KR20240012377A

KR20240012377A - 염기 편집기의 자기-불활성화용 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20240012377A
Application number: KR1020237039212A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 브라이슨; 잭 설리번
Original assignee: 빔 테라퓨틱스, 인크.
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2022-05-27
Publication date: 2024-01-29
Also published as: CA3219628A1; WO2022251687A2; EP4346840A2; AU2022280952A1; AU2022280952A9; WO2022251687A3; CN117729926A

Abstract

본 발명은 데아미나아제 또는 napDNAbp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 포함하는 데아미아나제 또는 napDNAbp 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 여기에 개시되며, 추가로 여기서 인트론은 mRNA 편집의 스플라이싱을 감소시키는 기능을 하는 변경된 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 가진다. 또한 인트론을 포함하는 염기 편집기 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 개시되며, 여기서 염기 편집기는 napDNAbp 도메인 또는 데아미나아제 도메인을 포함한다.

Description

염기 편집기의 자기-불활성화용 조성물 및 방법

본 발명은 염기 편집기의 자기-불활성화용 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2021년 5월 28일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/194,431의 우선권 및 이익을 주장하며, 이들 내용 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하고 있으며 그 전문이 참조로 포함된다. 2022년 5월 27일에 생성된 ASCII 사본의 이름은 180802-049001PCT_SL.txt이고 크기는 2,089,884바이트이다.

진핵생물에 CRISPR-Cas 시스템을 적용하고 염기 편집의 출현과 같은 유전자 편집 기술의 발전으로 다양한 세포 유형과 유기체에서 게놈을 효율적으로 편집할 수 있게 되었으며, 인간의 유전질환을 치료하기 위한 사용가능한 접근법이 빠르게 확장되었다. CRISPR-Cas 시스템과 염기 편집은 관심 게놈 표적에 대해 고도로 특이적일 수 있으나, 발현이 장기간 지속될 경우 발생할 가능성이 더 높은 잠재적 표적 외의 편집 현상을 완화하기 위하여 세포에서 게놈 변형 툴의 일시적 발현이 선호된다. 따라서 특히 아데노-연관 바이러스(AAV) 형질도입, DNA 형질감염, 또는 기타 방법을 통한 것과 같이 장기간 발현을 초래할 수 있는 전달 방법을 활용하는 경우, 성공적인 표적 편집 이후에 편집 활동을 억제하거나 중단하는 방법은 특히 광범위한 관심을 끌고 있다.

아래 기술된 바와 같이, 본 발명은 자기-불활성화 염기 편집기 및 관련 조성물 및 방법을 특징으로 한다.

발명의 요약

일 측면에서, 본 개시 발명은 데아미나아제 도메인 또는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다. 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유한다. 인트론은 데아미나아제, napDNAbp 또는 이의 단편을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 삽입된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 인트론을 함유하는 데아미나아제 도메인 또는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다. 인트론은 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위에 변경(alteration)을 포함한다. 변경은 염기 편집기 mRNA의 스플라이싱을 감소시키거나 제거하여 염기 편집기 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 염기 편집기 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다. 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유한다. 인트론은 염기 편집기 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 삽입된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 인트론을 함유하는 염기 편집기 오픈 리딩 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다. 인트론에는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위에 변경이 포함되어 있다. 변경은 염기 편집기 mRNA의 스플라이싱을 감소시키거나 제거하여 염기 편집기 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인 또는 데아미나아제 도메인을 함유하는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다. 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유한다. 인트론은 napDNAbp 도메인 또는 데아미나아제 도메인을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 삽입된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인, 및 데아미나아제 도메인, 또는 이의 단편을 함유하는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다. 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유하는 염기 편집기 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 인트론은 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위에 변경을 함유한다. 변경은 염기 편집기 mRNA의 스플라이싱을 감소시킨다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 (i) 데아미나아제 도메인 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 함유하되, 여기서 napDNAbp 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N와 융합되는 것인 조성물을 특징으로 한다. 조성물은 또한 (ii) napDNAbp 도메인의 C-말단 단편을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하되, 여기서 napDNAbp 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C와 융합되는 것인, 조성물을 함유한다. 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유하고, 여기서 인트론은 폴리뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임에 삽입된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 (i) 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 함유하되, 여기서 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N과 융합되는 것인, 조성물을 특징으로 한다. 조성물은 또한 (ii) 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하되, 여기서 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C와 융합되는 것인, 조성물을 포함한다. 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유하고, 여기서 인트론은 폴리뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임에 삽입된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 (i) 데아미나아제 도메인 또는 이의 단편을 함유하는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 염기 편집기 시스템을 특징으로 한다. 염기 편집기 시스템은 또한 (ii) 세포의 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 함유한다. 염기 편집기는 (iii) 염기 편집기가 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 추가로 포함한다. 편집은 코딩된 염기 편집기의 활성 및/또는 발현의 감소를 초래한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 (i) 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 염기 편집기 시스템을 특징으로 하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 함유한다. 염기 편집기 시스템은 (ii) 자기-불활성화 염기 편집기가 세포 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 추가로 함유한다. 염기 편집기 시스템은 또한 (iii) 자기-불활성화 염기 편집기가 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 (i) 염기 편집기를 코딩하는 상기 측면 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 염기 편집기 시스템을 특징으로 한다. 염기 편집기 시스템은 또한 (ii) 염기 편집기가 세포 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 함유한다. 염기 편집 시스템은 또한 (iii) 염기 편집기가 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 함유한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 (i) 염기 편집기를 코딩하는 상기 측면 중 임의의 조성물을 함유하는 염기 편집기 시스템을 특징으로 한다. 염기 편집기 시스템은 또한 (ii) 염기 편집기가 세포 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 함유한다. 염기 편집 시스템은 또한 (iii) 염기 편집기가 (i)의 조성물의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 함유한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 (i) 데아미나아제 도메인을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인의 N-말단 단편을 포함하는 염기 편집기 시스템을 특징으로 하며, 여기서 N-말단 단편은 napDNAbp 도메인의 스플릿된 인테인-N에 융합된다. 염기 편집기 시스템은 또한 (ii) napDNAbp 도메인의 C-말단 단편을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 napDNAbp 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C에 융합된다. 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유하며, 여기서 인트론은 오픈 리딩 프레임에 삽입되고, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 염기 편집기를 코딩한다. 염기 편집기 시스템은 (iii) 염기 편집기가 세포 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 추가로 포함한다. 염기 편집기 시스템은 또한 (iv) 염기 편집기가 (i) 또는 (ii)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 (i) 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 염기 편집기 시스템을 특징으로 하며, 여기서 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N과 융합된다. 염기 편집기 시스템은 또한 (ii) 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편과 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C에 융합된다. 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유하며, 여기서 인트론은 오픈 리딩 프레임에 삽입되고, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 염기 편집기를 코딩한다. 염기 편집기 시스템은 또한 (iii) 염기 편집기가 세포 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다. 염기 에디터 시스템은 또한 (iv) 염기 편집기가 (i) 또는 (ii)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 특징으로 한다. 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 함유한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 상기 측면 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 구현예, 또는 상기 측면 중 임의의 것의 염기 편집기 시스템, 또는 그의 구현예를 함유하는 벡터를 특징으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 상기 측면 중 어느 하나의 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 특징으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 함유하는 세포를 특징으로 한다. 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 함유한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 상기 측면 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 구현예, 상기 측면 중 임의의 것의 조성물 또는 그의 구현예, 상기 측면 중 임의의 것의 염기 편집기 시스템을 함유하는 세포, 또는 이의 실시예, 또는 상기 측면 중 임의의 것의 벡터, 또는 이의 실시예를 특징으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 상기 측면 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 구현예, 상기 측면 중 임의의 것의 염기 편집기 시스템 또는 그의 구현예, 상기 측면 중 임의의 것의 벡터를 함유하는 약제학적 조성물, 또는 이의 실시예, 또는 상기 측면 중 임의의 것의 세포, 또는 이의 실시예를 특징으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 임의의 상기 측면의 폴리뉴클레오티드, 조성물, 염기 편집기 시스템, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물, 또는 그의 구현예를 함유하는 키트를 특징으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소시키거나 제거하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 함유한다. 이 방법은 또한 (b) 폴리뉴클레오티드를 가이드 RNA 및 자기-불활성화 염기 편집기 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 가이드 RNA는 염기 편집기가 인트론의 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하여 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소시키거나 제거하는 변경을 생성한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 염기 편집을 자기-불활성화하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) 데아미나아제 도메인 또는 이의 단편을 함유하는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시키는 것을 포함한다. 이 방법은 또한 (b) 염기 편집기가 세포 게놈의 한 부위를 편집하도록 지시하여 세포 게놈에 변경을 발생시키는 제1 가이드 RNA와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 (c) 염기 편집기가 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 편집으로 인해 코딩된 염기 편집기의 활성 및/또는 발현이 감소하여 염기 편집기의 발현을 감소시키거나 제거하는 변경이 생성된다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 염기 편집을 자기-불활성화하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 함유한다. 이 방법은 또한 (b) 자기-불활성화 염기 편집기가 세포 게놈 부위를 편집하도록 지시하여 세포 게놈에 변경을 일으키는 제1 가이드 RNA와 세포를 접촉시키는 단계를 포함힌다. 이 방법은 추가로 (c) 자기-불활성화 염기 편집기가 (a)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 세포를 접촉시켜 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소시키거나 제거하는 변경을 생성하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 유기체의 게놈을 편집하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유기체의 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 함유한다. 이 방법은 또한 (b) 자기-불활성화 염기 편집기가 세포 게놈 부위를 편집하도록 지시하여 세포 게놈에 변경을 일으키는 제1 가이드 RNA와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 추가로 (c) 자기-불활성화 염기 편집기가 (a)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 세포를 접촉시켜 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소시키거나 제거하는 변경을 생성하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체의 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 함유한다. 이 방법은 (b) 자기-불활성화 염기 편집기가 세포 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 제1 가이드 RNA와 세포를 접촉시켜 대상체를 치료하기 위한 세포 게놈의 변경을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 이 방법은 또한 (c) 자기-불활성화 염기 편집기가 (a)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 세포를 접촉시켜 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소시키거나 제거하는 변경을 생성하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 상기 측면 중 임의의 것의 염기 편집기 시스템, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물, 또는 그의 구현예를 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 유기체의 게놈을 편집하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) 데아미나아제 도메인을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인의 N-말단 단편, 및 napDNAbp 도메인의 C-말단 단편을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 유기체의 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 napDNAbp 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N에 융합되고, 여기서, napDNAbp 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C에 융합된다. 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유한다. 인트론은 오픈 리딩 프레임에 삽입된다. 세포에서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 발현되면 자기-불활성화 염기 편집기가 형성된다. 이 방법은 또한 (b) 자기-불활성화 염기 편집기가 세포 게놈의 한 부위를 편집하도록 지시하여 세포 게놈에 변경을 일으키는 제1 가이드 RNA와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 또한 (c) 자기-불활성화 염기 편집기가 (a)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 세포를 접촉시켜 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소시키거나 제거하는 변경을 생성하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시 발명은 유기체의 게놈 편집 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 유기체 세포에 발현하는 단계를 포함하며, 여기서 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N과 융합되고, 여기서 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C와 융합된다. 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 함유하며, 여기서 인트론은 오픈 리딩 프레임에 삽입된다. 세포에서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 발현되면 자기-불활성화 염기 편집기가 형성된다. 이 방법은 또한 (b) 자기-불활성화 염기 편집기가 세포 게놈의 한 부위를 편집하도록 지시하여 세포 게놈에 변경을 일으키는 제1 가이드 RNA와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 또한 (c) 자기-불활성화 염기 편집기가 (a)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 세포를 접촉시켜 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소시키거나 제거하는 변경을 생성하는 것을 포함한다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 염기 편집기는 게놈 DNA에서 높은 편집 효율을 갖는다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 염기 편집기는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인 또는 데아미나아제 도메인을 함유한다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 데아미나아제 도메인은 사이티딘 데아미나아제 도메인 또는 아데노신 데아미나아제 도메인이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 데아미나아제 도메인은 TadA 도메인이다.

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, napDNAbp 도메인은 Cas9, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 및 Cas12j/CasΦ도메인 중 하나 이상으로부터 선택되는 Cas 도메인이다.

임의의 상기 측면, 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 인트론은 NF1, PAX2, EEF1A1, HBB, IGHG1, SLC50A1, ABCB11, BRSK2, PLXNB3, TMPRSS6, IL32, ANTXRL, PKHD1L1, PADI1, KRT6C, 및 HMCN2 중 하나 이상으로부터 선택되는 서열로부터 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 NF1에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 PAX2에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 EEF1A1에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 HBB에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 IGHG1에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 SLC50A1에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 ABCB11에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 BRSK2에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 PLXNB3에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 TMPRSS6에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 IL32에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 PKHD1L1에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 PADI1에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 KRT6C에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 HMCN2에서 유래한 것이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 포유동물 유전자에 자연적으로 존재하는 인트론에 대해 적어도 약 85%의 핵산 서열 상동성을 갖는다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 비포유동물 유전자에 자연적으로 존재하는 인트론에 대해 적어도 약 85%의 핵산 서열 상동성을 갖는다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 인트론은 합성 인트론이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 다음 중 하나와 적어도 약 85% 핵산 서열 상동성을 갖는 서열을 함유한다:

a)　GTGAGATCAAATGAAAGTTTCATATAGAAATACAAAACCTAGAGAACTGGCATGTAAGAGAAGCAAAAATTACTTCAGCAAGGCCATGTTAGTAAATTTGCATCTGTTTGTCCACATTAG (서열번호: 226);

b)　GTAGGTGACAATGCTGCAGCTGCCTAATCTAGGTGGGGGGAACTAAATTGTGGGTGAGCTGCTGAATGGTCTGTAGTCTGAGGCTGGGGTGGGGGGAGACACAACGTCCCCTCCCTGCAAACCACTGCTATTCTGTCCCTCTCTCTCCTTAG (서열번호: 227);

c)　GTAAGTGGCTTTCAAGACCATTGTTAAAAAGCTCTGGGAATGGCGATTTCATGCTTACATAAATTGGCATGCTTGTGTTTCAG (서열번호: 228);

d)　GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCTAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (서열번호: 229);

e)　GTAAGCACAACTGGGATGGGGTGACAGGGGTGCAAGATTGAAAACTGGCTCCTCTCCTCATAGCAGTTCTTGTGATTTCAG (서열번호: 230);

f)　GTAAGAAATGTTATTTTTCAGTAAGTGATTTAGTTATTTTTCCTTTTTTCTCATTAAAATTTCTCTAACATCTCCCTCTTCATGTTTTAG (서열번호: 231);

g)　GTGAGACCCTAGCCCCCTCAACCCTGCCCTGGCCTCTCCCCAAACCTGCCCCCCCACGCTGACCCCCACACCCGGCCGCCCGCAG (서열번호: 232);

h)　GTGGGTGTCAGAGGCATCGGGGCTGCGGGGTAGGGGGCTGCCCCACCCCTAACGAAGTCTGCTCCTCCAG (서열번호: 233);

i)　GCAGGGAAGTCCTGCTTCCGTGCCCCACCGGTGCTCAGCTGAGGCTCCCTTGAAAATGCGAGGCTGTTTCCAACTTTGGTCTGTTTCCCTGGCAG (서열번호: 234);

j)　GTGGGGAGTTGGGGTCCCCGAAGGTGAGGACCCTCTGGGGATGAGGGTGCTTCTCTGAGACACTTTCTTTTCCTCACACCTGTTCCTCGCCAGCAG (서열번호: 235);

k)　GTATAGACCCCTTGATCTCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCTACAAAATCTTAGAGCATCAGTGGGAGCATCTCACTGTCCAGGCTCAATATTTCTTCATTTTCTTGCAG (서열번호: 236);

l)　GTAATTATGATTAAAGATGGTGATTGTTTATTTTCTTTTATGATTGTCCTTAGTATTATGTAACCTGCAAATTCTATTGCAG (서열번호: 237);

m)　GTGAGTGACACAAGGTGTTGTCTGGGGAGTGGGGAAGGGGGATGGAAGTGAATCCTGTTGGTGGGGTGGAGAAAGGGCGATCTCAAGAGGGCCACTCTCTCCAG (서열번호: 238);

n)　GTAAGCATCTCCACCATCCTTCTGTTTACTCTGATGGGGTCTGCAAAGGGGAGATGATGTATAGGGTTGGGTATCTCTGTAAATGTCAGATGTGAAGTTGATCTTATGACCTTCTGTTCTGCAG (서열번호: 239);

o)　GTGAGGGTCTCCCAGGCTGGGCAGGGGGAGGGGGCTGCTGCCTTGATTGCGTCCCAGGACACAGCCCTCCTCCAGCCTGCCCTCGCCTTGCTCATCCCCTCCCCATCTCAGCCCCACCCCCACTAACTCTCTCTCTGCTCTGACTCAG (서열번호: 240);

p)　GTAATGATTGATTGCAATGTATGATTACAATAATCTCAGTATAAGTTCAGTAATAATAACCTTCCACTGCTGTCCTCTGTGTGCACCCAG (서열번호: 241); 또는

q)　 GTAAATATATACAACAGTTTTTCATTTAAATAAGTGCACGGCACAAATAAGAAAAATATGTCAAAAATGTAACCAATAGTTTTTTTCAAATTTAG (서열번호: 242).

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 다음 중 하나로부터의 핵산 서열을 함유한다:

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 인트론은 약 10개 염기쌍 내지 약 500개 염기쌍을 함유한다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 약 70개 내지 150개의 염기쌍을 함유한다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 약 100개 염기쌍 내지 200개 염기쌍을 함유한다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 인트론은 프로토스페이서 서열에 근접하게 삽입된다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 인트론은 프로토스페이서 서열의 약 10 내지 30개 염기쌍 내에 삽입된다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 프로토스페이서 서열은 NGG 또는 NNGRRT이다.

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 데아미나아제 도메인은 TadA 도메인을 함유한다.

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 TadA의 코돈 18, 23, 59, 62, 87 또는 129 내부 또는 바로 뒤에 삽입된다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 TadA의 코돈 87 바로 뒤에 삽입된다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 변경은 단일 염기 편집이다. 위의 측면 또는 그 실시예 중 임의의 것에서, 단일 염기 편집은 A에서 G로의(A-to-G) 염기 편집이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 단일 염기 편집은 C에서 T로의(C-to-T) 염기 편집이다.

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 함유한다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 인트론은 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입된다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 도메인은 Cas9 도메인이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, Cas9 도메인은 Cas9의 Asn309 및 Thr310에 상응하는 아미노산 잔기 사이에서 스플릿되고, 잔기 310은 Thr310Cys로 돌연변이된다.

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위에 변경을 함유하며, 여기서 변경은 염기 편집기 mRNA의 스플라이싱을 감소시키거나 제거한다.

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, napDNAbp 도메인은 Cas9 도메인이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, Cas9 도메인의 N- 및 C-말단 도메인은 아미노산 잔기 Asn309와 Thr310 사이에 스플릿된다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, Cas9 도메인은 돌연변이 Thr310Cys를 함유한다.

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 조성물은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 함유한다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 인트론은 링커 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입된다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 편집은 데아미나아제 도메인의 촉매 잔기를 변경시킨다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 데아미나아제 도메인은 아데노신 데아미나아제 도메인이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 데아미나아제 도메인은 사이티딘 데아미나아제 도메인이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 데아미나아제 도메인의 변경된 촉매 잔기는 다음 참조 서열의 His57(H57), Glu59(E59), Cys87(C87) 또는 Cys90(C90): MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD (서열번호: 1) 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제의 상응하는 위치이다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 변경된 촉매 잔기는 E59이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 촉매 잔기에 대한 변경은 E59G이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 변경된 촉매 잔기는 H57이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 촉매 잔기에 대한 변경은 H57R이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 변경된 촉매 잔기는 C87이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 촉매 잔기에 대한 변경은 C87R이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 변경된 촉매 잔기는 C90이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 촉매 잔기에 대한 변경은 C90R이다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 염기 편집기 시스템은 다음으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다:

a)　gGUUUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 191);

b)　gUUUCUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 192);

c)　gGUUUCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 193);

d)　GCCACUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 194);

e)　gACAUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 195);

f)　gGAUCUCACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 196);

g)　gUCCUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 197);

h)　GUCACCUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 198);

i)　GAUUUCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 190);

j)　gGUGCUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 200);

k)　gUCCACAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 201);

l)　GAUACUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 202);

m)　gUGUUUUAGCUGCGGCAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 203);

n)　gUUUCUUACAGCCAUAAUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 204);

o)　gCUCCACAGCUGCGGCAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 205);

p)　GAUACUUACAGCCAUAAUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 206);

q)　gUGUUUUAGGGACGAAAGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 207);

r)　gUUACCUGGCUCUCUUAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 208);

s)　gCUCCACAGGGACGAAAGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 209);

t)　gCUUGCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 210);

u)　gAUUGCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 211);

v)　gUCUCCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 212);

w)　gUCUGCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 213);

x)　gGACUCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 214);

y)　GCACCCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 215);

z)　gAAUUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 216);

aa)　gCAUUAGGUCGAGAUCACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 217);

bb)　gCCUUAGGUCGAGAUCACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 218);

cc)　GUUUCAGGUCGAGAUCACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 219);

dd)　gACAUUAGGCUAAGAGAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 220);

ee)　gUCCUUAGGCUAAGAGAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 221);

ff)　gGUUUCAGGCUAAGAGAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 222);

gg)　gACAUUAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 223);

hh)　gUCCUUAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 224);

ii)　gGUUUCAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 225);

jj)　gCACCAUGAGCGAGGUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 524);

kk)　gGCCACCAUGAGCGAGGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 525);

ll)　GUGUCGAAGUUCGCCCUGGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 526);

mm)　gAUGCCGAGAUAAUGGCCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 527);

nn)　gAUGCCGAGAUAAUGGCCCUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 528);

oo)　gAUGCCGAGAUCAUGGCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 529);

pp)　gAUGCCGAGAUCAUGGCACUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 530);

qq)　gAUGCCGAGAUCAUGGCACUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 531);

rr)　gAUGCCGAGAUCAUGGCGCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 532);

ss)　gAUGCCGAGAUCAUGGCGCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 533);

tt)　gAUGCCGAGAUCAUGGCGUUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 534);

uu)　gAUGCCGAGAUUAUGGCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 535);

vv)　gAUGCCGAGAUUAUGGCACUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 536);

ww)　gAUGCCGAGAUUAUGGCACUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 537);

xx)　gAUGCCGAGAUUAUGGCACUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 538);

yy)　gAUGCCGAGAUUAUGGCGCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 539);

zz)　gAUGCCGAGAUUAUGGCUCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 540);

aaa)　gAUGCGGAGAUCAUGGCGCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 541);

bbb)　gAUGCUGAGAUAAUGGCCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 542);

ccc)　gAACCGCACAUGCCGAAAUUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 543);

ddd)　gGCAGGUGUCGACAUAUCUAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 544);

eee)　gAUGCCGAAAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 545);

fff)　gACACAUGACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 546); 또는

ggg)　gGCCCCAGCACACAUGACACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 547).

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 발현 벡터는 포유동물 발현 벡터이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 벡터는 지질 나노입자이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 및 헤르페스 바이러스 벡터 중 하나 이상으로부터 선택된 바이러스 벡터이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 벡터는 AAV 벡터이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV8이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 벡터는 프로모터를 함유한다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 세포는 in vitro 또는 in vivo 이다.

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 조성물 또는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 추가로 함유한다.

임의의 상기 측면 또는 이의 구현예에서, 키트는 임의의 상기 측면 또는 이의 구현예의 방법에 사용하기 위한 지시서를 포함한다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 방법은 in vivo 에서 수행된다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드는 벡터에 의해 세포에서 발현된다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 별개의 벡터에 의해 세포에서 발현된다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 제1 가이드 RNA 및/또는 제2 가이드 RNA는 벡터에 의해 세포로 전달된다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 제1 가이드 RNA 및/또는 제2 가이드 RNA는 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드와 동일한 벡터로 세포에 전달된다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 제1 가이드 RNA 및/또는 제2 가이드 RNA는 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드와는 다른 벡터로 세포에 전달된다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 염기 편집기는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인 및 데아미나아제 도메인을 함유한다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임은 napDNAbp 도메인 또는 데아미나아제 도메인에 존재한다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 자기-불활성화 염기 편집기 폴리펩티드는 게놈 DNA에서 높은 편집 효율을 유지한다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 데아미나아제 도메인은 사이티딘 데아미나아제 도메인 또는 아데노신 데아미나아제 도메인이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 변경은 인트론의 5' 말단에 있는 컨센서스 스플라이스 공여체 부위 또는 인트론의 3' 말단에 있는 컨센서스 스플라이스 수용체 서열에 있다.

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 인트론은 다음 중 하나와 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99% 핵산 서열 상동성을 갖는 서열을 함유한다:

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 제2 가이드 RNA는 다음으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다:

p)　GAUACUUACAGCCAUAAUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 206); 또는

임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 함유한다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 인트론은 링커 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입된다.

상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 대상체 또는 유기체는 인간이다. 상기 측면 또는 그의 구현예 중 임의의 것에서, 대상체 또는 유기체는 포유동물이다. 임의의 상기 측면 또는 그의 구현예에서, 포유동물은 인간이다.

본 발명은 염기 편집기의 자기-불활성화용 조성물 및 그 방법을 제공한다.

도 1A는 염기 편집기의 자기-불활성화 메커니즘을 나타내는 개략도를 제공한다. 2개의 gRNA는 염기 편집이 호스트 게놈의 표적 부위와 염기 편집기의 코딩 영역 내에서 동시에 발생하도록 지시한다. 사용 중인 염기 편집기가 ABE(Adenine Base Editor)인 경우 데아미나아제 도메인(His57(H57), Glu59(E59), Cys87(C87) 또는 Cys90(C90))의 촉매 잔기는 단일 A에서 G로의(A-to-G) 편집을 통해 각 부위에 각각 Arg, Gly, Arg 또는 Arg를 설치하여 불활성화할 수 있다. 사용 중인 염기 편집기가 CBE(Cytosine Base Editor)인 경우 편집기 내의 모든 Arg, Gln 또는 Trp 잔기에서 단일 C에서 T로의(C-to-T) 편집을 통해 조기-종결 코돈을 설치할 수 있다.
도 1B는 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A) 및 두 개의 gRNA를 사용한 TadA (His57, Glu59, Cys87 또는 Cys90)의 자기-불활성화 부위에서, 미리 설치된 TadA 돌연변이(His57Arg, Glu59Gly, Cys87Arg 또는 Cys90Arg)를 포함하는 ABE7.10-m 및 ABE7.10-m 변이체의 리포펙션 후 HEK293T 세포의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 1C는 TadA 코딩 영역 내 자기-불활성화 표적 부위인 His57 및 Glu59의 DNA 서열을 도시하는 개략도를 제공한다. 3' PAM 서열은 회색으로 강조되어 있고, 각 서열의 프로토스페이서 내 표적 뉴클레오티드와 그 위치는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 도 1C에 제공된 뉴클레오티드 서열은 위에서 아래(top-to-bottom) 발생순서대로 서열번호 458-459에 해당한다. 도 1C에 제공된 아미노산 서열은 위에서 아래 발생순서대로 서열번호 460-461에 해당한다.
도 1D는 TadA의 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A) 및 자기-불활성화 부위 Glu59를 표적화하는 ABE8.5-m 코돈 변이체 및 2개의 gRNA의 리포펙션 후 HEK293T 세포에서의 염기 편집 활성을 나타내는 그래프를 제공한다. 변이체의 활성을 자기-불활성화 gRNA가 제공되지 않은 ABE8.5-m의 활성과 비교하였다.
도 1E 및 1F는 ARPE-19 세포의 게놈 부위 및 ABE의 TadA 촉매 잔기에서 AAV2에 의해 전달된 ABE8.5-m 코돈 변이체 및 2개의 gRNA의 염기 편집의 동역학을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 1E는 ABE8.5-m 코돈 변이체 및 2개의 gRNA의 AAV2 전달 후 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A)에서의 염기 편집의 5주 시간 경과를 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 도 1F는 5주 시간 과정의 동일 샘플에서 자기-불활성화 부위(TadA의 아미노산 잔기 His57 또는 잔기 Glu59)에서의 편집을 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 1G 및 1H는 ARPE-19 세포의 게놈 부위 및 ABE의 TadA 촉매 잔기에서 AAV2에 의해 전달된 ABE8.5-m 코돈 변이체 및 2개의 gRNA의 염기 편집 동역학을 보여주는 막대 그래프를 제공하며, 여기서 자기-불활성화 편집은 두 가지 상이한 방법으로 평가되었다. 도 1G는 ABE8.5-m 코돈 변이체 및 2개의 gRNA의 AAV2 전달 2주 후 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A)에서의 염기 편집을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 도 1H는 동일한 실험에서 세포 용해물로부터의 DNA 또는 기술적인 복제 샘플의 mRNA로부터 생성된 cDNA의 표적화된 서열분석에 의해 평가된 자기-불활성화 비율을 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 2A는 ABE 시작 코돈의 변경을 통해 편집기를 비활성화하기 위해 TadA에 만들어진 돌연변이의 다이어그램을 제공한다. DNA 및 단백질 서열의 돌연변이는 검은색으로 강조 표시된다. 대체로, 프레임 외부 시작 코돈(out-of-frame start codon)은 회색 상자로 식별된다. 도 2A에 제공된 뉴클레오티드 서열은 위에서 아래 발생순서대로 서열번호 462-466에 해당한다. 도 2A에 제공된 아미노산 서열은 위에서 아래 발생순서대로 서열번호 467-469에 해당한다.
도 2B는 미리 설치된 시작 코돈 돌연변이를 함유하는 ABE8.5-m 변이체의 리포펙션 후 HEK293T 세포의 게놈 부위 ABCA4 c.5882G>A에서의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 이 실험에서는 자기-불활성화 gRNA가 제공되지 않았다.
도 2C는 TadA의 Met1에서 염기 편집이 일어나도록 하는 PAM 서열(NGG)을 혼입하기 위해 ABE8.5-m에 만들어진 돌연변이를 보여주는 다이어그램을 제공한다. 도 2C에 제공된 뉴클레오티드 서열은 위에서 아래 발생순서대로 서열번호 470-476에 해당한다. 도 2C에 제공된 아미노산 서열은 위에서 아래 발생순서대로 서열번호 477-480에 해당한다.
도 2D는 돌연변이되지 않은 대조군과 비교하여 TadA에 설치된 PAM 서열을 함유하는 ABE8.5-m 변이체의 리포펙션 후 HEK293T 세포의 게놈 부위 ABCA4 c.5882G>A에서의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 실험에서는 자기-불활성화 gRNA가 제공되지 않았다.
도 2E는 두 개의 gRNA를 사용하여 TadA의 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A) 및 자기-불활성화 부위 Met1에서 ABE8.5-m 및 ABE8.5-m 변이체의 리포펙션 후 HEK293T 세포에서의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다..
도 3A는 ABE(Adenine Base Editor)의 DNA에 인트론의 혼입을 통한 염기 편집기의 자기-불활성화 메커니즘을 보여주는 개략도를 제공한다.
도 3B 및 3C는 TadA의 특정 코돈(잔기) 뒤 또는 내에 코딩 서열에 인트론을 함유하는 ABE 변이체의 리포펙션 후 HEK293T 세포에서의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 도 3B는 TadA의 잔기 87(NF1, PAX2, EEF1A1, 키메라, SLC50A1, ABCB11, BRSK2, PLXNB3, TMPRSS6, IL32) 뒤, 잔기 62(키메라, ABCB11, PLXNB3, IL32) 뒤 또는 잔기 23(Chimera, ABCB11, PLXNB3, IL32) 내의 인트론의 혼입 이후 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 도 3B는 NF1, PAX2 및 EEF1A1 외에 잔기 87(ANTXRL, PKHD1L1, PADI1, KRT6C, HMCN2, HMCN2-Salmon 또는 ENPEP-Gecko) 뒤에 일부 추가 인트론을 혼입한 후 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 이 실험에서는 자기-불활성화 gRNA가 제공되지 않았다.
도 3D는 스플라이스 수용체 부위 또는 스플라이스 공여체 부위에 사전 설치된 편집이 있는 인트론을 포함하는 ABE 변이체의 리포펙션 후 HEK293T 세포의 염기 편집 활동을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 인트론은 TadA 잔기 87(NF1 수용체, PAX2 수용체, EEF1A1 수용체, 키메라 수용체, ANTXRL 수용체, PKHK1L1 수용체, PADI1 수용체, KRT6C 수용체, HMCN2 수용체, ENPEP-Gecko 수용체, HMCN2-Salmon 수용체, NF1 공여체, PAX2 공여체, EEF1A1 공여체, 또는 키메라 공여체) 뒤에 위치했다. 이 실험에서는 자기-불활성화 gRNA가 제공되지 않았다.
도 3E는 스플라이스 수용체 부위 또는 스플라이스 공여체 부위에 사전 설치된 편집을 갖는 인트론을 함유하는 ABE 변이체의 리포펙션 후 HEK293T 세포에서의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 인트론은 TadA 잔기 129(NF1 수용체, PAX2 수용체, EEF1A1 수용체), 59(NF1 수용체, PAX2 수용체, EEF1A1 수용체), 18(NF1 수용체, PAX2 수용체, EEF1A1 수용체) 및 62(ABCB11 수용체) 뒤, 또는 잔기 23 내(ABCB11 공여체)에 위치했다. 이 실험에서는 자기-불활성화 gRNA가 제공되지 않았다.
도 3F는 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A) 및 잔기 87 뒤 TadA 내에 배치된 인트론의 수용체 부위(NF1 또는 PAX2)에서 리포펙션된 HEK293T 세포의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 3G는 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A) 및 잔기 87(NF1, PAX2 및 EEF1A1) 뒤 및 잔기 62(ABCB11) 뒤의 TadA 내에 배치된 인트론의 수용체 부위에서 리포펙션된 HEK293T 세포의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 3H는 스플라이스 수용체 부위에서 미리 설치된 돌연변이가 존재하거나 존재하지 않는 경우, TadA 내의 다양한 위치(잔기 87, 129, 59 또는 18 이후)에서 인트론(NF1, PAX2 또는 EEF1A1)을 함유하는 ABE8.5-m 변이체의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 이 실험에서는 자기-불활성화 gRNA가 제공되지 않았다.
도 3I는 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A) 및 잔기 87, 129, 59 및 18 뒤 TadA 내에 배치된 인트론의 수용체 부위(NF1, PAX2 및 EEF1A1)에서 리포펙션된 HEK293T 세포의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 3J는 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A) 및 잔기 87 뒤 TadA 내에 배치된 인트론 NF1, PAX2, EEF1A1 ANTXRL, PKHD1L1, PADI1 및 ENPEP-Gecko의 게놈 부위 및 수용체 부위에서 리포펙션된 HEK293T 세포의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. 도 3K, 3L 및 3M은 자기-불활성화 gRNA, 게놈 부위를 표적으로 하는 gRNA 및 TadA의 서열 코딩에서의 인트론을 포함하는 ABE 변이체를 코딩하는 플라스미드 DNA의 플라스미드 리포펙션 후 HEK293T 세포의 염기 편집 활성을 나타내는 막대 그래프와 누적 막대 그래프를 제공합니다.
도 3K는 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A) 및 잔기 87 이후 TadA 내에 배치된 인트론 NF1 또는 PAX2의 수용체 부위에서의 염기 편집 활성을 묘사하는 막대 그래프를 제공하며, 여기서 편집은 세포 용해물로부터 DNA의 표적화된 서열분석에 의해 평가되었다. 도 3L 및 3M은 전체 mRNA의 RNA-seq에 의해 평가된 ABE8.5-m mRNA 내의 스플라이스 변이체의 비율을 묘사하는 누적 막대 그래프를 제공한다. 도 3K, 3L 및 3M에서의 모든 분석은 동일한 실험에서 기술적으로 반복하여 수행되었다.
도 3N은 스플라이스 수용체 부위를 표적으로 하는 자기-불활성화 gRNA, 게놈 부위를 표적으로 하는 gRNA, 및 잔기 87에 있는 TadA의 코딩 서열에 NF1 인트론을 함유하는 ABE 변이체의 AAV2 전달 후 2주째에 ARPE-19 세포에서의 염기 편집 활성을 묘사하는 막대 그래프를 제공한다. 편집은 게놈 DNA의 표적화된 시퀀싱에 의해 게놈 부위에서 측정되었으며 자기-불활성화 부위에서의 편집은 회수된 AAV 게놈의 표적화된 시퀀싱 및 세포의 전체 mRNA의 RNAseq에 의해 측정된다. 모든 측정은 동일한 실험에서 기술적으로 반복하여 수행되었다.
도 4A-4C는 A>G 염기 전환이 망막 색소 상피에서 유래한 ARPE-19 세포에서 1주차, 3주차 및 5주차(x-축)에 측정된 5주 AAV2 형질도입 실험을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 4A는 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A)에서의 편집을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 4B는 DNA 서열 분석에 의해 측정된 TadA 촉매 잔기 또는 인트론 스플라이스 수용체 부위에서의 편집을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 4C는 RNA 앰플리콘 서열분석을 통한 동일한 유전자좌의 편집 측정을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 4a-4c에서 "_scrmbl"이라는 용어는 자기 비활성화 가이드 시퀀스가 스크램블되었음을 나타낸다. 도 4A-4C에서, NF1 및 PAX2 스플라이스 수용체 부위는 각각 가이드 g235 및 g239를 사용하여 편집되었다(표 1C 참조).
도 5A 및 5B는 형질도입 후 표시된 날짜(x-축)에 ARPE-19 세포에서 2주 AAV2 형질도입 실험을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 막대 그래프는 각각 세포 형질도입을 위해 추가된 바이러스 게놈의 수(높음, 중간 또는 낮음)를 나타낸다. 세포 형질도입을 위해 추가된 바이러스 게놈의 수는 높음(89k vg/세포), 중간(17k vg/세포) 또는 낮음(9k vg/세포)이었다. 도 5A는 첨가된 바이러스 양에 대한 형질도입 후 3일, 7일 및 14일째에 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A)의 편집 속도를 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 5B는 표시된 시점에서 DNA 서열 분석에 의해 측정된 TadA 촉매 잔기 또는 인트론 스플라이스 수용체 부위에서의 편집을 보여주는 막대 그래프를 제공한다.
도 6A 및 6B는 편집이 4일, 7일 및 14일에 측정된 ARPE-19 세포에서의 2주 AAV2 시간 경과 형질도입 실험을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 6A는 차세대 시퀀싱을 통해 측정된 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A)를 도 6B는 RNA 앰플리콘 서열 분석을 통해 측정된 TadA 촉매 잔기 또는 인트론 스플라이스 수용체의 편집을 보여주는 막대 그래프를 제공한다.
도 7A 및 7B는 리포펙션 후 2일 및 7일에 측정된 편집 속도에 따른 HEK293T 세포에서의 플라스미드 리포펙션 결과를 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 7A는 차세대 시퀀싱을 통해 측정된 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A)의 편집을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 7B는 RNA 앰플리콘 서열 분석을 통해 측정된 TadA 촉매 잔기 또는 인트론 스플라이스 수용체 부위의 편집을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도에서. 도 7a 및 도 7b에서 _scrmbl은 자기 불활성화 가이드 시퀀스가 스크램블되었음을 나타낸다.
도 8A 및 8B는 BALB/c 마우스에서 AAV8의 IV 꼬리 정맥 주사 후 수집된 편집 데이터를 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 8A는 1주 후 DNA 및 RNA 앰플리콘 서열분석을 통해 측정된 게놈 부위(ABCA4 c.5882G>A)에서의 편집뿐만 아니라 TadA 촉매 잔기 또는 인트론 스플라이스 수용자 부위의 편집을 보여주는 그래프를 제공한다. 도 8B는 4주 후 동일한 결과를 보여주는 그래프를 제공한다. 도 8A 및 8B에서, 게놈 부위의 편집은 왼쪽 y-축에 표시되고, TadA 촉매 잔기 또는 인트론 스플라이스 수용체의 편집은 오른쪽 y축에 표시된다. 도 8a 및 도 8b에서 '_scrmbl'이라는 용어는 자기 불활성화 가이드 시퀀스가 스크램블되었음을 나타낸다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 공통으로 이해되는 의미를 갖는다. 다음 참조는 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton 등, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger 등 (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).여기서 사용되는 바와 같이, 달리 특정하지 않는 한 다음 용어들은 하기에 기술된 의미를 갖는다.

"아데닌" 또는 "9H-퓨린-6-아민"은 구조를갖고, CAS 번호 73-24-5에 상응하는 분자식 C₅H₅N₅를 갖는 퓨린 핵염기를 의미한다.

“아데노신" 또는 "4-아미노-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸)옥솔란-2-일]피리미딘-2(1H)-온"은 구조를 갖고, CAS 번호 65-46-3에 상응하는 글리코시드 결합을 통해 리보스 당에 부착된 아데닌 분자를 의미한다. 이의 분자식은 C₁₀H₁₃N₅O₄이다.

"아데노신 데아미나아제" 또는 "아데닌 데아미나아제"는 아데닌 또는 아데노신의 가수분해성 탈아미노화를 촉매할 수 있는 폴리펩티드 또는 이의 기능성 단편을 의미한다. 용어 “아데닌 데아미나아제” 및 “아데노신 데아미나아제”는 본원 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제 또는 데아미나아제 도메인은 아데노신에서 이노신으로 또는 데옥시 아데노신에서 데옥시이노신으로의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 아데노신 데아미나아제이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌 또는 아데노신의 가수분해성 탈아미노화를 촉매화한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나아제(예를 들어, 조작된 아데노신 데아미나아제, 진화된 아데노신 데아미나아제)는 조류, 박테리아, 진균, 식물, 무척추동물(예를 들어, 곤충) 및 척추동물(예를 들어, 양서류, 포유동물)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유기체(예를 들어, 진핵, 원핵생물)로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 하나 이상의 변경을 갖는 아데노신 데아미나아제 변이체이고, 표적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA, RNA)에서 아데닌 및 사이토신 둘 모두를 탈아민화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 또는 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 DNA 내의 아데닌 및 사이토신 둘 모두를 탈아민화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 단일 가닥 DNA 내의 아데닌 및 사이토신 둘 모두를 탈아민화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 RNA에서 아데닌 및 사이토신 둘 모두를 탈아민화시킬 수 있다.

"아데노신 탈아미노화 활성"은 폴리뉴클레오티드에서 아데닌 또는 아데노신에서 구아닌으로의 탈아미노화를 촉매하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 아데노신 데아미나아제 변이체는 아데노신 데아미나아제 활성(예를 들어, 참조 아데노신 데아미나아제의 활성(예를 들어, TadA*8.20 또는 TadA*8.19)의 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)을 유지한다.

"아데노신 염기 편집기(ABE)"는 아데노신 데아미나아제를 포함하는 염기 편집기를 의미한다.

“아데노신 염기 편집기(ABE) 폴리뉴클레오티드”는 ABE를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "아데노신 염기 편집기 8(ABE8) 폴리펩티드" 또는 "ABE8"은 아데노신 데아미나아제 또는 표 14에 나열된 변경 중 하나 이상, 나열된 변경 조합 중 하나, 또는 표 14의 아미노산 위치 82 및/또는 166에서 변경을 포함하는 아데노신 데아미나아제 변이체를 포함하는, 본원에 정의된 염기 편집기를 의미하며, 이러한 변경은 다음 참조 서열의 참조 서열에 대한 것 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제의 상응하는 위치에 대한 것이다:

MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD(서열번호: 1).

일부 구현예에서, ABE8은 참조 서열에 대해 본원에 기재된 바와 같은 변경을 추가로 포함한다.

"아데노신 염기 편집기 8(ABE8) 폴리뉴클레오티드"는 ABE8 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

"투여"는 환자 또는 대상체에게 본원에 기재된 하나 이상의 조성물을 제공하는 것으로 본원에서 지칭된다.

"제제"는 임의의 소분자 화학 화합물, 항체, 핵산 분자, 또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 의미한다.

"변경"은 본원에 기재된 것과 같은 표준 기술 공지된 방법에 의해 검출되는 바와 같은 분석물, 유전자 또는 폴리펩티드의 수준, 구조, 또는 활성의 변화(증가 또는 감소)를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 변경은 발현 수준의 10% 변화, 25% 변화, 40% 변화, 및 50% 변화 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 변경에는 핵염기 또는 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환이 포함된다.

"개선하다"는 질환의 발달 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 축소, 저지 또는 안정화시키는 것을 의미한다.

"유사체"는 동일하지 않지만 유사한 기능적 또는 구조적 특성을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드 유사체는 상응하는 자연 발생 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하는 한편, 자연 발생 폴리펩티드에 대해 유사체의 기능을 향상시키는 특정 생화학적 변형을 갖는다. 이러한 생화학적 변형은 예를 들어 리간드 결합을 변경시키지 않으면서 DNA에 대한 유사체의 프로테아제 내성, 막 투과성, 또는 반감기를 증가시킬 수 있다. 유사체는 비자연 아미노산을 포함할 수 있다.

"염기 편집기(BE)" 또는 "핵염기 편집기 폴리펩티드(NBE)"는 폴리뉴클레오티드에 결합하고 핵염기 변형 활성을 갖는 제제를 의미한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집기는 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA(gRNA))와 함께 핵염기 변형 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제) 및 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)을 포함한다. 염기 편집기의 대표적인 핵산 및 단백질 서열은 서열목록에 서열번호: 2-11로 제공된다.

"염기 편집 활성"은 폴리뉴클레오티드 내의 염기를 화학적으로 변경하도록 작용하는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 제1 염기는 제2 염기로 변환된다. 일 구현예에서, 염기 편집 활성은 사이티딘 데아미나아제 활성, 예를 들어 표적 CㆍG를 TㆍA로 전환시키는 것이다. 또 다른 구현예에서, 염기 편집 활성은 아데노신 또는 아데닌 데아미나아제 활성, 예를 들어 AㆍT를 GㆍC로 전환시키는 것이다.

용어 "염기 편집기 시스템"은 표적 뉴클레오티드 서열의 핵염기를 편집하기 위한 분자간 복합체를 지칭한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집기(BE) 시스템은 (1) 표적 뉴클레오티드 서열에서 핵염기를 탈아미노화하기 위한 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인, 데아미나아제 도메인(예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 도메인 또는 아데노신 도메인); 및 (2) 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인과 함께 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 염기 편집기(BE) 시스템은 아데노신 데아미나아제 또는 사이티딘 데아미나아제로부터 선택된 핵염기 편집기 도메인, 및 핵산 서열 특이적 결합 활성을 갖는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 (1) 표적 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 핵염기를 탈아미노화하기 위한 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제 도메인을 포함하는 염기 편집기(BE); 및 (2) 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인과 함께 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인이다. 일부 구현예들에서, 염기 편집기는 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데닌 또는 아데노신 염기 편집기(ABE)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데닌 또는 아데노신 염기 편집기(ABE) 또는 사이티딘 또는 사이토신 염기 편집기(CBE)이다.

용어 "Cas9" 또는 "Cas9 도메인"은 Cas9 단백질, 또는 이의 단편(예를 들어, Cas9의 활성, 비활성, 또는 부분적으로 활성 DNA 절단 도메인, 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 뉴클레아제는 또한 때때로 casnl 뉴클레아제 또는 CRISPR(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부) 연관 뉴클레아제를 지칭한다.

용어 "보존적 아미노산 치환" 또는 "보존적 돌연변이"는 하나의 아미노산을 공통 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 개별 아미노산 사이의 공통 특성을 정의하는 기능적 방식은 상동성 유기체의 상응하는 단백질 사이의 표준화된 아미노산 변화의 빈도를 분석하는 것이다(Schulz, G. E. 및 Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). 이러한 분석에 따르면, 아미노산의 그룹은 그룹 내의 아미노산이 서로 우선적으로 교환되고, 따라서 전반적인 단백질 구조에 대한 이들의 영향이 서로 가장 유사한 것으로 정의될 수 있다(상기 Schulz, G. E. 및 Schirmer, R. H.). 보존적 돌연변이의 비-제한적인 예는 아미노산의 아미노산 치환, 예를 들어, 양전하가 유지될 수 있도록 아르기닌을 리신으로 및 그 반대로; 음전하가 유지될 수 있도록 아스파르트산을 글루탐산으로 및 그 반대로; 유리 -OH가 유지될 수 있도록 트레오닌을 세린으로; 및 유리 -NH₂가 유지될 수 있도록 아스파라긴을 글루타민으로 치환하는 것을 포함한다.

본원에서 상호교환적으로 사용된 바와 같은 용어 "코딩 서열" 또는 "단백질 코딩 서열"은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 분절을 지칭한다. 코딩 서열은 또한 개방 판독 프레임으로 지칭될 수 있다. 영역 또는 서열은 시작 코돈에 의해 5' 말단에 더 가깝고, 종결 코돈에 의해 3' 말단에 더 가깝게 결합된다. 본원에 기재된 염기 편집기에 유용한 종결 코돈은 다음을 포함한다:

글루타민 CAG →TAG 종결 코돈

CAA →TAA

아르기닌 CGA → TGA

트립토판 TGG → TGA

TGG →TAG

TGG →TAA

"복합체"는 상호작용이 분자간 힘에 의존하는 2개 이상의 분자의 조합을 의미한다. 분자간 힘의 비제한적인 예는 공유 및 비공유 상호작용을 포함한다. 비공유 상호작용의 비제한적인 예는 수소 결합, 이온 결합, 할로겐 결합, 소수성 결합, 반 데르 발스 상호작용(예를 들어, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 쌍극자-유도 쌍극자 상호작용, 및 런던 분산력), 및 π효과를 포함한다. 일 구현예에서, 복합체는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 폴리펩티드와 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 복합체는 염기 편집기(예를 들어, Cas9와 같은 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 및 데아미나아제를 포함하는 염기 편집기) 및 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)를 형성하기 위해 연관되는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 복합체는 수소 결합에 의해 함께 유지된다. 염기 편집기의 하나 이상의 구성요소(예를 들어, 데아미나아제, 또는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질)은 공유적으로 또는 비공유적으로 연관될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 일 예로서, 염기 편집기는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질에(예를 들어, 펩티드 결합에 의해) 공유적으로 연결된 데아미나아제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 염기 편집기는 데아미나아제 및 비공유적으로 연관되는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질을 포함할 수 있다(예를 들어, 염기 편집기의 하나 이상의 구성요소가 트랜스로 공급되고 직접적으로 또는 단백질 또는 핵산과 같은 또 다른 분자를 통해 연관된다). 구현예에서, 복합체의 하나 이상의 구성요소는 수소 결합들에 의해 함께 유지된다. 본 개시내용 전반에 걸쳐, 염기 편집기의 구현예가 융합 단백질을 함유하는 것으로 고려되는 경우, 염기 편집기의 하나 이상의 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 복합체도 고려된다.

"사이토신" 또는 "4-아미노피리미딘-2(1H)-온"은 구조를 갖고,CAS 번호 71-30-7에 상응하는 분자식 C₄H₅N₃O를 갖는 퓨린 핵염기를 의미한다_.

"사이티딘"은 구조를 갖고, CAS 번호 65-46-3에 상응하는 글리코시드 결합을 통해 리보스 당에 부착된 사이토신 분자를 의미한다. 이의 분자식은 C₉H₁₃N₃O₅이다.

"사이티딘 염기 편집기(CBE)"는 사이티딘 데아미나아제를 포함하는 염기 편집기를 의미한다.

"사이티딘 염기 편집기(CBE) 폴리뉴클레오티드"는 CBE를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

"사이티딘 데아미나아제" 또는 "사이토신 데아미나아제"는 사이티딘 또는 사이토신을 탈아미노화시킬 수 있는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 의미한다. 일 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 사이토신을 우라실로 또는 5-메틸사이토신을 티민으로 전환시킨다. 용어 "사이티딘 데아미나아제" 및 "사이토신 데아미나아제"는 본 출원 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다. 페트로미존 마리누스 사이토신 데아미나아제 1(PmCDA1)(서열번호: 12-13), 활성화-유도 사이티딘 데아미나아제(AICDA)(서열번호: 14-46, 및 18-21), 및 APOBEC(서열번호: 22-62)는 예시적인 사이티딘 데아미나아제이다. 추가의 예시적인 사이티딘 데아미나아제(CDA) 서열은 서열목록 63-67 및 서열번호: 68-190으로서 제공된다.

"사이토신 데아미나아제 활성"은 사이토신 또는 사이티딘의 탈아미노화를 촉매하는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 사이토신 데아미나아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 아미노기를 카르보닐기로 전환시킨다. 일 구현예에서, 사이토신 데아미나아제 변이체는 사이토신을 우라실로(즉, C에서 U로) 또는 5-메틸사이토신을 티민으로(즉, 5mC에서 T로) 전환시킨다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 사이토신 데아미나아제는 참조 사이토신 데아미나아제에 대해 증가된 사이토신 데아미나아제 활성(예를 들어, 적어도 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상)을 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "데아미나아제" 또는 "데아미나아제 도메인"은 탈아미노화 반응을 촉매하는 단백질 또는 이의 단편을 지칭한다.

"검출"은 검출될 분석물의 존재, 부재 또는 양을 식별하는 것을 지칭한다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 변경이 검출된다. 다른 구현예에서, 인델(indels)의 존재가 검출된다.

