 자가형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가적인 단백질 서열은 DNA 분자에 결합하거나 또는 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합, GAL4 DNA 결합 도메인 융합, 및 단순 포진 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 세포 분자에 결합하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
아데노신
데아미나제
또는
사이티딘
데아미나제
및
Cas9
도메인을 포함하는 융합 단백질의 사용 방법
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 융합 단백질, 또는 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 측면은 DNA 분자를 본원에 기재된 융합 단백질 중 임의의 것, 및 적어도 하나의 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 가이드 RNA는 약 15-100 개 뉴클레오티드 길이이며 표적 서열에 상보적인 적어도 10 개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 단부는 표준 PAM 서열(NGG)에 바로 인접한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 단부는 표준 PAM 서열(NGG)에 바로 인접하지 않다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 단부는 AGC, GAG, TTT, GTG, 또는 CAA 서열에 바로 인접한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 단부는 NGA, NGCG, NGN, NNGRRT, NNNRRT, NGCG, NGCN, NGTN, NGTN, NGTN, 또는 5'(TTTV) 서열에 바로 인접한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 관심 표적을 돌연변이화하는 데 사용된다. 특히, 본원에 기재된 아데노신 데아미나제 핵염기 편집기(또는 사이티딘 데아미나제 핵염기 편집기)는 표적 서열 내에 다중 돌연변이를 만들 수 있다. 이들 돌연변이는 표적의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 아데노신 데아미나제 핵염기 편집기가 조절 영역을 표적화하는 데 사용되는 경우 조절 영역의 기능은 변경되고 하류 단백질의 발현은 감소되거나 또는 제거된다.
각각의 서열에서 특이적 위치 또는 잔기의 넘버링은 사용된 특정 단백질 및 넘버링 체계에 의존하는 것으로 이해될 것이다. 넘버링은 예를 들어, 성숙 단백질의 전구체 및 성숙 단백질 자체에서 상이할 수 있고, 종마다의 서열 차이가 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 서열 정렬 및 상동 잔기의 결정에 의해 임의의 상동 단백질 및 각각의 암호화 핵산에서 각각의 잔기를 식별할 수 있을 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 Cas9 도메인 및 아데노신 데아미나제(또는 사이티딘 데아미나제)를 포함하는 융합 단백질 중 임의의 것을 표적 부위, 예를 들어, 편집될 돌연변이를 포함하는 부위에 표적화하기 위해, 전형적으로 융합 단백질을 가이드 RNA, 예를 들어, sgRNA와 함께 공동-발현할 필요가 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 본원의 다른 곳에서 보다 상세히 설명된 바와 같이, 가이드 RNA는 전형적으로 Cas9 결합을 허용하는 tracrRNA 프레임워크, 및 Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질에 서열 특이성을 부여하는 가이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 가이드 RNA 및 tracrRNA는 2 개의 핵산 분자로서 개별적으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 구조를 포함하며, 여기서 가이드 서열은 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 가이드 서열은 전형적으로 20 개 뉴클레오티드 길이이다. Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특이적 게놈 표적 부위에 표적화하기에 적합한 가이드 RNA의 서열은 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 적합한 가이드 RNA 서열은 전형적으로 편집될 표적 뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 있는 50 개 뉴클레오티드 이내의 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 제공된 융합 단백질 중 임의의 것을 특이적 표적 서열에 표적화하기에 적합한 일부 예시적인 가이드 RNA 서열이 본원에 제공된다.
염기 편집기 효율
CRISPR-Cas9 뉴클레아제는 표적화된 게놈 편집을 매개하는 데 널리 사용되었다. 대부분의 게놈 편집 적용에서, Cas9는 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단일 가이드 RNA(sgRNA))와의 복합체를 형성하고 sgRNA 서열에 의해 명시된 표적 부위에서 이중-가닥 DNA 파괴(DSB)를 유도한다. 세포는 주로 비-상동 말단-연결(NHEJ) 복구 경로를 통해 이 DSB에 반응하여, 유전자를 파괴하는 프레임시프트 돌연변이를 유발할 수 있는 확률적 삽입 또는 결실(indel)을 초래한다. DSB를 플랭킹하는 서열에 대한 상동성 정도가 높은 공여자 DNA 주형의 존재 하에, 유전자 교정은 상동성 지정 복구(HDR)로 알려진 대체 경로를 통해 달성될 수 있다. 불행히도, 대부분의 비-섭동 조건 하에, HDR은 비효율적이고, 세포 상태 및 세포 유형에 따라 달라지며, 더 큰 빈도의 indel에 의해 지배된다. 인간 질환과 연관된 알려진 유전적 변이의 대부분은 점 돌연변이이므로, 보다 효율적이고 깨끗하게 정확한 점 돌연변이를 만들 수 있는 방법이 필요하다. 본원에 제공된 바와 같은 염기 편집 시스템은 이중-가닥 DNA 파괴를 생성하지 않고, 공여자 DNA 주형을 필요로 하지 않고, 과도한 확률적 삽입 및 결실을 유도하지 않고 게놈 편집을 제공하는 새로운 방식을 제공한다.
본원에 제공된 염기 편집기는 상당한 비율의 indel을 생성하지 않고 특이적 뉴클레오티드 염기를 변형시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "indel(들)"은 핵산 내 뉴클레오티드 염기의 삽입 또는 결실을 지칭한다. 이러한 삽입 또는 결실은 유전자의 코딩 영역 내에서 프레임 시프트 돌연변이를 야기할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 뉴클레오티드 서열에서 다수의 삽입 또는 결실(즉, indel)을 생성하지 않고, 핵산 내 특이적 뉴클레오티드를 효율적으로 변형(예를 들어, 돌연변이화 또는 탈아미노화)시키는 염기 편집기를 생성하는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 indel에 비해 더 큰 비율의 의도된 변형(예를 들어, 점 돌연변이 또는 탈아미노화)를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 또는 0.01% 미만의 indel 형성을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 또는 0.01% 미만의 indel 형성을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 0.8% 미만의 indel 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 최대 0.8% indel 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 0.3% 미만의 indel 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템에 비해 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 더 낮은 indel 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 더 낮은 indel 형성을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 indel 빈도가 감소한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 indel 빈도가 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템은 ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 indel 빈도가 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소한다.
본 개시내용은 효율 및 특이성이 증가된 아데노신 데아미나제 변이체(예를 들어, ABE8 또는 ABE9 변이체)를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 아데노신 데아미나제 변이체는 폴리뉴클레오티드 내에서 원하는 염기를 편집할 가능성이 높고, 변경되도록 의도되지 않은 염기(예를 들어, "방관자")를 편집할 가능성이 적다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 방관자 편집 또는 돌연변이가 감소된다. 일부 구현예에서, 의도되지 않은 편집 또는 돌연변이는 방관자 돌연변이 또는 방관자 편집, 예를 들어, 표적 뉴클레오티드 서열의 표적 창에서 의도되지 않은 또는 비-표적 위치의 표적 염기(예를 들어, A 또는 C)의 염기 편집이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 방관자 편집 또는 돌연변이가 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 방관자 편집 또는 돌연변이가 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 방관자 편집 또는 돌연변이가 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 또는 적어도 3.0 배까지 감소된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 허위 편집이 감소된다. 일부 구현예에서, 의도되지 않은 편집 또는 돌연변이는 허위 돌연변이 또는 허위 편집, 예를 들어, 게놈의 의도되지 않은 또는 비-표적 영역에서 표적 염기(예를 들어, A 또는 C)의 비-특이적 편집 또는 가이드 독립적 편집이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템에 비해 허위 편집이 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 허위 편집이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 허위 편집이 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 또는 적어도 3.0 배까지 감소된다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기가 상당한 수의 의도되지 않은 돌연변이, 예컨대 의도되지 않은 점 돌연변이(즉, 방관자의 돌연변이)를 생성하지 않고 핵산(예를 들어, 대상체의 게놈 내 핵산)에서 점 돌연변이와 같은 의도된 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있다는 인식에 기초한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 의도된 돌연변이의 적어도 0.01%(즉 적어도 0.01% 염기 편집 효율)를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 의도된 돌연변이의 적어도 0.01%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 염기 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 세포의 집단에서 편집된 핵염기의 백분율을 계산함으로서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 세포의 집단에서 편집된 핵염기에 의해 측정된 바와 같이 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 염기 편집 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기과 비교하여 염기 편집 효율이 더 높다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 염기 편집 효율이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 더 높다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 염기 편집 효율이 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 적어도 3.0 배, 적어도 3.1 배, 적어도 3.2, 적어도 3.3 배, 적어도 3.4 배, 적어도 3.5 배, 적어도 3.6 배, 적어도 3.7 배, 적어도 3.8 배, 적어도 3.9 배, 적어도 4.0 배, 적어도 4.1 배, 적어도 4.2 배, 적어도 4.3 배, 적어도 4.4 배, 적어도 4.5 배, 적어도 4.6 배, 적어도 4.7 배, 적어도 4.8 배, 적어도 4.9 배, 또는 적어도 5.0 배 더 높다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 표적내 염기 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 세포의 집단에서 편집된 표적 핵염기에 의해 측정된 바와 같이 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 표적내 염기 편집 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기와 비교하여 표적내 염기 편집 효율이 더 높다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 표적내 염기 편집 효율이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 더 높다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 표적내 염기 편집 효율이 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 적어도 3.0 배, 적어도 3.1 배, 적어도 3.2 배, 적어도 3.3 배, 적어도 3.4 배, 적어도 3.5 배, 적어도 3.6 배, 적어도 3.7 배, 적어도 3.8 배, 적어도 3.9 배, 적어도 4.0 배, 적어도 4.1 배, 적어도 4.2 배, 적어도 4.3 배, 적어도 4.4 배, 적어도 4.5 배, 적어도 4.6 배, 적어도 4.7 배, 적어도 4.8 배, 적어도 4.9 배, 또는 적어도 5.0 배 더 높다.
본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드, 벡터, LNP 복합체, 또는 mRNA를 통해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 mRNA로서 숙주 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 기반 전달 시스템, 예를 들어, mRNA를 통해 전달된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기는 편집된 핵염기에 의해 측정된 바와 같이 적어도 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 표적내 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 시스템에 의해 전달된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기와 비교하여 염기 편집 효율이 더 높다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300% 이상, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 표적내 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 적어도 3.0 배, 적어도 3.1 배, 적어도 3.2 배, 적어도 3.3 배, 적어도 3.4 배, 적어도 3.5 배, 적어도 3.6 배, 적어도 3.7 배, 적어도 3.8 배, 적어도 3.9 배, 적어도 4.0 배, 적어도 4.1 배, 적어도 4.2 배, 적어도 4.3 배, 적어도 4.4 배, 적어도 4.5 배, 적어도 4.6 배, 적어도 4.7 배, 적어도 4.8 배, 적어도 4.9 배, 또는 적어도 5.0 배 더 높은 표적내 편집 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 또는 0.01% 미만의 표적외 편집을 초래한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드된 표적외 편집 효율이 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드된 표적외 편집 효율이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드된 편집의 효율이 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 또는 적어도 3.0 배 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드된 표적외 편집 효율이 적어도 약 2.2 배 감소한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드-독립적 표적외 편집 효율이 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드-독립적 표적외 편집 효율이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드-독립적 표적외 편집 효율이 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 적어도 3.0 배, 적어도 5.0 배, 적어도 10.0 배, 적어도 20.0 배, 적어도 50.0 배, 적어도 70.0 배, 적어도 100.0 배, 적어도 120.0 배, 적어도 130.0 배, 또는 적어도 150.0 배 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드-독립적 표적외 편집 효율(예를 들어, 허위 RNA 탈아미노화)이 134.0 배 감소한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 또는 ABE9 염기 편집기 변이체는 게놈에 걸쳐 가이드-독립적 돌연변이율을 증가시키지 않는다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기가 상당한 수의 의도되지 않은 돌연변이, 예컨대 의도되지 않은 점 돌연변이를 생성하지 않고 핵산(예를 들어, 대상체의 게놈 내 핵산)에서 점 돌연변이와 같은 의도된 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있다는 인식에 기초한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 의도된 돌연변이(예를 들어, 허위 표적외 편집 또는 방관자 편집)의 적어도 0.01%를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 표적 유전자에서 돌연변이를 변경하거나 또는 보정하도록 특이적으로 설계된 gRNA에 결합된 특이적 염기 편집기에 의해 생성된 돌연변이이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기가 상당한 수의 의도되지 않은 돌연변이를 생성하지 않고 핵산(예를 들어 대상체의 게놈 내 핵산)에서 의도된 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있다는 인식에 기초한다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 의도된 돌연변이를 변경하거나 또는 보정하도록 특이적으로 설계된 gRNA에 결합된 특이적 염기 편집기에 의해 생성된 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 종결 코돈, 예를 들어, 유전자의 코딩 영역 내에서 조기 종결 코돈을 생성하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 종결 코돈을 제거하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 스플라이싱을 변경하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 조절 서열(예를 들어, 유전자 프로모터 또는 유전자 억제인자)을 변경하는 돌연변이이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 1 초과:1인 의도된 점 돌연변이 대 indel의 비를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 2.5:1, 적어도 3:1, 적어도 3.5:1, 적어도 4:1, 적어도 4.5:1, 적어도 5:1, 적어도 5.5:1, 적어도 6:1, 적어도 6.5:1, 적어도 7:1, 적어도 7.5:1, 적어도 8:1, 적어도 8.5:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 11:1, 적어도 12:1, 적어도 13:1, 적어도 14:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 40:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 200:1, 적어도 300:1, 적어도 400:1, 적어도 500:1, 적어도 600:1, 적어도 700:1, 적어도 800:1, 적어도 900:1, 또는 적어도 1000:1, 또는 그 이상인 의도된 점 돌연변이 대 indel의 비를 생성할 수 있다.
의도된 돌연변이 및 indel의 수는 예를 들어, 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344(WO2017/070632); Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)에 기재된 바와 같이, 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있으며; 상기 문헌의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, indel 빈도를 계산하기 위해, indel이 발생할 수 있는 창의 양쪽 측면을 플랭킹하는 2 개의 10-bp 서열에 대한 정확한 일치에 대해 서열분석 판독물이 스캐닝된다. 정확한 일치가 위치하지 않는 경우, 판독물은 분석에서 제외된다. 이 indel 창의 길이가 참조 서열과 정확히 일치하는 경우 판독물은 indel을 함유하지 않는 것으로 분류된다. indel 창이 참조 서열 보다 더 길거나 또는 더 짧은 2 개 이상의 염기인 경우, 서열분석 판독물은 각각 삽입 또는 결실로 분류된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 핵산 영역에서 indel의 형성을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, 영역은 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오티드 또는 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오티드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 뉴클레오티드 내의 영역에 있다.
표적 뉴클레오티드 영역에서 형성된 indel의 수는 핵산(예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)이 염기 편집기에 노출된 시간의 양에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, indel의 수 또는 비율은 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)을 염기 편집기에 노출시키고 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 적어도 6 시간, 적어도 12 시간, 적어도 24 시간, 적어도 36 시간, 적어도 48 시간, 적어도 3 일, 적어도 4 일, 적어도 5 일, 적어도 7 일, 적어도 10 일, 또는 적어도 14 일 후에 결정된다. 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기의 특성은 임의의 융합 단백질, 또는 본원에 제공된 융합 단백질의 사용 방법에 적용될 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 핵산 영역에서 indel의 형성을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, 영역은 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오티드 또는 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오티드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 뉴클레오티드 내의 영역에 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 핵산 영역에서 indel의 형성을 1% 미만, 1.5% 미만, 2% 미만, 2.5% 미만, 3% 미만, 3.5% 미만, 4% 미만, 4.5% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 또는 20% 미만으로 제한할 수 있다. 핵산 영역에서 형성된 indel의 수는 핵산(예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)이 염기 편집기에 노출된 시간의 양에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, indel의 임의의 수 또는 비율은 핵산(예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)을 염기 편집기에 노출시키고 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 적어도 6 시간, 적어도 12 시간, 적어도 24 시간, 적어도 36 시간, 적어도 48 시간, 적어도 3 일, 적어도 4 일, 적어도 5 일, 적어도 7 일, 적어도 10 일, 또는 적어도 14 일 후에 결정된다.
염기 편집기 효율의 세부사항은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381(WO 2018/027078) 및 PCT/US2016/058344 (WO 2017/070632)에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)를 참조하며, 상기 문헌의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 하나 이상의 유전자에서 복수의 핵염기 쌍을 편집하는 것은 적어도 하나의 의도된 돌연변이의 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 의도된 돌연변이의 상기 형성은 유전자의 정상적인 유전자 기능의 붕괴를 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 의도된 돌연변이의 상기 형성은 유전자에 의해 암호화된 단백질 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 다중 편집은 본원에 제공된 임의의 방법 또는 방법의 조합을 사용하여 달성될 수 있음이 이해되어야 한다.
다중 편집
일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 유전자에서 복수의 핵염기 쌍을 다중 편집할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 핵염기 쌍은 동일한 유전자에 위치한다. 일부 구현예에서, 복수의 핵염기 쌍은 하나 이상의 유전자에 위치하며, 여기서 적어도 하나의 유전자는 상이한 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 다중 편집은 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 편집은 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 편집은 단일 가이드 폴리뉴클레오티드가 있는 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 편집은 복수의 가이드 폴리뉴클레오티드가 있는 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 편집은 단일 염기 편집기 시스템이 있는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 편집은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 편집은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 편집은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드 및 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드의 믹스를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 염기 편집기를 사용한 다중 편집의 특징은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용하는 방법의 임의의 조합에 적용될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 염기 편집기를 사용한 다중 편집은 복수의 핵염기 쌍의 순차적 편집을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 복수의 핵염기 쌍은 하나 이상의 유전자에 있다. 일부 구현예에서, 복수의 핵염기 쌍은 동일한 유전자에 있다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 유전자 중 적어도 하나의 유전자는 상이한 유전자좌에 위치한다.
일부 구현예에서, 편집은 적어도 하나의 단백질 코딩 영역에서 복수의 핵염기 쌍의 편집이다. 일부 구현예에서, 편집은 적어도 하나의 단백질 비-코딩 영역에서 복수의 핵염기 쌍의 편집이다. 일부 구현예에서, 편집은 적어도 하나의 단백질 코딩 영역 및 적어도 하나의 단백질 비-코딩 영역에서 복수의 핵염기 쌍의 편집이다.
일부 구현예에서, 편집은 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드와 함께 이루어진다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 단일 가이드 폴리뉴클레오티드와 함께 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 복수의 가이드 폴리뉴클레오티드와 함께 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 편집은 단일 염기 편집기 시스템이 있는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드와 함께 이루어진다. 일부 구현예에서, 편집은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드와 함께 이루어진다. 일부 구현예에서, 편집은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드와 함께 이루어진다. 일부 구현예에서, 편집은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드 및 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드의 믹스와 함께 이루어진다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 염기 편집기를 사용한 다중 편집의 특성은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용하는 방법의 임의의 조합에 적용될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 편집은 복수의 핵염기 쌍의 순차적 편집을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.
염기 편집기의 사용 방법
유전자 및 대립유전자의 염기 편집은 치료제 및 기초 연구를 위한 새롭고 유리한 전략을 제공한다.
본 개시내용은 본원에 제공된 염기 편집기 또는 염기 편집기 시스템에 의해 교정될 수 있는 점 돌연변이와 연관되거나 또는 이에 의해 유발된 질환으로 진단된 대상체의 치료를 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이러한 질환, 예를 들어, 유전적 돌연변이, 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 의해 유발된 질환이 있는 대상체에게, 질환 연관된 유전자에서 점 돌연변이를 교정하는 유효량의 핵염기 편집기(예를 들어, 아데노신 데아미나제 염기 편집기)를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 돌연변이에 의해 유발되거나 또는 이와 연관된 질환의 치료를 위한 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 질환은 SERPINA1 유전자의 돌연변이와 연관된 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)이다. 일 구현예에서, A1AD와 연관된 병원성 돌연변이는 예를 들어, 본원의 실시예 3에 기재된 바와 같이 E342K이다.
각각의 질환-관련 유전자 또는 이의 암호화된 단백질의 각각의 서열, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에서 특이적 위치 또는 잔기의 넘버링은 사용되는 특정 단백질 및 넘버링 방식에 따라 달라짐이 이해될 것이다. 넘버링은 예를 들어, 성숙 단백질의 전구체 및 성숙 단백질 자체에서 상이할 수 있고, 종 간의 서열의 차이가 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 당업계에서 널리 알려진 방법, 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 임의의 상동성 단백질 및 각각의 암호화 핵산에서 각각의 잔기를 식별할 수 있을 것이다.
본원에는 질환 또는 장애와 연관된 표적 뉴클레오티드 서열의 핵염기를 편집하기 위한 염기 편집기 또는 염기 편집기 시스템을 사용하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, 아데노신 데아미나제 및 Cas9 도메인 포함)의 활성은 점 돌연변이의 교정을 초래한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 활성은 스플라이스 수용체 또는 공여자 부위를 변경하는 돌연변이의 교정을 초래한다. 일부 구현예에서, 표적 DNA 서열은 질환 또는 장애와 연관된 G→A 점 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이체 A 염기의 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관되지 않은 서열을 초래한다.
일부 구현예에서, 표적 DNA 서열은 단백질을 암호화하고, 점 돌연변이는 코돈 내에 있고 야생형 코돈과 비교하여 돌연변이체 코돈에 의해 암호화된 아미노산에서 변화를 초래한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 A의 탈아미노화는 돌연변이체 코돈에 의해 암호화된 아미노산의 변화를 초래한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 A의 탈아미노화는 야생형 아미노산을 암호화하는 코돈을 초래한다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환 또는 장애가 있거나 또는 이로 진단되었다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 아데노신 데아미나제는 DNA의 데옥시아데노신 잔기의 아데닌을 탈아미노화할 수 있다. 본 개시내용의 다른 측면은 아데노신 데아미나제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 DNA에서 데옥시아데노신을 탈아미노화하는 아데노신 데아미나제) 및 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 도메인(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 단백질)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 아데노신은 전형적으로 사이토신 잔기와 염기 쌍을 이루는 이노신 잔기로 전환될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 그 중에서도 핵산 서열의 표적화된 편집에 유용하다. 이러한 융합 단백질은 시험관내에서 DNA의 표적화된 편집, 예를 들어, 돌연변이체 세포 또는 동물의 생성; 표적화된 돌연변이의 도입, 예를 들어, 생체외 세포, 예를 들어, 동일하거나 또는 또 다른 대상체 내로 후속적으로 재도입되는 대상체로부터 수득된 세포에서 유전적 결함의 교정; 및 생체내에서 표적화된 돌연변이의 도입을 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용은 데아미나제 및 핵염기 편집기를 활용하는 데아미나제, 융합 단백질, 핵산, 벡터, 세포, 조성물, 방법, 키트, 시스템 등을 제공한다.
의도된 돌연변이 생성
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법의 목적은 유전자 편집을 통해 기능장애 유전자의 기능을 회복시키는 것이다. 일부 구현예에서, 기능장애 유전자의 기능은 의도된 돌연변이를 도입함으로써 회복된다. 본원에 제공된 핵염기 편집 단백질은 예를 들어, 인간 세포 배양물에서 질환-연관 돌연변이를 교정함으로써 시험관내에서 유전자 편집-기반 인간 치료제에 대해 검증될 수 있다. 본원에 제공된 핵염기 편집 단백질, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 뉴클레오티드 결합 도메인(예를 들어, Cas9) 및 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질은 A에서 G로 또는 C에서 T로의 임의의 단일 점 돌연변이를 교정하는 데 사용될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 첫번째 경우, 돌연변이체 A에서 I로의 탈아미노화는 돌연변이를 교정하고, 후자의 경우, 돌연변이체 T와 염기 쌍을 이루는 A의 탈아미노화, 이어서 복제 라운드는 돌연변이를 교정한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 의도되지 않은 점 돌연변이와 같은 상당한 수의 의도되지 않은 돌연변이를 생성하지 않고 핵산(예를 들어, 대상체의 게놈 내 핵산)에서 점 돌연변이와 같은 의도된 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있는 염기 편집기를 제공한다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 의도된 돌연변이를 생성하도록 특이적으로 설계된 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)에 결합된 특이적 염기 편집기(예를 들어, 아데노신 염기 편집기)에 의해 생성된 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 질환 또는 장애와 연관된 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 질환 또는 장애와 연관된 아데닌(A)에서 구아닌(G)으로의 점 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 질환 또는 장애와 연관된 사이토신(C)에서 티민(T)으로의 점 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 코딩 영역 또는 비-코딩 영역 내에서 아데닌(A)에서 구아닌(G)으로의 점 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 코딩 영역 또는 비-코딩 영역 내에서 사이토신(C)에서 티민(T)으로의 점 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 종결 코돈, 예를 들어, 유전자의 코딩 영역 내에서 조기 종결 코돈을 생성하는 점 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 종결 코돈을 제거하는 돌연변이이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 1 초과 : 1인 의도된 돌연변이 대 의도되지 않은 돌연변이(예를 들어, 의도된 점 돌연변이 : 의도되지 않은 점 돌연변이)의 비를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 적어도 1.5: 1, 적어도 2: 1, 적어도 2.5: 1, 적어도 3: 1, 적어도 3.5: 1, 적어도 4: 1, 적어도 4.5: 1, 적어도 5: 1, 적어도 5.5: 1, 적어도 6: 1, 적어도 6.5: 1, 적어도 7: 1, 적어도 7.5: 1, 적어도 8: 1, 적어도 10: 1, 적어도 12: 1, 적어도 15: 1, 적어도 20: 1, 적어도 25: 1, 적어도 30: 1, 적어도 40: 1, 적어도 50: 1, 적어도 100: 1, 적어도 150: 1, 적어도 200: 1, 적어도 250: 1, 적어도 500: 1, 또는 적어도 1000: 1, 또는 그 이상인 의도된 돌연변이 대 의도되지 않은 돌연변이(예를 들어, 의도된 점 돌연변이 : 의도되지 않은 점 돌연변이)의 비를 생성할 수 있다.
염기 편집기 효율의 상세한 내용은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344(WO2017/070632)에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자에서 복수의 핵염기 쌍의 편집은 적어도 하나의 의도된 돌연변이의 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 의도된 돌연변이의 형성은 질환 유발 돌연변이의 정확한 교정을 초래한다. 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기의 다중 편집 특성은 본원에 제공된 염기 편집기를 사용하는 방법의 임의의 조합에 적용될 수 있음이 이해되어야 한다.
숙주 세포에서 융합 단백질의 발현
아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 본 개시내용의 융합 단백질은 당업자에게 알려진 일상적인 방법을 사용하여 박테리아, 효모, 진균, 곤충, 식물, 및 동물 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 실질적으로 임의의 관심 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 아데노신 데아미나제를 암호화하는 DNA는 cDNA 서열에 기초하여 CDS의 상류 및 하류에 적합한 프라이머를 설계함으로써 클로닝될 수 있다. 클로닝된 DNA는 직접적으로, 또는 원하는 경우 제한 효소로 소화 후, 또는 염기 편집 시스템의 하나 이상의 추가적인 구성요소를 암호화하는 DNA로 결찰된 적합한 링커 및/또는 핵 국소화 신호의 첨가 후에 있을 수 있다. 염기 편집 시스템은 숙주 세포에서 번역되어 복합체를 형성한다.
본원에 기재된 단백질 도메인을 암호화하는 DNA는 DNA를 화학적으로 합성하거나, 또는 이의 전장을 암호화하는 DNA를 구축하기 위해 PCR 방법 및 Gibson Assembly 방법을 활용함으로써 합성된 부분적으로 중첩된 올리고DNA 짧은 쇄를 연결함으로써 수득될 수 있다. 화학적 합성 또는 PCR 방법 또는 Gibson Assembly 방법의 조합에 의해 전장 DNA를 구축하는 것의 이점은 사용될 코돈이 DNA가 도입되는 숙주에 따라 CDS 전장으로 설계될 수 있다는 점이다. 이종 DNA의 발현에서, 단백질 발현 수준은 이의 DNA 서열을 숙주 유기체에서 매우 빈번하게 사용되는 코돈으로 전환함으로써 증가할 것으로 예상된다. 사용될 숙주에서 코돈 사용 빈도의 데이터로서, 예를 들어, Kazusa DNA Research Institute의 홈페이지에 개시된 유전자 코든 사용 빈도 데이터베이스(kazusa.or.jp/codon/index.html)가 사용될 수 있거나, 또는 각 숙주에서 코돈 사용 빈도를 나타내는 문서가 언급될 수 있다. 수득된 데이터 및 도입될 DNA 서열을 참조함으로써, DNA 서열에 사용되는 것들 중에서 숙주에서 낮은 사용 빈도를 나타내는 코돈은 동일한 아미노산을 코딩하고 높은 사용 빈도를 나타내는 코돈으로 전환될 수 있다.
핵산 서열-인식 모듈을 암호화하는 DNA 및/또는 핵산 염기 전환 효소를 함유하는 발현 벡터는 예를 들어, 적합한 발현 벡터에서 프로모터의 하류에 DNA를 연결함으로써 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 동물 세포 발현 플라스미드(예를 들어, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo), 및 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 등과 같은 동물 바이러스 벡터가 사용된다. 다른 구현예에서, 에스케리키아 콜라이-유래 플라스미드(예를 들어, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); 바실루스 서브틸리스-유래 플라스미드(예를 들어, pUB110, pTP5, pC194); 효모-유래 플라스미드(예를 들어, pSH19, pSH15); 곤충 세포 발현 플라스미드(예를 들어, pFast-Bac); 박테리오파지 예컨대 람다 파지 등; 곤충 바이러스 벡터 예컨대 배큘로바이러스 등(예를 들어, BmNPV, AcNPV) 등이 사용된다.
일부 구현예에서, 주어진 숙주에서 유전자 발현에 적절한 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. DSB를 사용하는 통상적인 방법에서, 숙주 세포의 생존률은 독성으로 인해 때때로 현저하게 감소하기 때문에, 유도성 프로모터를 사용함으로써 유도를 시작하여 세포의 수를 증가시키는 것이 바람직하다. 그러나, 본 개시내용의 핵산-변형 효소 복합체를 발현시킴으로써 충분한 세포 증식이 제공될 수 있기 때문에, 구성적 프로모터가 또한 제한 없이 사용될 수 있다.
예를 들어, 제한 없이, 숙주가 동물 세포인 경우, SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV(사이토메칼로바이러스) 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터, MoMuLV(몰로니 마우스 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK(단순 포진 바이러스 티미딘 키나제) 프로모터 등이 사용된다. 이들 중, CMV 프로모터, SRα 프로모터 등이 사용하기에 적합하다. 숙주가 에스케리키아 콜라이인 경우, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, 람다.PL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이 사용하기에 적합하다. 숙주가 바실루스(Bacillus) 속인 경우, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등이 사용하기에 적합하다. 숙주가 효모인 경우, Gal1/10 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 사용하기에 적합하다. 숙주가 곤충 세포인 경우, 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터 등이 사용하기에 적합하다. 숙주가 식물 세포인 경우, CaMV35S 프로모터, CaMV19S 프로모터, NOS 프로모터 등이 사용하기에 적합하다.
상기 언급된 것들 외에도, 인핸서, 스플라이싱 신호, 종결인자, polyA 부가 신호, 약물 내성 유전자, 영양요구성 상보성 유전자 등과 같은 선택 마커, 복제 기점 등을 함유하는 발현 벡터가 필요에 따라 사용될 수 있다.
본원에 기재된 단백질 도메인을 암호화하는 RNA는 예를 들어, 상기-언급된 핵산 서열-인식 모듈을 암호화하는 DNA를 암호화하는 벡터 및/또는 핵산 염기 전환 효소를 주형으로 사용함으로써 그 자체로 알려진 시험관내 전사 시스템에서 mRNA로의 전사에 의해 제조될 수 있다.
본 개시내용의 융합 단백질은 핵산 서열-인식 모듈을 암호화하는 DNA 및/또는 핵산 염기 전환 효소를 함유하는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하고, 숙주 세포를 배양함으로써 세포내로 발현될 수 있다.
동물 세포로서, 세포주 예컨대 원숭이 COS-7 세포, 원숭이 Vero 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, dhfr 유전자-결핍 CHO 세포, 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20 세포, 마우스 골수종 세포, 래트 GH3 세포, 인간 FL 세포 등, 다능성 줄기 세포 예컨대 인간 및 다른 포유동물의 iPS 세포, ES 세포 등, 및 다양한 조직으로부터 제조된 1차 배양 세포가 사용된다. 또한, 제브라피시 배아, 제노푸스(Xenopus) 난모세포 등이 또한 사용될 수 있다.
에스케리키아 속, 바실루스 속, 효모, 곤충 세포, 곤충, 동물 세포 등에 대해 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
에스케리키아 속의 경우, 에스케리키아 콜라이 K12.cndot.DH1(Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 60, 160 (1968)), 에스케리키아 콜라이 JM103(Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)), 에스케리키아 콜라이 JA221(Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), 에스케리키아 콜라이 HB101(Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), 에스케리키아 콜라이 C600(Genetics, 39, 440 (1954)) 등이 사용될 수 있다.
바실루스 속의 경우, 바실루스 서브틸리스 M1114(Gene, 24, 255 (1983)), 바실루스 서브틸리스 207-21(Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)) 등이 사용될 수 있다.
효모의 경우, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R.sup.-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913, NCYC2036, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) KM71 등이 사용될 수 있다.
곤충 세포의 경우 바이러스가 AcNPV일 때, 양배추 거염벌레 유충-유래 확립 균주의 세포(스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포; Sf 세포), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)의 중장으로부터 유래된 MG1 세포, 트리코플루시아 니의 알로부터 유래된 HIGHFIVE™ 세포, 마메스트라 브라시캐(Mamestra brassicae)-유래 세포, 에스티그메나 아크래(Estigmena acrea)-유래 세포 등이 사용된다. BmNPV 바이러스의 경우, 봄빅스 모리(Bombyx mori)-유래 확립 균주의 세포(봄빅스 모리 N 세포; BmN 세포) 등이 곤충 세포로서 사용된다. Sf 세포의 경우, 예를 들어, Sf9 세포(ATCC CRL1711), Sf21 세포[상기 모두, In Vivo , 13, 213-217 (1977)] 등이 사용될 수 있다.
곤충의 경우, 예를 들어, 봄빅스 모리, 드로소필라(Drosophila), 귀뚜라미 등의 유충이 사용될 수 있다(Nature, 315, 592 (1985)).
식물 세포의 경우, 다양한 식물(예를 들어, 벼, 밀, 옥수수(메이즈) 등과 같은 곡물, 토마토, 오이, 가지 등과 같은 생산 작물, 카네이션, 리시안서스 등과 같은 원예 식물, 담배, 애기장대 등과 같은 실험 식물 등)로부터 제조된 현탁된 배양 세포, 캘러스(callus), 원형질체, 잎 분절, 뿌리 분절 등이 사용될 수 있다.
모든 상기-언급된 숙주 세포는 반수체(단배체), 또는 배수체(예를 들어, 이배체, 삼배체, 사배체 등)일 수 있다. 통상적인 돌연변이 도입 방법에서, 돌연변이는 원칙적으로 하나의 상동성 염색체에만 도입되어 이종 유전자 유형을 생성한다. 따라서, 원하는 표현형은 달리 우성 돌연변이가 발생하지 않는 한 발현되지 않고, 동형접합은 불편하게 노동과 시간을 필요로 한다. 대조적으로, 본 개시내용에 따르면, 돌연변이는 게놈에서 상동 염색체 상의 임의의 대립유전자 내로 도입될 수 있기 때문에, 원하는 표현형은 열성 돌연변이의 경우에도 단일 세대로 발현될 수 있으며, 이는 통상적인 방법의 문제를 해결할 수 있기 때문에 매우 유용하다.
발현 벡터는 숙주의 종류에 따라 알려진 방법(예를 들어, 라이소자임 방법, 적격 방법, PEG 방법, CaCl2 공침전 방법, 전기천공 방법, 미세주사 방법, 입자 총 방법, 리포펙션 방법, 아그로박테리아 방법 등)에 의해 도입될 수 있다.
에스케리키아 콜라이는 예를 들어, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) 등에 기재된 방법에 따라 형질도입될 수 있다.
바실루스 속은 예를 들어, Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) 등에 기재된 방법에 따라 벡터 내로 도입될 수 있다.
효모는 예를 들어, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 75, 1929 (1978) 등에 기재된 방법에 따라 벡터 내로 도입될 수 있다.
곤충 세포 및 곤충은 예를 들어, Bio/Technology, 6, 47-55 (1988) 등에 기재된 방법에 따라 벡터 내로 도입될 수 있다.
동물 세포는 예를 들어, Cell Engineering additional volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), 및 Virology, 52, 456 (1973)에 기재된 방법에 따라 벡터 내로 도입될 수 있다. 벡터가 도입된 세포는 숙주의 종류에 따라 알려진 방법에 따라 배양될 수 있다.
예를 들어, 에스케리키아 콜라이 또는 바실루스 속이 배양되는 경우, 액체 배지가 배양에 적합하게 사용된다. 배지는 전형적으로 형질전환체의 성장에 필요한 탄소원, 질소원, 무기 물질 등을 함유한다. 탄소원의 예는 글루코스, 덱스트린, 가용성 전분, 수크로스 등을 포함하고; 질소원의 예는 무기 또는 유기 물질 예컨대 암모늄 염, 니트레이트 염, 옥수수 침지액, 펩톤, 카제인, 육류 추출물, 대두 케이크, 감자 추출물 등을 포함하고; 무기 물질의 예는 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 등을 포함한다. 배지는 효모 추출물, 비타민, 성장 촉진 인자 등을 함유할 수 있다. 배지의 pH는 약 5 내지 약 8이다.
에스케리키아 콜라이를 배양하기 위한 배지로서, 예를 들어, 글루코스, 카사미노산을 함유하는 M9 배지(Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972)가 사용될 수 있다. 필요한 경우, 예를 들어, 3-β-인돌릴아크릴산과 같은 제제가 프로모터의 효율적인 기능을 보장하기 위해 배지에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 에스케리키아 콜라이는 약 15° 내지 약 43℃에서 배양된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
바실루스 속은 일반적으로 약 30° 내지 약 40℃에서 배양된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
효모를 배양하기 위한 배지의 예는 Burkholder 최소 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)), 0.5% 카사미노산을 함유하는 SD 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)) 등을 포함한다. 배지의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이다. 배양은 일반적으로 약 20℃ 내지 약 35℃에서 유지된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
곤충 세포 또는 곤충을 배양하기 위한 배지로서, 예를 들어, 적절한 경우, 불활성화된 10% 소 혈청 등과 같은 첨가제를 함유하는 Grace's 곤충 배지(Nature, 195, 788 (1962)) 등이 사용된다. 배지의 pH는 바람직하게는 약 6.2 내지 약 6.4이다. 배양은 일반적으로 약 27℃에서 유지된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
동물 세포를 배양하기 위한 배지로서, 예를 들어, 약 5 내지 약 20%의 소 태아 혈청을 함유하는 최소 필수 배지(MEM)(Science, 122, 501 (1952)), 듀벨코(Dulbecco)의 변형된 이글 배지(DMEM)(Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 배지(The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), 199 배지(Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)) 등이 사용된다. 배지의 pH는 바람직하게는 약 6 내지 약 8이다. 배양은 일반적으로 약 30℃ 내지 약 40℃에서 유지된다. 필요한 경우, 통기 및 교반이 수행될 수 있다.
동물 세포와 같은 고등 진핵생물 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 본 개시내용의 염기 편집 시스템(예를 들어, 아데노신 데아미나제 변이체 포함)을 암호화하는 DNA는 유도성 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터(중금속 이온에 의해 유도됨), 열 충격 단백질 프로모터(열 충격에 의해 유도됨), Tet-ON/Tet-OFF 시스템 프로모터(테트라사이클린 또는 이의 유도체의 부가 또는 제거에 의해 유도됨), 스테로이드-반응성 프로모터(스테로이드 호르몬 또는 이의 유도체에 의해 유도됨) 등)의 조절 하에 숙주 세포 내로 도입되고, 유도 물질은 핵산-변형 효소 복합체의 발현을 유도하기 위해 적절한 단계에서 배지에 첨가되고(또는 배지로부터 제거되고), 일정 기간 동안 배양하여 염기 편집을 수행하고, 돌연변이의 표적 유전자 내로 도입, 염기 편집 시스템의 일시적 발현이 실현될 수 있다.
에스케리키아 콜라이 등과 같은 원핵생물 세포는 유도성 프로모터를 활용할 수 있다. 적합한 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터(IPTG에 의해 유도됨), cspA 프로모터(냉각 충격에 의해 유도됨), araBAD 프로모터(아라비노스에 의해 유도됨) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
대안적으로, 상기-언급된 유도성 프로모터는 또한 동물 세포 등과 같은 고등 진핵생물 세포가 숙주 세포로서 사용될 때 벡터 제거 메커니즘으로 활용될 수 있다. 즉, 벡터는 숙주 세포에서 기능하는 복제 기점으로 시작하고, 단백질을 암호화하는 핵산 발현의 복제에 필요한 단백질(예를 들어, 동물 세포의 경우 SV40 및 큰 T 항원, oriP 및 EBNA-1 등)을 암호화하는 핵산은 상기-언급된 유도성 프로모터에 의해 조절된다. 결과적으로, 벡터는 유도 물질의 존재 하에 자체적으로 복제가능한 반면, 유도 물질이 제거된 경우, 자가 복제가 이용가능하지 않고, 벡터는 세포 분열과 함께 자연적으로 탈락한다(자가 복제는 Tet-OFF 시스템 벡터에서 테트라사이클린 및 독시사이클린의 부가에 의해 가능하지 않다).
전달 시스템
본원에 개시된 염기 편집기는 바이러스 벡터에 함유되어 있는 핵산 상에서 암호화될 수 있다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 및 아데노 연관 바이러스(AAV)를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 적용에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, AAV는 온화한 면역원성으로 인해 생체내에서 유전자 전달에 통상적으로 사용된다. 아데노바이러스는 통상적으로 이들이 유도하는 강한 면역원성 반응으로 인해 백신으로 사용된다. 바이러스 벡터의 패키징 용량은 벡터 내로 패키징될 수 있는 염기 편집기의 크기를 제한할 수 있다. 예를 들어, AAV의 패키징 용량은 2 개의 145 개의 염기 도립된 말단 반복부(ITR)를 포함하여 ~4.5 kb이다.
AAV는 파보바이러스 패밀리에 속하는 작은 단일-가닥 DNA 의존적 바이러스이다. 4.7 kb 야생형(wt) AAV 게놈은 각각 4 개의 복제 단백질 및 3 개의 캡시드 단백질을 암호화하는 2 개의 유전자로 구성되고, 145-bp 도립된 말단 반복부(ITR)에 의해 어느 한 측면에 플랭킹된다. 비리온은 동일한 오픈 리딩 프레임으로부터, 그러나 차등 스플라이싱(Vp1) 및 대체 번역 시작 부위(각각 Vp2 및 Vp3)로부터 1:1:10 비로 생성된 3 개의 캡시드 단백질, Vp1, Vp2, 및 Vp3으로 구성된다. Vp3은 비리온에서 가장 풍부한 서브유닛이며 바이러스의 향성을 정의하는 세포 표면에서 수용체 인식에 참여한다. 바이러스 감염성으로 기능하는 포스포리파제 도메인은 Vp1의 고유한 N 말단에서 식별되었다.
wt AAV와 유사하게, 재조합 AAV(rAAV)는 시스-작용 145-bp ITR을 활용하여 벡터 이식유전자 카세트를 플랭킹하여, 외래 DNA의 패키닝을 위해 최대 4.5 kb를 제공한다. 감염 후, rAAV는 본 발명의 융합 단백질을 발현하고 원형 머리-대-꼬리 연쇄체(concatemer)에서 에피솜으로 존재함으로써 숙주 게놈 내로의 통합 없이 지속될 수 있다. 시험관내 및 생체내에서 이 시스템을 사용한 rAAV 성공의 많은 예가 있지만, 제한된 패키징 용량은 유전자의 코딩 서열의 길이가 wt AAV 게놈의 크기보다 더 크거나 또는 동일할 때 AAV-매개 유전자 전달의 사용을 제한하였다.
AAV 벡터의 작은 패키징 용량은 이 크기를 초과하는 다수의 유전자의 전달 및/또는 큰 생리학적 조절 요소의 사용을 어렵게 만든다. 이러한 어려움은 예를 들어, 전달될 단백질(들)를 2 개 이상의 단편으로 나눔으로써 해결될 수 있으며, 여기서 N-말단 단편은 스플릿 인테인-N에 융합되고 C-말단 단편은 스플릿 인테인-C에 융합된다. 그런 다음 이들 단편은 2 개 이상의 AAV 벡터로 패키징된다. 본원에 사용된 바와 같이, "인테인"은 플랭킹 N-말단 및 C-말단 엑스테인(예를 들어, 연결될 단편)을 결찰하는 자기-스플라이싱 단백질 인트론(예를 들어, 펩티드)을 지칭한다. 이종 단백질 단편을 연결하기 위한 특정 인테인의 사용은 예를 들어, Wood 등, J. Biol. Chem. 289(21); 14512-9 (2014)에 기재되어 있다. 예를 들어, 별도의 단백질 단편과 융합된 경우, 인테인 IntN 및 IntC는 서로를 인식하고, 스스로를 스플라이싱하고 이들이 융합된 단백질 단편의 플랭킹 N- 및 C-말단 엑스테인을 동시에 결찰시켜, 2 개의 단백질 단편으로부터 전장 단백질을 재구축한다. 다른 적합한 인테인은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 융합 단백질의 단편은 길이가 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 2 개의 아미노산 내지 약 1000 개의 아미노산 길이 범위이다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 약 5 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산 길이 범위이다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 약 20 개의 아미노산 내지 약 200 개의 아미노산 길이 범위이다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 약 10 개의 아미노산 내지 약 100 개의 아미노산 길이 범위이다. 다른 길이의 적합한 단백질 단편은 당업자에게 명백할 것이다.
일부 구현예에서, 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)의 일부 또는 단편은 인테인에 융합된다. 뉴클레아제는 인테인의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 일부 또는 단편은 인테인에 융합되고 AAV 캡시드 단백질에 융합된다. 인테인, 뉴클레아제 및 캡시드 단백질은 임의의 배열(예를 들어, 뉴클레아제-인테인-캡시드, 인테인-뉴클레아제-캡시드, 캡시드-인테인-뉴클레아제 등)에서 함께 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 인테인의 N-말단은 융합 단백질의 C-말단에 융합되고 인테인의 C-말단은 AAV 캡시드 단백질의 N-말단에 융합된다.
일 구현예에서, 이중 AAV 벡터는 큰 이식유전자 발현 카세트를 2 개의 별도의 절반(5' 및 3' 단부, 또는 머리 및 꼬리)으로 분할함으로써 생성되며, 여기서 카세트의 각각의 절반은 단일 AAV 벡터(5 kb 미만)에 패키징된다. 그런 다음 다음과 같은 두 이중 AAV 벡터에 의해 동일한 세포의 공동 감염 시 전장 이식유전자 발현 카세트에 의한 재조립이 달성된다: (1) 5' 및 3' 게놈 사이의 상동 재조합(HR)(이중 AAV 중첩 벡터); (2) 5' 및 3' 게놈의 ITR-매개 꼬리-대-머리 연쇄체화(이중 AAV 트랜스-스플라이싱 벡터); 또는 (3) 이들 2 가지 메커니즘의 조합(이중 AAV 하이브리드 벡터). 생체내에서 이중 AAV 벡터의 사용은 전장 단백질의 발현을 초래한다. 이중 AAV 벡터 플랫폼의 사용은 4.7 kb 초과 크기의 이식유전자에 대한 효율적이고 실행가능한 유전자 전달 전략을 나타낸다.
염기 편집기를 설계하기 위한 개시된 전략은 바이러스 벡터 내로 패키징될 수 있는 염기 편집기를 생성하는 데 유용할 수 있다. 염기 편집기의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 배양물 또는 숙주에서 특이적 세포에 바이러스를 표적화하고 핵 또는 숙주 세포 게놈에 바이러스 페이로드를 수송하는 고도로 진화된 과정의 이점을 취한다. 바이러스 벡터는 배양물, 환자(생체내)에서 세포에 직접적으로 투여될 수 있거나, 또는 시험관내에서 세포를 처리하는 데 사용될 수 있고, 변형된 세포는 임의적으로 환자(생체외)에게 투여될 수 있다. 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 숙주 게놈 내로 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하며, 종종 삽입된 이식유전자의 장기간 발현을 초래한다. 추가적으로, 높은 형질도입 효율이 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.
레트로바이러스의 향성은 외래 외피 단백질을 혼입하여, 표적 세포의 잠재적인 표적 집단으로 확장함으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분할 세포를 형질도입하거나 또는 감염시킬 수 있고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 따라서 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 따라 달라질 것이다. 레트로바이러스 벡터는 외래 서열의 최대 6-10 kb에 대한 패키징 용량을 갖는 시스-작용 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스-작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이어서 치료적 유전자를 표적 유전자 내로 통합하는 데 사용되어 영구적인 이식유전자 발현을 제공한다. 광범위하게 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 시미안 면역 결핍 바이러스(SIV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 및 이의 조합에 기초한 것들을 포함한다(예를 들어, Buchscher 등, J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann 등, J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt 등, Virol. 176:58-59 (1990); Wilson 등, J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller 등, J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700 참조).
레트로바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터는 표적 세포 내로의 효율적인 통합을 위해 주어진 길이보다 더 작은 폴리뉴클레오티드 서열을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 9 kb 초과 길이의 레트로바이러스 벡터는 더 작은 크기의 것과 비교하여 낮은 바이러스 역가를 초래할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 염기 편집기는 레트로바이러스 벡터를 통해 표적 세포 내로의 효율적인 패키징 및 전달을 가능하게 하기에 충분한 크기이다. 일부 경우에, 염기 편집기는 가이드 핵산 및/또는 표적화가능한 뉴클레아제 시스템의 다른 구성요소와 함께 발현될 때조차 효율적인 패키징 및 전달을 허용하기 위한 크기이다.
일시적 발현이 바람직한 적용에서, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하고 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 사용하여, 높은 역가 및 발현 수준이 수득되었다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 다량으로 생성될 수 있다. 아데노 연관 바이러스("AAV") 벡터는 또한 예를 들어, 핵산 및 펩티드의 시험관내 생산에서, 그리고 생체내 및 생체외 유전자 요법 절차를 위해 표적 핵산으로 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, West 등, Virology 160:38-47 (1987); 미국 특허 번호 제4,797,368호; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994) 참조. 재조합 AAV 벡터의 구축은 미국 특허 번호 제5,173,414호; Tratschin 등, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski 등, J. Virol. 63:03822-3828 (1989)를 포함한 다수의 간행물에 기재되어 있다.
따라서 본원에 기재된 염기 편집기는 바이러스 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 염기 편집기 시스템의 하나 이상의 구성요소는 하나 이상의 바이러스 벡터 상에서 암호화될 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기 및 가이드 핵산은 단일 바이러스 벡터 상에서 암호화될 수 있다. 다른 경우에, 염기 편집기 및 가이드 핵산은 상이한 바이러스 벡터 상에서 암호화된다. 어느 경우에든, 염기 편집기 및 가이드 핵산은 각각 프로모터 및 종결인자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
바이러스 벡터 상에서 암호화된 구성요소의 조합은 선택된 바이러스 벡터의 화물 크기 제한에 의해 결정될 수 있다.
염기 편집기의 비-바이러스 전달
염기 편집기에 대한 비-바이러스 전달 접근법이 또한 이용가능하다. 비-바이러스 핵산 벡터의 하나의 중요한 범주는 유기 또는 무기일 수 있는 나노입자이다. 나노입자는 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 적합한 나노입자 설계는 게놈 편집 시스템 구성요소 또는 이러한 구성요소를 암호화하는 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 유기(예를 들어 지질 및/또는 중합체) 나노입자는 본 개시내용의 특정 구현예에서 전달 비히클로서 사용하기에 적합할 수 있다. 나노입자 제형, 및/또는 유전자 전달에 사용하기 위한 예시적인 지질은 표 15(하기)에 제시되어 있다.
표 15
표 16은 유전자 전달 및/또는 나노입자 제형에 사용하기 위한 예시적인 중합체를 나열한다.
표 16
표 17은 본원에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 전달 방법을 요약한다.
표 17
또 다른 측면에서, 게놈 편집 시스템 구성요소 또는 이러한 구성요소를 암호화하는 핵산, 예를 들어, 핵산 결합 단백질 예컨대, 예를 들어, Cas9 또는 이의 변이체, 및 관심 게놈 핵산 서열을 표적화하는 gRNA의 전달은 리보뉴클레오단백질(RNP)을 세포에 전달함으로써 달성될 수 있다. RNP는 표적화 gRNA와의 복합체에 핵산 결합 단백질, 예를 들어, Cas9를 포함한다. RNP는 전기천공법, 뉴클레오펙션(nucleofection), 또는 예를 들어, Zuris, J.A. 등, 2015, Nat. Biotechnology, 33(1):73-80에 보고된 바와 같은 양이온성 지질-매개 방법과 같은 알려진 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. RNP는 CRISPR 염기 편집 시스템, 특히 1차 세포와 같이 형질감염이 어려운 세포에 사용하기에 유리하다. 게다가, RNP는 또한 특히 CRISPR 플라스미드에 사용될 수 있는 진핵생물 프로모터, 예를 들어, CMV 또는 EF1A가 잘 발현되지 않을 때, 세포에서 단백질 발현과 함께 발생할 수 있는 어려움을 완화할 수 있다. 유리하게는, RNP의 사용은 외래 DNA의 세포 내로의 전달을 필요로 하지 않는다. 더욱이, 핵산 결합 단백질 및 gRNA 복합체를 포함하는 RNP는 시간 경과에 따라 분해되기 때문에, RNP의 사용은 표적외 효과를 제한할 가능성이 있다. 플라스미드 기반 기술과 유사한 방식으로, RNP를 사용하여 결합 단백질(예를 들어, Cas9 변이체)을 전달하고 상동성 지정 복구(HDR)를 지시할 수 있다.
핵산 분자 발현을 코딩하는 염기 편집기를 구동하는 데 사용되는 프로모터는 AAV ITR을 포함할 수 있다. 이는 벡터에서 공간을 차지할 수 있는 추가적인 프로모터 요소에 대한 필요성을 제거하는 데 유리할 수 있다. 확보된 추가적인 공간은 가이드 핵산 또는 선택가능한 마커와 같은 추가적인 요소의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. ITR 활성은 상대적으로 약하므로, 선택된 뉴클레아제의 과발현으로 인한 잠재적인 독성을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
임의의 적합한 프로모터는 염기 편집기 및, 적절한 경우, 가이드 핵산의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. 보편적인 발현을 위해, 사용될 수 있는 프로모터는 CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, 페리틴(Ferritin) 중쇄 또는 경쇄 등을 포함한다. 뇌 또는 다른 CNS 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: 모든 뉴런의 경우 SynapsinI, 흥분성 뉴런의 경우 CaMKII알파, GABA성 뉴런의 경우 GAD67 또는 GAD65 또는 VGAT 등. 간 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 알부민 프로모터를 포함한다. 폐 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 SP-B를 포함할 수 있다. 내피 세포의 경우, 적합한 프로모터는 ICAM을 포함할 수 있다. 조혈 세포의 경우 적합한 프로모터는 IFN베타 또는 CD45를 포함할 수 있다. 골아세포의 경우 적합한 프로모터는 OG-2를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 염기 편집기는 별도의 프로모터가 동일한 핵산 분자 내에서 염기 편집기 및 호환성 가이드 핵산의 발현을 구동할 수 있도록 충분히 작은 크기의 것이다. 예를 들면, 벡터 또는 바이러스 벡터는 염기 편집기를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터 및 가이드 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함할 수 있다.
가이드 핵산의 발현을 구동하는 데 사용되는 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: Pol II 프로모터의 U6 또는 H1 사용 같은 Pol III 프로모터 및 gRNA 아데노 연관 바이러스(AAV)를 발현하는 인트론 카세트.
하나 이상의 가이드 핵산이 있거나 또는 없는 본원에 기재된 염기 편집기는 아데노 연관 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 플라스미드 또는 바이러스 벡터 유형을 사용하여, 특히, 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,454,972호(아데노바이러스에 대한 제형, 용량), 미국 특허 번호 제8,404,658호(AAV에 대한 제형, 용량) 및 미국 특허 번호 제5,846,946호(DNA 플라스미드에 대한 제형, 용량) 및 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스를 수반하는 임상 시험 및 임상 시험에 관한 간행물로부터의 제형 및 용량을 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, AAV의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 번호 제8,454,972호 및 AAV를 수반하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 아데노바이러스의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 번호 제8,404,658호 및 아데노바이러스를 수반하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 플라스미드 전달의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 번호 제5,846,946호 및 플라스미드를 수반하는 임상 연구에서와 같을 수 있다. 용량은 평균 70 kg 개인(예를 들어 성인 남성)을 기준으로 하거나 이에 추정될 수 있고, 상이한 체중 및 종의 환자, 대상체, 포유동물에 대해 조정될 수 있다. 투여 빈도는 연령, 성별, 일반적인 건강, 환자 또는 대상체의 다른 병태 및 다루어지는 특정 병태 또는 증상을 포함한 일반적 요인에 따라 의사 또는 수의사(예를 들어, 의사, 수의사)의 영역 내에 있다. 바이러스 벡터는 관심 조직 내로 주입될 수 있다. 세포-유형 특이적 염기 편집을 위해, 염기 편집기 및 임의적인 가이드 핵산의 발현은 세포-유형 특이적 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
생체내 전달의 경우, AAV는 다른 바이러스 벡터보다 유리할 수 있다. 일부 경우에, AAV는 낮은 독성을 허용하며, 이는 면역 반응을 활성화할 수 있는 세포 입자의 초원심분리를 필요로 하지 않는 정제 방법에 기인할 수 있다. 일부 경우에, AAV는 숙주 게놈 내로 통합되지 않기 때문에 삽입 돌연변이생성을 유발할 가능성이 낮다.
AAV는 4.5 또는 4.75 Kb의 패키징 제한을 갖는다. 이는 개시된 염기 편집기 뿐만 아니라 프로모터 및 전사 종결인자가 단일 바이러스 벡터 내로 맞춰질 수 있음을 의미한다. 4.5 또는 4.75 Kb 초과의 작제물은 상당히 감소된 바이러스 생산을 야기할 수 있다. 예를 들어, SpCas9는 상당히 크고, 유전자 자체는 4.1 Kb 초과이며, AAV 내로 패킹하기 어렵다. 따라서, 본 개시내용의 구현예는 통상적인 염기 편집기보다 더 짧은 길이인 개시된 염기 편집기를 활용하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 염기 편집기는 4 kb 미만이다. 개시된 염기 편집기는 4.5 kb, 4.4 kb, 4.3 kb, 4.2 kb, 4.1 kb, 4 kb, 3.9 kb, 3.8 kb, 3.7 kb, 3.6 kb, 3.5 kb, 3.4 kb, 3.3 kb, 3.2 kb, 3.1 kb, 3 kb, 2.9 kb, 2.8 kb, 2.7 kb, 2.6 kb, 2.5 kb, 2 kb, 또는 1.5 kb 미만일 수 있다. 일부 경우에, 개시된 염기 편집기는 4.5 kb 이하의 길이이다.
AAV는 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 표적화될 세포와 관련하여 AAV의 유형을 선택할 수 있고; 예를 들어, 뇌 또는 뉴런 세포를 표적화하기 위해 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이의 임의의 조합을 선택할 수 있고; 심장 조직을 표적화하기 위해 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간으로의 전달에 유용하다. 이들 세포에 관한 특정 AAV 혈청형의 도표는 Grimm, D. 등, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008))에서 찾을 수 있다.
렌티바이러스는 유사분열 및 유사분열후 세포 둘 다에서 유전자를 감염시키고 발현하는 능력을 갖는 복합 레트로바이러스이다. 가장 흔히 알려진 렌티바이러스는 광범위한 세포 유형을 표적화하는 다른 바이러스의 외피 당단백질을 사용하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)이다.
렌티바이러스는 다음과 같이 제조될 수 있다. pCasES10(렌티바이러스 전달 플라스미드 백본 함유)을 클로닝한 후, HEK293FT를 낮은 계대(p=5)에서 10% 소 태아 혈청을 함유하고 항생제가 없는 DMEM에서 형질감염 전날 50% 합류가 되도록 T-75 플라스크에 시딩하였다. 20 시간 후, 배지를 OptiMEM(무혈청) 배지로 교체하고 4 시간 후 형질감염을 수행하였다. 세포를 10 μg의 렌티바이러스 전달 플라스미드(pCasES10) 및 하기 패키징 플라스미드로 형질감염시켰다: 5 μg의 pMD2.G(VSV-g 위형), 및 7.5 μg의 psPAX2(gag/pol/rev/tat). 양이온성 지질 전달제(50 μl Lipofectamine 2000 및 100 ul 및 시약)를 함유하는 4 mL OptiMEM에서 형질감염을 수행할 수 있다. 6 시간 후, 배지를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 무항생제 DMEM으로 교체한다. 이러한 방법은 세포 배양 동안 혈청을 사용하지만, 무혈청 방법이 선호된다.
렌티바이러스는 다음과 같이 정제될 수 있다. 48 시간 후 바이러스 상청액을 수확한다. 상청액을 먼저 파편을 제거하고 0.45 μm 낮은 단백질 결합(PVDF) 필터를 통해 여과한다. 그런 다음 이들을 초원심분리기에서 2 시간 동안 24,000 rpm으로 회전시킨다. 바이러스 펠릿을 4℃에서 밤새 50 μl의 DMEM에 재현탁한다. 그런 다음 이들을 분취하고 -80℃에서 즉시 동결시킨다.
또 다른 구현예에서, 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)를 기반으로 한 최소 비-영장류 렌티바이러스 벡터가 또한 고려된다. 또 다른 구현예에서, 혈관형성 억제 단백질 엔도스타틴 및 안지오스타틴을 발현하는 말 전염성 빈혈 바이러스-기반 렌티바이러스 유전자 요법 벡터인 RETINOSTAT®가 망막하 주사를 통해 전달되는 것으로 고려된다. 또 다른 구현예에서, 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터의 사용이 고려된다.
시스템의 임의의 RNA, 예를 들어 가이드 RNA 또는 염기 편집기-암호화 mRNA는 RNA의 형태로 전달될 수 있다. 염기 편집기-암호화 mRNA는 시험관내 전사를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 mRNA는 하기 요소를 함유하는 PCR 카세트를 사용하여 합성될 수 있다: T7 프로모터, 임의적인 코작 서열(GCCACC), 뉴클레아제 서열, 및 베타 글로빈-polyA 꼬리로부터의 3' UTR과 같은 3' UTR. 카세트는 T7 폴리머라제에 의한 전사에 사용될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)는 또한 T7 프로모터, 이어서 서열 "GG", 및 가이드 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 카세트로부터 시험관내 전사를 사용하여 전사될 수 있다.
발현을 향상시키고 가능한 독성을 감소시키기 위해, 염기 편집기-코딩 서열 및/또는 가이드 핵산은 예를 들어, 슈도-U 또는 5-메틸-C를 사용하여 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하도록 변형될 수 있다.
본 개시내용은 일부 구현예에서 세포 또는 유기체를 변형시키는 방법을 이해한다. 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 세포는 포유류 세포일 수 있다. 포유류 세포는 비인간 영장류, 소, 돼지, 설치류 또는 마우스 세포일 수 있다. 본 개시내용의 염기 편집기, 조성물 및 방법에 의해 세포에 도입되는 변형은 세포 및 세포의 자손이 항체, 전분, 알코올 또는 다른 바람직한 세포 산출물과 같은 생물학적 생성물의 개선된 생산을 위해 변경되도록 할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 세포에 도입되는 변형은 세포 및 세포의 자손이 생성된 생물학적 생성물을 변화시키는 변경을 포함하도록 할 수 있다.
시스템은 하나 이상의 상이한 벡터를 포함할 수 있다. 측면에서, 염기 편집기는 원하는 세포 유형, 우선적으로는 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유류 세포 또는 인간 세포를 발현하기에 최적화된 코돈이다.
일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어 약 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 개 초과, 또는 그 이상의 코돈)을 천연 아미노산 서열을 유지하면서 해당 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에서 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정한 코돈에 대한 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 사이의 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관관계가 있으며, 이는 결국 그 중에서도, 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 이용가능성에 따라 달라지는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현에 맞춰질 수 있다. 코돈 사용 표는 예를 들어, www.kazusa.orjp/codon/ (visited Jul. 9, 2002)에서 이용가능한 "Codon Usage Database"에서 용이하게 이용가능하고, 이러한 표는 다수의 방식으로 조정될 수 있다. Nakamura, Y., 등 "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000) 참조. 특정 숙주 세포에서 발현을 위한 특정 서열을 최적화하는 코돈에 대한 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용가능하며, 예컨대 Gene Forge(Aptagen; Jacobus, Pa.)가 또한 이용가능하다. 일부 구현예에서, 조작된 뉴클레아제를 암호화하는 서열에서 하나 이상의 코돈(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 개, 또는 그 이상, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.
패키징 세포는 전형적으로 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는 데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 psi.2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자 내로 패키징하는 세포주를 생산함으로써 생성된다. 벡터는 전형적으로 숙주 내로의 패키징 및 후속 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 폴리뉴클레오티드(들)에 대한 발현 카세트로 대체된다. 누락 바이러스 기능은 전형적으로 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 숙주 게놈 내로의 패키징 및 통합에 필요한 AAV 게놈으로부터 ITR 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap를 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만, ITR 서열이 결여되어 있는 세포주에 패키징될 수 있다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진할 수 있다. 헬퍼 플라스미드는 일부 경우에 ITR 서열의 결여로 인해 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스로의 오염은 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.
인테인
일부 구현예에서, 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)의 일부 또는 단편은 인테인에 융합된다. 뉴클레아제는 인테인의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 일부 또는 단편은 인테인에 융합되고 AAV 캡시드 단백질에 융합된다. 인테인, 뉴클레아제 및 캡시드 단백질은 임의의 배열로 함께 융합될 수 있다(예를 들어, 뉴클레아제-인테인-캡시드, 인테인-뉴클레아제-캡시드, 캡시드-인테인-뉴클레아제 등). 일부 구현예에서, 인테인의 N-말단은 융합 단백질의 C-말단에 융합되고 인테인의 C-말단은 AAV 캡시드 단백질의 N-말단에 융합된다.
인테인(개재 단백질)은 단백질 스플라이싱으로 알려진 과정을 수행하는 다양한 여러 유기체에서 발견되는 자가-처리 도메인이다. 단백질 스플라이싱은 펩티드 결합의 절단 및 형성 둘 다로 이루어진 다단계 생화학 반응이다. 단백질 스플라이싱의 내인성 기질은 인테인-함유 유기체에서 발견되는 단백질이지만, 인테인은 또한 사실상 임의의 폴리펩티드 백본을 화학적으로 조작하는 데 사용될 수 있다.
단백질 스플라이싱에서, 인테인은 2 개의 펩티드 결합을 절단함으로써 전구체 폴리펩티드를 자체적으로 절제하여, 새로운 펩티드 결합의 형성을 통해 플랭킹 엑스테인(외부 단백질) 서열을 결찰시킨다. 이 재배열은 번역후(또는 가능한 동시 번역으로) 발생한다. 인테인-매개 단백질 스플라이싱은 자발적으로 발생하며, 인테인 도메인의 접힘만을 필요로 한다.