"검출가능한 표지"는 관심 분자에 연결될 때, 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 또는 화학 수단을 통해 후자를 검출가능하게 만드는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 유용한 표지는 방사성 동위원소, 자기 비드, 금속성 비드, 콜로이드성 입자, 형광 염료, 전자-밀도 시약, 효소(예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에서 통상적으로 사용되는 것), 비오틴, 디곡시게닌, 또는 합텐을 포함한다.

"질환"은 세포, 조직 또는 기관의 정상적인 기능을 손상시키거나 방해하는 임의의 병태 또는 장애를 의미한다.

"유효량"은 치료되지 않은 환자 또는 질병이 없는 개체, 즉 건강한 개체에 비해 질병의 증상을 개선하는 데 필요한 제제 또는 활성 화합물, 예를 들어 본원에 기술된 염기 편집기의 양을 의미한다. 또는 원하는 생물학적 반응을 이끌어내기에 충분한 제제 또는 활성 화합물의 양이다. 질병의 치료적 치료를 위해 본 발명을 실시하는데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중 및 전반적인 건강 상태에 따라 달라진다. 궁극적으로 주치의나 수의사가 적절한 양과 복용량을 결정하게 된다. 이러한 양을 "유효" 량으로 지칭한다. 일 구현예에서, 유효량은 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내 세포)에서 관심 유전자의 변경을 도입하기에 충분한 본 발명의 염기 편집기의 양이다. 일 구현예에서, 유효량은 치료 효과를 달성하는데 필요한 염기 편집기의 양이다. 이러한 치료 효과는 대상체, 조직 또는 기관의 모든 세포에서 병원성 유전자를 변경하기에 충분할 필요는 없지만, 병원성 유전자를 약 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% 또는 75% 정도만 변경시키기만 하면 된다. 일 구현예에서, 유효량은 질병의 하나 이상의 증상을 개선하는데 충분하다.

용어 "엑소뉴클레아제"는 유리 말단으로부터 핵산(예를 들어, RNA 또는 DNA)을 분해할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다.

용어 "엔도뉴클레아제"는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 내부 영역을 촉매 작용(예를 들어, 절단)할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다.

"단편"은 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 부분을 의미한다. 이 부분은 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 함유한다. 단편은 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.

"가이드 폴리뉴클레오티드"는 표적 서열에 대해 특이적이며 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 단백질(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)로 복합체를 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 복합체를 의미한다. 일 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA(gRNA)이다. gRNA는 둘 이상의 RNA의 복합체, 또는 단일 RNA 분자로서 존재할 수 있다.

일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 다음에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지며, 여기서 소문자 “”는 표적 서열에 대한 5' 미스매치를 나타낸다:

hh) gUCCUUAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 224); 또는

ii) gGUUUCAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 225).

"이종성 성" 또는 "외인성"은 1) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 실험적으로 혼입되었거나; 2) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 정상적으로 포함하지 않는 세포에 실험적으로 배치된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 구현예에서, "이종성 성"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 비-천연 맥락에서 실험적으로 배치되었음을 의미한다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 제1 종 또는 호스트 유기체로부터 유래되고, 제2 종 또는 호스트 유기체로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 혼입된 것이다. 일부 구현예에서, 제1 종 또는 호스트 유기체는 제2 종 또는 호스트 유기체와 상이하다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.일부 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 이종성 인트론이다. 일부 구현예에서, 이종성 인트론은 합성 인트론이다. 일부 구현예에서, 이종성 인트론은 포유동물 유전자(예를 들어, NF1, PAX2, EEF1A1, HBB, IGHG1, SLC50A1, ABCB11, BRSK2, PLXNB3, TMPRSS6, IL32, ANTXRL, PKHD1L1, PADI1, KRT6C 또는 HMCN2)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 이종성 인트론은 비포유동물 유전자(예를 들어, HMCN2-Salmon, ENPEP-Gecko)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이종성 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 염기 편집기(ABE)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다.

일부 구현예에서, 이종성 인트론은 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼입된 것이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질은 Cas9, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 또는 Cas12j/CasΦ도메인이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9(SaCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 1 (Streptococcus thermophiles 1) Cas9(St1Cas9), 스트렙로코쿠스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9), 또는 이들의 변이체이다.

일부 구현예에서, 이종성 인트론은 데아미나아제 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼입된 것이다. 일부 구현예에서, 이종성 인트론은 아데노신 데아미나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼입된 것이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA이다. 일부 구현예에서, 이종성 인트론은 사이티딘 데아미나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 혼입된 것이다.

"혼성화"는 수소 결합을 의미하며, 이는 상보적 핵염기 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합일 수 있다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 이루는 상보적 핵염기이다.

"증가"는 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 양의 변경을 의미한다.

용어 "염기 복구 억제제", "염기 복구 저해제", "IBR" 또는 이들의 문법적 동등어는 핵산 복구 효소, 예를 들어 염기 절제 복구 효소의 활성을 억제할 수 있는 단백질을 의미한다.

"인테인"은 단백질 스플라이싱으로 공지된 과정에서 자체 절제하고 나머지 단편(엑스테인)을 펩티드 결합으로 연결할 수 있는 단백질의 단편이다.

"인트론"은 전사체의 번역 전에 스플라이싱에 의해 제거되는 비암호화 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 일부 구현예에서, 인트론은 RNA 스플라이싱에 의해 mRNA 성숙 전구체 메신저 RNA 단계 동안 제거된다. 일부 구현예에서, 인트론은 유기체의 유전자로부터 유래된다. 일부 구현예에서 인트론은 합성된 것이다. 일부 구현예에서, 인트론은 스플라이스 수용체 및 스플라이스 공여체 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론의 길이는 약 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 인트론의 길이는 약 50, 100, 125, 150, 175 또는 200개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 인트론의 길이는 약 150개 뉴클레오티드이다.

일부 구현예에서, 인트론은 포유동물 유전자(예를 들어, NF1, PAX2, EEF1A1, HBB, IGHG1, SLC50A1, ABCB11, BRSK2, PLXNB3, TMPRSS6, IL32, ANTXRL, PKHD1L1, PADI1, KRT6C 또는 HMCN2)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 인트론은 비포유동물 유전자(예를 들어, HMCN2-Salmon, ENPEP-Gecko)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 인트론은 다음으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다:

일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이종성 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 염기 편집기(ABE)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 사이티딘 염기 편집기(CBE)이다. 일부 구현예에서, 인트론은 폴리뉴클레오티드 서열에 이종적으로 혼입된 것이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA이다. 일부 구현예에서, 인트론은 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 이종성으로 혼입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질은 Cas9, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 또는 Cas12j/CasΦ도메인이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인은 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9(SaCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 1 Cas9(St1Cas9), 스트렙로코쿠스 파이오게네스 Cas9(SpCas9), 또는 이들의 변이체이다.일부 구현예에서, 인트론은 데아미나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 이종적으로 혼입된 것이다. 일부 구현예에서, 인트론은 아데노신 데아미나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 이종적으로 혼입된 것이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA이다. 일부 구현예에서, 인트론은 사이티딘 데아미나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 이종적으로 혼입된 것이다. 일부 구현예에서, 인트론은 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(예를 들어, Cas9)에 이종적으로 혼입된 것이다. 일부 구현예에서, 인트론은 링커 영역에 이종성으로 혼입된 것이다.

용어 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 천연 상태에서 발견되는 바와 같이 일반적으로 동반되는 구성요소로부터 다양한 정도로 자유로운 물질을 지칭한다. "단리"는 원래의 공급원 또는 주변과의 분리 정도를 나타낸다. "정제"는 단리보다 더 높은 분리 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않거나 다른 역결과를 유발하지 않도록 다른 물질이 실질적으로 없다. 즉, 본 발명의 핵산 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 때 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 경우 정제된다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석적 화학 기술, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성하는 것을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들어, 인산화 또는 글리코실화가 적용될 수 있는 단백질의 경우, 상이한 변형은 개별적으로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 생성할 수 있다.

"단리된 폴리뉴클레오티드"는 본 발명의 핵산 분자가 유래되는 유기체의 자연 발생 게놈에서 유전자를 플랭킹하는 유전자가 없는 핵산 분자를 의미한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 DNA를 함유하거나, DNA 분자이다. 따라서, 용어는 예를 들어 벡터 내로; 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스 내로; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 혼입되거나; 또는 다른 서열과 독립적으로 별개의 분자(예를 들어, cDNA 또는 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 생성된 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 용어는 DNA 분자로부터 전사되는 RNA 분자, 뿐만 아니라 추가의 폴리펩티드 서열을 암호와하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.

"단리된 폴리펩티드"는 자연적으로 동반되는 구성요소로부터 분리된 본 발명의 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 단백질 및 자연적으로 회합되는 자연 발생 유기 분자로부터 중량 기준으로 적어도 60%가 없을 때 단리된다. 바람직하게는, 제조물은 본 발명의 폴리펩티드를 중량 기준으로 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99% 이다. 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 예를 들어, 천연 공급원으로부터 추출함으로써, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 단백질을 화학적으로 합성함으로써 수득될 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해, 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "링커"는 2개의 모이어티를 연결하는 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 용어 "링커"는 공유 링커(예를 들어, 공유 결합) 또는 비-공유 링커를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열 내에서 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내에서 하나 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는 전형적으로 원래의 잔기에 이어서 서열 내 잔기의 위치를 식별하고 새로 치환된 잔기의 아이덴티티(identity)를 식별함으로써 본원에 기재된다. 본원에 제공된 아미노산 치환(돌연변이)를 제조하는 다양한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, Green 및 Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4^th　ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))에 의해 제공된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 핵염기 및 산성 모이어티, 예를 들어, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 중합체성 핵산, 예를 들어, 3 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 선형 분자이며, 여기서 인접한 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결을 통해 서로 연결된다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 3 개 이상의 개별 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체(예를 들어, 적어도 3 개의 뉴클레오티드의 스트링)를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA뿐만 아니라 단일 및/또는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 핵산은 예를 들어, 게놈, 전사체, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, snRNA, 플라스미드, 코스미드, 염색체, 염색분체, 또는 다른 자연 발생 핵산 분자의 맥락에서 자연 발생할 수 있다. 다른 한편으로, 핵산 분자는 비-자연 발생 분자, 예를 들어, 재조합 DNA 또는 RNA, 인공 염색체, 조작된 게놈, 또는 이의 단편, 또는 합성 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드일 수 있거나, 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 예를 들어, 포스포디에스테르 백본 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제되고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성되고 선택적으로 정제되고, 화학적으로 합성 등이 될 수 있다. 적절한 경우, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 및 백본 변형을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 나타내지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 뉴클레오시드(예를 들어 아데노신, 티미딘, 구아노신, 사이티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시사이티딘); 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸사이티딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-사이티딘, C5-메틸사이티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오사이티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예를 들어, 메틸화 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기(예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포라미다이트 연결)이거나 또는 포함한다.

"핵 국소화 서열(nuclear localization sequence)", "핵 국소화 신호(nuclear localization signal)" 또는 "NLS"라는 용어는 단백질이 세포 핵으로 유입되는 것을 촉진하는 아미노산 서열을 의미한다. 핵 국소화 서열은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Plank et al., 국제 PCT 출원, PCT/EP2000/011690(2000년 11월 23일 출원, 2001년 5월 31일 WO/2001/038547로 공개됨)에 기재되어 있으며, 그 내용은 예시적인 핵 국소화 서열의 개시를 위한 참조문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 다른 구현예에서, NLS는 최적화된 NLS이고, 예를 들어 Koblan 등., Nature Biotech. 2018 doi:10.1038/nbt.4172에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, NLS는 아미노산 서열 KRTADGSEFESPKKKRKV(서열번호: 243), KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호: 244), KKTELQTTNAENKTKKL(서열번호: 245), KRGINDRNFWRGENGRKTR(서열번호: 246), RKSGKIAAIVVKRRPRK(서열번호: 247), PKKKRKV(서열번호: 248), 또는 MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(서열번호: 249)을 포함한다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "핵염기", "질소성 염기" 또는 "염기"는 뉴클레오시드를 형성하는 질소-함유 생물학적 화합물을 지칭하며, 이는 결국 뉴클레오티드의 성분이다. 염기쌍을 형성하고 서로 쌓이는 핵염기의 능력은 리보핵산(RNA) 및 데옥시리보핵산(DNA)과 같은 장쇄 힐리컬 구조로 직접 이어진다. 5개의 핵염기(아데닌(A), 사이토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 우라실(U))을 일차(primary) 또는 표준(caconical)이라고 한다. 아데닌과 구아닌은 퓨린에서 파생되고 사이토신, 우라실, 티민은 피리미딘에서 파생된다. DNA와 RNA는 또한 변형된 다른(비-일차) 염기를 포함할 수도 있다. 비제한적인 예시적인 변형된 핵염기는 하이포잔틴, 크산틴, 7-메틸구아닌, 5,6-디하이드로우라실, 5-메틸사이토신(m5C) 및 5-하이드로메틸사이토신을 포함할 수 있다. 하이포잔틴과 크산틴은 돌연변이 유발물질의 존재를 통해 생성될 수 있으며 둘 다 탈아미노화(아민 그룹을 카르보닐 그룹으로 대체)를 통해 생성된다. 하이포잔틴은 아데닌에서 변형될 수 있다. 크산틴은 구아닌에서 변형될 수 있다. 우라실은 사이토신의 탈아미노화로 인해 발생할 수 있다. "뉴클레오시드"는 핵염기와 5탄당(리보스 또는 디옥시리보스)으로 구성된다. 뉴클레오시드의 예에는 아데노신, 구아노신, 우리딘, 사이티딘, 5-메틸우리딘(m5U), 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 데옥시유리딘 및 데옥시사이티딘이 포함된다. 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드의 예에는 이노신(I), 크산토신(X), 7-메틸구아노신(m7G), 디히드로우리딘(D), 5-메틸사이티딘(m5C) 및 슈도우리딘(Ψ)이 포함된다. "뉴클레오티드"는 핵염기, 5탄당(리보스 또는 디옥시리보스) 및 적어도 하나의 인산염 그룹으로 구성된다. 변형된 핵염기 및/또는 변형된 핵염기가 포함할 수 있는 화학적 변형의 비제한적 예는 다음과 같다: 슈도-우리딘, 5-메틸-사이토신, 2'-O-메틸-3'-포스포노아세테이트, 2'-O-메틸 티오PACE(MSP), 2'-O-메틸-PACE(MP), 2'-플루오로 RNA(2'-F-RNA), 구속된(constrained) 에틸(S-cEt), 2'-O-메틸('M'), 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트('MS'), 2'-O-메틸-3'-티오포스포노아세테이트('MSP'), 5-메톡시유리딘, 포스포로티오에이트 및 N1-메틸슈도우리딘.

용어 "핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질" 또는 "napDNAbp"는 napDNAbp를 특이적 핵산 서열로 가이드하는, 가이드 핵산과 같은 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 또는 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)와 연관되는 단백질을 지칭하기 위해 "폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 RNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 Cas9 단백질이다. Cas9 단백질은 Cas9 단백질을 가이드 RNA에 상보적인 특이적 DNA 서열로 가이드하는 가이드 RNA와 연관될 수 있다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas9 도메인, 예를 들어 뉴클레아제 활성 Cas9, Cas9 니카아제(nCas9), 또는 뉴클레아제 비활성 Cas9(dCas9)이다. 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질의 비제한적인 예는 Cas9(예를 들어, dCas9 및 nCas9), Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 및 Cas12j/CasΦ를 포함한다. Cas 효소의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12로도 공지됨), Cas10, Cas10d, Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2cl, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j/CasΦCpf1, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csx11, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, II형 Cas 효과기 단백질, V형 Cas 효과기 단백질, VI형 Cas 효과기 단백질, CARF, DinG, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 또는 조작된 버전을 포함한다. 다른 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질은 또한 본 개시내용의 범주 내에 있지만, 이들은 본 개시내용에 구체적으로 나열되지 않을 수 있다. 예를 들어, Makarova 등 "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?" CRISPR J. 2018 Oct;1:325-336. doi: 10.1089/crispr.2018.0033; Yan 등, "Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems" Science. 2019 Jan 4;363(6422):88-91. doi: 10.1126/science.aav7271을 참조하며, 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예시적인 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열목록에서 서열번호: 250-283 및 490으로 제공된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵염기 편집 도메인" 또는 "핵염기 편집 단백질"은 RNA 또는 DNA에서 핵염기 변형, 예컨대 사이토신(또는 사이티딘)에서 우라실(또는 우리딘) 또는 티민(또는 티미딘)으로, 및 아데닌(또는 아데노신)에서 하이포크산틴(또는 이노신)으로의 탈아미노화, 뿐만 아니라 비-주형 뉴클레오티드 부가 및 삽입을 촉매화할 수 있는 단백질 또는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집 도메인은 데아미나아제 도메인(예를 들어, 아데닌 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제; 또는 사이티딘 데아미나아제 또는 사이토신 데아미나아제)이다.

본원에 사용된 바와 같이, "제제를 수득하는"에서와 같은 "수득하는"은 제제를 합성, 구매, 또는 달리 획득하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "환자" 또는 "대상체"는 질환 또는 장애로 진단되거나, 질환 또는 장애가 있거나 또는 발병할 위험이 있거나, 또는 질환 또는 장애가 있거나 또는 발병할 것으로 의심되는 포유동물 대상체 또는 개체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "환자"는 질환 또는 장애가 발병할 가능성이 평균보다 더 높은 포유류 대상체를 지칭한다. 예시적인 환자는 인간, 비-인간 영장류, 고양이, 개, 돼지, 소, 고양이, 말, 낙타, 라마, 염소, 양, 설치류(예를 들어, 마우스, 토끼, 랫트, 또는 기니 피그) 및 본원에 개시된 요법에서 이익을 얻을 수 있는 다른 포유류일 수 있다. 예시적인 인간 환자는 남성 및/또는 여성일 수 있다.

"이를 필요로 하는 환자" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 본원에서, 질환 또는 장애로 진단되거나, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 가질 위험이 있거나, 질환 또는 장애를 갖는 것으로 미리 결정되거나, 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 환자를 지칭한다.

용어 "병원성 돌연변이", "병원성 변이체", "질환 유발 돌연변이", “질환 유발 변이체” "유해한 돌연변이" 또는 "소인성 돌연변이"는 특정 질환 또는 장애에 대한 개인의 이병성 또는 소인성을 증가시키는 질환 또는 장애와 연관된 유전적 변경 또는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구현예에서, 병원성 돌연변이는 유전자에 의해 암호화된 단백질에서 적어도 하나의 병원성 아미노산에 의해 치환된 적어도 하나의 야생형 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 병원성 돌연변이는 종결 영역(예를 들어, 종결 코돈)에 존재한다. 일부 구현예에서, 병원성 돌연변이는 비-코딩 영역(예를 들어, 인트론, 프로모터 등)에 존재한다.

용어 "단백질", "펩티드", "폴리펩티드", 및 이의 문법적 등가물은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 펩티드(아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 자연 발생, 재조합, 또는 합성, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

용어 "융합 단백질"은 적어도 2개의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 하이브리드 폴리펩티드를 지칭한다.

단백질 또는 핵산의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 자연에서 발생하지 않지만, 인간 조작의 생성물인 단백질 또는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 단백질 또는 핵산 분자는 임의의 자연 발생 서열과 비교하여 적어도 1 개, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 또는 적어도 7 개의 돌연변이를 포함하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

"감소"는 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 음의 변경을 의미한다.

"참조"는 표준 또는 제어 조건을 의미한다. 일 구현예에서, 참조는 인트론을 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 염기 편집기에 의해 제공되는 편집 수준이다.

다른 구현예에서, 참조는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위의 변경을 포함하지 않는 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 염기 편집기에 의해 제공되는 편집 수준이다. 한 구현예에서, 참조는 야생형 또는 건강한 세포에 존재하는 분석물의 수준, 구조 또는 활성이다. 다른 구현예에서 그리고 제한 없이, 참조는 테스트 조건에 적용되지 않거나 위약 또는 생리식염수, 배지, 완충제 및/또는 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 대조군 벡터에 적용되는 미처리 세포에 존재하는 분석물의 수준, 구조 또는 활성이다.

"참조 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로 사용되는 정의된 서열이다. 참조 서열은 명시된 서열의 서브세트 또는 전체; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 분절, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다. 폴리펩티드의 경우, 참조 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16 개의 아미노산, 적어도 약 20 개의 아미노산, 적어도 약 25 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 또는 약 100 개의 아미노산일 것이다. 핵산의 경우, 참조 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 60 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 75 개의 뉴클레오티드, 약 100 개의 뉴클레오티드, 또는 약 300 개의 뉴클레오티드 또는 그 부근 또는 그 사이의 임의의 정수일 것이다. 일부 구현예에서, 참조 서열은 관심 단백질의 야생형 서열이다. 다른 구현예에서, 참조 서열은 야생형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.

용어 "RNA-프로그래밍 가능한 뉴클레아제", 및 "RNA-가이드된 뉴클레아제"는 절단을 위한 표적이 아닌 하나 이상의 RNA(들)와 함께 사용된다(예를 들어, 이와 결합하거나 연관된다). 일부 구현예에서, RNA-프로그래밍 가능한 뉴클레아제는 RNA와 복합체를 형성할 때, 뉴클레아제:RNA 복합체로 지칭될 수 있다. 전형적으로, 결합된 RNA(들)는 가이드 RNA(gRNA)로 지칭된다. 일부 구현예에서, RNA-프로그래밍 가능한 뉴클레아제는 (CRISPR-연관 시스템) Cas9 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 파이오오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9(Csnl) (예를 들어 서열번호: 250), 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)로부터의 Cas9 (NmeCas9; 서열번호: 261), Nme2Cas9 (서열번호: 262), 또는 이의 유도체 (예를 들어, Nme2Cas9 또는 spCas9과 같은 Cas9과 최소 약 85% 서열 상동성을 갖는 서열)이다,

용어 "단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)"은 게놈 내의 특이적 위치에서 발생하는 단일 뉴클레오티드에서의 변이이며, 여기서 각각의 변이는 집단 내에서 일부 인지가능한 정도로 존재한다(예를 들어, > 1%).

"특이적으로 결합하는"은 핵산 분자, 폴리펩티드, 폴리펩티드/폴리뉴클레오티드 복합체, 화합물, 또는 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자를 인식하고 결합하지만, 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인식하고 결합하지 않는 분자를 의미한다.

"실질적으로 동일한"은 참조 아미노산 서열에 대해 적어도 50%의 상동성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 일 구현예에서, 참조 서열은 야생형 아미노산 또는 핵산 서열이다. 또 다른 구현예에서, 참조 서열은 본원에 기재된 아미노산 또는 핵산 서열 중 어느 하나이다. 일 구현예에서, 이러한 서열은 아미노산 수준 또는 핵산 수준에서 비교를 위해 사용된 서열과 적어도 60%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.

서열 상동성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, Genetics Computer Group의 Sequence Analysis Software Package, 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 위스콘신 대학 생물공학 센터 소재, BLAST, BESTFIT, GAP 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 사용하여 측정한다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 상동성의 정도를 할당함으로써 동일하거나 유사한 서열을 매칭시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신 내의 치환을 포함한다. 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, 밀접하게 관련된 서열을 나타내는 e^-3 및 e^-100 사이의 확률 점수와 함께 BLAST 프로그램이 사용될 수 있다.

예를 들어 COBALT는 다음과 같은 매개변수와 함께 사용된다:

a) 정렬 매개변수: 갭 페널티-11,-1 및 엔드-갭 페널티-5,-1,

b) CDD 매개변수: RPS BLAST 사용; Blast E-값 0.003; 보존된 열 찾기 및 재계산, 및

c) 쿼리 클러스터링 매개변수: 쿼리 클러스터 사용; 글자 크기 4; 최대 클러스터 거리 0.8; 알파벳 레귤러(alphabet regular).

예를 들어 EMBOSS Needle은 다음 매개변수와 함께 사용된다:

a) 행렬: BLOSUM62;

b) 갭 개방: 10;

c) 갭 확장: 0.5;

d) 출력 형식: 쌍;

e) 엔드 갭 페널티: 위(false);

f) 엔드 갭 개방: 10; 및

g) 엔드 간격 확장: 0.5.

본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열에 대해 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화될 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열에 대해 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화될 수 있다. "혼성화하는"은 다양한 엄격성 조건 하에서 상보적 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 유전자) 또는 이의 부분 사이에 이중-가닥 분자를 형성하는 쌍을 의미한다. (예를 들어, Wahl, G. M. 및 S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507 참조).

예를 들어, 엄격한 염 농도는 일반적으로 약 750 mM NaCl 및 75 mM 시트르산삼나트륨 미만, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 시트르산삼나트륨 미만, 및 보다 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 낮은 엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 부재 하에 수득될 수 있는 반면, 높은 엄격성 혼성화는 적어도 약 35% 포름아미드, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 포름아미드의 존재 하에 수득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로 적어도 약 30℃보다 바람직하게는 적어도 약 37℃및 가장 바람직하게는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 혼성화 시간, 세제, 예를 들어, 나트륨 도데실 술페이트(SDS)의 농도, 및 담체 DNA의 포함 또는 배제와 같은 다양한 추가적인 매개변수는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 필요에 따라 이러한 다양한 조건을 조합함으로써 다양한 수준의 엄격성이 달성된다. 바람직한 구현예에서, 혼성화는 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨, 및 1% SDS 중 30℃에서 발생할 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 혼성화는 500 mM NaCl, 50 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 35% 포름아미드, 및 100 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA(ssDNA) 중 37℃에서 발생할 것이다. 가장 바람직한 구현예에서, 혼성화는 250 mM NaCl, 25 mM 시트르산삼나트륨, 1% SDS, 50% 포름아미드, 및 200 μg/ml ssDNA 중 42℃에서 발생할 것이다. 이러한 조건에 대한 유용한 변이는 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.

대부분의 적용의 경우, 혼성화 후 세척 단계에서 또한 엄격성이 다를 것이다. 세척 엄격성 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 상기와 같이, 세척 엄격성은 염 농도를 감소시키거나 또는 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에 대한 엄격한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 시트르산삼나트륨 미만 및 가장 바람직하게는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 시트르산삼나트륨 미만일 것이다. 세척 단계에 대한 엄격한 온도 조건은 일반적으로 적어도 약 25℃보다 바람직하게는 적어도 약 42℃및 심지어 보다 바람직하게는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 일 구현예에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS 중 25℃에서 발생할 것이다. 또 다른 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS 중 42℃에서 발생할 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산삼나트륨, 및 0.1% SDS 중 68℃에서 발생할 것이다. 이러한 조건에 대한 추가적인 변경은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 혼성화 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있고 예를 들어, Benton 및 Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein 및 Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel 등 (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger 및 Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); 및 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 기재되어 있다.

"스플릿"은 2개 이상의 단편으로 나눠지는 것을 의미한다.

"스플릿 Cas9 단백질" 또는 "스플릿 Cas9"는 2 개의 별개의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 N-말단 단편 및 C-말단 단편으로 제공되는 Cas9를 지칭한다. Cas9 단백질의 N-말단 부분 및 C-말단 부분에 상응하는 폴리펩티드는 스플릿되어 "재구성된" Cas9 단백질을 형성할 수 있다.

용어 “표적 부위"는 변형되는 핵산 분자 내의 서열을 의미한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 데아미나아제, 융합 단백질 또는 데아미나아제를 포함하는 복합체, 또는 본원에 개시된 염기 편집기에 의해 탈아미노화된다. 일 구현예에서, 데아미나아제는 사이티딘 또는 아데닌 데아미나아제다. 일부 예에서, 데아미나아제는 dCas9-아데노신 데아미나아제 융합 단백질이다. 일부 케이스에서, 염기 편집기는 아데닌 또는 아데노신 염기 편집기(ABE) 또는 사이티딘 또는 사이토신 염기 편집기(CBE)이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", 치료하는", "치료" 등은 장애 및/또는 이와 연관된 증상(들)을 감소시키거나 또는 개선하거나 또는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것은 장애, 병태 또는 이와 연관된 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하지 않는 것으로 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 효과는 치료적이며, 즉, 제한 없이, 효과는 질환 및/또는 질환에 기인하는 부작용의 강도를 부분적으로 또는 완전히 축소, 경감, 폐지, 약화, 개선, 감소 또는 치유한다. 일부 구현예에서, 효과는 예방적이며, 즉, 효과는 질환 또는 병태의 발생 또는 재발을 보호 또는 방지한다. 이를 위해, 현재 개시된 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

"우라실 글리코실라제 억제제" 또는 "UGI"는 우라실-절제 복구 시스템을 억제하는 제제를 의미한다. 사이티딘 데아미나아제를 포함하는 염기 편집기는 사이토신을 우라실로 전환한 다음 DNA 복제 또는 복구를 통해 티민으로 전환한다. 염기 편집기에 우라실 DNA 글리코실라제(UGI)의 억제제를 포함하면 U를 다시 C로 변경하는 염기 절단 복구를 방지한다. 예시적인 UGI는 다음과 같은 아미노산 서열을 포함한다:

>splP14739IUNGI_BPPB2 우라실-DNA 글리코실라제 억제제

MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSD APEYKPWALVIQDSNGENKIKML (서열번호: 284).

본원에 제공된 범위는 해당 범위 내의 모든 값을 줄여서 표현한 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 임의의 숫자, 숫자의 조합, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50로 구성된 그룹의 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.

본원에서 변수의 임의의 정의에서 화학 그룹의 목록의 인용은 해당 변수를 임의의 단일 그룹 또는 나열된 그룹의 조합으로 정의하는 것을 포함한다. 본원의 변수 또는 양태에 대한 구현예의 언급은 해당 구현예를 임의의 단일 구현예로 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 부분과 조합하여 포함한다.

모든 용어는 당업자가 이해하는 대로 이해되도록 의도되었다. 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본원에서, 단수형의 사용은 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 본원에서 "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, "포함하는(including)"이라는 용어는 물론 "포함하다(include)", "포함하다(includes)", "포함되는(included)"과 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다.

본 명세서 및 청구항(들)에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"(및 "포함한다" 및 "포함한다"와 같은 임의의 형태), "갖는"(및 "갖는다" 및 "갖는다"와 같은 임의의 형태), "포함하는"(및 "포함하다" 및 "포함하다”와 같은 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유하다" 및 "함유하다"와 같은 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방적이며, 추가적인, 미기재된 요소 또는 방법 단계를 제외하는 것이 아니다. 특정 구성요소(들) 또는 요소(들)을 "포함하는" 것으로 명시된 임의의 구현예는 또한 일부 구현예에서 특정 구성요소(들) 또는 요소(들)로 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는" 것으로도 고려된다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 본원에 개시의 임의의 방법 또는 구성에 대해 구현될 수 있고, 그 반대도 가능하다는 것이 고려된다. 또한, 본 개시의 조성물은 본원에 개시된 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.

용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 측정되거나 결정되는 방식, 즉 측정 시스템의 한계로 인하여 달라질 수 있다.

명세서에서 "일부 구현예", "일 구현예", "일 구현예" 또는 "다른 구현예"에 대한 명세서 내 참조는, 구현예와 관련하여 설명된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 본원에 개시된 적어도 일부 구현예에 포함되지만, 반드시 모든 구현예에 포함되는 것은 아니라는 것을 의미한다.

본 발명은 자기-불활성화 염기 편집기를 포함하는 조성물 및 이러한 편집기를 사용하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 자가-불활성화를 위한 이종성 인트론을 갖는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 및 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 염기 편집기를 불활성화하는 방법을 특징으로 한다.

DNA 염기 편집 기술은 일반적으로 사이토신 데아미나아제 또는 아데닌 데아미나아제와의 단백질 융합에서 RNA 유도 Cas9 니카아제(nCas9)와 같은 조작된 DNA 결합 도메인을 활용한다. 사이토신 염기 편집기(CBE)는 우라실 중간체를 통해 사이토신이 티민으로 전환(C > T)되는 것을 촉매하는 반면, 아데닌 염기 편집기(ABE)는 하이포크산틴 중간체를 통해 아데닌이 구아닌으로 전환(A > G)되는 것을 촉매한다 (Rees, H. A., & Liu, D. R. (2018). Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet, 19(12), 770-788). DNA 염기 편집은 RNA 유도 nCas9 도메인을 사용하여 게놈의 관심 영역에 결합하며, 이는 nCas9에서 R-루프로 압출되는 게놈 DNA의 비표적 가닥을 대체하여 이러한 짝이 없는 염기를 탈아미노화에 노출시킨다. gRNA에 결합된 DNA의 표적 가닥은 또한 nCas9에 의해 닉(nick, 흠집)이 생기는데, 이는 편집되지 않은 표적 가닥의 야생형 염기쌍으로 분해되기보다는 R-루프에 설치된 돌연변이의 혼입 쪽으로 세포 DNA 불일치 복구를 편향시킨다.

모든 게놈 변형 도구와 마찬가지로 DNA에서 영구적이고 잠재적으로 해로울 수 있는 원치 않는 오프-타겟 편집을 방지하기 위해 예방 조치를 취해야 한다(Kim, D., 등 (2017). Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nat Biotechnol, 35(5), 475-480; Liang, P., et al. (2019). Genome-wide profiling of adenine base editor specificity by EndoV-seq. Nature Communications, 10(1), 67; Zuo, E., 등 (2019). Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science, 364(6437), 289-292). AAV에 의해 전달되는 경우와 같이 DNA 편집기가 무기한으로 발현되는 상황 (Colella, P., 등 (2018). Emerging Issues in AAV-Mediated In Vivo Gene Therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, 8, 87-104; Nathwani, A. C., 등 (2011). Long-term Safety and Efficacy Following Systemic Administration of a Self-complementary AAV Vector Encoding Human FIX Pseudotyped With Serotype 5 and 8 Capsid Proteins. Molecular Therapy, 19(5), 876-885; Nguyen, G. N., 등 (2021). A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology, 39(1), 47-55; Niemeyer, G. P., 등 (2009). Long-term correction of inhibitor-prone hemophilia B dogs treated with liver-directed AAV2-mediated factor IX gene therapy. Blood, 113(4), 797-806)은 노출 시간에 따라 이러한 부위에서의 편집 위험이 증가하므로 오프-타겟 활성이 매우 낮더라도 잠재적으로 문제가 될 수 있다.

또한, 염기 편집기에 의한 비표적 RNA 탈아미노화의 지속성은 비영구적이지만 영향을 받은 세포의 전사체 프로파일을 변경할 수 있다 (Grunewald, J., 등 (2019). Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature, 569(7756), 433-437; Rees, H. A., 등 (2019). Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv, 5(5), eaax5717; Zhou, C., 등 (2019). Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature, 571(7764), 275-278). AAV에 의해 전달된 Cas9 뉴클레아제의 프로그래밍된 자기-불활성화를 위한 메커니즘은 이전에 설명되었으며, 여기서 Cas9을 발현하는 이식유전자는 호스트 게놈 내의 표적 부위 외에 이중 가닥 DNA 절단을 위해 표적화된다 (Epstein, B. E., & Schaffer, D. V. (2016). Engineering a Self-Inactivating CRISPR System for AAV Vectors. Molecular Therapy, 24, S50; Li, A., 등 (2019). A Self-Deleting AAV-CRISPR System for In Vivo Genome Editing. Mol Ther Methods Clin Dev, 12, 111-122). 따라서 Cas9 발현에 대한 지시는 Cas9이 처음 전달된 세포에서 제거된다.

염기 편집 기술의 가장 광범위한 치료적 유용성을 실현하기 위해, 본 발명은 장기간 발현을 초래할 수 있는 전달 방법 후에 염기 편집기의 활성 및 발현을 약화시키는 방법을 제공한다. CRISPR-Cas 뉴클레아제와 달리 염기 편집기는 변경되지 않은 Cas9 뉴클레아제로 인해 발생할 수 있는 인델 형성을 방지하기 위해 nCas9 또는 촉매적으로 불활성인 “죽은(dead)”변이체(dCas9)을 활용한다 (Gaudelli, N. M., 등 (2017). Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464-471; Komor, A. C., 등 (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533(7603), 420-424). DNA 코딩에서 이중 가닥 절단을 생성하여 염기 편집기를 자기-불활성화하는 것이 가능하지만 몇 가지 고려사항이 있다. 염기 편집기의 니카아제 Cas9을 활용하여 염기 편집기 DNA를 코딩하는 두 가닥 모두에 닉을 형성할 수 있다. 각 닉에 대한 부위는 블런트-말단 이중-가닥 DNA 브레이크(blunt-ended double-stranded DNA break)를 생성하기 위한 각 가닥의 닉을 포함하여 염기쌍 뉴클레오티드의 해리를 선호할 정도로 근접하여 충분히 가까운 거리에서 발생할 수 있다. 또한, 이러한 접근 방식에는 재결찰을 피하기 위해 이러한 닉을 순차적이 아닌 동시에 만들어야 하며, 닉을 표적으로 하기 위해 최소한 2개의 추가 gRNA가 필요하다. dCas9이 혼입된(incorporate) 염기 편집기는 이 전략을 사용할 수 없다. 따라서 일 구현예에서, 본 발명은 가이드 의존적 및 가이드 독립적 (예: 허위 탈아미드화(spurious deamination)) 가능성을 최소화하는 목표로 추가 편집 활성 또는 발현을 줄이거나 제거하기 위해 편집기 DNA 내에서 단일 염기 편집을 수행하는 데 의존하는 방법을 제공한다 (Yu, Y., 등 (2020). Cytosine base editors with minimized unguided DNA and RNA off-target events and high on-target activity. Nature Communications, 11(1), 2052). 본 발명은 또한 CBD의 4가지 센스 코돈 CAA, CAG, CGA 또는 TGG - Gln, Arg 및 Trp 잔기를 코딩함 - 중 임의의 것이 단일 C에서 T로의 염기 편집을 통해 종결 코돈으로 직접 전환될 수 있음을 제공한다 (Billon, P., 등 (2017). CRISPR-Mediated Base Editing Enables Efficient Disruption of Eukaryotic Genes through Induction of STOP Codons. Molecular Cell, 67(6), 1068-1079.e1064). 그러나 ABE를 사용하여 자기-불활성화를 달성하기 위해서는 대체 접근 방식이 필요한데, 이는 A에서 G로의 염기 편집을 통해서는 센스 코돈이 넌센스 코돈으로 변환될 수 없기 때문이다.

본 명세서에 기술된, 본 발명은 암호화 유전 물질의 세포 전달 후 염기 편집기의 자기-불활성화를 촉진하는 조성물 및 방법을 특징으로 한다. ABE의 자기-불활성화를 위한 본 발명의 방법은 센스 코돈의 종결 코돈으로의 직접적인 전환에 의존하지 않으며, C에서 T로의 단일 염기 편집을 사용하여 CBE를 불활성화하도록 적용될 수 있다. 이들 조성물 및 방법은 염기 편집을 활용하여 편집기를 코딩하는 DNA에 단일 염기 돌연변이를 프로그래밍 방식으로 설치하여 DNA 편집 활성이 제거되거나 발현이 변경된다.

일 구현예에서, 본 발명은 가이드 RNA가 염기 편집기에 염기 편집기의 데아미나아제 서브유닛의 활성 부위 잔기를 돌연변이시켜 촉매적으로 사멸된 효소를 생성하고 염기 편집의 손실을 일으키도록 지시할 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초하고 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 단일 염기 돌연변이에 대한 염기 편집기의 시작 코돈을 표적화하면 번역을 방지한다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 인트론이 염기 편집기 코딩 서열(예를 들어, 오픈 리딩 프레임)에 삽입될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 인트론은 염기 편집기 전사체(예: mRNA)의 생산적인 스플라이싱을 방해하거나 변경하여 염기 편집기(예: ABE, CBE)의 발현 손실을 초래하는 염기 편집의 표적이 될 수 있는 서열을 제공한다. 일부 구현예에서, 염기 편집은 인트론 서열의 5' 또는 3' 말단(예를 들어, 스플라이스 공여체 또는 스플라이스 수용체 부위)에서 이루어진다.

타겟 폴리뉴클레오티드의 편집

본 발명의 조성물은 예를 들어 정의된 기간 동안 유전자 편집을 생성하는 데 사용된다. 원하는 수준의 편집에 도달하면 염기 편집기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 인트론의 스플라이스 수용체 또는 공여체 부위를 파괴하여 염기 편집기의 발현이 감소되거나 제거된다.

일반적으로 염기 편집은 대상 세포의 게놈에 치료적 변화를 유도하기 위해 수행된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 세포(생체 내 또는 시험관 내)는 2개 이상의 가이드 RNA 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예: Cas9), 데아미나아제(예: 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제)를 포함하는 핵염기 편집기 폴리펩티드와 접촉된다.

일부 구현예에서, 편집될 세포는 적어도 하나의 핵산 분자와 접촉되는데, 여기서 적어도 하나의 핵산 분자는 2개 이상의 가이드 RNA 및 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하고, 이 폴리펩티드는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어, Cas9) 도메인, 데아미나아제(예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인을 포함하며, 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 일부는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체를 포함하는 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 편집될 세포는 적어도 하나의 핵산 분자와 접촉되는데, 여기서 적어도 하나의 핵산 분자는 2개 이상의 가이드 RNA 및 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하며, 이 폴리펩티드는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어 Cas9) 도메인, 사이티딘 데아미나아제 도메인을 포함하며, 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 일부는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 편집될 세포는 적어도 하나의 핵산 분자와 접촉되는데, 여기서 적어도 하나의 핵산 분자는 2개 이상의 가이드 RNA 및 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하며, 이 폴리펩티드는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) (예를 들어, Cas9) 도메인, 아데노신 데아미나아제 도메인을 포함하며, 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 일부는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 가이드 RNA 및 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자는 하나 이상의 벡터(예를 들어, AAV 벡터)에 의해 세포로 전달된다.

일부 구현예에서, 편집될 세포는 2개 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자 및 스플릿 핵염기 편집 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 2개의 핵산 분자와 접촉되며, 여기서 하나의 핵산 분자는 스플릿 인테인-N과 융합된 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어, Cas9) 도메인의 N-말단 단편 및 데아미나아제 (예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인을 코딩하며, 여기서 제2 핵산 분자는 스플릿 인테인-C와 융합된 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) (예를 들어, Cas9)의 C-말단 단편을 코딩하고, 제1 또는 제2 핵산 분자는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론을 포함한다.

일부 구현예에서, 편집될 세포는 2개 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자 및 스플릿 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 최소 2개의 핵산 분자와 접촉되며, 여기서 하나의 핵산 분자는 스플릿 인테인-N에 융합된 데아미나아제(예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인의 C-말단 단편을 코딩하고, 여기서 제2 핵산 분자는 스플릿 인테인-C와 융합된 데아미아나제(예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인의 C-말단 단편 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어, Cas9) 도메인을 코딩하고, 제1 또는 제2 핵산 분자는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론을 포함한다.

일부 구현예에서, 2개 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자 및 스플릿 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 제1 및 제2 핵산 분자는 하나 이상의 벡터(예를 들어, AAV 벡터)에 의해 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자 및 스플릿 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 제1 및 제2 핵산 분자는 각각 별개의 벡터(예를 들어, AAV 벡터)에 의해 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자와 스플릿 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 첫 번째 및 두 번째 핵산 분자는 동일한 벡터(예를 들어, AAV 벡터)에 의해 세포에 전달된다.

일부 구현예에서, 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 핵염기 편집 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 오픈 리딩 프레임 내에 삽입된다. 일부 구현예에서, 인트론은 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어, Cas9) 도메인, 데아미나아제(예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인, 또는 링커 내에 삽입된다. 일부 구현예에서, 인트론은 프로토스페이서 서열에 근접하게 삽입된다. 일부 구현예에서, 인트론은 프로토스페이서 서열의 약 10 내지 30개 염기쌍 내에 삽입된다. 일부 구현예에서, 프로토스페이서 서열은 NGG 또는 NNGRRT이다. 일부 구현예에서, 인트론의 길이는 약 10개 염기쌍 내지 약 500개 염기쌍 사이이다. 일부 구현예에서, 인트론은 약 70개 염기쌍 내지 150개 염기쌍 사이이다. 일부 구현예에서, 인트론은 약 100개 염기쌍 내지 200개 염기쌍 사이이다.

일부 구현예에서, 2개 이상의 가이드 RNA에는 하나 이상의 가이드 RNA가 포함되며, 이 가이드 RNA는 세포 게놈 내의 특정 위치를 편집하도록 핵염기 편집기 폴리펩티드를 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA와 함께, 핵염기 편집기 폴리펩티드를 특정 인트론 내에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는(예를 들어, A에서 G로의 편집 또는 C에서 T로의 편집) 하나 이상의 가이드 RNA가 포함된다. 일부 구현예에서, gRNA는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 유사체는 세포 과정에서 gRNA가 분해되는 것을 억제할 수 있다.

다양한 경우에, 스페이서 서열이 5' 및/또는 3' "G" 뉴클레오티드를 포함하는 것이 유리하다. 일부 경우에, 예를 들어 본원에 제공된 임의의 스페이서 서열 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 5' "G"를 포함하거나 추가로 포함하며, 일부 구현예에서 5' "G"는 표적 서열에 상보적이거나 상보적이지 않다. 일부 구현예에서, 5' "G"는 5' "G"를 아직 포함하지 않은 스페이서 서열에 추가된다. 예를 들어, 가이드 RNA가 U6 프로모터 등의 제어 하에 발현될 때 가이드 RNA가 5' 말단 "G"를 포함하는 것이 유리할 수 있는데, 그 이유는 U6 프로모터가 전사 시작 부위에서 "G"를 선호하기 때문이다 (Cong, L. 등 “Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339:819-823 (2013) doi: 10.1126/science.1231143 참고). 일부 경우에, 5' 말단 "G"는 프로모터의 제어 하에 발현될 가이드 폴리뉴클레오티드에 첨가되지만, 가이드 폴리뉴클레오티드가 프로모터의 제어 하에 발현되지 않는 경우 또는 가이드 폴리뉴클레오티드가 발현되지 않을 때에는 임의로 가이드 폴리뉴클레오티드에 첨가되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 발명의 염기 편집은 in vivo에서 대상체에 수행된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 가이드 RNA 및 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 최소 하나의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어 AAV 벡터)가, in vivo에서 대상체의 세포(예를 들어, A-에서-G 또는 C-에서-T 베이스 편집)로 전달되며, 여기서 핵염기 편집기 폴리펩티드는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)(예를 들어, Cas9) 도메인, 데아미아나제(예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인을 포함하고, 여기서 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 일부는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵염기 편집기 폴리펩티드가 세포 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 최소 하나의 핵산 분자, 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)(예를 들어, Cas9) 도메인, 데아미나아제 (예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인, 및 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론을 포함하는 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 최소 하나의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는 세포의 게놈 부위를 편집하기 위해 in vivo에서 대상체 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 대상체에서 원하는 수준의 염기 편집이 달성되면, 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는 in vivo에서 대상체 내 세포로 전달되어 핵염기 편집기 폴리뉴클레오티드의 인트론을 코딩하는 핵산 분자 내에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하는 것을 표적으로 하며, 이렇게 함으로써 핵염기 편집 활동을 줄이거나 제거하여 핵염기 편집기 폴리뉴클레오티드를 자기-불활성화한다.

일부 구현예에서, 두 개 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자 및 스플릿 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 두 개의 핵산 분자를 코딩하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는 in vivo에서 대상체 내 세포로 전달되며, 여기서 하나의 핵산 분자는 스플릿 인테인-N 및 데아미나아제(예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인과 융합된 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어, Cas9) 도메인의 N-말단 단편을 코딩하며, 제2 핵산 분자는 스플릿 인테인-C와 융합된 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어 Cas9) 도메인의 C-말단 단편을 코딩하며, 제1 또는 제2 핵산 분자 중 하나는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론을 포함한다.

일부 구현예에서, 2개 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자 및 스플릿 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 2개의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는 in vivo에서 대상체의 세포에 전달되며, 여기서 하나의 핵산 분자는 스플릿 인테인-N에 융합된 데아미나아제(예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인의 N-말단 단편을 코딩하고, 여기서 제2 핵산 분자는 스플릿 인테인-C 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어 Cas9) 도메인에 융합된 데아미나아제 (예를 들어 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인의 C-말단 단편을 코딩하며, 제1 또는 제2 핵산 분자는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵염기 편집기 폴리펩티드가 세포의 게놈 내 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, AAV 벡터), 및 스플릿 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 2개의 핵산 분자는 in vivo에서 대상체의 세포에 전달되어 세포 게놈 부위를 편집하며, 여기서 하나의 핵산 분자는 스플릿 인테인-N 및 데아미나아제(예를 들어 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인에 융합된 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어 Cas9) 도메인의 N-말단 단편을 코딩하고, 여기서 제2 핵산 분자는 스플릿 인테인-C에 융합된 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어 Cas9) 도메인의 C-말단 단편을 코딩하고, 제1 또는 제2 핵산 분자 중 하나는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵염기 편집기 폴리펩티드가 세포 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, AAV 벡터), 및 스플릿 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 2개의 핵산 분자는 in vivo에서 대상체의 세포에 전달되어 세포 게놈 부위를 편집하며, 여기서 하나의 핵산 분자는 스플릿 인테인-C에 융합된 데아미나아제(예를 들어 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인의 N-말단 단편을 코딩하고, 여기서 제2 핵산 분자는 스플릿 인테인-C 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)(예를 들어 Cas9) 도메인에 융합된 데아미나아제(예를 들어 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제) 도메인의 C-말단 단편을 코딩하며, 제1 또는 제2 핵산 분자 중 하나는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론을 포함한다.

하나 이상의 벡터(예를 들어, AAV 벡터)가 세포에 전달될 때, 세포는 스플릿 핵염기 편집기 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 단편을 발현할 것이며, 이는 함께 결합하여 핵염기 편집기 폴리펩티드를 형성할 것이다. 일부 구현예에서, 대상체에서 원하는 수준의 염기 편집이 달성되면, 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는 in vivo에서 대상체 내 세포로 전달되어 핵염기 편집기 폴리뉴클레오티드의 인트론을 코딩하는 핵산 분자에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집(예를 들어 A에서 G로의 또는 G에서 T로의 염기 편집)하는 것을 표적으로 하며, 이렇게 함으로써 핵염기 편집 활동을 줄이거나 제거하여 핵염기 편집기 폴리뉴클레오티드를 자기-불활성화한다.

본 발명은 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 스플릿 인테인 염기 편집기 시스템을 함유하는 2개의 AAV 벡터를 투여함으로써 관심 SNP가 있는 질병을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 각각 염기 편집기의 일부를 코딩한다: 인테인-N에 융합된 N-말단 부분 및 인테인-C에 융합된 C-말단 부분. 염기 편집기의 두 부분 중 하나 이상의 코딩 서열에 코딩된 것은 인트론 서열이다. 일부 구현예에서, SNP를 표적으로 하는 가이드 RNA도 AAV 벡터 중 하나에 포함된다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 질병에 걸린 세포, 조직 또는 기관과 관련된 향성을 갖는다(예를 들어, AAV 벡터는 단일 혈청형(single serotype)이다).

세포가 염기 편집 시스템의 두 AAV 벡터에 감염되면 염기 편집기의 두 부분을 코딩하는 전사물이 발현되고 인트론이 절단된다. 두 반쪽의 폴리펩티드가 발현되면 염기 편집기는 스플릿 인테인 태그를 통해 세포 내에서 단백질 접합에 의해 재구성된다. 일부 구현예에서, 염기 편집이 발생하도록 일정 기간 동안 염기 편집을 수행한 후, 세포의 염기 편집기와 함께 인트론에서 공여체 또는 수용체 스플라이스 부위를 표적으로 하는 가이드 RNA를 코딩하는 제3 AAV가 제공된다. 이 AAV가 염기 편집기를 발현하는 세포를 감염시키면 스플라이싱이 발생하지 않도록 스플라이스 부위를 변경한다. 염기 편집기의 일부가 적절하게 발현되지 못하기 때문에 온-타겟 및 오프-타겟 부위를 포함하여 세포 내에서 염기 편집이 불활성화되거나 약화된다. 본 발명은 또한 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론을 표적으로 하는 가이드 RNA를 제공한다. 표 1A는 인트론 수용체 또는 공여체 부위를 표적으로 하는 gRNA에 사용되는 표적 인트론 서열을 제공한다.

표 1A: 예시적 표적 인트론 서열

표 1B는 인트론 수용체 또는 공여체 부위를 표적화하기 위한 gRNA 서열을 제공한다. 일부 구현예에서, gRNA 서열은 U6 프로모터로부터 발현된다. 아래 표 1B에서 소문자 “g”는 표적 서열에 대한 5' 미스매치를 나타낸다.

표 1B. 예시적 gRNA 서열. 소문자 “”는 표적 서열에 대한 5' 미스매치를 나타낸다.

일부 구현예에서, 데아미나아제 도메인은 TadA 도메인이다. 일부 구현예에서, 인트론은 TadA의 코돈 내부 또는 바로 뒤에 삽입된다. 일부 구현예에서, 인트론은 TadA의 코돈 18, 23, 59, 62, 87 또는 129 내부 또는 바로 뒤에 삽입된다. 일부 구현예에서, 인트론은 TadA의 코돈 87 바로 뒤에 삽입된다.

아래 표 1C는 TadA 오픈 리딩 프레임에 인트론을 삽입하기 위한 표적 서열좌를 제공한다(예를 들어, c.100+1은 인트론 서열의 첫 번째 염기쌍이 TadA의 100번째 코딩 뉴클레오티드 바로 뒤에 있다는 것을 나타낸다). 따라서, 일부 구현예에서, 인트론 서열은 명명된 아미노산 위치 바로 뒤에 위치한다. 다른 구현예에서, 인트론 서열은 명명된 아미노산 위치 바로 앞에 위치한다.