인테인의 약 5%는 스플릿 인테인이며, 각각이 하나의 엑스테인에 융합된 N-인테인 및 C-인테인인 2 개의 별도의 폴리펩티드로서 전사 및 번역된다. 번역 시, 인테인 단편은 자발적으로 및 비-공유적으로 표준 인테인 구조 내로 조립되어 단백질 스플라이싱을 트랜스로 수행한다. 단백질 스플라이싱의 메커니즘은 인테인-엑스테인 접합부에서 2 개의 펩티드 결합의 절단 및 N- 및 C-엑스테인 사이에 새로운 펩티드 결합의 형성을 초래하는 일련의 아실-전달 반응을 수반한다. 이 과정은 N-엑스테인 및 인테인의 N-말단을 연결하는 펩티드 결합의 활성화로 개시된다. 사실상 모든 인테인은 N-말단에서 C-말단 N-엑스테인 잔기의 카르보닐 탄소를 공격하는 시스테인 또는 세린을 갖는다. 이러한 N에서 O/S로의 아실-이동은 흔히 발견되는 아스파르테이트와 함께 보존된 트레오닌 및 히스티딘(TXXH 모티프로 지칭됨)에 의해 용이하게 되어, 선형 (티오)에스테르 중간체의 형성을 초래한다. 다음으로, 이 중간체는 시스테인, 세린, 또는 트레오닌인 첫번째 C-엑스테인 잔기(+1)의 친핵체 공격에 의해 트랜스-(티오)에스테르화에 적용된다. 생성된 분지형 (티오)에스테르 중간체는 고유한 형태인 인테인의 고도로 보존된 C-말단 아스파라긴의 환화를 통해 분해된다. 이 과정은 히스티딘(고도로 보존된 HNF 모티프에서 발견) 및 끝에서 두번째 히스티딘에 의해 용이하게 되고 또한 아스파르테이트를 수반할 수 있다. 이 숙신이미드 형성 반응은 반응성 복합체로부터 인테인을 절제하고 비-펩티드성 결합을 통해 부착된 엑스테인을 남겨 둔다. 이 구조는 인테인-독립적 방식으로 안정된 펩티드 결합 내로 빠르게 재배열된다.
일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, ABE, CBE)의 N-말단 단편은 스플릿 인테인-N에 융합되고 C-말단 단편은 스플릿 인테인-C에 융합된다. 그런 다음 이러한 단편은 2 개 이상의 AAV 벡터 내로 패키징된다. 이종 단백질 단편을 연결하기 위한 특정 인테인의 사용은 예를 들어, Wood 등, J. Biol. Chem. 289(21); 14512-9 (2014)에 기재되어 있다. 예를 들어, 별개의 단백질 단편에 융합될 때, 인테인 IntN 및 IntC는 서로를 인식하고, 스스로를 스플라이싱하고, 이들이 융합된 단백질 단편의 플랭킹 N- 및 C-말단 엑스테인을 동시에 결찰시켜, 2 개의 단백질 단편으로부터 전장 단백질을 재구축한다. 다른 적합한 인테인은 당업자에게 명백할 것이다.
일부 구현예에서, ABE는 SpCas9의 선택된 영역 내의 Ala, Ser, Thr, 또는 Cys 잔기에서 N- 및 C-말단 단편으로 스플릿되었다. 이들 영역은 Cas9 결정 구조 분석에 의해 식별된 루프 영역에 상응한다. 각 단편의 N-말단은 인테인-N에 융합되고 각 단편의 C-말단은 아미노산 위치 S303, T310, T313, S355, A456, S460, A463, T466, S469, T472, T474, C574, S577, A589, 및 S590에서 인테인 C에 융합되며, 이는 하기 서열에서 굵은 대문자로 표시된다.
약제학적 조성물
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 염기 편집기, 융합 단백질, 융합 단백질-가이드 폴리뉴클레오티드 복합체, 또는 편집된 세포 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적 조성물"은 약제학적 용도를 위해 제형화된 조성물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 추가적인 제제(예를 들어, 특이적 전달, 반감기 증가, 또는 다른 치료적 화합물을 위함)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로-허용되는 담체"는 약제학적으로-허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예를 들어, 윤활제, 활석 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트, 또는 스테르산), 또는 신체의 한 부위(예를 들어, 전달 부위)에서 또 다른 부위(예를 들어, 기관, 조직 또는 신체의 일부)로 화합물을 운반하거나 또는 수송하는 데 수반되는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제형의 다른 성분과 호환성이고 대상체의 조직에 해롭지 않다는 의미(예를 들어, 생리학적으로 호환성, 멸균성, 생리학적 pH 등)에서 "허용가능하다".
약제학적으로-허용되는 담체로서 역할을 할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 술페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG); (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 무발열원수; (17) 등장성 염수; (18) 링거(Ringer) 용액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 증량제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산 (23) 혈청 알코올, 예컨대 에탄올; 및 (23) 약제학적 제형에서 이용되는 다른 무독성 호환성 물질. 습윤제, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제, 방향제, 방부제 및 산화방제제가 또한 제형에 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "약제학적으로 허용되는 담체", "비히클" 등과 같은 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
약제학적 조성물은 미리 결정된 수준에서 약 5.0 내지 약 8.0의 범위에서와 같은 생리학적 pH를 반영하는 제형의 pH를 유지하기 위해 하나 이상의 pH 완충 화합물을 포함할 수 있다. 수성 액체 제형에 사용되는 pH 완충 화합물은 아미노산 또는 히스티딘과 같은 아미노산의 혼합물 또는 히스티딘 및 글리신과 같은 아미노산의 혼합물일 수 있다. 대안적으로, pH 완충 화합물은 바람직하게는 미리 결정된 수준에서 약 5.0 내지 약 8.0의 범위에서와 같은 제형의 pH를 유지하고, 칼슘 이온을 킬레이트화하지 않는 제제이다. 이러한 pH 완충 화합물의 예시적인 예는 이미다졸 및 아세테이트 이온을 포함하나 이에 제한되지 않는다. pH 완충 화합물은 미리 결정된 수준에서 제형의 pH를 유지하기에 적합한 임의의 양으로 존재할 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 삽투압 조절제, 즉, 개인 수혜자의 혈류 및 혈액 세포에 허용가능한 수준으로 제형의 삼투압 특성(예를 들어, 등장성, 삼투압, 및/또는 삼투 압력)을 조절하는 화합물을 함유할 수 있다. 삽투압 조절제는 칼슘 이온을 킬레이트화하지 않는 제제일 수 있다. 삽투압 조절제는 제형의 삼투압 특성을 조절하는 당업자에게 알려지거나 또는 이용가능한 임의의 화합물일 수 있다. 당업자는 본 발명의 제형에 사용하기 위한 주어진 삽투압 조절제의 적합성을 경험적으로 결정할 수 있다. 적합한 유형의 삽투압 조절제의 예시적인 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 염, 예컨대 나트륨 클로라이드 및 나트륨 아세테이트; 당, 예컨대 수크로스, 덱스트로스, 및 만니톨; 아미노산, 예컨대 글리신; 및 이러한 제제 및/또는 제제의 유형 중 하나 이상의 혼합물. 삽투압 조절제(들)는 제형의 삼투압 특성을 조절하기에 충분한 임의의 농도로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어, 유전자 편집을 위해 대상체에게 전달하기 위해 제형화된다. 본원에 기재된 약제학적 조성물을 투여하는 적합한 경로는 다음을 포함하나 이제 제한되지 않는다: 국소, 피하, 경피, 피내, 병변내, 관절내, 복강내, 방광내, 경점막, 치은, 치간, 와우내, 경고막, 기관내, 경막외, 척추강내, 근육내, 정맥내, 혈관내, 골내, 안구주위, 종양내, 대뇌내, 및 뇌실내 투여.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 병적 부위, 예를 들어, 종양 부위에 국부적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 이식물에 의해 대상체에게 투여되며, 이식물은 시알라스틱 막, 또는 섬유와 같은 막을 포함한 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질이다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달된다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(예를 들어, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit . Ref. Biomed . Eng . 14:201; Buchwald 등, 1980, Surgery 88:507; Saudek 등, 1989, N. Engl . J. Med . 321:574 참조). 또 다른 구현예에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다. (예를 들어, Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol . Sci . Rev. Macromol . Chem . 23:61 참조. 또한 Levy 등, 1985, Science 228: 190; During 등, 1989, Ann. Neurol . 25:351; Howard et ah, 1989, J. Neurosurg . 71: 105 참조) 예를 들어, 상기 Langer에서 다른 제어 방출 시스템이 논의되고 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체, 예를 들어, 인간에게 정맥내 또는 피하 투여에 적합한 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 일부 구현예에서, 주사에 의해 투여하기 위한 약제학적 조성물은 가용화제로서 사용하기 위한 멸균 등장성 용액 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제이다. 일반적으로, 성분은 개별적으로 또는 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 샤셰(sachette)와 같은 완전 밀폐 용기에서 건조 동결건조 분말 또는 무수 농출물로서 단위 투여 형태로 함께 공급된다. 약제가 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약제학적 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 약제학적 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
전신 투여를 위한 약제학적 조성물은 액체, 예를 들어, 멸균 염수, 락테이트화 링거 또는 행크 용액일 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 고체 형태이고 사용 직전에 재용해되거나 또는 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태가 또한 고려된다. 약제학적 조성물은 비경구 투여에도 적합한 리소솜 또는 미세결정과 같은 지질 입자 또는 소포 내에 함유될 수 있다. 입자는 조성물이 그 안에 함유되어 있는 한, 단층 또는 다층과 같은 임의의 적합한 구조일 수 있다. 화합물은 낮은 수준(5-10 mol%)의 양이온성 지질인 융해성 지질 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)을 함유하는 "안정화된 플라스미드-지질 입자"(SpLP)에 포획되고, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 코팅에 의해 안정화될 수 있다(Zhang Y. P. et ah, Gene Ther. 1999, 6: 1438-47). 이러한 입자 및 소포에 대해 N-[l-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸술페이트, 또는 "DOTAP"와 같은 양으로 하전된 지질이 특히 바람직하다. 이러한 지질 입자의 제조는 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,880,635; 4,906,477; 4,911,928; 4,917,951; 4,920,016; 및 4,921,757을 참조하며; 각각이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 예를 들어, 단위 용량으로 투여되거나 또는 패키징될 수 있다. 용어 "단위 용량"은 본원의 개시내용의 약제학적 조성물과 관련하여 사용될 때 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 필요한 희석제; 즉, 담체, 또는 비히클과 관련하여 원하는 치료적 효과를 생성하기 위해 계산된 미리 결정된 활성 물질의 양을 함유한다.
또한, 약제학적 조성물은 (a) 동결건조된 형태의 본 발명의 화합물을 함유하는 용기 및 (b) 약제학적으로 허용되는 희석제(예를 들어, 본 발명의 동결건조된 화합물의 재구성 및 희석에 사용되는 멸균물을 함유하는 제2 용기를 포함하는 약제학적 키트로 제공될 수 있다. 이러한 용기(들)과 임의적으로 관련된 것은 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 안내문이며, 이 안내문은 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 포함된다. 일부 구현예에서, 제조 물품은 용기 또는 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 테스트 튜브를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 본원에 기재된 질환을 치료하기에 효과적인 조성물을 보유하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 스토퍼가 있는 바이알일 수 있다. 조성물 내 활성제는 본 발명의 화합물이다. 일부 구현예에서, 용기 상의 또는 관련된 라벨은 조성물이 선택 질환을 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 제조 물품은 약제학적으로-허용되는 완충제, 예컨대 포스페이트-완충 염수, 링거 용액, 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함한 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 융합 단백질, gRNA, 복합체, 및/또는 세포는 약제학적 조성물의 일부로 제공된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 제공된 임의의 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 gRNA 및 양이온성 지질과 복합체를 형성하는 RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)를 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서 약제학적 조성물은 gRNA, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질, 양이온성 지질, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물을 본원에 기재된 생성물, 시스템 및 방법에 의해 편집된 세포를 포함한다. 약제학적 조성물은 임의적으로 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 물질을 포함할 수 있다.
유전 질환의 치료 방법
또한 본원에 기재된 염기 편집기 시스템(예를 들어, 염기 편집기 및 gRNA)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료 유효량의 약제학적 조성물을 대상체(예를 들어, 인간과 같은 포유동물)에게 투여하는 단계를 포함하는 유전 질환과 연관된 병원성 돌연변이를 치료하는 방법이 제공된다. 구현예에서, 유전 질환은 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 아데노신 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 대상체의 세포는 염기 편집기 및 야생형 서열에 비해 돌연변이를 함유하는 핵산 서열의 AㆍT에서 GㆍC로의 변경(세포가 아데노신 데아미나제 도메인으로 형질도입된 경우)에 영향을 미치도록 염기 편집기를 표적화하는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드로 형질도입된다.
본원의 방법은 본원에 기재된 유효량의 조성물을 대상체(이러한 치료를 필요로 하는 것으로 식별된 대상체, 또는 질환의 위험이 있는 것으로 의심되고 이러한 치료를 필요로 하는 대상체 포함)에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에서 식별하는 것은 대상체 또는 건강 관리 전문가의 판단에 따를 수 있고 주관적(예를 들어 의견) 또는 객관적(예를 들어 테스트 또는 진단 방법에 의해 측정가능)일 수 있다.
치료 방법은 일반적으로 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 환자)의 관심 유전자를 표적화하는 염기 편집기 및 gRNA를 암호화하는 벡터를 포함하는, 치료 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료는 유전 질환을 앓고 있거나, 이를 가지고 있거나, 이에 취약하거나, 또는 이에 대한 위험이 있는 대상체, 특히 인간 대상체에게 적합하게 투여될 것이다. 구현예에서, 유전 질환은 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)이다.
일 구현예에서, 치료 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다. 방법은 병원성 돌연변이와 연관된 장애 또는 이의 증상을 앓고 있거나 또는 취약한 대상체에서 진단 마커(마커)(예를 들어, 질환과 연관된 SNP) 또는 진단 측정(예를 들어, 스크린, 검정)의 수준을 결정하는 단계를 포함하며 여기서 대상체에게 질환 또는 이의 증상을 치료하기에 충분한 본원의 치료량의 조성물이 투여되었다. 방법에서 결정된 마커의 수준은 건강한 정상 대조군 또는 대상체의 질환 상태를 확립하도록 이환된 다른 환자에서 마커의 알려진 수준과 비교될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 대상체에서 마커의 제2 수준은 제1 수준의 결정보다 나중 시점에 결정되고, 2 개의 수준은 질환 과정 또는 요법의 효능을 모니터링하기 위해 비교된다. 특정 바람직한 구현예에서, 대상체에서 마커의 치료전 수준은 본 발명에 따른 치료를 시작하기 전에 결정된 다음; 마커의 이 치료전 수준은 치료의 효능을 결정하기 위해 치료 시작 후 대상체에서 마커의 수준과 비교될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 대상체 내에서 표적화된 게놈 변형에 영향을 미치기 위해, 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에게 투여된다. 일 구현예에서, 게놈 변형은 본원의 실시예 3에 기재된 바와 같으며 유전 질환은 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 수득되고 본원에 제공된 약제학적 조성물 중 임의의 것과 접촉된다. 일부 구현예에서, 대상체로부터 제거되고 약제학적 조성물과 생체외에서 접촉된 세포는 임의적으로 원하는 게놈 변형이 세포에서 영향을 미쳤거나 또는 검출된 후에 대상체에 재도입된다. 뉴클레아제를 포함하는 약제학적 조성물을 전달하는 방법은 알려져 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호에 기재되어 있으며, 모든 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공된 약제학적 조성물의 설명은 주로 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 예를 들어, 수의학 용도를 위해 모든 종류의 동물 또는 유기체에게 투여하기에 적합함이 당업자에 의해 이해될 것이다.
다양한 동물에 대한 투여에 적합한 조성물을 제공하기 위해 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되어 있고, 통상의 숙련된 수의학 약리학자는 단지 평범한 실험으로 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 포유동물, 가축, 애완동물, 및 상업적으로 관련된 포유동물 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 및/또는 래트; 및/또는 상업적으로 관련된 조류를 포함한 조류 예컨대 닭, 오리, 거위, 및/또는 칠면조를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에서 알려지거나 또는 이후 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분(들)을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합시키는 단계, 및 이어서 필요하고/하거나 바람직한 경우, 제품을 원하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 성형 및/또는 패키징하는 단계를 포함한다. 약제학적 제형은 추가적으로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있으며, 이는 본원에 사용된 바와 같이, 원하는 특정 투여 형태에 맞는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장성제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함한다. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro(Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; 전문이 본원에 참조로 포함)는 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용되는 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 알려진 기술을 개시한다. 또한 뉴클레아제를 포함하는 약제학적 조성물을 생성하기 위한 추가적인 적합한 방법, 시약, 부형제 및 용매에 대해, PCT 출원 PCT/US2010/055131(2010년 11월 2일 출원된 공개 번호 WO2011/053982 A8)을 참조하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
임의의 통상적인 부형제 매질이 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 또는 달리 약제학적 조성물의 임의의 다른 구성성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용하는 것과 같이 재료 또는 이의 유도체와 호환되지 않는 경우를 제외하고, 이의 사용이 본 개시내용의 범위 내에 있도록 고려된다.
상기 기재된 바와 같이, 조성물은 유효량으로 투여될 수 있다. 유효량은 투여 모드, 치료되는 특정 병태, 및 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 또한 병태의 단계, 대상체의 연령 및 신체적 상태, 병행 요법이 존재하는 경우 이의 특성, 및 의사에게 잘 알려진 유사 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료 적용의 경우, 의학적으로 바람직한 결과를 달성하기에 충분한 양이다.
키트
본 개시내용의 다양한 측면은 염기 편집기 시스템을 포함하는 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 키트는 핵염기 편집기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함한다. 융합 단백질은 데아미나제(예를 들어, 아데닌 데아미나제) 및 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 관심 핵산 분자를 표적화할 수 있는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 적어도 하나의 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 염기 편집기 생성물, 시스템 및 방법에 의해 편집된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 중 임의의 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 이식 또는 생착을 위해 대상체를 조건화하는 데 유용하다.
키트는 일부 구현예에서, 질환, 병리, 장애, 또는 병태와 연관될 수 있는 하나 이상의 돌연변이를 편집하기 위한 키트를 사용하는 설명서를 제공한다. 설명서는 일반적으로 핵산 분자를 편집하기 위한 키트의 사용에 관한 정보를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 설명서는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 예방책; 경고; 임상 연구; 및/또는 참고문헌. 설명서는 (존재하는 경우) 용기 상에 직접 인쇄되거나, 또는 용기에 부착된 라벨로, 또는 용기 내에 또는 용기와 함께 공급되는 별도의 시트, 팜플렛, 카드, 또는 폴더로 인쇄될 수 있다. 추가 구현예에서, 키트는 적합한 작동 매개변수에 대한 라벨 또는 별도의 삽입물(패키지 삽입물) 형태의 설명서를 포함할 수 있다. 또한 또 다른 구현예에서, 키트는 검출, 보정, 또는 정규화를 위한 표준(들)으로 사용될 적절한 양성 및 음성 대조군 또는 대조군 샘플이 있는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 (멸균) 포스페이트-완충 염수, 링거 용액, 또는 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서와 함께 패키지 삽입물을 포함하는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적 목적을 제공하며 본원에 제공된 청구범위의 범위를 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
1.
염기 편집기에서 PAM
변이체
검증
신규 CRISPR 시스템 및 PAM 변이체는 염기 편집기(예를 들어, 표 14 및 18에 나열된 ABE9)가 관심 폴리뉴클레오티드에 존재하는 돌연변이를 편집하는 것을 가능하게 한다. 여러 신규 PAM 변이체를 평가하고 검증하였다. PAM 평가 및 염기 편집기의 세부사항은 예를 들어, 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344(WO2017/070632)에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)를 참조하며, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
2.
ABE8
또는
ABE9를
사용한 유전자 편집
ABE9 염기 편집기를 생성하기 위해, ABE8.20의 다수의 위치에서 모든 가능한 아미노산 치환을 포함하는 주형으로서 ABE8.20(이종이량체_(WT)+ (TadA*7.10 + Q154R)으로 시작하는 합성 라이브러리를 생성하였다. 선택을 위해, 4 개의 부위를 A에서 G로의 염기 편집을 위해 한 번에 표적화하여, 4 가지 상이한 선택 조건 하에 생존력 및 성장을 허용하였다. 표 14에 기재된 염기 편집기를 하기 제공된 gRNA와 함께 사용하여 인간 HEK293 세포에서 변경을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 편집하였다. 예시적인 표적 서열은 다음과 같다:
HRB03
GCTGGCAGCAAGGGCGGCGCTGG
HRB04
GCAGCCGCACCCTCAAGCAACGG
HRB08
GTAGCTGACTCACTGCTAGCTGG
HRB12
GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGG
ng-424
GATGAGAAGGAGAAGTTCTTAGG
하기 중에서 선택된 가이드 RNA를 사용하여 관심 폴리뉴클레오티드를 표적화하였다:
HRB03
5'-GCUGGCAGCAAGGGCGGCGCUGG-3'
HRB04
GCAGCCGCACCCUCAAGCAACGG
HRB08
GUAGCUGACUCACUGCUAGCUGG
HRB12
GAGUCCGAGCAGAAGAAGAAGGG
ng-424
GAUGAGAAGGAGAAGUUCUUAGG
상기 참조된 gRNA와의 복합체에서 아데노신 염기 편집기의 A>G 편집 활성을 테스트하였다. ABE9.1-ABE9.58(pNMG-B531-634)의 활성의 A>G 편집 활성은 도 1 및 도 2에 제시되어 있다. 각각의 ABE9 편집기에서 ABE7*10과 관련한 변경은 표 14 및 표 18에 제공되어 있다. ABE8.32, ABE8.33, ABE8.39, 및 ABE8.40의 활성을 또한 테스트하였다. 단량체인 ABE8.32는 다음 변경을 포함하였다: V82S + Q154R + Y147R + Y123H(pNMG-B433). 단량체인 ABE8.33(pNMG-B434)은 다음 변경을 포함하였고: Q154R + Y147R + Y123H + I76Y V82S, 이량체인 ABE8.39(pNMG-B440)는 다음 변경을 포함하였으며: V82S + Q154R + Y147R + Y123H, 이량체인 ABE8.40(pNMG-B441)은 다음 변경을 포함하였다: Q154R + Y147R + Y123H + I76Y + V82S. 이 테스트 결과는 도 1 및 2에 정량화되어 있으며, 이는 플라스미드 번호에 의해 아데노신 염기 편집기를 지칭한다.
실시예
3.
ABE9에
의한 알파-1-항-트립신 결핍증(
A1AD
) 돌연변이의 교정
알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)은 간(간세포)에 영향을 미치는 질환이며 일반적으로 상염색체 공동-우성 방식으로 유전된다. 알파-1 항트립신(A1AT)은 인간 염색체 14 상에서 SERPINA1 유전자에 의해 암호화된 당단백질 프로테아제 억제제이다. A1AT는 주로 간에서 합성되고 혈류로 분비되며; 건강한 성인에서 A1AT의 전형적인 혈청 농도는 1.5-3.0 g/L(20-52 μmol/L)이다. 혈액으로부터, A1AT는 폐 간질 및 폐포 내막액으로 확산되며, 여기서 호중구 엘라스타제를 비활성화하고 폐 조직을 프로테아제-매개 손상으로부터 보호한다.
SERPINA1 유전자의 100 개 초과의 유전적 변이체가 기재되었지만, 모두가 질환과 연관된 것은 아니다. 이러한 유전적 변이체의 알파벳 지정은 겔 전기영동에서의 이동 속도에 기반한다. 가장 흔한 변이체는 M(중간 이동성) 대립유전자(PiM)이고, 2 개의 가장 빈번한 결핍 대립유전자는 PiS 및 PiZ이다(후자는 가장 느린 이동 속도를 가짐). 측정가능한 혈청 단백질을 생산하지 않는 여러 돌연변이가 기재되었으며; 이들은 "null" 대립유전자로 지칭된다. 가장 흔한 유전자형은 MM이며, 이는 알파-1 항트립신의 정상 혈청 수준을 생성한다. 중증 결핍이 있는 대부분의 개체는 Z 대립유전자에 대해 동형접합성이다(ZZ). 미국에서 60,000 명 초과의 A1AD 환자는 중증 ZZ 표현형을 갖는다. Z 단백질은 간세포의 소포체에서 생성되는 동안 잘못 접히고 중합되며; 이러한 비정상적인 중합체는 간에 포획되어, A1AT의 혈청 수준을 크게 감소시킨다. 결핍되거나 또는 불안정한 A1AT 생성은 A1AD를 앓고 있는 환자에서 간 및/또는 폐 병리를 유발한다. A1AD 환자에서 볼 수 있는 간 질환은 간 세포에 비정상적인 A1AT 단백질의 축적 및 자가포식, 소포체 스트레스 반응 및 세포자멸사를 포함한 세포 반응 결과에 의해 유발된다. A1AT의 순환 수준 감소는 폐에서 호중구 엘라스타제 활성을 증가시킨다. 프로테아제 및 항프로테아제의 불균형은 이 병리와 연관된 폐 질환을 초래한다.
A1AD는 환자가 간세포 암종에 취약하게 만들 수 있다. 동형접합성 ZZ 유전자형은 간 질환이 발생하는 데 필요하지만, 이형접합성 Z 돌연변이는 C형 간염 감염 및 낭포성 섬유증 간 질환과 같은 보다 중증 간 질환의 더 높은 위험을 부여함으로써 다른 질환에 대한 유전적 변형자로서 작용할 수 있다.
A1AD의 2 가지 가장 흔한 임상 변이체는 E264V(PiS) 및 E342K(PiZ) 대립유전자이다. 임상 단일 뉴클레오티드 변이체 E342K(PiZ)는 A1AT 단백질을 불안정하게 하고/하거나 불활성화시키고, 결과적으로, 간 및 폐 독성을 유발한다. 유전은 상염색체 공동-우성이다. A1AD 환자의 절반 초과가 돌연변이 E342K의 적어도 하나의 카피를 보유한다
본원에서, 예를 들어, 표 14 및 18, 및 도 도 3a-3c에 기재된 바와 같은 ABE9를 포함하는 염기 편집기 및 염기 편집기 시스템은 E342K(PiZ 대립유전자)와 같은 SERPINA1 유전자에서 병원성 돌연변이를 교정하는데 특이 유용하다. 특정 예에서, 위치 7의 A는 G로 편집되어 PiZ 대립유전자를 야생형 대립유전자로 복원한다. (도 4a).
이 실시예에서, 예를 들어, 도 3a-3c 및 4b에 제시된 바와 같은 선택된 ABE9 작제물을 E342K 돌연변이를 포함하는 A1AT를 발현하는 HEK293 세포(HEK293T-E342K)에서 염기 편집 활성에 대해 평가하였다. 실험에서, HEK293T-E342K 세포를 gRNA 플라스미드 250 ng 및 TadA 데아미나제 변이체, 예를 들어, TadA*9를 암호화하는 플라스미드 750 ng을 사용하여 3 μl:1 μg 비로 HEK293 세포인 Mirus TransIT293에 대해 최적화된 고효율, 저독성 DNA 형질감염 시약으로 일시적으로 형질감염시켰다(도 4b). HEK293T-E342K 세포를 2.5μg ABE9 mRNA 및 20 개 뉴클레오티드(nt) 길이를 갖는 1000ng gRNA [191]를 사용하여 전기천공(Neon 전기천공)의해 형질감염시켰다. spCas9 염기 편집기에 대한 sgRNA로서 제공된 gRNA 백본(스캐폴드)은 하기와 같다:
5'- GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3'. spCas9 염기 편집기에 대한 sgRNA로서 제공된 또 다른 gRNA 스캐폴드는 다음과 같다: 5'-GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGGACCGAGU CGGUGCUUUU-3'. 일 구현예에서, 상기 gRNA 스캐폴드의 말단 우라실(U)은 임의적으로 "mU*mU*mU*U"를 포함할 수 있으며, 이는 2'OMe를 나타내고 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.
기재된 방법에 유용한 가이드 RNA는 하기를 포함한다:
플라스미드 형질감염(4 일 후) 및 RNA 전기천공(2 일 후) 후, 게놈 DNA를 0.05% SDS, 25 μg/ml 프로테이나제 K, 10 mM Tris pH 8.0의 단순 용해 완충액으로 추출한 다음, 85℃에서 열 불활성화시켰다. 게놈 부위를 PCR 증폭시키고 MiSeq에서 서열분석하였다. 결과를 이전에 기재된 바와 같이 분석하고 각 위치에서 염기 빈도 및 퍼센트 indel에 대해 당업자에 의해 실행하였다. indel 계산의 세부사항은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381 및 PCT/US2016/058344에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature, 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
ABE9 염기 편집기(도 3a-3c 및 4b)의 염기 편집 활성을 19- 또는 20-뉴클레오티드 길이의 가이드 RNA를 사용하여 HEK293T-E342K 세포에서 검정하였다. gRNA를 상이한 제조업체, 즉, 독일 소재 AxoLabs 및 캘리포니아주 먼로 파크 소재 Synthego에 의해 생산하였다. 도 4c 및 4d에 제시된 바와 같이, V82T 돌연변이를 포함하는 TadA 데아미나제 변이체를 포함하는 염기 편집기는 대조군 편집기(AVT686)에 비해 높은 수준의 효율 및 특이성을 나타내었으며 지속된 편집기 조작을 통해 1차 PiZZ 섬유모세포에서 개선된 핵염기 교정 속도를 생성하는 것과 관련된 데이터 및 결과를 제공한다. 도 5a는 도 4b에 제시된 것과 같은 TadA* 데아미나제 변이체, 특히, LNP에 의해 전달된 변이체 8 및 9를 함유하는 염기 편집기를 사용하여 총 간 gDNA에서 표적 대립유전자의 특이적 염기 편집 대 방관자 편집을 나타내는 그래프를 제시한다. 도 5b는 도 4b에 제시된 것과 TadA* 데아미나제 변이체, 특히, 변이체 8 및 9를 함유하는 염기 편집기를 사용하여 NSG-PiZ 유전자이식 마우스에서 지질 나노입자(LNP)-매개 전달 및 염기 편집에 의해 생성된 혈청 A1AT의 증가와 관련된 데이터 및 결과의 그래프를 제시한다.
다양한 실험에서, 본원에 기재된 바와 같은 특정 돌연변이를 포함하는 TadA*9 아데노신 데아미나제 변이체 구성성분, 및 5'-NGC-3' PAM에 결합하는 Cas9 단백질(예를 들어, SpCas9)의 능력을 부여하는 아미노산 돌연변이를 포함하는 Cas9 구성성분, 예를 들어, SpCas9 변이체 구성성분을 포함하는 ABE9 염기 편집기를 암호화하는 플라스미드(예를 들어, mRNA 플라스미드)는 도 3a- 3c 에 제시된 바와 같이 사용되었으며 다음과 같다:
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+A109S를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+T111R을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+D119N을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+H122N을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147d+Q154S를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+F149Y를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+T166I를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9; 및
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+D167N을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9.
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+L36H+N157K를 갖는 모노 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147D+Q154S+F149Y+D167N+L36H+N157K를 갖는 모노 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L,R753G, R1114G, MQKFRAER을 갖는 SpCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147D+Q154S+F149Y+D167N+L36H+N157K+V106W를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G, MQKFRAER을 갖는 SpCas9
모노 ABE9e: 돌연변이 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N을 갖는 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L,R753G, R1114G, MQKFRAER을 갖는 SpCas9; 및
모노 ABE9e: 돌연변이 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N + V106W를 갖는 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L,R753G, R1114G, MQKFRAER을 갖는 SpCas9.
ABE9 염기 편집기는 또한 표적내 아데닌(A) 염기 대 방관자 A에 대한 정확한 편집(즉, AㆍT에서 GㆍC로의 전환)을 제공하였고 A1AD 표적 부위에서 매우 효율적인 치료적으로 관련된 편집을 가능하게 한다. 예를 들어, ABE9를 사용하여 E342K의 염기 편집을 통한 정확한 돌연변이 교정은 순환 AAT 수준을 회복하고(예를 들어, 5-15 μM 초과의 수준으로) A1AD를 앓고 있는 대상체에서 폐 및 간 기능 둘 다를 개선하는 능력을 제공한다. 구현예에서, ABE9 염기 편집기는 예를 들어, NSG-PiZ 유전자이식 마우스에서 혈청 A1AT 염기 편집을 증가시키기 위해 세포 내로 도입되거나 또는 지질 나노입자(LNP)-매개 전달에 의해 의해 투여될 수 있다.
실시예 4. 재료 및 방법
본원에 기재된 실시예에 제공된 결과는 하기 재료 및 방법을 사용하여 수득하였다.
본 발명에 유용한 ABE는 ABE7*10에 비해 하기 아미노산 변경(상기 기재된 바와 같은 ABE7*10의 아미노산 서열) 중 하나 이상을 갖는다: R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, V82T, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K.
본 발명에 유용한 아데노신 데아미나제 도메인은 하기 변경의 조합을 포함한다: V82S + Q154R + Y147R; V82S + Q154R + Y123H; V82S + Q154R + Y147R+ Y123H; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y+ V82S; V82S + I76Y; V82S + Y147R; V82S + Y147R + Y123H; V82S + Q154R + Y123H; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y; V82S + Y147R; V82S + Y147R + Y123H; V82S + Q154R + Y123H; V82S + Q154R + Y147R; V82S + Q154R + Y147R; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y + V82S; I76Y_V82S_Y123H_Y147R_Q154R; Y147R + Q154R + H123H; 및 V82S + Q154R.
본 발명에 유용한 다른 아데노신 데아미나제 도메인은 하기 변경의 조합을 포함한다: E25F + V82S + Y123H, T133K + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R; Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R; L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R; P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K; N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; 및 M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R.
본 발명에 유용한 다른 아데노신 데아미나제는 하기 변경의 조합을 포함한다: Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 V82S + Q154R; N72K_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Q71M_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N72K_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Q71M_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; 및 M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 단량체로서 발현된다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 이종이량체로서 발현된다.
하기 표는 본 발명의 방법에 유용한 벡터의 설명을 제공한다.
표 18
표 18에서, ABE 7*10 참조 서열에 비해 변경을 갖는 신규 ABE9 핵염기 편집기가 제시되어 있다. 표 18에 사용된 바와 같은 용어 "단량체"는 표 18에 기재된 변경을 포함하는 TadA*7.10의 단량체성 형태를 지칭한다. 표 18에 사용된 바와 같은 용어 "이종이량체"는 표 18에 기재된 병경을 포함하는 TadA*7.10에 융합된 명시된 야생형 이. 콜라이 TadA를 지칭한다.
클로닝
.