표 1C. 예시적 표적 인트론 서열좌

핵염기 편집기

폴리뉴클레오티드의 표적 뉴클레오티드 서열을 편집, 변형 또는 변경하는 핵염기 편집기(예를 들어 자기-불활성화 핵염기 편집기)가 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용하다. 본원에 기재된 핵염기 편집기는 전형적으로 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나아제 또는 사이티딘 데아미나아제)을 포함한다. 결합된 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)와 함께 결합될 때, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 이에 의해 염기 편집기를 편집하고자 하는 표적 핵산 서열에 국재화할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 인트론에 존재한다 (예를 들어 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위).

특정 구현예에서, 본원에 제공된 핵염기 편집기는 염기 편집 활성을 개선시키는 하나 이상의 특성을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 임의의 핵염기 편집기는 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 핵염기 편집기는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9 도메인(dCas9), 또는 Cas9 니카아제(nCas9)로 지칭되는 듀플렉스된 DNA 분자의 한 가닥을 절단하는 Cas9 도메인을 가질 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 촉매 잔기(예를 들어, H840)의 존재는 표적화된 핵염기 반대편의 비-편집된(예를 들어, 비-탈아미노화된) 가닥을 절단하기 위해 Cas9의 활성을 유지한다. 촉매 잔기 (예를 들어, D10에서 A10으로의)의 돌연변이는 표적화된 잔기(예를 들어, A 또는 C)를 함유하는 편집된(예를 들어, 탈아민화된) 가닥의 절단을 방지한다. 이러한 Cas9 변이체는 gRNA-정의된 표적 서열에 기반한 특이적 위치에서 단일-가닥 DNA 절단(닉)을 생성하여, 비-편집된 가닥의 복구를 야기하고, 궁극적으로 비-편집된 가닥 상의 핵염기 변화를 초래할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인

폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA, DNA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 인트론은 염기 편집기의 뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 존재한다. 염기 편집기의 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 그 자체로 하나 이상의 도메인(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레아제 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 뉴클레아제 도메인은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있다. 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 핵산의 단일 가닥 또는 이중-가닥 핵산 분자의 양쪽 가닥을 절단할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 뉴클레아제 도메인은 표적 폴리뉴클레오티드의 0, 1, 또는 2개의 가닥을 절단할 수 있다.

염기 편집기 내로 혼입될 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 비제한적인 예는 CRISPR 단백질-유래 도메인, 제한 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, TAL 뉴클레아제(TALEN), 및 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 결합된 가이드 핵산을 통해 핵산의 CRISPR(즉, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부)-매개 변형 동안 핵산 서열에 결합할 수 있는 천연 또는 변형된 단백질 또는 이의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함한다. 이러한 단백질은 본원에서 "CRISPR 단백질"로 지칭된다. 따라서, 본원에는 CRISPR 단백질의 전부 또는 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기(즉, 염기 편집기의 "CRISPR 단백질-유래 도메인"으로도 지칭되는 CRISPR 단백질의 전부 또는 부분을 도메인으로 포함하는 염기 편집기)가 개시되어 있다. 염기 편집기 내로 혼입된 CRISPR 단백질-유래 도메인은 CRISPR 단백질의 야생형 또는 천연 버전과 비교하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 하기 기재된 바와 같이 CRISPR 단백질-유래 도메인은 CRISPR 단백질의 야생형 또는 천연 버전에 비해 하나 이상의 돌연변이, 삽입, 결실, 재배열 및/또는 재조합을 포함할 수 있다.

본원에 사용될 수 있는 Cas 단백질은 클래스 1 및 클래스 2를 포함한다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 또는 Csx12로도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1(예를 들어, 서열번호: 320), Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 및 Cas12j/CasΦCARF, DinG, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. CRISPR 효소는 표적 서열 내에서 및/또는 표적 서열의 상보체 내에서와 같은 표적 서열에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소는 표적 서열의 첫번째 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 개 이상의 염기 쌍 내에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 지시할 수 있다.

돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 뉴클레오티드의 하나 또는 두 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화하는 벡터가 사용될 수 있다. Cas 단백질(예를 들어, Cas9, Cas12) 또는 Cas 도메인(예를 들어, Cas9, Cas12)은 예시적인 야생형 Cas 폴리펩티드 또는 Cas 도메인에 대해 적어도 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 상동성 및/또는 서열 호몰로지(homology)를 갖는 폴리펩티드 또는 도메인을 지칭할 수 있다. Cas(예를 들어, Cas9, Cas12)는 아미노산 변화, 예컨대 결실, 삽입, 치환, 변이체, 돌연변이, 융합, 키메라, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 Cas 단백질의 야생형 또는 변형된 형태를 지칭할 수 있다.

일부 구현예에서, 염기 편집기의 CRISPR 단백질-유래 도메인은 코리네박테리움 울세란스(Corynebacterium ulcerans)(NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)(NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라(Spiroplasma syrphidicola)(NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 인테르메디아(Prevotella intermedia)(NCBI Ref: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와넨세(Spiroplasma taiwanense)(NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코쿠스 이니에(Streptococcus iniae)(NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카(Belliella baltica)(NCBI Ref: NC_018010.1); 사이크로플렉수스 토르퀴스(Psychroflexus torquis)(NCBI Ref: NC_018721.1); 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) (NCBI Ref: YP_820832.1); 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)(NCBI Ref: NP_472073.1); 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)(NCBI Ref: YP_002344900.1); 네이세리아 메닌자이티디스(Neisseria meningitidis)(NCBI Ref: YP_002342100.1), 스트렙토코쿠스 파이오게네스, 또는 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9의 전부 또는 부분을 포함할 수 있다.

Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, "Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., 등, Nature 471:602-607 (2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., 등, Science 337:816-821(2012)을 참조하며, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다). Cas9 오솔로그는 에스. 파이오게네스 및 에스. 써모필루스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 종에 기재되었다. 추가적인 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이며, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 Chylinski, Rhun, 및 Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함하며; 상기 문헌의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.

고충실도 Cas9 도메인(High Fidelity Cas9 Domains)

본 개시내용의 일부 측면은 고충실도 Cas9 도메인을 제공한다. 고충실도 Cas9 도메인은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 Kleinstiver, B.P., 등 “CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.”Nature 529, 490-495 (2016); and Slaymaker, I.M., 등 “Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.”Science 351, 84-88 (2015)에 기재되어 있고; 각각의 전체 내용은 본 문서에 참조로 포함된다. 예시적인 고충실도 Cas9 도메인은 서열 목록에 서열번호 321로 제공된다. 일부 구현예에서, 고충실도 Cas9 도메인은, 상응하는 야생형 Cas9 도메인에 비하여, Cas9 도메인과 당-인산염 백본 사이의 정전기적 상호작용을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 조작된 Cas9 도메인이다.

DNA의 당-인산 백본과의 정전기적 상호작용이 감소된 고충실도 Cas9 도메인은 오프-타겟 효과가 적다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인(예를 들어, 야생형 Cas9 도메인(서열 번호: 250 및 253))은 Cas9 도메인과 DNA의 당-인산염 백본 사이의 연관성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 도메인은 Cas9 도메인과 DNA의 당-인산 골격 사이의 결합을 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 최소 5%, 최소 10%, 최소 15%, 최소 20%, 최소 25%, 최소 30%, 최소 35%, 최소 40%, 최소 45%, 최소 50%, 최소 55%, 최소 60%, 최소 65% 또는 최소 70% 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 Cas9 융합 단백질 중 어느 것은 D10A, N497X, R661X, Q695X 및/또는 Q926X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본 명세서에 제공된 아미노산 서열 중 어느 것에 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 고충실도 Cas9 효소는 SpCas9(K855A), eSpCas9(1.1), SpCas9-HF1, 또는 초정밀(hyper accurate) Cas9 변이체(HypaCas9)이다. 일부 구현예에서, 변형된 Cas9 eSpCas9(1.1)은 HNH/RuvC 그루브(groove)와 비표적 DNA 가닥 사이의 상호작용을 약화시켜 가닥 분리를 방지하고 오프-타겟 부위에서 절단하는 알라닌 치환을 함유한다. 마찬가지로 SpCas9-HF1은 Cas9와 DNA 인산염 백본의 상호 작용을 방해하는 알라닌 치환을 통해 오프-타겟 편집을 낮춘다. HypaCas9는 Cas9 교정 및 표적 차별을 증가시키는 REC3 도메인의 돌연변이(SpCas9 N692A/M694A/Q695A/H698A)를 포함한다. 세 가지 고충실도 효소는 모두 야생형 Cas9보다 오프-타겟 편집을 덜 생성한다.

독점성이 감소된 Cas9 도메인(Cas9 domains with Reduced Exclusivity)

일반적으로 에스. 파이오게네스(S. pyogenes)의 Cas9(spCas9)와 같은 Cas9 단백질은 "프로토스페이서 인접 모티프(PAM)" 또는 PAM 유사 모티프가 필요하며, 이는 CRISPR 박테리아 적응성 면역(adaptive immune) 시스템에서 Cas9 뉴클레아제가 목표로 하는 DNA 서열 바로 뒤에 나타나는 2-6 염기쌍 DNA 서열로 되어 있다. 특정 핵산 영역을 결합하려면 NGG PAM 서열의 존재가 필요하며, 여기서 "NGG"의 "N"은 아데노신(A), 티미딘(T) 또는 사이토신(C)이고 G는 구아노신이다. 이는 게놈 내에서 원하는 염기를 편집하는 능력을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 문서에 제공된 염기 편집 융합 단백질은 정확한 위치, 예를 들어 PAM의 상류에 있는 표적 염기를 포함하는 영역에 배치되는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어 Komor, A.C., 등 “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”Nature 533, 420-424 (2016)를 참조할 수 있고, 이는 전체 내용이 여기에 참조로 포함된다.

PAM 서열에 결합할 수 있는 spCas9 단백질에 대한 예시적인 폴리펩티드 서열은 서열 목록에 서열 번호: 250, 254, 및 322-325로 제공된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 표준(canonical)(예를 들어, NGG) PAM 서열을 포함하지 않는 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 Cas9 도메인을 포함할 수 있다. 비표준(non-canonical) PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 당업계에 기술되어 있으며 당업자에게는 명백할 것이다. 예를 들어, 비표준 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 Kleinstiver, B. P., 등 “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities”Nature 523, 481-485 (2015); and Kleinstiver, B. P., 등 “Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition”Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)에 기재되어 있으며; 각각의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.

니카아제(Nickases)

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 니카아제 도메인을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "니카아제"는 듀플렉스된 핵산 분자 (예를 들어 DNA)에서 두 가닥 중 한 가닥만 절단할 수 있는 뉴클레아제 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 의미한다. 일부 구현예에서, 니카아제는 활성 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 완전히 촉매적으로 활성인(예를 들어, 천연) 형태의 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인이 Cas9로부터 유래된 니카아제 도메인을 포함하는 경우, Cas9 유래 니카아제 도메인은 위치 840에 D10A 돌연변이 및 히스티딘을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 잔기 H840은 촉매 활성을 유지하여 듀플렉스된 핵산 단일 가닥이 절단될 수 있다. 또 다른 예에서, Cas9 유래 니카아제 도메인은 H840A 돌연변이를 포함할 수 있는 반면, 위치 10의 아미노산 잔기는 D로 유지된다. 일부 구현예에서, 니카아제 도메인은 니카아제 활성에 필요하지 않은 뉴클레아제 도메인의 전부 또는 일부를 제거함으로써 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 형태인 완전히 촉매적으로 활성인(예를 들어, 천연) 형태의 니카아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인이 Cas9로부터 유래된 니카아제 도메인을 포함하는 경우, Cas9 유래 니카아제 도메인은 RuvC 도메인 또는 HNH 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 야생형 Cas9은 다음 아미노산 서열에 상응하거나 이를 포함한다:

(서열번호: 250) (밑줄: HNH 도메인, 이중 밑줄: RuvC 도메인)

일부 구현예에서, 니카아제 도메인(예를 들어, Cas9-유래 니카아제 도메인, Cas12-유래 니카아제 도메인)을 포함하는 염기 편집기에 의해 절단되는 듀플렉스된 핵산 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 가닥은 염기 편집기 (즉, 염기 편집기에 의해 절단되는 가닥이 편집될 염기를 포함하는 가닥의 반대편에 있음)에 의해 편집되지 않는 가닥이다. 다른 구현예에서, 니카아제 도메인(예를 들어, Cas9-유래 니카아제 도메인, Cas12-유래 니카아제 도메인)을 포함하는 염기 편집기는 편집을 위해 표적화되는 DNA 분자의 가닥을 절단할 수 있다. 이러한 구현예에서, 비표적화 가닥은 절단되지 않는다.

일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 비활성(예를 들어, 비활성화) DNA 절단 도메인을 갖고, 즉 Cas9는 "nCas9" 단백질("니카아제" Cas9의 경우)로 지칭되는 니카아제이다. Cas9 니카아제는 듀플렉스된 핵산 분자(예를 들어, 듀플렉스된 DNA 분자)의 단지 하나의 가닥을 절단할 수 있는 Cas9 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 니카아제는 듀플렉스된 핵산 분자의 표적 가닥을 절단하며, 이는 Cas9 니카아제가 Cas9에 결합된 gRNA(예를 들어, sgRNA)에 염기 쌍을 이루는 (상보적으로) 연결된 가닥을 절단함을 의미한다. 일부 구현예에서, Cas9 니카아제는 D10A 돌연변이를 포함하고 위치 840에서 히스티딘을 갖는다

일부 구현예에서, Cas9 니카아제는 듀플렉스된 핵산 분자의 비표적, 비-염기 편집 가닥을 절단하는데, 이는 Cas9 니카아제가 Cas9에 결합된 gRNA (예를 들어, sgRNA)와 염기 쌍을 이루지 않은 가닥을 절단한다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, Cas9 니카아제는 H840A 돌연변이를 포함하고 위치 10에 아스파르트산 잔기 또는 상응하는 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서 Cas9 니카아제는 본원에 제공된 Cas9 니카아제 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상, 적어도 96% 이상, 적어도 97% 이상, 적어도 98% 이상, 적어도 99% 이상 또는 적어도 99.5% 이상 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 적합한 Cas9 니카아제는 본 개시내용 및 해당 분야의 지식에 기초하여 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시내용의 범위 내에 있다.

예시적인 촉매적 Cas9 니카아제(nCas9)의 아미노산 서열은 다음과 같다:

MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD (서열번호: 254).

Cas9 뉴클레아제에는 RuvC와 HNH라는 두 가지 기능성 엔도뉴클레아제 도메인이 있다. Cas9는 표적 DNA의 반대 가닥을 절단하기 위해 뉴클레아제 도메인을 위치시키는 표적 결합 시 형태 변화를 겪는다. Cas9 매개 DNA 절단의 최종 결과는 표적 DNA(PAM 서열 상류의 ~3-4 뉴클레오티드) 내의 이중-가닥 파손(double-strand break, DSB)이다. 생성된 DSB는 다음 두 가지 일반적인 복구 경로 중 하나에 의해 복구된다. (1) 효율적이지만 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ(비-동종 말단 결합, non-homologous end joining) 경로; 또는 (2) 덜 효율적이지만 고충실도의 HDR(상동성 지시 복구, homology directed repair) 경로.

NHEJ 및/또는 HDR의 “효율성”은 편리한 방법으로 계산할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 효율성은 성공적 HDR의 백분율로 표시될 수 있다. 예를 들어, 서베이어 뉴클레아제 분석(surveyor nuclease assay)을 이용하여 절단 생성물을 생성할 수 있고, 생성물 대 기질의 비율을 사용하여 백분율을 계산할 수 있다. 예를 들어, 성공적인 HDR의 결과로 새로 혼입된 제한 서열(integrated restriction sequence)를 포함하는 DNA를 직접 절단하는 서베이어 뉴클레아제 효소를 사용할 수 있다. 더 많이 절단된 기질은 더 높은 HDR 비율(HDR 효율성이 더 높음)을 나타낸다. 예시적 예로서, HDR의 분율(백분율)은 다음 식 [(절단 생성물(cleavage products))/(기질+절단 생성물(substrate plus cleavage products))] (예를 들어, (b+c)/(a+b+c), 여기서 “”는 DNA 기질의 밴드 강도이고, “”및 “”는 절단 생성물이다)으로 계산될 수 있다.

일부 구현예에서, 효율성은 성공적인 NHEJ의 백분율로 표현될 수 있다. 예를 들어, T7 엔도뉴클레아제 I 분석을 사용하여 절단 생성물을 생성할 수 있으며 생성물 대 기질의 비율을 사용하여 NHEJ 비율을 계산할 수 있다. T7 엔도뉴클레아제 I은 야생형 및 돌연변이 DNA 가닥의 혼성화로 인해 발생하는 미스매치된 이종성 이중 DNA를 절단한다(NHEJ는 오리지널 절단 부위에서 작은 무작위 삽입(random insertions) 또는 삭제(deletions, 인델)를 생성한다). 절단이 많을수록 NHEJ 비율이 높아진다(NHEJ 효율성이 높아짐). 예시적인 예로서, NHEJ의 비율(백분율)은 다음 식을 사용하여 계산할 수 있다: (1-(1-(b+c)/(a+b+c))^1/2)×100, 여기서 "a "는 DNA 기질의 밴드 강도이고 "b"와 "c"는 절단 생성물이다 (Ran 등Cell. 2013 Sep. 12; 154(6):1380-9; and Ran et al., Nat Protoc. 2013 Nov.; 8(11): 2281-2308).

NHEJ 복구 경로는 가장 활동적인 복구 메커니즘이며 DSB 부위에서 작은 뉴클레오티드 삽입 또는 삭제(인델)를 자주 유발한다. NHEJ-매개 DSB 복구의 무작위성(randomness)은 Cas9 및 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포 집단이 다양한 돌연변이 배열을 초래할 수 있기 때문에 중요한 실제적 의미를 갖는다. 대부분의 구현예에서, NHEJ는 표적 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF) 내의 조기 종결 코돈을 초래하는 아미노산 결실, 삽입 또는 프레임이동 돌연변이를 초래하는 표적 DNA의 작은 삽입결실을 발생시킨다. 이상적인 최종 결과는 표적 유전자 내의 기능 상실 돌연변이(loss-of-function mutation)이다.

NHEJ 매개 DSB 복구는 종종 유전자의 개방형 판독 프레임을 방해하는 반면, HDR은 단일 뉴클레오티드 변화부터 형광단 또는 태그 추가와 같은 대규모 삽입에 이르기까지 특정 뉴클레오티드 변화를 생성하는 데 사용될 수 있다.

유전자 편집을 위해 HDR을 활용하기 위해, 원하는 서열을 포함하는 DNA 복구 템플릿을 gRNA 및 Cas9 또는 Cas9 니카아제와 함께 관심 세포 유형으로 전달할 수 있다. 복구 템플릿에는 원하는 편집 내용과 표적의 바로 상류 및 하류에 있는 추가 상동성 서열(왼쪽 및 오른쪽 상동성 암(left & right homology arms)이라고 함)이 포함될 수 있다. 각 상동성 암의 길이는 도입되는 변화의 크기에 따라 달라질 수 있으며, 더 큰 삽입에는 더 긴 상동성 암이 필요하다. 복구 템플릿은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이중-가닥 DNA 플라스미드일 수 있다. HDR의 효율성은 Cas9, gRNA 및 외인성 복구 템플릿을 발현하는 세포에서도 일반적으로 낮다(변형된 대립유전자의 <10%). HDR은 세포 주기의 S 및 G2 단계에서 발생하므로 세포를 동기화함으로써 HDR의 효율성을 향상시킬 수 있다. NHEJ와 관련된 유전자를 화학적으로 또는 유전적으로 억제하는 것도 HDR 빈도를 증가시킬 수 있다.

일부 구현예에서, Cas9는 변형된 Cas9이다. 주어진 gRNA 표적화 서열은 부분적 상동성이 존재하는 게놈 전반에 걸쳐 추가적인 부위를 가질 수 있다. 이들 부위는 오프-타겟이라 불리며 gRNA를 설계할 때 고려되어야 한다. gRNA 설계를 최적화하는 것 외에도, CRISPR 특이성은 또한 Cas9에 대한 변형을 통해 증가될 수 있다. Cas9는 2 개의 뉴클레아제 도메인인 RuvC 및 HNH의 조합된 활성을 통해 이중-가닥 절단(DSB)을 생성한다. SpCas9의 D10A 돌연변이체인 Cas9 니카아제는 하나의 뉴클레아제 도메인을 보유하고 DSB보다 DNA 닉을 생성한다. 니카아제 시스템은 또한 특이적 유전자 편집을 위해 HDR-매개 편집과 조합될 수 있다.

촉매적 사멸 뉴클레아제

또한 본원에는 촉매적으로 사멸(즉, 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 절단할 수 없는) 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기가 제공된다. 본원에서 용어 "촉매적으로 사멸된" 및 "뉴클레아제 사멸된"은 핵산의 가닥을 절단할 수 없는 능력을 초래하는 하나 이상의 돌연변이 및/또는 결실을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 사멸된 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 염기 편집기는 하나 이상의 뉴클레아제 도메인에서 특이적 점 돌연변이의 결과로서 뉴클레아제 활성이 결여될 수 있다. 예를 들어, Cas9 도메인을 포함하는 염기 편집기의 경우, Cas9는 D10A 돌연변이 및 H840A 돌연변이 둘 모두를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 뉴클레아제 도메인 둘 모두를 비활성화하여, 뉴클레아제 활성의 손실을 초래한다. 다른 구현예에서, 촉매적으로 사멸된 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 촉매 도메인(예를 들어, RuvC1 및/또는 HNH 도메인)의 전부 또는 부분의 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 촉매적으로 사멸된 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 점 돌연변이(예를 들어, D10A 또는 H840A) 뿐만 아니라 뉴클레아제 도메인의 전부 또는 부분의 결실을 포함한다. dCas9 도메인은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Qi 등, "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression." Cell. 2013; 152(5):1173-83에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.

추가의 적합한 뉴클레아제-비활성 dCas9 도메인은 본 개시내용 및 당해 분야의 지식에 기초하여 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시내용의 범주 내에 있다. 이러한 추가의 예시적인 적합한 뉴클레아제-비활성 Cas9 도메인은 D10A/H840A, D10A/D839A/H840A, 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이체 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Prashant 등, CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838을 참조하며, 이의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다).

일부 구현예에서, dCas9는 Cas9 뉴클레아제 활성을 불활성화하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 Cas9 아미노산 서열에 상응하거나, 부분적으로 또는 전체적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-비활성 dCas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열의 D10X 돌연변이 및 H840X 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산 변화이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본원에 제시된 아미노산 서열의 D10A 돌연변이 및 H840A 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 클로닝 벡터 pPlatTET-gRNA2(수탁 번호 BAV54124)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 가이드 표적 서열의 상보적 가닥을 절단할 수 있지만 이중 가닥 가이드 표적 서열의 비-상보적 가닥을 절단하는 능력은 감소된다. 예를 들어, 변이체 Cas9 단백질은 RuvC 도메인의 기능을 감소시키는 돌연변이(아미노산 치환)을 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 D10A(아미노산 위치 10에서 아스파르테이트를 알라닌으로)를 가지며 따라서 이중 가닥 가이드 표적 서열의 상보적 가닥을 절단할 수 있지만 이중 가닥 가이드 표적 서열의 비-상보적 가닥을 절단하는 능력은 감소된다(따라서 변이체 Cas9 단백질이 이중 가닥 표적 핵산을 절단할 때 이중 가닥 절단(DSB) 대신에 단일 가닥 절단(SSB)을 초래한다)(예를 들어, Jinek 등, Science. 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21 참조).

일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 이중 가닥 가이드 표적 서열의 비-상보적 가닥을 절단할 수 있지만 가이드 표적 서열의 상보적 가닥을 절단하는 능력은 감소된다. 예를 들어, 변이체 Cas9 단백질은 HNH 도메인(RuvC/HNH/RuvC 도메인 모티프)의 기능을 감소시키는 돌연변이(아미노산 치환)를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A(아미노산 위치 840에서 히스티딘을 알라닌으로) 돌연변이를 가지며 따라서 가이드 표적 서열의 비-상보적 가닥을 절단할 수 있지만 가이드 표적 서열의 상보적 가닥을 절단하는 능력은 감소된다(따라서 변이체 Cas9 단백질이 이중 가닥 가이드 표적 서열을 절단할 때 DSB 대신에 SSB를 초래한다). 이러한 Cas9 단백질은 가이드 표적 서열(예를 들어, 단일 가닥 가이드 표적 서열)을 절단하는 능력이 감소되지만 가이드 표적 서열(예를 들어, 단일 가닥 가이드 표적 서열)을 결합하는 능력은 보유한다.

또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 W476A 및 W1126A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 보유한다.

또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 보유한다.

또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, W476A, 및 W1126A, 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 보유한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, D10A, W476A, 및 W1126A, 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 보유한다. 일부 구현예에서, 변이체 Cas9는 Cas9 HNH 도메인의 위치 840에서 촉매 His 잔기를 복원하였다(A840H).

또 다른 비제한적인 예로, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A 및 D1127A 돌연변이를 가지고 있고, 따라서 DNA를 절단하는 능력이 감소된다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력은 감소하지만 표적 DNA (예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력은 유지한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 D10A, H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소되지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 결합하는 능력은 보유한다. 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질이 W476A 및 W1126A 돌연변이를 보유하거나 또는 변이체 Cas9 단백질이 P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 보유할 때, 변이체 Cas9 단백질은 PAM 서열에 효율적으로 결합하지 않는다. 따라서, 따라서, 일부 이러한 경우에, 이러한 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용될 때, 상기 방법은 PAM 서열이 필요하지 않다. 다시 말해서, 일부 구현예에서, 이러한 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용될 때, 상기 방법은 가이드 RNA를 포함할 수 있지만, 상기 방법은 PAM 서열의 부재 하에 수행될 수 있다(그리고 따라서 결합의 특이성은 가이드 RNA의 표적화 분절에 의해 제공된다). 다른 잔기가 돌연변이되어 상기 효과를 달성할 수 있다(즉, 하나 또는 다른 뉴클레아제 부분을 비활성화시킨다). 비제한적인 예로서, 잔기 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, 및/또는 A987은 변경(즉, 치환)될 수 있다. 또한, 알라닌 치환 이외의 돌연변이가 적합하다. 일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질이 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, 및/또는 A987 돌연변이를 갖는, 예를 들어 D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A, 및/또는 D986A일 때)은 감소된 촉매 활성을 가지며, 변이체 Cas9 단백질은 부위-특이적으로 표적 DNA에 여전히 결합할 수 있다 (왜냐하면 가이드 RNA와 상호작용하는 능력을 유지하는 한 여전히 가이드 RNA에 의해 표적 DNA 서열로 가이드되기 때문이다).

일부 구현예에서, 변이체 Cas 단백질은 spCas9, spCas9-VRQR, spCas9-VRER, xCas9(sp), saCas9, saCas9-KKH, spCas9-MQKSER, spCas9-LRKIQK, 또는 spCas9-LRVSQL일 수 있다.

일부 구현예에서, Cas9 도메인은 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9(SaCas9) 도메인이다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SaCas9, 뉴클레아제 불활성 SaCas9(SaCas9d), 또는 SaCas9 니카아제(SaCas9n)이다. 일부 구현예에서, SaCas9는 N579A 돌연변이, 또는 함께 제출된 서열목록에 제공된 임의의 아미노산 서열에 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인 또는 SaCas9n 도메인은 비표준 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인, 또는 SaCas9n 도메인은 NNGRRT 또는 NNGRRV PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 E781X, N967X 및 R1014X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본 명세서에 제공된 임의의 아미노산 서열에 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 E781K, N967K 및 R1014H 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인은 E781K, N967K 또는 R1014H 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 융합 단백질에 존재하는 Cas9 도메인 중 하나는 PAM 서열에 대한 요구 사항이 없는 가이드 뉴클레오티드 서열 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 도메인으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서 Cas9는 SaCas9이다. SaCas9의 잔기 A579는 N579에서 돌연변이되어 SaCas9 니카아제를 생성할 수 있다. 잔기 K781, K967 및 H1014는 E781, N967 및 R1014에서 돌연변이되어 SaKKH Cas9를 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 아미노산 치환 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E, 및 T1337R(SpCas9-MQKFRAER)을 포함하고 변경된 PAM 5'-NGC-3'에 대해 특이성을 갖는 변형된 SpCas9를 사용하였다.

에스. 파이오게네스(S. pyogenes) Cas9에 대한 대안에는 포유류 세포에서 절단 활성을 나타내는 Cpf1 계열의 RNA 유도 엔도뉴클레아제가 포함될 수 있다. Prevotella 및 Francisella 1의 CRISPR(CRISPR/Cpf1)은 CRISPR/Cas9 시스템과 유사한 DNA 편집 기술이다. Cpf1은 클래스 II CRISPR/Cas 시스템의 RNA 유도 엔도뉴클레아제이다. 이러한 후천적 면역 메커니즘은 Prevotella 및 Francisella 박테리아에서 발견된다. Cpf1 유전자는 CRISPR 유전자좌와 연관되어 있으며 가이드 RNA를 사용하여 바이러스 DNA를 찾아 절단하는 엔도뉴클레아제를 코딩한다. Cpf1은 Cas9보다 작고 단순한 엔도뉴클레아제로 CRISPR/Cas9 시스템 제한 사항 중 일부를 극복한다. Cas9 뉴클레아제와 달리 Cpf1 매개 DNA 절단의 결과는 짧은 3' 오버행을 갖는 이중-가닥 파손이다. Cpf1의 엇갈린(staggered) 절단 패턴은 전통적인 제한 효소 복제와 유사한 방향성 유전자 전달 가능성을 열어 유전자 편집 효율성을 높일 수 있다. 위에서 설명한 Cas9 변종 및 오솔로그(orthologues)와 마찬가지로 Cpf1은 CRISPR의 표적이 될 수 있는 부위의 수를 SpCas9가 선호하는 NGG PAM 부위가 없는 AT가 풍부한 부위 또는 AT가 풍부한 게놈으로 확장할 수도 있다. Cpf1 유전자좌에는 혼합 알파/베타 도메인, RuvC-I, 이어서 힐리컬(helical) 영역, RuvC-II 및 징크 핑거형 도메인이 포함되어 있다. Cpf1 단백질에는 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC 유사 엔도뉴클레아제 도메인이 있다.

또한 Cpf1은 Cas9와 달리 HNH 엔도뉴클레아제 도메인이 없으며 Cpf1의 N 말단에는 Cas9의 알파-힐리컬 인식 로브(alpha-helical recognition lobe)가 없다. Cpf1 CRISPR-Cas 도메인 아키텍처는 Cpf1이 기능적으로 고유하며 클래스 2, 유형 V CRISPR 시스템으로 분류됨을 보여준다. Cpf1 유전자좌는 유형 II 시스템보다 유형 I 및 III과 더 유사한 Cas1, Cas2 및 Cas4 단백질을 코딩한다. 기능성 Cpf1에는 트랜스 활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)가 필요하지 않으므로 CRISPR(crRNA)만 필요하다. Cpf1은 Cas9보다 작을 뿐만 아니라 sgRNA 분자도 더 작기 때문에(Cas9의 뉴클레오티드 수의 약 절반) 게놈 편집에 이점이 있다. Cpf1-crRNA 복합체는 Cas9가 표적으로 하는 G가 풍부한 PAM과 달리 프로토스페이서 인접 모티프 5'-YTN-3' 또는 5'-TTN-3'을 식별하여 표적 DNA 또는 RNA를 절단한다. PAM을 확인한 후 Cpf1은 4개 또는 5개 뉴클레오티드의 오버행을 갖는 스틱키-말단-유사(sticky-end-like) DNA 이중 가닥 파손(break)을 도입한다.

일부 구현예에서, Cas9는 변경된 PAM 서열에 대해 특이성을 갖는 Cas9 변이체이다. 일부 구현예에서, 추가의 Cas9 변이체 및 PAM 서열은 Miller, S.M., 등 Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs, Nat. Biotechnol. (2020)에 기재되어 있으며, 이의 전문은 여기에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체는 특이적 PAM 요건을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, Cas9 변이체, 예를 들어, SpCas9 변이체는 NRNH PAM에 대해 특이성을 가지며, 여기서 R은 A 또는 G이고, H는 A, C, 또는 T이다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 PAM 서열 AAA, TAA, CAA, GAA, TAT, GAT 또는 CAC에 대해 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 위치 1114, 1134, 1135, 1137, 1139, 1151, 1180, 1188, 1211, 1218, 1219, 1221, 1249, 1256, 1264, 1290, 1318, 1317, 1320, 1321, 1323, 1332, 1333, 1335, 1337, 또는 1339, 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 위치 1114, 1135, 1218, 1219, 1221, 1249, 1320, 1321, 1323, 1332, 1333, 1335, 또는 1337 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 위치 1114, 1134, 1135, 1137, 1139, 1151, 1180, 1188, 1211, 1219, 1221, 1256, 1264, 1290, 1318, 1317, 1320, 1323, 1333 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 위치 1114, 1131, 1135, 1150, 1156, 1180, 1191, 1218, 1219, 1221, 1227, 1249, 1253, 1286, 1293, 1320, 1321, 1332, 1335, 1339 또는 이의 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 변이체는 위치 1114, 1127, 1135, 1180, 1207, 1219, 1234, 1286, 1301, 1332, 1335, 1337, 1338, 1349 또는 이의 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. SpCas9 변이체의 예시적인 아미노산 치환 및 PAM 특이성은 표 2A-2D에 나타낸다.

표 2A. SpCas9 변이체 및 PAM 특이성

표 2B. SpCas9 변이체 및 PAM 특이성

표 2C. SpCas9 변이체 및 PAM 특이성

표 2D. SpCas9 변이체 및 PAM 특이성

변형된 PAM 인식을 갖는 추가의 예시적인 Cas9 (예를 들어, SaCas9) 폴리펩티드는 Kleinstiver, 등 “the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition,”에 기재되어 있고, 이 내용은 모두 여기에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 변경 E782K, N929R, N968K 및/또는 R1015H 중 하나 이상을 포함하는 Cas9 변이체 (예를 들어, SaCas9 변이체)는 참조 폴리펩티드(예를 들어, SaCas9) NNNRRT 또는 NNHRRT PAM 서열에 대해 특이성을 갖거나 증가된 편집 활성과 연관되며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드를 나타내고, H는 G 이외의 임의의 뉴클레오티드(즉, "G가 아님")를 나타내며, R은 퓨린을 나타낸다. 구현예에서, Cas9 변이체(예를 들어, SaCas9 변이체)는 변경 E782K, N968K 및 R1015H 또는 변경 E782K, K929R 및 R1015H를 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)은 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 효과기이다.

미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 효과기는 Cas9, Cpf1, Cas12b/C2c1, 및 Cas12c/C2c3을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 미생물 CRISPR-Cas 시스템은 클래스 1 및 클래스 2 시스템으로 나눠진다. 클래스 1 시스템은 다중 서브유닛 효과기 복합체를 갖는 반면, 클래스 2 시스템은 단일 단백질 효과기를 갖는다. 예를 들어, Cas9 및 Cpf1은 클래스 2 효과기이다. Cas9 및 Cpf1 외에도, 3 개의 별도의 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템(Cas12b/C2c1, 및 Cas12c/C2c3)이 Shmakov 등, "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems",　Mol. Cell,　2015 Nov. 5; 60(3): 385-397에 기재되었으며, 이의 전체 내용이 여기에 참조로 포함된다. 2 개의 시스템인 Cas12b/C2c1, 및 Cas12c/C2c3의 효과기는 Cpf1과 관련된 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. 제3 시스템은 2 개의 예측된 HEPN RNase 도메인을 갖는 효과기를 함유한다. 성숙 CRISPR RNA의 생산은 Cas12b/C2c1에 의한 CRISPR RNA의 생산과 달리 tracrRNA-독립적이다. Cas12b/C2c1은 DNA 절단을 위해 CRISPR RNA 및 tracrRNA 둘 모두에 따라 달라진다.

일부 구현예에서, napDNAbp는 원형 순열(예를 들어, 서열번호: 326)이다.

알리사이클로바실루스 아시도테라스트리스(Alicyclobaccillus acidoterrastris)　Cas12b/C2c1(AacC2c1)의 결정 구조는 키메라 단일-분자 가이드 RNA(sgRNA)와의 복합체로 보고되었다. 예를 들어, Liu 등, "C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism",　Mol. Cell,　2017 Jan. 19; 65(2):310-322를 참조하며, 이의 전체 내용이 여기에 참조로 포함된다. 결정 구조는 또한 삼원 복합체로서 표적 DNA에 결합된 알리사이클로바실루스 아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris) C2c1에서 보고되었다. 예를 들어, Yang 등, "PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease",　Cell,　2016 Dec. 15; 167(7):1814-1828을 참조하며, 이의 전체 내용이 여기에 참조로 포함된다. 표적 및 비-표적 DNA 가닥 둘 모두를 갖는 AacC2c1의 촉매적으로 적격한 형태는 독립적으로 단일 RuvC 촉매 포켓 내에 위치하도록 포획되었으며, Cas12b/C2c1-매개 절단은 표적 DNA의 시차를 둔 7-뉴클레오티드 절단을 초래한다. Cas12b/C2c1 삼원 복합체 및 이전에 식별된 Cas9 및 Cpf1 대응물 사이의 구조적 비교는 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 사용되는 메커니즘의 다양성을 입증한다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)은 Cas12b/C2c1, 또는 Cas12c/C2c3 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12b/C2c1 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12c/C2c3 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12b/C2c1 또는 Cas12c/C2c3 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 쉽게(at ease) 99.5% 동일한 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12b/C2c1 또는 Cas12c/C2c3 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 본원에 제공된 napDNAbp 서열 중 임의의 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 바람직하게는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 Cas12b/C2c1 또는 Cas12c/C2c3은 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.

일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12c를 지칭한다. 일부 구현예에서, Cas12c 단백질은 Cas12c1(서열번호: 327) 또는 Cas12c1의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12c2(서열번호: 328) 또는 Cas12c2의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 올레이필루스 종 HI0009(즉, OspCas12c; 서열번호: 329)로부터의 Cas12c 단백질 또는 OspCas12c의 변이체이다. 이들 Cas12c 분자는 Yan 등, "Functionally Diverse Type V CRISPR-Cas Systems," Science, 2019 Jan. 4; 363: 88-91에 기재되어 있으며; 이의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 본원에 기재된 임의의 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 바람직하게는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 Cas12c1, Cas12c2, 또는 OspCas12c가 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.

일부 구현예에서, napDNAbp는 예를 들어 Yan 등, "Functionally Diverse Type V CRISPR-Cas Systems," Science, 2019 Jan. 4; 363: 88-91에 기재된 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i를 지칭하고; 각각의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다. 예시적인 Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i 폴리펩티드 서열은 서열목록에서 서열번호: 330-333으로서 제공된다. 10 테라바이트 초과의 서열 데이터를 종합함으로써, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i를 포함하는, 이전에 특징화된 클래스 V 단백질과 약한 유사성을 나타내는 V형 Cas 단백질의 새로운 분류가 식별되었다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12g 또는 Cas12g의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12h 또는 Cas12h의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 Cas12i 또는 Cas12i의 변이체이다. 다른 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질이 napDNAbp로서 사용될 수 있고, 본 개시내용의 범주 내에 있다는 것이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12g, Cas12h 또는 Cas12i 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i 단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 본원에 기재된 임의의 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 바람직하게는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 Cas12g, Cas12h, 또는 Cas12i가 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, Cas12i는 Cas12i1 또는 Cas12i2이다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp)은 Cas12j/CasΦ단백질일 수 있다. Cas12j/CasΦ는 Pausch 등, "CRISPR-CasΦfrom huge phages is a hypercompact genome editor," Science, 17 July 2020, Vol. 369, Issue 6501, pp. 333-337에 기재되어 있으며, 이는 이의 전문이 여기에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12j/CasΦ단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 바람직하게는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12j/CasΦ단백질이다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 뉴클레아제 불활성("사멸") Cas12j/CasΦ단백질이다. 다른 종들로부터의 Cas12j/CasΦ가 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

내부 삽입을 갖는 융합 단백질

본원에는 핵산 프로그래밍 가능한 핵산 결합 단백질, 예를 들어, napDNAbp에 융합된 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 아래에 상세히 설명된 바와 같이, 본 개시내용은 이종성 폴리펩티드를 특징으로 하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 융합 단백질의 이종성 도메인의 전부 또는 일부를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 인트론을 포함한다. 이종성 폴리펩티드는 천연 또는 야생형 napDNAbp 폴리펩티드 서열에서 발견되지 않는 폴리펩티드일 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 napDNAbp의 C-말단 단부, napDNAbp의 N-말단 단부에서 napDNAbp에 융합되거나, 또는 napDNAbp의 내부 위치에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 napDNAbp의 내부 위치에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제의 사이티딘) 또는 이의 기능적 단편이다. 예를 들어, 융합 단백질은 Cas9 또는 Cas12 (예를 들어 Cas12b/C2c1) 폴리펩티드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 APOBEC 데아미나아제 (예를 들어 APOBEC1)이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA (예를 들어, TadA*7.10 또는 TadA*8)이다. 일부 구현예에서, TadA는 TadA*8 또는 TadA*9이다. 본원에 개시된 TadA 서열 (예를 들어 TadA7.10 또는 TadA*8)은 상기-기재된 융합 단백질의 적합한 데마이나아제이다.

일부 구현예에서, 융합 단백질은 구조

NH₂-[napDNAbp의 N-말단 단편]-[데아미나아제]-[napDNAbp의 C-말단 단편]-COOH;

NH₂-[Cas9의 N-말단 단편]-[아데노신 데아미나아제]-[Cas9의 C-말단 단편]-COOH;

NH₂-[Cas12의 N-말단 단편]-[아데노신 데아미나아제]-[Cas12의 C-말단 단편]-COOH;

NH₂-[Cas9의 N-말단 단편]-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas9의 C-말단 단편]-COOH;

NH₂-[Cas12의 N-말단 단편]-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas12의 C-말단 단편]-COOH;를 포함하며;

여기서 "]-["의 각 인스턴스는 선택적 링커이다.

데아미나아제는 원형 순열 데아미나아제일 수 있다. 예를 들어, 데아미나아제는 원형 순열 아데노신 데아미나아제일 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 넘버링된 바와 같이 아미노산 잔기 116, 136 또는 65에서 원형으로 순열된 원형 순열 TadA이다.

융합 단백질은 하나 초과의 데아미나아제를 포함할 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 또는 두 개의 데아미나아제를 포함한다. 융합 단백질에서 2개 이상의 데아미나아제는 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 2개 이상의 데아미나아제는 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다. 2개 이상의 데아미나아제는 napDNAbp에서 나란히 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 데아미나아제는 napDNAbp에서 나란히 있지 않을 수 있다.

일부 구현예에서, 융합 단백질에서 napDNAbp는 Cas9 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. Cas9 폴리펩티드는 변이체 Cas9 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 Cas9 니카아제(nCas9) 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 뉴클레아제 사멸 Cas9(dCas9) 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 융합 단백질에서 Cas9 폴리펩티드는 전장 Cas9 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 융합 단백질에서 Cas9 폴리펩티드는 전장 Cas9 폴리펩티드가 아닐 수 있다. Cas9 폴리펩티드는 자연 발생 Cas9 단백질에 대해 예를 들어, N-말단 또는 C-말단 단부에서 절단될 수 있다. Cas9 폴리펩티드는 원형으로 순열된 Cas9 단백질일 수 있다. Cas9 폴리펩티드는 여전히 표적 폴리뉴클레오티드 및 가이드 핵산 서열에 결합할 수 있는 Cas9 폴리펩티드의 단편, 부분, 또는 도메인일 수 있다.

일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 스트렙토코쿠스 파이오게네스 Cas9(SpCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9(SaCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 1 Cas9(St1Cas9), 또는 본원에 개시된 임의의 Cas9 폴리펩티드의 단편 또는 변이체이다.

일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 내에 삽입된 아데노신 데아미나아제 도메인 및 사이티딘 데아미나아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 Cas9 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나아제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 Cas9 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나아제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 Cas9 내에서 융합되고 아데노신 데아미나아제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 Cas9 내에서 융합되고 아데노신 데아미나아제는 N-말단에 융합된다.

아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제 및 Cas9를 갖는 융합 단백질의 예시적인 구조는 다음과 같이 제공된다:

NH₂-[Cas9(아데노신 데아미나아제)]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas9(아데노신 데아미나아제)]-COOH;

NH₂-[Cas9(사이티딘 데아미나아제)]-[아데노신 데아미나아제]-COOH; 또는

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[Cas9(사이티딘 데아미나아제)]-COOH.

일부 구현예에서, 상기 일반적인 구조에서 사용되는 "-"는 선택적인 링커의 존재를 나타낸다.

다양한 구현예에서, 촉매 도메인은 DNA 변형 활성(예를 들어, 데아미나아제 활성), 예컨대 아데노신 데아미나아제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA(예를 들어, TadA*7.10)이다. 일부 구현예에서, TadA는 TadA*8이다. 일부 구현예에서, TadA*8은 Cas9 내에 융합되고, 사이티딘 데아미나아제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, TadA*8 은 Cas9 내에 융합되고, 사이티딘 데아미나아제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 Cas9 내에 융합되고, TadA*8은 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 Cas9 및 N-말단에 융합된 TadA*8 내에 융합된다. TadA*8 및 사이티딘 데아미나아제 및 Cas9를 갖는 융합 단백질의 예시적인 구조는 다음과 같이 제공된다:

NH₂-[Cas9(TadA*8)]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas9(TadA*8)]-COOH;

NH₂-[Cas9(사이티딘 데아미나아제)]-[TadA*8]-COOH; 또는

NH₂-[TadA*8]-[Cas9(사이티딘 데아미나아제)]-COOH.

이종성 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제)는 예를 들어 적합한 위치에서 napDNAbp(예를 들어, Cas9 또는 Cas12 (예를 들어 Cas12b/C2c1))에 삽입될 수 있어, napDNAbp가 표적 폴리뉴클레오티드 및 가이드 핵산에 결합하는 능력을 보유하도록 한다. 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 데아미나아제의 기능(예를 들어, 염기 편집 활성) 또는 napDNAbp(예를 들어, 표적 핵산 및 가이드 핵산에 결합하는 능력)를 손상시키지 않고 napDNAbp 내로 삽입될 수 있다. 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 예를 들어, 무질서한 영역 또는 결정학 연구에 의해 나타낸 바와 같이 고온 인자(high temperature factor) 또는 B-인자(B-factor)를 포함하는 영역에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 질서가 적거나, 무질서하거나, 또는 비구조화된 단백질의 영역, 예를 들어 용매 노출된 영역 및 루프는 구조 또는 기능을 손상시키지 않고 삽입에 사용될 수 있다. 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 유연한 루프 영역 또는 용매-노출된 영역에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 Cas9 또는 Cas12b/C2c1 (예를 들어 Cas12b/C2c1) 폴리펩티드의 유연한 루프에 삽입된다.

일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)의 삽입 위치는 Cas9 폴리펩티드의 결정 구조의 B-인자 분석에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 평균보다 더 높은 B-인자(예를 들어, 총 단백질 또는 무질서한 영역을 포함하는 단백질 도메인과 비교하여 더 높은 B-인자)를 포함하는 Cas9 폴리펩티드의 영역에 삽입된다. B-인자 또는 온도 인자는 평균 위치에서 원자의 변동을 나타낼 수 있다(예를 들어, 온도-의존적 원자 진동 또는 결정 격자에서 정적 무질서의 결과). 백본 원자에 대한 높은 B-인자(예를 들어, 평균보다 더 높은 B-인자)는 비교적 높은 국소 이동성을 갖는 영역을 나타낼 수 있다. 이러한 영역은 구조 또는 기능을 손상시키지 않으면서 데아미나아제를 삽입하는 데 사용될 수 있다. 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 총 단백질에 대한 평균 B-인자보다 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 또는 200% 초과인 B-인자를 갖는 Cα 원자를 갖는 잔기가 있는 위치에 삽입될 수 있다. 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 잔기를 포함하는 Cas9 단백질 도메인에 대한 평균 B-원자보다 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 또는 200% 초과인 B-원자를 갖는 Cα 원자를 갖는 잔기가 있는 위치에 삽입될 수 있다. 평균보다 더 큰 B-원자를 포함하는 Cas9 폴리펩티드 위치는 예를 들어, 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 768, 792, 1052, 1015, 1022, 1026, 1029, 1067, 1040, 1054, 1068, 1246, 1247, 및 1248을 포함할 수 있다. 평균보다 더 큰 B-인자를 포함하는 Cas9 폴리펩티드 영역은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같이 예를 들어, 잔기 792-872, 792-906, 및 2-791을 포함할 수 있다.

이종성 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 768, 791, 792, 1015, 1016, 1022, 1023, 1026, 1029, 1040, 1052, 1054, 1067, 1068, 1069, 1246, 1247, 및 1248로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 768-769, 791-792, 792-793, 1015-1016, 1022-1023, 1026-1027, 1029-1030, 1040-1041, 1052-1053, 1054-1055, 1067-1068, 1068-1069, 1247-1248, 또는 1248-1249 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 769-770, 792-793, 793-794, 1016-1017, 1023-1024, 1027-1028, 1030-1031, 1041-1042, 1053-1054, 1055-1056, 1068-1069, 1069-1070, 1248-1249, 또는 1249-1250 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 768, 791, 792, 1015, 1016, 1022, 1023, 1026, 1029, 1040, 1052, 1054, 1067, 1068, 1069, 1246, 1247, 및 1248로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체한다. 삽입 위치와 관련하여 상기 Cas9 참조 서열에 대한 언급은 예시적인 목적을 위한 것임이 이해되어야 한다. 본원에 논의된 바와 같은 삽입은 상기 Cas9 참조 서열의 Cas9 폴리펩티드 서열로 제한되지 않지만, 변이체 Cas9 폴리펩티드, 예를 들어 Cas9 니카아제(nCas9), 뉴클레아제 사멸 Cas9(dCas9), 뉴클레아제 도메인이 결여되어 있는 Cas9 변이체, 절단된 Cas9, 또는 부분적 또는 완전한 HNH 도메인이 결여되어 있는 Cas9 도메인에서 상응하는 위치에의 삽입을 포함한다.

이종성 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 768, 792, 1022, 1026, 1040, 1068, 및 1247로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 768-769, 792-793, 1022-1023, 1026-1027, 1029-1030, 1040-1041, 1068-1069, 또는 1247-1248 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 위치 769-770, 793-794, 1023-1024, 1027-1028, 1030-1031, 1041-1042, 1069-1070, 또는 1248-1249 또는 이의 상응하는 아미노산 위치 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 폴리펩티드는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 768, 792, 1022, 1026, 1040, 1068, 및 1247로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체한다.

이종성 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제)는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 일 구현예에서, 이종성 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1002, 1003, 1025, 1052-1056, 1242-1247, 1061-1077, 943-947, 686-691, 569-578, 530-539, 및 1060-1077로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 napDNAbp에 삽입될 수 있다. 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 잔기의 N-말단 또는 C-말단에 삽입되거나 또는 잔기를 대체할 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 잔기의 C-말단에 삽입된다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제(예를 들어, TadA)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제(예를 들어, TadA)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 792-872, 792-906, 또는 2-791, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기 대신에 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체한다.

일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제(예를 들어, APOBEC1)는 상기 Cas9 참조 서열에서 번호가 매겨진 1016, 1023, 1029, 1040, 1069 및 1247로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 상응하는 다른 Cas9 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서 사이티딘 데아미나아제는 상기 Cas9 참조 서열에 번호가 매겨진 1016, 1023, 1029, 1040, 1069 및 1247로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산, 또는 다른 Cas9 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 잔기의 N-말단에 삽입된다.

일부 구현예에서 사이티딘 데아미나아제는 상기 Cas9 참조 서열에서 번호가 매겨진 1016, 1023, 1029, 1040, 1069 및 1247로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산, 또는 다른 Cas9 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 잔기의 C-말단에 삽입된다. 일부 구현예에서 사이티딘 데아미나아제는 상기 Cas9 참조 서열에서 번호가 매겨진 1016, 1023, 1029, 1040, 1069 및 1247로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산, 또는 다른 Cas9 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.

일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 768, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하기 위해 삽입된다.

일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된바와 같은 아미노산 잔기 791에 삽입되거나, 아미노산 잔기 792에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 791의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 792의 N-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 791의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 792의 N-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 791을 대체하도록 삽입되거나, 아미노산 792를 대체하도록 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하도록 삽입된다.

일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1016, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하도록 삽입된다.

일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1023에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1023의 N-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1023의 C-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1022를 대체하도록 삽입되거나, 아미노산 잔기 1023을 대체하도록 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하도록 삽입된다.

일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1029에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1029의 N-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1029의 C-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1026을 대체하도록 삽입되거나, 아미노산 잔기 1029를 대체하도록 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하도록 삽입된다.

일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040의 N-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040의 C-말단, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1040, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하도록 삽입된다.

일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1054에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1054의 N-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제 (예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1054의 C-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1052를 대체하도록 삽입되거나, 아미노산 잔기 1054를 대체하도록 삽입되거나, 또는 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하도록 삽입된다.

일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같이 아미노산 잔기 1067에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1068에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1069에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1068의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1069의 N-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1068의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1069의 C-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1067을 대체하도록 삽입되거나, 아미노산 잔기 1068을 대체하도록 삽입되거나, 아미노산 잔기 1069를 대체하도록 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하도록 삽입된다.