사용된 표적 폴리뉴클레오티드 및 gRNA 및 프라이머의 DNA 서열은 본원에 기재되어 있다. gRNA의 경우, 다음 스캐폴드 서열이 제시된다: GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU. gRNA는 본원에 기재되거나 또는 당업자의 지식에 기반하여 결정되고 당업자에게 이해되는 바와 같은 병원성 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대한 스캐폴드 서열 및 스페이서 서열(표적 서열)을 포함한다.
염기 편집 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Komor, A.C., 등, “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, “Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage”Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., 등, “base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity”Science Advances 3:eaao4774 (2017), 및 Rees, H.A., 등, “editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.” Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1 참조.
PCR은 VeraSeq 울트라 DNA 폴리머라제(Enzymatics), 또는 Q5 핫 스타트 고충실도 DNA 폴리머라제(New England Biolabs)를 사용하여 수행한다. 염기 편집기(BE) 플라스미드는 USER 클로닝(New England Biolabs)을 사용하여 구축하였다. 데아미나제 유전자는 gBlocks 유전자 단편(Integrated DNA Technologies)으로 합성하였다. 본 발명에 유용한 Cas9 유전자는 하기 나열되어 있고 본원에 기재되어 있다. Cas9 유전자는 이전에 보고된 플라스미드로부터 수득하였다. 데아미나제 및 융합 유전자는 상기 표 17에 기재된 벡터 내로 클로닝하였다(이. 콜라이 코돈-최적화). sgRNA 발현 플라스미드는 부위-지정 돌연변이생성을 사용하여 구축한다.
간단히 말해서, 본 발명에 유용한 프라이머를 제조업체의 지침에 따라 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(New England Biolabs)를 사용하여 5' 인산화한다. 다음으로, PCR을 인산화된 프라이머 및 제조업체의 지침에 따라 주형으로서 관심 유전자를 암호화하는 플라스미드와 함께 Q5 핫 스타트 고충실도 폴리머라제(New England Biolabs)를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 37℃에서 1 시간 동안 DpnI(20 U, New England Biolabs)과 함께 인큐베이션하고, QIAprep 스핀 칼럼(Qiagen)에서 정제하고, 제조업체의 지침에 따라 QuickLigase(New England Biolabs)를 사용하여 결찰시켰다. DNA 벡터 증폭을 Mach1 적격 세포(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 수행하였다.
ssDNA에
대한
시험관내
데아미나제
검정.
모든 ssDNA 기질의 서열은 표준 방법을 사용하여 수득된다. 모든 Cy3-표지된 기질은 Integrated DNA Technologies(IDT)로부터 수득된다. 데아미나제를 1 μg의 플라스미드를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 TNT T7 신속 결합 전사/번역 키트(Promega)를 사용하여 시험관 내에서 발현한다. 단백질 발현 후, 5 μl의 용해물을 CutSmart 완충액(New England Biolabs)(50 mM 칼륨 아세테이트, 29 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 100 μg ml-1 BSA, pH 7.9) 중 35 μl의 ssDNA(1.8 μM) 및 USER 효소(1 단위)와 조합하고 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한다. 절단된 U-함유 기질을 10% TBE-우레아 겔(Bio-Rad) 상에서 전장 비변형된 기질로부터 분해한다.
염기 편집기의 발현 및
정제.
이. 콜라이 BL21 STAR(DE3)-적격 세포(ThermoFisher Scientific)를 플라스미드(예를 들어 표 17에 기재된 염기 편집기를 암호화하는 플라스미드)로 형질전환한다. 생성된 발현 균주를 100 μg ml-1의 카나마이신을 함유하는 Luria-Bertani(LB) 브로쓰에서 37℃에서 밤새 성장시킨다. 세포를 동일한 성장 배지로 1:100으로 희석하고 OD600 = ∼0.6까지 37℃에서 성장시킨다. 배양물을 2 시간의 기간에 걸쳐 4℃로 냉각하고, 이소프로필-β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 0.5 mM로 첨가하여 단백질 발현을 유도한다. ∼16 시간 후, 세포를 4,000g에서 원심분리하여 수집하고 용해 완충액(50 mM 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄 (Tris)- HCl(pH 7.5), 1 M NaCl, 20% 글리세롤, 10 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP, Soltec Ventures))에 재현탁한다. 세포를 초음파처리(6 W 출력으로 총 8 분 동안 20 초 펄스-온, 20 초 펄스-오프)에 의해 용해하고 25,000g에서 15 분 동안 원심분리한 후 용해물 상청액을 단리한다. 용해물을 His-Pur 니켈-니트릴로아세트산(nickel-NTA) 수지(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 4℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 His-태그된 융합 단백질을 포획한다. 수지를 칼럼으로 옮기고 40 ml의 용해 완충액으로 세척한다. His-태그된 융합 단백질을 285 mM 이미다졸이 보충된 용해 완충액에 용리하고, 한외여과(Amicon-Millipore, 100-kDa 분자량 컷오프)에 의해 1 ml 총 부피까지 농축한다. 단백질을 50 mM 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄(Tris)-HCl(pH 7.0), 0.1 M NaCl, 20% 글리세롤, 10 mM TCEP를 함유하는 저염 정제 완충액에서 20 ml로 희석하고 SP 세파로즈 빠른 유동 수지(GE Life Sciences) 위에 로딩한다. 수지를 40 ml의 이 저염 완충액으로 세척하고, 단백질을 50 mM 트리스(하이드록시메틸)- 아미노메탄(Tris)-HCl(pH 7.0), 0.5 M NaCl, 20% 글리세롤, 10 mM TCEP를 함유하는 5 ml의 활성 완충액으로 용리한다. 용리된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 정량화한다.
sgRNA의
시험관내
전사.
T7 프로모터 이어서 20-bp sgRNA 표적 서열을 함유하는 선형 DNA 단편을 제조업체의 지침에 따라 TranscriptAid T7 고수율 전사 키트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 시험관 내에서 전사한다. sgRNA 생성물을 제조업체의 지침에 따라 MEGAclear 키트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 정제하고 UV 흡광도에 의해 정량화한다.
Cy3
-
접합된
dsDNA
기질의 제조.
전형적으로, 비표지된 서열 가닥(예를 들어 80-nt 비표지된 가닥의 서열)을 IDT로부터 PAGE-정제된 올리고뉴클레오티드로 주문한다. 각각 80-nt 기질의 3' 단부에 상보적인 25-nt Cy3-표지된 프라이머를 IDT로부터 HPLC-정제된 올리고뉴클레오티드로 주문한다. Cy3-표지된 dsDNA 기질을 생성하기 위해, 80-nt 가닥(5 μl의 100 μM 용액)을 dNTP(0.75 μl의 100 mM 용액)를 함유하는 NEBuffer 2(38.25 μl의 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7.9 용액, New England Biolabs) 중 Cy3-표지된 프라이머(5 μl의 100 μM 용액)와 조합하고 95℃에서 5 분 동안 가열한 후, 초 당 0.1℃의 속도로 45℃까지 점진적으로 냉각시킨다. 이 어닐링 기간 후에, Klenow exo-(5 U, New England Biolabs)를 첨가하고 반응물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 용액을 완충액 PB(250 μl, Qiagen) 및 이소프로판올(50 μl)로 희석하고 QIAprep 스핀 칼럼(Qiagen)에서 50 μl의 Tris 완충액으로 용리하여 정제한다.
dsDNA에 대한 데아미나제 검정.
정제된 융합 단백질(활성 완충액 중 1.9 μM 20 μl)을 1 당량의 적절한 sgRNA와 조합하고 주위 온도에서 5 분 동안 인큐베이션한다. Cy3-표지된 dsDNA 기질을 125 nM의 최종 농도로 첨가하고 생성된 용액을 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한다. 완충액 PB(100 μl, Qiagen) 및 이소프로판올(25 μl)을 첨가하여 융합물로부터 dsDNA를 분리하고 EconoSpin 마이크로 스핀 칼럼(Epoch Life Science)에서 20 μl의 CutSmart 완충액(New England Biolabs)으로 용리하여 정제한다. USER 효소(1 U, New England Biolabs)를 정제된, 편집된 dsDNA에 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. Cy3-표지된 가닥은 5 μl의 반응 용액과 15 μl의 DMSO-기반 로딩 완충액(5 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 12.5% 글리세롤, 0.02% 브로모페놀 블루, 0.02% 자일렌 시안, 80% DMSO)을 조합함으로써 보체로부터 완전히 변성된다. 전장 C-함유 기질을 10% TBE-우레아 겔(Bio-Rad) 상에서 임의의 절단된, U-함유 편집된 기질로부터 분리하고 GE Amersham Typhoon 이미저에서 이미지화한다.
고처리량
서열분석을 위한
시험관내
-편집된
dsDNA의
제조.
올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 수득된다. 상보적 서열을 Tris 완충액에서 조합하고(5 μl의 100 μM 용액) 95℃에서 5 분 동안 가열하여 어닐링한 후, 초 당 0.1℃의 속도로 45℃까지 점진적으로 냉각시켜 60-bp dsDNA 기질을 생성한다. 정제된 융합 단백질(활성 완충액 중 1.9 μM 20 μl)을 1 당량의 적절한 sgRNA와 조합하고 주위 온도에서 5 분 동안 인큐베이션한다. 60-mer dsDNA 기질을 125 nM의 최종 농도로 첨가하고, 생성된 용액을 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한다. dsDNA를 완충액 PB(100 μl, Qiagen) 및 이소프로판올(25 μl)을 첨가하여 융합물로부터 분리하고EconoSpin 마이크로 스핀 칼럼(Epoch Life Science)에서 20 μl의 Tris 완충액으로 용리하여 정제한다. 생성된 편집된 DNA(1 μl가 주형으로 사용됨)를 13 주기의 증폭으로 고처리량 서열분석 프라이머 쌍 및 제조업체의 지침에 따른 VeraSeq Ultra(Enzymatics)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. PCR 반응 생성물을 RapidTips(Diffinity Genomics)을 사용하여 정제하고, 정제된 DNA를 서열분석 어댑터를 함유하는 프라이머로 PCR에 의해 증폭시키고, 정제하고, 이전에 기재된 바와 같이 MiSeq 고처리량 DNA 서열분석기(Illumina)에서 서열분석한다.
세포 배양.
HEK293T(ATCC CRL-3216) 및 U2OS(ATCC HTB-96) 발현 표적 폴리뉴클레오티드를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 듈베코의 변형된 이글 배지 플러스 GlutaMax(ThermoFisher)에서 37℃에서 5% CO2와 함께 유지한다. HCC1954 세포(ATCC CRL-2338)를 상기 기재된 바와 같이 보충된 RPMI-1640 배지(ThermoFisher Scientific)에서 유지한다. 불멸화 세포(Taconic Biosciences)를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS) 및 200 μg ml-1 제네티신(Geneticin)(ThermoFisher Scientific)이 보충된 듈베코의 변형된 이글 배지 플러스 GlutaMax(ThermoFisher Scientific)에서 배양한다.
형질감염.
HEK293T 세포를 48-웰 콜라겐-코팅된 BioCoat 플레이트(Corning)에 시딩하고 대략 85% 합류로 형질감염시킨다. 간단히 말해서, 750 ng의 BE 및 250 ng의 sgRNA 발현 플라스미드를 제조업체의 프로토콜에 따라 웰 당 1.5 μl의 Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 형질감염시켰다. HEK293T 세포를 제조업체의 지침에 따라 적절한 Amaxa Nucleofector II 프로그램(HEK293T 세포에 대한 프로그램 Q-001을 사용하는 V 키트)을 사용하여 형질감염시킨다.
게놈 DNA 샘플의
고처리량
DNA 서열분석.
형질감염된 세포를 3 일 후에 수확하고 게놈 DNA를 제조업체의 지침에 따라 Agencourt DNAdvance 게놈 DNA 단리 키트(Beckman Coulter)를 사용하여 단리한다. 관심 표적내 및 표적외 게놈 영역을 고처리량 서열분석 프라이머 쌍으로 플랭킹하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 증폭을 주형으로서 5 ng의 게놈 DNA를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 Phusion 고충실도 DNA 폴리머라제(ThermoFisher)로 수행한다. 반응이 선형 증폭 범위에서 중단되도록 주기 수를 각 프라이머 쌍에 대해 별도로 결정하였다. PCR 생성물을 RapidTips(Diffinity Genomics)을 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 서열분석 어댑터를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성물을 Quant-iT PicoGreen dsDNA 검정 키트(ThermoFisher) 및 KAPA 라이브러리 정량화 키트-Illumina(KAPA Biosystems)를 사용하여 겔 정제하고 정량화하였다. 샘플을 이전에 기재된 바와 같이 Illumina MiSeq에서 서열분석하였다(Pattanayak, Nature Biotechnol. 31, 839-843 (2013)).
데이터 분석.
서열분석 판독을 MiSeq Reporter(Illumina)를 사용하여 자동으로 역다중화하고, 개별 FASTQ 파일을 맞춤형 Matlab으로 분석하였다. 각각의 판독을 Smith-Waterman 알고리즘을 사용하여 적절한 참조 서열에 대해 쌍으로 정렬하였다. 31 미만의 Q-점수를 갖는 염기 호출을 N으로 대체하여 뉴클레오티드 빈도 계산에서 제외하였다. 이 처리는 대략 1,000분의 1의 예상된 MiSeq 염기-호출 오류율을 산출한다. 판독 및 참조 서열이 갭을 함유하지 않는 정렬된 서열은 염기 빈도를 각각의 유전자좌에 대해 표로 만들 수 있는 정렬 표에 저장하였다. Indel 빈도를 이전에 기재된 기준을 사용하여 맞춤형 Matlab 스크립트로 정량화하였다(Zuris, 등, Nature Biotechnol. 33, 73-80 (2015). 서열분석 판독을 indel이 발생할 수 있는 창의 양면을 플랭킹하는 2 개의 10-bp 서열에 정확히 일치하는지에 대해 스캐닝하였다. 정확한 일치가 위치하지 않는 경우, 판독을 분석에서 제외하였다. 이 indel 창의 길이가 참조 서열과 정확히 일치하는 경우 판독이 indel을 함유하지 않는 것으로 분류하였다. indel 창이 참조 서열보다 2 개 이상의 염기가 더 길거나 또는 더 짧은 경우, 서열분석 판독이 각각 삽입 또는 결실인 것으로 분류하였다.
다른
구현예
전술된 설명으로부터, 다양한 용법 및 조건으로 조정되도록 본원에 기재된 발명에 변경 및 변형이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 구현예는 또한 하기 청구범위의 범위 내에 있다.
본원의 변수의 임의의 정의에서 요소 목록의 인용은 해당 변수를 나열된 요소의 임의의 단일 요소로 또는 조합(또는 하위조합)하여 정의하는 것을 포함한다. 본원에서 구현예의 언급은 해당 구현예를 임의의 단일 구현예로 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 부분과 조합하여 포함한다.
참조로 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 의도되는 것처럼 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 달리 임의로 표시되지 않는 한, 본 명세서에 언급된 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> BEAM THERAPEUTICS INC.
<120> NOVEL NUCLEOBASE EDITORS AND METHODS OF USING SAME
<130> 180802.043401/PCT
<140> PCT/US2020/049975
<141> 2020-09-09
<150> PCT/US2020/018195
<151> 2020-02-13
<150> 62/897,777
<151> 2019-09-09
<160> 187
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 167
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 2
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Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu
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1220 1225 1230
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Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 3
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Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
20
<210> 4
<211> 1052
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 4
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1 5 10 15
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Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile Gln
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg Glu
465 470 475 480
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Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu Asp
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<210> 5
<211> 103
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 5
accaucgaca agaaagggac ugaguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 6
<211> 102
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 6
ccaucgacaa gaaagggacu gaguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uu 102
<210> 7
<211> 101
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 7
caucgacaag aaagggacug aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60
ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu u 101
<210> 8
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 8
aucgacaaga aagggacuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 9
<211> 99
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 9
ucgacaagaa agggacugag uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99
<210> 10
<211> 98
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 10
cgacaagaaa gggacugagu uuuagagcua gaaauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg 60
uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugcuuuu 98
<210> 11
<211> 167
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
TadA sequence
<400> 11
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35 40 45
Ile Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
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Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
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Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
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Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
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Leu Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 12
<211> 167
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 12
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Thr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 13
<211> 160
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 13
Met Gly Ser His Met Thr Asn Asp Ile Tyr Phe Met Thr Leu Ala Ile
1 5 10 15
Glu Glu Ala Lys Lys Ala Ala Gln Leu Gly Glu Val Pro Ile Gly Ala
20 25 30
Ile Ile Thr Lys Asp Asp Glu Val Ile Ala Arg Ala His Asn Leu Arg
35 40 45
Glu Thr Leu Gln Gln Pro Thr Ala His Ala Glu His Ile Ala Ile Glu
50 55 60
Arg Ala Ala Lys Val Leu Gly Ser Trp Arg Leu Glu Gly Cys Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Thr Ile Val Met
85 90 95
Ser Arg Ile Pro Arg Val Val Tyr Gly Ala Asp Asp Pro Lys Gly Gly
100 105 110
Cys Ser Gly Ser Leu Met Asn Leu Leu Gln Gln Ser Asn Phe Asn His
115 120 125
Arg Ala Ile Val Asp Lys Gly Val Leu Lys Glu Ala Cys Ser Thr Leu
130 135 140
Leu Thr Thr Phe Phe Lys Asn Leu Arg Ala Asn Lys Lys Ser Thr Asn
145 150 155 160
<210> 14
<211> 161
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 14
Met Thr Gln Asp Glu Leu Tyr Met Lys Glu Ala Ile Lys Glu Ala Lys
1 5 10 15
Lys Ala Glu Glu Lys Gly Glu Val Pro Ile Gly Ala Val Leu Val Ile
20 25 30
Asn Gly Glu Ile Ile Ala Arg Ala His Asn Leu Arg Glu Thr Glu Gln
35 40 45
Arg Ser Ile Ala His Ala Glu Met Leu Val Ile Asp Glu Ala Cys Lys
50 55 60
Ala Leu Gly Thr Trp Arg Leu Glu Gly Ala Thr Leu Tyr Val Thr Leu
65 70 75 80
Glu Pro Cys Pro Met Cys Ala Gly Ala Val Val Leu Ser Arg Val Glu
85 90 95
Lys Val Val Phe Gly Ala Phe Asp Pro Lys Gly Gly Cys Ser Gly Thr
100 105 110
Leu Met Asn Leu Leu Gln Glu Glu Arg Phe Asn His Gln Ala Glu Val
115 120 125
Val Ser Gly Val Leu Glu Glu Glu Cys Gly Gly Met Leu Ser Ala Phe
130 135 140
Phe Arg Glu Leu Arg Lys Lys Lys Lys Ala Ala Arg Lys Asn Leu Ser
145 150 155 160
Glu
<210> 15
<211> 183
<212> PRT
<213> Salmonella typhimurium
<400> 15
Met Pro Pro Ala Phe Ile Thr Gly Val Thr Ser Leu Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Leu Asp His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg
20 25 30
Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val His Asn
35 40 45
His Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile Gly Arg His Asp
50 55 60
Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val
65 70 75 80
Leu Gln Asn Tyr Arg Leu Leu Asp Thr Thr Leu Tyr Val Thr Leu Glu
85 90 95
Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Val His Ser Arg Ile Gly Arg
100 105 110
Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu
115 120 125
Ile Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Ile
130 135 140
Glu Gly Val Leu Arg Asp Glu Cys Ala Thr Leu Leu Ser Asp Phe Phe
145 150 155 160
Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Leu Lys Lys Ala Asp Arg Ala
165 170 175
Glu Gly Ala Gly Pro Ala Val
180
<210> 16
<211> 164
<212> PRT
<213> Shewanella putrefaciens
<400> 16
Met Asp Glu Tyr Trp Met Gln Val Ala Met Gln Met Ala Glu Lys Ala
1 5 10 15
Glu Ala Ala Gly Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Lys Asp Gly
20 25 30
Gln Gln Ile Ala Thr Gly Tyr Asn Leu Ser Ile Ser Gln His Asp Pro
35 40 45
Thr Ala His Ala Glu Ile Leu Cys Leu Arg Ser Ala Gly Lys Lys Leu
50 55 60
Glu Asn Tyr Arg Leu Leu Asp Ala Thr Leu Tyr Ile Thr Leu Glu Pro
65 70 75 80
Cys Ala Met Cys Ala Gly Ala Met Val His Ser Arg Ile Ala Arg Val
85 90 95
Val Tyr Gly Ala Arg Asp Glu Lys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Val Val
100 105 110
Asn Leu Leu Gln His Pro Ala Phe Asn His Gln Val Glu Val Thr Ser
115 120 125
Gly Val Leu Ala Glu Ala Cys Ser Ala Gln Leu Ser Arg Phe Phe Lys
130 135 140
Arg Arg Arg Asp Glu Lys Lys Ala Leu Lys Leu Ala Gln Arg Ala Gln
145 150 155 160
Gln Gly Ile Glu
<210> 17
<211> 173
<212> PRT
<213> Haemophilus influenzae
<400> 17
Met Asp Ala Ala Lys Val Arg Ser Glu Phe Asp Glu Lys Met Met Arg
1 5 10 15
Tyr Ala Leu Glu Leu Ala Asp Lys Ala Glu Ala Leu Gly Glu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Ala Val Leu Val Asp Asp Ala Arg Asn Ile Ile Gly Glu Gly
35 40 45
Trp Asn Leu Ser Ile Val Gln Ser Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile
50 55 60
Ile Ala Leu Arg Asn Gly Ala Lys Asn Ile Gln Asn Tyr Arg Leu Leu
65 70 75 80
Asn Ser Thr Leu Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Thr Met Cys Ala Gly
85 90 95
Ala Ile Leu His Ser Arg Ile Lys Arg Leu Val Phe Gly Ala Ser Asp
100 105 110
Tyr Lys Thr Gly Ala Ile Gly Ser Arg Phe His Phe Phe Asp Asp Tyr
115 120 125
Lys Met Asn His Thr Leu Glu Ile Thr Ser Gly Val Leu Ala Glu Glu
130 135 140
Cys Ser Gln Lys Leu Ser Thr Phe Phe Gln Lys Arg Arg Glu Glu Lys
145 150 155 160
Lys Ile Glu Lys Ala Leu Leu Lys Ser Leu Ser Asp Lys
165 170
<210> 18
<211> 161
<212> PRT
<213> Caulobacter crescentus
<400> 18
Met Arg Thr Asp Glu Ser Glu Asp Gln Asp His Arg Met Met Arg Leu
1 5 10 15
Ala Leu Asp Ala Ala Arg Ala Ala Ala Glu Ala Gly Glu Thr Pro Val
20 25 30
Gly Ala Val Ile Leu Asp Pro Ser Thr Gly Glu Val Ile Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Asn Gly Pro Ile Ala Ala His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile
50 55 60
Ala Ala Met Arg Ala Ala Ala Ala Lys Leu Gly Asn Tyr Arg Leu Thr
65 70 75 80
Asp Leu Thr Leu Val Val Thr Leu Glu Pro Cys Ala Met Cys Ala Gly
85 90 95
Ala Ile Ser His Ala Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Asp Asp
100 105 110
Pro Lys Gly Gly Ala Val Val His Gly Pro Lys Phe Phe Ala Gln Pro
115 120 125
Thr Cys His Trp Arg Pro Glu Val Thr Gly Gly Val Leu Ala Asp Glu
130 135 140
Ser Ala Asp Leu Leu Arg Gly Phe Phe Arg Ala Arg Arg Lys Ala Lys
145 150 155 160
Ile
<210> 19
<211> 179
<212> PRT
<213> Geobacter sulfurreducens
<400> 19
Met Ser Ser Leu Lys Lys Thr Pro Ile Arg Asp Asp Ala Tyr Trp Met
1 5 10 15
Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ala Ala Lys Ala Ala Ala Arg Asp Glu Val
20 25 30
Pro Ile Gly Ala Val Ile Val Arg Asp Gly Ala Val Ile Gly Arg Gly
35 40 45
His Asn Leu Arg Glu Gly Ser Asn Asp Pro Ser Ala His Ala Glu Met
50 55 60
Ile Ala Ile Arg Gln Ala Ala Arg Arg Ser Ala Asn Trp Arg Leu Thr
65 70 75 80
Gly Ala Thr Leu Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Leu Met Cys Met Gly
85 90 95
Ala Ile Ile Leu Ala Arg Leu Glu Arg Val Val Phe Gly Cys Tyr Asp
100 105 110
Pro Lys Gly Gly Ala Ala Gly Ser Leu Tyr Asp Leu Ser Ala Asp Pro
115 120 125
Arg Leu Asn His Gln Val Arg Leu Ser Pro Gly Val Cys Gln Glu Glu
130 135 140
Cys Gly Thr Met Leu Ser Asp Phe Phe Arg Asp Leu Arg Arg Arg Lys
145 150 155 160
Lys Ala Lys Ala Thr Pro Ala Leu Phe Ile Asp Glu Arg Lys Val Pro
165 170 175
Pro Glu Pro
<210> 20
<211> 418
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala
20 25 30
Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn
35 40 45
Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln
50 55 60
Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser
65 70 75 80
Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr
85 90 95
His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro
100 105 110
Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn
115 120 125
Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu
130 135 140
Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys
145 150 155 160
Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu
165 170 175
Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys
180 185 190
Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu
195 200 205
Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val
210 215 220
Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val
225 230 235 240
Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys
245 250 255
Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala
260 265 270
Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu
275 280 285
Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp
290 295 300
Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr
305 310 315 320
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe
325 330 335
Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly
355 360 365
Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile
370 375 380
Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu
385 390 395 400
Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr
405 410 415
Gln Lys
<210> 21
<211> 8811
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 21
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 60
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 120
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 180
cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 240
atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 300
ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct 360
agagatccgc ggccgctaat acgactcact atagggagag ccgccaccat gaaacggaca 420
gccgacggaa gcgagttcga gtcaccaaag aagaagcgga aagtctctga agtcgagttt 480
agccacgagt attggatgag gcacgcactg accctggcaa agcgagcatg ggatgaaaga 540
gaagtccccg tgggcgccgt gctggtgcac aacaatagag tgatcggaga gggatggaac 600
aggccaatcg gccgccacga ccctaccgca cacgcagaga tcatggcact gaggcaggga 660
ggcctggtca tgcagaatta ccgcctgatc gatgccaccc tgtatgtgac actggagcca 720
tgcgtgatgt gcgcaggagc aatgatccac agcaggatcg gaagagtggt gttcggagca 780
cgggacgcca agaccggcgc agcaggctcc ctgatggatg tgctgcacca ccccggcatg 840
aaccaccggg tggagatcac agagggaatc ctggcagacg agtgcgccgc cctgctgagc 900
gatttcttta gaatgcggag acaggagatc aaggcccaga agaaggcaca gagctccacc 960
gactctggag gatctagcgg aggatcctct ggaagcgaga caccaggcac aagcgagtcc 1020
gccacaccag agagctccgg cggctcctcc ggaggatcct ctgaggtgga gttttcccac 1080
gagtactgga tgagacatgc cctgaccctg gccaagaggg cacgcgatga gagggaggtg 1140
cctgtgggag ccgtgctggt gctgaacaat agagtgatcg gcgagggctg gaacagagcc 1200
atcggcctgc acgacccaac agcccatgcc gaaattatgg ccctgagaca gggcggcctg 1260
gtcatgcaga actacagact gattgacgcc accctgtacg tgacattcga gccttgcgtg 1320
atgtgcgccg gcgccatgat ccactctagg atcggccgcg tggtgtttgg cgtgaggaac 1380
gcaaaaaccg gcgccgcagg ctccctgatg gacgtgctgc actaccccgg catgaatcac 1440
cgcgtcgaaa ttaccgaggg aatcctggca gatgaatgtg ccgccctgct gtgctatttc 1500
tttcggatgc ctagacaggt gttcaatgct cagaagaagg cccagagctc caccgactcc 1560
ggaggatcta gcggaggctc ctctggctct gagacacctg gcacaagcga gagcgcaaca 1620
cctgaaagca gcgggggcag cagcgggggg tcagacaaga agtacagcat cggcctggcc 1680
atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag 1740
aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg cacagcatca agaagaacct gatcggagcc 1800
ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga 1860
agatacacca gacggaagaa ccggatctgc tatctgcaag agatcttcag caacgagatg 1920
gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat 1980
aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag 2040
aagtacccca ccatctacca cctgagaaag aaactggtgg acagcaccga caaggccgac 2100
ctgcggctga tctatctggc cctggcccac atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc 2160
gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag 2220
acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc 2280
atcctgtctg ccagactgag caagagcaga cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc 2340
ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc 2400
aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc 2460
tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt 2520
ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc 2580
gagatcacca aggcccccct gagcgcctct atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag 2640
gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt 2700
ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc ggctacattg acggcggagc cagccaggaa 2760
gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc 2820
gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc 2880
ccccaccaga tccacctggg agagctgcac gccattctgc ggcggcagga agatttttac 2940
ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc gagaagatcc tgaccttccg catcccctac 3000
tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag 3060
gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc 3120
ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag 3180
cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg 3240
accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac 3300
ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag 3360
aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc 3420
ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag 3480
gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg ctgaccctga cactgtttga ggacagagag 3540
atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag 3600
ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc 3660
cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac 3720
agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac agcctgacct ttaaagagga catccagaaa 3780
gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc 3840
cccgccatta agaagggcat cctgcagaca gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg 3900
atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc 3960
cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag 4020
ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag 4080
ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg gatatgtacg tggaccagga actggacatc 4140
aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac 4200
tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg 4260
ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag aactactggc ggcagctgct gaacgccaag 4320
ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa 4380
ctggataagg ccggcttcat caagagacag ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac 4440
gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac actaagtacg acgagaatga caagctgatc 4500
cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc 4560
cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac 4620
gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac 4680
ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc 4740
aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc aacatcatga actttttcaa gaccgagatt 4800
accctggcca acggcgagat ccggaagcgg cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg 4860
gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc 4920
caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc 4980
ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc gccagaaaga aggactggga ccctaagaag 5040
tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa 5100
aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg aaagagctgc tggggatcac catcatggaa 5160
agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg 5220
aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg 5280
aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc 5340
aaatatgtga acttcctgta cctggccagc cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag 5400
gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa cagcacaagc actacctgga cgagatcatc 5460
gagcagatca gcgagttctc caagagagtg atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg 5520
ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag cccatcagag agcaggccga gaatatcatc 5580
cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc 5640
atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag 5700
agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc gacctgtctc agctgggagg tgactctggc 5760
ggctcaaaaa gaaccgccga cggcagcgaa ttcgagccca agaagaagag gaaagtctaa 5820
ccggtcatca tcaccatcac cattgagttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt 5880
ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 5940
ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 6000
gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 6060
atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct 6120
ggggctcgat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 6180
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 6240
gtaaagccta gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 6300
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 6360
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 6420
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 6480
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 6540
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 6600
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 6660
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 6720
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 6780
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 6840
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 6900
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 6960
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 7020
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 7080
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 7140
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac actcagtgga 7200
acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 7260
tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 7320
ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 7380
catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 7440
ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 7500
caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 7560
ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 7620
tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 7680
cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 7740
aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 7800
tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 7860
gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 7920
cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 7980
aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 8040
tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 8100
tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 8160
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atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 8280
taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtcgacgga tcgggagatc 8340
gatctcccga tcccctaggg tcgactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa 8400
gccagtatct gctccctgct tgtgtgttgg aggtcgctga gtagtgcgcg agcaaaattt 8460
aagctacaac aaggcaaggc ttgaccgaca attgcatgaa gaatctgctt agggttaggc 8520
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gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 8640
ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 8700
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 8760
gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat c 8811
<210> 22
<211> 1367
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 22
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Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
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Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
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Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
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Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Arg Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
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Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Arg Asn Gly Leu Phe Gly Asn
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Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
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Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
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Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
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355 360 365
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Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
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<210> 23
<211> 1129
<212> PRT
<213> Alicyclobacillus acidoterrestris
<400> 23
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260 265 270
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275 280 285
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Arg Val Trp Arg His Met Gly Lys Gln Val Arg Asp Trp Arg Lys Asp
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Val Arg Ser Gly Glu Arg Pro Lys Ile Arg Gly Tyr Ala Lys Asp Val
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Ser Arg Val Pro Leu Gln Asp Ser Ala Cys Glu Asn Thr Gly Asp
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Ile
<210> 24
<211> 1129
<212> PRT
<213> Alicyclobacillus acidiphilus
<400> 24
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Arg Arg Val Pro Ala Arg Cys Ala Arg Glu Gln Asn Pro Glu Pro Phe
915 920 925
Pro Trp Trp Leu Asn Lys Phe Val Ala Glu His Lys Leu Asp Gly Cys
930 935 940
Pro Leu Arg Ala Asp Asp Leu Ile Pro Thr Gly Glu Gly Glu Phe Phe
945 950 955 960
Val Ser Pro Phe Ser Ala Glu Glu Gly Asp Phe His Gln Ile His Ala
965 970 975
Asp Leu Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln Arg Arg Leu Trp Ser Asp Phe
980 985 990
Asp Ile Ser Gln Ile Arg Leu Arg Cys Asp Trp Gly Glu Val Asp Gly
995 1000 1005
Glu Pro Val Leu Ile Pro Arg Thr Thr Gly Lys Arg Thr Ala Asp
1010 1015 1020
Ser Tyr Gly Asn Lys Val Phe Tyr Thr Lys Thr Gly Val Thr Tyr
1025 1030 1035
Tyr Glu Arg Glu Arg Gly Lys Lys Arg Arg Lys Val Phe Ala Gln
1040 1045 1050
Glu Glu Leu Ser Glu Glu Glu Ala Glu Leu Leu Val Glu Ala Asp
1055 1060 1065
Glu Ala Arg Glu Lys Ser Val Val Leu Met Arg Asp Pro Ser Gly
1070 1075 1080
Ile Ile Asn Arg Gly Asp Trp Thr Arg Gln Lys Glu Phe Trp Ser
1085 1090 1095
Met Val Asn Gln Arg Ile Glu Gly Tyr Leu Val Lys Gln Ile Arg
1100 1105 1110
Ser Arg Val Arg Leu Gln Glu Ser Ala Cys Glu Asn Thr Gly Asp