일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같이 아미노산 잔기 1246에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1247에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1248에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같이, 아미노산 잔기 1246의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1247의 N-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1248의 N-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 넘버링된 바와 같이 아미노산 잔기 1246의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1247의 C-말단에 삽입되거나, 아미노산 잔기 1248의 C-말단에 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 삽입된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1246을 대체하도록 삽입되거나, 아미노산 잔기 1247을 대체하도록 삽입되거나, 아미노산 잔기 1248을 대체하도록 삽입되거나, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 대체하도록 삽입된다.

일부 구현예에서, 이종성 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제)는 Cas9 폴리펩티드의 유연한 루프에 삽입된다. 유연한 루프 부분은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 530-537, 569-570, 686-691, 943-947, 1002-1025, 1052-1077, 1232-1247, 또는 1298-1300, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 유연한 루프 부분은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1-529, 538-568, 580-685, 692-942, 948-1001, 1026-1051, 1078-1231, 또는 1248-1297, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

이종성 폴리펩티드(예를 들어, 아데닌 데아미나아제)는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1017-1069, 1242-1247, 1052-1056, 1060-1077, 1002 - 1003, 943-947, 530-537, 568-579, 686-691, 1242-1247, 1298-1300, 1066-1077, 1052-1056, 또는 1060-1077, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응하는 Cas9 폴리펩티드 영역 내로 삽입될 수 있다.

이종성 폴리펩티드(예를 들어, 아데닌 데아미나아제)는 Cas9 폴리펩티드의 결실된 영역 대신에 삽입될 수 있다. 결실된 영역은 Cas9 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 부분에 상응할 수 있다. 일부 구현예에서, 결실된 영역은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 792-872, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 구현예에서, 결실된 영역은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 792-906, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 구현예에서, 결실된 영역은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 2-791, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 구현예에서, 결실된 영역은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 잔기 1017-1069, 또는 이의 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다.

예시적인 내부 융합 염기 편집기는 하기 표 3에 제공된다:

표 3. Cas9 단백질의 삽입 유전자좌

이종성 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제)는 Cas9 폴리펩티드의 구조적 또는 기능적 도메인 내에 삽입될 수 있다. 이종성 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제)는 Cas9 폴리펩티드의 2 개의 구조적 또는 기능적 도메인 사이에 삽입될 수 있다. 이종성 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제)는 예를 들어, Cas9 폴리펩티드로부터 도메인을 결실시킨 후, Cas9 폴리펩티드의 구조적 또는 기능적 도메인 대신에 삽입될 수 있다. Cas9 폴리펩티드의 구조적 또는 기능적 도메인은 예를 들어, RuvC I, RuvC II, RuvC III, Rec1, Rec2, PI, 또는 HNH를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 RuvC I, RuvC II, RuvC III, Rec1, Rec2, PI, 또는 HNH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 뉴클레아제 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 HNH 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 Cas9 폴리펩티드가 HNH 활성을 감소시키거나 또는 폐지(abolished)하도록 HNH 도메인의 부분이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Cas9 폴리펩티드는 뉴클레아제 도메인의 결실을 포함하고, 데아미나아제는 뉴클레아제 도메인을 대체하기 위해 삽입된다. 일부 구현예에서, HNH 도메인은 결실되고 데아미나아제가 그 자리에 삽입된다. 일부 구현예에서, RuvC 도메인 중 하나 이상은 결실되고 데아미나아제가 그 자리에 삽입된다.

이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질은 napDNAbp의 N-말단 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 폴리펩티드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 데아미나아제를 포함한다. N 말단 단편 또는 C 말단 단편은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있다. N 말단 단편의 C-말단 또는 C 말단 단편의 N-말단은 Cas9 폴리펩티드의 유연한 루프의 일부를 포함할 수 있다. N 말단 단편의 C-말단 또는 C 말단 단편의 N-말단은 Cas9 폴리펩티드의 알파-힐리컬 구조의 일부를 포함할 수 있다. N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 RuvC 도메인을 포함할 수 있다. N-말단 단편 또는 C-말단 단편은 HNH 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, N-말단 단편 및 C-말단 단편 중 어느 것도 HNH 도메인을 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, N 말단 Cas9 단편의 C-말단은 융합 단백질이 표적 핵염기를 탈아미노화할 때 표적 핵염기에 근접한 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, C 말단 Cas9 단편의 N-말단은 융합 단백질이 표적 핵염기를 탈아미노화할 때 표적 핵염기에 근접한 아미노산을 포함한다. 상이한 데아미나아제의 삽입 위치는 표적 핵염기 및 N 말단 Cas9 단편의 C-말단 또는 C 말단 Cas9 단편의 N-말단에서의 아미노산 사이에 근접성을 갖기 위해 상이할 수 있다. 예를 들어, 데아미나아제의 삽입 위치는 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 1015, 1022, 1029, 1040, 1068, 1247, 1054, 1026, 768, 1067, 1248, 1052, 및 1246으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 있을 수 있다.

융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편(즉, 융합 단백질에서 데아미나아제를 플랭킹하는 N-말단 Cas9 단편)은 Cas9 폴리펩티드의 N-말단을 포함할 수 있다. 융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 1300 개 아미노산의 길이를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1-56, 1-95, 1-200, 1-300, 1-400, 1-500, 1-600, 1-700, 1-718, 1-765, 1-780, 1-906, 1-918, 또는 1-1100, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. N-말단 Cas9 단편은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1-56, 1-95, 1-200, 1-300, 1-400, 1-500, 1-600, 1-700, 1-718, 1-765, 1-780, 1-906, 1-918, 또는 1-1100, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 서열 상동성을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

융합 단백질의 C-말단 Cas9 단편(즉, 융합 단백질에서 데아미나아제를 플랭킹하는 C-말단 Cas9 단편)은 Cas9 폴리펩티드의 C-말단을 포함할 수 있다. 융합 단백질의 C-말단 Cas9 단편은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 1300 개 아미노산의 길이를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 C-말단 Cas9 단편은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1099-1368, 918-1368, 906-1368, 780-1368, 765-1368, 718-1368, 94-1368, 또는 56-1368, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. N-말단 Cas9 단편은 상기 Cas9 참조 서열에서 넘버링된 바와 같은 아미노산 잔기 1099-1368, 918-1368, 906-1368, 780-1368, 765-1368, 718-1368, 94-1368, 또는 56-1368, 또는 또 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 서열 상동성을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

함께 취해진 융합 단백질의 N-말단 Cas9 단편 및 C-말단 Cas9 단편은 예를 들어, 상기 Cas9 참조 서열에 제시된 바와 같은 전장 자연 발생 Cas9 폴리펩티드 서열에 상응하지 않을 수 있다.

본원에 기재된 융합 단백질은 감소된 게놈 와이드 허위 탈아미노화와 같은, 비-표적 부위(예를 들어, 오프-타겟 부위)에서 감소된 탈아미노화로 표적화된 탈아미노화에 영향을 미칠 수 있다. 본원에 기재된 융합 단백질은 비-표적 부위에서 감소된 방관자 탈아미노화로 표적화된 탈아미노화에 영향을 미칠 수 있다. 바람직하지 않은 탈아미노화 또는 오프-타겟 탈아미노화는 예를 들어, Cas9 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 융합된 데아미나아제를 포함하는 단부 말단 융합 단백질과 비교하여 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%까지 감소될 수 있다. 바람직하지 않은 탈아미노화 또는 오프-타겟 탈아미노화는 예를 들어, Cas9 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 융합된 데아미나아제를 포함하는 단부 말단 융합 단백질과 비교하여, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10배, 적어도 15 배, 적어도 20 배, 적어도 30 배, 적어도 40 배, 적어도 50 배, 적어도 60 배, 적어도 70 배, 적어도 80 배, 적어도 90 배, 또는 적어도 100 배까지 감소될 수 있다.

일부 구현예에서, 융합 단백질의 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)는 R-루프의 범위 내에서 2 개 이하의 핵염기를 탈아미노화한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 데아미나아제는 R-루프의 범위 내에서 3 개 이하의 핵염기를 탈아미노화한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 데아미나아제는 R-루프의 범위 내에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 이하의 핵염기를 탈아미노화한다. R-루프는 DNA:RNA 하이브리드, DNA:DNA 또는 RNA: RNA 상보적 구조를 포함하는 3-가닥 핵산 구조이며 단일-가닥 DNA와 연관된다. 본원에 사용된 바와 같이, R-루프는 표적 폴리뉴클레오티드가 CRISPR 복합체 또는 염기 편집 복합체와 접촉될 때 형성될 수 있으며, 여기서 가이드 폴리뉴클레오티드의 부분, 예를 들어 가이드 RNA는 표적 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 표적 DNA의 부분과 혼성화하고 대체한다. 일부 구현예에서, R-루프는 스페이서 서열 및 표적 DNA 상보적 서열의 혼성화된 영역을 포함한다. R-루프 영역은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 개의 핵염기 쌍 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, R-루프 영역은 약 20 개의 핵염기 쌍 길이이다. 본원에 사용된 바와 같이, R-루프 영역은 가이드 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 표적 DNA 가닥으로 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 예를 들어, R-루프 영역 내에서 표적 핵염기의 편집은 가이드 RNA에 대한 상보적 가닥을 포함하는 DNA 가닥에 대한 것일 수 있거나, 또는 가이드 RNA에 상보적인 가닥의 반대 가닥인 DNA 가닥에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, R-루프의 영역에서 편집은 표적 DNA 서열에서 비-상보적 가닥(프로토스페이서 가닥) 상의 핵염기를 가이드 RNA로 편집하는 것을 포함한다.

본원에 기재된 융합 단백질은 표준 염기 편집과 상이한 편집 윈도우에서 표적 탈아미노화에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 PAM 서열의 상류에 있는 약 1 내지 약 20 개의 염기이다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 PAM 서열의 상류에 있는 약 2 내지 약 12 개의 염기이다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 상류에 있거나 떨어져 있는 약 1 내지 9 개의 염기 쌍, 약 2 내지 10 개의 염기 쌍, 약 3 내지 11 개의 염기 쌍, 약 4 내지 12 개의 염기 쌍, 약 5 내지 13 개의 염기 쌍, 약 6 내지 14 개의 염기 쌍, 약 7 내지 15 개의 염기 쌍, 약 8 내지 16 개의 염기 쌍, 약 9 내지 17 개의 염기 쌍, 약 10 내지 18 개의 염기 쌍, 약 11 내지 19 개의 염기 쌍, 약 12 내지 20 개의 염기 쌍, 약 1 내지 7 개의 염기 쌍, 약 2 내지 8 개의 염기 쌍, 약 3 내지 9 개의 염기 쌍, 약 4 내지 10 개의 염기 쌍, 약 5 내지 11 개의 염기 쌍, 약 6 내지 12 개의 염기 쌍, 약 7 내지 13 개의 염기 쌍, 약 8 내지 14 개의 염기 쌍, 약 9 내지 15 개의 염기 쌍, 약 10 내지 16 개의 염기 쌍, 약 11 내지 17 개의 염기 쌍, 약 12 내지 18 개의 염기 쌍, 약 13 내지 19 개의 염기 쌍, 약 14 내지 20 개의 염기 쌍, 약 1 내지 5 개의 염기 쌍, 약 2 내지 6 개의 염기 쌍, 약 3 내지 7 개의 염기 쌍, 약 4 내지 8 개의 염기 쌍, 약 5 내지 9 개의 염기 쌍, 약 6 내지 10 개의 염기 쌍, 약 7 내지 11 개의 염기 쌍, 약 8 내지 12 개의 염기 쌍, 약 9 내지 13 개의 염기 쌍, 약 10 내지 14 개의 염기 쌍, 약 11 내지 15 개의 염기 쌍, 약 12 내지 16 개의 염기 쌍, 약 13 내지 17 개의 염기 쌍, 약 14 내지 18 개의 염기 쌍, 약 15 내지 19 개의 염기 쌍, 약 16 내지 20 개의 염기 쌍, 약 1 내지 3 개의 염기 쌍, 약 2 내지 4 개의 염기 쌍, 약 3 내지 5 개의 염기 쌍, 약 4 내지 6 개의 염기 쌍, 약 5 내지 7 개의 염기 쌍, 약 6 내지 8 개의 염기 쌍, 약 7 내지 9 개의 염기 쌍, 약 8 내지 10 개의 염기 쌍, 약 9 내지 11 개의 염기 쌍, 약 10 내지 12 개의 염기 쌍, 약 11 내지 13 개의 염기 쌍, 약 12 내지 14 개의 염기 쌍, 약 13 내지 15 개의 염기 쌍, 약 14 내지 16 개의 염기 쌍, 약 15 내지 17 개의 염기 쌍, 약 16 내지 18 개의 염기 쌍, 약 17 내지 19 개의 염기 쌍, 약 18 내지 20 개의 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 상류에 있거나 또는 떨어져 있는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 이상의 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 상류에 있는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 개의 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 표적 핵염기는 PAM 서열의 상류에 있는 약 2, 3, 4, 또는 6 개의 염기 쌍이다.

융합 단백질은 하나 초과의 이종성 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 하나 이상의 UGI 도메인 및/또는 하나 이상의 핵 국재화 신호를 추가적으로 포함할 수 있다. 2 개 이상의 이종성 도메인은 나란히 삽입될 수 있다. 2 개 이상의 이종성 도메인은 NapDNAbp에서 나란히 있지 않도록 하는 위치에 삽입될 수 있다.

융합 단백질은 데아미나아제 및 napDNAbp 폴리펩티드 사이에 링커를 포함할 수 있다. 링커는 펩티드 또는 비-펩티드 링커일 수 있다. 예를 들어, 링커는 XTEN, (GGGS)n(서열번호: 334), (GGGGS)n(서열번호: 335), (G)n, (EAAAK)n(서열번호: 336), (GGS)n, SGSETPGTSESATPES(서열번호: 337)일 수 있다.

일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단 Cas9 단편과 데아미나아제 사이에 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 C-말단 Cas9 단편과 데아미나아제 사이에 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp의 N-말단 및 C-말단 단편은 링커로 데아미나아제에 연결된다. 일부 구현예에서, N-말단 및 C-말단 단편은 링커 없이 데아미나아제 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단 Cas9 단편과 데아미나아제 사이에 링커를 포함하지만, C-말단 Cas9 단편과 데아미나아제 사이에 링커를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 C-말단 Cas9 단편과 데아미나아제 사이에 링커를 포함하지만, N-말단 Cas9 단편과 데아미나아제 사이에 링커를 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 융합 단백질의 napDNAbp는 Cas12 폴리펩티드, 예를 들어 Cas12b/C2c1 또는 이의 단편이다. Cas12 폴리펩티드는 변이체 Cas12 폴리펩티드일 수 있다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단 단편은 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인 또는 RuvC 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 Cas12 폴리펩티드와 촉매 도메인 사이에 링커를 함유한다. 다른 구현예에서, 링커의 아미노산 서열은 GGSGGS(서열번호: 338) 또는 GSSGSETPGTSESATPESSG(서열번호: 339)이다. 다른 구현예에서, 링커는 강성(rigid) 링커이다. 상기 측면의 다른 구현예에서, 링커는 GGAGGCTCTGGAGGAAGC(서열번호: 340) 또는 GGCTCTTCTGGATCTGAAACACCTGGCACAAGCGAGAGCGCCACCCCTGAGAGCTCTGGC(서열번호: 341)에 의해 코딩된다.

Cas12 폴리펩티드의 N- 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 이종성 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질은 또한 본원에 기재된 바와 같은 방법에서 염기 편집에 유용하다. Cas12 및 하나 이상의 데아미나아제 도메인, 예를 들어, 아데노신 데아미나아제를 포함하거나, 또는 Cas12 서열에 의해 플랭킹된 아데노신 데아미나아제 도메인을 포함하는 융합 단백질은 또한 표적 서열의 고도로 특이적이고 효율적인 염기 편집에 유용하다. 일 구현예에서, 키메라 Cas12 융합 단백질은 Cas12 폴리펩티드 내에 삽입된 이종성 촉매 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, 사이티딘 데아미나아제, 또는 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제)을 함유한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas12 내에 삽입된 아데노신 데아미나아제 도메인 및 사이티딘 데아미나아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 Cas12 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나아제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 Cas12 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나아제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 Cas12 내에서 융합되고 아데노신 데아미나아제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 Cas12 내에서 융합되고 아데노신 데아미나아제는 N-말단에 융합된다. 아데노신 데아미나아제 및 사이티딘 데아미나아제 및 Cas12를 갖는 융합 단백질의 예시적인 구조는 다음과 같이 제공된다:

NH₂-[Cas12(아데노신 데아미나아제)]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas12(아데노신 데아미나아제)]-COOH;

NH₂-[Cas12(사이티딘 데아미나아제)]-[아데노신 데아미나아제]-COOH; 또는

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[Cas12(사이티딘 데아미나아제)]-COOH;

다양한 구현예에서, 촉매 도메인은 아데노신 데아미나아제 활성과 같은 DNA 변형 활성(예를 들어, 데아미나아제 활성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA(예를 들어, TadA*7.10)이다. 일부 구현예에서, TadA는 TadA*8이다. 일부 구현예에서, TadA*8은 Cas12 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나아제는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, TadA*8은 Cas12 내에서 융합되고 사이티딘 데아미나아제는 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 Cas12 내에서 융합되고 TadA*8은 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 Cas12 내에서 융합되고 TadA*8은 N-말단에 융합된다. TadA*8 및 사이티딘 데아미나아제 및 Cas12가 있는 융합 단백질의 예시적인 구조는 다음과 같이 제공된다:

N-[Cas12(TadA*8)]-[사이티딘 데아미나아제]-C;

N-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas12(TadA*8)]-C;

N-[Cas12(사이티딘 데아미나아제)]-[TadA*8]-C; 또는

N-[TadA*8]-[Cas12(사이티딘 데아미나아제)]-C.

다른 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 촉매 도메인을 함유한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 촉매 도메인 중 적어도 하나는 Cas12 폴리펩티드 내에 삽입되거나 또는 Cas12 N-말단 또는 C-말단에서 융합된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 촉매 도메인 중 적어도 하나는 Cas12 폴리펩티드의 루프, 알파 힐리컬 영역, 비구조화 부분, 또는 용매 허용가능한 부분 내에 삽입된다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i 또는 Cas12j/CasΦ이다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 바실루스 히사시이 Cas12b, 바실루스 써모아밀로보란스 Cas12b, 바실루스 종 V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실루스 아시디필루스 Cas12b(서열번호: 342)에 대해 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 바실루스 히사시이 Cas12b(서열번호: 343), 바실루스 써모아밀로보란스 Cas12b, 바실루스 종 V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실루스 아시디필루스 Cas12b에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 바실루스 히사시이 Cas12b, 바실루스 써모아밀로보란스 Cas12b(서열번호: 344), 바실루스 종 V3-13 Cas12b(서열번호: 345), 또는 알리사이클로바실루스 아시디필루스 Cas12b에 대해 적어도 약 95% 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 바실루스 히사시이 Cas12b, 바실루스 써모아밀로보란스 Cas12b, 바실루스 종 V3-13 Cas12b, 또는 알리사이클로바실루스 아시디필루스 Cas12b의 단편을 함유하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 구현예에서, Cas12 폴리펩티드는 BvCas12b(V4)를 함유하며, 이는 일부 구현예에서 5'mRNA 캡---5' UTR---bhCas12b---종결 서열 --- 3' UTR --- 120polyA 테일(서열번호: 346-348)로서 발현된다.

다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 위치 153-154, 255-256, 306-307, 980-981, 1019-1020, 534-535, 604-605, 또는 344-345 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i 또는 Cas12j/CasΦ의 상응하는 아미노산 잔기 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 P153 및 S154 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 K255 및 E256 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 D980 및 G981 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 K1019 및 L1020 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 F534 및 P535 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 K604 및 G605 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BhCas12b의 아미노산 H344 및 F345 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 위치 147 및 148, 248 및 249, 299 및 300, 991 및 992, 또는 1031 및 1032 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i 또는 Cas12j/CasΦ의 상응하는 잔기 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 P147 및 D148 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 G248 및 G249 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 P299 및 E300 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 G991 및 E992 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 BvCas12b의 아미노산 K1031 및 M1032 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 위치 157 및 158, 258 및 259, 310 및 311, 1008 및 1009, 또는 1044 및 1045 또는 Cas12a, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i 또는 Cas12j/CasΦ의 상응하는 아미노산 잔기 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 P157 및 G158 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 V258 및 G259 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 D310 및 P311 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 G1008 및 E1009 사이에 삽입된다. 다른 구현예에서, 촉매 도메인은 AaCas12b의 아미노산 G1044 및 K1045 사이에 삽입된다.

다른 구현예에서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호(예를 들어, 이분 핵 국재화 신호)를 포함한다. 다른 구현예에서, 핵 국재화 신호의 아미노산 서열은 MAPKKKRKVGIHGVPAA(서열번호: 349)이다. 상기 양태의 다른 구현예들에서, 핵 국재화 신호는 다음과 같은 서열에 의해 암호화된다:

ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCC(서열번호: 350). 다른 구현예에서, Cas12b 폴리펩티드는 RuvC 도메인의 촉매 활성을 침묵시키는 돌연변이를 함유한다. 다른 구현예에서, Cas12b 폴리펩티드는 D574A, D829A 및/또는 D952A 돌연변이를 함유한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 태그(예를 들어, 인플루엔자 헤마글루티닌 태그)를 추가로 함유한다.

일부 구현예에서, 융합 단백질은 내부적으로 융합된 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 데아미나아제 도메인, 예를 들어, 아데노신 데아미나아제 도메인의 전부 또는 부분)을 갖는 napDNAbp 도메인(예를 들어, Cas12-유래 도메인)을 포함한다. 일부 구현예에서, napDNAbp는 Cas12b이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 하기 표 4에 제공된 유전자좌에 삽입된 내부적으로 융합된 TadA*8 도메인을 갖는 BhCas12b 도메인을 포함한다.

표 4: Cas12b 단백질의 삽입 유전자좌

예시적이지만 비제한적인 아데노신 데아미나아제(예를 들어, TadA*8.13)는 BhCas12b 내로 삽입되어 핵산 서열을 효과적으로 편집하는 융합 단백질(예를 들어, TadA*8.13-BhCas12b)을 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 설명된 염기 편집 시스템은 Cas9에 TadA가 삽입된 ABE이다. Cas9에 삽입된 TadA를 갖는 관련 ABE 폴리펩티드의 서열은 첨부된 서열목록에 서열번호: 351-396으로 제공된다.

일부 구현예에서, TadA 또는 이의 변이체는 Cas9 폴리펩티드의 확인된 위치에 삽입하기 위해 아데노신 염기 편집기가 생성되었다.

예시적이지만 비제한적인 융합 단백질은 국제 PCT 출원 번호 PCT/US2020/016285 및 U.S. 가출원번호 62/852,224 및 62/852,228 에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

A에서 G로의 편집

일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집기는 아데노신 데아미나아제 도메인을 포함한다. 염기 편집기의 이러한 아데노신 데아미나아제 도메인은 A를 탈아미노화하여 G의 염기 쌍 형성 특성을 나타내는 이노신(I)을 형성함으로써 아데닌(A) 핵염기의 구아닌(G) 핵염기로의 편집을 용이하게 할 수 있다. 아데노신 데아미나아제는 데옥시리보핵산(DNA)에서 데옥시아데노신 잔기의 아데닌을 탈아미노화(즉, 아민 기를 제거)할 수 있다.

일부 구현예에서, A에서 G로의 염기 편집기는 이노신 염기 절제 복구의 억제제, 예를 들어, 우라실 글리코실라제 억제제(UGI) 도메인 또는 촉매적으로 비활성인 이노신 특이적 뉴클레아제를 추가로 포함한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, UGI 도메인 또는 촉매적으로 비활성인 이노신 특이적 뉴클레아제는 탈아미노화된 아데노신 잔기(예를 들어, 이노신)의 염기 절제 복구를 억제하거나 또는 방지할 수 있으며, 이는 염기 편집기의 활성 또는 효율을 개선시킬 수 있다.

아데노신 데아미나아제를 포함하는 염기 편집기는 DNA, RNA 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한 임의의 폴리뉴클레오티드에서 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, 아데노신 데아미나아제를 포함하는 염기 편집기는 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 표적 A를 탈아미노화할 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기는 RNA 폴리뉴클레오티드 및/또는 DNA-RNA 하이브리드 폴리뉴클레오티드의 표적 A를 탈아미노화할 수 있는 아데노신 데아미나아제 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 아데노신 데아미나아제는 RNA(ADAR, 예를 들어, ADAR1 또는 ADAR2) 또는 tRNA (ADAT)에서 작용하는 아데노신 데아미나아제의 전부 또는 부분을 포함한다. 아데노신 데아미나아제 도메인을 포함하는 염기 편집기는 또한 DNA 폴리뉴클레오티드의 A 핵염기를 탈아미노화할 수 있다. 일 구현예에서 염기 편집기의 아데노신 데아미나아제 도메인은 ADAT가 DNA에서 표적 A를 탈아미노화하도록 허용하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 ADAT의 전부 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 염기 편집기는 다음 돌연변이 D108N, A106V, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하는 에세리키아 콜라이로부터의 ADAT(EcTadA)의 전부 또는 부분을 포함할 수 있다. 예시적인 ADAT 호몰로그 폴리펩티드 서열은 서열목록에 서열번호 1, 397-403으로 제공된다.

아데노신 데아미나아제는 임의의 적합한 유기체(예를 들어, 이. 콜라이)로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 원핵생물로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 박테리아로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 에세리키아 콜라이, 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 티피, 슈와넬라 푸트레파시엔스, 헤모필루스 인플루엔자, 카울로박터 크레센투스 또는 바실루스 서브틸리스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 이. 콜라이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 아데닌 데아미나아제는 본원에 제공된 임의의 돌연변이(예를 들어, ecTadA에서의 돌연변이)에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 자연 발생 아데노신 데아미나아제다. 임의의 상동성 단백질에서 상응하는 잔기는 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 식별될 수 있다. 따라서 본원에 기재된 임의의 돌연변이(예를 들어, ecTadA에서 식별된 임의의 돌연변이)에 상응하는 임의의 자연 발생 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA에 대한 상동성을 가짐)에서 돌연변이가 생성될 수 있다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나아제는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본원에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 개시내용은 특정 퍼센트 동일성을 갖는 임의의 데아미나아제 도메인 및 본원에 기재된 임의의 돌연변이 또는 이들의 조합을 제공한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 참조 서열, 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 당업계에 알려져 있거나 또는 본원에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 비교하여 적어도 5 개, 적어도 10 개, 적어도 15 개, 적어도 20 개, 적어도 25 개, 적어도 30 개, 적어도 35 개, 적어도 40 개, 적어도 45 개, 적어도 50 개, 적어도 60 개, 적어도 70 개, 적어도 80 개, 적어도 90 개, 적어도 100 개, 적어도 110 개, 적어도 120 개, 적어도 130 개, 적어도 140 개, 적어도 150 개, 적어도 160 개, 또는 적어도 170 개의 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본원에 제공된 임의의 돌연변이(예를 들어, TadA 참조 서열에 기초함)는 이. 콜라이 TadA(ecTadA), 에스. 아우레우스 TadA(saTadA), 또는 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, 박테리아 아데노신 데아미나아제)와 같은 다른 아데노신 데아미나아제 내로 도입될 수 있음이 이해되어야 한다. 추가적인 데아미나아제는 본원에 제공된 바와 같이 돌연변이될 수 있는 상동성 아미노산 잔기를 식별하도록 정렬될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다. 따라서, TadA 참조 서열에서 식별된 임의의 돌연변이는 상동성 아미노산 잔기를 갖는 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTada)에서 만들어질 수 있다. 또한 본원에 제공된 임의의 돌연변이는 개별적으로 또는 TadA 참조 서열 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제와의 임의의 조합으로 만들어질 수 있음이 이해되어야 한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 D108X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 D108G, D108N, D108V, D108A, 또는 D108Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 그러나, 추가의 데아미나아제는 본원에 제공된 바와 같은 돌연변이될 수 있는 상동성 아미노산 잔기를 식별하기 위해 유사하게 정렬될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A106X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A106V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 E155X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 E155D, E155G, 또는 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 D147X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 D147Y, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A106X, E155X, 또는 D147X, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 E155D, E155G, 또는 E155V 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 D147Y를 포함한다. 또한, 본원에 제공된 임의의 돌연변이는 ecTadA 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 만들어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 D108N, A106V, E155V, 및/또는 D147Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 다음 돌연변이의 군(돌연변이의 군은 ";"에 의해 구분됨), 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다: D108N 및 A106V; D108N 및 E155V; D108N 및 D147Y; A106V 및 E155V; A106V 및 D147Y; E155V 및 D147Y; D108N, A106V, 및 E155V; D108N, A106V, 및 D147Y; D108N, E155V, 및 D147Y; A106V, E155V, 및 D147Y; 및 D108N, A106V, E155V, 및 D147Y. 그러나, 본원에 제공된 상응하는 돌연변이의 임의의 조합은 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 만들어질 수 있음이 이해되어야 한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열 (예를 들어 TadA*7.10)에서 돌연변이의 조합, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다: V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; 또는 L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8X, T17X, L18X, W23X, L34X, W45X, R51X, A56X, E59X, E85X, M94X, I95X, V102X, F104X, A106X, R107X, D108X, K110X, M118X, N127X, A138X, F149X, M151X, R153X, Q154X, I156X, 및/또는 K157X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, T17S, L18E, W23L, L34S, W45L, R51H, A56E, 또는 A56S, E59G, E85K, 또는 E85G, M94L, I95L, V102A, F104L, A106V, R107C, 또는 R107H, 또는 R107P, D108G, 또는 D108N, 또는 D108V, 또는 D108A, 또는 D108Y, K110I, M118K, N127S, A138V, F149Y, M151V, R153C, Q154L, I156D, 및/또는 K157R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, 및/또는 N127X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, 및/또는 N127S 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8X, R26X, M61X, L68X, M70X, A106X, D108X, A109X, N127X, D147X, R152X, Q154X, E155X, K161X, Q163X, 및/또는 T166X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, R26W, M61I, L68Q, M70V, A106T, D108N, A109T, N127S, D147Y, R152C, Q154H 또는 Q154R, E155G 또는 E155V 또는 E155D, K161Q, Q163H, 및/또는 T166P 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, N127X, D147X, R152X, 및 Q154X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8X, M61X, M70X, D108X, N127X, Q154X, E155X, 및 Q163X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, N127X, E155X, 및 T166X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 H8X, A106X, 및 D108X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 H8X, R26X, L68X, D108X, N127X, D147X 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8X, R126X, L68X, D108X, N127X, D147X 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8X, D108X, A109X, N127X, 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, R152C, 및 Q154H로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, M61I, M70V, D108N, N127S, Q154R, E155G 및 Q163H로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, E155V, 및 T166P로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, A106T, D108N, N127S, E155D, 및 K161Q로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, R26W, L68Q, D108N, N127S, D147Y, 및 E155V로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, A109T, N127S, 및 E155G로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 또는 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 D108N, D108G, 또는 D108V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A106V 및 D108N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 R107C 및 D108N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, 및 Q154H 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, 및 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 D108N, D147Y, 및 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, D108N, 및 N127S 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A106V, D108N, D147Y 및 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 S2X, H8X, I49X, L84X, H123X, N127X, I156X 및/또는 K160X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 S2A, H8Y, I49F, L84F, H123Y, N127S, I156F 및/또는 K160S 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 L84X 돌연변이 아데노신 데아미나아제를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 L84F 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H123X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H123Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 I156X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 I156F 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 L84X, A106X, D108X, H123X, D147X, E155X, 및 I156X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 S2X, I49X, A106X, D108X, D147X, 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8X, A106X, D108X, N127X, 및 K160X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 L84F, A106V, D108N, H123Y, D147Y, E155V, 및 I156F로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 S2A, I49F, A106V, D108N, D147Y, 및 E155V로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H8Y, A106T, D108N, N127S, 및 K160S로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 E25X, R26X, R107X, A142X, 및/또는 A143X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 E25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, E25Y, R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, R26K, R107P, R107K, R107A, R107N, R107W, R107H, R107S, A142N, A142D, A142G, A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q 및/또는 A143R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에 상응하는 본원에 기재된 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 E25X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 E25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, 또는 E25Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 R26X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, 또는 R26K 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 R107X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 R107P, R107K, R107A, R107N, R107W, R107H, 또는 R107S 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A142X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A142N, A142D, A142G, 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A143X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q 및/또는 A143R 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H36X, N37X, P48X, I49X, R51X, M70X, N72X, D77X, E134X, S146X, Q154X, K157X, 및/또는 K161X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H36L, N37T, N37S, P48T, P48L, I49V, R51H, R51L, M70L, N72S, D77G, E134G, S146R, S146C, Q154H, K157N, 및/또는 K161T 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H36X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 H36L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 N37X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 N37T, 또는 N37S 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 P48X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 P48T 또는 P48L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 R51X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 R51H 또는 R51L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 S146X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 S146R 또는 S146C 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 K157X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 K157N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 P48X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 P48S, P48T, 또는 P48A 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A142X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 A142N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 W23X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 W23R 또는 W23L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 R152X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에서 R152P 또는 R52H 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 돌연변이 H36L, R51L, L84F, A106V, D108N, H123Y, S146C, D147Y, E155V, I156F, 및 K157N를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 참조 서열에 비해 다음 돌연변이 조합을 포함하며, 여기서 조합의 각각의 돌연변이는 "_"에 의해 구분되고 각각의 돌연변이 조합은 괄호 사이에 있다:

(A106V_D108N),

(R107C_D108N),

(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H),

(H8Y _D108N_N127S_D147Y_E155V),

(D108N_D147Y_E155V),

(H8Y_D108N_N127S),

(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H),

(A106V_D108N_D147Y_E155V),

(D108Q_D147Y_E155V),

(D108M_D147Y_E155V),

(D108L_D147Y_E155V),

(D108K_D147Y_E155V),

(D108I_D147Y_E155V),

(D108F_D147Y_E155V),

(A106V_D108N_D147Y),

(A106V_D108M_D147Y_E155V),

(E59A_A106V_D108N_D147Y_E155V),

(E59A 캣 데드(cat dead)_A106V_D108N_D147Y_E155V),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156Y),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(D103A_D104N),

(G22P_D103A_D104N),

(D103A_D104N_S138A),

(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),

(E25G_R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),

(E25D_R26G_L84F_A106V_R107K_D108N_H123Y_A142N_A143G_D147Y_E155V_I156F), (R26Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),

(E25M_R26G_L84F_A106V_R107P_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F), (R26C_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), (L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_A143L_D147Y_E155V_I156F),

(R26G_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),

(E25A_R26G_L84F_A106V_R107N_D108N_H123Y_A142N_A143E_D147Y_E155V_I156F), (R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),

(A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),

(R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),

(E25D_R26G_A106V_R107K_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V), (R26G_A106V_D108N_R107H_A142N_A143D_D147Y_E155V),

(E25D_R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V),

(A106V_R107K_D108N_A142N_D147Y_E155V),

(A106V_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V),

(A106V_D108N_A142N_A143L_D147Y_E155V),

(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),

(N37T_P48T_M70L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_I49V_E155V_I156F),

(N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K161T),

(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_Q154H_E155V_I156F),

(N72S_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F),

(H36L_P48L_L84F_A106V_D108N_H123Y_E134G_D147Y_E155V_I156F),

(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_ D147Y_E155V_I156F_K157N) (H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T),

(N37S_R51H_D77G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N),

(D24G_Q71R_L84F_H96L_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K160E),

(H36L_G67V_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146T_D147Y_E155V_I156F),

(Q71L_L84F_A106V_D108N_H123Y_L137M_A143E_D147Y_E155V_I156F),

(E25G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L),

(L84F_A91T_F104I_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(N72D_L84F_A106V_D108N_H123Y_G125A_D147Y_E155V_I156F),

(P48S_L84F_S97C_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(W23G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(D24G_P48L_Q71R_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),

(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N), (N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_K161T),

(L84F_A106V_D108N_D147Y_E155V_I156F),

(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K161T),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K161T),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E_K161T),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E), (R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(R74A_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(L84F_R98Q_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F),

(L84F_A106V_D108N_H123Y_R129Q_D147Y_E155V_I156F),

(P48S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F),

(P48S_A142N),

(P48T_I49V_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_L157N),

(P48T_I49V_A142N),

(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), (H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F (H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),

(H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_ I156F _K157N),

(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),

(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), (H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F _K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), (W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), (W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F _K161T),

(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152H_E155V_I156F _K157N),

(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F _K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V _I156F _K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_R152P _E155V_I156F _K157N),

(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F _K161T),

(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V _I156F _K157N), (H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155 V_I156F _K157N).

일부 구현예에서, TadA 데아미나아제는 TadA 변이체이다. 일부 구현예에서, TadA 변이체는 TadA*7.10이다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일 TadA*7.10 도메인(예를 들어, 단량체로서 제공됨)을 포함한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 이종이량체를 형성할 수 있는 TadA*7.10 및 TadA(wt)를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 Cas9 니카아제에 연결된, TadA*7.10에 연결된 야생형 TadA를 포함한다.

일부 구현예에서, TadA*7.10은 적어도 하나의 변경을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 다음의 서열의 변경을 포함한다:

TadA*7.10

MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD(서열번호: 1)

일부 구현예에서, TadA*7.10은 아미노산 82 및/또는 166에서의 변경을 포함한다. 특정 구현예에서, TadA*7.10은 다음 변경 중 하나 이상을 포함한다: Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R. 다른 구현예에서, TadA*7.10의 변이체는 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, TadA*7.10의 변이체는 L36H, I76Y, V82G, Y147T, Y147D, F149Y, Q154S, N157K, 및/또는 D167N의 군으로부터 선택된 변경 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, TadA*7.10의 변이체는 V82G, Y147T/D, Q154S 및 L36H, I76Y, F149Y, N157K, 및 D167N 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예에서 TadA*7.10의 변이체는 V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; 및 L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체(예를 들어, TadA*8)는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 C 말단의 결실을 포함한다. 특정 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 잔기 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 및 157에서 시작하는 C 말단의 결실을 포함한다.

다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체(예를 들어, TadA*8)는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상의 변경을 포함하는 단량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체(TadA*8)는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함하는 단량체이다.

다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 각각 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 갖는 2개의 아데노신 데아미나아제 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 동종이량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 각각 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 갖는 2개의 아데노신 데아미나아제 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 동종이량체이다.

다른 구현예에서, 본 개시내용의 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이에 대해 다음 변경 중 하나 이상의 변경: R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N, 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미나아제 변이체(예를 들어, TadA*8) 단량체를 포함한다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체 (TadA*8) 단량체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이에 대해 다음에서 선택되는 변경의 조합: R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N을 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체 (예를 들어, MSP828)은 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이에 대해, 다음 변경 중 하나 이상: L36H, I76Y, V82G, Y147T, Y147D, F149Y, Q154S, N157K, 및/또는 D167N, 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 단량체이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체 (예를 들어, MSP828)은 TadA*7.10, TadA 참조 서열에 대해, 다음 변경 중 하나 이상: V82G, Y147T/D, Q154S 및 하나 이상의 L36H, I76Y, F149Y, N157K, 및 D167N을 포함하는 단량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체 (TadA 변이체)는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이에 대해 다음 그룹에서 선택되는 변경의 조합: V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N을 포함하는 단량체이다.

다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 야생형 아데노신 데아미나아제 도메인 및 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이에 대해 하나 이상의 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R, 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인 (예를 들어, TadA*8)의 이종이량체다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 야생형 아데노신 데아미나아제 도메인 및 TadA*7.10, TadA 참조 서열에 대해 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 그룹에서 선택되는 변경의 조합을 포함하는 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인 (예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이다.

다른 구현예에서, 본 개시내용의 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이와 비교하여 각각 변경 R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N 중 하나 이상을 갖는 2개의 아데노신 데아미나아제 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 아데노신 데아미나아제 변이체(예를 들어, TadA*8) 동종이량체를 포함한다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이와 비교하여 각각 R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 갖는 2개의 아데노신 데아미나아제 도메인(예를 들어, TadA*8)을 포함하는 동종이량체이다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이와 비교하여 각각 변경 L36H, I76Y, V82G, Y147T, Y147D, F149Y, Q154S, N157K, 및/또는 D167N 중 하나 이상을 갖는 2개의 아데노신 데아미나아제 도메인(예를 들어, TadA*7.10)을 포함하는 동종이량체이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이와 비교하여 각각 변경 V82G, Y147T/D, Q154S, 및 L36H, I76Y, F149Y, N157K, 및 D167N 중 하나 이상을 갖는 2 개의 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, MSP828)을 포함하는 동종이량체이다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이와 비교하여 각각 V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 갖는 2개의 아데노신 데아미나아제 도메인(예를 들어, TadA*7.10)을 포함하는 동종이량체이다.

다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이고, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다.

다른 구현예에서, 염기 편집기는 야생형 아데노신 데아미나아제 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체를 포함하며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 변경 R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 야생형 아데노신 데아미나아제 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인의 이종이량체(예를 들어, TadA*8)를 포함하며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다.

다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 야생형 아데노신 데아미나아제 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*7.10)의 이종이량체이고, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 다른 TadA에서의 상응하는 돌연변이와 비교하여 변경 L36H, I76Y, V82G, Y147T, Y147D, F149Y, Q154S, N157K, 및/또는 D167N 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 야생형 아데노신 데아미나아제 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, MSP828)을 포함하는 이종이량체이며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 변경 V82G, Y147T/D, Q154S, 및 L36H, I76Y, F149Y, N157K, 및 D167N 중 하나 이상을 갖는다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 야생형 아데노신 데아미나아제 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*7.10)의 이종이량체이며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다.

다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 변경 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, V82S, T166R, 및/또는 Q154R 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체이며, 이는 TadA*7.10 도메인 및 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다.

특정 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 이종이량체는 에스. 아우레우스 (S. aureus) TadA, 비. 서브틸리스 (B. subtilis) TadA, 에스. 티피뮤리움 (S. typhimurium) TadA, 에스. 푸트레파시엔스 (S. putrefaciens) TadA, 에이취. 인플루엔자에 F3031 (H. influenza F3031) TadA, 씨. 크레센투스 (C. crescentus) TadA, 쥐. 술푸레두센스 (G. sulfurreducens) TadA, 또는 TadA*7.10에서 선택되는 아데노신 데아미나아제 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA*8이다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 다음 서열 또는 아데노신 데아미나아제 활성을 갖는 이의 단편을 포함하거나, 또는 필수적으로 구성된 TadA*8이다: MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD (서열번호: 404)

일부 구현예에서, TadA*8은 절단된다. 일부 구현예에서, 절단된 TadA*8은 전장 TadA*8에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20개의 N-말단 아미노산 잔기가 미싱(missing)된 것이다. 일부 구현예에서, 절단된 TadA*8은 전장 TadA*8에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20개의 C-말단 아미노산 잔기가 미싱된 것이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 전장 TadA*8이다.

일부 구현예에서, TadA*8은 TadA*8.1, TadA*8.2, TadA*8.3, TadA*8.4, TadA*8.5, TadA*8.6, TadA*8.7, TadA*8.8, TadA*8.9, TadA*8.10, TadA*8.11, TadA*8.12, TadA*8.13, TadA*8.14, TadA*8.15, TadA*8.16, TadA*8.17, TadA*8.18, TadA*8.19, TadA*8.20, TadA*8.21, TadA*8.22, TadA*8.23, 또는 TadA*8.24이다.

다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이에 대해 하나 이상의 다음 변경: R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N을 포함하는 아데노신 데아미나아제 변이체 (예를 들어 TadA*8) 단량체를 포함한다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체 (TadA*8) 단량체는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이에 대해 다음 그룹: R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N에서 선택되는 변경의 조합을 포함한다.

다른 구현예에서, 염기 편집기는 야생형 아데노신 데아미나아제 도메인 및 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이에 대해 하나 이상의 다음 변경: R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N을 포함하는 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인 (예를 들어, TadA*8)의 이종이량체를 포함한다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 야생형 아데노신 데아미나아제 도메인 및 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA의 상응하는 돌연변이에 대해 다음 그룹: R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N에서 선택되는 변경의 조합을 포함하는 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인 (예를 들어, TadA*8)을 포함한다.

다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체를 포함하며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 변경 R26C, V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및/또는 D167N 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*8)의 이종이량체를 포함하며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N; V88A + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; R26C + A109S + T111R + D119N + H122N + F149Y + T166I + D167N; V88A + T111R + D119N + F149Y; 및 A109S + T111R + D119N + H122N + Y147D + F149Y + T166I + D167N의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다.

다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*7.10)의 이종이량체이며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 변경 L36H, I76Y, V82G, Y147T, Y147D, F149Y, Q154S, N157K, 및/또는 D167N 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA *7.10 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, MSP828)을 포함하는 이종이량체이며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 변경 V82G, Y147T/D, Q154S, 및 L36H, I76Y, F149Y, N157K, 및 D167N 중 하나 이상을 갖는다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제 변이체는 TadA*7.10 도메인 및 아데노신 데아미나아제 변이체 도메인(예를 들어, TadA*7.10)의 이종이량체이며, 이는 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 V82G + Y147T + Q154S; I76Y + V82G + Y147T + Q154S; L36H + V82G + Y147T + Q154S + N157K; V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147T + Q154S + N157K; I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + D167N; L36H + I76Y + V82G + Y147D + F149Y + Q154S + N157K + D167N의 군으로부터 선택된 변경의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, TadA*8은 표 5에 나타낸 바와 같은 변이체이다. 표 5는 TadA 아미노산 서열 내의 특정 아미노산 위치 번호 및 TadA-7.10 아데노신 데아미나아제 내의 이들 위치에 존재하는 아미노산을 나타낸다. 표 5는 또한 M. Richter 등, 2020, Nature Biotechnology, doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z에 기재된 바와 같이 파지-보조된 비-연속 진화(PANCE) 및 파지-보조된 연속 진화(PACE) 후 TadA-7.10에 대한 TadA 변이체에서의 아미노산 변화를 나타내고, 이의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, TadA*8은 TadA*8a, TadA*8b, TadA*8c, TadA*8d 또는 TadA*8e이다. 일부 구현예에서, TadA*8은 TadA*8e이다.

표 5. 선택된 TadA*8 변이체

일부 구현예에서, TadA 변이체는 표 5.1에 제시된 바와 같은 변이체이다. 표 5.1는 TadA 아미노산 서열 내의 특정 아미노산 위치 번호 및 TadA*7.10 아데노신 데아미나아제 내의 이들 위치에 존재하는 아미노산을 보여준다. 일부 구현예에서, TadA 변이체는 MSP605, MSP680, MSP823, MSP824, MSP825, MSP827, MSP828 또는 MSP829이다. 일부 구현예에서, TadA 변이체는 MSP828이다. 일부 구현예에서, TadA 변이체는 MSP829이다.

표 5.1. TadA 변이체

일 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 기재된 아데노신 데아미나아제 변이체(예를 들어 TadA*8)에 연결된 야생형 TadA를 포함하고, 이는 Cas9 니카아제에 연결된다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일 TadA*8 도메인 (예를 들어, 단량체로서 제공됨)을 포함한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 이종이량체를 형성할 수 있는 TadA*8 및 TadA(wt)를 포함한다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 여기에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나아제는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본원에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시내용은 특정 백분율 상동성을 갖는 임의의 데아미나아제 도메인과 본원에 기술된 임의의 돌연변이 또는 이들의 조합을 제공한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는, 참조 서열 또는 여기에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 당업계에 공지되어 있거나, 본원에 기술된 임의의 아미노산 서열 중 하나와 비교하였을 때 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 적어도 150개, 적어도 160개 또는 적어도 170개 상동성이 있는 연속 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, TadA*8은 굵은체로 표시된 임의의 다음 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, TadA*8은 밑줄 친 것으로 제시된 임의의 다음 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다:

예를 들어, TadA*8은 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 아미노산 위치 82 및/또는 166(예를 들어, V82S, T166R)에서 단독으로 또는 다음 Y147T, Y147R, Q154S, Y123H, 및/또는 Q154R 중 임의의 하나 이상과 조합한 변경을 포함한다. 특정 구현예에서, 변경의 조합은 TadA*7.10, TadA 참조 서열, 또는 또 다른 TadA에서 상응하는 돌연변이와 비교하여 Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; 및 I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R의 군으로부터 선택된다.

일 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 Cas9 니카아제에 연결된, 본원에 기술된 아데노신 데아미나아제 변이체(예를 들어, TadA*8)에 연결된 야생형 TadA를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일 TadA*8 도메인(예를 들어, 단량체로서 제공됨)을 포함한다. 다른 구현예에서, 염기 편집기는 이종이량체를 형성할 수 있는 TadA*8 및 TadA(wt)를 포함한다.

특정 구현예에서, 융합 단백질은 단일(예를 들어, 단량체로서 제공됨) TadA*8을 포함한다. 일부 구현예에서, TadA*8은 Cas9 니카아제에 연결된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 TadA*8에 연결된 야생형 TadA(TadA(wt))의 이종이량체로서 포함된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 TadA*8에 연결된 TadA*7.10의 이종이량체로서 포함된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 변이체 단량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 및 TadA(wt)의 이종이량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8 및 TadA*7.10의 이종이량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 TadA*8의 이종이량체를 포함하는 ABE8이다. 일부 구현예에서, TadA*8은 표 5, 11 또는 12로부터 선택된다. 일부 구현예에서, ABE8은 표 11, 12 또는 14로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA*9 변이체이다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 하기 서열(TadA*7.10으로 지칭됨)을 참조하여 하기 기재된 변이체로부터 선택된 TadA*9 변이체이다:

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 다음 변경 중 하나 이상을 포함한다: R21N, R23H, E25F, N38G, L51W, P54C, M70V, Q71M, N72K, Y73S, V82T, M94V, P124W, T133K, D139L, D139M, C146R, 및 A158K. 하나 이상의 변경은 밑줄 및 굵은체로 상기 서열에 표기되었다.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 다음 변경의 조합 중 하나 이상을 포함한다: V82S + Q154R + Y147R; V82S + Q154R + Y123H; V82S + Q154R + Y147R+ Y123H; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y+ V82S; V82S + I76Y; V82S + Y147R; V82S + Y147R + Y123H; V82S + Q154R + Y123H; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y; V82S + Y147R; V82S + Y147R + Y123H; V82S + Q154R + Y123H; V82S + Q154R + Y147R; V82S + Q154R + Y147R; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y; Q154R + Y147R + Y123H + I76Y + V82S; I76Y_V82S_Y123H_Y147R_Q154R; Y147R + Q154R + H123H; 및 V82S + Q154R.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 다음 변경의 조합 중 하나 이상을 포함한다: E25F + V82S + Y123H, T133K + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R; Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + P124W + Y147R + Q154R; L51W + V82S + Y123H + C146R + Y147R + Q154R; P54C + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Y73S + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + Y147R + Q154R + A158K; N72K + V82S + Y123H + D139L + Y147R + Q154R; E25F + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; 및 M70V + V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 다음 변경의 조합 중 하나 이상을 포함한다: Q71M + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + I76Y+ V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; E25F + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82T + Y123H + Y147R + Q154R; N38G + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R23H + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; P54C + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; R21N + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; I76Y + V82S + Y123H + D139M + Y147R + Q154R; Y73S + I76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R; and V82S + Q154R; N72K_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Q71M_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R; N72K_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; Q71M_V82S + Y123H + Y147R + Q154R; M70V +V82S + M94V + Y123H + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R; V82S + Y123H + T133K + Y147R + Q154R + A158K; 및 M70V +Q71M +N72K +V82S + Y123H + Y147R + Q154R. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 단량체로서 발현된다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 이종이량체로서 발현된다. 일부 구현예에서, 데아미나아제 또는 다른 폴리펩티드 서열은, 예를 들어 융합 단백질의 구성요소로서 포함될 때, 메티오닌이 결여된다. 이는 위치의 넘버링을 변경할 수 있다. 그러나, 당업자는 이러한 상응하는 돌연변이가 동일한 돌연변이, 예를 들어 Y73S 및 Y72S 및 D139M 및 D138M을 지칭함을 이해할 것이다.

일부 구현예에서, TadA*9 변이체는 본원에 기재된 표 15에 기재된 변경을 포함한다.

일부 구현예에서, TadA*9 변이체는 단량체이다. 일부 구현예에서, TadA*9 변이체는 야생형 TadA 아데노신 데아미나아제를 갖는 이종이량체다. 일부 구현예에서, TadA*9 변이체는 또 다른 TadA 변이체(예를 들어, TadA*8, TadA*9)를 갖는 이종이량체다. TadA*9 아데노신 데아미나아제에 대한 추가 세부 사항은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2020/049975에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 여기에 참조로 포함된다.

본원에 제공된 임의의 돌연변이 및 임의의 추가의 돌연변이(예를 들어, ecTadA 아미노산 서열을 기초로 함)는 임의의 다른 아데노신 데아미나아제에 도입될 수 있다. 본원에 제공된 돌연변이 중 임의의 것은 개별적으로 또는 TadA 참조 서열 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, ecTadA)에서 임의의 조합으로 이루어질 수 있다.

A에서 G로의 핵염기 편집 단백질의 상세한 내용은 국제 PCT 출원번호 PCT/2017/045381 (WO2018/027078) 및 Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature, 551, 464-471 (2017)에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

C에서 T로의 편집

일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 염기 편집기는 폴리뉴클레오티드의 표적 사이티딘(C) 염기를 탈아민화하여 티민의 염기쌍 결합 특성을 갖는 우리딘(U)을 생성할 수 있는 사이티딘 데아미나아제를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥(예: DNA)인 일부 구현예에서, 우리딘 염기는 티미딘 염기로 치환되어(예: 세포 복구 기구에 의해) C:G에서 T:A로 전환될 수 있다. 다른 구현예에서, 염기 편집기에 의한 핵산 내 C에서 U로의 탈아미노화는 U에서 T로의 치환을 수반할 수 없다.

U를 발생시키기 위한 폴리뉴클레오티드 내 표적 C의 탈아미노화는 본원에 기술된 염기 편집기에 의해 실행될 수 있는 염기 편집 유형의 비제한적인 예이다. 또 다른 예에서, 사이티딘 데아미나아제 도메인을 포함하는 염기 편집기는 사이토신(C) 염기의 구아닌(G) 염기로의 전환을 중재할 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기의 사이티딘 데아미나아제 도메인에 의한 사이티딘의 탈아미노화에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드의 U는 염기 절단 복구 메커니즘(예: 우라실 DNA 글리코실라제(UDG) 도메인)에 의해 폴리뉴클레오티드로부터 절단되어 무염기 부위(abasic site)를 생성할 수 있다. 이어서, 염기 부위 반대편의 핵염기는 예를 들어 전이 중합효소에 의해 C와 같은 또 다른 염기로 대체될 수 있다(예를 들어, 염기 복구 기구에 의해). 무염기 부위 반대편의 핵염기가 C로 대체되는 것이 일반적이지만, 다른 치환(예를 들어, A, G 또는 T)도 발생할 수 있다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 염기 편집기는 폴리뉴클레오티드에서 표적 C를 U로 탈아미노화할 수 있는 탈아미노화 도메인(예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 도메인)을 포함한다. 또한, 아래에 설명된 바와 같이, 염기 편집기는 탈아미노화로 인한 U의 일부 실시예에서는 T 또는 G로의 전환을 촉진하는 추가 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 도메인을 포함하는 염기 편집기는 우라실을 추가로 포함할 수 있다. 글리코실라제 억제제(UGI) 도메인은 U의 T로의 치환을 중재하여 C에서 T로의 염기 편집 이벤트를 완료한다. 또 다른 예에서, 염기 편집기는 C에서 G로의 염기 편집의 효율성을 향상시키기 위해 전이 중합효소가 혼입될 수 있다. 왜냐하면 전이 중합효소는 무염기 부위 반대편에 C의 혼입을 촉진할 수 있기 때문이다(즉, 무염기 부위에 G를 혼입시키고, C에서 G로의 염기 편집 이벤트를 완료함).

사이티딘 데아미나아제를 도메인으로 포함하는 염기 편집기는 DNA, RNA 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한 임의의 폴리뉴클레오티드에서 표적 C를 탈아미노화할 수 있다. 일반적으로 사이티딘 데아미나아제는 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥 부분에 위치하는 C 핵염기를 촉매한다. 일부 구현예에서, 표적 C를 포함하는 전체 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기에 혼입된 사이티딘 데아미나아제는 단일 가닥 RNA 폴리뉴클레오티드의 표적 C를 탈아미노화할 수 있다. 다른 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제도메인을 포함하는 염기 편집기는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 작용할 수 있지만, 표적 C는 탈아미노화 반응 시 단일 가닥 상태에 있는 폴리뉴클레오티드의 일부에 위치할 수 있다. 예를 들어, NAGPB 도메인이 Cas9 도메인을 포함하는 구현예에서, 여러 뉴클레오티드는 Cas9-gRNA-표적 DNA 복합체 형성 동안 쌍을 이루지 않은 상태로 남아 Cas9 "R-루프 복합체"가 형성될 수 있다. 이러한 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드는 단일 가닥 특정 뉴클레오티드 데아미나아제 효소(예: 사이티딘 데아미나아제)에 대한 기질 역할을 할 수 있는 단일 가닥 DNA 버블을 형성할 수 있다.

일부 구현예에서, 염기 편집기의 사이티딘 데아미나아제는 아포지단백질 B mRNA 편집 복합체(APOBEC) 계열 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. APOBEC은 진화적으로 보존된 사이티딘 탈아미노효소 계열이다. 이 계열의 구성원은 C에서 U로의(C-to-U) 편집 효소이다. APOBEC 유사 단백질의 N-말단 도메인은 촉매 도메인인 반면, C-말단 도메인은 유사촉매 도메인이다. 보다 구체적으로, 촉매 도메인은 아연 의존성 사이티딘 탈아미노효소 도메인이며 사이티딘 탈아미노화에 중요하다. APOBEC 계열 구성원에는 APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D(현재 "APOBEC3E"는 이를 지칭함), APOBEC3F, APOBEC3G, APOBEC3H, APOBEC4 및 활성화 유도(사이티딘) 데아미나아제가 포함된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC1 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC2 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC3 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC3A 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC3B 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC3C 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC3D 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC3E 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC3F 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC3G 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC3H 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC4 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 활성화 유도 데아미나아제(AID)의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 사이티딘 데아미나아제 1(CDA1)의 전부 또는 일부를 포함한다. 염기 편집기는 임의의 적합한 유기체(예를 들어, 인간 또는 쥐)로부터의 데아미나아제를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 데아미나아제 도메인은 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 쥐 또는 마우스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 데아미나아제 도메인은 래트(예를 들어, 래트 APOBEC1)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 데아미나아제 도메인은 인간 APOBEC1이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 데아미나아제 도메인은 pmCDA1이다.

본 개시의 측면에 따라 Cas9에 융합될 수 있는 다른 예시적인 데아미나아제가 아래에 제공된다. 구현예에서, 데아미나아제는 활성화 유도된 데아미나아제(AID)이다. 일부 구현예에서, 각각의 서열의 활성 도메인, 예를 들어 국소화 신호가 없는 도메인(핵 국소화 서열, 핵 방출 신호가 없는 핵 국소화 서열, 세포질 국소화 신호)이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

본 개시내용의 일부 측면은 예를 들어 데아미나아제 도메인에서 점 돌연변이를 생성함으로써 본원에 기술된 임의의 융합 단백질의 데아미나아제 도메인 촉매 활성을 조절하는 것이 융합 단백질의 진행성에 영향을 미친다는 인식에 기초한다(예를 들어, 염기 편집기). 예를 들어, 염기 편집 융합 단백질 내에서 데아미나아제 도메인의 촉매 활성을 감소시키지만 제거하지는 않는 돌연변이는 데아미나아제 도메인이 표적 잔기에 인접한 잔기의 탈아미노화를 촉매할 가능성을 줄임으로써 탈아미노화 윈도우를 좁힐 수 있다. 탈아미노화 윈도우을 좁힐 수 있는 능력은 특정 표적 잔기에 인접한 잔기의 원치 않는 탈아미노화를 방지할 수 있으며, 이는 오프-타겟 효과를 감소시키거나 방지할 수 있다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 H121X, H122X, R126X, R126X, R118X, W90X, W90X 및 R132X로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.

일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 H121R, H122R, R126A, R126E, R118A, W90A, W90Y 및 R132E로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 D316X, D317X, R320X, R320X, R313X, W285X, W285X, R326X로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 돌연변이, 또는 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 hAPOBEC3G의 D316R, D317R, R320A, R320E, R313A, W285A, W285Y, R326E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이, 또는 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함한다.

일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 H121R 및 H122R 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 R126A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 R126E 돌연변이, 또는 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 R118A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 W90A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 W90Y 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 W90Y 및 R126E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 R126E 및 R132E 돌연변이, 또는 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 W90Y 및 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 rAPOBEC1의 W90Y, R126E 및 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 D316R 및 D317R 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 hAPOBEC3G의 R320A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 R320E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 R313A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 W285A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 W285Y 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 W285Y 및 R320E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 R320E 및 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 W285Y 및 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 APOBEC 데아미나아제는 hAPOBEC3G의 W285Y, R320E 및 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나아제의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나아제를 포함할 수 있다.

SaBE3, SaKKH-BE3, VQR-BE3, EQR-BE3, VRER-BE3, YE1-BE3, EE-BE3, YE2-BE3 및 YEE-BE3를 포함하되 이에 국한되지 않는 다수의 변형된 사이티딘 데아미나아제가 상업적으로 이용 가능하며, 이들은 애드진(Addgene)에서 구입 가능하다(플라스미드 85169, 85170, 85171, 85172, 85173, 85174, 85175, 85176, 85177). 일부 구현예에서, 염기 편집기에 포함된 데아미나아제는 APOBEC1 데아미나아제의 전부 또는 일부를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 사이티딘 데아미나아제 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 사이티딘 데아미나아제는 사이토신 또는 5-메틸사이토신을 우라실 또는 티민으로 탈아민화할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 사이티딘 데아미나아제는 DNA에서 사이토신을 탈아미노화할 수 있다. 사이티딘 데아미나아제는 임의의 적합한 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 본원에 제공된 임의의 돌연변이에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 자연 발생 사이티딘 데아미나아제이다. 당업자는 예를 들어 서열 정렬 및 상동 잔기의 결정에 의해 임의의 상동 단백질에서 상응하는 잔기를 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 당업자는 본원에 기술된 임의의 돌연변이에 상응하는 임의의 자연 발생 사이티딘 데아미나아제에서 돌연변이를 생성할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서 사이티딘 데아미나아제는 원핵생물로부터 유래된다. 일부 구현예에서 사이티딘 데아미나아제는 박테리아로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 포유동물(예를 들어, 인간)로부터 유래된다.

일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 본원에 제시된 사이티딘 데아미나아제 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 사이티딘 데아미나아제는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본원에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 일부 구현예는 임의의 이전 측면 또는 본원에 기술된 사이티딘 데아미나아제 핵염기 편집기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화된다.

본 개시내용은 특정 백분율 동일성을 갖는 임의의 데아미나아제 도메인과 본원에 기술된 임의의 돌연변이 또는 이들의 조합을 제공한다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제는 참조 서열 또는 본원에 제공된 임의의 사이티딘 데아미나아제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 사이티딘 데아미나아제는 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기술된 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 최소 50개, 최소 60개, 최소 70개, 최소 80개, 최소 90개, 최소 100개, 최소 110개, 최소 120개, 최소 130개, 최소 140개, 최소 150개, 최소 160개 또는 적어도 170개의 동일한 연속 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 제2 단백질의 융합 단백질은 2개 이상의 핵산 편집 도메인을 포함한다.

C에서 T로의 핵염기 편집의 세부사항은 국제 PCT 출원번호 PCT/US2016/058344 (WO2017/070632) 및 Komor, A.C., 등 “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”Nature 533, 420-424 (2016)에 기술되어 있으며, 그 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.

가이드 폴리뉴클레오티드

폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은, 결합된 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)와 결합할 때 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있으며 (즉, 결합된 가이드 핵산의 염기와 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 염기 사이의 상보적인 염기쌍 형성을 통해), 이에 의해 편집하고자 하는 표적 핵산 서열에 염기 편집기를 위치시킨다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA-RNA 하이브리드를 포함한다.

CRISPR는 이동성 유전 요소(바이러스, 전이 요소 및 접합 플라스미드)로부터 보호하는 적응성 면역 시스템이다. CRISPR 클러스터에는 스페이서, 선행 모바일 요소에 상보적인 서열 및 표적 침입 핵산이 포함되어 있다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA(crRNA)로 전사되고 처리된다. 유형 II CRISPR 시스템에서 pre-crRNA의 올바른 처리에는 트랜스 코딩된 소형 RNA(tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3(rnc) 및 Cas9 단백질이 필요하다. tracrRNA는 pre-crRNA의 리보뉴클레아제 3 보조 처리를 위한 가이드 역할을 한다. 이어서, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 핵내분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 내핵용해적으로(endonucleolytically) 절단된 다음, 외핵용해적으로(exonucleolytically) 3'-5' 트리밍된다. 자연적으로 DNA 결합과 절단에는 일반적으로 단백질과 두 RNA가 모두 필요하다. 그러나 단일 가이드 RNA("sgRNA" 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종에 혼입하도록 조작될 수 있다. 예를 들어 Jinek M., 등 Science 337:816-821(2012)를 참고하며, 이의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다. Cas9은 CRISPR 반복 서열(PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)에서 짧은 모티프를 인식하여 자기와 비자기를 구별하는 데 도움을 준다. 예를 들어 “genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.” Ferretti, J.J. 등 Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); “RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.” Deltcheva E. 등 Nature 471:602-607(2011); 및 Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity, Jinek M. 등, Science 337:816-821(2012)를 참조하며, 이의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.

PAM 서열은 당업계에 공지된 임의의 PAM 서열일 수 있다. 적합한 PAM 서열에는NGG, NGA, NGC, NGN, NGT, NGCG, NGAG, NGAN, NGNG, NGCN, NGCG, NGTN, NNGRRT, NNNRRT, NNGRR(N), TTTV, TYCV, TYCV, TATV, NNNNGATT, NNAGAAW 또는 NAAAAC가 포함되나 이로 제한되지 않는다. Y는 피리미딘이고; N은 임의의 뉴클레오티드 염기이고; W는 A 또는 T이다.

일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 가이드 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 한 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 gRNA이다. RNA/Cas 복합체는 Cas 단백질을 표적 DNA로 "유도"하는 데 도움을 줄 수 있다. Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 핵내분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 내핵용해적으로 절단된 다음, 외핵용해적으로 3'-5'로 잘린다. 자연적으로 DNA 결합과 절단에는 일반적으로 단백질과 두 RNA가 모두 필요하다. 그러나 단일 가이드 RNA("sgRNA" 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종에 혼입하도록 조작될 수 있다. 예를 들어 Jinek M., 등. Science 337:816-821(2012)를 참고하며, 이의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 단일 가이드 RNA("sgRNA" 또는 "gRNA")이다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 상보적인 염기쌍(예를 들어, 이중 가이드 폴리뉴클레오티드, 이중 gRNA)을 통해 서로 상호작용할 수 있는 2개 이상의 개별 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오티드는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스 활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함할 수 있거나 하나 이상의 트랜스 활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 tracrRNA이다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)을 표적 뉴클레오티드 서열로 안내하기 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는다.

가이드 폴리뉴클레오티드는 천연 또는 비천연(또는 비천연) 뉴클레오티드(예를 들어, 펩티드 핵산 또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 가이드 핵산 서열의 표적화 영역은 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 가이드 핵산의 표적화 영역은 길이가 10-30개 뉴클레오티드, 또는 15-25개 뉴클레오티드, 또는 15-20개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드(예: 다중 gRNA)를 활용한다. 일부 구현예에서, 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 설명된 다양한 염기 편집기에 사용된다. 예를 들어, 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 사이티딘 염기 편집기 및 아데노신 염기 편집기에 활용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 조작된 Cas 단백질을 활용할 수 있다. 가이드 RNA(gRNA)는 Cas 결합에 필요한 스캐폴드 서열과 변형할 게놈 표적을 정의하는 사용자 정의 ~20 뉴클레오티드 스페이서로 구성된 짧은 합성 RNA이다. 예시적인 gRNA 스캐폴드 서열은 서열 목록에 서열 번호: 405-415로 제공된다. 따라서, 숙련된 기술자는 Cas 단백질 특이성의 게놈 표적을 변경할 수 있으며, 이는 gRNA 표적화 서열이 게놈의 나머지 부분과 비교하여 게놈 표적에 대해 얼마나 특이적인가에 따라 부분적으로 결정된다.

다른 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 단일 분자(즉, 단일 분자 가이드 핵산)에 핵산의 폴리뉴클레오티드 표적화 부분과 핵산의 스캐폴드 부분을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 분자 가이드 폴리뉴클레오티드는 단일 가이드 RNA(sgRNA 또는 gRNA)일 수 있다. 본 명세서에서 가이드 폴리뉴클레오티드 서열이라는 용어는 염기 편집기와 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 상호작용하고 이를 지시할 수 있는 임의의 단일, 이중 또는 다중 분자 핵산을 고려한다.

전형적으로, 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, crRNA/trRNA 복합체 또는 gRNA)는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 인식하고 이에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 "폴리뉴클레오티드-표적화 분절" 및 이를 안정화시키는 "단백질-결합 분절"를 포함한다. 염기 편집기의 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 구성요소 내에서 폴리뉴클레오티드를 안내한다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 표적화 분절은 DNA 폴리뉴클레오티드를 인식하고 이에 결합함으로써 DNA 내 염기의 편집을 촉진한다. 다른 경우에, 가이드 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 표적화 분절은 RNA 폴리뉴클레오티드를 인식하고 이에 결합하여 RNA의 염기 편집을 촉진한다. 본 명세서에서 "분절"은 분자의 섹션 또는 영역, 예를 들어 가이드 폴리뉴클레오티드 내 연속적인 뉴클레오티드 스트레치를 의미한다. 분절은 또한 분절이 다음보다 많은 영역을 포함할 수 있도록 복합체의 영역/섹션을 의미할 수 있다. 예를 들어, 가이드 폴리뉴클레오티드가 다중 핵산 분자를 포함하는 경우, 단백질 결합 분절은 예를 들어 상보성 영역을 따라 혼성화되는 다중 개별 분자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 두 개의 개별 분자를 포함하는 DNA 표적화 RNA의 결합 분절은 (i) 길이가 100개의 염기쌍인 첫 번째 RNA 분자의 염기쌍 40-75 및 (ii) 두 번째 RNA 분자의 염기쌍 10-25를 포함할 수 있으며, 즉, 길이는 50개 염기쌍이다. 특정 문맥에서 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, "분절"의 정의는 총 염기쌍의 특정 수에 제한되지 않고, 주어진 RNA 분자로부터의 특정 염기쌍 수에 제한되지 않으며, 특정 염기쌍 수에 제한되지 않고, 복합체 내의 개별 분자의 수는 임의의 전체 길이의 RNA 분자 영역을 포함할 수 있으며 다른 분자에 대한 상보성을 갖는 영역을 포함할 수 있다.

가이드 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성되거나, 효소적으로 합성되거나, 이들의 조합으로 합성될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 표준 포스포르아미다이트 기반 고체상 합성 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 대안적으로, gRNA는 gRNA를 코딩하는 DNA를 파지 RNA 폴리머라아제에 의해 인식되는 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결함으로써 시험관내에서 합성될 수 있다. 적합한 파지 프로모터 서열의 예에는 T7, T3, SP6 프로모터 서열 또는 그의 변이가 포함된다. gRNA가 2개의 별도의 분자(예를 들어, crRNA 및 tracrRNA)를 포함하는 구현예에서, crRNA는 화학적으로 합성될 수 있고 tracrRNA는 효소적으로 합성될 수 있다.

가이드 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 gRNA를 코딩하는 DNA, 예를 들어 gRNA를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 벡터에 의해 발현될 수 있다. gRNA는 단독으로 또는 코딩된 염기 편집기와 함께 코딩될 수 있다. 이러한 DNA 서열은 발현 시스템, 예를 들어 세포 내로 함께 또는 별도로 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및 gRNA를 코딩하는 DNA 서열은 세포 내로 도입될 수 있으며, 각 DNA 서열은 별도의 분자(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 코딩 서열을 포함하는 하나의 벡터 및 두 번째 벡터)의 일부일 수 있다. gRNA 코딩 서열을 포함하는 또는 둘 다 동일한 분자의 일부일 수 있다(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능힌 뉴클레오티드 결합 도메인과 gRNA 둘 다에 대한 코딩(및 조절) 서열을 포함하는 하나의 벡터). RNA는 합성 DNA 분자(예: gBlocks®유전자 단편)로부터 전사될 수 있다. gRNA 분자는 in vitro에서 전사될 수 있다.

gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 3개의 영역, 즉 염색체 서열의 표적 부위에 상보적일 수 있는 5' 말단의 첫 번째 영역, 스템 루프 구조를 형성할 수 있는 두 번째 내부 영역, 및 단일 가닥이 될 수 있는 세 번째 3' 영역을 포함할 수 있다. 각 gRNA의 첫 번째 영역은 또한 각 gRNA가 융합 단백질을 특정 표적 부위로 안내하도록 다를 수 있다. 또한, 각 gRNA의 두 번째 및 세 번째 영역은 모든 gRNA에서 동일할 수 있다.

gRNA의 제1 영역 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 gRNA의 제1 영역이 표적 부위와 염기쌍을 이룰 수 있도록 염색체 서열의 표적 부위의 서열에 상보적일 수 있다. 일부 경우에, gRNA의 제1 영역은 약 10개의 뉴클레오티드 내지 25개의 뉴클레오티드(즉, 10개의 뉴클레오티드 내지 뉴클레오티드; 또는 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드; 또는 10개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드; 또는 약 10개 뉴클레오티드 내지 25개 뉴클레오티드) 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA의 제1 영역과 염색체 서열의 표적 부위 사이의 염기쌍 형성 영역은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있거나, 또는 그 길이일 수 있다. 때때로, gRNA의 제1 영역은 길이가 약 19개, 20개 또는 21개 뉴클레오티드일 수 있거나 길이일 수 있다.

gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 또한 2차 구조를 형성하는 제2 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA에 의해 형성된 2차 구조는 스템(또는 헤어핀) 및 루프를 포함할 수 있다. 루프와 스템의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 루프의 길이는 약 3 내지 10개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 스템의 길이는 약 6 내지 20개의 염기쌍 길이일 수 있다. 스템은 1개 내지 10개 또는 약 10개의 뉴클레오티드로 구성된 하나 이상의 오버행을 포함할 수 있다. 제2 영역의 전체 길이는 약 16 내지 60개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 루프는 길이가 약 4개의 뉴클레오티드일 수 있거나 그럴 수 있고 스템은 약 12개의 염기쌍일 수 있거나 그럴 수 있다.

gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 또한 본질적으로 단일 가닥일 수 있는 3' 말단에 제3 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세 번째 영역은 관심 세포의 염색체 서열과 상보적이지 않은 경우도 있고 gRNA의 나머지 부분과 상보적이지 않은 경우도 있다. 또한, 제3 영역의 길이는 다양할 수 있다. 제3 영역의 길이는 약 4개 뉴클레오티드 이상일 수 있다. 예를 들어, 제3 영역의 길이는 약 5 내지 60개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 유전자 표적의 임의의 엑손 또는 인트론을 표적화할 수 있다. 어떤 경우에는 가이드가 유전자의 엑손 1 또는 2를 표적으로 삼을 수 있고, 다른 경우에는; 가이드는 유전자의 엑손 3 또는 4를 표적으로 삼을 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 모두 동일한 엑손을 표적화하는 다중 gRNA 또는 상이한 엑손을 표적화하는 다중 gRNA를 포함한다. 유전자의 엑손 및/또는 인트론이 표적화될 수 있다.

gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 약 20개 뉴클레오티드 또는 약 20개 미만의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 약 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30개 뉴클레오티드) 또는 약 1-100개 뉴클레오티드(예: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100)의 핵산 서열을 표적할 수 있다. 표적 핵산 서열은 PAM의 첫 번째 뉴클레오티드의 5' 바로 옆의 약 20개의 염기이거나 그럴 수 있다. gRNA는 핵산 서열을 표적으로 삼을 수 있다. 표적 핵산은 적어도 또는 적어도 약 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90 또는 1-100개의 뉴클레오티드 일 수 있다.

가이드 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 gRNA 및 표적화 서열을 선택, 설계 및 검증하는 방법은 본원에 기재되어 있으며 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 핵염기 편집기 시스템(예: AID 도메인)에서 데아미나아제 도메인의 잠재적 기질 부적합성(substrate promiscuity)의 영향을 최소화하기 위해 의도하지 않게 탈아미노화의 표적이 될 수 있는 잔기(예: 잠재적으로 표적을 벗어난 C 잔기)의 수를 최소화한다. 표적 핵산 유전자좌 내의 단일 가닥 DNA에 존재하는 것)이 최소화될 수 있다. 또한, 소프트웨어 도구를 사용하여 표적 핵산 서열에 해당하는 gRNA를 최적화할 수 있다(예: 게놈 전반에 걸쳐 전체 표적을 벗어난 활성을 최소화하기 위해). 예를 들어 에스. 파이오게네스(S. pyogenes) Cas9를 사용하여 가능한 각각의 표적화 도메인 선택에 대해 모든 오프-타겟 서열(선행된 선택된 PAM, 예를 들어 NAG 또는 NGG)은 미스매치된 염기쌍 특정 수(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)까지를 포함하는 전체 게놈 내에서 확인될 수 있다. 표적 부위에 상보적인 gRNA의 첫 번째 영역을 식별할 수 있으며, 모든 첫 번째 영역(예: crRNA)은 전체 예측된 오프-타겟 점수에 따라 순위를 매길 수 있다. 최상위 타겟팅 도메인은 목표에 대한 활동이 가장 크고 목표를 벗어난 활동이 가장 적을 가능성이 있는 도메인을 나타낸다. gRNA를 표적으로 하는 후보는 당업계에 공지된 방법 및/또는 본원에 제시된 방법을 사용하여 기능적으로 평가될 수 있다.

비제한적 예로서, Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA의 crRNA의 표적 DNA 혼성화 서열은 DNA 서열 검색 알고리즘을 사용하여 식별될 수 있다. gRNA 디자인은 Bae S., Park J., & Kim J.-S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014)에 설명된 공개 도구 cas-OFFinder를 기반으로 하는 맞춤형 gRNA 디자인 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 이 소프트웨어는 게놈 전체의 오프-타겟 성향을 계산한 후 점수를 매긴다. 일반적으로 길이가 17~24인 가이드에 대해 완벽한 일치부터 7개의 불일치까지 일치 항목이 고려된다. 오프-타겟 부위가 컴퓨터로 결정되면 각 가이드에 대해 집계 점수가 계산되고 웹-인터페이스를 사용하여, 표형식의 아웃풋이 요약된다. PAM 서열에 인접한 잠재적인 표적 부위를 식별하는 것 외에도, 소프트웨어는 선택된 표적 부위와 1, 2, 3 또는 3개 이상의 뉴클레오티드가 다른 모든 PAM 인접 서열도 식별한다. 표적 핵산 서열, 예를 들어 표적 유전자에 대한 게놈 DNA 서열을 얻을 수 있고 반복 요소는 공개적으로 이용 가능한 도구, 예를 들어 리피트마스커(RepeatMasker) 프로그램을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 리피트마스커(RepeatMasker)는 입력 DNA 서열에서 반복되는 요소와 복잡성이 낮은 영역을 검색한다. 출력은 주어진 쿼리 시퀀스에 존재하는 반복에 대한 자세한 주석이다.

식별 후, gRNA(예: crRNA)의 첫 번째 영역은 표적 부위까지의 거리, 직교성(orthogonality) 및 관련 PAM 서열과 밀접하게 일치하는 5' 뉴클레오티드의 존재 여부를 기준으로 계층으로 순위가 지정된다 (예를 들어, 관련 PAM, 예를 들어 에스. 파이오게네스(S. pyogenes)의 경우, NGG PAM, 에스. 파이오게네스(S. pyogenes)의 경우, NNGRRT 또는 NNGRRV PAM을 함유하는 인간 게놈에서 근접한 매치의 식별에 기초한 5'G). 본 명세서에 사용된 바와 같이, 직교성(orthogonality)은 표적 서열에 대한 최소 수의 미스매치를 포함하는 인간 게놈의 서열 수를 의미한다. "높은 수준의 직교성" 또는 "우수한 직교성"은 예를 들어, 의도된 표적 외에 인간 게놈에 동일한 서열이 없거나 표적에 하나 또는 두 개의 미스매치를 포함하는 서열이 없는 20량체 표적 도메인을 의미할 수 있다. 표적을 벗어난 DNA 절단을 최소화하기 위해 직교성이 좋은 표적화 도메인을 선택할 수 있다.

그런 다음 gRNA는 RNA 분자 또는 비RNA 핵산 분자, 예를 들어 DNA 분자로서 세포 또는 배아에 도입될 수 있다. 한 구현예에서, gRNA를 코딩하는 DNA는 관심 세포 또는 배아에서 gRNA의 발현을 위한 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. RNA 코딩 서열은 RNA 폴리머라아제 III(Pol III)에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. gRNA를 발현하는데 사용될 수 있는 플라스미드 벡터에는 px330 벡터 및 px333 벡터가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 플라스미드 벡터(예를 들어, px333 벡터)는 적어도 2개의 gRNA 코딩 DNA 서열을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 추가적인 발현 제어 서열(예를 들어, 인핸서 서열, Kozak 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선택 가능한 마커 서열(예를 들어, GFP 또는 퓨로마이신과 같은 항생제 내성 유전자), 복제 오리진 등을 포함할 수 있다. gRNA를 코딩하는 DNA 분자는 선형일 수도 있다. gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 DNA 분자는 또한 원형일 수 있다.

일부 구현예에서, 염기 편집 활성을 검출하고 후보 가이드 폴리뉴클레오티드를 테스트하기 위해 리포터 시스템이 사용된다. 일부 구현예에서, 리포터 시스템은 염기 편집 활성이 리포터 유전자의 발현을 유도하는 리포터 유전자 기반 검정을 포함한다. 예를 들어, 리포터 시스템은 비활성화된 시작 코돈, 예를 들어 주형 가닥의 3'-TAC-5'에서 3'-CAC-5'로의 돌연변이를 포함하는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 표적 C가 성공적으로 탈아미노화되면 해당 mRNA가 5'-GUG-3' 대신 5'-AUG-3'으로 전사되어 리포터 유전자의 번역이 가능해진다. 적합한 리포터 유전자는 당업자에게 명백할 것이다. 리포터 유전자의 비제한적인 예에는 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 루시퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP)를 코딩하는 유전자, 또는 발현이 검출 가능하고 당업자에게 명백한 기타 유전자가 포함된다. 리포터 시스템은 예를 들어 각각의 데아미나아제가 표적화할 표적 DNA 서열과 관련하여 어느 잔기(들)를 결정하기 위해 다양한 gRNA를 테스트하는 데 사용될 수 있다. 비주형 가닥을 표적으로 하는 sgRNA는 특정 염기 편집 단백질(예: Cas9 데아미나아제 융합 단백질)의 오프-타겟 효과를 평가하기 위해 테스트될 수도 있다. 일부 구현예에서, 이러한 gRNA는 돌연변이된 시작 코돈이 gRNA와 염기쌍을 이루지 않도록 설계될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 표준 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드(예를 들어, 슈도우리딘), 리보뉴클레오티드 이성질체, 및/또는 리보뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 검출 가능한 라벨은 형광단(예: FAM, TMR, Cy3, Cy5, 텍사스 레드(Texas Red), 오레곤 그린(Oregon Green), 알렉사 플루어스(Alexa Fluors), 할로(Halo) 태그 또는 적합한 형광 염료), 검출 태그(예: 비오틴, 디곡시게닌 등), 양자점 또는 금 입자 일 수 있다.

일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 다중 가이드 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 gRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA는 염기 편집기 시스템으로 구성되는 하나 이상의 표적 유전자좌(예를 들어, 적어도 1 gRNA, 적어도 2 gRNA, 적어도 5 gRNA, 적어도 10 gRNA, 적어도 20 gRNA, 적어도 30 g RNA, 적어도 50 gRNA)를 표적화할 수 있다. 다수의 gRNA 서열은 일렬로 배열될 수 있고 바람직하게는 직접 반복부에 의해 분리된다.

변경된 폴리뉴클레오티드(Modified Polynucleotides)

발현, 안정성 및/또는 게놈/염기 편집 효율성을 향상시키고/하거나 가능한 독성을 줄이기 위해, 염기 편집기 코딩 서열(예: mRNA) 및/또는 가이드 폴리뉴클레오티드(예: gRNA)는 다음 중 하나를 포함하도록 변형될 수 있다. 또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 화학적 변형, 예를 들어 슈도-우리딘, 5-메틸-사이토신, 2'-O-메틸-3'-포스포노아세테이트, 2'-O-메틸 티오PACE(MSP), 2'-O-메틸-PACE(MP), 2'-플루오로 RNA(2'-F-RNA), =컨스트레인된 에틸(S-cEt), 2'-O-메틸('M'), 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트('MS'), 2'-O-메틸-3'-티오포스포노아세테이트('MSP'), 5-메톡시우리딘, 포스포로티오에이트 및 N1-메틸슈도우리딘을 사용하여 변경될 수 있다. 화학적으로 보호된 gRNA는 생체 내 및 생체 외 안정성과 편집 효율성을 향상시킬 수 있다. 화학적으로 변경된 mRNA 및 가이드 RNA를 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Jiang 등, Chemical modifications of adenine base editor mRNA and guide RNA expand its application scope. Nat Commun　11,　1979 (2020). doi.org/10.1038/s41467-020-15892-8, Callum 등, N1-Methylpseudouridine substitution enhances the performance of synthetic mRNA switches in cells,　Nucleic Acids Research, Volume 48, Issue 6, 06 April 2020, Page e35, 및 Andries 등, Journal of Controlled Release, Volume 217, 10 November 2015, Pages 337-344에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 여기에 참조로 포함된다.

특정 구현예에서, 화학적 변형은 2'-O-메틸(2'-OMe) 변형이다. 변형된 가이드 RNA는 saCas9 효능과 특이성을 향상시킬 수 있다. 개별 변형의 효과는 사용된 화학적 변형의 위치와 조합뿐만 아니라 다른 변형된 뉴클레오티드와의 분자간 및 분자내 상호작용에 따라 달라진다. 예를 들어, S-cEt는 올리고뉴클레오티드 분자내 접힘을 개선하는 데 사용되었다.

일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 2개, 3개, 4개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 2개, 3개, 4개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드의 5' 말단에 4개의 변형된 뉴클레오시드 및 3' 말단에 4개의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 2'-O-메틸 또는 포스포로티오에이트를 포함한다.

일부 구현예에서, 가이드는 적어도 약 50%-75% 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드는 적어도 약 85% 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA의 5' 말단에 있는 적어도 약 1-5개의 뉴클레오티드가 변형되고, gRNA의 3' 말단에 있는 적어도 약 1-5개의 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 구현예에서, gRNA의 5' 및 3' 말단 각각에서 적어도 약 3-5개의 연속 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 구현예에서, 직접 반복부 또는 역-직접 반복부에 존재하는 뉴클레오티드의 약 20% 이상이 변형된다. 일부 구현예에서, 직접 반복부 또는 역-직접 반복부에 존재하는 뉴클레오티드의 약 50% 이상이 변형된다. 일부 구현예에서, 직접 반복부 또는 역-직접 반복부에 존재하는 뉴클레오티드의 적어도 약 50-75%가 변형된다. 일부 구현예에서, 직접 반복부 또는 역-직접 반복부에 존재하는 뉴클레오티드 중 적어도 약 100개가 변형된다. 일부 구현예에서, gRNA 스캐폴드에 존재하는 헤어핀에 존재하는 뉴클레오티드의 적어도 약 20% 이상이 변형된다. 일부 구현예에서, gRNA 스캐폴드에 존재하는 헤어핀에 존재하는 뉴클레오티드의 적어도 약 50% 이상이 변형된다. 일부 실시예에서, 가이드는 가변 길이 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드는 20-40개의 뉴클레오티드 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드는 적어도 약 20-25개의 뉴클레오티드 또는 적어도 약 30-35개의 뉴클레오티드를 포함하는 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 가이드는 다음 중 2개 이상을 포함한다:

gRNA의 5' 말단에 있는 적어도 약 1-5개의 뉴클레오티드가 변형되고, gRNA의 3' 말단에 있는 적어도 약 1-5개의 뉴클레오티드가 변형되고;

직접 반복 또는 역-직접 반복에 존재하는 뉴클레오티드의 약 20% 이상이 변형되고;

직접 반복 또는 역직접 반복에 존재하는 뉴클레오티드의 약 50-75% 이상이 변형되고;

gRNA 스캐폴드에 존재하는 헤어핀에 존재하는 뉴클레오티드의 적어도 약 20% 이상이 변형되고;

가변 길이 스페이서; 및

변형된 뉴클레오티드를 포함하는 스페이서.

구현예에서, gRNA는 수많은 변형된 뉴클레오티드 및/또는 화학적 변형("중형 모드(heavy mods)")을 포함한다. 이러한 중형 모드는 생체 내 또는 시험관 내에서 염기 편집을 ~2배 증가시킬 수 있다. 이러한 변형의 경우 mN = 2'-OMe; Ns = 포스포로티오에이트(PS)이고, 여기서 "N"은 당업자가 이해하는 바와 같이 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 경우에, 뉴클레오티드(N)는 두 가지 변형, 예를 들어 2'-OMe 및 PS 변형을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트와 2'OMe가 있는 뉴클레오티드는 "mNs"로 표시된다. 두 개의 수정 사항이 나란히 있는 경우 표기법은 "mNsmNs"이다.

변형된 gRNA의 일부 구현예에서, gRNA는 2′-O-메틸 (2'-OMe), 포스포로티오에이트(PS), 2'-O-메틸 티오PACE(MSP), 2'-O-메틸-PACE(MP), 2'-O-메틸 티오PACE(MSP), 2'-플루오로 RNA(2'-F-RNA) 및 컨스트레인된(constrained) 에틸(S-cEt)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화학적 변형을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 2'-O-메틸 또는 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 2'-O-메틸 및 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 구현예에서, 변형은 염기 편집을 적어도 약 2배 증가시킨다.

가이드 폴리뉴클레오티드는 새롭거나 향상된 특징을 가진 핵산을 제공하기 위해 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 핵산 친화성 태그를 포함할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 합성 뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드 유도체 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

일부 경우에, gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 변형을 포함할 수 있다. 변형은 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드의 임의 위치에서 이루어질 수 있다. 단일 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드에 대해 하나 이상의 변형이 이루어질 수 있다. gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 변형 후 품질 관리를 받을 수 있다. 어떤 경우에는 품질 관리에 PAGE, HPLC, MS 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.

gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드의 변형은 치환, 삽입, 결실, 화학적 변형, 물리적 변형, 안정화, 정제 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 또한 5' 아데닐레이트, 5' 구아노신-트리포스페이트 캡, 5' N7-메틸구아노신-트리포스페이트 캡, 5' 트리포스페이트 캡, 3' 포스페이트, 3' 티오포스페이트, 5' 포스페이트, 5' 티오포스페이트, Cis-Syn 티미딘 이량체, 삼량체, C12 스페이서, C3 스페이서, C6 스페이서, d스페이서, PC 스페이서, r스페이서, 스페이서 18, 스페이서 9, 3'-3' 변형, 2'-O-메틸 티오PACE(MSP), 2'-O-메틸-PACE(MP) 및 컨드트레인된(constrained) 에틸(S-cEt), 5'-5' 변형, 아크리딘, 아조벤젠, 비오틴, 비오틴 BB, 비오틴 TEG, 콜레스테릴 TEG, 데스티오비오틴 TEG, DNP TEG , DNP-X, DOTA, dT-비오틴, 이중 비오틴, PC 비오틴, 소랄렌(psoralen) C2, 소랄렌(psoralen) C6, TINA, 3' DABCYL, 블랙홀 소광제 1, 블랙홀 소광제 2, DABCYL SE, dT-DABCYL, IRDye QC-1 , QSY-21, QSY-35, QSY-7, QSY-9, 카르복실 링커, 티올 링커, 2'-데옥시리보뉴클레오사이드 유사체 퓨린, 2'-데옥시리보뉴클레오사이드 유사체 피리미딘, 리보뉴클레오사이드 유사체, 2'-O-메틸 리보뉴클레오사이드 유사체, 슈가 변형된 유사체, 워블/범용 베이스(wobble/universal bases), 형광 염료 라벨, 2'-플루오로 RNA, 2'-O-메틸 RNA, 메틸포스포네이트, 포스포디에스테르 DNA, 포스포디에스테르 RNA, 포스포티오에이트 DNA, 포스포로티오에이트 RNA, UNA, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 5'-메틸사이티딘-5'-트리포스페이트, 또는 이들의 조합에 의해 변형될 수 있다..

일부 경우, 변형은 영구적이다. 다른 경우, 변형은 일시적이다. 어떤 경우 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드에 다중 변형이 이루어진다. gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드 변형은 형태, 극성, 소수성, 화학적 반응성, 염기쌍 상호작용 또는 이들의 조합과 같은 뉴클레오티드의 물리화학적 특성을 변경할 수 있다.

가이드 폴리뉴클레오티드는 단리된 gRNA 또는 가이드 RNA를 코딩하는 서열 및 프로모터를 포함하는 플라스미드 DNA로 세포를 형질감염시킴으로써 세포 내로 전달될 수 있다. gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드는 바이러스 매개 유전자 전달을 사용하는 것과 같은 다른 방식으로 세포 내로 전달될 수도 있다. gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드가 분리될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 분리된 RNA 형태로 세포나 유기체에 형질감염될 수 있다. gRNA는 당업계에 공지된 임의의 시험관내 전사 시스템을 사용하여 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. gRNA는 gRNA에 대한 암호화 서열을 포함하는 플라스미드 형태가 아닌 분리된 RNA 형태로 세포에 전달될 수 있다.

변형은 포스포로티오에이트 대체물일 수도 있다. 어떤 경우에는 천연 포스포디에스테르 결합이 세포 뉴클레아제에 의해 빠르게 분해되기 쉬울 수 있다. 포스포로티오에이트(PS) 결합 대체물을 사용한 뉴클레오티드 간 연결의 변형은 세포 분해에 의한 가수분해에 대해 더 안정적일 수 있다. 변형은 gRNA 또는 가이드 폴리뉴클레오티드의 안정성을 증가시킬 수 있다. 변형은 생물학적 활동을 향상시킬 수도 있다. 어떤 경우에는 포스포로티오에이트 강화 RNA gRNA가 RNase A, RNase T1, 소 혈청 뉴클레아제 또는 이들의 조합을 억제할 수 있다. 이러한 특성으로 인해 생체 내 또는 시험관 내에서 뉴클레아제에 노출될 가능성이 높은 응용 분야에서 PS-RNA gRNA를 사용할 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트(PS) 결합은 엑소뉴클레아제 분해를 억제할 수 있는 gRNA의 5'- 또는 3'-말단의 마지막 3-5개 뉴클레오티드 사이에 도입될 수 있다. 어떤 경우에는 엔도뉴클레아제에 의한 공격을 줄이기 위해 전체 gRNA에 포스포로티오에이트 결합을 추가할 수 있다.

일부 구현예에서, 가이드 RNA는 스플라이스 부위(즉, 스플라이스 수용체(SA) 또는 스플라이스 공여체(SD)를 파괴하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 염기 편집이 조기 종결 코돈을 초래하도록 설계된다.

프로토스페이서 인접 모티프(Protospacer Adjacent Motif)

용어 “프로토스페이서 인접 모티프(PAM)”또는 PAM 유사 모티프는 CRISPR 박테리아 적응성 면역 시스템에서 Cas9 뉴클레아제가 표적으로 삼는 DNA 서열 바로 뒤에 있는 2-6 염기쌍 DNA 서열을 의미한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' PAM일 수 있다(즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 상류에 위치함). 다른 구현예에서, PAM은 3' PAM(즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 하류에 위치함)일 수 있다. PAM 서열은 표적 결합에 필수적이지만 정확한 서열은 Cas 단백질의 유형에 따라 다르다. PAM 서열은 당업계에 공지된 임의의 PAM 서열일 수 있다. 적합한 PAM 서열에는 NGG, NGA, NGC, NGN, NGT, NGTT, NGCG, NGAG, NGAN, NGNG, NGCN, NGCG, NGTN, NNGRRT, NNNRRT, NNGRR(N), TTTV, TYCV, TYCV, TATV, NNNNGATT, NNAGAAW 또는 NAAAAC이 있으며 이로 제한되지 않는다. Y는 피리미딘이고; N은 임의의 뉴클레오티드 염기이고; W는 A 또는 T이다.

본원에 제공된 염기 편집기는 표준 또는 비-표준 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 CRISPR 단백질 유래 도메인을 포함할 수 있다. PAM 부위는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 근접한 뉴클레오티드 서열이다. 본 개시내용의 일부 측면은 상이한 PAM 특이성을 갖는 CRISPR 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 염기 편집기를 제공한다.

예를 들어, 일반적으로 에스. 파이오게네스(S. pyogenes)의 Cas9(spCas9)와 같은 Cas9 단백질은 특정 핵산 영역에 결합하기 위해 표준 NGG PAM 서열이 필요하다. 여기서 "NGG"의 "N"은 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G) 또는 사이토신(C)이고, G는 구아닌이다. PAM은 CRISPR 단백질 특이적일 수 있으며 다양한 CRISPR 단백질 유래 도메인을 포함하는 다양한 염기 편집기 간에 다를 수 있다. PAM은 표적 서열의 5' 또는 3'일 수 있다. PAM은 표적 서열의 업스트림 또는 다운스트림일 수 있다. PAM은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 종종 PAM의 길이는 2-6개 뉴클레오티드 사이이다.

일부 구현예에서, PAM은 "NRN"의 "N"이 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G) 또는 사이토신(C)이고, R이 아데닌(A) 또는 구아닌(G)인 "NRN" PAM이거나; 또는 PAM은 "NYN" PAM이고, 여기서 NYN의 "N"은 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G) 또는 사이토신(C)이고, Y는 사이티딘(C) 또는 티민(T)이며, 예를 들어 R.T. Walton 등 2020, Science, 10.1126/science.aba8853 (2020)에 설명되어 있고, 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.

여러 PAM 변형이 아래 표 6에 설명되어 있다.

표 6. Cas9 단백질 및 상응하는 PAM 서열

일부 구현예에서, PAM은 NGC이다. 일부 구현예에서, NGC PAM은 Cas9 변이체에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, NGC PAM 변이체는 D1135M, S1136Q, G1218K, E1219F, A1322R, D1332A, R1335E 및 T1337R(총칭하여 "MQKFRAER"로 지칭됨)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.

일부 구현예에서, PAM은 NGT이다. 일부 구현예에서 NGT PAM은 Cas9 변이체에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하나 이상의 잔기 1335, 1337, 1135, 1136, 1218 및/또는 1219에서 표적화된 돌연변이를 통해 생성된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하나 이상의 잔기 1219, 1335, 1337, 1218에서 표적화된 돌연변이를 통해 생성된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 하나 이상의 잔기 1135, 1136, 1218, 1219 및 1335에서 표적화된 돌연변이를 통해 생성된다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 아래 표 7A 및 7B에 제공된 표적화된 돌연변이 세트에서 선택된다.

표 7A. 잔기 1219, 1335, 1337, 1218에서의 NGT PAM 변이체 돌연변이

표7B: 잔기 1135, 1136, 1218, 1219, 및 1335에서의 NGT PAM 변이체 돌연변이

일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 표 7A 및 표 7B의 변이체 5, 7, 28, 31, 또는 36에서 선택된다. 일부 구현예에서, 변이체는 향상된 NGT PAM 인식을 갖는다.

일부 구현예에서, NCT PAM 변이체는 잔기 1219, 1335, 1337 및/또는 1218에 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, NGT PAM 변이체는 다음 표 8에 제공된 변이체로부터 향상된 인식을 갖는 돌연변이에서 선택된다.

표 8: 잔기 1219, 1335, 1337, 및 1218에서의 NGT PAM 변이체 돌연변이

일부 구현예에서, NGT PAM은 아래 표 9에 제공되는 변이체로부터 선택된다.

표 9. NGT PAM 변이체

일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 1이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 2이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 3이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 4이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 5이다. 일부 구현예에서, NGTN 변이체는 변이체 6이다.

일부 구현예에서, Cas9 도메인은 스트렙토코쿠스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes) (SpCas9)으로부터의 Cas9 도메인이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SpCas9, 뉴클레아제 불활성 SpCas9(SpCas9d), 또는 SpCas9 니카아제(SpCas9n)이다. 일부 구현예에서, SpCas9는 D9X 돌연변이, 또는 본 명세서에 제공된 임의의 아미노산 서열에 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서 X는 D를 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 D9A 돌연변이 또는 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인, SpCas9d 도메인, 또는 SpCas9n 도메인은 비표준 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인, SpCas9d 도메인 또는 SpCas9n 도메인은 NGG, NGA 또는 NGCG PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다.

일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135X, R1335X 및 T1337X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135E, R1335Q 및 T1337R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135E, R1335Q 및 T1337R 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135X, R1335X 및 T1337X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135V, R1335Q 및 T1337R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135V, R1335Q 및 T1337R 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135X, G1218X, R1335X 및 T1337X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본 명세서에 제공된 임의의 아미노산 서열에 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135V, G1218R, R1335Q 및 T1337R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, SpCas9 도메인은 D1135V, G1218R, R1335Q 및 T1337R 돌연변이, 또는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열에 상응하는 돌연변이를 포함한다.

일부 예에서, 본 명세서에 개시된 염기 편집기의 CRISPR 단백질 유래 도메인에 의해 인식되는 PAM은 염기 편집기를 코딩하는 삽입물(예를 들어, AAV 삽입물)에 대한 별도의 올리고뉴클레오티드 상의 세포에 제공될 수 있다. 이러한 구현예에서, 별도의 올리고뉴클레오티드에 PAM을 제공하면 표적 서열과 동일한 폴리뉴클레오티드에 인접한 PAM이 존재하지 않기 때문에 그렇지 않으면 절단될 수 없는 표적 서열의 절단을 허용할 수 있다.

구현예에서, 에스. 파이오게네스(S. pyogenes) Cas9(SpCas9)는 게놈 조작을 위한 CRISPR 엔도뉴클레아제로 사용될 수 있다. 그러나 다른 것들도 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 특정 게놈 표적을 표적으로 하기 위해 다른 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-NGG PAM 서열을 갖는 합성 SpCas9-유래 변이체가 사용될 수 있다. 추가로, 다양한 종으로부터의 다른 Cas9 이종성 상동체가 확인되었으며 이들 "비-SpCas9"는 본 개시내용에 또한 유용할 수 있는 다양한 PAM 서열에 결합할 수 있다. 예를 들어, SpCas9의 상대적으로 큰 크기(대략 4kb 코딩 서열)는 세포에서 효율적으로 발현될 수 없는 SpCas9 cDNA를 운반하는 플라스미드로 이어질 수 있다. 반대로, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureu) Cas9(SaCas9)의 코딩 서열은 SpCas9보다 약 1킬로베이스 짧기 때문에 세포에서 효율적으로 발현될 수 있다. SpCas9와 유사하게 SaCas9 엔도뉴클레아제는 시험관 내 포유류 세포와 생체 내 생쥐의 표적 유전자를 변형할 수 있다. 일부 구현예에서 Cas 단백질은 다른 PAM 서열을 표적으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 예를 들어 Cas9 PAM, 5'-NGG에 인접할 수 있다. 다른 구현예에서, 다른 Cas9 오솔로그는 다른 PAM 요구 사항을 가질 수 있다. 예를 들어 에스. 써모필루스(S. thermophiles)(CRISPR1의 경우 5'-NNAGAA, CRISPR3의 경우 5'-NGGNG) 및 네이세리아 메닌자이티디스(Neisseria meningitides) (5'-NNNNGATT)와 같은 다른 PAM도 표적 유전자 근처에서 발견될 수 있다.

일부 구현예에서, 에스. 파이오게네스 시스템의 경우, 표적 유전자 서열은 5'-NGG PAM보다 앞에 있을 수 있고(즉, 5'에 대해), 20-nt 가이드 RNA 서열은 반대 가닥과 염기쌍을 맺어 PAM에 인접한 Cas9 절단을 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, 인접한 절단부는 PAM 상류의 약 3개 염기쌍일 수 있거나 그럴 수 있다. 일부 구현예에서, 인접한 절단부는 PAM 상류의 염기쌍 약 10개일 수 있거나 그럴 수 있다. 일부 구현예에서, 인접한 절단부는 PAM 상류의 약 0-20개의 염기쌍일 수 있거나 그럴 수 있다. 예를 들어 인접한 컷은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 염기쌍 상류의 PAM 옆에 있을 수 있다. 인접한 컷은 PAM의 하류에 1~30개 염기쌍만큼 있을 수도 있다. PAM 서열에 결합할 수 있는 예시적인 SpCas9 단백질의 서열은 다음과 같다:

일부 구현예에서, 조작된 SpCas9 변이체는 3' H(비-G PAM)가 측면에 있는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식할 수 있다(표 2A-2D 참조). 일부 구현예에서 SpCas9 변이체는 NRNH PAM(여기서 R은 A 또는 G이고 H는 A, C 또는 T임)을 인식한다. 일부 구현예에서, 비-G PAM은 NRRH, NRTH 또는 NRCH이다(예를 들어, Miller, S.M., 등Continuous Evolution of SpCas9 Variants Compatible with non-G PAMs, Nat. Biotechnol. (2020)를 참조하며, 이는 전체 내용이 여기에 참조로 포함된다.)

일부 구현예에서 Cas9 도메인은 재조합 Cas9 도메인이다. 일부 구현예에서, 재조합 Cas9 도메인은 SpyMacCas9 도메인이다. 일부 구현예에서, SpyMacCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SpyMacCas9, 뉴클레아제 불활성 SpyMacCas9(SpyMacCas9d), 또는 SpyMacCas9 니카아제(SpyMacCas9n)이다. 일부 구현예에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인 또는 SaCas9n 도메인은 비표준 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, SpyMacCas9 도메인, SpCas9d 도메인, 또는 SpCas9n 도메인은 NAA PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다.

천연 5'-NAAN-3' PAM 특이성을 갖는 스트렙토코커스 마카카에에서 Spy Cas9의 예시적인 Cas9 A 상동체의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Chatterjee, 등, “A Cas9 with PAM recognition for adenine dinucleotides”, Nature Communications, vol. 11, article no. 2474 (2020)에 기술되어 있고, 서열목록에 서열번호: 325로 존재한다.