1115 1120 1125
Ile
<210> 25
<211> 1140
<212> PRT
<213> Bacillus hisashii
<400> 25
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val
20 25 30
Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala
35 40 45
Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ala Ile Tyr Glu
50 55 60
His His Glu Gln Asp Pro Lys Asn Pro Lys Lys Val Ser Lys Ala Glu
65 70 75 80
Ile Gln Ala Glu Leu Trp Asp Phe Val Leu Lys Met Gln Lys Cys Asn
85 90 95
Ser Phe Thr His Glu Val Asp Lys Asp Glu Val Phe Asn Ile Leu Arg
100 105 110
Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Val Pro Ser Ser Val Glu Lys Lys Gly Glu
115 120 125
Ala Asn Gln Leu Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn
130 135 140
Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ala Ser Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp
145 150 155 160
Tyr Asn Leu Lys Ile Ala Gly Asp Pro Ser Trp Glu Glu Glu Lys Lys
165 170 175
Lys Trp Glu Glu Asp Lys Lys Lys Asp Pro Leu Ala Lys Ile Leu Gly
180 185 190
Lys Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Pro Tyr Thr Asp
195 200 205
Ser Asn Glu Pro Ile Val Lys Glu Ile Lys Trp Met Glu Lys Ser Arg
210 215 220
Asn Gln Ser Val Arg Arg Leu Asp Lys Asp Met Phe Ile Gln Ala Leu
225 230 235 240
Glu Arg Phe Leu Ser Trp Glu Ser Trp Asn Leu Lys Val Lys Glu Glu
245 250 255
Tyr Glu Lys Val Glu Lys Glu Tyr Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ile Lys
260 265 270
Glu Asp Ile Gln Ala Leu Lys Ala Leu Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Arg
275 280 285
Gln Glu Gln Leu Leu Arg Asp Thr Leu Asn Thr Asn Glu Tyr Arg Leu
290 295 300
Ser Lys Arg Gly Leu Arg Gly Trp Arg Glu Ile Ile Gln Lys Trp Leu
305 310 315 320
Lys Met Asp Glu Asn Glu Pro Ser Glu Lys Tyr Leu Glu Val Phe Lys
325 330 335
Asp Tyr Gln Arg Lys His Pro Arg Glu Ala Gly Asp Tyr Ser Val Tyr
340 345 350
Glu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Asn His Phe Ile Trp Arg Asn His Pro
355 360 365
Glu Tyr Pro Tyr Leu Tyr Ala Thr Phe Cys Glu Ile Asp Lys Lys Lys
370 375 380
Lys Asp Ala Lys Gln Gln Ala Thr Phe Thr Leu Ala Asp Pro Ile Asn
385 390 395 400
His Pro Leu Trp Val Arg Phe Glu Glu Arg Ser Gly Ser Asn Leu Asn
405 410 415
Lys Tyr Arg Ile Leu Thr Glu Gln Leu His Thr Glu Lys Leu Lys Lys
420 425 430
Lys Leu Thr Val Gln Leu Asp Arg Leu Ile Tyr Pro Thr Glu Ser Gly
435 440 445
Gly Trp Glu Glu Lys Gly Lys Val Asp Ile Val Leu Leu Pro Ser Arg
450 455 460
Gln Phe Tyr Asn Gln Ile Phe Leu Asp Ile Glu Glu Lys Gly Lys His
465 470 475 480
Ala Phe Thr Tyr Lys Asp Glu Ser Ile Lys Phe Pro Leu Lys Gly Thr
485 490 495
Leu Gly Gly Ala Arg Val Gln Phe Asp Arg Asp His Leu Arg Arg Tyr
500 505 510
Pro His Lys Val Glu Ser Gly Asn Val Gly Arg Ile Tyr Phe Asn Met
515 520 525
Thr Val Asn Ile Glu Pro Thr Glu Ser Pro Val Ser Lys Ser Leu Lys
530 535 540
Ile His Arg Asp Asp Phe Pro Lys Val Val Asn Phe Lys Pro Lys Glu
545 550 555 560
Leu Thr Glu Trp Ile Lys Asp Ser Lys Gly Lys Lys Leu Lys Ser Gly
565 570 575
Ile Glu Ser Leu Glu Ile Gly Leu Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly
580 585 590
Gln Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ile Phe Glu Val Val Asp Gln Lys
595 600 605
Pro Asp Ile Glu Gly Lys Leu Phe Phe Pro Ile Lys Gly Thr Glu Leu
610 615 620
Tyr Ala Val His Arg Ala Ser Phe Asn Ile Lys Leu Pro Gly Glu Thr
625 630 635 640
Leu Val Lys Ser Arg Glu Val Leu Arg Lys Ala Arg Glu Asp Asn Leu
645 650 655
Lys Leu Met Asn Gln Lys Leu Asn Phe Leu Arg Asn Val Leu His Phe
660 665 670
Gln Gln Phe Glu Asp Ile Thr Glu Arg Glu Lys Arg Val Thr Lys Trp
675 680 685
Ile Ser Arg Gln Glu Asn Ser Asp Val Pro Leu Val Tyr Gln Asp Glu
690 695 700
Leu Ile Gln Ile Arg Glu Leu Met Tyr Lys Pro Tyr Lys Asp Trp Val
705 710 715 720
Ala Phe Leu Lys Gln Leu His Lys Arg Leu Glu Val Glu Ile Gly Lys
725 730 735
Glu Val Lys His Trp Arg Lys Ser Leu Ser Asp Gly Arg Lys Gly Leu
740 745 750
Tyr Gly Ile Ser Leu Lys Asn Ile Asp Glu Ile Asp Arg Thr Arg Lys
755 760 765
Phe Leu Leu Arg Trp Ser Leu Arg Pro Thr Glu Pro Gly Glu Val Arg
770 775 780
Arg Leu Glu Pro Gly Gln Arg Phe Ala Ile Asp Gln Leu Asn His Leu
785 790 795 800
Asn Ala Leu Lys Glu Asp Arg Leu Lys Lys Met Ala Asn Thr Ile Ile
805 810 815
Met His Ala Leu Gly Tyr Cys Tyr Asp Val Arg Lys Lys Lys Trp Gln
820 825 830
Ala Lys Asn Pro Ala Cys Gln Ile Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ser Asn
835 840 845
Tyr Asn Pro Tyr Glu Glu Arg Ser Arg Phe Glu Asn Ser Lys Leu Met
850 855 860
Lys Trp Ser Arg Arg Glu Ile Pro Arg Gln Val Ala Leu Gln Gly Glu
865 870 875 880
Ile Tyr Gly Leu Gln Val Gly Glu Val Gly Ala Gln Phe Ser Ser Arg
885 890 895
Phe His Ala Lys Thr Gly Ser Pro Gly Ile Arg Cys Ser Val Val Thr
900 905 910
Lys Glu Lys Leu Gln Asp Asn Arg Phe Phe Lys Asn Leu Gln Arg Glu
915 920 925
Gly Arg Leu Thr Leu Asp Lys Ile Ala Val Leu Lys Glu Gly Asp Leu
930 935 940
Tyr Pro Asp Lys Gly Gly Glu Lys Phe Ile Ser Leu Ser Lys Asp Arg
945 950 955 960
Lys Cys Val Thr Thr His Ala Asp Ile Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln
965 970 975
Lys Arg Phe Trp Thr Arg Thr His Gly Phe Tyr Lys Val Tyr Cys Lys
980 985 990
Ala Tyr Gln Val Asp Gly Gln Thr Val Tyr Ile Pro Glu Ser Lys Asp
995 1000 1005
Gln Lys Gln Lys Ile Ile Glu Glu Phe Gly Glu Gly Tyr Phe Ile
1010 1015 1020
Leu Lys Asp Gly Val Tyr Glu Trp Val Asn Ala Gly Lys Leu Lys
1025 1030 1035
Ile Lys Lys Gly Ser Ser Lys Gln Ser Ser Ser Glu Leu Val Asp
1040 1045 1050
Ser Asp Ile Leu Lys Asp Ser Phe Asp Leu Ala Ser Glu Leu Lys
1055 1060 1065
Gly Glu Lys Leu Met Leu Tyr Arg Asp Pro Ser Gly Asn Val Phe
1070 1075 1080
Pro Ser Asp Lys Trp Met Ala Ala Gly Val Phe Phe Gly Lys Leu
1085 1090 1095
Glu Arg Ile Leu Ile Ser Lys Leu Thr Asn Gln Tyr Ser Ile Ser
1100 1105 1110
Thr Ile Glu Asp Asp Ser Ser Lys Gln Ser Met Lys Arg Pro Ala
1115 1120 1125
Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1130 1135 1140
<210> 26
<211> 1112
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 26
Met Ala Ile Arg Ser Ile Lys Leu Lys Met Lys Thr Asn Ser Gly Thr
1 5 10 15
Asp Ser Ile Tyr Leu Arg Lys Ala Leu Trp Arg Thr His Gln Leu Ile
20 25 30
Asn Glu Gly Ile Ala Tyr Tyr Met Asn Leu Leu Thr Leu Tyr Arg Gln
35 40 45
Glu Ala Ile Gly Asp Lys Thr Lys Glu Ala Tyr Gln Ala Glu Leu Ile
50 55 60
Asn Ile Ile Arg Asn Gln Gln Arg Asn Asn Gly Ser Ser Glu Glu His
65 70 75 80
Gly Ser Asp Gln Glu Ile Leu Ala Leu Leu Arg Gln Leu Tyr Glu Leu
85 90 95
Ile Ile Pro Ser Ser Ile Gly Glu Ser Gly Asp Ala Asn Gln Leu Gly
100 105 110
Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn Ser Gln Ser Gly Lys
115 120 125
Gly Thr Ser Asn Ala Gly Arg Lys Pro Arg Trp Lys Arg Leu Lys Glu
130 135 140
Glu Gly Asn Pro Asp Trp Glu Leu Glu Lys Lys Lys Asp Glu Glu Arg
145 150 155 160
Lys Ala Lys Asp Pro Thr Val Lys Ile Phe Asp Asn Leu Asn Lys Tyr
165 170 175
Gly Leu Leu Pro Leu Phe Pro Leu Phe Thr Asn Ile Gln Lys Asp Ile
180 185 190
Glu Trp Leu Pro Leu Gly Lys Arg Gln Ser Val Arg Lys Trp Asp Lys
195 200 205
Asp Met Phe Ile Gln Ala Ile Glu Arg Leu Leu Ser Trp Glu Ser Trp
210 215 220
Asn Arg Arg Val Ala Asp Glu Tyr Lys Gln Leu Lys Glu Lys Thr Glu
225 230 235 240
Ser Tyr Tyr Lys Glu His Leu Thr Gly Gly Glu Glu Trp Ile Glu Lys
245 250 255
Ile Arg Lys Phe Glu Lys Glu Arg Asn Met Glu Leu Glu Lys Asn Ala
260 265 270
Phe Ala Pro Asn Asp Gly Tyr Phe Ile Thr Ser Arg Gln Ile Arg Gly
275 280 285
Trp Asp Arg Val Tyr Glu Lys Trp Ser Lys Leu Pro Glu Ser Ala Ser
290 295 300
Pro Glu Glu Leu Trp Lys Val Val Ala Glu Gln Gln Asn Lys Met Ser
305 310 315 320
Glu Gly Phe Gly Asp Pro Lys Val Phe Ser Phe Leu Ala Asn Arg Glu
325 330 335
Asn Arg Asp Ile Trp Arg Gly His Ser Glu Arg Ile Tyr His Ile Ala
340 345 350
Ala Tyr Asn Gly Leu Gln Lys Lys Leu Ser Arg Thr Lys Glu Gln Ala
355 360 365
Thr Phe Thr Leu Pro Asp Ala Ile Glu His Pro Leu Trp Ile Arg Tyr
370 375 380
Glu Ser Pro Gly Gly Thr Asn Leu Asn Leu Phe Lys Leu Glu Glu Lys
385 390 395 400
Gln Lys Lys Asn Tyr Tyr Val Thr Leu Ser Lys Ile Ile Trp Pro Ser
405 410 415
Glu Glu Lys Trp Ile Glu Lys Glu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Ala Pro
420 425 430
Ser Ile Gln Phe Asn Arg Gln Ile Lys Leu Lys Gln His Val Lys Gly
435 440 445
Lys Gln Glu Ile Ser Phe Ser Asp Tyr Ser Ser Arg Ile Ser Leu Asp
450 455 460
Gly Val Leu Gly Gly Ser Arg Ile Gln Phe Asn Arg Lys Tyr Ile Lys
465 470 475 480
Asn His Lys Glu Leu Leu Gly Glu Gly Asp Ile Gly Pro Val Phe Phe
485 490 495
Asn Leu Val Val Asp Val Ala Pro Leu Gln Glu Thr Arg Asn Gly Arg
500 505 510
Leu Gln Ser Pro Ile Gly Lys Ala Leu Lys Val Ile Ser Ser Asp Phe
515 520 525
Ser Lys Val Ile Asp Tyr Lys Pro Lys Glu Leu Met Asp Trp Met Asn
530 535 540
Thr Gly Ser Ala Ser Asn Ser Phe Gly Val Ala Ser Leu Leu Glu Gly
545 550 555 560
Met Arg Val Met Ser Ile Asp Met Gly Gln Arg Thr Ser Ala Ser Val
565 570 575
Ser Ile Phe Glu Val Val Lys Glu Leu Pro Lys Asp Gln Glu Gln Lys
580 585 590
Leu Phe Tyr Ser Ile Asn Asp Thr Glu Leu Phe Ala Ile His Lys Arg
595 600 605
Ser Phe Leu Leu Asn Leu Pro Gly Glu Val Val Thr Lys Asn Asn Lys
610 615 620
Gln Gln Arg Gln Glu Arg Arg Lys Lys Arg Gln Phe Val Arg Ser Gln
625 630 635 640
Ile Arg Met Leu Ala Asn Val Leu Arg Leu Glu Thr Lys Lys Thr Pro
645 650 655
Asp Glu Arg Lys Lys Ala Ile His Lys Leu Met Glu Ile Val Gln Ser
660 665 670
Tyr Asp Ser Trp Thr Ala Ser Gln Lys Glu Val Trp Glu Lys Glu Leu
675 680 685
Asn Leu Leu Thr Asn Met Ala Ala Phe Asn Asp Glu Ile Trp Lys Glu
690 695 700
Ser Leu Val Glu Leu His His Arg Ile Glu Pro Tyr Val Gly Gln Ile
705 710 715 720
Val Ser Lys Trp Arg Lys Gly Leu Ser Glu Gly Arg Lys Asn Leu Ala
725 730 735
Gly Ile Ser Met Trp Asn Ile Asp Glu Leu Glu Asp Thr Arg Arg Leu
740 745 750
Leu Ile Ser Trp Ser Lys Arg Ser Arg Thr Pro Gly Glu Ala Asn Arg
755 760 765
Ile Glu Thr Asp Glu Pro Phe Gly Ser Ser Leu Leu Gln His Ile Gln
770 775 780
Asn Val Lys Asp Asp Arg Leu Lys Gln Met Ala Asn Leu Ile Ile Met
785 790 795 800
Thr Ala Leu Gly Phe Lys Tyr Asp Lys Glu Glu Lys Asp Arg Tyr Lys
805 810 815
Arg Trp Lys Glu Thr Tyr Pro Ala Cys Gln Ile Ile Leu Phe Glu Asn
820 825 830
Leu Asn Arg Tyr Leu Phe Asn Leu Asp Arg Ser Arg Arg Glu Asn Ser
835 840 845
Arg Leu Met Lys Trp Ala His Arg Ser Ile Pro Arg Thr Val Ser Met
850 855 860
Gln Gly Glu Met Phe Gly Leu Gln Val Gly Asp Val Arg Ser Glu Tyr
865 870 875 880
Ser Ser Arg Phe His Ala Lys Thr Gly Ala Pro Gly Ile Arg Cys His
885 890 895
Ala Leu Thr Glu Glu Asp Leu Lys Ala Gly Ser Asn Thr Leu Lys Arg
900 905 910
Leu Ile Glu Asp Gly Phe Ile Asn Glu Ser Glu Leu Ala Tyr Leu Lys
915 920 925
Lys Gly Asp Ile Ile Pro Ser Gln Gly Gly Glu Leu Phe Val Thr Leu
930 935 940
Ser Lys Arg Tyr Lys Lys Asp Ser Asp Asn Asn Glu Leu Thr Val Ile
945 950 955 960
His Ala Asp Ile Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln Lys Arg Phe Trp Gln
965 970 975
Gln Asn Ser Glu Val Tyr Arg Val Pro Cys Gln Leu Ala Arg Met Gly
980 985 990
Glu Asp Lys Leu Tyr Ile Pro Lys Ser Gln Thr Glu Thr Ile Lys Lys
995 1000 1005
Tyr Phe Gly Lys Gly Ser Phe Val Lys Asn Asn Thr Glu Gln Glu
1010 1015 1020
Val Tyr Lys Trp Glu Lys Ser Glu Lys Met Lys Ile Lys Thr Asp
1025 1030 1035
Thr Thr Phe Asp Leu Gln Asp Leu Asp Gly Phe Glu Asp Ile Ser
1040 1045 1050
Lys Thr Ile Glu Leu Ala Gln Glu Gln Gln Lys Lys Tyr Leu Thr
1055 1060 1065
Met Phe Arg Asp Pro Ser Gly Tyr Phe Phe Asn Asn Glu Thr Trp
1070 1075 1080
Arg Pro Gln Lys Glu Tyr Trp Ser Ile Val Asn Asn Ile Ile Lys
1085 1090 1095
Ser Cys Leu Lys Lys Lys Ile Leu Ser Asn Lys Val Glu Leu
1100 1105 1110
<210> 27
<211> 306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 27
tgcctgtcat acgaaaccga gatactgaca gtagaatatg gccttctgcc aatcgggaag 60
attgtggaga aacggataga atgcacagtt tactctgtcg ataacaatgg taacatttat 120
actcagccag ttgcccagtg gcacgaccgg ggagagcagg aagtattcga atactgtctg 180
gaggatggaa gtctcattag ggccactaag gaccacaaat ttatgacagt cgatggccag 240
atgctgccta tagacgaaat ctttgagcga gagttggacc tcatgcgagt tgacaacctt 300
cctaat 306
<210> 28
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 28
Cys Leu Ser Tyr Glu Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Leu Leu
1 5 10 15
Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Lys Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Ser
20 25 30
Val Asp Asn Asn Gly Asn Ile Tyr Thr Gln Pro Val Ala Gln Trp His
35 40 45
Asp Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Gly Ser
50 55 60
Leu Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Glu Leu Asp Leu Met Arg
85 90 95
Val Asp Asn Leu Pro Asn
100
<210> 29
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 29
atgatcaaga tagctacaag gaagtatctt ggcaaacaaa acgtttatga tattggagtc 60
gaaagagatc acaactttgc tctgaagaac ggattcatag cttctaat 108
<210> 30
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 30
Met Ile Lys Ile Ala Thr Arg Lys Tyr Leu Gly Lys Gln Asn Val Tyr
1 5 10 15
Asp Ile Gly Val Glu Arg Asp His Asn Phe Ala Leu Lys Asn Gly Phe
20 25 30
Ile Ala Ser Asn
35
<210> 31
<211> 303
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 31
tgcctgtctt atgataccga gatacttacc gttgaatatg gcttcttgcc tattggaaag 60
attgtcgaag agagaattga atgcacagta tatactgtag acaagaatgg tttcgtttac 120
acacagccca ttgctcaatg gcacaatcgc ggcgaacaag aagtatttga gtactgtctc 180
gaggatggaa gcatcatacg agcaactaaa gatcataaat tcatgaccac tgacgggcag 240
atgttgccaa tagatgagat attcgagcgg ggcttggatc tcaaacaagt ggatggattg 300
cca 303
<210> 32
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 32
Cys Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Phe Leu
1 5 10 15
Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Thr
20 25 30
Val Asp Lys Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His
35 40 45
Asn Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Gly Ser
50 55 60
Ile Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Thr Asp Gly Gln
65 70 75 80
Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Gly Leu Asp Leu Lys Gln
85 90 95
Val Asp Gly Leu Pro
100
<210> 33
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 33
atgaagagga ctgccgatgg atcagagttt gaatctccca agaagaagag gaaagtaaag 60
ataatatctc gaaaaagtct tggtacccaa aatgtctatg atattggagt ggagaaagat 120
cacaacttcc ttctcaagaa cggtctcgta gccagcaac 159
<210> 34
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 34
Met Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Val Lys Ile Ile Ser Arg Lys Ser Leu Gly Thr Gln Asn Val
20 25 30
Tyr Asp Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu Lys Asn Gly
35 40 45
Leu Val Ala Ser Asn
50
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 35
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 36
Ser Gly Gly Ser
1
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 37
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 38
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 39
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 40
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 41
Pro Ala Pro Ala Pro Ala
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 42
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 43
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 44
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 45
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
<210> 46
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 46
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala Pro
20
<210> 47
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 47
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1 5 10 15
Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser
20
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 48
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 49
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 49
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1 5 10 15
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
20 25 30
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly
35 40 45
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
50 55 60
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
65 70 75 80
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
100
<210> 50
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 50
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
35 40
<210> 51
<211> 64
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 51
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
35 40 45
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
50 55 60
<210> 52
<211> 92
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 52
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
1 5 10 15
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
20 25 30
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu
35 40 45
Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser
50 55 60
Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
65 70 75 80
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
85 90
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization sequence
<400> 53
Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Val
<210> 54
<211> 16
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization sequence
<400> 54
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization sequence
<400> 55
Lys Lys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Asn Ala Glu Asn Lys Thr Lys Lys
1 5 10 15
Leu
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization sequence
<400> 56
Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg
1 5 10 15
Lys Thr Arg
<210> 57
<211> 16
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization sequence
<400> 57
Arg Lys Ser Gly Lys Ile Ala Ala Ile Val Val Lys Arg Pro Arg Lys
1 5 10 15
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization sequence
<400> 58
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 59
<211> 30
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization sequence
<400> 59
Met Asp Ser Leu Leu Met Asn Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Gln Phe Lys
1 5 10 15
Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg Arg Glu Thr Tyr Leu Cys
20 25 30
<210> 60
<211> 84
<212> PRT
<213> Bacillus phage PBS2
<400> 60
Met Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu
1 5 10 15
Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val
20 25 30
Ile Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp
35 40 45
Glu Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu
50 55 60
Tyr Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys
65 70 75 80
Ile Lys Met Leu
<210> 61
<211> 1368
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 61
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 62
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 62
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 63
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 63
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
gggaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 64
<211> 125
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 64
guuuuuguac ucucaagauu uaaguaacug uacaacgaaa cuuacacagu uacuuaaauc 60
uugcagaagc uacaaagaua aggcuucaug ccgaaaucaa cacccuguca uuuuauggca 120
gggug 125
<210> 65
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 65
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugc 76
<210> 66
<211> 84
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 66
guuuuaguac ucuguaauga aaauuacaga aucuacuaaa acaaggcaaa augccguguu 60
uaucucguca acuuguuggc gaga 84
<210> 67
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 67
guucugtcuu uuggucagga caaccgucua gcuauaagug cugcagggug ugagaaacuc 60
cuauugcugg acgaugucuc uuacgaggca uuagcac 97
<210> 68
<211> 88
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 68
gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60
ggagcaccug aaaacaggug cuuggcac 88
<210> 69
<211> 4104
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 69
atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60
atcactgatg attataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg gcagtggaga gacagcggaa 180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420
aaattggcag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa atctacaatc aattatttga agaaaaccct 600
attaacgcaa gtagagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga gaaatggctt gtttgggaat 720
ctcattgctt tgtcattggg attgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900
ttactttcag atatcctaag agtaaatagt gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960
atgattaagc gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020
caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200
aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260
gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320
gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380
cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440
gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500
aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560
tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgagggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680
gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740
tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggcgcct accatgattt gctaaaaatt 1800
attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860
ttaacattga ccttatttga agataggggg atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920
cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980
cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040
gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100
agtttgacat ttaaagaaga tattcaaaaa gcacaggtgt ctggacaagg ccatagttta 2160
catgaacaga ttgctaactt agctggcagt cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220
gtaaaaattg ttgatgaact ggtcaaagta atggggcata agccagaaaa tatcgttatt 2280
gaaatggcac gtgaaaatca gacaactcaa aagggccaga aaaattcgcg agagcgtatg 2340
aaacgaatcg aagaaggtat caaagaatta ggaagtcaga ttcttaaaga gcatcctgtt 2400
gaaaatactc aattgcaaaa tgaaaagctc tatctctatt atctacaaaa tggaagagac 2460
atgtatgtgg accaagaatt agatattaat cgtttaagtg attatgatgt cgatcacatt 2520
gttccacaaa gtttcattaa agacgattca atagacaata aggtactaac gcgttctgat 2580
aaaaatcgtg gtaaatcgga taacgttcca agtgaagaag tagtcaaaaa gatgaaaaac 2640
tattggagac aacttctaaa cgccaagtta atcactcaac gtaagtttga taatttaacg 2700
aaagctgaac gtggaggttt gagtgaactt gataaagctg gttttatcaa acgccaattg 2760
gttgaaactc gccaaatcac taagcatgtg gcacaaattt tggatagtcg catgaatact 2820
aaatacgatg aaaatgataa acttattcga gaggttaaag tgattacctt aaaatctaaa 2880
ttagtttctg acttccgaaa agatttccaa ttctataaag tacgtgagat taacaattac 2940
catcatgccc atgatgcgta tctaaatgcc gtcgttggaa ctgctttgat taagaaatat 3000
ccaaaacttg aatcggagtt tgtctatggt gattataaag tttatgatgt tcgtaaaatg 3060
attgctaagt ctgagcaaga aataggcaaa gcaaccgcaa aatatttctt ttactctaat 3120
atcatgaact tcttcaaaac agaaattaca cttgcaaatg gagagattcg caaacgccct 3180
ctaatcgaaa ctaatgggga aactggagaa attgtctggg ataaagggcg agattttgcc 3240
acagtgcgca aagtattgtc catgccccaa gtcaatattg tcaagaaaac agaagtacag 3300
acaggcggat tctccaagga gtcaatttta ccaaaaagaa attcggacaa gcttattgct 3360
cgtaaaaaag actgggatcc aaaaaaatat ggtggttttg atagtccaac ggtagcttat 3420
tcagtcctag tggttgctaa ggtggaaaaa gggaaatcga agaagttaaa atccgttaaa 3480
gagttactag ggatcacaat tatggaaaga agttcctttg aaaaaaatcc gattgacttt 3540
ttagaagcta aaggatataa ggaagttaaa aaagacttaa tcattaaact acctaaatat 3600
agtctttttg agttagaaaa cggtcgtaaa cggatgctgg ctagtgccgg agaattacaa 3660
aaaggaaatg agctggctct gccaagcaaa tatgtgaatt ttttatattt agctagtcat 3720
tatgaaaagt tgaagggtag tccagaagat aacgaacaaa aacaattgtt tgtggagcag 3780
cataagcatt atttagatga gattattgag caaatcagtg aattttctaa gcgtgttatt 3840
ttagcagatg ccaatttaga taaagttctt agtgcatata acaaacatag agacaaacca 3900
atacgtgaac aagcagaaaa tattattcat ttatttacgt tgacgaatct tggagctccc 3960
gctgctttta aatattttga tacaacaatt gatcgtaaac gatatacgtc tacaaaagaa 4020
gttttagatg ccactcttat ccatcaatcc atcactggtc tttatgaaac acgcattgat 4080
ttgagtcagc taggaggtga ctga 4104
<210> 70
<211> 4212
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 70
atggataaaa agtattctat tggtttagac atcggcacta attccgttgg atgggctgtc 60
ataaccgatg aatacaaagt accttcaaag aaatttaagg tgttggggaa cacagaccgt 120
cattcgatta aaaagaatct tatcggtgcc ctcctattcg atagtggcga aacggcagag 180
gcgactcgcc tgaaacgaac cgctcggaga aggtatacac gtcgcaagaa ccgaatatgt 240
tacttacaag aaatttttag caatgagatg gccaaagttg acgattcttt ctttcaccgt 300
ttggaagagt ccttccttgt cgaagaggac aagaaacatg aacggcaccc catctttgga 360
aacatagtag atgaggtggc atatcatgaa aagtacccaa cgatttatca cctcagaaaa 420
aagctagttg actcaactga taaagcggac ctgaggttaa tctacttggc tcttgcccat 480
atgataaagt tccgtgggca ctttctcatt gagggtgatc taaatccgga caactcggat 540
gtcgacaaac tgttcatcca gttagtacaa acctataatc agttgtttga agagaaccct 600
ataaatgcaa gtggcgtgga tgcgaaggct attcttagcg cccgcctctc taaatcccga 660
cggctagaaa acctgatcgc acaattaccc ggagagaaga aaaatgggtt gttcggtaac 720
cttatagcgc tctcactagg cctgacacca aattttaagt cgaacttcga cttagctgaa 780
gatgccaaat tgcagcttag taaggacacg tacgatgacg atctcgacaa tctactggca 840
caaattggag atcagtatgc ggacttattt ttggctgcca aaaaccttag cgatgcaatc 900
ctcctatctg acatactgag agttaatact gagattacca aggcgccgtt atccgcttca 960
atgatcaaaa ggtacgatga acatcaccaa gacttgacac ttctcaaggc cctagtccgt 1020
cagcaactgc ctgagaaata taaggaaata ttctttgatc agtcgaaaaa cgggtacgca 1080
ggttatattg acggcggagc gagtcaagag gaattctaca agtttatcaa acccatatta 1140
gagaagatgg atgggacgga agagttgctt gtaaaactca atcgcgaaga tctactgcga 1200
aagcagcgga ctttcgacaa cggtagcatt ccacatcaaa tccacttagg cgaattgcat 1260
gctatactta gaaggcagga ggatttttat ccgttcctca aagacaatcg tgaaaagatt 1320
gagaaaatcc taacctttcg cataccttac tatgtgggac ccctggcccg agggaactct 1380
cggttcgcat ggatgacaag aaagtccgaa gaaacgatta ctccatggaa ttttgaggaa 1440
gttgtcgata aaggtgcgtc agctcaatcg ttcatcgaga ggatgaccaa ctttgacaag 1500
aatttaccga acgaaaaagt attgcctaag cacagtttac tttacgagta tttcacagtg 1560
tacaatgaac tcacgaaagt taagtatgtc actgagggca tgcgtaaacc cgcctttcta 1620
agcggagaac agaagaaagc aatagtagat ctgttattca agaccaaccg caaagtgaca 1680
gttaagcaat tgaaagagga ctactttaag aaaattgaat gcttcgattc tgtcgagatc 1740
tccggggtag aagatcgatt taatgcgtca cttggtacgt atcatgacct cctaaagata 1800
attaaagata aggacttcct ggataacgaa gagaatgaag atatcttaga agatatagtg 1860
ttgactctta ccctctttga agatcgggaa atgattgagg aaagactaaa aacatacgct 1920
cacctgttcg acgataaggt tatgaaacag ttaaagaggc gtcgctatac gggctgggga 1980
cgattgtcgc ggaaacttat caacgggata agagacaagc aaagtggtaa aactattctc 2040
gattttctaa agagcgacgg cttcgccaat aggaacttta tgcagctgat ccatgatgac 2100
tctttaacct tcaaagagga tatacaaaag gcacaggttt ccggacaagg ggactcattg 2160
cacgaacata ttgcgaatct tgctggttcg ccagccatca aaaagggcat actccagaca 2220
gtcaaagtag tggatgagct agttaaggtc atgggacgtc acaaaccgga aaacattgta 2280
atcgagatgg cacgcgaaaa tcaaacgact cagaaggggc aaaaaaacag tcgagagcgg 2340
atgaagagaa tagaagaggg tattaaagaa ctgggcagcc agatcttaaa ggagcatcct 2400
gtggaaaata cccaattgca gaacgagaaa ctttacctct attacctaca aaatggaagg 2460
gacatgtatg ttgatcagga actggacata aaccgtttat ctgattacga cgtcgatcac 2520
attgtacccc aatccttttt gaaggacgat tcaatcgaca ataaagtgct tacacgctcg 2580
gataagaacc gagggaaaag tgacaatgtt ccaagcgagg aagtcgtaaa gaaaatgaag 2640
aactattggc ggcagctcct aaatgcgaaa ctgataacgc aaagaaagtt cgataactta 2700
actaaagctg agaggggtgg cttgtctgaa cttgacaagg ccggatttat taaacgtcag 2760
ctcgtggaaa cccgccaaat cacaaagcat gttgcacaga tactagattc ccgaatgaat 2820
acgaaatacg acgagaacga taagctgatt cgggaagtca aagtaatcac tttaaagtca 2880
aaattggtgt cggacttcag aaaggatttt caattctata aagttaggga gataaataac 2940
taccaccatg cgcacgacgc ttatcttaat gccgtcgtag ggaccgcact cattaagaaa 3000
tacccgaagc tagaaagtga gtttgtgtat ggtgattaca aagtttatga cgtccgtaag 3060
atgatcgcga aaagcgaaca ggagataggc aaggctacag ccaaatactt cttttattct 3120
aacattatga atttctttaa gacggaaatc actctggcaa acggagagat acgcaaacga 3180
cctttaattg aaaccaatgg ggagacaggt gaaatcgtat gggataaggg ccgggacttc 3240
gcgacggtga gaaaagtttt gtccatgccc caagtcaaca tagtaaagaa aactgaggtg 3300
cagaccggag ggttttcaaa ggaatcgatt cttccaaaaa ggaatagtga taagctcatc 3360
gctcgtaaaa aggactggga cccgaaaaag tacggtggct tcgatagccc tacagttgcc 3420
tattctgtcc tagtagtggc aaaagttgag aagggaaaat ccaagaaact gaagtcagtc 3480
aaagaattat tggggataac gattatggag cgctcgtctt ttgaaaagaa ccccatcgac 3540
ttccttgagg cgaaaggtta caaggaagta aaaaaggatc tcataattaa actaccaaag 3600
tatagtctgt ttgagttaga aaatggccga aaacggatgt tggctagcgc cggagagctt 3660
caaaagggga acgaactcgc actaccgtct aaatacgtga atttcctgta tttagcgtcc 3720
cattacgaga agttgaaagg ttcacctgaa gataacgaac agaagcaact ttttgttgag 3780
cagcacaaac attatctcga cgaaatcata gagcaaattt cggaattcag taagagagtc 3840
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ccagccgcat tcaagtattt tgacacaacg atagatcgca aacgatacac ttctaccaag 4020
gaggtgctag acgcgacact gattcaccaa tccatcacgg gattatatga aactcggata 4080
gatttgtcac agcttggggg tgacggatcc cccaagaaga agaggaaagt ctcgagcgac 4140
tacaaagacc atgacggtga ttataaagat catgacatcg attacaagga tgacgatgac 4200
aaggctgcag ga 4212
<210> 71
<211> 1368
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 71
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
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Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
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Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 72
<211> 4107
<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 72
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cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420
aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600
attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720
ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900
ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960
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caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140
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attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580
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taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000
tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060
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attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900
ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960
cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020
gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080
gatttgagtc agctaggagg tgactga 4107
<210> 73
<211> 1368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 73
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1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
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130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
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210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
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Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
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Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
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Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
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530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
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660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
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Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
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965 970 975
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Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
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Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
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Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
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Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 74
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<212> PRT
<213> Sulfolobus islandicus
<400> 74
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1 5 10 15
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Ser Asp Asp Gly Lys Val Arg Asp Leu Lys Leu Ile Ser Ala Tyr Val
325 330 335
Asn Gly Glu Leu Ile Arg Gly Glu Gly
340 345
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<211> 345
<212> PRT
<213> Sulfolobus islandicus
<400> 75
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1 5 10 15
Val Ala Thr Glu Ala Glu Asn Ser Thr Ile Tyr Asn Asn Lys Val Glu
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165 170 175
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180 185 190
Ser Leu Ile Gln Asn Val Asn Gly Ile Val Pro Gly Ile Lys Pro Glu
195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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275 280 285
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305 310 315 320
Ser Asp Asp Gly Lys Val Arg Asp Leu Lys Leu Ile Ser Ala Tyr Val
325 330 335
Asn Gly Glu Leu Ile Arg Gly Glu Gly
340 345
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Deltaproteobacteria CasX sequence
<400> 76
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100 105 110
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180 185 190
Leu Asp Phe Tyr Ser Ile His Val Thr Lys Glu Ser Thr His Pro Val
195 200 205
Lys Pro Leu Ala Gln Ile Ala Gly Asn Arg Tyr Ala Ser Gly Pro Val
210 215 220
Gly Lys Ala Leu Ser Asp Ala Cys Met Gly Thr Ile Ala Ser Phe Leu
225 230 235 240
Ser Lys Tyr Gln Asp Ile Ile Ile Glu His Gln Lys Val Val Lys Gly
245 250 255
Asn Gln Lys Arg Leu Glu Ser Leu Arg Glu Leu Ala Gly Lys Glu Asn