일부 구현예에서, 변이체 Cas9 단백질은 H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A 및 D1218A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA 또는 RNA를 절단하는 능력이 감소된다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소하지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 유지한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서 변이체 Cas9 단백질은 D10A, H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A 및 D1218A 돌연변이를 보유하여 폴리펩티드가 표적 DNA를 절단하는 능력이 감소되도록 한다. 이러한 Cas9 단백질은 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)를 절단하는 능력이 감소하지만 표적 DNA(예를 들어, 단일 가닥 표적 DNA)에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 구현예에서, 변이 Cas9 단백질이 W476A 및 W1126A 돌연변이를 보유하는 경우 또는 변이 Cas9 단백질이 P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A 및 D1218A 돌연변이를 보유하는 경우, 변이 Cas9 단백질은 PAM 서열에 효율적으로 결합하지 않는다. 따라서 일부 경우에 이러한 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용되는 경우 해당 방법에는 PAM 서열이 필요하지 않다. 즉, 일부 구현예에서 이러한 변이체 Cas9 단백질이 결합 방법에 사용되는 경우, 방법은 가이드 RNA를 포함할 수 있지만, 이 방법은 PAM 서열 없이 수행될 수 있다(그리고 결합의 특이성은 따라서 가이드 RNA의 표적화 분절에 의해 제공된다). 위의 효과를 달성하기 위해 다른 잔기가 돌연변이될 수 있다(즉, 하나 또는 다른 뉴클레아제 부분을 불활성화함). 비제한적인 예로서, 잔기 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 및/또는 A987은 변경(즉, 치환)될 수 있다. 또한 알라닌 치환 이외의 돌연변이도 적합하다.

일부 구현예에서, 염기 편집기의 CRISPR 단백질 유래 도메인은 표준 PAM 서열(NGG)을 갖는 Cas9 단백질의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 염기 편집기의 Cas9 유래 도메인은 비표준 PAM 서열을 사용할 수 있다. 이러한 서열은 당업계에 기술되어 있으며 당업자에게는 명백할 것이다. 예를 들어, 비-표준 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 Kleinstiver, B. P., 등, “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities”Nature 523, 481-485 (2015); and Kleinstiver, B. P., 등, “Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition”Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015); R.T. Walton 등. “Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants”Science 10.1126/science.aba8853 (2020); Hu 등, “Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity,”Nature, 2018 Apr. 5, 556(7699), 57-63; Miller 등, "Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs”Nat. Biotechnol., 2020 Apr;38(4):471-481에 기술되어 있고; 각각의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.

NapDNAbp 및 사이티딘 데아미나아제 및/또는 아데노신 데아미나아제를 포함하는 융합 단백질

본 개시내용의 일부 양태는 Cas9 도메인 또는 다른 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(예를 들어, Cas12) 및 하나 이상의 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. Cas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 Cas9 도메인 또는 Cas9 단백질(예를 들어, dCas9 또는 nCas9)임을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 Cas9 도메인 또는 Cas9 단백질(예를 들어, dCas9 또는 nCas9)은 본원에 제공된 임의의 사이티딘 데아미나아제 및/또는 아데노신 데아미나아제와 융합될 수 있다. 본원에 개시된 염기 편집기의 도메인들은 임의의 순서로 배열될 수 있다.

일부 구현예에서, 융합 단백질은 다음 도메인 A-C, A-D 또는 A-E를 포함하며,

NH₂-[A-B-C]-COOH;

NH₂-[A-B-C-D]-COOH; 또는

NH₂-[A-B-C-D-E]-COOH;

여기서 A 및 C 또는 A, C 및 E는 각각

아데노신 데아미나아제 도메인 또는 이의 활성 단편,

사이티딘 데아미나아제 도메인 또는 이의 활성 단편 중 하나 이상을 포함하고,

여기서 B 또는 B 및 D는 각각 핵산 서열 특이적 결합 활성을 갖는 하나 이상의 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 융합 단백질은 다음 구조를 포함하며,

NH₂-[A_n-B_o-C_n]-COOH;

NH₂-[A_n-B_o-C_n-D_o]-COOH; 또는

NH₂-[A_n-B_o-C_p-D_o-E_q]-COOH;

여기서 A 및 C 또는 A, C 및 E는 각각

아데노신 데아미나아제 도메인 또는 이의 활성 단편,

여기서 n은 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이고, 여기서 p는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이며; 여기서 q는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이고; 여기서 B 또는 B 및 D는 각각 핵산 서열 특이적 결합 활성을 갖는 도메인을 포함하며; 여기서 o는 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이다.

예를 들어, 비제한적으로, 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하기 구조를 포함한다:

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[Cas9 도메인]-COOH;

NH₂-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas9 도메인]-COOH;

NH₂-[Cas9 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[Cas9 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas9 도메인]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[아데노신 데아미나아제]-[Cas9 도메인]-COOH;

NH₂-[Cas9 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH; 또는

NH₂-[Cas9 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-[아데노신 데아미나아제]-COOH.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 Cas12 도메인 또는 Cas12 단백질은 본원에 제공된 임의의 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제와 융합될 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하기 구조를 포함한다:

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[Cas12 도메인]-COOH;

NH₂-[Cas12 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas12 도메인]-COOH;

NH₂-[Cas12 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas12 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[Cas12 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas12 도메인]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[아데노신 데아미나아제]-[Cas12 도메인]-COOH;

NH₂-[Cas12 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH; 또는

NH₂-[Cas12 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-[아데노신 데아미나아제]-COOH.

일부 구현예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA*8이다. 예시적인 융합 단백질 구조는 다음을 포함한다:

NH₂-[TadA*8]-[Cas9 도메인]-COOH;

NH₂-[Cas9 도메인]-[TadA*8]-COOH;

NH₂-[TadA*8]-[Cas12 도메인]-COOH; 또는

NH₂-[Cas12 도메인]-[TadA*8]-COOH.

일부 구현예에서, 융합 단백질의 아데노신 데아미나아제는 TadA*8 및 사이티딘 데아미나아제 및/또는 아데노신 데아미나아제를 포함한다. 일부 구현예에서, TadA*8은 TadA*8.1, TadA*8.2, TadA*8.3, TadA*8.4, TadA*8.5, TadA*8.6, TadA*8.7, TadA*8.8, TadA*8.9, TadA*8.10, TadA*8.11, TadA*8.12, TadA*8.13, TadA*8.14, TadA*8.15, TadA*8.16, TadA*8.17, TadA*8.18, TadA*8.19, TadA*8.20, TadA*8.21, TadA*8.22, TadA*8.23, 또는 TadA*8.24이다.

예시적인 융합 단백질 구조는 다음을 포함한다:

NH₂-[TadA*8]-[Cas9/Cas12]-[아데노신 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[Cas9/Cas12]-[TadA*8]-COOH;

NH₂-[TadA*8]-[Cas9/Cas12]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH; 또는

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas9/Cas12]-[TadA*8]-COOH.

일부 구현예에서, 융합 단백질의 아데노신 데아미나아제는 TadA*9 및 사이티딘 데아미나아제 및/또는 아데노신 데아미나아제를 포함한다. 예시적인 융합 단백질 구조는 다음을 포함한다:

NH₂-[TadA*9]-[Cas9/Cas12]-[아데노신 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[Cas9/Cas12]-[TadA*9]-COOH;

NH₂-[TadA*9]-[Cas9/Cas12]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH; 또는

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[Cas9/Cas12]-[TadA*9]-COOH.

일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 또는 Cas12 폴리펩티드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 또는 Cas12 폴리펩티드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 사이티딘 데아미나아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Cas9 또는 Cas 12 폴리펩티드의 N-말단 단편 및 C-말단 단편에 의해 플랭킹된 아데노신 데아미나아제를 포함한다.

일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 napDNAbp(예를 들어, Cas9 또는 Cas12 도메인)를 포함하는 융합 단백질은 링커 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제와 napDNAbp 사이에 링커가 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 일반적 구조에서 사용된 "-"는 선택적인 링커의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제 및 napDNAbp는 본원에 제공된 임의의 링커를 통해 융합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제 및 napDNAbp는 본원에 제공된 임의의 링커를 통해 융합된다.

본 개시내용의 융합 단백질은 하나 이상의 추가적인 특징을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 융합 단백질은 억제제, 세포질 국재화 서열, 이출 서열(export sequence), 예컨대 핵 이출 서열, 또는 다른 국재화 서열, 뿐만 아니라 융합 단백질의 가용화, 정제, 또는 검출에 유용한 서열 태그를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 적합한 단백질 태그는 비오틴 카르복실라제 담체 단백질(BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌(HA)-태그, 히스티딘 태그 또는 His-태그로도 지칭되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질(MBP)-태그, nus-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-태그, 녹색 형광 단백질(GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프트태그(Softag) (예를 들어, Softag 1, Softag 3), 스트렙(strep)-태그, 비오틴 리가제 태그, 플래쉬(FlAsH) 태그, V5 태그 및 SBP-태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 His 태그를 포함한다.

예시적이지만 비제한적인 융합 단백질은 국제 PCT 출원번호 PCT/2017/044935, PCT/US2019/044935 및 PCT/US2020/016288에 기재되어 있고, 각각은 그 전문이 여기에 참조로 포함된다.

핵 국재화 서열(NLS)을 포함하는 융합 단백질

일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5 개)의 핵 표적화 서열, 예를 들어 핵 국재화 서열(NLS)을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 이분 NLS가 사용된다. 일부 구현예에서, NLS는 NLS를 포함하는 단백질의 세포 핵 내로의 유입(예를 들어, 핵 수송체에 의함)을 용이하게 하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, NLS은 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단과 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 nCas9 도메인 또는 dCas9 도메인의 N-말단 또는 C-말단과 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 Cas12 도메인의 N-말단 또는 C-말단과 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제의 N-말단 또는 C-말단과 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 하나 이상의 링커를 통해 융합 단백질에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 링커 없이 융합 단백질에 융합된다. 일부 구현예에서, NLS는 본원에 제공되거나 참조된 NLS 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 추가적인 핵 국재화 서열은 당업계에 알려져 있고 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, NLS 서열은 Plank 등, PCT/EP2000/011690에 기재되어 있으며, 이의 내용은 예시적인 핵 국재화 서열의 개시내용에 대해 여기에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, NLS는 아미노산 서열 PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV(서열번호: 416), KRTADGSEFESPKKKRKV(서열번호: 243), KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호: 244), KKTELQTTNAENKTKKL(서열번호: 245), KRGINDRNFWRGENGRKTR(서열번호: 246), RKSGKIAAIVVKRPRKPKKKRKV(서열번호: 417) 또는 MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(서열번호: 249)를 포함한다.

일부 구현예에서, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제, Cas9 도메인, 및 NLS를 포함하는 융합 단백질은 링커 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 도메인 또는 단백질(예를 들어, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제, Cas9 도메인 또는 NLS) 사이에 링커 서열이 존재한다. 일부 구현예에서, 링커는 사이티딘 데아미나아제 및 아데노신 데아미나아제 도메인과 napDNAbp 사이에 존재한다. 일부 구현예에서, 하기 일반 구조에서 사용되는 "-"는 선택적인 링커의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 사이티딘 데아미나아제 및 아데노신 데아미나아제 및 napDNAbp는 본원에 제공된 임의의 링커를 통해 융합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 사이티딘 데아미나아제 및 아데노신 데아미나아제 및 napDNAbp는 본원에 제공된 임의의 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제 및 napDNAbp(예를 들어, Cas9 또는 Cas12) 도메인을 갖는 예시적인 napDNAbp(예를 들어, Cas9 또는 Cas12) 융합 단백질의 일반적인 구조는 다음 구조 중 어느 하나를 포함하며, 여기서 NLS는 핵 국재화 서열(예를 들어, 본원에 제공된 임의의 NLS)이고, NH₂는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다:

NH₂-NLS-[사이티딘 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-COOH;

NH₂-NLS [napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-NLS-COOH;

NH₂-[napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-NLS-COOH;

NH₂-NLS-[아데노신 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-COOH;

NH₂-NLS [napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-NLS-COOH;

NH₂-[napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-NLS-COOH;

NH₂-NLS-[사이티딘 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-COOH;

NH₂-NLS-[아데노신 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH;

NH₂-NLS-[아데노신 데아미나아제] [사이티딘 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-COOH;

NH₂-NLS-[사이티딘 데아미나아제]-[아데노신 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-COOH;

NH₂-NLS-[napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-[사이티딘 데아미나아제]-COOH;

NH₂-NLS-[napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-[아데노신 데아미나아제]-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-NLS-COOH;

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-NLS-COOH;

NH₂-[아데노신 데아미나아제] [사이티딘 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-NLS-COOH;

NH₂-[사이티딘 데아미나아제]-[아데노신 데아미나아제]-[napDNAbp 도메인]-NLS-COOH;

NH₂-[napDNAbp 도메인]-[아데노신 데아미나아제]-[사이티딘 데아미나아제]-NLS-COOH; 또는

NH₂-[napDNAbp 도메인]-[사이티딘 데아미나아제]-[아데노신 데아미나아제]-NLS-COOH.

일부 구현예에서, NLS는 링커 내에 존재하거나, 또는 NLS는 예를 들어 본원에 기재된 링커에 의해 플랭킹된다. 이분 NLS는 2개의 염기성 아미노산 클러스터를 포함하며, 이는 비교적 짧은 스페이서 서열에 의해 분리된다(따라서 이분(bipartite) - 2부(2 parts), 반면, 일분 NLS(monopartite NLSs)는 그렇지 않다). 뉴클레오플라스민의 NLS, KR[PAATKKAGQA]KKKK(서열번호: 244)는 약 10개 아미노산의 스페이서에 의해 분리된 2개의 염기성 아미노산 클러스터의 편재하는 이분 신호의 원형이다. 예시적인 이분 NLS의 서열은 다음과 같다: PKKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV(서열번호: 416).

하나 이상의 핵 국재화 서열(NLS)을 포함하는 CRISPR 효소를 암호화하는 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 NLS가 사용될 수 있거나 사용될 수 있다. CRISPR 효소는 아미노-말단에 또는 그 근처에 NLS, 카르복시-말단에 또는 그 근처에 약 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 초과의 NLS, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어, 아미노-말단에 하나 이상의 NLS 및 카르복시 말단에 하나 이상의 NLS)을 포함할 수 있다. 하나 초과의 NLS가 존재하는 경우, 각각은 다른 것들과 독립적으로 선택될 수 있어서, 단일 NLS가 하나 이상의 카피 내에 및/또는 하나 이상의 카피 내에 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합되어 존재할 수 있다.

본 방법에 사용되는 CRISPR 효소는 약 6개의 NLS를 포함할 수 있다. NLS에 가장 가까운 아미노산이 N- 또는 C-말단으로부터 폴리펩티드 사슬을 따라 약 50개 아미노산 내에, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50개 아미노산 내에 있을 때, NLS는 N- 또는 C-말단 근처에 있는 것으로 간주된다.

추가 도메인

본 명세서에 기술된 염기 편집기는 폴리뉴클레오티드의 핵염기의 핵염기 편집, 변형 또는 변경을 촉진하는 데 도움이 되는 임의의 도메인을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 이들 추가 도메인 중 임의의 것을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 본원에 기재된 방법에 따라 불활성화되는 인트론을 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인(예: Cas9), 핵염기 편집 도메인(예: 데아미나아제 도메인) 및 하나 이상의 추가 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 도메인은 염기 편집기의 효소적 또는 촉매적 기능, 염기 편집기의 결합 기능을 촉진할 수 있거나, 원하는 염기 편집 결과를 방해할 수 있는 세포 기구(예: 효소)의 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 뉴클레아제, 니카아제, 재조합효소, 데아미나아제, 메틸트랜스퍼라제, 메틸라제, 아세틸라제, 아세틸트랜스퍼라제, 전사 활성화제, 또는 전사 억제인자 도메인을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 염기 편집기는 우라실 글리코실라제 억제제(UGI) 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, U:G 이종이중체 DNA의 존재에 대한 세포 DNA 복구 반응은 세포에서 핵염기 편집 효율의 감소를 담당할 수 있다. 이러한 구현예에서, 우라실 DNA 글리코실라제(UDG)는 세포 내 DNA로부터 U의 제거를 촉매할 수 있으며, 이는 염기 절단 복구(BER)를 개시할 수 있고, 대부분 U:G 쌍이 C:G 쌍으로 전환되는 결과를 가져온다. 이러한 구현예에서, BER은 단일 가닥에 결합하고, 편집된 염기를 차단하며, UGI를 억제하고, BER을 억제하며, 편집된 염기를 보호하고/하거나 편집되지 않은 가닥의 복구를 촉진하는 하나 이상의 도메인을 포함하는 염기 편집기에서 억제될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 UGI 도메인을 포함하는 염기 편집기 융합 단백질을 고려한다.

일부 구현예에서, 염기 편집기는 이중 가닥 절단(DSB) 결합 단백질의 전부 또는 일부를 도메인으로 포함한다. 예를 들어, DSB 결합 단백질은 DSB의 말단에 결합하여 분해로부터 보호할 수 있는 박테리오파지 Mu의 Gam 단백질을 포함할 수 있다. Komor, A.C., 등, “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3: eaao4774 (2017)를 참고하며, 그 내용은 여기에 참조로 포함된다.

추가적으로, 일부 구현예에서, Gam 단백질은 염기 편집기의 N 말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, Gam 단백질은 염기 편집기의 C 말단에 융합될 수 있다. 박테리오파지 Mu의 Gam 단백질은 이중 가닥 절단(DSB)의 끝 부분에 결합하여 분해로부터 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, Gam을 사용하여 DSB의 자유 말단에 결합하면 염기 편집 과정 동안 삽입결실 형성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 174-잔기 Gam 단백질은 염기 편집기의 N 말단에 융합된다. Komor, A.C., 등, “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity”Science Advances 3:eaao4774 (2017)를 참조한다. 일부 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 야생형 도메인에 대해 염기 편집기 도메인의 길이를 변경할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산을 삭제하면 염기 편집기의 길이가 줄어들 수 있다. 다른 경우에는 돌연변이가 야생형 도메인에 비해 도메인의 길이를 변경하지 않는다. 예를 들어, 어떤 도메인의 대체도 염기 편집기의 길이를 변경하지 않는다.

모든 도메인의 길이가 야생형 도메인과 동일한 염기 편집기의 비제한적인 예는 다음과 같다.

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[APOBEC1]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[APOBEC1]-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[APOBEC1]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[APOBEC1]-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[APOBEC1]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-[UGI]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[APOBEC1]-[핵염기 편집 도메인]-[UGI]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[APOBEC1]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-[UGI]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[APOBEC1]-[핵염기 편집 도메인]-[UGI]-COOH;

NH₂-[UGI]-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[APOBEC1]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[UGI]-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[APOBEC1]-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[UGI]-[핵염기 편집 도메인]-[APOBEC1]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-COOH; 또는

NH₂-[UGI]-[핵염기 편집 도메인]-[APOBEC1]-[핵염기 편집 도메인]-COOH.

염기 편집기 시스템

자기-불활성화 염기 편집기를 특징으로 하는 염기 편집기 시스템을 사용하여 핵염기를 편집하기 위한 시스템, 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 (1) 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및 핵염기를 편집하기 위한 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 데아미나아제 도메인)을 포함하는 염기 편집기(BE); 및 (2) 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인과 함께 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 사이티딘 염기 편집기(CBE), 또는 아데노신 염기 편집기(ABE)이다. 인트론은 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인, 핵염기 편집 도메인, 또는 이들 도메인 중 하나의 단편을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 또는 RNA 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 데아미나아제 도메인은 사이티딘 데아미나아제 또는 사이토신 데아미나아제일 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나아제 도메인은 아데닌 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제일 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 염기 편집기는 DNA 내의 아데인을 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 DNA 내의 사이티딘을 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 염기 편집 시스템은, 촉매적으로 결함이 있는 스트렙토코커스 파이오게네스 Cas9, 데아미나아제(예를 들어, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제), 및 염기 절제 복구 억제제를 함유하는 융합 단백질을 사용하여 이중 가닥 DNA 절단을 발생시키지 않고, 공여체 DNA 주형을 필요로 하지 않으며, 과량의 확률적 삽입 및 결실을 유도하지 않으면서 DNA에서 프로그래밍 가능한 단일 뉴클레오티드(C→또는 A→변화를 유도하는 게놈 편집에 대한 새로운 접근법을 제공한다.

핵염기 편집 단백질의 상세한 내용은 국제 PCT 출원번호 PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344(WO2017/070632)에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한 Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of A ㆍT to G ㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)을 참조하여, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 제공된 자기-불활성화 염기 편집기 시스템의 사용은 (a) 대상체의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 이중- 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA)의 표적 뉴클레오티드 서열을 핵염기 편집기(예를 들어, 아데노신 염기 편집기 또는 사이티딘 염기 편집기) 및 가이드 폴리핵산(예를 들어, gRNA)을 포함하는 염기 편집기 시스템과 접촉시키는 단계로서, 여기서 표적 뉴클레오티드 서열은 표적화된 핵염기 쌍을 포함하는, 단계; (b) 상기 표적 영역의 가닥 분리를 유도하는 단계; (c) 표적 영역의 단일 가닥 내의 상기 표적 핵염기 쌍의 제1 핵염기를 제2 핵염기로 전환시키는 단계; (d) 상기 표적 영역의 하나 이상의 가닥을 절단하는 단계로서, 여기서 제1 핵염기 염기에 상보적인 제3 핵염기는 제2 핵염기에 상보적인 제4 핵염기에 의해 대체되는, 단계; (e) 핵염기 편집기의 도메인을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 존재하는 표적 인트론 서열을 인트론의 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 표적으로 하는 가이드 RNA와 접촉시키고, 단계 b-d에 기술된 바와 같이 편집을 도입함으로써 염기 편집기를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 원하는 편집 수준에 도달하면 언제든지 불활성화가 유도될 수 있다. 일부 구현예들에서, 단계 (b) 또는 (e)는 생략된다는 것이 이해되어야 한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 표적화된 핵염기쌍은 하나 이상의 유전자에서의 복수의 핵염기쌍이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 유전자에서 복수의 핵염기 쌍의 멀티플렉스 편집이 가능하다. 일부 구현예에 있어서, 복수의 핵염기 쌍은 동일한 유전자에 위치한다. 일부 구현예에 있어서, 복수의 핵염기 쌍은 하나 이상의 유전자에 위치하고, 적어도 하나의 유전자는 상이한 유전자좌에 위치한다.

일부 구현예에서, 절단된 단일 가닥(닉 가닥)은 가이드 핵산에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 절단된 단일 가닥은 제1 핵염기를 포함하는 가닥의 반대편에 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 Cas9 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 염기는 아데닌이고, 제2 염기는 G, C, A, 또는 T가 아니다. 일부 구현예에서, 제2 염기는 이노신이다.

일부 구현예에서, 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 데아미나아제를 표적 핵산 서열에 표적화하기 위해 활용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 쌍의 가이드 폴리뉴클레오티드는 표적 핵산 서열에 상이한 데아미나아제를 표적화하기 위해 활용될 수 있다. 염기 편집기 시스템의 구성요소(예를 들어, 데아미나아제 도메인, 가이드 RNA, 및/또는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인)는 서로 공유적으로 또는 비공유적으로 연관될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 데아미나아제 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인에 의해 표적 뉴클레오티드 서열로 표적화될 수 있으며, 임의로 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 가이드 RNA)와 복합체를 형성할(complexed) 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 데아미나아제 도메인에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 데아미나아제 도메인과 비공유적으로 상호작용하거나 이와 연관됨으로써 데아미나아제 도메인을 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵염기 편집 구성요소 (예를 들어, 데아미나아제 구성요소)는 상응하는 이종성 부분, 항원 또는 도메인과 상호작용하거나, 이와 연관되거나, 복합체를 형성할 수 있는 추가적인 이종성 부분 또는 도메인을 포함하며, 이는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및/또는 이와 복합체를 이루는 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)의 일부이다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및/또는 이와 복합체화된 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)는 복합체와 상호작용할 수 있거나, 연관될 수 있거나, 복합체를 형성할 수 있는 추가적인 이종성 부분 또는 도메인을 포함하며, 이는 핵염기 편집 도메인의 일부인 상응하는 이종성 부분, 항원 또는 도메인(예를 들어, 데아미나아제 성분)과 함께 사용된다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩티드에 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 이와 연관되거나, 또는 폴리펩티드와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드에 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 이와 연관되거나, 또는 이와 복합체를 형성할 수 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리펩티드 링커에 결합할 수 있다.

일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드 링커에 결합할 수 있다. 추가적인 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 람다 박테리오파지 항종결자 단백질 N(N22p)의 22개 아미노산 RNA 결합 도메인, 2G12 IgG 동종이량체 도메인, ABI, 항체(예를 들어 결합하는 항체)와 같은 폴리펩티드를 포함한다. 염기 편집기 시스템의 구성요소 또는 이종성 부분) 또는 이의 단편(예: IgM(MHD2) 또는 IgE(EHD2)의 중쇄 도메인 2(CH2), 면역글로불린 Fc 영역, IgM(MHD2)의 중쇄 도메인 3(CH3)) IgG 또는 IgA, IgM 또는 IgE의 중쇄 도메인 4(CH4), Fab, Fab2, 소형항체 및/또는 ZIP 항체), 바르나제-바스타 이량체 도메인, Bcl-xL 도메인, 칼시뉴린 A(CAN) 도메인, 심장 포스포람반 막관통 펜타머 도메인, 콜라겐 도메인, Com RNA 결합 단백질 도메인(예를 들어 SfMu Com 코트 단백질 도메인 및 SfMu Com 결합 단백질 도메인), 시클로필린-Fas 융합 단백질(CyP-Fas) 도메인, Fab 도메인, Fe 도메인, 피브리틴 폴돈 도메인, FK506 결합 단백질(FKBP) 도메인, mTOR의 FKBP 결합 도메인(FRB) 도메인, 폴돈 도메인, 단편 X 도메인, GAI 도메인, GID1 도메인, 글리코포린 A 막횡단 도메인, GyrB 도메인, Halo 태그, HIV Gp41 삼량체화 도메인, HPV45 종양단백질 E7 C-말단 이량체 도메인, 소수성 폴리펩티드, K 상동성(KH) 도메인, Ku 단백질 도메인(예: Ku 이종이량체), 류신 지퍼, LOV 도메인, 미토콘드리아 항바이러스 신호 전달 단백질 CARD 필라멘트 도메인, MS2 코트 단백질 도메인(MCP), 해당 RNA 모티프/압타머에 결합하는 비천연 RNA 앱타머 리간드, 부갑상선 호르몬 이량체화 도메인, PP7 코트 단백질(PCP) 도메인, PSD95-Dlgl-zo-1(PDZ) 도메인, PYL 도메인, SNAP 태그, SpyCatcher 모이어티, SpyTag 모이어티, 스트렙타비딘 도메인, 스트렙타비딘 결합 단백질 도메인, 스트렙타비딘 결합 단백질(SBP) 도메인, 텔로머라제 Sm7 단백질 도메인(예를 들어, Sm7 호모헵타머 또는 단량체성 Sm 유사 단백질) 및/또는 이의 단편을 포함한다. 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 모티프), 예컨대 MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프(예를 들어, MS2, MS2 C-5 돌연변이체, 또는 MS2 F-5 돌연변이체), 비-천연 RNA 모티프, PP7 작동자 스템-루프, SfMu 페이트 Com 스템-루프, 스테릴 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프, 및/또는 이의 단편을 포함한다. 추가적인 이종성 부분의 비제한적 예에는 서열번호: 492, 494, 496, 498-500 중 하나 이상과 적어도 약 85% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편이 포함된다. 추가적인 이종성 부분의 비제한적 예에는 서열번호: 491, 493, 495, 497 중 하나 이상 또는 이의 단편과 적어도 약 85% 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

염기 편집기 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 염기 편집기 시스템의 구성요소는 공유 결합, 비공유 상호작용, 또는 이의 연관 및 상호작용의 임의의 조합을 통해 서로 연관될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 데아미나아제 도메인은 가이드 폴리뉴클레오티드에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템의 핵염기 편집 구성요소, (예를 들어, 데아미나아제 구성요소)는 가이드 폴리뉴클레오티드의 이종성 부분 또는 분절(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 모티프) 또는 항원과 상호작용하거나, 연관되거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있는 추가적인 이종성 부분 또는 도메인(예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오티드 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분 또는 도메인(예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오티드 결합 도메인)은 데아미나아제 도메인에 연결되거나 또는 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리펩티드에 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 연관되거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드에 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 연관되거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리펩티드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드 링커에 결합할 수 있다. 추가적인 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리펩타이드, 예컨대 람다 박테리오파지 항종결자 단백질 N(N22p)의 22개 아미노산 RNA 결합 도메인, 2G12 IgG 동종이량체 도메인, ABI, 항체(예를 들어, 염기 편집기 시스템의 구성요소 또는 이종성 부분) 또는 이의 단편(예를 들어, IgM(MHD2) 또는 IgE(EHD2)의 중쇄 도메인 2(CH2), 면역글로불린 Fc 영역, 중쇄 도메인 3(CH3) IgG 또는 IgA, IgM 또는 IgE의 중쇄 도메인 4(CH4), Fab, Fab2, 소형항체 및/또는 ZIP 항체), 바르나제-바스타 이량체 도메인, Bcl-xL 도메인, 칼시뉴린 A( CAN) 도메인, 심장 포스포람반 막횡단 펜타머 도메인, 콜라겐 도메인, Com RNA 결합 단백질 도메인(예를 들어 SfMu Com 코트 단백질 도메인 및 SfMu Com 결합 단백질 도메인), 시클로필린-Fas 융합 단백질(CyP-Fas) 도메인, Fab 도메인, Fe 도메인, 피브리틴 폴돈 도메인, FK506 결합 단백질(FKBP) 도메인, mTOR의 FKBP 결합 도메인(FRB) 도메인, 폴돈 도메인, 단편 X 도메인, GAI 도메인, GID1 도메인, 글리코포린 A 막횡단 도메인, GyrB 도메인, Halo 태그, HIV Gp41 삼량체화 도메인, HPV45 종양단백질 E7 C-말단 이량체 도메인, 소수성 폴리펩티드, K 상동성(KH) 도메인, MS2 코트 단백질, Ku 단백질 도메인(예를 들어, Ku 이종이량체), 류신 지퍼, LOV 도메인, 미토콘드리아 항바이러스 신호 단백질 CARD 필라멘트 도메인, MS2 코트 단백질 도메인(MCP), 해당 RNA 모티프/압타머에 결합하는 비천연 RNA 앱타머 리간드, 부갑상선 호르몬 이량체화 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 멸균(PCP) 도메인, PSD95-Dlgl-zo-1(PDZ) 도메인, PYL 도메인, SNAP 태그, SpyCatcher 모이어티, SpyTag 모이어티, 스트렙타비딘 도메인, 스트렙타비딘 결합 단백질 도메인, 스트렙타비딘 결합 단백질(SBP) 도메인, 텔로머라제 Sm7 단백질 도메인(예를 들어, Sm7 호모헵타머 또는 단량체성 Sm 유사 단백질) 및/또는 이의 단편을 포함한다. 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 모티프), 예컨대 MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프(예를 들어, MS2, MS2 C-5 돌연변이체, 또는 MS2 F-5 돌연변이체), 비-천연 RNA 모티프, PP7 작동자 스템 루프, SfMu 페이트 Com 스템 루프, 스테릴 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인식 모티프 및/또는 그 단편을 포함한다. 추가적인 이종성 부분의 비제한적 예에는 서열번호: 492, 494, 496, 498-500 중 하나 이상과 적어도 약 85% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편이 포함된다. 추가적인 이종성 부분의 비제한적 예에는 서열번호: 491, 493, 495, 497 중 하나 이상 또는 이의 단편과 적어도 약 85% 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 염기 절제 복구(BER) 구성요소의 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 염기 편집기 시스템의 구성요소는 공유 결합, 비공유 상호작용, 또는 이의 연관 및 상호작용의 임의의 조합을 통해 서로 연관될 수 있음이 이해되어야 한다. BER 구성요소의 억제제는 염기 절제 복구 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 우라실 DNA 글리코실라제 억제제(UGI)일 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 이노신 염기 절제 복구 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화될 수 있으며, 선택적으로 여기서 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 가이드 RNA)와 복합체화된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 염기 절제 복구의 억제제에 연결되거나 또는 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 데아미나아제 도메인 및 염기 절제 복구의 억제제에 연결되거나 또는 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 염기 절제 복구의 억제제와 비-공유적으로 상호작용하거나 또는 연관됨으로써 염기 절제 복구의 억제제를 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제 구성요소는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인의 일부인 상응하는 추가적인 이종성 부분, 항원 또는 도메인과 상호작용하거나, 연관되거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있는 추가적인 이종성 부분 또는 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 뉴클레오티드 결합 도메인 구성요소, 및/또는 이와 복합화된 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)는 염기 절제 복구 성분의 억제제의 일부인 상응하는 이종성 부분, 항원 또는 도메인과 상호작용할 수 있거나, 연관될 수 있거나, 이와의 복합체를 형성할 수 있는 추가적인 이종성 부분 또는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 가이드 폴리뉴클레오티드에 의해 표적 뉴클레오티드 서열에 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 절제 복구의 억제제는 가이드 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 분절(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 모티프)과 상호작용하거나, 연관되거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있는 추가적인 이종성 부분 또는 도메인(예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오티드 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 폴리뉴클레오티드의 추가적인 이종성 부분 또는 도메인(예를 들어, RNA 또는 DNA 결합 단백질과 같은 폴리뉴클레오티드 결합 도메인)은 염기 절제 복구의 억제제에 연결되거나 또는 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드에 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 연관되거나, 또는 이와의 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 가이드 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리펩티드 링커에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드 링커에 결합할 수 있다. 추가적인 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 추가적인 이종성 부분은 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 폴리펩타이드, 예컨대 람다 박테리오파지 항종결자 단백질 N(N22p)의 22개 아미노산 RNA 결합 도메인, 2G12 IgG 동종이량체 도메인, ABI, 항체(예를 들어, 염기 편집기 시스템의 구성요소 또는 이종성 부분) 또는 이의 단편(예를 들어, IgM(MHD2) 또는 IgE(EHD2)의 중쇄 도메인 2(CH2), 면역글로불린 Fc 영역, 중쇄 도메인 3(CH3) IgG 또는 IgA, IgM 또는 IgE의 중쇄 도메인 4(CH4), Fab, Fab2, 소형항체 및/또는 ZIP 항체), 바르나제-바스타 이량체 도메인, Bcl-xL 도메인, 칼시뉴린 A(CAN) 도메인, 심장 포스포람반 막횡단 펜타머 도메인, 콜라겐 도메인, Com RNA 결합 단백질 도메인(예를 들어, SfMu Com 코트 단백질 도메인 및 SfMu Com 결합 단백질 도메인), 시클로필린-Fas 융합 단백질(CyP-Fas) 도메인, Fab 도메인, Fe 도메인, 피브리틴 폴돈 도메인, FK506 결합 단백질(FKBP) 도메인, mTOR의 FKBP 결합 도메인(FRB) 도메인, 폴돈 도메인, 단편 X 도메인, GAI 도메인, GID1 도메인, 글리코포린 A 막횡단 도메인, GyrB 도메인, Halo 태그, HIV Gp41 삼량체화 도메인, HPV45 종양단백질 E7 C-말단 이량체 도메인, 소수성 폴리펩티드, K 상동성(KH) 도메인, MS2 코트 단백질, Ku 단백질 도메인(예를 들어, Ku 이종이량체), 류신 지퍼, LOV 도메인, 미토콘드리아 항바이러스 신호 단백질 CARD 필라멘트 도메인, MS2 코트 단백질 도메인(MCP), 해당 RNA 모티프/압타머에 결합하는 비천연 RNA 앱타머 리간드, 부갑상선 호르몬 이량체화 도메인, PP7 코트 단백질 도메인, SfMu Com 코트 단백질 도메인, 멸균(PCP) 도메인, PSD95-Dlgl-zo-1(PDZ) 도메인, PYL 도메인, SNAP 태그, SpyCatcher 모이어티, SpyTag 모이어티, 스트렙타비딘 도메인, 스트렙타비딘 결합 단백질 도메인, 스트렙타비딘 결합 단백질(SBP) 도메인, 텔로머라제 Sm7 단백질 도메인(예를 들어, Sm7 호모헵타머 또는 단량체성 Sm 유사 단백질) 및/또는 이의 단편을 포함한다. 구현예에서, 추가의 이종성 부분은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 모티프), 예컨대 MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프(예를 들어, MS2, MS2 C-5 돌연변이체, 또는 MS2 F-5 돌연변이체), 비-천연 RNA 모티프, PP7 작동자 스템 루프, SfMu 페이트 Com 스템 루프, 스테릴 알파 모티프, 텔로머라제 Ku 결합 모티프 및 Ku 단백질, 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7 단백질, 또는 RNA 인식 모티프 및/또는 그 단편을 포함한다. 추가적인 이종성 부분의 비제한적 예에는 서열번호: 492, 494, 496, 498-500 중 하나 이상과 적어도 약 85% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편이 포함된다. 추가적인 이종성 부분의 비제한적 예에는 서열번호: 491, 493, 495, 497 중 하나 이상 또는 이의 단편과 적어도 약 85% 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

어떤 경우에는, 염기 편집 시스템의 구성요소가 류신 지퍼 도메인(예를 들어, 서열번호 499 및 500)의 상호작용을 통해 서로 연관된다. 일부 경우에, 염기 편집 시스템의 구성요소는 약, 적어도 약, 또는 약 1, 2 이하 (즉, 이량체화), 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 폴리펩티드 도메인 유닛을 포함하는 단백질 복합체를 형성하는 것과 연관된 폴리펩티드 도메인 (예를 들어,FokI 도메인)을 통해 또 다른 것과 연관되며, 선택적으로 폴리펩티드 도메인은 이의 활성을 감소 또는 제거하는 변경을 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 염기 편집 시스템의 구성요소가 다량체 항체 또는 이의 단편(예를 들어, IgG, IgD, IgA, IgM, IgE, IgM(MHD2)의 중쇄 도메인 2(CH2)), IgE(EHD2), 면역글로불린 Fc 영역, IgG 또는 IgA의 중쇄 도메인 3(CH3), IgM 또는 IgE의 중쇄 도메인 4(CH4), Fab 및 Fab2)의 상호작용을 통해 서로 연관된다. 어떤 경우에, 항체는 이량체, 삼량체 또는 사량체이다. 구현예에서, 이량체 항체는 염기 편집 시스템의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 구성요소에 결합한다. 일부 경우에, 염기 편집 시스템의 구성요소는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 도메인(들)과 폴리뉴클레오티드(들)의 상호작용을 통해 서로 연관된다. 일부 경우에, 염기 편집 시스템의 구성요소는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드-결합 단백질 도메인과 자기 상보적 및/또는 서로 상보적인 폴리뉴클레오티드의 상호작용을 통해 서로 연관되어 폴리뉴클레오티드가 서로 상보적으로 결합되도록 하며, 각각의 결합된 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 도메인(들)을 결합시킨다. 일부 경우에, 염기 편집 시스템의 구성요소가 폴리펩티드 도메인과 소분자(예: 화학적 이량체화 유도제(CID), "이량체화제"라고도 알려져 있음)의 상호작용을 통해 서로 연관된다. CID의 비제한적 예는 Amara, 등, "A Versatile Synthetic Dimerizer for the Regulator of Protein-Protein Interaction," PNAS, 94:10618-10623 (1997); 및 Voß등 "Chemically ducated dimerization: reversible and spatiotemporal control of Protein function in cell", Current Opinion in Chemical Biology, 28:194-201(2015)에 설명되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 여기에 참조로 포함된다. 이량체화 할 수 있는 폴리펩티드 및 그에 상응하는 이량체화제의 비제한적 예가 아래 표 10.1에 제공된다.

표 10.1. 화학적으로 유도된 이량체 시스템

구현예에서, 추가적인 이종성 부분은 가이드 RNA 분자의 일부이다. 어떤 경우에는 추가적인 이종성 부분이 RNA 모티프를 포함하거나 RNA 모티프이다. RNA 모티프는 가이드 RNA 분자의 5' 또는 3' 말단 또는 가이드 RNA 분자의 다양한 위치에 위치할 수 있다. 구현예에서, RNA 모티프는 가이드 RNA 내에 위치하여 입체 장애를 감소시키며, 선택적으로 이러한 장애는 RNA 스캐폴드의 다른 부피가 큰 루프와 연관된다. 어떤 경우에는 RNA 모티프를 링커를 통해 가이드 RNA의 다른 부분에 연결하는 것이 유리하며, 여기서 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오티드 길이 이하일 수 있다. 선택적으로 링커는 GC가 풍부한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 가이드 RNA는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 RNA 모티프 카피를 함유할 수 있으며, 선택적으로 이들은 연속적으로 위치하고/하거나 선택적으로 링커(들)에 의해 각각 서로 분리되어 있다. RNA 모티프는 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드 변형 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. RNA 모티프에 적합한 변형의 비제한적인 예에는 2' 데옥시-2-아미노퓨린, 2'리보스-2-아미노퓨린, 포스포로티오에이트 모드, 2'-O-메틸 모드, 2'-플루로 모드 및 LNA 모드가 포함된다. 유리하게는, 변형은 안정성을 증가시키고 RNA 모티프에 의해 형성된 헤어핀(들)의 더 강한 결합/접힘 구조를 촉진하는 데 도움이 된다.

일부 구현예에서, RNA 모티프는 연장부를 포함하도록 변형된다. 구현예에서, 연장은 약, 적어도 약, 또는 약 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 또는 25개 이하의 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 경우에는 연장으로 인해 RNA 모티프에 의해 형성된 스템 길이가 변경된다(예: 연장 또는 단축). RNA 모티프에 의해 형성된 스템이 약, 적어도 약, 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 뉴클레오티드 길이 이하인 것이 유리할 수 있다. 다양한 구현예에서, 연장은 RNA 모티프의 유연성을 증가시키고/시키거나 상응하는 RNA 모티프와의 결합을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 염기 편집기는 편집된 가닥의 염기 절제 복구(BER)를 억제한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 편집되지 않은 가닥을 보호하거나 또는 결합한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 UGI 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 촉매적으로 비활성 이노신-특이적 뉴클레아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 니카아제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 쌍의 의도된 편집은 PAM 부위의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 염기 쌍의 의도된 편집은 PAM 부위의 상류에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 염기-쌍의 의도된 편집은 PAM 부위의 하류에 있다. 일부 구현예에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 하류 스트림에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 뉴클레오티드이다.

일부 구현예에서, 방법은 표준(예를 들어, NGG) PAM 부위를 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵염기 편집기는 링커 또는 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 1-25 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 5-20 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 아미노산 길이이다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집 융합 단백질은 정확한 위치에 위치될 필요가 있으며, 예를 들어, 여기서 표적 염기가 정의된 영역(예를 들어, "탈아미노화 윈도우") 내에 배치된다. 일부 구현예에서, 표적은 4 염기 영역 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 정의된 표적 영역은 PAM의 대략 15 염기 상류일 수 있다. Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)를 참조하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 표적 영역은 표적 윈도우를 포함하며, 여기서 표적 윈도우는 표적 핵염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 1-10 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 염기 쌍의 의도된 편집은 표적 윈도우 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 염기 쌍의 의도된 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 윈도우는 탈아미노화 윈도우이다. 탈아미노화 윈도우는 염기 편집기가 표적 뉴클레오티드에 작용하고 탈아미노화하는 정의된 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, 탈아미노화 윈도우는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 염기 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 탈아미노화 윈도우는 PAM의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 염기 상류이다.

본 개시내용의 염기 편집기는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 편집을 용이하게 하는 임의의 도메인, 특성 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 편집기는 핵 국재화 서열(NLS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 NLS는 데아미나아제 도메인과 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 사이에 국재화된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 NLS는 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인에 대해 국재화된 C-말단이다.

본원에 개시된 바와 같은 염기 편집기에 존재할 수 있는 다른 예시적인 특성은 세포질 국재화 서열, 예컨대 국재화 서열, 이출 서열, 예컨대 핵 이출 서열, 또는 다른 국재화 서열, 뿐만 아니라 융합 단백질의 가용화, 정제, 또는 검출에 유용한 서열 태그이다. 본원에 제공된 적합한 단백질 태그는 비오틴 카르복실라제 담체 단백질(BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌(HA)-태그, 히스티딘 태그 또는 His-태그로도 지칭되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질(MBP)-태그, nus-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-태그, 녹색 형광 단백질(GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프트태그(Softag)(예를 들어, 소프트태그 1, 소프트태그 3), 스트렙(strep)-태그, 비오틴 리가제 태그, 플래쉬(FlAsH) 태그, V5 태그 및 SBP-태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 His 태그를 포함한다.

일부 구현예에서, 비제한적인 예시적인 사이티딘 염기 편집기(CBE)에는 BE1(APOBEC1-XTEN-dCas9), BE2(APOBEC1-XTEN-dCas9-UGI), BE3(APOBEC1-XTEN-dCas9(A840H)-UGI), BE3-Gam, saBE3, saBE4-Gam, BE4, BE4-Gam, saBE4 또는 saB4E-Gam이 포함된다. BE4는 APOBEC1-Cas9n(D10A) 링커를 32개 아미노산으로 확장하고 Cas9n-UGI 링커를 9개 아미노산으로 확장하고 또 다른 9개 아미노산 링커를 사용하여 UGI의 두 번째 복사본을 구조물의 C 말단에 추가하여 단일 염기 편집기로 확장한다. 염기 편집기 saBE3 및 saBE4에는 에스. 파이오게네스(S. pyogenes) Cas9n(D10A)이 더 작은 에스. 파이오게네스(S. pyogenes) Cas9n(D10A)으로 대체되었다. BE3-Gam, saBE3-Gam, BE4-Gam 및 saBE4-Gam은 16개 아미노산 XTEN 링커를 통해 BE3, saBE3, BE4 및 saBE4의 N-말단에 융합된 Gam 단백질의 174개 잔기를 갖는다.

일부 구현예에서, 아데노신 염기 편집기(ABE)는 DNA에서 아데닌을 탈아미노화할 수 있다. 일부 구현예에서, ABE는 BE3의 APOBEC1 구성요소를 천연 또는 조작된 이. 콜라이 TadA, 인간 ADAR2, 마우스 ADA, 또는 인간 ADAT2로 대체함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, ABE는 진화된 TadA 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE 1.2(TadA*-XTEN-nCas9-NLS)이다. 일부 구현예에서, TadA*는 A106V 및 D108N 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, ABE는 2세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 TadA*(TadA*2.1)에서 추가적인 돌연변이 D147Y 및 E155V를 포함하는 ABE2.1이다. 일부 구현예에서, ABE는 인간 알킬 아데닌 DNA 글리코실라제의 촉매적으로 비활성화 버전(E125Q 돌연변이가 있는 AAG)에 융합된 ABE2.1인 ABE2.2이다. 일부 구현예에서, ABE는 이. 콜라이 Endo V의 촉매적으로 비활성화 버전(D35A 돌연변이로 비활성화)에 융합된 ABE2.1인 ABE2.3이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE2.1에서 링커보다 2 개 긴 링커(32 개의 아미노산, (SGGS)2(서열번호: 418)-XTEN-(SGGS)2(서열번호: 418))를 갖는 ABE2.6이다. 일부 구현예에서, ABE는 추가적인 야생형 TadA 단량체로 테더링된 ABE2.1인 ABE2.7이다. 일부 구현예에서, ABE는 추가적인 TadA*2.1 단량체로 테더링된 ABE2.1인 ABE2.8이다. 일부 구현예에서, ABE는 진화된 TadA(TadA*2.1)가 ABE2.1의 N-말단에 직접 융합된 ABE2.9이다. 일부 구현예에서, ABE는 야생형 TadA가 ABE2.1의 N-말단에 직접 융합된 ABE2.10이다. 일부 구현예에서, ABE는 TadA* 단량체의 N-말단에서 비활성화 E59A 돌연변이가 있는 ABE2.9인 ABE2.11이다. 일부 구현예에서, ABE는 내부 TadA* 단량체에 비활성화 E59A 돌연변이가 있는 ABE2.9인 ABE2.12이다.

일부 구현예에서, ABE는 3세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE3.1이고, 이는 3개의 추가적인 TadA 돌연변이(L84F, H123Y 및 I156F)를 갖는 ABE2.3이다.

일부 실시예에서, ABE는 4세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE4.3이고, 이는 추가적인 TadA 돌연변이 A142N(TadA*4.3)을 갖는 ABE3.1이다.

일부 구현예에서, ABE는 5세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 생존 클론(H36L, R51L, S146C, 및 K157N)으로부터 ABE3.1 내로 돌연변이의 컨센서스 세트를 유입함으로써 생성된 ABE5.1이다. 일부 구현예에서, ABE는 내부 진화된 TadA*에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물을 갖는 ABE5.3이다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 10에 제시된 바와 같이, ABE5.2, ABE5.4, ABE5.5, ABE5.6, ABE5.7, ABE5.8, ABE5.9, ABE5.10, ABE5.11, ABE5.12, ABE5.13, 또는 ABE5.14이다. 일부 구현예에서, ABE는 6세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 10에 제시된 바와 같이, ABE6.1, ABE6.2, ABE6.3, ABE6.4, ABE6.5, 또는 ABE6.6이다. 일부 구현예에서, ABE는 7세대 ABE이다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 10에 제시된 바와 같이, ABE7.1, ABE7.2, ABE7.3, ABE7.4, ABE7.5, ABE7.6, ABE7.7, ABE7.8, ABE 7.9, 또는 ABE7.10이다.

표 10. ABE의 유전자형

일부 구현예에서, 염기 편집기는 8세대 ABE(ABE8)이다. 일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체를 함유한다. 일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체를 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다("ABE8.x-m"). 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.1)을 갖는 ABE8.1-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단랑체성 작제물(TadA*8.2)을 갖는 ABE8.2-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.3)을 갖는 ABE8.3-m이다.

일부 구현예에서, ABE8은 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.4)을 갖는 ABE8.4-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.5)을 갖는 ABE8.5-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.6)을 갖는 ABE8.6-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.7)을 갖는 ABE8.7-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.8)을 갖는 ABE8.8-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.9)을 갖는 ABE8.9-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.10)을 갖는 ABE8.10-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.11)을 갖는 ABE8.11-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.12)을 갖는 ABE8.12-m이다.

일부 구현예에서, ABE8은 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.13)을 갖는 ABE8.13-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y 및 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.14)을 갖는 ABE8.14-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.15)을 갖는 ABE8.15-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.16)을 갖는 ABE8.16-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.17)을 갖는 ABE8.17-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.18)을 갖는 ABE8.18-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.19)을 갖는 ABE8.19-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y, V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.20)을 갖는 ABE8.20-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.21)을 갖는 ABE8.21-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.22)을 갖는 ABE8.22-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.23)을 갖는 ABE8.23-m이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), 및 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물(TadA*8.24)을 갖는 ABE8.24-m이다.

일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물을 갖는다("ABE8.x-d"). 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.1)을 갖는 ABE8.1-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.2)을 갖는 ABE8.2-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.3)을 갖는 ABE8.3-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.4)을 갖는 ABE8.4-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.5)을 갖는 ABE8.5-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.6)을 갖는 ABE8.6-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.7)을 갖는 ABE8.7-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.8)을 갖는 ABE8.8-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.9)을 갖는 ABE8.9-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.10)을 갖는 ABE8.10-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.11)을 갖는 ABE8.11-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.12)을 갖는 ABE8.12-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.13)을 갖는 ABE8.13-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y 및 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.14)을 갖는 ABE8.14-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.15)을 갖는 ABE8.15-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.16)을 갖는 ABE8.16-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.17)을 갖는 ABE8.17-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.18)을 갖는 ABE8.18-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.19)을 갖는 ABE8.19-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y, V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.20)을 갖는 ABE8.20-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.21)을 갖는 ABE8.21-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.22)을 갖는 ABE8.22-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.23)을 갖는 ABE8.23-d이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), 및 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.24)을 갖는 ABE8.24-d이다.

일부 구현예에서, ABE8은 TadA*8 변이체에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물을 갖는다("ABE8.x-7"). 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.1)을 갖는 ABE8.1-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.2)을 갖는 ABE8.2-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.3)을 갖는 ABE8.3-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.4)을 갖는 ABE8.4-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.5)을 갖는 ABE8.5-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.6)을 갖는 ABE8.6-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.7)을 갖는 ABE8.7-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 Y123H 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.8)을 갖는 ABE8.8-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.9)을 갖는 ABE8.9-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R, Q154R, 및 T166R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.10)을 갖는 ABE8.10-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.11)을 갖는 ABE8.11-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147T 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.12)을 갖는 ABE8.12-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R, Q154R 및 I76Y 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.13)을 갖는 ABE8.13-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y 및 V82S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.14)을 갖는 ABE8.14-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.15)을 갖는 ABE8.15-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Y147R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.16)을 갖는 ABE8.16-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.17)을 갖는 ABE8.17-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.18)을 갖는 ABE8.18-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.19)을 갖는 ABE8.19-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 I76Y, V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), Y147R 및 Q154R 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.20)을 갖는 ABE8.20-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 Y147R 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.21)을 갖는 ABE8.21-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Q154S 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.22)을 갖는 ABE8.22-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S 및 Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨) 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.23)을 갖는 ABE8.23-7이다. 일부 구현예에서, ABE8은 V82S, Y123H(Y123H는 H123Y로부터 복귀됨), 및 Y147T 돌연변이가 있는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체성 작제물(TadA*8.24)을 갖는 ABE8.24-7이다.

일부 구현예에서, ABE는 하기 표 11에 나타낸 바와 같은 ABE8.1-m, ABE8.2-m, ABE8.3-m, ABE8.4-m, ABE8.5-m, ABE8.6-m, ABE8.7-m, ABE8.8-m, ABE8.9-m, ABE8.10-m, ABE8.11-m, ABE8.12-m, ABE8.13-m, ABE8.14-m, ABE8.15-m, ABE8.16-m, ABE8.17-m, ABE8.18-m, ABE8.19-m, ABE8.20-m, ABE8.21-m, ABE8.22-m, ABE8.23-m, ABE8.24-m, ABE8.1-d, ABE8.2-d, ABE8.3-d, ABE8.4-d, ABE8.5-d, ABE8.6-d, ABE8.7-d, ABE8.8-d, ABE8.9-d, ABE8.10-d, ABE8.11-d, ABE8.12-d, ABE8.13-d, ABE8.14-d, ABE8.15-d, ABE8.16-d, ABE8.17-d, ABE8.18-d, ABE8.19-d, ABE8.20-d, ABE8.21-d, ABE8.22-d, ABE8.23-d, 또는 ABE8.24-d이다.

표 11: 아데노신 염기 편집기 8(ABE8) 변이체

일부 구현예에서, ABE8은 ABE8a-m이고, 이는 R26C, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이(TadA*8a)를 갖는 TadA*7.10을 함유하는 단량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8b-m이고, 이는 V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이(TadA*8b)를 갖는 TadA*7.10을 함유하는 단량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8c-m이고, 이는 R26C, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이(TadA*8c)를 갖는 TadA*7.10을 함유하는 단량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8d-m이고, 이는 V88A, T111R, D119N, 및 F149Y 돌연변이(TadA*8d)를 갖는 TadA*7.10을 함유하는 단량체성 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8e-m이고, 이는 A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이(TadA*8e)를 갖는 TadA*7.10을 함유하는 단량체 작제물을 갖는다.

일부 구현예에서, ABE8은 ABE8a-d이며, 이는 R26C, A109S, T111R, D119, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이(TadA*8a)를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8b-d이며, 이는 V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I 및 D167N 돌연변이(TadA*8b)를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8c-d이고, 이는 R26C, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I 및 D167N 돌연변이(TadA*8c)를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8d-d이고, 이는 V88A, T111R, D119N 및 F149Y 돌연변이(TadA*8d)를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8e-d이며, 이는 A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I 및 D167N 돌연변이(TadA*8e)를 갖는 TadA*7.10에 융합된 야생형 이. 콜라이 TadA를 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다.

일부 구현예에서, ABE8은 ABE8a-7이고, 이는 R26C, A109S, T111R, D119, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이(TadA*8a)를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8b-7이고, 이는 V88A, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이(TadA*8b)를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8c-7이고, 이는 R26C, A109S, T111R, D119N, H122N, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이(TadA*8c)를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8d-7이고, 이는 V88A, T111R, D119N, 및 F149Y 돌연변이(TadA*8d)를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다. 일부 구현예에서, ABE8은 ABE8e-7이고, 이는 A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I, 및 D167N 돌연변이(TadA*8e)를 갖는 TadA*7.10에 융합된 TadA*7.10을 함유하는 이종이량체 작제물을 갖는다.

일부 구현예에서, ABE는 하기 표 12에 나타낸 바와 같이, ABE8a-m, ABE8b-m, ABE8c-m, ABE8d-m, ABE8e-m, ABE8a-d, ABE8b-d, ABE8c-d, ABE8d-d, 또는 ABE8e-d이다. 일부 구현예에서, ABE는 ABE8e-m 또는 ABE8e-d이다. ABE8e는 SpCas9 이외의 Cas 상동체, 예를 들어, SaCas9, SaCas9-KKH, Cas12a 상동체, 예를 들어, LbCas12a, enAs-Cas12a, SpCas9-NG 및 원형적으로 순열된 CP1028-SpCas9 및 CP1041-SpCas9와 함께 사용될 때 효율적인 아데닌 염기 편집 활성 및 낮은 인델 형성을 나타낸다. 표 12에서 ABE8e에 대해 나타낸 돌연변이 이외에, 오프-타겟 RNA 및 DNA 편집은 TadA 도메인 내로 V106W 치환을 도입함으로써 감소되었다(M. Richter 등, 2020, Nature Biotechnology, doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z에 기재된 바와 같고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).

표 12. 추가의 아데노신 염기 편집기 8 변이체. 표에서, “단량체”는 표시된 변경을 포함하는 단일 TadA*7.10을 포함하는 ABE를 나타내고, “이종이량체”는 이. 콜라이 TadA 아데노신 데아미나아제에 융합된 표시된 변경을 포함하는 TadA*7.10을 포함하는 ABE를 나타낸다.

일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, ABE8)는 아데노신 데아미나아제 변이체(예를 들어, TadA*8)를 원형 순열 Cas9(예를 들어, CP5 또는 CP6) 및 이분 핵 국재화 서열을 포함하는 스캐폴드 내로 클로닝함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, ABE7.9, ABE7.10, 또는 ABE8)는 NGC PAM CP5 변이체(에스. 파이오게네스 Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, ABE7.9, ABE7.10, 또는 ABE8)는 AGA PAM CP5 변이체(에스. 파이오게네스 Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, ABE7.9, ABE7.10, 또는 ABE8)는 NGC PAM CP6 변이체(에스. 파이오게네스 Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어 ABE7.9, ABE7.10, 또는 ABE8)는 AGA PAM CP6 변이체(에스. 파이오게네스 Cas9 또는 spVRQR Cas9)이다.

일부 구현예에서, ABE는 하기 표 13에 제시된 바와 같은 유전자형을 갖는다.

표 13. ABE의 유전자형

하기 표 14에 제시된 바와 같이, 40 개의 ABE8의 유전자형이 기재되어 있다. ABE의 진화된 이. 콜라이 TadA 부분에서의 잔기 위치가 표시된다. ABE7.10 돌연변이와 구별될 때 ABE8의 돌연변이 변화가 제시된다. 일부 구현예에서, ABE는 하기 표 14에 제시된 바와 같은 ABE 중 하나의 유전자형을 갖는다.

표 14. 진화된 TadA의 잔기 식별

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일부 구현예에서, 염기 편집기는 아데노신 데아미나아제 활성을 갖는 하기 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 ABE8.1이다:

ABE8.1_Y147T_CP5_NGC PAM_단량체 (서열번호: 419)

상기 서열에서, 상기 일반 글씨체는 아데노신 데아미나아제 서열을 의미하고, 굵은체 서열은 Cas9로부터 유래된 서열을 의미하며, 이탤릭체 서열은 링커 서열을 의미하고, 밑줄친 서열은 이분 핵 국재화 서열을 의미한다. 다른 ABE8 서열은 첨부된 서열목록(서열번호: 420-442)에 제공된다.

일부 구현예들에서, 염기 편집기는 9세대 ABE(ABE9)이다. 일부 구현예에서, ABE9는 TadA*9 변이체를 함유한다. ABE9 염기 편집기는 본원에 기재된 바와 같이 ABE 7*10 참조 서열에 대한 변경을 함유하는, 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나아제 변이체를 포함한다. 예시적인 ABE9 변이체는 표 15에 열거되어 있다. ABE9 염기 편집기의 세부 사항은 국제 PCT 출원번호 PCT/2020/049975에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

표 15. 아데노신 염기 편집기 9(ABE9) 변이체. 표에서 "단량체"는 표시된 변경을 포함하는 단일 TadA*7.10을 포함하는 ABE를 나타내고 "이종이량체"는 이. 콜라이 TadA 아데노신 데아미나아제에 융합된 표시된 변경을 포함하는 TadA*7.10을 포함하는 ABE를 나타낸다.

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일부 구현예에서, 염기 편집기는 본원에 기재된 바와 같은 ABE 7*10 참조 서열에 대한 변경을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나아제 변이체를 포함한다. 표 15.1에 사용된 용어 "단량체"는 기술된 변형을 포함하는 TadA*7.10의 단량체 형태를 의미한다. 표 15.1에 사용된 용어 "이종이량체"는 설명된 변경을 포함하는 TadA*7.10에 융합된 특정 야생형 이. 콜라이 TadA 아데노신 데아미나아제를 의미한다.

표 15.1. 아데노신 데아미나아제 염기 편집기 변이체

일부 구현예에서, 염기 편집기는 우라실 글리코실라제 억제제(UGI)의 전부 또는 부분을 포함하는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 핵산 폴리머라아제의 전부 또는 부분을 포함하는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 도메인으로서 핵산 폴리머라아제(NAP)의 전부 또는 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기는 진핵생물 NAP의 전부 또는 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 DNA 폴리머라아제다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 손상통과 폴리머라아제 활성을 갖는다. 일부 경우에, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 손상통과 DNA 폴리머라아제다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 Rev7, Rev1 복합체, 폴리머라아제 이오타, 폴리머라아제 카파, 또는 폴리머라아제 에타이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 진핵생물 폴리머라아제 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론, 감마, 에타, 이오타, 카파, 람다, 뮤, 또는 누 구성요소이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 내로 혼입된 NAP 또는 이의 부분은 핵산 폴리머라아제(예를 들어, 트랜스레전(translesion) DNA 폴리머라아제)와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기에 혼입된 핵산 폴리머라아제 또는 이의 부분은 트랜스레전 (translesion) DNA 폴리머라아제이다.

일부 구현예에서, 염기 편집기의 도메인은 다중 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Cas9로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함하는 염기 편집기는 야생형 또는 천연 Cas9의 REC 로브 및 NUC 로브에 상응하는 REC 로브 및 NUC 로브를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 염기 편집기는 RuvCI 도메인, BH 도메인, REC1 도메인, REC2 도메인, RuvCII 도메인, L1 도메인, HNH 도메인, L2 도메인, RuvCIII 도메인, WED 도메인, TOPO 도메인 또는 CTD 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 하나 이상의 도메인은 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 야생형 버전에 비해 돌연변이(예를 들어, 치환, 삽입, 결실)를 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인의 HNH 도메인은 H840A 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인의 RuvCI 도메인은 D10A 치환을 포함할 수 있다.

본원에 개시된 염기 편집기의 상이한 도메인(예를 들어, 인접한 도메인)은 하나 이상의 링커 도메인(예를 들어, XTEN 링커 도메인)을 사용하거나 또는 사용하지 않고 서로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 결합(예를 들어, 공유 결합), 화학 기, 또는 2 개의 분자 또는 모이어티를 연결하는 분자, 예를 들어, 융합 단백질의 2 개의 도메인, 예컨대, 예를 들어, 제1 도메인(예를 들어, Cas9-유래 도메인) 및 제2 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나아제 도메인 또는 사이티딘 데아미나아제 도메인)일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 공유 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합, 디술피드 결합, 탄소-헤테로 원자 결합 등)이다. 특정 구현예에서, 링커는 아미드 결합의 탄소 질소 결합이다. 특정 구현예에서, 링커는 환형 또는 비환형, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 특정 구현예에서, 링커는 중합체성(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노알칸산의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노알칸산(예를 들어, 글리신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노헥산산(Ahx)의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 탄소환형 모이어티(예를 들어, 사이클로펜탄, 사이클로헥산)를 기반으로 한다. 다른 구현예에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(PEG)를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 페닐 고리를 기반으로 한다. 링커는 펩티드에서 링커까지 친핵체(예를 들어, 티올, 아미노)의 부착을 용이하게 하는 작용화된 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 친전자체가 링커의 일부로 사용될 수 있다. 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클(Michael) 수용체, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드, 및 이소티오시아네이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 링커는 Cas9 뉴클레아제 도메인을 포함하는 RNA-프로그래밍 가능한 뉴클레아제의 gRNA 결합 도메인, 및 핵산 편집 단백질의 촉매 도메인을 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 dCas9 및 제2 도메인(예를 들어, UGI 등)을 연결한다.

링커

특정 구현예에서, 링커는 본 발명의 임의의 펩티드 또는 펩티드 도메인을 연결하는 데 사용될 수 있다. 링커는 공유 결합만큼 단순할 수 있거나, 또는 많은 원자 길이의 중합체성 링커일 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 폴리펩티드이거나 또는 아미노산을 기반으로 한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 또는 아미노산 기반 링커는 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 데아미나아제 도메인 및/또는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편은 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 데아미나아제 도메인 및/또는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 오픈 리딩 프레임 내에 삽입된 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 링커 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입된다.

다른 구현예에서, 링커는 펩티드와 유사하지 않다. 특정 구현예에서, 링커는 공유 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합, 디술피드 결합, 탄소-헤테로원자 결합 등)이다. 특정 구현예에서, 링커는 아미드 결합의 탄소-질소 결합이다. 특정 구현예에서, 링커는 환형 또는 비환형, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 특정 구현예에서, 링커는 중합체성(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노알칸산의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노알칸산(예를 들어, 글리신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노헥산산(Ahx)의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 탄소환형 모이어티(예를 들어, 사이클로펜탄, 사이클로헥산)를 기반으로 한다. 다른 구현예에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(PEG)를 포함한다. 다른 구현예에서, 링커는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 펩티드를 포함한다.　특정 구현예에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 페닐 고리를 기반으로 한다. 링커는 펩티드에서 링커까지 친핵체(예를 들어, 티올, 아미노)의 부착을 용이하게 하는 작용화된 모이어티를 포함할 수 있다.　임의의 친전자체는 링커의 일부로 사용될 수 있다.　예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클 수용체, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드, 및 이소티오시아네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

전형적으로, 링커는 2 개의 기, 분자, 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나, 또는 이에 의해 플랭킹되고 공유 결합을 통해 서로 연결되어, 2 개를 연결한다. 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산(예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 구현예에서, 링커는 유기 분자, 그룹, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 구현예에서, 링커는 2-100 개의 아미노산 길이, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 또는 150-200 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 약 3 내지 약 104 개(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개)의 아미노산 길이이다. 더 길거나 또는 더 짧은 링커가 또한 고려된다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 링커를 통해 서로 융합된 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제 및 Cas9 도메인을 포함한다. 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제 핵염기 편집기에 대한 활성을 위한 최적의 길이를 달성하기 위해 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제 및 Cas9 도메인 사이의 다양한 링커 길이 및 유연성이 이용될 수 있다(예를 들어, (GGGS)_n(서열번호: 334), (GGGGS)_n(서열번호: 335) 및 (G)_n을 형성하는 매우 유연한 링커에서 (EAAAK)_n(서열번호: 336), (SGGS)_n(서열번호: 443), SGSETPGTSESATPES(서열번호: 337)(예를 들어, Guilinger JP, 등, Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82를 참조하며; 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨) 및 (XP)_n을 형성하는 보다 강성 링커까지). 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다. 일부 구현예에서, 링커는 (GGS)_n 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 융합의 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 및 Cas9 도메인은 XTEN 링커로도 지칭될 수 있는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열번호: 237)를 포함하는 링커를 통해 융합된다.

일부 구현예에서, 염기 편집기의 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 링커를 통해 융합된다:

SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS(서열번호: 444),

SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(서열번호: 445), 또는 GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS(서열번호: 446).

일부 구현예에서, 염기 편집기의 도메인은 XTEN 링커로도 지칭될 수 있는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES(서열번호: 237)을 포함하는 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 길이가 24개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES(서열번호: 447)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 길이가 40개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열: SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS(서열번호: 448)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 길이가 64개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열: SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(서열번호: 449)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 길이가 92개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열: PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS(서열번호: 450)을 포함한다.

일부 구현예에서, 링커는 복수의 프롤린 잔기를 포함하고, 길이가 5-21, 5-14, 5-9, 5-7개의 아미노산인, 예를 들어, PAPAP(서열번호: 451), PAPAPA(서열번호: 452)이다. ), PAPAPAP (서열번호: 453), PAPAPAPA (서열번호: 454), P(AP)4 (서열번호: 455), P(AP)7 (서열번호: 456), P(AP)10 (서열번호: 457)을 포함한다 (예를 들어, Tan J, Zhang F, Karcher D, Bock R. Engineering of high-precision base editors for site-specific single nucleotide replacement. Nat Commun. 2019 Jan 25;10(1):439을 참조하며; 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다). 이러한 프롤린이-풍부한 링커는 “강성(rigid)”링커라고도 한다.

또 다른 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 데아미나아제(DNA 데아미나아제), 예를 들어 아데노신 또는 사이티딘 데아미나아제와 비공유적으로 상호작용하고, 최소 또는 감소된 방관자 또는 표적-인접 효과로, 특이적 편집을 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 표적 핵염기에 아데노신 또는 사이티딘 데아미나아제를 일시적으로 유인하는 구성요소(단백질)을 포함한다. 데아미나아제-상호작용 단백질을 포함하는 이러한 비-공유 시스템 및 방법은 DNA 데아미나아제를 특정 게놈 표적 핵염기로 유인하고, 온-타겟 및 표적-인접 편집의 사건을 분리하도록 작용하여, 보다 정확한 단일 염기 치환 돌연변이의 달성을 향상시킨다. 일 구현예에서, 데아미나아제-상호작용 단백질은 데아미나아제의 활성(촉매) 부위가 표적 핵염기(예를 들어, 각각 아데노신 또는 사이티딘)와 결합하는 것을 차단하거나 방해하지 않고 데아미나아제(예를 들어, 아데노신 데아미나아제 또는 사이티딘 데아미나아제)에 결합한다. "MagnEdit"로 지칭되는 이러한 시스템은 Cas9 및 gRNA 복합체에 연결된 상호작용하는 단백질을 포함하고, 공동-발현된 아데노신 또는 사이티딘 데아미나아제(외인성 또는 내인성)을 유인하여 특정 게놈 표적 부위를 편집하기 위해 할 수 있고, 이는 McCann, J. 등, 2020, "MagnEdit - interacting factors that recruit DNA-editing enzymes to single base targets," Life-Science-Alliance, Vol. 3, No. 4 (e201900606), (doi 10.26508/Isa.201900606)에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일 구현예에서, DNA 데아미나아제는 본원에 기재된 바와 같은 아데노신 데아미나아제 변이체(예를 들어, TadA*8)이다.

또 다른 구현예에서, "Suntag"로 불리는 시스템은 염기 편집기의 단백질(예를 들어, 아데노신 데아미나아제 또는 사이티딘 데아미나아제) 구성요소 또는 이의 다중 카피를 폴리뉴클레오티드 표적 부위로 모집하여 인접 표적 편집이 감소된 부위에서 염기 편집을 달성하는 데 사용되는 비-공유적으로 상호작용하는 구성요소를 포함하고, 이는 예를 들어, Tanenbaum, M.E. 등, "A protein tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging," Cell. 2014 October 23; 159(3): 635-646. doi:10.1016/j.cell.2014.09.039; 및 Huang, Y.-H. 등, 2017, "DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A," Genome Biol 18: 176. doi:10.1186/s13059-017-1306-z에 기재된 바와 같고, 이의 내용은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일 구현예에서, DNA 데아미나아제는 본원에 기재된 바와 같은 아데노신 데아미나아제 변이체(예를 들어, TadA*8)이다.

가이드 RNA를 갖는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질

염기 편집 및/또는 세포 내 염기 편집기 불활성화를 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 본원에서 추가로 제공되는 것은, 가이드 다중핵산 서열, 예를 들어 가이드 RNA 서열, 또는 본원에 제공된 바와 같은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 가이드 RNA 서열의 조합을 포함하는 조성물이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집용 조성물은 염기 편집기, 예를 들어 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 C-염기 편집기 또는 A-염기 편집기를 추가로 포함한다. 예를 들어, 염기 편집을 위한 조성물은 BE, BE4, ABE, 및 제공된 하나 이상의 가이드 RNA의 조합을 코딩하는 mRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이종성 인트론을 포함한다. 염기 편집용 조성물은 염기 편집기 폴리펩티드 및 본원에 제공된 임의의 가이드 RNA 중 하나 이상의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 전기천공, 뉴클레오펙션, 바이러스 형질도입 또는 형질감염과 같은 다양한 전달 접근법을 통해 염기 편집을 수행하거나 세포 내 염기 편집기를 불활성화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 및/또는 염기 편집기 불활성화를 위한 조성물은 염기 편집기를 코딩하는 mRNA 서열 및 전기천공을 위해 본원에 제공된 하나 이상의 가이드 RNA 서열의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기를 코딩하는 mRNA 서열은 이종성 인트론을 포함한다.

본 개시내용의 일부 양태는 본원에 제공된 임의의 융합 단백질, 및 융합 단백질의 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인(예를 들어, Cas9(예를 들어, dCas9, 뉴클레아제 활성 Cas9, 또는 Cas9 니카아제) 또는 Cas12)에 결합된 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 제공한다. 이러한 복합체는 리보뉴클레오단백질(RNP)이라고도 한다. 일부 구현예에서, 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 15 내지 100 개의 뉴클레오티드 길이이며 표적 서열에 상보적인 적어도 10 개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 표적 서열에 상보적인 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 DNA 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 RNA 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 박테리아, 효모, 진균, 곤충, 식물 또는 동물의 게놈 내의 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 인간의 게놈 내의 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단 단부는 표준 PAM 서열 (NGG)에 바로 인접한다. 일부 구현예들에서, 표적 서열의 3' 말단 단부는 비-표준 PAM 서열(예를 들어, 표 6 또는 5'-NAA-3'에 열거된 서열)에 바로 인접한다. 일부 구현예들에서, 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 관심 유전자 (예를 들어 질환 또는 장애와 관련된 유전자) 서열에 상보적이다.

본 개시내용의 일부 양태는 본원에 제공된 융합 단백질 또는 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 양태는 DNA 분자를 본원에 제공된 임의의 융합 단백질, 및 적어도 하나의 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 가이드 RNA는 약 15-100 개의 뉴클레오티드 길이이며 표적 서열에 상보적인 적어도 10 개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단 단부는 AGC, GAG, TTT, GTG, 또는 CAA 서열에 바로 인접한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단 단부는 NGA, NGCG, NGN, NNGRRT, NNNRRT, NGCG, NGCN, NGTN, NGTN, NGTN, 또는 5'(TTTV) 서열에 바로 인접한다. 일부 구현예에서, 표적 서열의 3' 말단 단부는 예를 들어 TTN, DTTN, GTTN, ATTN, ATTC, DTTNT, WTTN, HATY, TTTN, TTTV, TTTC, TG, RTR, 또는 YTN PAM부위에 바로 인접한다.

각각의 서열에서 특이적 위치 및 잔기의 넘버링은 사용되는 특정 단백질 및 넘버링 방식에 따라 달라짐이 이해될 것이다. 넘버링은 예를 들어, 성숙 단백질의 전구체 및 성숙 단백질 자체에서 상이할 수 있고, 종 간의 서열 차이는 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 서열 정렬 및 상동성 잔기의 결정에 의해 임의의 상동성 단백질 및 각각의 암호화 핵산에서 각각의 잔기를 식별할 수 있을 것이다.

표적 부위, 예를 들어, 편집될 돌연변이를 포함하는 부위에 본원에 개시된 임의의 융합 단백질을 표적화하기 위해, 전형적으로 가이드 RNA와 함께 융합 단백질을 공발현하는 것이 필요함이 당업자에게 명백할 것이다. 본원의 다른 곳에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 가이드 RNA는 전형적으로 napDNAbp(예를 들어, Cas9 또는 Cas12) 결합을 허용하는 tracrRNA 프레임워크, 및 napDNAbp:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질에 서열 특이성을 부여하는 가이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 가이드 RNA 및 tracrRNA는 2 개의 핵산 분자로서 개별적으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 구조를 포함하며, 여기서 가이드 서열은 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 가이드 서열은 전형적으로 20 개의 뉴클레오티드 길이이다. napDNAbp:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특이적 게놈 표적 부위에 표적화하기 위한 적합한 가이드 RNA의 서열은 본 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 적합한 가이드 RNA 서열은 전형적으로 편집될 표적 뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 있는 50 개의 뉴클레오티드 내에서 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 임의의 제공된 융합 단백질을 특이적 표적 서열에 표적화하기에 적합한 일부 예시적인 가이드 RNA 서열이 본원에 제공된다.

sgRNA의 별개의 부분은 Cas9(예를 들어, SpyCas9) 및/또는 DNA 표적과 상호작용하는 다양한 특성을 형성할 것으로 예측된다. 6개의 보존된 모듈은 천연 crRNA:tracrRNA 듀플렉스 및 Cas9 엔도뉴클레아제 활성을 지시하는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 내에서 식별되었다(Briner 등, Guide RNA Functional Modules Direct Cas9 Activity and Orthogonality Mol Cell. 2014 Oct 23;56(2):333-339 참조). 6개의 모듈은 DNA 표적화를 담당하는 스페이서, 상부 스템, 벌지(bulge), CRISPR 반복부:tracrRNA 듀플렉스에 의해 형성된 하부 스템, 넥서스, 및 tracrRNA의 3' 말단 단부으로부터의 헤어핀을 포함한다. 상부 및 하부 스템은 주로 포스페이트 백본과의 서열-독립적 상호작용을 통해 Cas9와 상호작용한다. 일부 구현예에서, 상부 스템은 분배가능하다. 일부 구현예에서, 하부 스템의 염기에서의 보존된 우라실 뉴클레오티드 서열은 분배가능하다. 벌지는 Cas9의 Rec1 도메인과의 특이적 측쇄 상호작용에 참여한다. U44의 핵염기는 Tyr 325 및 His 328의 측쇄와 상호작용하는 반면, G43은 Tyr 329와 상호작용한다. 넥서스는 sgRNA:Cas9 상호작용의 핵심을 형성하고 sgRNA와 Cas9 및 표적 DNA 사이의 교차점에 있다. A51 및 A52의 핵염기는 Phe 1105의 측쇄와 상호작용하고; U56은 Arg 457 및 Asn 459와 상호작용하고; U59의 핵염기는 Arg 74, Asn 77, Pro 475, Leu 455, Phe 446, 및 Ile 448의 측쇄에 의해 정의된 소수성 포켓에 삽입되고; C60은 Leu 455, Ala 456, 및 Asn 459와 상호작용하고, C61은 Arg 70의 측쇄와 상호작용하고, 이는 이어서 C15와 상호작용한다. 일부 구현예에서, 이들 돌연변이 중 하나 이상은 sgRNA:Cas9 상호작용을 최적화하기 위해 Cas9(예를 들어, spyCas9)에 대한 sgRNA의 벌지 및/또는 넥서스에서 이루어진다.

또한, tracrRNA 넥서스 및 헤어핀은 Cas9 쌍형성에 중요하고, 상이한 Cas9 단백질을 분리하는 교차 직교성 장벽으로 교환될 수 있으며, 이는 직교 Cas9 단백질의 추가 용도에 중요하다. 일부 구현예에서, 넥서스 및 헤어핀은 표적 직교 Cas9 단백질로 교환된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 보다 컴팩트하고 입체형태적으로 안정한 가이드 RNA를 설계하기 위해 상부 스템, 헤어핀 1, 및/또는 하부 스템의 서열 유연성이 분배된다. 일부 구현예에서, 모듈은 다양한 키메라 가이드를 갖는 단일 Cas9를 사용하여 또는 키메라 sgRNA의 상이한 조합을 갖는 직교 시스템을 동시에 사용하여 멀티플렉스 편집을 최적화하도록 변형된다. 가이드 기능 모듈 및 이의 방법에 관한 상세사항은, 예를 들어 Briner 등, Guide RNA Functional Modules Direct Cas9 Activity and Orthogonality Mol Cell. 2014 Oct 23;56(2):333-339에 기재되어 있고, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 개시된 염기 편집기의 도메인은 임의의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드-프로그래밍 가능한 뉴클레오티드-결합 도메인(예를 들어, Cas9 또는 Cas12) 및 데아미나아제 도메인(예를 들어, 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 염기 편집기의 비제한적인 예는 다음과 같이 배열될 수 있다:

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[데아미나아제]-링커1-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[데아미나아제]-링커1-[핵염기 편집 도메인]-링커2-[UGI]-COOH;

NH₂-[데아미나아제]-링커1-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[아데노신 데아미나아제]-링커1-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[데아미나아제]-COOH;

NH₂-[데아미나아제]-[핵염기 편집 도메인]-[이노신 BER 억제제]-COOH;

NH₂-[데아미나아제]-[이노신 BER 억제제]-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[이노신 BER 억제제]-[데아미나아제]-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[데아미나아제]-[이노신 BER 억제제]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[이노신 BER 억제제]-[데아미나아제]-COOH;

NH₂-[이노신 BER 억제제]-[핵염기 편집 도메인]-[데아미나아제]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[데아미나아제]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[데아미나아제]-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[데아미나아제]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[데아미나아제]-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[데아미나아제]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-[이노신 BER 억제제]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[데아미나아제]-[핵염기 편집 도메인]-[이노신 BER 억제제]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[데아미나아제]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-[이노신 BER 억제제]-COOH;

NH₂-[핵염기 편집 도메인]-[데아미나아제]-[핵염기 편집 도메인]-[이노신 BER 억제제]-COOH;

NH₂-[이노신 BER 억제제]-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[데아미나아제]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[이노신 BER 억제제]-[핵염기 편집 도메인]-링커1-[데아미나아제]-[핵염기 편집 도메인]-COOH;

NH₂-[이노신 BER 억제제]-[핵염기 편집 도메인]-[데아미나아제]-링커2-[핵염기 편집 도메인]-COOH; 또는

NH₂-[이노신 BER 억제제]NH2-[핵염기 편집 도메인]-[데아미나아제]-[핵염기 편집 도메인]-COOH.

일부 구현예에서, 본원에 제공되는 염기 편집 융합 단백질은 예를 들어, 표적 염기가 정의된 영역(예를 들어, "탈아미노화 윈도우") 내에 배치되는 정확한 위치에 위치할 필요가 있다. 일부 구현예에서, 표적은 4 개의 염기 영역 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 정의된 표적 영역은 PAM의 상류에 있는 대략 15 개의 염기일 수 있다. Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)을 참조하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.

정의된 표적 영역은 탈아미노화 윈도우일 수 있다. 탈아미노화 윈도우는 염기 편집기가 표적 뉴클레오티드에 작용하고 탈아미노화하는 정의된 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, 탈아미노화 윈도우는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 염기 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 탈아미노화 윈도우는 PAM의 상류에 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개의 염기이다.

본 개시내용의 염기 편집기는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 편집을 용이하게 하는 임의의 도메인, 특성 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 염기 편집기는 핵 국재화 서열(NLS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 NLS는 데아미나아제 도메인과 napDNAbp 도메인 사이에 국재화되어 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기의 NLS는 napDNAbp 도메인에 대해 C-말단에 국재화된다.

융합 단백질에 포함될 수 있는 단백질 도메인의 비제한적인 예는 데아미나아제 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나아제 또는 사이티딘 데아미나아제), 우라실 글리코실라제 억제제(UGI) 도메인, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및/또는 본원에 기재된 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함할 수 있다.

도메인은 에피토프 태그, 리포터 단백질, 다른 결합 도메인으로 검출되거나 표지될 수 있다. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제(GST), 홀스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함한 자가형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가적인 단백질 서열은 DNA 분자에 결합하거나 또는 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합, GAL4 DNA 결합 도메인 융합, 및 단순 포진 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 세포 분자에 결합하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제 및 Cas9 도메인을 포함하는 융합 단백질의 사용

본 개시내용의 일부 양태는 본원에 제공된 융합 단백질 또는 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 양태는 DNA 분자를 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 및 본원에 기재된 적어도 하나의 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 관심 표적 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 편집하는데 사용된다. 특히, 본 명세서에 기술된 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 핵염기 편집기는 표적 서열 내에서 다중 돌연변이를 만들 수 있다. 이러한 돌연변이는 표적의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 핵염기 편집기를 사용하여 조절 영역을 표적으로 하는 경우 조절 영역의 기능이 변경되고 하류 단백질의 발현이 감소되거나 제거된다. 또 다른 예에서, 사이티딘 데아미나아제 또는 아데노신 데아미나아제 핵염기 편집기를 사용하여 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 혼입된 이종성 인트론의 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 표적화하는 경우, 인트론의 스플라이싱이 변경되고 염기 편집기의 발현 또는 활성이 줄어들거나 제거된다.

각 서열의 특정 위치 또는 잔기의 넘버링은 사용된 특정 단백질 및 넘버링 체계에 따라 달라지는 것으로 이해될 것이다. 넘버링은 성숙한 단백질의 전구체와 성숙한 단백질 자체에서 다를 수 있으며 종마다 서열의 차이가 넘버링에 영향을 줄 수 있다. 당업자는 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어 서열 정렬 및 상동 잔기의 결정에 의해 임의의 상동성 단백질 및 각각의 코딩 핵산 내의 각각의 잔기를 확인할 수 있을 것이다.

본 명세서에 개시된 바와 같이 Cas9 도메인 및 사이티딘 또는 아데노신 데아미나아제를 포함하는 임의의 융합 단백질을 표적 부위, 예를 들어 돌연변이를 포함하는 부위에 표적화하는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 편집된 경우 일반적으로 가이드 RNA(예: sgRNA)와 함께 융합 단백질을 공동 발현하는 것이 필요하다. 본원의 다른 곳에서 더 자세히 설명된 바와 같이, 가이드 RNA는 일반적으로 Cas9 결합을 허용하는 tracrRNA 프레임워크, 및 Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질에 서열 특이성을 부여하는 가이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 가이드 RNA 및 tracrRNA는 2개의 핵산 분자로서 별도로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 구조를 포함하고, 여기서 가이드 서열은 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 가이드 서열의 길이는 일반적으로 20개 뉴클레오티드이다. Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특정 게놈 표적 부위에 표적화하기 위한 적합한 가이드 RNA의 서열은 본 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 적합한 가이드 RNA 서열은 전형적으로 편집될 표적 뉴클레오티드의 상류 또는 하류 50개 뉴클레오티드 내의 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 제공된 임의의 융합 단백질을 특정 표적 서열에 표적화하는데 적합한 일부 예시적인 가이드 RNA 서열이 본원에 제공된다.

염기 편집기 효율

일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법의 목적은 유전자 편집을 통해 유전자 및/또는 유전자 생성물을 변경하는 것이다. 핵염기 편집 단백질은 in vitro 또는 in vivo에서 유전자 편집-기반 인간 치료제로 사용될 수 있다. 본원에 제공된 핵염기 편집 단백질, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인(예를 들어, Cas9) 및 핵염기 편집 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나아제 도메인 또는 사이티딘 데아미나아제 도메인)을 포함하는 융합 단백질은 A에서 G로의 또는 C에서 T로의 뉴클레오티드를 편집하기 위해 사용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 자기-불활성화 염기 편집기이며, 여기서 불활성화는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 인트론을 편집함으로써 유도된다.

유리하게도, 본원에 제공된 바와 같은 염기 편집 시스템은, CRISPR가 할 수 있는 것처럼, 이중-가닥 DNA 절단을 생성하지 않고, 공여체 DNA 주형을 필요로 하지 않고, 그리고 과잉의 확률적 삽입 및 결실을 유도하지 않고, 게놈 편집을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 유의한 수의 의도되지 않은 돌연변이, 예컨대 의도되지 않은 점 돌연변이를 생성하지 않으면서, 의도된 돌연변이, 예를 들어 핵산(예를 들어, 대상체의 게놈 내 핵산)내의 종결 코돈을 효율적으로 생성하는 염기 편집기를 제공한다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 의도된 돌연변이를 생성하도록 특이적으로 설계된 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)에 결합된 특이적 염기 편집기(예를 들어, 아데노신 염기 편집기 또는 사이티딘 염기 편집기)에 의해 생성되는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 질환 또는 장애와 연관된 표적 항원과 연관된 유전자이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 질환 또는 장애와 연관된 표적 항원과 연관된 유전자에서 아데닌(A)에서 구아닌(G)으로의 점 돌연변이(예를 들어, SNP)이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 코딩 영역 또는 비-코딩 영역(예를 들어, 조절 영역 또는 요소) 내의 아데닌 (A)에서 구아닌 (G)으로의 점 돌연변이이다.

일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 질병 또는 장애와 관련된 표적 항원과 관련된 유전자의 사이토신(C)에서 티민(T)으로의 점 돌연변이(예를 들어, SNP)이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 코딩 영역 또는 비코딩 영역(예를 들어, 조절 영역 또는 요소) 내의 사이토신(C)에서 티민(T)으로의 점 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 종결 코돈, 예를 들어 유전자의 코딩 영역 내의 조기 종결 코돈을 생성하는 점 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 종결 코돈을 제거하는 돌연변이이다.

일부 구현예에서, 의도된 편집은 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론에 있다. 일부 구현예에서, 의도된 편집은 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위에 있다. 일부 구현예에서, 의도된 편집은 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론에 있는 아데닌(A)에서 구아닌(G)으로의 점 돌연변이(예를 들어, SNP)이다. 일부 구현예에서, 의도된 편집은 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위 내의 아데닌(A)에서 구아닌(G)으로의 점 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 편집은 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론에 있는 사이토신(C)에서 티민(T)으로의 점 돌연변이(예: SNP)이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위 내의 사이토신(C)에서 티민(T)으로의 점 돌연변이이다.

본 발명의 염기 편집기는 유리하게는 유의한 비율의 인델을 생성하지 않으면서 단백질을 암호화하는 특이적 뉴클레오티드 염기를 변형시킨다. 본원에서 사용된 바와 같은 "인델"은 핵산 내의 뉴클레오티드 염기의 삽입 또는 결실을 지칭한다. 이러한 삽입 또는 결실은 유전자의 코딩 영역 내에서 프레임 시프트 돌연변이를 야기할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 내에 많은 수의 삽입 또는 결실(즉, 인델)을 생성함이 없이, 핵산 내의 특이적 뉴클레오티드를 효율적으로 변형(예를 들어, 돌연변이)하는 염기 편집기를 생성하는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 핵산 내에 많은 수의 삽입 또는 결실(즉, 인델)을 생성함이 없이, 핵산 내의 특이적 뉴클레오티드를 효율적으로 변형(예를 들어, 돌연변이 또는 메틸화)하는 염기 편집기를 생성하는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 인델에 대해 의도된 변형(예를 들어, 메틸화)을 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 인델에 대해 더 큰 비율의 의도된 변형(예를 들어, 돌연변이)을 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 1:1 초과의 의도된 돌연변이 대 인델의 비율(즉, 의도된 점 돌연변이:의도되지 않은 점 돌연변이)를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 2.5:1, 적어도 3:1, 적어도 3.5:1, 적어도 4:1, 적어도 4.5:1, 적어도 5:1, 적어도 5.5:1, 적어도 6:1, 적어도 6.5:1, 적어도 7:1, 적어도 7.5:1, 적어도 8:1, 적어도 10:1, 적어도 12:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 40:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 200:1, 적어도 300:1, 적어도 400:1, 적어도 500:1, 적어도 600:1, 적어도 700:1, 적어도 800:1, 적어도 900:1, 또는 적어도 1000:1 이상인 의도된 돌연변이 대 인델의 비율을 생성할 수 있다. 의도된 돌연변이 및 인델의 수는 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 핵산의 영역에서 인델의 형성을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, 영역은 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오티드 또는 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오티드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 뉴클레오티드 내의 영역에 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 핵산 영역에서 인델의 형성을 1% 미만, 1.5% 미만, 2% 미만, 2.5% 미만, 3% 미만, 3.5% 미만, 4% 미만, 4.5% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 또는 20% 미만으로 제한할 수 있다. 핵산 영역에서 형성된 인델의 수는 핵산(예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)이 염기 편집기에 노출된 시간의 양에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 인델의 임의의 수 또는 비율은 핵산(예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)을 염기 편집기에 노출시키고 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 적어도 6 시간, 적어도 12 시간, 적어도 24 시간, 적어도 36 시간, 적어도 48 시간, 적어도 3 일, 적어도 4 일, 적어도 5 일, 적어도 7 일, 적어도 10 일, 또는 적어도 14 일 후에 결정된다.

본 개시내용의 일부 양태는 본원에 제공된 임의의 염기 편집기가 상당한 수의 의도되지 않은 돌연변이를 생성하지 않고 핵산(예를 들어, 대상체의 게놈 내의 핵산)에서 의도된 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있다는 인식에 기초한다(예를 들어, 허위 오프-타겟 편집 또는 방관자 편집). 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 의도된 돌연변이를 생성하도록 특이적으로 설계된, gRNA에 결합된 특이적 염기 편집기에 의해 생성되는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 종결 코돈, 예를 들어 유전자의 코딩 영역 내의 조기 종결 코돈을 생성하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 종결 코돈을 제거하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 스플라이싱을 변경하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 의도된 돌연변이는 유전자(예를 들어, 유전자 프로모터 또는 유전자 억제자)의 조절 서열을 변경시키는 돌연변이이다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 1:1 초과의 의도된 돌연변이 대 의도되지 않은 돌연변이의 비율(예를 들어, 의도된 돌연변이: 의도되지 않은 돌연변이)를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 2.5:1, 적어도 3:1, 적어도 3.5:1, 적어도 4:1, 적어도 4.5:1, 적어도 5:1, 적어도 5.5:1, 적어도 6:1, 적어도 6.5:1, 적어도 7:1, 적어도 7.5:1, 적어도 8:1, 적어도 10:1, 적어도 12:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 40:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 150:1, 적어도 200:1, 적어도 250:1, 적어도 500:1, 또는 적어도 1000:1 이상인 의도된 돌연변이 대 의도되지 않은 돌연변이의 비율을 생성할 수 있다. 본원에 기재된 염기 편집기의 특징은 임의의 융합 단백질, 또는 본원에 제공된 융합 단백질을 사용하는 방법에 적용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

염기 편집은 종종 유전 변형, 유전자 변형 및 핵산 서열의 변형과 같은 "변형"으로 지칭되며, 변형은 염기 편집 변형이라는 문맥에 기초하여 명백하게 이해될 수 있다. 따라서, 염기 편집 변형은 예를 들어, 본 개시내용 전반에 걸쳐 논의된 데아미나아제 활성의 결과로서 뉴클레오티드 염기 수준에서의 변형이며, 이는 이어서 유전자 서열의 변화를 초래하고, 유전자 생성물에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본질적으로, 본원에 기재된 유전자 편집 변형은 구조적으로 및/또는 기능적으로 유전자의 변형을 초래할 수 있으며, 여기서 유전자 생성물의 발현은 변형될 수 있고, 예를 들어, 유전자의 발현은 녹아웃되거나; 또는 반대로, 향상되거나, 또는 일부 상황에서는, 유전자 기능 또는 활성이 변형될 수 있다. 본원에 개시된 방법을 사용하여, 염기 편집 효율은 염기 편집이 수행되는 유전자의 녹다운 효율로서 결정될 수 있으며, 여기서 염기 편집은 유전자의 발현을 녹다운하도록 의도된다. 녹다운 수준은 임의의 검출 검정, 예컨대 단백질 발현 수준에 대한 검정, 예를 들어 유세포 분석; RNA 발현을 검출하기 위한 검정, 예컨대 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 또는 임의의 다른 적합한 검정, 예컨대 파이로시퀀싱에 의해 발현 수준을 결정함으로써 정량적으로 검증될 수 있고; 뉴클레오티드 시퀀싱 반응에 의해 질적으로 검증될 수 있다.

일부 구현예에서, 변형, 예를 들어 단일 염기 편집은 유전자 표적 발현의 적어도 10% 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 유전자 표적화 발현의 적어도 10% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 유전자 표적 발현의 적어도 20% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 유전자 표적화 발현의 적어도 30% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 유전자 표적 발현의 적어도 40% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 유전자 표적 발현의 적어도 50% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 60% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 70% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 80% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 90% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 91% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 92% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 93% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 94% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 95% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 96% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 97% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 98% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적 유전자 발현의 적어도 99% 감소를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 표적화되는 유전자의 녹아웃(유전자 발현의 100% 녹다운)을 초래할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 또는 0.01% 미만의 인델 형성을 초래한다.

일부 구현예에서, 표적화된 변형, 예를 들어 단일 염기 편집은 상이한 가이드 RNA를 사용한 염기 편집을 위해 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 상이한 내인성 서열을 동시에 표적화하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 표적화된 변형, 예를 들어 단일 염기 편집은 상이한 가이드 RNA를 사용한 염기 편집을 위해 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 50개 이상의 상이한 내인성 유전자 서열을 순차적으로 표적화하는데 사용된다.

본 개시내용의 일부 양태는 본원에 제공된 임의의 염기 편집기가 유의한 수의 의도되지 않은 돌연변이, 예컨대 의도되지 않은 점 돌연변이(즉, 방관자의 돌연변이)를 생성하지 않고 핵산(예를 들어, 대상체의 게놈 내 핵산)에서 점 돌연변이와 같은 의도된 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있다는 인식에 기초한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 적어도 0.01%의 의도된 돌연변이(즉, 적어도 0.01% 염기 편집 효율)를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 염기 편집기는 의도된 돌연변이의 적어도 0.01%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%를 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 또는 0.01% 미만의 인델 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 0.8% 미만의 인델 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 최대 0.8% 인델 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 0.3% 미만의 인델 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템에 비해 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 더 낮은 인델 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 더 낮은 인델 형성을 초래한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 인델 빈도가 감소한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 인델 빈도가 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 염기 편집기 시스템은 ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 인델 빈도가 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소한다.

본 발명은 효율 및 특이성이 증가된 아데노신 데아미나아제 변이체(예를 들어, ABE8 변이체)를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 아데노신 데아미나아제 변이체는 폴리뉴클레오티드 내에서 원하는 염기를 편집할 가능성이 높고, 변경되도록 의도되지 않은 염기(예를 들어, "방관자")를 편집할 가능성이 적다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 방관자 편집 또는 돌연변이가 감소된다. 일부 구현예에서, 의도되지 않은 편집 또는 돌연변이는 방관자 돌연변이 또는 방관자 편집, 예를 들어, 표적 뉴클레오티드 서열의 표적 창에서 의도되지 않은 또는 비-표적 위치의 표적 염기(예를 들어, A 또는 C)의 염기 편집이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 방관자 편집 또는 돌연변이가 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 방관자 편집 또는 돌연변이가 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 방관자 편집 또는 돌연변이가 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 또는 적어도 3.0 배까지 감소된다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 허위 편집이 감소된다. 일부 구현예에서, 의도되지 않은 편집 또는 돌연변이는 허위 돌연변이 또는 허위 편집, 예를 들어, 게놈의 의도되지 않은 또는 비-표적 영역에서 표적 염기(예를 들어, A 또는 C)의 비-특이적 편집 또는 가이드 독립적 편집이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템에 비해 허위 편집이 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 허위 편집이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집 시스템은 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10을 포함하는 염기 편집기 시스템과 비교하여 허위 편집이 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 또는 적어도 3.0 배까지 감소된다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 염기 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 염기 편집 효율은 세포의 집단에서 편집된 핵염기의 백분율을 계산함으로서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 세포의 집단에서 편집된 핵염기에 의해 측정된 바와 같이 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 염기 편집 효율을 갖는다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기와 비교하여 염기 편집 효율이 더 높다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 염기 편집 효율이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 더 높다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 염기 편집 효율이 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 적어도 3.0 배, 적어도 3.1 배, 적어도 3.2, 적어도 3.3 배, 적어도 3.4 배, 적어도 3.5 배, 적어도 3.6 배, 적어도 3.7 배, 적어도 3.8 배, 적어도 3.9 배, 적어도 4.0 배, 적어도 4.1 배, 적어도 4.2 배, 적어도 4.3 배, 적어도 4.4 배, 적어도 4.5 배, 적어도 4.6 배, 적어도 4.7 배, 적어도 4.8 배, 적어도 4.9 배, 또는 적어도 5.0 배 더 높다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 온-타겟 염기 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 세포의 집단에서 편집된 표적 핵염기에 의해 측정된 바와 같이 적어도 0.01%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 온-타겟 염기 편집 효율을 갖는다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기와 비교하여 온-타겟 염기 편집 효율이 더 높다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 온-타겟 염기 편집 효율이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 더 높다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 ABE7 염기 편집기, 예를 들어, ABE7.10과 비교하여 온-타겟 염기 편집 효율이 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 적어도 3.0 배, 적어도 3.1 배, 적어도 3.2 배, 적어도 3.3 배, 적어도 3.4 배, 적어도 3.5 배, 적어도 3.6 배, 적어도 3.7 배, 적어도 3.8 배, 적어도 3.9 배, 적어도 4.0 배, 적어도 4.1 배, 적어도 4.2 배, 적어도 4.3 배, 적어도 4.4 배, 적어도 4.5 배, 적어도 4.6 배, 적어도 4.7 배, 적어도 4.8 배, 적어도 4.9 배, 또는 적어도 5.0 배 더 높다.

본원에 기재된 ABE 염기 편집기 변이체는 플라스미드, 벡터, LNP 복합체, 또는 mRNA를 통해 호스트 세포로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 mRNA로서 호스트 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 기반 전달 시스템, 예를 들어, mRNA를 통해 전달된 ABE8 염기 편집기는 편집된 핵염기에 의해 측정된 바와 같이 적어도 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 온-타겟 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 시스템에 의해 전달된 ABE8 염기 편집기는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달된 ABE8 염기 편집기와 비교하여 염기 편집 효율이 더 높다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300% 이상, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 온-타겟 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 적어도 3.0 배, 적어도 3.1 배, 적어도 3.2 배, 적어도 3.3 배, 적어도 3.4 배, 적어도 3.5 배, 적어도 3.6 배, 적어도 3.7 배, 적어도 3.8 배, 적어도 3.9 배, 적어도 4.0 배, 적어도 4.1 배, 적어도 4.2 배, 적어도 4.3 배, 적어도 4.4 배, 적어도 4.5 배, 적어도 4.6 배, 적어도 4.7 배, 적어도 4.8 배, 적어도 4.9 배, 또는 적어도 5.0 배 더 높은 온-타겟 편집 효율을 갖는다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 임의의 염기 편집기 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 또는 0.01% 미만의 오프-타겟 편집을 초래한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드된 오프-타겟 편집 효율이 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드된 오프-타겟 편집 효율이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드된 편집의 효율이 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 또는 적어도 3.0 배 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드된 오프-타겟 편집 효율이 적어도 약 2.2 배 감소한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드-독립적 오프-타겟 편집 효율이 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드-독립적 오프-타겟 편집 효율이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드-독립적 오프-타겟 편집 효율이 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.6 배, 적어도 1.7 배, 적어도 1.8 배, 적어도 1.9 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.1 배, 적어도 2.2 배, 적어도 2.3 배, 적어도 2.4 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.6 배, 적어도 2.7 배, 적어도 2.8 배, 적어도 2.9 배, 적어도 3.0 배, 적어도 5.0 배, 적어도 10.0 배, 적어도 20.0 배, 적어도 50.0 배, 적어도 70.0 배, 적어도 100.0 배, 적어도 120.0 배, 적어도 130.0 배, 또는 적어도 150.0 배 더 낮다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체는 플라스미드 또는 벡터 시스템에 의해 전달될 때와 비교하여 mRNA 시스템에 의해 전달될 때 가이드-독립적 오프-타겟 편집 효율(예를 들어, 허위 RNA 탈아미노화)이 134.0 배 감소한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE 염기 편집기 변이체는 게놈에 걸쳐 가이드-독립적 돌연변이율을 증가시키지 않는다.

일부 구현예에서, 단일 유전자 전달 이벤트(예를 들어, 형질도입, 형질감염, 전기천공 또는 임의의 다른 방법에 의함)는 세포의 게놈 내의 5개의 서열의 염기 편집을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 유전자 전달 이벤트는 세포의 게놈 내의 6개의 서열의 염기 편집을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 유전자 전달 이벤트는 세포의 게놈 내의 7개의 서열의 염기 편집을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 전기천공 이벤트는 세포의 게놈 내의 8개의 서열의 염기 편집을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 유전자 전달 이벤트는 세포의 게놈 내의 9개의 서열의 염기 편집을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 유전자 전달 이벤트는 세포의 게놈 내의 10개의 서열의 염기 편집을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 유전자 전달 이벤트는 세포의 게놈 내의 20개의 서열의 염기 편집을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 유전자 전달 이벤트는 세포의 게놈 내의 30개의 서열의 염기 편집을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 유전자 전달 이벤트는 세포의 게놈 내의 40개의 서열의 염기 편집을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 유전자 전달 이벤트는 세포의 게놈 내의 50개의 서열의 염기 편집을 표적화하는 데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법, 예를 들어, 염기 편집 방법은 오프-타겟 효과가 최소 내지 전혀 없다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 적어도 50%의 성공적으로 편집된 세포 집단(즉, 성공적으로 조작된 세포)을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 적어도 55%의 성공적으로 편집된 세포 집단을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 적어도 60%의 성공적으로 편집된 세포 집단을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 적어도 65%의 성공적으로 편집된 세포 집단을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 적어도 70%의 성공적으로 편집된 세포 집단을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 적어도 75%의 성공적으로 편집된 세포 집단을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 적어도 80%의 성공적으로 편집된 세포 집단을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 적어도 85%의 성공적으로 편집된 세포 집단을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 적어도 90%의 성공적으로 편집된 세포 집단을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 적어도 95%의 성공적으로 편집된 세포 집단을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 염기 편집 방법은 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 성공적으로 편집된 세포 집단을 초래한다.

일부 구현예에서, 염기 편집 개입 후의 살아있는 세포 회수율은 염기 편집 이벤트 시에 출발 세포 집단의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%보다 더 크다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 살아있는 세포 회수율은 약 70%이다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 살아있는 세포 회수율은 약 75%이다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 살아있는 세포 회수율은 약 80%이다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 살아있는 세포 회수율은 약 85%이다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 살아있는 세포 회수율은 염기 편집 이벤트 시에 집단 내의 세포의 약 90%, 또는 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100%이다.