260 265 270
Leu Glu Tyr Pro Ser Val Thr Leu Pro Pro Gln Pro His Thr Lys Glu
275 280 285
Gly Val Asp Phe Ala Tyr Asn Glu Val Ile Ala Arg Val Arg Met Trp
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Val Asn Leu Asn Leu Trp Gln Lys Leu Lys Leu Ser Arg Asp Asp Ala
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595 600 605
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675 680 685
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850 855 860
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Ser Ala Glu Leu Asp Arg Leu Ser Glu Glu Ser Gly Asn Asn Asp Ile
885 890 895
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Arg Ser Trp Leu Phe Leu Asn Ser Asn Ser Thr Glu Phe Lys Ser Tyr
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Lys Ser Gly Lys Gln Pro Phe Val Gly Ala Trp Gln Ala Phe Tyr Lys
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Arg Arg Leu Lys Glu Val Trp Lys Pro Asn Ala
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<211> 1210
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
uncultured Parcubacteria group bacterium
<400> 77
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1 5 10 15
His Ala Gln Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Lys Ser Gly Ala Met Arg Thr
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Ile Lys Tyr Pro Leu Tyr Ser Ser Pro Ser Gly Gly Arg Thr Val Pro
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65 70 75 80
Lys Val Tyr Ser Val Leu Asp Phe Trp Tyr Asp Cys Val Gln Tyr Gly
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Leu Tyr Asp Glu Leu Gln Ile Asp Lys Val Ile Lys Phe Leu Asn Lys
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Lys Glu Ile Ser Arg Ala Asn Gly Ser Leu Asp Lys Leu Lys Lys Asp
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Ile Ile Asp Cys Phe Lys Ala Glu Tyr Arg Glu Arg His Lys Asp Gln
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180 185 190
Ala Ser Leu Gly Glu Arg Gln Lys Lys Leu Phe Arg Asp Phe Phe Gly
195 200 205
Ile Ser Glu Gln Ser Glu Asn Asp Lys Pro Ser Phe Thr Asn Pro Leu
210 215 220
Asn Leu Thr Cys Cys Leu Leu Pro Phe Asp Thr Val Asn Asn Asn Arg
225 230 235 240
Asn Arg Gly Glu Val Leu Phe Asn Lys Leu Lys Glu Tyr Ala Gln Lys
245 250 255
Leu Asp Lys Asn Glu Gly Ser Leu Glu Met Trp Glu Tyr Ile Gly Ile
260 265 270
Gly Asn Ser Gly Thr Ala Phe Ser Asn Phe Leu Gly Glu Gly Phe Leu
275 280 285
Gly Arg Leu Arg Glu Asn Lys Ile Thr Glu Leu Lys Lys Ala Met Met
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1100 1105 1110
Leu Ile Asp Ala Ile Lys Asp Phe Met Arg Pro Pro Ile Phe Asp
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Glu Asn Asp Thr Pro Phe Pro Lys Tyr Arg Asp Phe Cys Asp Lys
1130 1135 1140
His His Ile Ser Lys Lys Met Arg Gly Asn Ser Cys Leu Phe Ile
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Cys Pro Phe Cys Arg Ala Asn Ala Asp Ala Asp Ile Gln Ala Ser
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Gln Thr Ile Ala Leu Leu Arg Tyr Val Lys Glu Glu Lys Lys Val
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Glu Asp Tyr Phe Glu Arg Phe Arg Lys Leu Lys Asn Ile Lys Val
1190 1195 1200
Leu Gly Gln Met Lys Lys Ile
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<210> 78
<211> 1082
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 78
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1 5 10 15
Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Met Val Glu Ile Asp Glu Asp
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Glu Asn Pro Ile Cys Leu Ile Asp Leu Gly Val Arg Val Phe Glu Arg
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50 55 60
Ala Arg Ser Val Arg Arg Leu Thr Arg Arg Arg Ala His Arg Leu Leu
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Leu Leu Lys Arg Glu Gly Val Leu Gln Ala Ala Asp
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100 105 110
Leu Arg Ala Ala Ala Leu Asp Arg Lys Leu Thr Pro Leu Glu Trp Ser
115 120 125
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130 135 140
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Thr Gln Arg Pro Ala Leu Ser Gly Asp Ala Val Gln Lys Met Leu Gly
245 250 255
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260 265 270
Thr Ala Glu Arg Phe Ile Trp Leu Thr Lys Leu Asn Asn Leu Arg Ile
275 280 285
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290 295 300
Leu Met Asp Glu Pro Tyr Arg Lys Ser Lys Leu Thr Tyr Ala Gln Ala
305 310 315 320
Arg Lys Leu Leu Gly Leu Glu Asp Thr Ala Phe Phe Lys Gly Leu Arg
325 330 335
Tyr Gly Lys Asp Asn Ala Glu Ala Ser Thr Leu Met Glu Met Lys Ala
340 345 350
Tyr His Ala Ile Ser Arg Ala Leu Glu Lys Glu Gly Leu Lys Asp Lys
355 360 365
Lys Ser Pro Leu Asn Leu Ser Pro Glu Leu Gln Asp Glu Ile Gly Thr
370 375 380
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<211> 1082
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 79
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (98)..(117)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 80
guucugtcuu uuggucagga caaccgucua gcuauaagug cugcagggug ugagaaacuc 60
cuauugcugg acgaugucuc uuacgaggca uuagcacnnn nnnnnnnnnn nnnnnnn 117
<210> 81
<211> 108
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (89)..(108)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 81
gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60
ggagcaccug aaaacaggug cuuggcacnn nnnnnnnnnn nnnnnnnn 108
<210> 82
<211> 119
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (100)..(119)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 82
gucuaaagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggcc acuuuccagg uggcaaagcc 60
cguugaacuu cucaaaaaga acgaucugag aaguggcacn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 119
<210> 83
<211> 1300
<212> PRT
<213> Francisella novicida
<400> 83
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Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys
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Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys
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Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
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Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr
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Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu
225 230 235 240
Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg
245 250 255
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260 265 270
Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys
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Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile
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Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys
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325 330 335
Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met
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1100 1105 1110
Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe
1115 1120 1125
Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr
1130 1135 1140
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1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly
1175 1180 1185
Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe
1190 1195 1200
Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg
1205 1210 1215
Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val
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Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys
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<210> 84
<211> 1300
<212> PRT
<213> Francisella novicida
<400> 84
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Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys
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Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys
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Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu
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Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala Lys
340 345 350
Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu Thr
355 360 365
Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser Asn
370 375 380
Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile Asn
385 390 395 400
Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala Ile
405 410 415
Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln Gln
420 425 430
Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val
435 440 445
Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile Ile
450 455 460
Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg Glu
465 470 475 480
Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys Arg
485 490 495
Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr Gly
500 505 510
Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp Met
515 520 525
Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu Asp
530 535 540
Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro Arg
545 550 555 560
Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys Gln
565 570 575
Glu Glu Ala Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu Ser
580 585 590
Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile Leu
595 600 605
Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu Tyr
610 615 620
Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp Phe
625 630 635 640
Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu Met
645 650 655
Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys Val
660 665 670
Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp Lys
675 680 685
Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp Ala
690 695 700
Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys Leu
705 710 715 720
Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys Gln
725 730 735
Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu Ile
740 745 750
Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp Tyr
755 760 765
Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Lys Leu Ile Asn
770 775 780
Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu Ile
785 790 795 800
Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu Lys
805 810 815
Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His Asp
820 825 830
Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly Asp
835 840 845
Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr Leu
850 855 860
Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile Lys
865 870 875 880
Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp Tyr
885 890 895
Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr Arg
900 905 910
Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val Lys
915 920 925
Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser Lys
930 935 940
Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala Glu
945 950 955 960
Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly Glu
965 970 975
Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile Glu
980 985 990
Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met Asn
995 1000 1005
Asp Lys Arg Pro Pro His Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys Thr
1010 1015 1020
Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu Tyr
1025 1030 1035
Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly
1040 1045 1050
<210> 94
<211> 167
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 94
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 95
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 95
gggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccacc 47
<210> 96
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 96
gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc 60
ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg a 101
<210> 97
<211> 3420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 97
atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc cgccaccaga 60
tccttcatcc tgaagatcga gcccaacgag gaagtgaaga aaggcctctg gaaaacccac 120
gaggtgctga accacggaat cgcctactac atgaatatcc tgaagctgat ccggcaagag 180
gccatctacg agcaccacga gcaggacccc aagaatccca agaaggtgtc caaggccgag 240
atccaggccg agctgtggga tttcgtgctg aagatgcaga agtgcaacag cttcacacac 300
gaggtggaca aggacgaggt gttcaacatc ctgagagagc tgtacgagga actggtgccc 360
agcagcgtgg aaaagaaggg cgaagccaac cagctgagca acaagtttct gtaccctctg 420
gtggacccca acagccagtc tggaaaggga acagccagca gcggcagaaa gcccagatgg 480
tacaacctga agattgccgg cgatccctcc tgggaagaag agaagaagaa gtgggaagaa 540
gataagaaaa aggacccgct ggccaagatc ctgggcaagc tggctgagta cggactgatc 600
cctctgttca tcccctacac cgacagcaac gagcccatcg tgaaagaaat caagtggatg 660
gaaaagtccc ggaaccagag cgtgcggcgg ctggataagg acatgttcat tcaggccctg 720
gaacggttcc tgagctggga gagctggaac ctgaaagtga aagaggaata cgagaaggtc 780
gagaaagagt acaagaccct ggaagagagg atcaaagagg acatccaggc tctgaaggct 840
ctggaacagt atgagaaaga gcggcaagaa cagctgctgc gggacaccct gaacaccaac 900
gagtaccggc tgagcaagag aggccttaga ggctggcggg aaatcatcca gaaatggctg 960
aaaatggacg agaacgagcc ctccgagaag tacctggaag tgttcaagga ctaccagcgg 1020
aagcacccta gagaggccgg cgattacagc gtgtacgagt tcctgtccaa gaaagagaac 1080
cacttcatct ggcggaatca ccctgagtac ccctacctgt acgccacctt ctgcgagatc 1140
gacaagaaaa agaaggacgc caagcagcag gccaccttca cactggccga tcctatcaat 1200
caccctctgt gggtccgatt cgaggaaaga agcggcagca acctgaacaa gtacagaatc 1260
ctgaccgagc agctgcacac cgagaagctg aagaaaaagc tgacagtgca gctggaccgg 1320
ctgatctacc ctacagaatc tggcggctgg gaagagaagg gcaaagtgga cattgtgctg 1380
ctgcccagcc ggcagttcta caaccagatc ttcctggaca tcgaggaaaa gggcaagcac 1440
gccttcacct acaaggatga gagcatcaag ttccctctga agggcacact cggcggagcc 1500
agagtgcagt tcgacagaga tcacctgaga agataccctc acaaggtgga aagcggcaac 1560
gtgggcagaa tctacttcaa catgaccgtg aacatcgagc ctacagagtc cccagtgtcc 1620
aagtctctga agatccaccg ggacgacttc cccaaggtgg tcaacttcaa gcccaaagaa 1680
ctgaccgagt ggatcaagga cagcaagggc aagaaactga agtccggcat cgagtccctg 1740
gaaatcggcc tgagagtgat gagcatcgac ctgggacaga gacaggccgc tgccgcctct 1800
attttcgagg tggtggatca gaagcccgac atcgaaggca agctgttttt cccaatcaag 1860
ggcaccgagc tgtatgccgt gcacagagcc agcttcaaca tcaagctgcc cggcgagaca 1920
ctggtcaaga gcagagaagt gctgcggaag gccagagagg acaatctgaa actgatgaac 1980
cagaagctca acttcctgcg gaacgtgctg cacttccagc agttcgagga catcaccgag 2040
agagagaagc gggtcaccaa gtggatcagc agacaagaga acagcgacgt gcccctggtg 2100
taccaggatg agctgatcca gatccgcgag ctgatgtaca agccttacaa ggactgggtc 2160
gccttcctga agcagctcca caagagactg gaagtcgaga tcggcaaaga agtgaagcac 2220
tggcggaagt ccctgagcga cggaagaaag ggcctgtacg gcatctccct gaagaacatc 2280
gacgagatcg atcggacccg gaagttcctg ctgagatggt ccctgaggcc taccgaacct 2340
ggcgaagtgc gtagactgga acccggccag agattcgcca tcgaccagct gaatcacctg 2400
aacgccctga aagaagatcg gctgaagaag atggccaaca ccatcatcat gcacgccctg 2460
ggctactgct acgacgtgcg gaagaagaaa tggcaggcta agaaccccgc ctgccagatc 2520
atcctgttcg aggatctgag caactacaac ccctacgagg aaaggtcccg cttcgagaac 2580
agcaagctca tgaagtggtc cagacgcgag atccccagac aggttgcact gcagggcgag 2640
atctatggcc tgcaagtggg agaagtgggc gctcagttca gcagcagatt ccacgccaag 2700
acaggcagcc ctggcatcag atgtagcgtc gtgaccaaag agaagctgca ggacaatcgg 2760
ttcttcaaga atctgcagag agagggcaga ctgaccctgg acaaaatcgc cgtgctgaaa 2820
gagggcgatc tgtacccaga caaaggcggc gagaagttca tcagcctgag caaggatcgg 2880
aagtgcgtga ccacacacgc cgacatcaac gccgctcaga acctgcagaa gcggttctgg 2940
acaagaaccc acggcttcta caaggtgtac tgcaaggcct accaggtgga cggccagacc 3000
gtgtacatcc ctgagagcaa ggaccagaag cagaagatca tcgaagagtt cggcgagggc 3060
tacttcattc tgaaggacgg ggtgtacgaa tgggtcaacg ccggcaagct gaaaatcaag 3120
aagggcagct ccaagcagag cagcagcgag ctggtggata gcgacatcct gaaagacagc 3180
ttcgacctgg cctccgagct gaaaggcgaa aagctgatgc tgtacaggga ccccagcggc 3240
aatgtgttcc ccagcgacaa atggatggcc gctggcgtgt tcttcggaaa gctggaacgc 3300
atcctgatca gcaagctgac caaccagtac tccatcagca ccatcgagga cgacagcagc 3360
aagcagtcta tgaaaaggcc ggcggccacg aaaaaggccg gccaggcaaa aaagaaaaag 3420
<210> 98
<211> 1108
<212> PRT
<213> Bacillus thermoamylovorans
<400> 98
Met Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val
1 5 10 15
Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala
20 25 30
Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ala Ile Tyr Glu
35 40 45
His His Glu Gln Asp Pro Lys Asn Pro Lys Lys Val Ser Lys Ala Glu
50 55 60
Ile Gln Ala Glu Leu Trp Asp Phe Val Leu Lys Met Gln Lys Cys Asn
65 70 75 80
Ser Phe Thr His Glu Val Asp Lys Asp Val Val Phe Asn Ile Leu Arg
85 90 95
Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Val Pro Ser Ser Val Glu Lys Lys Gly Glu
100 105 110
Ala Asn Gln Leu Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn
115 120 125
Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ala Ser Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp
130 135 140
Tyr Asn Leu Lys Ile Ala Gly Asp Pro Ser Trp Glu Glu Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Trp Glu Glu Asp Lys Lys Lys Asp Pro Leu Ala Lys Ile Leu Gly
165 170 175
Lys Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Pro Phe Thr Asp
180 185 190
Ser Asn Glu Pro Ile Val Lys Glu Ile Lys Trp Met Glu Lys Ser Arg
195 200 205
Asn Gln Ser Val Arg Arg Leu Asp Lys Asp Met Phe Ile Gln Ala Leu
210 215 220
Glu Arg Phe Leu Ser Trp Glu Ser Trp Asn Leu Lys Val Lys Glu Glu
225 230 235 240
Tyr Glu Lys Val Glu Lys Glu His Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ile Lys
245 250 255
Glu Asp Ile Gln Ala Phe Lys Ser Leu Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Arg
260 265 270
Gln Glu Gln Leu Leu Arg Asp Thr Leu Asn Thr Asn Glu Tyr Arg Leu
275 280 285
Ser Lys Arg Gly Leu Arg Gly Trp Arg Glu Ile Ile Gln Lys Trp Leu
290 295 300
Lys Met Asp Glu Asn Glu Pro Ser Glu Lys Tyr Leu Glu Val Phe Lys
305 310 315 320
Asp Tyr Gln Arg Lys His Pro Arg Glu Ala Gly Asp Tyr Ser Val Tyr
325 330 335
Glu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Asn His Phe Ile Trp Arg Asn His Pro
340 345 350
Glu Tyr Pro Tyr Leu Tyr Ala Thr Phe Cys Glu Ile Asp Lys Lys Lys
355 360 365
Lys Asp Ala Lys Gln Gln Ala Thr Phe Thr Leu Ala Asp Pro Ile Asn
370 375 380
His Pro Leu Trp Val Arg Phe Glu Glu Arg Ser Gly Ser Asn Leu Asn
385 390 395 400
Lys Tyr Arg Ile Leu Thr Glu Gln Leu His Thr Glu Lys Leu Lys Lys
405 410 415
Lys Leu Thr Val Gln Leu Asp Arg Leu Ile Tyr Pro Thr Glu Ser Gly
420 425 430
Gly Trp Glu Glu Lys Gly Lys Val Asp Ile Val Leu Leu Pro Ser Arg
435 440 445
Gln Phe Tyr Asn Gln Ile Phe Leu Asp Ile Glu Glu Lys Gly Lys His
450 455 460
Ala Phe Thr Tyr Lys Asp Glu Ser Ile Lys Phe Pro Leu Lys Gly Thr
465 470 475 480
Leu Gly Gly Ala Arg Val Gln Phe Asp Arg Asp His Leu Arg Arg Tyr
485 490 495
Pro His Lys Val Glu Ser Gly Asn Val Gly Arg Ile Tyr Phe Asn Met
500 505 510
Thr Val Asn Ile Glu Pro Thr Glu Ser Pro Val Ser Lys Ser Leu Lys
515 520 525
Ile His Arg Asp Asp Phe Pro Lys Phe Val Asn Phe Lys Pro Lys Glu
530 535 540
Leu Thr Glu Trp Ile Lys Asp Ser Lys Gly Lys Lys Leu Lys Ser Gly
545 550 555 560
Ile Glu Ser Leu Glu Ile Gly Leu Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly
565 570 575
Gln Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ile Phe Glu Val Val Asp Gln Lys
580 585 590
Pro Asp Ile Glu Gly Lys Leu Phe Phe Pro Ile Lys Gly Thr Glu Leu
595 600 605
Tyr Ala Val His Arg Ala Ser Phe Asn Ile Lys Leu Pro Gly Glu Thr
610 615 620
Leu Val Lys Ser Arg Glu Val Leu Arg Lys Ala Arg Glu Asp Asn Leu
625 630 635 640
Lys Leu Met Asn Gln Lys Leu Asn Phe Leu Arg Asn Val Leu His Phe
645 650 655
Gln Gln Phe Glu Asp Ile Thr Glu Arg Glu Lys Arg Val Thr Lys Trp
660 665 670
Ile Ser Arg Gln Glu Asn Ser Asp Val Pro Leu Val Tyr Gln Asp Glu
675 680 685
Leu Ile Gln Ile Arg Glu Leu Met Tyr Lys Pro Tyr Lys Asp Trp Val
690 695 700
Ala Phe Leu Lys Gln Leu His Lys Arg Leu Glu Val Glu Ile Gly Lys
705 710 715 720
Glu Val Lys His Trp Arg Lys Ser Leu Ser Asp Gly Arg Lys Gly Leu
725 730 735
Tyr Gly Ile Ser Leu Lys Asn Ile Asp Glu Ile Asp Arg Thr Arg Lys
740 745 750
Phe Leu Leu Arg Trp Ser Leu Arg Pro Thr Glu Pro Gly Glu Val Arg
755 760 765
Arg Leu Glu Pro Gly Gln Arg Phe Ala Ile Asp Gln Leu Asn His Leu
770 775 780
Asn Ala Leu Lys Glu Asp Arg Leu Lys Lys Met Ala Asn Thr Ile Ile
785 790 795 800
Met His Ala Leu Gly Tyr Cys Tyr Asp Val Arg Lys Lys Lys Trp Gln
805 810 815
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820 825 830
Tyr Asn Pro Tyr Glu Glu Arg Ser Arg Phe Glu Asn Ser Lys Leu Met
835 840 845
Lys Trp Ser Arg Arg Glu Ile Pro Arg Gln Val Ala Leu Gln Gly Glu
850 855 860
Ile Tyr Gly Leu Gln Val Gly Glu Val Gly Ala Gln Phe Ser Ser Arg
865 870 875 880
Phe His Ala Lys Thr Gly Ser Pro Gly Ile Arg Cys Ser Val Val Thr
885 890 895
Lys Glu Lys Leu Gln Asp Asn Arg Phe Phe Lys Asn Leu Gln Arg Glu
900 905 910
Gly Arg Leu Thr Leu Asp Lys Ile Ala Val Leu Lys Glu Gly Asp Leu
915 920 925
Tyr Pro Asp Lys Gly Gly Glu Lys Phe Ile Ser Leu Ser Lys Asp Arg
930 935 940
Lys Leu Val Thr Thr His Ala Asp Ile Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln
945 950 955 960
Lys Arg Phe Trp Thr Arg Thr His Gly Phe Tyr Lys Val Tyr Cys Lys
965 970 975
Ala Tyr Gln Val Asp Gly Gln Thr Val Tyr Ile Pro Glu Ser Lys Asp
980 985 990
Gln Lys Gln Lys Ile Ile Glu Glu Phe Gly Glu Gly Tyr Phe Ile Leu
995 1000 1005
Lys Asp Gly Val Tyr Glu Trp Gly Asn Ala Gly Lys Leu Lys Ile
1010 1015 1020
Lys Lys Gly Ser Ser Lys Gln Ser Ser Ser Glu Leu Val Asp Ser
1025 1030 1035
Asp Ile Leu Lys Asp Ser Phe Asp Leu Ala Ser Glu Leu Lys Gly
1040 1045 1050
Glu Lys Leu Met Leu Tyr Arg Asp Pro Ser Gly Asn Val Phe Pro
1055 1060 1065
Ser Asp Lys Trp Met Ala Ala Gly Val Phe Phe Gly Lys Leu Glu
1070 1075 1080
Arg Ile Leu Ile Ser Lys Leu Thr Asn Gln Tyr Ser Ile Ser Thr
1085 1090 1095
Ile Glu Asp Asp Ser Ser Lys Gln Ser Met
1100 1105
<210> 99
<211> 1302
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas12c1 sequence
<400> 99
Met Gln Thr Lys Lys Thr His Leu His Leu Ile Ser Ala Lys Ala Ser
1 5 10 15
Arg Lys Tyr Arg Arg Thr Ile Ala Cys Leu Ser Asp Thr Ala Lys Lys
20 25 30
Asp Leu Glu Arg Arg Lys Gln Ser Gly Ala Ala Asp Pro Ala Gln Glu
35 40 45
Leu Ser Cys Leu Lys Thr Ile Lys Phe Lys Leu Glu Val Pro Glu Gly
50 55 60
Ser Lys Leu Pro Ser Phe Asp Arg Ile Ser Gln Ile Tyr Asn Ala Leu
65 70 75 80
Glu Thr Ile Glu Lys Gly Ser Leu Ser Tyr Leu Leu Phe Ala Leu Ile
85 90 95
Leu Ser Gly Phe Arg Ile Phe Pro Asn Ser Ser Ala Ala Lys Thr Phe
100 105 110
Ala Ser Ser Ser Cys Tyr Lys Asn Asp Gln Phe Ala Ser Gln Ile Lys
115 120 125
Glu Ile Phe Gly Glu Met Val Lys Asn Phe Ile Pro Ser Glu Leu Glu
130 135 140
Ser Ile Leu Lys Lys Gly Arg Arg Lys Asn Asn Lys Asp Trp Thr Glu
145 150 155 160
Glu Asn Ile Lys Arg Val Leu Asn Ser Glu Phe Gly Arg Lys Asn Ser
165 170 175
Glu Gly Ser Ser Ala Leu Phe Asp Ser Phe Leu Ser Lys Phe Ser Gln
180 185 190
Glu Leu Phe Arg Lys Phe Asp Ser Trp Asn Glu Val Asn Lys Lys Tyr
195 200 205
Leu Glu Ala Ala Glu Leu Leu Asp Ser Met Leu Ala Ser Tyr Gly Pro
210 215 220
Phe Asp Ser Val Cys Lys Met Ile Gly Asp Ser Asp Ser Arg Asn Ser
225 230 235 240
Leu Pro Asp Lys Ser Thr Ile Ala Phe Thr Asn Asn Ala Glu Ile Thr
245 250 255
Val Asp Ile Glu Ser Ser Val Met Pro Tyr Met Ala Ile Ala Ala Leu
260 265 270
Leu Arg Glu Tyr Arg Gln Ser Lys Ser Lys Ala Ala Pro Val Ala Tyr
275 280 285
Val Gln Ser His Leu Thr Thr Thr Asn Gly Asn Gly Leu Ser Trp Phe
290 295 300
Phe Lys Phe Gly Leu Asp Leu Ile Arg Lys Ala Pro Val Ser Ser Lys
305 310 315 320
Gln Ser Thr Ser Asp Gly Ser Lys Ser Leu Gln Glu Leu Phe Ser Val
325 330 335
Pro Asp Asp Lys Leu Asp Gly Leu Lys Phe Ile Lys Glu Ala Cys Glu
340 345 350
Ala Leu Pro Glu Ala Ser Leu Leu Cys Gly Glu Lys Gly Glu Leu Leu
355 360 365
Gly Tyr Gln Asp Phe Arg Thr Ser Phe Ala Gly His Ile Asp Ser Trp
370 375 380
Val Ala Asn Tyr Val Asn Arg Leu Phe Glu Leu Ile Glu Leu Val Asn
385 390 395 400
Gln Leu Pro Glu Ser Ile Lys Leu Pro Ser Ile Leu Thr Gln Lys Asn
405 410 415
His Asn Leu Val Ala Ser Leu Gly Leu Gln Glu Ala Glu Val Ser His
420 425 430
Ser Leu Glu Leu Phe Glu Gly Leu Val Lys Asn Val Arg Gln Thr Leu
435 440 445
Lys Lys Leu Ala Gly Ile Asp Ile Ser Ser Ser Pro Asn Glu Gln Asp
450 455 460
Ile Lys Glu Phe Tyr Ala Phe Ser Asp Val Leu Asn Arg Leu Gly Ser
465 470 475 480
Ile Arg Asn Gln Ile Glu Asn Ala Val Gln Thr Ala Lys Lys Asp Lys
485 490 495
Ile Asp Leu Glu Ser Ala Ile Glu Trp Lys Glu Trp Lys Lys Leu Lys
500 505 510
Lys Leu Pro Lys Leu Asn Gly Leu Gly Gly Gly Val Pro Lys Gln Gln
515 520 525
Glu Leu Leu Asp Lys Ala Leu Glu Ser Val Lys Gln Ile Arg His Tyr
530 535 540
Gln Arg Ile Asp Phe Glu Arg Val Ile Gln Trp Ala Val Asn Glu His
545 550 555 560
Cys Leu Glu Thr Val Pro Lys Phe Leu Val Asp Ala Glu Lys Lys Lys
565 570 575
Ile Asn Lys Glu Ser Ser Thr Asp Phe Ala Ala Lys Glu Asn Ala Val
580 585 590
Arg Phe Leu Leu Glu Gly Ile Gly Ala Ala Ala Arg Gly Lys Thr Asp
595 600 605
Ser Val Ser Lys Ala Ala Tyr Asn Trp Phe Val Val Asn Asn Phe Leu
610 615 620
Ala Lys Lys Asp Leu Asn Arg Tyr Phe Ile Asn Cys Gln Gly Cys Ile
625 630 635 640
Tyr Lys Pro Pro Tyr Ser Lys Arg Arg Ser Leu Ala Phe Ala Leu Arg
645 650 655
Ser Asp Asn Lys Asp Thr Ile Glu Val Val Trp Glu Lys Phe Glu Thr
660 665 670
Phe Tyr Lys Glu Ile Ser Lys Glu Ile Glu Lys Phe Asn Ile Phe Ser
675 680 685
Gln Glu Phe Gln Thr Phe Leu His Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu
690 695 700
Leu Leu Arg Arg Ile Gln Lys Pro Ile Pro Ala Glu Ile Ala Phe Phe
705 710 715 720
Ser Leu Pro Gln Glu Tyr Tyr Asp Ser Leu Pro Pro Asn Val Ala Phe
725 730 735
Leu Ala Leu Asn Gln Glu Ile Thr Pro Ser Glu Tyr Ile Thr Gln Phe
740 745 750
Asn Leu Tyr Ser Ser Phe Leu Asn Gly Asn Leu Ile Leu Leu Arg Arg
755 760 765
Ser Arg Ser Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Trp Val Gly Asn Ser Lys
770 775 780
Leu Ile Tyr Ala Ala Lys Glu Ala Arg Leu Trp Lys Ile Pro Asn Ala
785 790 795 800
Tyr Trp Lys Ser Asp Glu Trp Lys Met Ile Leu Asp Ser Asn Val Leu
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Ala Arg Glu Asp Asp Gly Ala Thr Tyr Ile Ser Pro Ser Gln Ala Leu
50 55 60
Leu Glu Arg Arg Leu Leu Leu Gly Asp Ala Glu Asp Val Ala Ile Lys
65 70 75 80
Phe Leu Asp Val Leu Phe Lys Gly Gly Ala Pro Ser Ser Ser Cys Tyr
85 90 95
Ser Leu Phe Tyr Glu Asp Phe Ala Leu Arg Asp Lys Ala Lys Tyr Ser
100 105 110
Gly Ala Lys Arg Glu Phe Ile Glu Gly Leu Ala Thr Met Pro Leu Asp
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Lys Ile Ile Glu Arg Ile Arg Gln Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ile Pro
130 135 140
Ala Glu Glu Trp Leu Ile Leu Gly Ala Glu Tyr Ser Pro Glu Glu Ile
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225 230 235 240
Glu Phe Ala Glu Val Leu Glu Glu Lys Asn Tyr Gly Leu Gly Trp Tyr
245 250 255
Val Leu Trp Gln Gly Val Lys Gln Ala Leu Lys Glu Gln Lys Lys Pro
260 265 270
Thr Lys Ile Gln Ile Ala Val Asp Gln Leu Arg Gln Pro Lys Phe Ala
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290 295 300
Trp Lys Leu Lys Lys Arg Leu Glu Lys Arg Lys Ala Phe Pro Tyr Met
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Pro Asn Trp Asp Asn Asp Tyr Gln Ile Pro Val Gly Leu Thr Gly Leu
325 330 335
Gly Val Phe Thr Leu Glu Val Lys Arg Thr Glu Val Val Val Asp Leu
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355 360 365
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370 375 380
Lys Leu Lys Leu Arg Lys Arg Asp Ser Arg Val Glu Pro Thr Ile Gly
385 390 395 400
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420 425 430
Asp Asn Phe Gln Ile Ala Lys Arg Phe Phe Ser Ala Ala Lys Pro Asp
435 440 445
Lys Glu Val Ile Asn Gly Leu Pro Ser Glu Met Val Val Gly Ala Ala
450 455 460
Asp Leu Asn Leu Ser Asn Ile Val Ala Pro Val Lys Ala Arg Ile Gly
465 470 475 480
Lys Gly Leu Glu Gly Pro Leu His Ala Leu Asp Tyr Gly Tyr Gly Glu
485 490 495
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500 505 510
Glu Leu Ile Ser Leu Lys Arg Asp Ile Val Glu Ile Lys Ser Ala Ile
515 520 525
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530 535 540
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565 570 575
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580 585 590
Leu Arg Leu Leu Asp Ala Met Asp Ser Tyr Asn Ser Leu Leu Glu Ser
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Val Ala His Thr Ile Val Glu Tyr Phe Asp Asp Cys Asp Ile Val Phe
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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705 710 715 720
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725 730 735
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas12i1 sequence
<400> 104
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50 55 60
Asn Lys Asp Lys Ile Ser Asp Asp Leu Leu Leu Ala Val Asn Trp Phe
65 70 75 80
Lys Val Met Pro Ile Asn Ser Lys Pro Gln Gly Val Ser Pro Ser Asn
85 90 95
Leu Ala Asn Leu Phe Gln Gln Tyr Ser Gly Ser Glu Pro Asp Ile Gln
100 105 110
Ala Gln Glu Tyr Phe Ala Ser Asn Phe Asp Thr Glu Lys His Gln Trp
115 120 125
Lys Asp Met Arg Val Glu Tyr Glu Arg Leu Leu Ala Glu Leu Gln Leu
130 135 140
Ser Arg Ser Asp Met His His Asp Leu Lys Leu Met Tyr Lys Glu Lys
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Cys Ile Gly Leu Ser Leu Ser Thr Ala His Tyr Ile Thr Ser Val Met
165 170 175
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180 185 190
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Leu Lys Ile Val Gln Asp Tyr Glu Leu Gly Thr Asn His Asp Asp Glu
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Phe Glu Tyr Glu Cys Glu Trp Lys Cys Met Glu Lys Ile Lys Ala Phe
275 280 285
Leu Ala Ser Lys Val Gly Pro Tyr Tyr Leu Gly Ser Tyr Ser Ala Met
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835 840 845
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850 855 860
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<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
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435 440 445
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450 455 460
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Arg Trp Lys Lys His His Ile Pro Phe Tyr Asp Thr Arg Phe Phe Gln
485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
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565 570 575
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595 600 605
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Cys Phe Val Arg Phe Ile Ser Ser Gly Asp Ile Val Ser Ile Thr Glu
625 630 635 640
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675 680 685
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Lys Phe Asn Lys Glu Tyr Ala Tyr Leu Leu Arg Asp Ile Val Arg Gly
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770 775 780
Arg Lys Glu Phe Asp Pro Glu Leu Phe Ala Leu Leu Glu Lys Leu Glu
785 790 795 800
Leu Ile Arg Thr Arg Lys Lys Lys Gln Lys Val Glu Arg Ile Ala Asn
805 810 815
Ser Leu Ile Gln Thr Cys Leu Glu Asn Asn Ile Lys Phe Ile Arg Gly
820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
Met Lys Cys Arg Trp Ala Ala Ile Pro Val Lys Asp Ile Gly Asp Trp
900 905 910
Val Leu Arg Lys Leu Ser Gln Asn Leu Arg Ala Lys Asn Ile Gly Thr
915 920 925
Gly Glu Tyr Tyr His Gln Gly Val Lys Glu Phe Leu Ser His Tyr Glu
930 935 940
Leu Gln Asp Leu Glu Glu Glu Leu Leu Lys Trp Arg Ser Asp Arg Lys
945 950 955 960
Ser Asn Ile Pro Cys Trp Val Leu Gln Asn Arg Leu Ala Glu Lys Leu
965 970 975
Gly Asn Lys Glu Ala Val Val Tyr Ile Pro Val Arg Gly Gly Arg Ile
980 985 990
Tyr Phe Ala Thr His Lys Val Ala Thr Gly Ala Val Ser Ile Val Phe
995 1000 1005
Asp Gln Lys Gln Val Trp Val Cys Asn Ala Asp His Val Ala Ala
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Ala Asn Ile Ala Leu Thr Val Lys Gly Ile Gly Glu Gln Ser Ser
1025 1030 1035
Asp Glu Glu Asn Pro Asp Gly Ser Arg Ile Lys Leu Gln Leu Thr
1040 1045 1050
Ser
<210> 106
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 106
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 107
<211> 4092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 107
gccaccatgg ccccaaagaa gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgcc 60
accagatcct tcatcctgaa gatcgagccc aacgaggaag tgaagaaagg cctctggaaa 120
acccacgagg tgctgaacca cggaatcgcc tactacatga atatcctgaa gctgatccgg 180
caagaggcca tctacgagca ccacgagcag gaccccaaga atcccaagaa ggtgtccaag 240
gccgagatcc aggccgagct gtgggatttc gtgctgaaga tgcagaagtg caacagcttc 300
acacacgagg tggacaagga cgaggtgttc aacatcctga gagagctgta cgaggaactg 360
gtgcccagca gcgtggaaaa gaagggcgaa gccaaccagc tgagcaacaa gtttctgtac 420
cctctggtgg accccaacag ccagtctgga aagggaacag ccagcagcgg cagaaagccc 480
agatggtaca acctgaagat tgccggcgat cccggaggct ctggaggaag ctccgaagtc 540
gagttttccc atgagtactg gatgagacac gcattgactc tcgcaaagag ggctcgagat 600
gaacgcgagg tgcccgtggg ggcagtactc gtgctcaaca atcgcgtaat cggcgaaggt 660
tggaataggg caatcggact ccacgacccc actgcacatg cggaaatcat ggcccttcga 720
cagggagggc ttgtgatgca gaattatcga ctttatgatg cgacgctgta cgtcacgttt 780
gaaccttgcg taatgtgcgc gggagctatg attcactccc gcattggacg agttgtattc 840
ggtgttcgca acgccaagac gggtgccgca ggttcactga tggacgtgct gcatcatcca 900
ggcatgaacc accgggtaga aatcacagaa ggcatattgg cggacgaatg tgcggcgctg 960
ttgtgtcgtt tttttcgcat gcccaggcgg gtctttaacg cccagaaaaa agcacaatcc 1020
tctactgacg gctcttctgg atctgaaaca cctggcacaa gcgagagcgc cacccctgag 1080
agctctggct cctgggaaga agagaagaag aagtgggaag aagataagaa aaaggacccg 1140
ctggccaaga tcctgggcaa gctggctgag tacggactga tccctctgtt catcccctac 1200
accgacagca acgagcccat cgtgaaagaa atcaagtgga tggaaaagtc ccggaaccag 1260
agcgtgcggc ggctggataa ggacatgttc attcaggccc tggaacggtt cctgagctgg 1320
gagagctgga acctgaaagt gaaagaggaa tacgagaagg tcgagaaaga gtacaagacc 1380
ctggaagaga ggatcaaaga ggacatccag gctctgaagg ctctggaaca gtatgagaaa 1440
gagcggcaag aacagctgct gcgggacacc ctgaacacca acgagtaccg gctgagcaag 1500
agaggcctta gaggctggcg ggaaatcatc cagaaatggc tgaaaatgga cgagaacgag 1560
ccctccgaga agtacctgga agtgttcaag gactaccagc ggaagcaccc tagagaggcc 1620
ggcgattaca gcgtgtacga gttcctgtcc aagaaagaga accacttcat ctggcggaat 1680
caccctgagt acccctacct gtacgccacc ttctgcgaga tcgacaagaa aaagaaggac 1740
gccaagcagc aggccacctt cacactggcc gatcctatca atcaccctct gtgggtccga 1800
ttcgaggaaa gaagcggcag caacctgaac aagtacagaa tcctgaccga gcagctgcac 1860
accgagaagc tgaagaaaaa gctgacagtg cagctggacc ggctgatcta ccctacagaa 1920
tctggcggct gggaagagaa gggcaaagtg gacattgtgc tgctgcccag ccggcagttc 1980
tacaaccaga tcttcctgga catcgaggaa aagggcaagc acgccttcac ctacaaggat 2040
gagagcatca agttccctct gaagggcaca ctcggcggag ccagagtgca gttcgacaga 2100
gatcacctga gaagataccc tcacaaggtg gaaagcggca acgtgggcag aatctacttc 2160
aacatgaccg tgaacatcga gcctacagag tccccagtgt ccaagtctct gaagatccac 2220
cgggacgact tccccaaggt ggtcaacttc aagcccaaag aactgaccga gtggatcaag 2280
gacagcaagg gcaagaaact gaagtccggc atcgagtccc tggaaatcgg cctgagagtg 2340
atgagcatcg acctgggaca gagacaggcc gctgccgcct ctattttcga ggtggtggat 2400
cagaagcccg acatcgaagg caagctgttt ttcccaatca agggcaccga gctgtatgcc 2460
gtgcacagag ccagcttcaa catcaagctg cccggcgaga cactggtcaa gagcagagaa 2520
gtgctgcgga aggccagaga ggacaatctg aaactgatga accagaagct caacttcctg 2580
cggaacgtgc tgcacttcca gcagttcgag gacatcaccg agagagagaa gcgggtcacc 2640
aagtggatca gcagacaaga gaacagcgac gtgcccctgg tgtaccagga tgagctgatc 2700
cagatccgcg agctgatgta caagccttac aaggactggg tcgccttcct gaagcagctc 2760
cacaagagac tggaagtcga gatcggcaaa gaagtgaagc actggcggaa gtccctgagc 2820
gacggaagaa agggcctgta cggcatctcc ctgaagaaca tcgacgagat cgatcggacc 2880
cggaagttcc tgctgagatg gtccctgagg cctaccgaac ctggcgaagt gcgtagactg 2940
gaacccggcc agagattcgc catcgaccag ctgaatcacc tgaacgccct gaaagaagat 3000
cggctgaaga agatggccaa caccatcatc atgcacgccc tgggctactg ctacgacgtg 3060
cggaagaaga aatggcaggc taagaacccc gcctgccaga tcatcctgtt cgaggatctg 3120
agcaactaca acccctacga ggaaaggtcc cgcttcgaga acagcaagct catgaagtgg 3180
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<210> 108
<211> 1361
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 108
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<210> 109
<211> 4092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 109
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gacaaaggcg gcgagaagtt catcagcctg agcaaggatc ggaagtgcgt gaccacacac 3480
gccgacatca acgccgctca gaacctgcag aagcggttct ggacaagaac ccacggcttc 3540
tacaaggtgt actgcaaggc ctaccaggtg gacggccaga ccgtgtacat ccctgagagc 3600
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gttccagatt acgcttatcc ctacgacgtg cctgattatg catacccata tgatgtcccc 4080
gactatgcct aa 4092
<210> 110
<211> 1361
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 110
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1010 1015 1020
Gln Ala Lys Asn Pro Ala Cys Gln Ile Ile Leu Phe Glu Asp Leu
1025 1030 1035
Ser Asn Tyr Asn Pro Tyr Glu Glu Arg Ser Arg Phe Glu Asn Ser
1040 1045 1050
Lys Leu Met Lys Trp Ser Arg Arg Glu Ile Pro Arg Gln Val Ala
1055 1060 1065
Leu Gln Gly Glu Ile Tyr Gly Leu Gln Val Gly Glu Val Gly Ala
1070 1075 1080
Gln Phe Ser Ser Arg Phe His Ala Lys Thr Gly Ser Pro Gly Ile
1085 1090 1095
Arg Cys Ser Val Val Thr Lys Glu Lys Leu Gln Asp Asn Arg Phe
1100 1105 1110
Phe Lys Asn Leu Gln Arg Glu Gly Arg Leu Thr Leu Asp Lys Ile
1115 1120 1125
Ala Val Leu Lys Glu Gly Asp Leu Tyr Pro Asp Lys Gly Gly Glu
1130 1135 1140
Lys Phe Ile Ser Leu Ser Lys Asp Arg Lys Cys Val Thr Thr His
1145 1150 1155
Ala Asp Ile Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln Lys Arg Phe Trp Thr
1160 1165 1170
Arg Thr His Gly Phe Tyr Lys Val Tyr Cys Lys Ala Tyr Gln Val
1175 1180 1185
Asp Gly Gln Thr Val Tyr Ile Pro Glu Ser Lys Asp Gln Lys Gln
1190 1195 1200
Lys Ile Ile Glu Glu Phe Gly Glu Gly Tyr Phe Ile Leu Lys Asp
1205 1210 1215
Gly Val Tyr Glu Trp Val Asn Ala Gly Lys Leu Lys Ile Lys Lys
1220 1225 1230
Gly Ser Ser Lys Gln Ser Ser Ser Glu Leu Val Asp Ser Asp Ile
1235 1240 1245
Leu Lys Asp Ser Phe Asp Leu Ala Ser Glu Leu Lys Gly Glu Lys
1250 1255 1260
Leu Met Leu Tyr Arg Asp Pro Ser Gly Asn Val Phe Pro Ser Asp
1265 1270 1275
Lys Trp Met Ala Ala Gly Val Phe Phe Gly Lys Leu Glu Arg Ile
1280 1285 1290
Leu Ile Ser Lys Leu Thr Asn Gln Tyr Ser Ile Ser Thr Ile Glu
1295 1300 1305
Asp Asp Ser Ser Lys Gln Ser Met Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys
1310 1315 1320
Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp
1325 1330 1335
Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr
1340 1345 1350
Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1355 1360
<210> 111
<211> 4092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 111
gccaccatgg ccccaaagaa gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgcc 60
accagatcct tcatcctgaa gatcgagccc aacgaggaag tgaagaaagg cctctggaaa 120
acccacgagg tgctgaacca cggaatcgcc tactacatga atatcctgaa gctgatccgg 180
caagaggcca tctacgagca ccacgagcag gaccccaaga atcccaagaa ggtgtccaag 240
gccgagatcc aggccgagct gtgggatttc gtgctgaaga tgcagaagtg caacagcttc 300
acacacgagg tggacaagga cgaggtgttc aacatcctga gagagctgta cgaggaactg 360
gtgcccagca gcgtggaaaa gaagggcgaa gccaaccagc tgagcaacaa gtttctgtac 420
cctctggtgg accccaacag ccagtctgga aagggaacag ccagcagcgg cagaaagccc 480
agatggtaca acctgaagat tgccggcgat ccctcctggg aagaagagaa gaagaagtgg 540
gaagaagata agaaaaagga cccgctggcc aagatcctgg gcaagctggc tgagtacgga 600
ctgatccctc tgttcatccc ctacaccgac agcaacgagc ccatcgtgaa agaaatcaag 660
tggatggaaa agtcccggaa ccagagcgtg cggcggctgg ataaggacat gttcattcag 720
gccctggaac ggttcctgag ctgggagagc tggaacctga aagtgaaaga ggaatacgag 780
aaggtcgaga aagagtacaa gaccctggaa gagaggatca aagaggacat ccaggctctg 840
aaggctctgg aacagtatga gaaagagcgg caagaacagc tgctgcggga caccctgaac 900
accaacgagt accggctgag caagagaggc cttagaggct ggcgggaaat catccagaaa 960
tggctgaaaa tggacggagg ctctggagga agctccgaag tcgagttttc ccatgagtac 1020
tggatgagac acgcattgac tctcgcaaag agggctcgag atgaacgcga ggtgcccgtg 1080
ggggcagtac tcgtgctcaa caatcgcgta atcggcgaag gttggaatag ggcaatcgga 1140
ctccacgacc ccactgcaca tgcggaaatc atggcccttc gacagggagg gcttgtgatg 1200
cagaattatc gactttatga tgcgacgctg tacgtcacgt ttgaaccttg cgtaatgtgc 1260
gcgggagcta tgattcactc ccgcattgga cgagttgtat tcggtgttcg caacgccaag 1320
acgggtgccg caggttcact gatggacgtg ctgcatcatc caggcatgaa ccaccgggta 1380
gaaatcacag aaggcatatt ggcggacgaa tgtgcggcgc tgttgtgtcg tttttttcgc 1440
atgcccaggc gggtctttaa cgcccagaaa aaagcacaat cctctactga cggctcttct 1500
ggatctgaaa cacctggcac aagcgagagc gccacccctg agagctctgg cgagaacgag 1560
ccctccgaga agtacctgga agtgttcaag gactaccagc ggaagcaccc tagagaggcc 1620
ggcgattaca gcgtgtacga gttcctgtcc aagaaagaga accacttcat ctggcggaat 1680
caccctgagt acccctacct gtacgccacc ttctgcgaga tcgacaagaa aaagaaggac 1740
gccaagcagc aggccacctt cacactggcc gatcctatca atcaccctct gtgggtccga 1800
ttcgaggaaa gaagcggcag caacctgaac aagtacagaa tcctgaccga gcagctgcac 1860
accgagaagc tgaagaaaaa gctgacagtg cagctggacc ggctgatcta ccctacagaa 1920
tctggcggct gggaagagaa gggcaaagtg gacattgtgc tgctgcccag ccggcagttc 1980
tacaaccaga tcttcctgga catcgaggaa aagggcaagc acgccttcac ctacaaggat 2040
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gatcacctga gaagataccc tcacaaggtg gaaagcggca acgtgggcag aatctacttc 2160
aacatgaccg tgaacatcga gcctacagag tccccagtgt ccaagtctct gaagatccac 2220
cgggacgact tccccaaggt ggtcaacttc aagcccaaag aactgaccga gtggatcaag 2280
gacagcaagg gcaagaaact gaagtccggc atcgagtccc tggaaatcgg cctgagagtg 2340
atgagcatcg acctgggaca gagacaggcc gctgccgcct ctattttcga ggtggtggat 2400
cagaagcccg acatcgaagg caagctgttt ttcccaatca agggcaccga gctgtatgcc 2460
gtgcacagag ccagcttcaa catcaagctg cccggcgaga cactggtcaa gagcagagaa 2520
gtgctgcgga aggccagaga ggacaatctg aaactgatga accagaagct caacttcctg 2580
cggaacgtgc tgcacttcca gcagttcgag gacatcaccg agagagagaa gcgggtcacc 2640
aagtggatca gcagacaaga gaacagcgac gtgcccctgg tgtaccagga tgagctgatc 2700
cagatccgcg agctgatgta caagccttac aaggactggg tcgccttcct gaagcagctc 2760
cacaagagac tggaagtcga gatcggcaaa gaagtgaagc actggcggaa gtccctgagc 2820
gacggaagaa agggcctgta cggcatctcc ctgaagaaca tcgacgagat cgatcggacc 2880
cggaagttcc tgctgagatg gtccctgagg cctaccgaac ctggcgaagt gcgtagactg 2940
gaacccggcc agagattcgc catcgaccag ctgaatcacc tgaacgccct gaaagaagat 3000
cggctgaaga agatggccaa caccatcatc atgcacgccc tgggctactg ctacgacgtg 3060
cggaagaaga aatggcaggc taagaacccc gcctgccaga tcatcctgtt cgaggatctg 3120
agcaactaca acccctacga ggaaaggtcc cgcttcgaga acagcaagct catgaagtgg 3180
tccagacgcg agatccccag acaggttgca ctgcagggcg agatctatgg cctgcaagtg 3240
ggagaagtgg gcgctcagtt cagcagcaga ttccacgcca agacaggcag ccctggcatc 3300
agatgtagcg tcgtgaccaa agagaagctg caggacaatc ggttcttcaa gaatctgcag 3360
agagagggca gactgaccct ggacaaaatc gccgtgctga aagagggcga tctgtaccca 3420
gacaaaggcg gcgagaagtt catcagcctg agcaaggatc ggaagtgcgt gaccacacac 3480
gccgacatca acgccgctca gaacctgcag aagcggttct ggacaagaac ccacggcttc 3540
tacaaggtgt actgcaaggc ctaccaggtg gacggccaga ccgtgtacat ccctgagagc 3600
aaggaccaga agcagaagat catcgaagag ttcggcgagg gctacttcat tctgaaggac 3660
ggggtgtacg aatgggtcaa cgccggcaag ctgaaaatca agaagggcag ctccaagcag 3720
agcagcagcg agctggtgga tagcgacatc ctgaaagaca gcttcgacct ggcctccgag 3780
ctgaaaggcg aaaagctgat gctgtacagg gaccccagcg gcaatgtgtt ccccagcgac 3840
aaatggatgg ccgctggcgt gttcttcgga aagctggaac gcatcctgat cagcaagctg 3900
accaaccagt actccatcag caccatcgag gacgacagca gcaagcagtc tatgaaaagg 3960
ccggcggcca cgaaaaaggc cggccaggca aaaaagaaaa agggatccta cccatacgat 4020
gttccagatt acgcttatcc ctacgacgtg cctgattatg catacccata tgatgtcccc 4080
gactatgcct aa 4092
<210> 112
<211> 1361
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 112
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val
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Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala
35 40 45
Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ala Ile Tyr Glu
50 55 60
His His Glu Gln Asp Pro Lys Asn Pro Lys Lys Val Ser Lys Ala Glu
65 70 75 80
Ile Gln Ala Glu Leu Trp Asp Phe Val Leu Lys Met Gln Lys Cys Asn
85 90 95
Ser Phe Thr His Glu Val Asp Lys Asp Glu Val Phe Asn Ile Leu Arg
100 105 110
Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Val Pro Ser Ser Val Glu Lys Lys Gly Glu
115 120 125
Ala Asn Gln Leu Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn
130 135 140
Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ala Ser Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp
145 150 155 160
Tyr Asn Leu Lys Ile Ala Gly Asp Pro Ser Trp Glu Glu Glu Lys Lys
165 170 175
Lys Trp Glu Glu Asp Lys Lys Lys Asp Pro Leu Ala Lys Ile Leu Gly
180 185 190
Lys Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Pro Tyr Thr Asp
195 200 205
Ser Asn Glu Pro Ile Val Lys Glu Ile Lys Trp Met Glu Lys Ser Arg
210 215 220
Asn Gln Ser Val Arg Arg Leu Asp Lys Asp Met Phe Ile Gln Ala Leu
225 230 235 240
Glu Arg Phe Leu Ser Trp Glu Ser Trp Asn Leu Lys Val Lys Glu Glu
245 250 255
Tyr Glu Lys Val Glu Lys Glu Tyr Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ile Lys
260 265 270
Glu Asp Ile Gln Ala Leu Lys Ala Leu Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Arg
275 280 285
Gln Glu Gln Leu Leu Arg Asp Thr Leu Asn Thr Asn Glu Tyr Arg Leu
290 295 300
Ser Lys Arg Gly Leu Arg Gly Trp Arg Glu Ile Ile Gln Lys Trp Leu
305 310 315 320
Lys Met Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His
325 330 335
Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp
340 345 350
Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val
355 360 365
Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala
370 375 380
His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn
385 390 395 400
Tyr Arg Leu Tyr Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val
405 410 415
Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe
420 425 430
Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val
435 440 445
Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile
450 455 460
Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Arg Phe Phe Arg Met Pro
465 470 475 480
Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Gly
485 490 495
Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
500 505 510
Ser Ser Gly Glu Asn Glu Pro Ser Glu Lys Tyr Leu Glu Val Phe Lys
515 520 525
Asp Tyr Gln Arg Lys His Pro Arg Glu Ala Gly Asp Tyr Ser Val Tyr
530 535 540
Glu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Asn His Phe Ile Trp Arg Asn His Pro
545 550 555 560
Glu Tyr Pro Tyr Leu Tyr Ala Thr Phe Cys Glu Ile Asp Lys Lys Lys
565 570 575
Lys Asp Ala Lys Gln Gln Ala Thr Phe Thr Leu Ala Asp Pro Ile Asn
580 585 590
His Pro Leu Trp Val Arg Phe Glu Glu Arg Ser Gly Ser Asn Leu Asn
595 600 605
Lys Tyr Arg Ile Leu Thr Glu Gln Leu His Thr Glu Lys Leu Lys Lys
610 615 620
Lys Leu Thr Val Gln Leu Asp Arg Leu Ile Tyr Pro Thr Glu Ser Gly
625 630 635 640
Gly Trp Glu Glu Lys Gly Lys Val Asp Ile Val Leu Leu Pro Ser Arg
645 650 655
Gln Phe Tyr Asn Gln Ile Phe Leu Asp Ile Glu Glu Lys Gly Lys His
660 665 670
Ala Phe Thr Tyr Lys Asp Glu Ser Ile Lys Phe Pro Leu Lys Gly Thr
675 680 685
Leu Gly Gly Ala Arg Val Gln Phe Asp Arg Asp His Leu Arg Arg Tyr
690 695 700
Pro His Lys Val Glu Ser Gly Asn Val Gly Arg Ile Tyr Phe Asn Met
705 710 715 720
Thr Val Asn Ile Glu Pro Thr Glu Ser Pro Val Ser Lys Ser Leu Lys
725 730 735
Ile His Arg Asp Asp Phe Pro Lys Val Val Asn Phe Lys Pro Lys Glu
740 745 750
Leu Thr Glu Trp Ile Lys Asp Ser Lys Gly Lys Lys Leu Lys Ser Gly
755 760 765
Ile Glu Ser Leu Glu Ile Gly Leu Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly
770 775 780
Gln Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ile Phe Glu Val Val Asp Gln Lys
785 790 795 800
Pro Asp Ile Glu Gly Lys Leu Phe Phe Pro Ile Lys Gly Thr Glu Leu
805 810 815
Tyr Ala Val His Arg Ala Ser Phe Asn Ile Lys Leu Pro Gly Glu Thr
820 825 830
Leu Val Lys Ser Arg Glu Val Leu Arg Lys Ala Arg Glu Asp Asn Leu
835 840 845
Lys Leu Met Asn Gln Lys Leu Asn Phe Leu Arg Asn Val Leu His Phe
850 855 860
Gln Gln Phe Glu Asp Ile Thr Glu Arg Glu Lys Arg Val Thr Lys Trp
865 870 875 880
Ile Ser Arg Gln Glu Asn Ser Asp Val Pro Leu Val Tyr Gln Asp Glu
885 890 895
Leu Ile Gln Ile Arg Glu Leu Met Tyr Lys Pro Tyr Lys Asp Trp Val
900 905 910
Ala Phe Leu Lys Gln Leu His Lys Arg Leu Glu Val Glu Ile Gly Lys
915 920 925
Glu Val Lys His Trp Arg Lys Ser Leu Ser Asp Gly Arg Lys Gly Leu
930 935 940
Tyr Gly Ile Ser Leu Lys Asn Ile Asp Glu Ile Asp Arg Thr Arg Lys
945 950 955 960
Phe Leu Leu Arg Trp Ser Leu Arg Pro Thr Glu Pro Gly Glu Val Arg
965 970 975
Arg Leu Glu Pro Gly Gln Arg Phe Ala Ile Asp Gln Leu Asn His Leu
980 985 990
Asn Ala Leu Lys Glu Asp Arg Leu Lys Lys Met Ala Asn Thr Ile Ile
995 1000 1005
Met His Ala Leu Gly Tyr Cys Tyr Asp Val Arg Lys Lys Lys Trp
1010 1015 1020
Gln Ala Lys Asn Pro Ala Cys Gln Ile Ile Leu Phe Glu Asp Leu
1025 1030 1035
Ser Asn Tyr Asn Pro Tyr Glu Glu Arg Ser Arg Phe Glu Asn Ser
1040 1045 1050
Lys Leu Met Lys Trp Ser Arg Arg Glu Ile Pro Arg Gln Val Ala
1055 1060 1065
Leu Gln Gly Glu Ile Tyr Gly Leu Gln Val Gly Glu Val Gly Ala
1070 1075 1080
Gln Phe Ser Ser Arg Phe His Ala Lys Thr Gly Ser Pro Gly Ile
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Phe Lys Asn Leu Gln Arg Glu Gly Arg Leu Thr Leu Asp Lys Ile
1115 1120 1125
Ala Val Leu Lys Glu Gly Asp Leu Tyr Pro Asp Lys Gly Gly Glu
1130 1135 1140
Lys Phe Ile Ser Leu Ser Lys Asp Arg Lys Cys Val Thr Thr His
1145 1150 1155
Ala Asp Ile Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln Lys Arg Phe Trp Thr
1160 1165 1170
Arg Thr His Gly Phe Tyr Lys Val Tyr Cys Lys Ala Tyr Gln Val
1175 1180 1185
Asp Gly Gln Thr Val Tyr Ile Pro Glu Ser Lys Asp Gln Lys Gln
1190 1195 1200
Lys Ile Ile Glu Glu Phe Gly Glu Gly Tyr Phe Ile Leu Lys Asp
1205 1210 1215
Gly Val Tyr Glu Trp Val Asn Ala Gly Lys Leu Lys Ile Lys Lys
1220 1225 1230
Gly Ser Ser Lys Gln Ser Ser Ser Glu Leu Val Asp Ser Asp Ile
1235 1240 1245
Leu Lys Asp Ser Phe Asp Leu Ala Ser Glu Leu Lys Gly Glu Lys
1250 1255 1260
Leu Met Leu Tyr Arg Asp Pro Ser Gly Asn Val Phe Pro Ser Asp
1265 1270 1275
Lys Trp Met Ala Ala Gly Val Phe Phe Gly Lys Leu Glu Arg Ile
1280 1285 1290
Leu Ile Ser Lys Leu Thr Asn Gln Tyr Ser Ile Ser Thr Ile Glu
1295 1300 1305
Asp Asp Ser Ser Lys Gln Ser Met Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys
1310 1315 1320
Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp
1325 1330 1335
Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr
1340 1345 1350
Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1355 1360
<210> 113
<211> 4092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 113
gccaccatgg ccccaaagaa gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgcc 60
accagatcct tcatcctgaa gatcgagccc aacgaggaag tgaagaaagg cctctggaaa 120
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caagaggcca tctacgagca ccacgagcag gaccccaaga atcccaagaa ggtgtccaag 240
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gtgcccagca gcgtggaaaa gaagggcgaa gccaaccagc tgagcaacaa gtttctgtac 420
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agatggtaca acctgaagat tgccggcgat ccctcctggg aagaagagaa gaagaagtgg 540
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gccaagacag gcagccctgg catcagatgt agcgtcgtga ccaaagagaa gctgcaggac 2760
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gatgcgacgc tgtacgtcac gtttgaacct tgcgtaatgt gcgcgggagc tatgattcac 3300
tcccgcattg gacgagttgt attcggtgtt cgcaacgcca agacgggtgc cgcaggttca 3360
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ttggcggacg aatgtgcggc gctgttgtgt cgtttttttc gcatgcccag gcgggtcttt 3480
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<210> 114
<211> 1361
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 114
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<210> 115
<211> 4092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
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gttccagatt acgcttatcc ctacgacgtg cctgattatg catacccata tgatgtcccc 4080
gactatgcct aa 4092
<210> 116
<211> 1361
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 116
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Tyr Arg Leu Tyr Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys
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Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val
1130 1135 1140
Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu
1145 1150 1155
Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile
1160 1165 1170
Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Arg
1175 1180 1185
Phe Phe Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala
1190 1195 1200
Gln Ser Ser Thr Asp Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
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Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Leu Lys Ile Lys Lys
1220 1225 1230
Gly Ser Ser Lys Gln Ser Ser Ser Glu Leu Val Asp Ser Asp Ile
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Leu Lys Asp Ser Phe Asp Leu Ala Ser Glu Leu Lys Gly Glu Lys
1250 1255 1260
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1280 1285 1290
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1310 1315 1320
Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 117
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1 5
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas-phi-1 sequence
<400> 118
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130 135 140
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Ser Gln Lys Lys His Arg Arg Met Arg Gly Tyr Gly Leu Lys Ala Arg
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Trp Asn Val Met Thr Ala Thr Ser Thr Ile Leu Thr Asp Leu Phe Leu
465 470 475 480
Ala Arg Gly Gly Asp Pro Lys Lys Cys Met Phe Thr Ser Glu Pro Lys
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Ala Ala Glu
705
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas-phi-2 sequence
<400> 119
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas-phi-3 sequence
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Gly Lys Asn Ser Gly Lys Val Lys Phe Ser Asp Lys Thr Gly Arg Val
275 280 285
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Phe Leu Glu Glu Ser Lys Lys Val Ser Ala Leu Asp Ser Ile Leu Ala
305 310 315 320
Ile Ile Thr Ile Gly Asp Asp Trp Val Val Phe Asp Ile Arg Gly Leu
325 330 335
Tyr Arg Asn Val Phe Tyr Arg Glu Leu Ala Gln Lys Gly Leu Thr Ala
340 345 350
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435 440 445
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Ser Asp Ser Thr Arg Lys Asn Leu Asn Asp Ser Ile Trp Lys Leu Lys
565 570 575
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580 585 590
Ser Arg Ala Val Val Asn Tyr Thr Ile Arg Gln Ser Lys Leu Leu Ser
595 600 605
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Ser Ser Arg Lys Glu Asn Arg Trp Phe Ile Pro Ala Phe His Lys Ala
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<211> 765
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas-phi-4 sequence
<400> 121
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Ala Lys Leu Leu Arg Asp Arg Phe Pro Gly Lys Tyr Trp Leu Pro Lys
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Gly Asn Ala Ile Ser Leu His Gly Gly Val Leu Lys Lys Ile Asp Asn
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Gly Arg Arg Arg Arg Leu Ser Gly Ser Glu Ser Asn Met Arg Gln Lys
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Leu Arg Asn Leu Arg Trp Arg Glu Ser Lys Arg Gly Leu Ser Cys Asp
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420 425 430
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485 490 495
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Glu Ser Leu Trp Glu Val Lys Arg Thr Ser Ser Glu Tyr Ala Arg Leu
580 585 590
Ser Gln Arg Lys Lys Glu Met Ala Arg Arg Ala Val Asn Phe Val Val
595 600 605
Glu Ile Ser Arg Arg Lys Thr Gly Leu Ser Asn Val Ile Val Asn Ile
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Gly Trp Asp Gly Phe Phe Arg Pro Lys Ser Glu Asn Arg Trp Phe Ile
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675 680 685
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Lys Gly Cys Gly Ala Ser Met Asp Ala Asp Phe Asp Ala Ala Cys Arg
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725 730 735
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740 745 750
Asp His Ser Leu Ser His Asp Ala Ile Glu Lys Ala Ser
755 760 765
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<211> 793
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas-phi-5 sequence
<400> 122
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Gly Lys Val Leu Lys Lys Asp Gly Glu Glu Ala Ala Leu Ala Phe Leu
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145 150 155 160
Lys His Glu Ala Leu Asn Lys Lys Arg Arg Ala Ser Gly Glu Ala Glu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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260 265 270
Asn Phe Arg Lys Gly Arg Ile Arg Arg Ser Tyr Thr Ala Leu Tyr Ala
275 280 285
Lys Arg Asp Ser Arg Arg Val Arg Gln Gly Lys Leu Ala Leu Pro Ser
290 295 300
Tyr Arg His His Met Met Arg Leu Asn Ser Asn Ala Glu Ser Ala Ile
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325 330 335
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340 345 350
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500 505 510
Thr Met Gly Ser Asn Thr Ile His Ile Ala Lys Trp Val Met Arg His
515 520 525
Gly Asp Pro Ser Leu Val Glu Val Leu Glu Tyr Arg Lys Asp Asn Glu
530 535 540
Ile Lys Leu Asp Lys Asn Gly Val Pro Lys Lys Val Lys Leu Thr Asp
545 550 555 560
Lys Arg Ile Ala Asn Leu Thr Ser Ile Arg Leu Arg Phe Ser Gln Glu
565 570 575
Thr Ser Lys His Tyr Asn Asp Thr Met Trp Glu Leu Arg Arg Lys His
580 585 590
Pro Val Tyr Gln Lys Leu Ser Lys Ser Lys Ala Asp Phe Ser Arg Arg
595 600 605
Val Val Asn Ser Ile Ile Arg Arg Val Asn His Leu Val Pro Arg Ala
610 615 620
Arg Ile Val Phe Ile Ile Glu Asp Leu Lys Asn Leu Gly Lys Val Phe
625 630 635 640
His Gly Ser Gly Lys Arg Glu Leu Gly Trp Asp Ser Tyr Phe Glu Pro
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Lys Ser Glu Asn Arg Trp Phe Ile Gln Val Leu His Lys Ala Phe Ser
660 665 670
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690 695 700
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705 710 715 720
Thr Asp Phe Gly Thr Ala Pro Asp Asn Leu Val Lys Ile Ala Thr Thr
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Gly Lys Gly Leu Pro Gly Pro Lys Lys Arg Cys Lys Gly Ser Ser Lys
740 745 750
Gly Lys Asn Pro Lys Ile Ala Arg Ser Ser Glu Thr Gly Val Ser Val
755 760 765
Thr Glu Ser Gly Ala Pro Lys Val Lys Lys Ser Ser Pro Thr Gln Thr
770 775 780
Ser Gln Ser Ser Ser Gln Ser Ala Pro
785 790
<210> 123
<211> 441
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas-phi-6 sequence
<400> 123
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Gly Lys Lys Leu Leu Lys Glu Gly Glu Leu Lys Thr Ile Glu Tyr Met
35 40 45
Thr Gly Lys Gly Ser Ile Glu Pro Leu Pro Asn Phe Lys Pro Pro Val
50 55 60
Lys Cys Leu Ile Val Ala Lys Arg Arg Asp Leu Lys Tyr Phe Pro Ile
65 70 75 80
Cys Lys Ala Ser Cys Glu Ile Gln Ser Tyr Val Tyr Ser Leu Asn Tyr
85 90 95
Lys Asp Phe Met Asp Tyr Phe Ser Thr Pro Met Thr Ser Gln Lys Gln
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Ala Ile Lys Asn Asn Tyr Glu Phe Glu Glu Ile Lys Thr Phe Asn Asp
165 170 175
Asp Gly Cys Leu Ile Asn Lys Pro Gly Ile Asn Asn Val Ile Tyr Cys
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195 200 205
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210 215 220
Lys Tyr Val Ser Arg Leu Asp Ile Pro Glu Ser Gln Pro Gly His Val
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245 250 255
Arg Arg Arg Arg Lys Trp Tyr Ser Asn Gly Arg Asn Ile Ser Lys Gly
260 265 270
Tyr Ser Val Asp Gln Val Asn Gln Ala Lys Ile Glu Asp Ser Leu Leu
275 280 285
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<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas-phi-7 sequence
<400> 124
Met Ser Asn Thr Ala Val Ser Thr Arg Glu His Met Ser Asn Lys Thr
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340 345 350
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Asn Leu Ala Val Glu Arg Leu Ser Pro Glu His Lys Ser Glu Ile Leu
485 490 495
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500 505 510
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Glu Ala Ala Glu
770
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas-phi-8 sequence
<400> 125
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Asn Ala Val Asn Thr Tyr Lys Gly Val Gln Val Lys Val Asp Asn Lys
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210 215 220
Glu Pro Ile Val Ser Pro Tyr Gln Phe Asp Arg Leu Arg Ile Pro Ile
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Gly Glu Pro Gly Tyr Val Pro Lys Trp Gln Tyr Thr Phe Leu Ser Lys
245 250 255
Lys Glu Asn Lys Arg Arg Lys Leu Ser Lys Arg Ile Lys Asn Val Ser
260 265 270
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275 280 285
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Ile Asp Thr Lys Ala Asn Val Val Arg Phe Arg Tyr Lys Met Glu Asn
325 330 335
Gly Ile Val Asn Tyr Lys Pro Val Arg Glu Lys Lys Gly Lys Glu Leu
340 345 350
Leu Glu Asn Ile Cys Asp Gln Asn Gly Ser Cys Lys Leu Ala Thr Val
355 360 365
Asp Val Gly Gln Asn Asn Pro Val Ala Ile Gly Leu Phe Glu Leu Lys
370 375 380
Lys Val Asn Gly Glu Leu Thr Lys Thr Leu Ile Ser Arg His Pro Thr
385 390 395 400
Pro Ile Asp Phe Cys Asn Lys Ile Thr Ala Tyr Arg Glu Arg Tyr Asp
405 410 415
Lys Leu Glu Ser Ser Ile Lys Leu Asp Ala Ile Lys Gln Leu Thr Ser
420 425 430
Glu Gln Lys Ile Glu Val Asp Asn Tyr Asn Asn Asn Phe Thr Pro Gln
435 440 445
Asn Thr Lys Gln Ile Val Cys Ser Lys Leu Asn Ile Asn Pro Asn Asp
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Leu Pro Trp Asp Lys Met Ile Ser Gly Thr His Phe Ile Ser Glu Lys
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Ala Gln Val Ser Asn Lys Ser Glu Ile Tyr Phe Thr Ser Thr Asp Lys
485 490 495
Gly Lys Thr Lys Asp Val Met Lys Ser Asp Tyr Lys Trp Phe Gln Asp
500 505 510
Tyr Lys Pro Lys Leu Ser Lys Glu Val Arg Asp Ala Leu Ser Asp Ile
515 520 525
Glu Trp Arg Leu Arg Arg Glu Ser Leu Glu Phe Asn Lys Leu Ser Lys
530 535 540
Ser Arg Glu Gln Asp Ala Arg Gln Leu Ala Asn Trp Ile Ser Ser Met
545 550 555 560
Cys Asp Val Ile Gly Ile Glu Asn Leu Val Lys Lys Asn Asn Phe Phe
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Gly Gly Ser Gly Lys Arg Glu Pro Gly Trp Asp Asn Phe Tyr Lys Pro
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Lys Lys Glu Asn Arg Trp Trp Ile Asn Ala Ile His Lys Ala Leu Thr
595 600 605
Glu Leu Ser Gln Asn Lys Gly Lys Arg Val Ile Leu Leu Pro Ala Met
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625 630 635 640
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Lys Pro Val Arg Ala Arg Lys Ala Lys Ala Pro Glu Phe His Asp Lys
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Leu Ala Pro Ser Tyr Thr Val Val Leu Arg Glu Ala Val
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas-phi-9 sequence
<400> 126
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Leu Leu Val Val Met Arg Ile Lys Glu Asp Trp Val Val Phe Asp Val
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340 345 350
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Leu Asn Val Lys Ser Leu His Gly Lys Gly Ala Arg Glu Pro Gly Trp
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Cas-phi-10 sequence
<400> 127
Met Asp Met Leu Asp Thr Glu Thr Asn Tyr Ala Thr Glu Thr Pro Ala
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Gln Gln Gln Asp Tyr Ser Pro Lys Pro Pro Lys Lys Ala Gln Arg Ala
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Pro Lys Gly Phe Ser Lys Lys Ala Arg Pro Glu Lys Lys Pro Pro Lys
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Lys Pro Lys Gly Lys Arg Lys Ser Glu Ile Arg Ile Leu Lys Ile Arg
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610 615 620
Arg Lys Ala Gln Arg Glu Gln Leu Trp Lys Leu Gln Lys Ala Ser Ser
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Glu Phe Glu Arg Leu Ser Arg Tyr Lys Ile Asn Ile Ala Arg Ala Ile
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Ala Asn Trp Ala Leu Gln Trp Gly Arg Glu Leu Ser Gly Cys Asp Ile
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Gly Lys Gly Lys Trp Leu Leu Gly Trp Asp Asn Arg Phe Thr Pro Lys
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<210> 128
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<212> PRT
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1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Val Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Arg
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Glu Tyr Arg Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 131
<211> 1359
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 131
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Gly Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Ala Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Ile Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Arg Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Arg Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Ser Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Ala Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Gly Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly His Ser Leu
705 710 715 720
His Glu Gln Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr
755 760 765
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770 775 780
Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val
785 790 795 800
Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln
805 810 815
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820 825 830
Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Ile Lys Asp
835 840 845
Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly
850 855 860
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865 870 875 880
Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
885 890 895
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900 905 910
Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys
915 920 925
His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu
930 935 940
Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
945 950 955 960
Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu
965 970 975
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980 985 990
Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val
995 1000 1005
Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr
1025 1030 1035
Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn
1040 1045 1050
Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr
1055 1060 1065
Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg
1070 1075 1080
Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu
1085 1090 1095
Ile Gln Thr Val Gly Gln Asn Gly Gly Leu Phe Asp Asp Asn Pro
1100 1105 1110
Lys Ser Pro Leu Glu Val Thr Pro Ser Lys Leu Val Pro Leu Lys
1115 1120 1125
Lys Glu Leu Asn Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Tyr Gln Lys Pro Thr
1130 1135 1140
Thr Ala Tyr Pro Val Leu Leu Ile Thr Asp Thr Lys Gln Leu Ile
1145 1150 1155
Pro Ile Ser Val Met Asn Lys Lys Gln Phe Glu Gln Asn Pro Val
1160 1165 1170
Lys Phe Leu Arg Asp Arg Gly Tyr Gln Gln Val Gly Lys Asn Asp
1175 1180 1185
Phe Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Thr Leu Val Asp Ile Gly Asp Gly
1190 1195 1200
Ile Lys Arg Leu Trp Ala Ser Ser Lys Glu Ile His Lys Gly Asn
1205 1210 1215
Gln Leu Val Val Ser Lys Lys Ser Gln Ile Leu Leu Tyr His Ala
1220 1225 1230
His His Leu Asp Ser Asp Leu Ser Asn Asp Tyr Leu Gln Asn His
1235 1240 1245
Asn Gln Gln Phe Asp Val Leu Phe Asn Glu Ile Ile Ser Phe Ser
1250 1255 1260
Lys Lys Cys Lys Leu Gly Lys Glu His Ile Gln Lys Ile Glu Asn
1265 1270 1275
Val Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Ser Ala Ser Ile Glu Glu Leu Ala
1280 1285 1290
Glu Ser Phe Ile Lys Leu Leu Gly Phe Thr Gln Leu Gly Ala Thr
1295 1300 1305
Ser Pro Phe Asn Phe Leu Gly Val Lys Leu Asn Gln Lys Gln Tyr
1310 1315 1320
Lys Gly Lys Lys Asp Tyr Ile Leu Pro Cys Thr Glu Gly Thr Leu
1325 1330 1335
Ile Arg Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Val Asp Leu
1340 1345 1350
Ser Lys Ile Gly Glu Asp
1355
<210> 132
<211> 29
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization sequence
<400> 132
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Gly Ala Asp Lys Arg Thr Ala Asp
1 5 10 15
Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 133
<211> 23
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization sequence
<400> 133
Arg Lys Ser Gly Lys Ile Ala Ala Ile Val Val Lys Arg Pro Arg Lys
1 5 10 15
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 134
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 134
Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
1 5 10 15
Glu Ser Ser Gly
20
<210> 135
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 135
ggaggctctg gaggaagc 18
<210> 136
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 136
ggctcttctg gatctgaaac acctggcaca agcgagagcg ccacccctga gagctctggc 60
<210> 137
<211> 17
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization signal sequence
<400> 137
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 138
<211> 51
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
nuclear localization signal sequence
<400> 138
atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc c 51
<210> 139
<211> 178
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 139
Met Arg Arg Ala Phe Ile Thr Gly Val Phe Phe Leu Ser Glu Val Glu
1 5 10 15
Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg
20 25 30
Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val His Asn
35 40 45
Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile Gly Arg His Asp
50 55 60
Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val
65 70 75 80
Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Leu Glu
85 90 95
Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg
100 105 110
Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu
115 120 125
Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr
130 135 140
Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu Ser Asp Phe Phe
145 150 155 160
Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser
165 170 175
Thr Asp
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 140
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 141
<211> 1609
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 141
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Thr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser
180 185 190
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr
195 200 205
Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu
210 215 220
Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
225 230 235 240
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg
245 250 255
Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val
260 265 270
Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser
275 280 285
Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly
290 295 300
Gly Phe Met Gln Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys
305 310 315 320
Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu
325 330 335
Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp
340 345 350
Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile
355 360 365
Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg
370 375 380
Met Leu Ala Ser Ala Lys Phe Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu
385 390 395 400
Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys
405 410 415
Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu
420 425 430
Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe
435 440 445
Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser
450 455 460
Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
465 470 475 480
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Arg Ala Phe
485 490 495
Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Ala Arg Lys Glu Tyr Arg Ser Thr Lys
500 505 510
Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr
515 520 525
Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly
530 535 540
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
545 550 555 560
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
565 570 575
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
580 585 590
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
595 600 605
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
610 615 620
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
625 630 635 640
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
645 650 655
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
660 665 670
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
675 680 685
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
690 695 700
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
705 710 715 720
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
725 730 735
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
740 745 750
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
755 760 765
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
770 775 780
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
785 790 795 800
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
805 810 815
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
820 825 830
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
835 840 845
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
850 855 860
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
865 870 875 880
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
885 890 895
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
900 905 910
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
915 920 925
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
930 935 940
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
945 950 955 960
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
965 970 975
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
980 985 990
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
995 1000 1005
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala
1010 1015 1020
Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe
1025 1030 1035
Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu
1040 1045 1050
Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu
1055 1060 1065
Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu
1070 1075 1080
Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala
1085 1090 1095
Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe
1100 1105 1110
Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr
1115 1120 1125
Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val
1130 1135 1140
Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu
1145 1150 1155
Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu
1160 1165 1170
Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp
1175 1180 1185
Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe
1190 1195 1200
Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly
1205 1210 1215
Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys
1220 1225 1230
Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
1235 1240 1245
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr
1250 1255 1260
Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp
1265 1270 1275
Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile
1280 1285 1290
Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val
1295 1300 1305
Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met
1310 1315 1320
Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg
1325 1330 1335
Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser
1340 1345 1350
Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn
1355 1360 1365
Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr
1370 1375 1380
Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val
1385 1390 1395
Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp
1400 1405 1410
Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp
1415 1420 1425
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1430 1435 1440
Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp
1445 1450 1455
Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys
1460 1465 1470
Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
1475 1480 1485
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr
1490 1495 1500
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1520 1525 1530
Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr
1535 1540 1545
Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys
1550 1555 1560
Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(21)
<223> This sequence may encompass 1, 3, or 7 "Gly Gly Ser"
repeating units
<400> 165
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser
20
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 166
gctggcagca agggcggcgc tgg 23
<210> 167
<211> 23
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 167
gcagccgcac cctcaagcaa cgg 23
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 168
gtagctgact cactgctagc tgg 23
<210> 169
<211> 23
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 169
gagtccgagc agaagaagaa ggg 23
<210> 170
<211> 23
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 170
gatgagaagg agaagttctt agg 23
<210> 171
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 171
gcuggcagca agggcggcgc ugg 23
<210> 172
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 172
gcagccgcac ccucaagcaa cgg 23
<210> 173
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 173
guagcugacu cacugcuagc ugg 23
<210> 174
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 174
gaguccgagc agaagaagaa ggg 23
<210> 175
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 175
gaugagaagg agaaguucuu agg 23
<210> 176
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 176
gacaagaaag ggacugaagc 20
<210> 177
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 177
aucgacaaga aagggacuga 20
<210> 178
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 178
acacaccggu ugguggccuc 20
<210> 179
<211> 28
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(27)
<400> 179
atc gac aag aaa ggg act gaa gct gct g 28
Ile Asp Lys Lys Gly Thr Glu Ala Ala
1 5
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
target sequence
<400> 180
Ile Asp Lys Lys Gly Thr Glu Ala Ala
1 5
<210> 181
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> This sequence may encompass 1-30 "Ser Gly Gly Ser"
repeating units
<400> 181
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
50 55 60
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
65 70 75 80
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
85 90 95
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
115 120
<210> 182
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> This sequence may encompass 1-30 "Gly Gly Gly Ser"
repeating units
<400> 182
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
115 120
<210> 183
<211> 150
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(150)
<223> This sequence may encompass 1-30 "Gly Gly Gly Gly Ser"
repeating units
<400> 183
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150
<210> 184
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> This sequence may encompass 1-30 residues
<400> 184
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 185
<211> 150
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(150)
<223> This sequence may encompass 1-30 "Glu Ala Ala Ala Lys"
repeating units
<400> 185
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
35 40 45
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
50 55 60
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
85 90 95
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
100 105 110
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
115 120 125
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
130 135 140
Lys Glu Ala Ala Ala Lys
145 150
<210> 186
<211> 90
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(90)
<223> This sequence may encompass 1-30 "Gly Gly Ser"
repeating units
<400> 186
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
85 90
<210> 187
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(60)
<223> This sequence may encompass 1-30 "Xaa Pro"
repeating units
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (47)..(47)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (51)..(51)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (53)..(53)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (55)..(55)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (57)..(57)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> Any amino acid
<400> 187
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
1 5 10 15
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
20 25 30
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
35 40 45
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
50 55 60
Claims (125)
- 제1항에 있어서, 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호: 1의 V82T 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 추가로 포함하는, 아데노신 데아미나제.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 1의 21, 23, 25, 38, 51, 54, 70, 71, 72, 73, 94, 124, 133, 139, 146, 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 2 개 이상의 아미노산 위치에서 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변경 중 2 개 이상을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변경 중 3 개 이상을 포함하는, 아데노신 데아미나제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 변경: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및 Q154R 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 아데노신 데아미나제.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제가 하기 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함하는 것인, 아데노신 데아미나제:
E25F + V82S + Y123H;
T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K;
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K_V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M_V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; 또는
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 및 157로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에서 시작하는 C 말단의 결실을 포함하는, 아데노심 데아미나제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및 Q154R로 이루어진 군으로부터 선택된 변경을 추가로 포함하는, 아데노신 데아미나제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표 14, 표 18, 또는 도 3a-3c에 기재된 아데노신 데아미나제 변이체인, 아데노신 데아미나제.
- 제12항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체인 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함하는 융합 단백질.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 서열번호: 1의 V82T 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 추가로 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인, 및 변경 V82T 및 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체인 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함하는 융합 단백질.
- 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 서열번호: 1의 21, 23, 25, 38, 51, 54, 70, 71, 72, 73, 94, 124, 133, 139, 146, 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 2 개 이상의 아미노산 위치에서 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 상기 변경 중 2 개 이상을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 상기 변경 중 3 개 이상을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 다음 변경: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및 Q154R 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 하기 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함하는 것인, 융합 단백질:
E25F + V82S + Y123H;
T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K;
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; 또는
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R. - 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 및 157로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기에서 시작하는 C 말단의 결실을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기 도메인이 아데노신 데아미나제 변이체 단량체를 포함하되, 상기 아데노신 데아미나제 단량체는 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, V82T, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기 도메인이 야생형 아데노신 데아미나제 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체를 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제24항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및 Q154R로 이루어진 군으로부터 선택된 변경을 추가로 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기 도메인이 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 포함하는 아데노신 데아미나제 이종이량체를 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제26항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 2 개 이상의 변경을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기가 TadA*7.10 도메인 및 하기 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 이종이량체를 포함하는 것인, 융합 단백질:
E25F + V82S + Y123H;
T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K;
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; 또는
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R. - 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 표 14, 표 18, 또는 도 3a-3c에 기재된 ABE9 또는 TadA*9 데아미나제 변이체인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 전장 ABE9에 비해 1, 2, 3, 4, 5 ,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기가 누락되어 있는 절두된 ABE8 또는 ABE9인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이 Cas9, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 또는 Cas12j/CasΦ 도메인인, 융합 단백질.
- 하기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 서열번호: 1의 21, 23, 25, 38, 51, 54, 70, 71, 72, 73, 94, 124, 133, 138, 139, 146, 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 변경을 포함하는 아데노신 데아미나제 변이체를 포함하는 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함하는 융합 단백질로서,
상기 굵은 글씨 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 나타내고, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 나타내고, 밑줄 친 서열은 이분 핵 국소화 서열을 나타내는 것인, 융합 단백질. - 제32항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, M94V, P124W, T133K, D138M, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 변경을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제33항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 서열번호: 1의 변경 V82T를 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 상기 변경 중 2 개 이상을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 상기 변경 중 3 개 이상을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및 Q154R로 이루어진 군으로부터 선택된 변경을 추가로 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 다음 변경: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및 Q154R 중 2 개 이상을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제32항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 하기 변경의 그룹 중 임의의 하나:
E25F + V82S + Y123H;
T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K;
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K;
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 또는
또는 표 14의 임의의 다른 변경 또는 이의 그룹을 포함하는 것인, 융합 단백질. - 제12항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9(SaCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 1 Cas9(St1Cas9), 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9(SpCas9), 또는 이의 변이체인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이 변경된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 특이성을 갖는 변형된 SaCas9를 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제41항에 있어서, 상기 변형된 SaCas9가 아미노산 치환 E782K, N968K, 및 R1015H, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이 변경된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 특이성을 갖는 SpCas9의 변이체를 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제43항에 있어서, 상기 변경된 PAM이 핵산 서열 5'-NGA-3', 5'-NGC-3', 5'-NGG-3', 5'-NGT-3', 또는 5'-NGN-3'에 대해 특이성을 갖는 것인, 융합 단백질.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 변이체 SpCas9가,
D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환;
I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER) 또는 이의 상응하는 아미노산 치환;
I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G 또는 이의 상응하는 아미노산 치환으로부터 선택된 아미노산 치환; 또는 도 3a-3c에 제시된 바와 같은 아미노산 치환을 포함하는 것인, 융합 단백질. - 제12항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이 뉴클레아제 불활성 또는 닉카제 변이체인, 융합 단백질.
- 제46항에 있어서, 상기 닉카제 변이체가 아미노산 치환 D10A 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 도메인이 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌을 탈아미노화할 수 있는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제가 자연에서 발생하지 않는 변형된 아데노신 데아미나제인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제가 TadA 데아미나제인, 융합 단백질.
- 제50항에 있어서, 상기 TadA 데아미나제가 TadA*7.10 변이체인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 아데노신 데아미나제 도메인 사이에 링커를 포함하는, 융합 단백질.
- 제52항에 있어서, 상기 링커가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질:
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES. - 제12항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 핵 국소화 신호를 포함하는, 융합 단백질.
- 제54항에 있어서, 상기 핵 국소화 신호가 이분 핵 국소화 신호인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9가 StCas9인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9가 SaCas9 또는 SpCas9인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9가 변형된 SaCas9 또는 변형된 SpCas9인, 융합 단백질.
- 제58항에 있어서, 상기 변형된 SaCas9가 아미노산 치환 E782K, N968K, 및 R1015H, 또는 이의 상응하는 아미노산 치환을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제12항 내지 제60항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제12항 내지 제60항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및
유전 질환과 연관된 SNP의 AㆍT에서 GㆍC로의 변경에 영향을 미치도록 염기 편집기를 표적화하는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를
세포, 또는 이의 전구체 내에 도입함으로써 생성되는 세포. - 제62항에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인, 세포.
- 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 세포가 시험관내 또는 생체내에 있는 것인, 세포.
- 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환이 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)인, 세포.
- 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질 및 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드가 세포에서 복합체를 형성하는 것인, 세포.
- 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항의 세포로부터 단리된 세포 또는 증식되거나 또는 확장된 세포 집단.
- 유전 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전 질환을 치료하는 방법으로서, 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항의 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제68항에 있어서, 상기 세포가 대상체에 대해 자가, 동종이계, 또는 이종이계인, 방법.
- 제70항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 서열번호: 1의 R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, V82T, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K로 이루어진 군으로부터 선택된 변경, 또는 또 다른 아데노신 데아미나제에서 상응하는 변경을 포함하는, 염기 편집기 시스템.
- 제70항 또는 제71항에 있어서, 유전 질환과 연관된 SNP의 AㆍT에서 GㆍC로의 변경에 영향을 미치도록 염기 편집기 도메인을 표적화하는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 염기 편집기 시스템.
- 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌을 탈아미노화할 수 있는 것인, 염기 편집기 시스템.
- 제73항에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드가 리보핵산(RNA), 또는 데옥시리보핵산(DNA)을 포함하는 것인, 염기 편집기 시스템.
- 제74항에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드가 CRISPR RNA(crRNA) 서열, 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA) 서열, 또는 이의 조합을 포함하는 것인, 염기 편집기 시스템.
- 제72항에 있어서, 제2 가이드 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 염기 편집기 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 제2 가이드 폴리뉴클레오티드가 리보핵산(RNA), 또는 데옥시리보핵산(DNA)을 포함하는 것인, 염기 편집기 시스템.
- 제76항에 있어서, 상기 제2 가이드 폴리뉴클레오티드가 CRISPR RNA(crRNA) 서열, 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA) 서열, 또는 이의 조합을 포함하는 것인, 염기 편집기 시스템.
- 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인이 Cas9, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 또는 Cas12j/CasΦ 도메인을 포함하는 것인, 염기 편집기 시스템.
- 제79항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인이 뉴클레아제 사멸인, 염기 편집기 시스템.
- 제79항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인이 닉카제인, 염기 편집기 시스템.
- 제79항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인이 Cas9 도메인인, 염기 편집기 시스템.
- 제82항에 있어서, 상기 Cas9 도메인이 뉴클레아제 사멸 Cas9(dCas9), Cas9 닉카제(nCas9), 또는 뉴클레아제 활성 Cas9를 포함하는 것인, 염기 편집기 시스템.
- 제83항에 있어서, 상기 Cas9 도메인이 Cas9 닉카제를 포함하는 것인, 염기 편집기 시스템.
- 제70항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인이 조작된 또는 변형된 폴리뉴클레오티드-프로그램가능한 DNA-결합 도메인인, 염기 편집기 시스템.
- 제72항에 있어서, 상기 유전 질환이 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)인, 염기 편집기 시스템.
- 폴리뉴클레오티드에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 교정하는 방법으로서,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 역 보체에 위치한 적어도 일부인 표적 뉴클레오티드 서열을, 제12항 내지 제60항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항의 염기 편집기 시스템과 접촉시키는 단계; 및 표적 뉴클레오티드 서열에 염기 편집기의 표적화 시 SNP 또는 이의 보체 핵염기를 탈아미노화함으로써 SNP를 편집하는 단계이되, 상기 SNP 또는 이의 보체 핵염기를 탈아미노화하는 것은 SNP를 교정하는 것인, 방법. - 제87항에 있어서, 상기 SNP가 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)과 연관되는 것인, 방법.
- 제87항 또는 제88항에 있어서, 상기 SNP가 SERPINA1 유전자 내에 있고 교정이 E342K (PiZ 대립유전자) 변경을 포함하는 것인, 방법.
- 폴리뉴클레오티드를 편집하는 방법으로서, 표적 뉴클레오티드 서열을 제12항 내지 제60항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항의 염기 편집기 시스템과 접촉시켜, 폴리뉴클레오티드를 편집하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제90항에 있어서, 상기 편집이 20% 미만의 indel 형성, 15% 미만의 indel 형성, 10% 미만의 indel 형성; 5% 미만의 indel 형성; 4% 미만의 indel 형성; 3% 미만의 indel 형성; 2% 미만의 indel 형성; 1% 미만의 indel 형성; 0.5% 미만의 indel 형성; 또는 0.1% 미만의 indel 형성을 초래하는 것인, 방법.
- 제91항에 있어서, 상기 편집이 전좌를 초래하지 않는 것인, 방법.
- 하기로부터 선택된 TadA*7.10 아데노신 데아미나제 변이체 도메인 및 Cas9 엔도뉴클레아제 도메인을 포함하는 ABE9:
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+A109S를 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+T111R을 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+D119N을 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+H122N을 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147d+Q154S를 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+F149Y를 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+T166I를 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9; 및
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+D167N을 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9.
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+L36H+N157K를 갖는 모노 TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147D+Q154S+F149Y+D167N+L36H+N157K를 갖는 모노 TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 I76Y+V82T+Y147D+Q154S+F149Y+D167N+L36H+N157K+V106W를 갖는 모노TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
서열번호: 1의 돌연변이 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N을 갖는 모노 TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G, MQKFRAER을 갖는 spCas9; 및
서열번호: 1의 돌연변이 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N + V106W를 갖는 모노 TadA*7.10, 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
및 유전 질환과 연관된 SNP의 AㆍT에서 GㆍC로의 변경에 영향을 미치도록 아데노신 데아미나제 변이체 도메인을 표적화하는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 염기 편집기. - 제93항에 있어서, 상기 SNP가 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)과 연관되는 것인, 염기 편집기.
- 하기로부터 선택된 TadA 아데노신 데아미나제 도메인 및 SpCas9 엔도뉴클레아제 도메인을 포함하는 ABE9 염기 편집기를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터:
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+A109S를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+T111R을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+D119N을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+H122N을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147d+Q154S를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+F149Y를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+T166I를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9; 및
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+D167N을 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9.
돌연변이 I76Y+V82T+Y147T+Q154S+L36H+N157K를 갖는 모노 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147D+Q154S+F149Y+D167N+L36H+N157K를 갖는 모노 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 SpCas9;
돌연변이 I76Y+V82T+Y147D+Q154S+F149Y+D167N+L36H+N157K+V106W를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G, (MQKFRAER)을 갖는 SpCas9
돌연변이 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N을 갖는 모노 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 SpCas9; 및
돌연변이 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N + V106W를 갖는 모노 TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G,R654L,R753G, R1114G(MQKFRAER)를 갖는 SpCas9. - 제95항에 있어서, 플라스미드, 바이러스, 또는 mRNA 벡터인, 벡터.
- 제12항 내지 제60항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항의 염기 편집기 시스템을 포함하는 조성물.
- 제97항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 또는 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
- 가이드 RNA에 결합된 제12항 내지 제60항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 조성물로서, 상기 가이드 RNA가 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)과 연관된 SERPINA1 유전자에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 가이드 RNA에 결합된 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항의 염기 편집기 시스템을 포함하는 조성물로서, 상기 가이드 RNA가 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)과 연관된 SERPINA1 유전자에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌을 탈아미노화할 수 있는 것인, 조성물.
- 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질 또는 염기 편집기 시스템이
(i) Cas9 닉카제를 포함하거나;
(ii) 뉴클레아제 불활성 Cas9를 포함하거나;
(iii) 도 3a-3c에 제시된 아미노산 치환의 조합을 포함하는 SpCas9 변이체를 포함하거나; 또는
(iv) I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER); 또는 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G, R1114G, (MQKFRAER)로부터 선택된 아미노산 서열 치환의 조합을 포함하는 SpCas9 변이체를 포함하는 것인, 조성물. - 제99항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 또는 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제98항의 조성물을 포함하는 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제학적 조성물.
- 제104항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)인, 약제학적 조성물.
- 제105항에 있어서, 상기 융합 단백질 또는 염기 편집기 시스템이 가이드 RNA에 결합되되, 상기 가이드 RNA는 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)과 연관된 SERPINA1 유전자에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제106항에 있어서, 상기 gRNA 및 염기 편집기가 함께 또는 별도로 제형화되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제98항, 또는 제103항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 세포에서 발현에 적합한 벡터를 추가로 포함하되, 상기 벡터는 염기 편집기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제109항에 있어서, 상기 염기 편집기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 mRNA인, 약제학적 조성물.
- 제109항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
- 제111항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 또는 아데노-연관 바이러스 벡터(AAV)인, 약제학적 조성물.
- 제98항, 또는 제103항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 세포에서 발현에 적합한 리보핵입자를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제98항, 또는 제103항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 지질을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
- 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)을 치료하는 방법으로서, 제98항 또는 제103항 내지 제114항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 대상체에서 알파-1 항트립신 결핍증(A1AD)의 치료에서 제98항 또는 제103항 내지 제114항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도.
- 제115항 또는 제116항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법 또는 용도.
- 제70항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 변이체가 하기 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함하는 것인, 염기 편집기 시스템:
E25F + V82S + Y123H;
T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R;
L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R;
P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K;
N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R;
E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R;
M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R;
Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
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I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R;
N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
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V82S + Q154R;
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Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R;
V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R;
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V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; 또는
M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R. - 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 변이체가 하기 아미노산 변경 또는 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함하는 TadA*7.10 변이체인, 아데노신 데아미나제, 융합 단백질, 염기 편집기, 또는 염기 편집기 시스템:
V82T;
I76Y + V82T; 또는
I76Y + V82T + Y147T + Q154S. - 하기 아미노산 변경 또는 변경의 그룹 중 임의의 하나를 포함하는 TadA*7.10 변이체인 아데노신 데아미나제 변이체:
V82T;
I76Y + V82T; 또는
I76Y + V82T + Y147T + Q154S. - 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 하기 아미노산 변경 또는 변경의 그룹 중 임의이 하나를 포함하는 TadA*7.10 아데노신 데아미나제 변이체인 적어도 하나의 염기 편집기 도메인을 포함하는 융합 단백질:
V82T;
I76Y + V82T; 또는
I76Y + V82T + Y147T + Q154S. - 제121항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이 Cas9 엔도뉴클레아제 도메인을 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제122항에 있어서, 상기 Cas9 엔도뉴클레아제 도메인이 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9를 포함하는 것인, 융합 단백질.
- 제121항에 있어서 또는 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TadA7*10이 단량체성인, 아데노신 데아미나제 변이체 또는 융합 단백질.
- 하기로부터 선택된 TadA*7.10 아데노신 데아미나제 변이체 도메인 및 Cas9 엔도뉴클레아제 도메인을 포함하는 핵염기 편집기:
돌연변이 V82T를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9;
돌연변이 I76Y + V82T를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9; 또는
돌연변이 I76Y + V82T + Y147T + Q154S를 갖는 모노TadA*7.10 및 돌연변이 I322V, S409I, E427G, R654L, R753G(MQKFRAER)를 갖는 spCas9.
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