일부 구현예에서, 조작된 세포 집단은 시험관내에서 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배 또는 약 100배 추가로 확장될 수 있다.

의도된 돌연변이 및 인델의 수는 예를 들어, 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381(WO2018/027078) 및 PCT/US2016/058344(WO2017/070632); Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)에 기재된 바와 같이, 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있으며; 상기 문헌의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 인델 빈도를 계산하기 위해, 인델이 발생할 수 있는 창의 양쪽 측면을 플랭킹하는 2 개의 10-bp 서열에 대한 정확한 일치에 대해 서열분석 판독물이 스캐닝된다. 정확한 일치가 위치하지 않는 경우, 판독물은 분석에서 제외된다. 이 인델 윈도우의 길이가 참조 서열과 정확히 일치하는 경우 판독물은 인델을 함유하지 않는 것으로 분류된다. 인델 윈도우가 참조 서열 보다 더 길거나 또는 더 짧은 2 개 이상의 염기인 경우, 서열분석 판독물은 각각 삽입 또는 결실로 분류된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기는 핵산 영역에서 인델의 형성을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, 영역은 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오티드 또는 염기 편집기에 의해 표적화된 뉴클레오티드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 뉴클레오티드 내의 영역에 있다.

표적 뉴클레오티드 영역에서 형성된 인델의 수는 핵산(예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)이 염기 편집기에 노출된 시간의 양에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 인델의 수 또는 비율은 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 세포의 게놈 내 핵산)을 염기 편집기에 노출시키고 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 10일, 또는 적어도 14일 후에 결정된다. 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기의 특징은 임의의 융합 단백질, 또는 본원에 제공된 융합 단백질의 사용 방법에 적용될 수 있음이 이해되어야 한다.

염기 편집기 효율에 대한 상세한 설명은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381 (WO 2018/027078) 및 PCT/US2016/058344 (WO 2017/070632)에 기재되어 있으며, 이의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, Komor, A.C., 등, "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, "Programmable base editing of AㆍT to GㆍC in genomic DNA without DNA cleavage" Nature 551, 464-471 (2017); 및 Komor, A.C., 등, "Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity" Science Advances 3:eaao4774 (2017)을 참조한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 하나 이상의 유전자에서 복수의 핵염기 쌍을 편집하는 것은 적어도 하나의 의도된 돌연변이의 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 의도된 돌연변이의 상기 형성은 유전자의 정상 기능 파괴를 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 의도된 돌연변이 결과의 상기 형성은 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현을 감소시키거나 제거한다. 멀티플렉스 편집은 본원에 제공된 임의의 방법 또는 방법의 조합을 사용하여 달성될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

멀티플렉스 편집

일부 구현예에서, 본원에 제공된 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서 복수의 핵염기 쌍을 멀티플렉스 편집할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 핵염기 쌍은 동일한 유전자 또는 하나 이상의 유전자에 위치하며, 여기서 적어도 하나의 유전자는 상이한 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 단일 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 가이드 폴리뉴클레오티드가 있는 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 단일 염기 편집기 시스템이 있는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하거나 또는 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 편집은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드 및 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드의 믹스를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 염기 편집기를 사용한 멀티플렉스 편집의 특징은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용하는 방법의 임의의 조합에 적용될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 염기 편집기를 사용한 멀티플렉스 편집은 복수의 핵염기 쌍의 순차적 편집을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.

일부 구현예에서, 복수의 핵염기 쌍은 하나 이상의 유전자에 있다. 일부 구현예에서, 복수의 핵염기 쌍은 동일한 유전자에 있다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 유전자 중 적어도 하나의 유전자는 상이한 유전자좌에 위치한다.

일부 구현예에서, 편집은 적어도 하나의 단백질 코딩 영역에서 복수의 핵염기 쌍의 편집이다. 일부 구현예에서, 편집은 적어도 하나의 단백질 비-코딩 영역에서 복수의 핵염기 쌍의 편집이다. 일부 구현예에서, 편집은 적어도 하나의 단백질 코딩 영역 및 적어도 하나의 단백질 비-코딩 영역에서 복수의 핵염기 쌍의 편집이다.

일부 구현예에서, 편집은 최소 하나의 단백질 코딩 영역, 적어도 하나의 단백질 비코딩 영역, 또는 적어도 하나의 단백질 코딩 영역 및 적어도 하나의 단백질 비코딩 영역에서 복수의 핵염기 쌍을 편집하는 것이다.

일부 구현예에서, 편집은 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드와 함께 이루어진다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템은 단일 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 가이드 폴리뉴클레오티드와 함께 하나 이상의 염기 편집기 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 편집은 단일 염기 편집기 시스템이 있는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드와 함께 이루어진다. 일부 구현예에서, 편집은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드와 함께 이루어지거나, 또는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하지 않는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드 및 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합을 표적화하기 위해 PAM 서열을 필요로 하는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드의 믹스와 함께 이루어진다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 염기 편집기를 사용한 멀티플렉스 편집의 특징은 본원에 제공된 임의의 염기 편집기를 사용하는 방법의 임의의 조합에 적용될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 편집은 복수의 핵염기 쌍의 순차적 편집을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.

일부 구현예에 있어서, 하나 이상의 유전자 내의 복수의 핵염기 쌍의 멀티플렉스 편집이 가능한 염기 편집기 시스템은 ABE7, ABE8, 및/또는 ABE9 염기 편집기 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집이 가능한 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집이 가능한 염기 편집기 시스템에 비해 더 높은 멀티플렉스 편집 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집이 가능한 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집이 가능한 염기 편집기 시스템과 비교하여 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300% 더 높은, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 적어도 400%, 적어도 450%, 또는 적어도 500% 더 높은 멀티플렉스 편집의 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ABE8 염기 편집기 변이체 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집이 가능한 염기 편집기 시스템은 ABE7 염기 편집기 중 하나를 포함하는 멀티플렉스 편집이 가능한 염기 편집기 시스템과 비교하여 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 적어도 3.0배, 적어도 3.1배, 적어도 3.2배, 적어도 3.3배, 적어도 3.4배, 적어도 3.5배, 적어도 4.0배, 적어도 4.5배, 적어도 5.0배, 적어도 5.5배, 또는 적어도 6.0배 더 높은 멀티플렉스 편집 효율을 갖는다.

전달 시스템

폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 유전자 또는 인트론)에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 표적화하는 핵염기 편집기의 적합성은 본원에 기술된 바와 같이 평가된다. 일 구현예에서, 관심 단일 세포는 리포터(예를 들어, GFP)를 코딩하는 소량의 벡터와 함께 본원에 기술된 염기 편집 시스템을 코딩하는 핵산 분자 또는 분자들로 형질감염, 형질도입 또는 달리 변형된다. 이들 세포는 당업계에 공지된 임의의 세포주(예를 들어, HEK293T 세포)일 수 있다. 대안적으로, 일차 세포(예를 들어, 인간)가 사용될 수 있다. 세포는 조직 생검, 수술, 혈액, 혈장, 혈청 또는 기타 생물학적 체액 등을 통해 피험자 또는 개인으로부터 얻을 수도 있다. 그러한 세포는 최종 세포 표적과 관련될 수 있다.

전달은 바이러스 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 형질감염은 지질 형질감염(예를 들어, 리포펙타민(Lipofectamine) 또는 퓨진(Fugene))을 사용하거나 전기천공에 의해 수행될 수 있다. 형질감염 후 리포터(예: GFP)의 발현은 형광 현미경이나 유세포 분석을 통해 결정되어 일관되고 높은 수준의 형질감염을 확인할 수 있다. 이러한 예비 형질감염은 다양한 핵염기 편집기로 구성되어 어떤 편집기 조합이 가장 큰 활성을 제공하는지 결정할 수 있다. 시스템은 하나 이상의 서로 다른 벡터를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 염기 편집기는 원하는 세포 유형, 우선적으로 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 인간 세포의 발현을 위해 코돈 최적화된다.

핵염기 편집기의 활성은 본원에 기술된 바와 같이, 즉 표적 서열의 변경을 검출하기 위해 세포의 게놈을 서열분석함으로써 평가된다. Sanger 시퀀싱의 경우 정제된 PCR 앰플리콘은 플라스미드 백본에 클로닝되고, 변형되고, 미니프렙되고 단일 프라이머로 시퀀싱된다. 서열분석은 차세대 서열분석(NGS) 기술을 사용하여 수행될 수도 있다. 차세대 시퀀싱을 사용하는 경우 앰플리콘은 의도된 절단 부위가 비대칭으로 배치된 300-500bp일 수 있다. PCR 후에는 처리량이 많은 시퀀싱(예: Illumina MiSeq에서)에 사용하기 위해 차세대 시퀀싱 어댑터 및 바코드(예: Illumina 멀티플렉스 어댑터 및 인덱스)를 앰플리콘 끝에 추가할 수 있다. 초기 테스트에서 가장 높은 수준의 표적 특이적 변경을 유도하는 융합 단백질을 선택하여 추가 평가를 수행할 수 있다.

특정 구현예에서, 핵염기 편집기는 관심 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 데 사용된다. 일 구현예에서, 본 발명의 핵염기 편집기는 세포의 게놈 내에서 하나 이상의 관심 핵산 서열을 표적화하여 표적 유전자(들)를 변경시키는 데 사용되는 하나 이상의 가이드 RNA와 함께 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 하나 이상의 관심 유전자의 서열에 하나 이상의 편집물을 도입하기 위해 하나 이상의 가이드 RNA에 의해 표적화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 관심 유전자의 서열에 대한 하나 이상의 편집은 호스트 세포에서 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현을 감소시키거나 제거한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 관심 유전자에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질의 발현은 호스트 세포에서 완전히 녹아웃되거나 제거된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 핵염기 편집기 또는 핵염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 이종성 인트론을 표적화하는 하나 이상의 가이드 RNA와 함께 세포(예를 들어, 호스트 세포)에 전달되고, 이로써 표적 인트론(예: 스플라이스 수용체, 스플라이스 공여체 부위)을 변경한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열에 대한 하나 이상의 편집은 염기 편집 활성의 발현, 활성 또는 수준을 감소시키거나 제거한다.

일부 구현예에서, 호스트 세포는 박테리아 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 인간 세포 또는 포유동물 세포로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 호스트 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 호스트 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관 내(in vitro)에 있다. 일부 구현예에서, 세포는 생체 내(in vivo)에 있다.

염기 편집기 시스템의 핵산-기반 전달

본 개시내용에 따른 염기 편집기 시스템을 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 방법 또는 본원에 기재된 바와 같이 시험관내 또는 생체내에서 대상체에게 투여되거나 세포 내로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 핵산 분자에는 세포 내 염기 편집기의 수준, 발현 또는 활성을 감소시키기 위해 편집될 수 있는 인트론이 포함된다. 예를 들어, 데아미나아제(예를 들어, 사이티딘 또는 아데닌 데아미나아제)를 포함하는 염기 편집기 시스템은 벡터(예를 들어, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터)에 의해, 또는 네이키드 DNA, DNA 복합체, 지질 나노입자, 또는 상기 언급된 조성물의 조합에 의해 전달될 수 있다.

유기 또는 무기일 수 있는 나노입자는 염기 편집기 시스템 또는 이의 구성요소를 전달하는 데 유용하다. 나노입자는 당업계에 널리 공지되어 있고, 임의의 적합한 나노입자가 염기 편집기 시스템 또는 이의 구성요소, 또는 이러한 구성요소를 암호화하는 핵산 분자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일 예에서, 유기(예를 들어, 지질 및/또는 중합체) 나노입자는 본 개시내용의 특정 구현예에서 전달 비히클로서 사용하기에 적합하다.

나노입자 제형 및/또는 유전자 전달에 사용하기 위한 예시적인 지질은 표 16(하기)에 나타낸다.

표 16

표 17은 유전자 전달 및/또는 나노입자 제형에 사용하기 위한 예시적인 중합체를 열거한다.

표 17

표 18은 본원에 기재된 융합 단백질을 임호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 전달 방법을 요약한다.

표 18

또 다른 양태에서, 염기 편집기 시스템 구성요소 또는 이러한 구성요소를 코딩하는 핵산, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인(예, Cas9), 예를 들어 Cas9 또는 이의 변이체, 및 관심 핵산 서열을 표적화하는 gRNA의 전달은 리보뉴클레오단백질(RNP)를 세포에 전달함으로써 달성될 수 있다. RNP는 표적화 gRNA와의 복합체에 폴리뉴클레오티드 프로그래밍 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인(예, Cas9)을 포함한다. RNP 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 전기천공법, 뉴클레오펙션, 또는 예를 들어, 전체 내용이 참조로 포함되어 있는 Zuris, J.A. 등, 2015, Nat. Biotechnology, 33(1):73-80에 보고된 바와 같은 양이온성 지질-매개 방법과 같은 공지된 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. RNP는 CRISPR 염기 편집 시스템, 특히 1차 세포와 같이 형질감염이 어려운 세포에 사용하기에 유리하다. 게다가, RNP는 또한 특히 CRISPR 플라스미드에 사용될 수 있는 진핵생물 프로모터, 예를 들어, CMV 또는 EF1A가 잘 발현되지 않을 때, 세포에서 단백질 발현과 함께 발생할 수 있는 어려움을 완화할 수 있다. 유리하게는, RNP의 사용은 외래 DNA의 세포 내로의 전달을 필요로 하지 않는다.　더욱이, 핵산 결합 단백질 및 gRNA 복합체를 포함하는 RNP는 시간 경과에 따라 분해되기 때문에, RNP의 사용은 오프-타겟 효과를 제한할 가능성이 있다. 플라스미드 기반 기술과 유사한 방식으로, RNP를 사용하여 결합 단백질(예를 들어, Cas9 변이체)을 전달하고 상동성 지정 복구(HDR)를 지시할 수 있다.

염기 편집기 시스템을 코딩하는 핵산 분자는 예를 들어 형질감염 또는 전기천공을 통해 네이키드 DNA 또는 RNA로 세포에 직접 전달될 수 있거나 표적 세포의 흡수를 촉진하는 분자(예: N-아세틸갈락토사민)에 접합될 수 있다. 염기 편집기 시스템 및/또는 해당 구성요소를 코딩하는 벡터도 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 염기 편집기 시스템 또는 이의 기능적 구성요소를 코딩하는 mRNA는 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 가이드 RNA와 공동-전기천공될 수 있다.

핵산 벡터는 본원에 기술된 융합 단백질의 도메인을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 핵 국소화 신호, 핵소체 국소화 신호 또는 미토콘드리아 국소화 신호에 작동 가능하게 연결된 염기 편집기 시스템의 단백질 구성요소를 코딩할 수 있다. 한 예로서, 벡터는 하나 이상의 핵 국소화 서열(예를 들어, SV40으로부터의 핵 국소화 서열) 및 하나 이상의 데아미나아제를 포함하는 Cas9 코딩 서열을 포함할 수 있다.

벡터는 또한 임의의 적합한 수의 조절/제어 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, Kozak 공통 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함할 수 있다. 이들 요소는 당해 분야에 잘 알려져 있다.

본 개시내용에 따른 벡터는 재조합 바이러스 벡터를 포함한다. 예시적인 바이러스 벡터는 상기에 제시되어 있다. 당업계에 공지된 다른 바이러스 벡터도 사용될 수 있다. 또한 바이러스 입자를 사용하여 염기 편집기 시스템 구성요소를 핵산 및/또는 단백질 형태로 전달할 수 있다. 예를 들어, "빈" 바이러스 입자를 조립하여 염기 편집기 시스템이나 구성요소를 화물로 포함할 수 있다. 바이러스 벡터와 바이러스 입자는 표적 조직 특이성을 변경하기 위해 표적 리간드를 혼입하도록 조작될 수도 있다.

본 명세서에 기술된 벡터는 베이스 편집기 시스템 또는 그 구성요소의 발현을 구동하기 위한 조절 요소를 포함할 수 있다. 이러한 벡터에는 역위 긴 말단 반복부(AAV ITR)가 있는 아데노 관련 바이러스가 포함된다. AAV ITR의 사용은 벡터에서 공간을 차지할 수 있는 추가적인 프로모터 요소에 대한 필요성을 제거하는 데 유리할 수 있다. 확보된 추가적인 공간은 가이드 핵산 또는 선택가능한 마커와 같은 추가적인 요소의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. ITR 활성은 과발현으로 인한 잠재적인 독성을 감소시키는 데 사용될 수 있다.

임의의 적합한 프로모터는 염기 편집기 시스템 또는 이의 구성요소 및, 적절한 경우, 가이드 핵산의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. 보편적인 발현을 위해, 프로모터는 CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, 페리틴(Ferritin) 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 뇌 또는 다른 CNS 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: 모든 뉴런의 경우 SynapsinI, 흥분성 뉴런의 경우 CaMKII알파, GABA성 뉴런의 경우 GAD67 또는 GAD65 또는 VGAT. 간 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 알부민 프로모터를 포함한다. 폐 세포 발현의 경우, 적합한 프로모터는 SP-B를 포함한다. 내피 세포의 경우, 적합한 프로모터는 ICAM을 포함한다. 조혈 세포 발현에 적합한 프로모터는 IFN베타 또는 CD45를 포함한다. 골아세포 발현에 적합한 프로모터는 OG-2를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 염기 편집기 시스템은 별도의 프로모터가 동일한 핵산 분자 내에서 염기 편집기 및 호환성 가이드 핵산의 발현을 구동할 수 있도록 충분히 작은 크기의 것이다. 예를 들면, 벡터 또는 바이러스 벡터는 염기 편집기를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터 및 가이드 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함할 수 있다.

가이드 핵산의 발현을 구동하는 데 사용되는 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: Pol II 프로모터의 U6 또는 H1 사용 같은 Pol III 프로모터 및 gRNA 아데노 연관 바이러스(AAV)를 발현하는 인트론 카세트.

특정 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV), AAV3, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAV10, 및 이의 변이체), 또는 임의의 바이러스 벡터의 적합한 캡시드 단백질에 존재하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 융합 단백질의 바이러스 전달에 관한 것이다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 말로니 뮤린 백혈병 바이러스, MML-V), 아데노바이러스 벡터(예를 들어, AD100), 렌티바이러스 벡터(HIV 및 FIV-기반 벡터), 헤르페스바이러스 벡터(예를 들어, HSV-2)가 포함된다.

바이러스 벡터

본원에 기재된 염기 편집기는 바이러스 벡터와 함께 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 염기 편집기는 바이러스 벡터에 함유된 핵산 상에 암호화될 수 있다. 일부 구현예에서, 염기 편집기 시스템의 하나 이상의 구성요소는 하나 이상의 바이러스 벡터 상에 암호화될 수 있다. 예를 들어, 염기 편집기 및 가이드 핵산은 단일 바이러스 벡터 상에서 암호화될 수 있다. 다른 구현예에서, 염기 편집기 및 가이드 핵산은 상이한 바이러스 벡터 상에 암호화된다. 어느 경우든, 염기 편집기 및 가이드 핵산은 각각 프로모터 및 종결인자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 바이러스 벡터 상에서 암호화되는 구성요소의 조합은 선택된 바이러스 벡터의 카고 크기 제한에 의해 결정될 수 있다.

염기 편집기를 설계하기 위한 개시된 전략은 바이러스 벡터 내로 패키징될 수 있는 염기 편집기를 생성하는 데 유용할 수 있다. 염기 편집기의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 배양물 또는 호스트에서 특이적 세포에 바이러스를 표적화하고 핵 또는 호스트 세포 게놈에 바이러스 페이로드를 수송하는 고도로 진화된 과정의 이점을 취한다. 바이러스 벡터는 배양물, 환자(생체내)에서 세포에 직접적으로 투여될 수 있거나, 또는 시험관내에서 세포를 처리하는 데 사용될 수 있고, 변형된 세포는 임의적으로 환자(생체외)에게 투여될 수 있다. 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 호스트 게놈 내로의 혼입은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하며, 종종 삽입된 이식유전자의 장기간 발현을 초래한다. 추가적으로, 높은 형질도입 효율이 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.

바이러스 벡터는 렌티바이러스(예를 들어, HIV 및 FIV-기반 벡터), 아데노바이러스(예를 들어, AD100), 레트로바이러스 (예를 들어, 말로니 뮤린 백혈병 바이러스, MML-V), 헤르페스바이러스 벡터(예를 들어, HSV-2), 및 아데노-연관 바이러스(AAV), 또는 다른 플라스미드 또는 바이러스 벡터 유형을 사용하여, 특히, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,454,972(아데노바이러스에 대한 제형, 용량), 미국 특허 번호 8,404,658(AAV에 대한 제형, 용량) 및 미국 특허 번호 5,846,946(DNA 플라스미드에 대한 제형, 용량) 및 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스를 수반하는 임상 시험 및 임상 시험에 관한 간행물로부터의 제형 및 용량을 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, AAV의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 번호 8,454,972 및 AAV를 수반하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 아데노바이러스의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 번호 8,404,658 및 아데노바이러스를 수반하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 플라스미드 전달의 경우, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 번호 5,846,946 및 플라스미드를 수반하는 임상 연구에서와 같을 수 있다. 용량은 평균 70 kg 개체(예를 들어 성인 남성)를 기준으로 하거나 이에 추정될 수 있고, 상이한 체중 및 종의 환자, 대상체, 포유동물에 대해 조정될 수 있다. 투여 빈도는 연령, 성별, 일반적인 건강, 환자 또는 대상체의 다른 병태 및 다루어지는 특정 병태 또는 증상을 포함한 일반적 요인에 따라 의사 또는 수의사(예를 들어, 의사, 수의사)의 영역 내에 있다. 바이러스 벡터는 관심 조직 내로 주입될 수 있다. 세포-유형 특이적 염기 편집을 위해, 염기 편집기 및 임의적인 가이드 핵산의 발현은 세포-유형 특이적 프로모터에 의해 구동될 수 있다.

레트로바이러스의 향성은 외래 외피 단백질을 혼입하여, 표적 세포의 잠재적인 표적 집단으로 확장함으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분할 세포를 형질도입하거나 또는 감염시킬 수 있고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 따라서 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 따라 달라질 것이다. 레트로바이러스 벡터는 외래 서열의 최대 6-10 kb에 대한 패키징 용량을 갖는 시스-작용 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스-작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이어서 치료적 유전자를 표적 유전자 내로 혼입하는 데 사용되어 영구적인 이식유전자 발현을 제공한다. 광범위하게 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 시미안 면역 결핍 바이러스(SIV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 및 이의 조합에 기초한 것들을 포함한다(예를 들어, Buchscher 등, J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann 등, J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt 등, Virol. 176:58-59 (1990); Wilson 등, J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller 등, J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700 참조).

레트로바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터는 표적 세포 내로의 효율적인 혼입을 위해 주어진 길이보다 더 작은 폴리뉴클레오티드 서열을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 9 kb 초과 길이의 레트로바이러스 벡터는 더 작은 크기의 것과 비교하여 낮은 바이러스 역가를 초래할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 염기 편집기는 레트로바이러스 벡터를 통해 표적 세포 내로의 효율적인 패키징 및 전달을 가능하게 하기에 충분한 크기이다. 일부 구현예에서, 염기 편집기는 가이드 핵산 및/또는 표적화가능한 뉴클레아제 시스템의 다른 구성요소와 함께 발현될 때조차 효율적인 패키징 및 전달을 허용하기 위한 크기이다.

패키징 세포는 전형적으로 호스트 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는 데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 psi.2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자 내로 패키징하는 세포주를 생산함으로써 생성된다. 벡터는 전형적으로 호스트 내로의 패키징 및 후속 혼입에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 폴리뉴클레오티드(들)에 대한 발현 카세트로 대체된다. 누락 바이러스 기능은 전형적으로 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 아데노-연관 바이러스(“”벡터는 전형적으로 호스트 게놈 내로의 패키징 및 혼입에 필요한 AAV 게놈으로부터 ITR 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap를 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만, ITR 서열이 결여되어 있는 세포주에 패키징될 수 있다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진할 수 있다. 헬퍼 플라스미드는 일부 경우에 ITR 서열의 결여로 인해 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스로의 오염은 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.

일시적 발현이 바람직한 적용에서, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하고 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 사용하여, 높은 역가 및 발현 수준이 수득되었다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 다량으로 생성될 수 있다. AAV 벡터는 또한 예를 들어, 핵산 및 펩티드의 시험관내 생산에서, 그리고 생체내 및 생체외 유전자 요법 절차를 위해 표적 핵산으로 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, West 등, Virology 160:38-47 (1987); 미국 특허 번호 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994) 참조. 재조합 AAV 벡터의 구축은 미국 특허 번호 5,173,414; Tratschin 등, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski 등, J. Virol. 63:03822-3828 (1989)를 포함한 다수의 간행물에 기재되어 있다.

일부 구현예에서, AAV 벡터는 본원에 제공된 바와 같은 염기 편집기 또는 염기 편집기 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 관심 세포를 형질도입하는 데 사용된다. AAV는 파르보바이러스 패밀리에 속하는 작은 단일 가닥 DNA 의존성 바이러스이다. 4.7 kb 야생형 (wt) AAV 게놈은 각각 4개의 복제 단백질 및 3개의 캡시드 단백질을 암호화하는 2개의 유전자로 구성되고, 145-bp 역전 말단 반복부(ITR)에 의해 어느 한 측면에 플랭킹된다. 비리온은 동일한 오픈 리딩 프레임으로부터, 그러나 차동 스플라이싱(Vp1) 및 대체 번역 시작 부위(각각 Vp2 및 Vp3)로부터 1:1:10 비율로 생성된 3개의 캡시드 단백질, Vp1, Vp2 및 Vp3으로 구성된다. Vp3은 비리온에서 가장 풍부한 서브유닛이며 바이러스의 향성을 정의하는 세포 표면에서 수용체 인식에 참여한다. 바이러스 감염성에서 기능하는 포스포리파제 도메인은 Vp1의 고유한 N 말단에서 식별되었다.

wt AAV와 유사하게, 재조합 AAV(rAAV)는 시스-작용 145-bp ITR을 활용하여 벡터 이식유전자 카세트를 플랭킹하여, 외래 DNA의 패키닝을 위해 최대 4.5 kb를 제공한다. 감염 후, rAAV는 본 발명의 융합 단백질을 발현하고 원형 머리-대-꼬리 연쇄체(concatemer)에서 에피솜으로 존재함으로써 호스트 게놈 내로의 혼입 없이 지속될 수 있다. 시험관내 및 생체내에서 이 시스템을 사용한 rAAV 성공의 많은 예가 있지만, 제한된 패키징 용량은 유전자의 코딩 서열의 길이가 wt AAV 게놈의 크기보다 더 크거나 또는 동일할 때 AAV-매개 유전자 전달의 사용을 제한하였다.

바이러스 벡터는 적용에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 생체내 유전자 전달의 경우, AAV는 다른 바이러스 벡터보다 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV는 낮은 독성을 허용하며, 이는 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 세포 입자의 초원심분리를 필요로 하지 않는 정제 방법에 기인할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV는 호스트 게놈에 혼입되지 않기 때문에 삽입 돌연변이생성을 유발할 가능성이 낮다. 아데노바이러스는 통상적으로 이들이 유도하는 강한 면역원성 반응 때문에 백신으로 사용된다. 바이러스 벡터의 패키징 용량은 벡터 내로 패키징될 수 있는 염기 편집기의 크기를 제한할 수 있다.

AAV는 2개의 145개의 염기 역전 말단 반복부(ITR)를 포함하는 약 4.5 Kb 또는 4.75 Kb의 패키징 용량을 갖는다. 이는 개시된 염기 편집기뿐만 아니라 프로모터 및 전사 종결인자가 단일 바이러스 벡터에 적합할 수 있음을 의미한다. 4.5 또는 4.75 Kb 초과의 작제물은 유의하게 감소된 바이러스 생산을 야기할 수 있다. 예를 들어, SpCas9는 매우 크고, 유전자 자체는 4.1 Kb를 초과하며, 이는 AAV 내로 패킹하기 어렵다. 따라서, 본 개시내용의 구현예는 종래의 염기 편집기보다 길이가 더 짧은 개시된 염기 편집기를 활용하는 것을 포함한다. 일부 예에서 염기 편집기는 4kb 미만이다. 개시된 염기 편집기는 4.5 kb, 4.4 kb, 4.3 kb, 4.2 kb, 4.1 kb, 4 kb, 3.9 kb, 3.8 kb, 3.7 kb, 3.6 kb, 3.5 kb, 3.4 kb, 3.3 kb, 3.2 kb, 3.1 kb, 3 kb, 2.9 kb, 2.8 kb, 2.7 kb, 2.6 kb, 2.5 kb, 2 kb, 또는 1.5 kb 미만일 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 염기 편집기는 길이가 4.5 kb 이하이다.

AAV는 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 표적화될 세포와 관련하여 AAV의 유형을 선택할 수 있고; 예를 들어, 뇌 또는 뉴런 세포를 표적화하기 위해 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합을 선택할 수 있고; 심장 조직을 표적화하기 위해 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간으로의 전달에 유용하다. 이들 세포에 관한 특정 AAV 혈청형의 도표는 Grimm, D. 등, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008))에서 찾을 수 있다.

일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 본원에 제공된 바와 같은 염기 편집기 또는 염기 편집기 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 관심 세포를 형질도입하는 데 사용된다. 렌티바이러스는 유사분열 세포 및 유사분열 후 세포 둘 모두에서 이들의 유전자를 감염시키고 발현시키는 능력을 갖는 복합 레트로바이러스이다. 가장 흔히 알려진 렌티바이러스는 광범위한 세포 유형을 표적화하는 다른 바이러스의 외피 당단백질을 사용하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)이다.

렌티바이러스는 다음과 같이 제조될 수 있다. pCasES10(렌티바이러스 전달 플라스미드 백본 함유)을 클로닝한 후, HEK293FT를 낮은 계대(p=5)에서 10% 소 태아 혈청을 함유하고 항생제가 없는 DMEM에서 형질감염 전날 50% 합류가 되도록 T-75 플라스크에 시딩하였다. 20 시간 후, 배지를 OptiMEM(무혈청) 배지로 교체하고 4 시간 후 형질감염을 수행하였다. 세포를 10 μg의 렌티바이러스 전달 플라스미드(pCasES10) 및 다음 패키징 플라스미드로 형질감염시켰다: 5 μg의 pMD2.G(VSV-g 위형), 및 7.5 μg의 psPAX2(gag/pol/rev/tat). 형질감염은 양이온성 지질 전달제(50 μl 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 및 100 μl 및 시약)를 함유하는 4 mL OptiMEM에서 수행될 수 있다. 6 시간 후, 배지를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 무항생제 DMEM으로 교체한다. 이러한 방법은 세포 배양 동안 혈청을 사용하지만, 무혈청 방법이 선호된다.

렌티바이러스는 다음과 같이 정제될 수 있다. 48 시간 후 바이러스 상청액을 수확한다. 상청액을 먼저 파편을 제거하고 0.45 μm 낮은 단백질 결합(PVDF) 필터를 통해 여과한다. 그런 다음 이들을 초원심분리기에서 2 시간 동안 24,000 rpm으로 회전시킨다. 바이러스 펠릿을 4℃에서 밤새 50 μl의 DMEM에 재현탁한다. 그런 다음 이들을 분취하고 -80℃에서 즉시 동결시킨다.

또 다른 구현예에서, 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)를 기반으로 한 최소 비-영장류 렌티바이러스 벡터가 또한 고려된다. 또 다른 구현예에서, 혈관형성 억제 단백질 엔도스타틴 및 안지오스타틴을 발현하는 말 전염성 빈혈 바이러스-기반 렌티바이러스 유전자 요법 벡터인 RetinoStat^®가 망막하 주사를 통해 전달되는 것으로 고려된다. 또 다른 구현예에서, 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터의 사용이 고려된다.

시스템의 임의의 RNA, 예를 들어 가이드 RNA 또는 염기 편집기-암호화 mRNA는 RNA의 형태로 전달될 수 있다. 염기 편집기-암호화 mRNA는 시험관내 전사를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 mRNA는 다음 요소를 함유하는 PCR 카세트를 사용하여 합성될 수 있다: T7 프로모터, 선택적인 코작 서열(GCCACC), 뉴클레아제 서열, 및 베타 글로빈-polyA 꼬리로부터의 3' UTR과 같은 3' UTR. 카세트는 T7 폴리머라아제에 의한 전사에 사용될 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, gRNA)는 또한 T7 프로모터, 이어서 서열 "GG", 및 가이드 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 카세트로부터 시험관내 전사를 사용하여 전사될 수 있다.

발현을 향상시키고 가능한 독성을 감소시키기 위해, 염기 편집기-코딩 서열 및/또는 가이드 핵산은 예를 들어 슈도 U 또는 5-메틸-C와 같은 변형된 뉴크렐오시드를 포함하도록 변형될 수 있다.

AAV 벡터의 작은 패키징 용량은 이 크기를 초과하는 다수의 유전자의 전달 및/또는 큰 생리학적 조절 요소의 사용을 어렵게 만든다. 이러한 어려움은 예를 들어, 전달될 단백질(들)을 2 개 이상의 단편으로 나눔으로써 해결될 수 있으며, 여기서 N-말단 단편은 스플릿 인테인-N에 융합되고 C-말단 단편은 스플릿 인테인-C에 융합된다. 그런 다음 이들 단편은 2 개 이상의 AAV 벡터로 패키징된다. 본원에 사용된 바와 같이, "인테인"은 플랭킹 N-말단 및 C-말단 엑스테인(예를 들어, 연결될 단편)을 결찰하는 자기-스플라이싱 단백질 인트론(예를 들어, 펩티드)을 지칭한다. 이종성 단백질 단편을 연결하기 위한 특정 인테인의 사용은 예를 들어, Wood 등, J. Biol. Chem. 289(21); 14512-9 (2014)에 기재되어 있다. 예를 들어, 별도의 단백질 단편과 융합된 경우, 인테인 IntN 및 IntC는 서로를 인식하고, 스스로를 스플라이싱하고 이들이 융합된 단백질 단편의 플랭킹 N- 및 C-말단 엑스테인을 동시에 결찰시켜, 2 개의 단백질 단편으로부터 전장 단백질을 재구축한다. 다른 적합한 인테인은 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명의 융합 단백질의 단편은 길이가 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 길이가 2개의 아미노산 내지 약 1000개의 아미노산 범위이다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 길이가 약 5개의 아미노산 내지 약 500개의 아미노산 범위이다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 길이가 약 20개의 아미노산 내지 약 200개의 아미노산 범위이다. 일부 구현예에서, 단백질 단편은 길이가 약 10개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산의 범위이다. 다른 길이의 적합한 단백질 단편은 당업자에게 명백할 것이다.

일 구현예에서, 이중 AAV 벡터는 큰 이식유전자 발현 카세트를 2 개의 별도의 절반(5' 및 3' 말단 단부, 또는 머리 및 꼬리)으로 분할함으로써 생성되며, 여기서 카세트의 각각의 절반은 단일 AAV 벡터(5 kb 미만)에 패키징된다. 그런 다음, 다음과 같은 두 이중 AAV 벡터에 의해 동일한 세포의 공동 감염 시 전장 이식유전자 발현 카세트에 의한 재조립이 달성된다: (1) 5' 및 3' 게놈 사이의 상동 재조합(HR)(이중 AAV 중첩 벡터); (2) 5' 및 3' 게놈의 ITR-매개 꼬리-대-머리 연쇄체화(이중 AAV 트랜스-스플라이싱 벡터); 또는 (3) 이들 2 가지 메커니즘의 조합(이중 AAV 하이브리드 벡터). 생체내에서 이중 AAV 벡터의 사용은 전장 단백질의 발현을 초래한다. 이중 AAV 벡터 플랫폼의 사용은 4.7 kb 초과 크기의 이식유전자에 대한 효율적이고 실행가능한 유전자 전달 전략을 나타낸다.

인테인

인테인(개재 단백질)은 단백질 스플라이싱으로 공지된 과정을 수행하는 다양한 여러 유기체에서 발견되는 자가-처리 도메인이다. 단백질 스플라이싱은 펩티드 결합의 절단 및 형성 둘 모두로 이루어진 다단계 생화학 반응이다. 단백질 스플라이싱의 내인성 기질은 인테인-함유 유기체에서 발견되는 단백질이지만, 인테인은 또한 사실상 임의의 폴리펩티드 백본을 화학적으로 조작하는 데 사용될 수 있다.

단백질 스플라이싱에서, 인테인은 2 개의 펩티드 결합을 절단함으로써 전구체 폴리펩티드를 자체적으로 절제하여, 새로운 펩티드 결합의 형성을 통해 플랭킹 엑스테인(외부 단백질) 서열을 결찰시킨다. 이 재배열은 번역후(또는 가능한 동시 번역으로) 발생한다. 인테인-매개 단백질 스플라이싱은 자발적으로 발생하며, 인테인 도메인의 접힘만을 필요로 한다.

인테인의 약 5%는 스플릿 인테인이며, 각각이 하나의 엑스테인에 융합된 N-인테인 및 C-인테인인 2 개의 별도의 폴리펩티드로서 전사 및 번역된다. 번역 시, 인테인 단편은 자발적으로 및 비-공유적으로 표준 인테인 구조 내로 조립되어 단백질 스플라이싱을 트랜스로 수행한다. 단백질 스플라이싱의 메커니즘은 인테인-엑스테인 접합부에서 2 개의 펩티드 결합의 절단 및 N- 및 C-엑스테인 사이에 새로운 펩티드 결합의 형성을 초래하는 일련의 아실-전달 반응을 수반한다. 이 과정은 N-엑스테인 및 인테인의 N-말단을 연결하는 펩티드 결합의 활성화로 개시된다. 사실상 모든 인테인은 N-말단에서 C-말단 N-엑스테인 잔기의 카르보닐 탄소를 공격하는 시스테인 또는 세린을 갖는다. 이러한 N에서 O/S로의 아실-이동은 흔히 발견되는 아스파르테이트와 함께 보존된 트레오닌 및 히스티딘(TXXH 모티프(서열번호: 17)로 지칭됨)에 의해 용이하게 되어, 선형 (티오)에스테르 중간체의 형성을 초래한다. 다음으로, 이 중간체는 시스테인, 세린, 또는 트레오닌인 첫번째 C-엑스테인 잔기(+1)의 친핵체 공격에 의해 트랜스-(티오)에스테르화에 적용된다. 생성된 분지형 (티오)에스테르 중간체는 고유한 형태인 인테인의 고도로 보존된 C-말단 아스파라긴의 환화를 통해 분해된다. 이 과정은 히스티딘(고도로 보존된 HNF 모티프에서 발견) 및 끝에서 두번째 히스티딘에 의해 용이하게 되고 또한 아스파르테이트를 수반할 수 있다. 이 숙신이미드 형성 반응은 반응성 복합체로부터 인테인을 절제하고 비-펩티드성 결합을 통해 부착된 엑스테인을 남겨 둔다. 이 구조는 인테인-독립적 방식으로 안정된 펩티드 결합 내로 빠르게 재배열된다.

일부 구현예에서, 스플릿 인테인은 Gp41.1, IMPDH.1, NrdJ.1 및 Gp41.8로부터 선택된다(Carvajal-Vallejos, Patricia 등. "Unprecedented rates and efficiency presents for new natural 분할 인테인 from metagenomic source." J. Biol.Chem., vol.287,34(2012)).

인테인의 비제한적인 예에는 dnaE 인테인, Cfa-N(예: 스플릿 인테인-N) 및 Cfa-C(예: 스플릿 인테인-C) 인테인 쌍(예를 들어, 문헌[Stevens 등., J Am Chem Soc. 2016 Feb. 24;138(7):2162-5, 본원에 참조로 포함됨)] 및 DnaE을 기반으로 하는 합성 인테인을 포함하는 당업계에 알려진 임의의 인테인 또는 인테인-쌍이 포함된다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 인테인 쌍의 비제한적 예에는 Cfa DnaE 인테인, Ssp GyrB 인테인, Ssp DnaX 인테인, Ter DnaE3 인테인, Ter ThyX 인테인, Rma DnaB 인테인 및 Cne Prp8 인테인(예를 들어, 미국 특허 제8,394,604호, 본원에 참조로 포함됨)에 설명되어 있다. 인테인의 예시적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열 목록의 서열번호: 482-489에 제공되어 있다.

스플릿 Cas9의 N 말단 부분과 C-말단 부분의 결합을 위해 스플릿 Cas9의 N 말단 부분과 스플릿 Cas9의 C 말단 부분에 각각 Intein-N과 intein-C가 융합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 인테인-N은 스플릿 Cas9의 N-말단 부분의 C-말단에 융합되어, 즉 N--[스플릿 Cas9의 N-말단 부분]-[인테인-N]--C의 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 인테인-C는 스플릿 Cas9의 C-말단 부분의 N-말단에 융합된다. 일부 구현혜에서, 인테인-C는 스플릿 Cas9의 C-말단 부분의 N-말단에 융합되어, 즉 N-[인테인-C]―[스플릿 Cas9의 C-말단 부분]-C의 구조를 형성한다. 인테인이 융합되는 단백질을 연결하기 위한(예를 들어, 스플릿 Cas9) 인테인 매개 단백질 스플라이싱의 메커니즘은 예를 들어 Shah 등., Chem Sci. 2014년; 5(1):446-461(본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와같이, 이 기술분야에 알려져 있다. 인테인을 설계하고 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO2014004336, WO2017132580, US20150344549 및 US20180127780에 기술되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 뉴클레아제의 부분 또는 단편(예를 들어, Cas9)은 인테인에 융합된다. 뉴클레아제는 인테인의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 부분 또는 단편은 인테인에 융합되고 AAV 캡시드 단백질에 융합된다. 인테인, 뉴클레아제 및 캡시드 단백질은 임의의 배열로 함께 융합될 수 있다(예를 들어, 뉴클레아제-인테인-캡시드, 인테인-뉴클레아제-캡시드, 캡시드-인테인-뉴클레아제 등). 일부 구현예에서, 염기 편집기(예를 들어, ABE, CBE)의 N-말단 단편은 스플릿 인테인-N에 융합되고, C-말단 단편은 스플릿 인테인-C에 융합된다. 이들 단편은 이어서 2개 이상의 AAV 벡터로 패키징된다. 일부 구현예에서, 인테인의 N-말단은 융합 단백질의 C-말단에 융합되고, 인테인의 C-말단은 AAV 캡시드 단백질의 N-말단에 융합된다.

일부 구현예에서, 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인(예를 들어, Cas9)의 N-말단 단편은 스플릿 인테인-N에 융합되고 C-말단 단편은 스플릿 인테인-C에 융합된다. 일부 구현예에서, 스플릿 인테인-N에 융합된 데아미나아제 도메인(예를 들어, 아데노신 또는 사이티딘 데아미나아제)의 N-말단 단편 및 C-말단 단편은 스플릿 인테인-C에 융합된다.

이들 단편은 이어서 2개 이상의 AAV 벡터로 패키징된다. 일부 구현예에서, 인테인을 특징으로 하는 염기 편집기 (예를 들어, 자기-불활성화 염기 편집기)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 인테인의 N-말단은 융합 단백질의 C-말단에 융합되고, 인테인의 C-말단은 AAV 캡시드 단백질의 N-말단에 융합된다.

일 구현예에서, 인테인은 AAV 캡시드 단백질 상에 그래프트된 사이티딘 또는 아데노신 염기 편집기 단백질의 단편 또는 부분을 연결하는 데 사용된다. 이종성 단백질 단편을 연결하기 위한 특정 인테인의 사용은 예를 들어, Wood 등, J. Biol. Chem. 289(21); 14512-9 (2014)에 기재되어 있다. 예를 들어, 별개의 단백질 단편에 융합될 때, 인테인 IntN 및 IntC는 서로를 인식하고, 스스로를 스플라이싱하고, 이들이 융합된 단백질 단편의 플랭킹 N- 및 C-말단 엑스테인을 동시에 결찰시켜, 2 개의 단백질 단편으로부터 전장 단백질을 재구축한다. 다른 적합한 인테인은 당업자에게 명백할 것이다.

일부 구현예에서, ABE는 SpCas9의 선택된 영역 내의 Ala, Ser, Thr, 또는 Cys 잔기에서 N- 및 C-말단 단편으로 스플릿되었다. 이들 영역은 Cas9 결정 구조 분석에 의해 식별된 루프 영역에 상응한다.

각 단편의 N-말단은 인테인-N에 융합되고 각 단편의 C-말단은 아미노산 위치 S303, T310, T313, S355, A456, S460, A463, T466, S469, T472, T474, C574, S577, A589, 및 S590에서 인테인 C에 융합되며, 이는 하기 서열(“참조 서열”이라 부름)에서 대문자로 표시된다.

(서열번호: 250).

약제학적 조성물

일부 양태에서, 본 발명은 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 염기 편집기(예를 들어, 자기-불활성화 염기 편집기), 염기 편집기 시스템, 가이드 폴리뉴클레오티드, 융합 단백질, 또는 융합 단백질-가이드 폴리뉴클레오티드 복합체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, Remington, The Science And Practice of Pharmacy (21st ed. 2005)를 참조한다. 일반적으로, 세포 또는 이의 집단은 투여 또는 저장에 앞서 적절한 담체와 혼합되며, 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 보조하거나, 약제학적 조성물을 전달가능한 제조물로 가공하는 것을 보조하거나, 또는 투여 전에 약제학적 조성물을 저장하는 것을 보조하는 불활성 물질을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제형의 형태, 농도, 점도, pH, 약동학적 특성, 용해도를 안정화시키거나, 최적화하거나, 또는 달리 변경할 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 완충제, 습윤제, 유화제, 희석제, 캡슐화제, 및 피부 침투 증진제를 포함한다. 예를 들어, 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 아르기닌, 수크로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 소르비톨, 덱스트란, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

약제학적으로-허용되는 담체로서 역할을 할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 술페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG); (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 무발열원수; (17) 등장성 염수; (18) 링거(Ringer) 용액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 증량제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산 (23) 혈청 알코올, 예컨대 에탄올; 및 (23) 약제학적 제형에서 이용되는 다른 무독성 호환성 물질. 습윤제, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제, 방향제, 방부제 및 산화방지제가 또한 제형에 존재할 수 있다.

약제학적 조성물은 미리 결정된 수준에서 약 5.0 내지 약 8.0의 범위에서와 같은 생리학적 pH를 반영하는 제형의 pH를 유지하기 위해 하나 이상의 pH 완충 화합물을 포함할 수 있다. 수성 액체 제형에 사용되는 pH 완충 화합물은 아미노산 또는 히스티딘과 같은 아미노산의 혼합물 또는 히스티딘 및 글리신과 같은 아미노산의 혼합물일 수 있다. 대안적으로, pH 완충 화합물은 바람직하게는 미리 결정된 수준에서 약 5.0 내지 약 8.0의 범위에서와 같은 제형의 pH를 유지하고, 칼슘 이온을 킬레이트화하지 않는 제제이다. 이러한 pH 완충 화합물의 예시적인 예는 이미다졸 및 아세테이트 이온을 포함하나 이에 제한되지 않는다. pH 완충 화합물은 미리 결정된 수준에서 제형의 pH를 유지하기에 적합한 임의의 양으로 존재할 수 있다.

약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 삽투압 조절제, 즉, 개인 수혜자의 혈류 및 혈액 세포에 허용가능한 수준으로 제형의 삼투압 특성(예를 들어, 등장성, 삼투압, 및/또는 삼투 압력)을 조절하는 화합물을 함유할 수 있다. 삽투압 조절제는 칼슘 이온을 킬레이트화하지 않는 제제일 수 있다. 삽투압 조절제는 제형의 삼투압 특성을 조절하는 당업자에게 알려지거나 또는 이용가능한 임의의 화합물일 수 있다. 당업자는 본 발명의 제형에 사용하기 위한 주어진 삽투압 조절제의 적합성을 경험적으로 결정할 수 있다. 적합한 유형의 삽투압 조절제의 예시적인 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 염, 예컨대 나트륨 클로라이드 및 나트륨 아세테이트; 당, 예컨대 수크로스, 덱스트로스, 및 만니톨; 아미노산, 예컨대 글리신; 및 이러한 제제 및/또는 제제의 유형 중 하나 이상의 혼합물. 삽투압 조절제(들)는 제형의 삼투압 특성을 조절하기에 충분한 임의의 농도로 존재할 수 있다.

변형된 세포 또는 이의 집단 및 담체에 더하여, 본 발명의 약제학적 조성물은 질병 치료에 유용한 적어도 하나의 추가 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 약제학적 조성물의 일부 구현예는 화학요법제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 사이토카인 펩티드 또는 사이토카인 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 그의 집단을 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제와 별도로 투여될 수 있다.

본 발명의 유전적으로 변형된 세포의 치료적 용도에 관한 한 가지 고려사항은 최적 또는 만족스러운 효과를 달성하는데 필요한 세포의 양이다. 투여되는 세포의 양은 치료 대상에 따라 달라질 수 있다. 한 구현예에서, 10⁴ 내지 10¹⁰사이, 10⁵ 내지 10⁹ 사이, 또는 10⁶ 내지 10⁸사이의 유전적으로 변형된 세포가 인간 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 약 1 x 10⁸, 2 x 10⁸, 3 x 10⁸, 4 x 10⁸, 및 5 x 10⁸개의 본 발명의 유전적으로 변형된 세포가 인간 대상체에 투여된다. 정확한 유효 용량을 결정하는 것은 크기, 연령, 성별, 체중 및 상태를 포함한 각 개별 피험자의 요인을 기반으로 할 수 있다. 투여량은 본 개시내용 및 해당 분야의 지식으로부터 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다.

당업자는 본 발명의 방법에서 투여될 조성물 중 세포의 수 및 선택적인 첨가제, 비히클 및/또는 담체의 양을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로 첨가제(세포 외에)는 인산염 완충 식염수에 용액 0.001~50%(중량)의 양으로 존재하며, 활성 성분은 약 0.0001 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 1 중량%, 더욱 더 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 0.05 중량% 또는 약 0.001 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 10 중량%, 더욱 더 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5wt%과 같이 마이크로그램에서 밀리그램 정도의 단위로 존재한다. 물론, 동물 또는 인간에게 투여될 임의의 조성물 및 임의의 특정 투여 방법에 대해, 따라서 독성, 예를 들어 적합한 동물 모델(예를 들어, 마우스와 같은 설치류)에서 치사량(LD) 및 LD50을 결정하며; 및 적합한 반응을 이끌어내는 조성물(들)의 투여량, 그 안의 성분의 농도, 및 조성물(들)을 투여하는 시기를 결정하는 것이 바람직하다. 이러한 결정은 당업자의 지식, 본 개시 내용 및 여기에 인용된 문서로부터의 과도한 실험을 요구하지 않는다. 그리고, 무리한 실험 없이 순차적 투여 시점을 확인할 수 있다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체에게 전달하기 위해 제형화된다. 본원에 기재된 약제학적 조성물을 투여하는 적합한 경로는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 국소, 피하, 경피, 피내, 병변내, 관절내, 복강내, 방광내, 경점막, 치은, 치간, 와우내, 경고막, 기관내, 경막외, 척추강내, 근육내, 정맥내, 혈관내, 골내, 안구주위, 종양내, 대뇌내, 및 뇌실내 투여.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 질환 부위에 국부적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 삽입물에 의해 대상체에게 투여되며, 삽입물은 시알라스틱 막, 또는 섬유와 같은 막을 포함한 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질이다.

다른 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달된다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(예를 들어, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald 등, 1980, Surgery 88:507; Saudek 등, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574 참조). 또 다른 구현예에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다. (예를 들어, Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 참조. 또한 Levy 등, 1985, Science 228: 190; During 등, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard 등, 1989, J. Neurosurg. 71: 105 참조.) 예를 들어, 상기 Langer에서 다른 제어 방출 시스템이 논의되고 있다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체, 예를 들어, 인간에게 정맥내 또는 피하 투여에 적합한 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 일부 구현예에서, 주사에 의해 투여하기 위한 약제학적 조성물은 가용화제로서 사용하기 위한 멸균 등장성 용액 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 리그노카인과 같은 국부 마취제이다. 일반적으로, 성분은 개별적으로 또는 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 샤셰(sachette)와 같은 완전 밀폐 용기에서 건조 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 단위 투여 형태로 함께 공급된다. 약제가 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약제학적 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 약제학적 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.

전신 투여를 위한 약제학적 조성물은 액체, 예를 들어, 멸균 염수, 락테이트화 링거 또는 행크 용액일 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 고체 형태이고 사용 직전에 재용해되거나 또는 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태가 또한 고려된다. 약제학적 조성물은 비경구 투여에도 적합한 리소솜 또는 미세결정과 같은 지질 입자 또는 소포 내에 함유될 수 있다. 입자는 조성물이 그 안에 함유되어 있는 한, 단층 또는 다층과 같은 임의의 적합한 구조일 수 있다. 화합물은 낮은 수준(5-10 mol%)의 양이온성 지질인 융해성 지질 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)을 함유하는 "안정화된 플라스미드-지질 입자"(SPLP)에 포획되고, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 코팅에 의해 안정화될 수 있다(Zhang Y. P. 등, Gene Ther. 1999, 6: 1438-47). 이러한 입자 및 소포에 대해 N-[l-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸술페이트, 또는 "DOTAP"와 같은 양으로 하전된 지질이 특히 바람직하다. 이러한 지질 입자의 제조는 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,880,635; 4,906,477; 4,911,928; 4,917,951; 4,920,016; 및 4,921,757을 참조하며; 각각이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 기재된 약제학적 조성물은 예를 들어, 단위 용량으로 투여되거나 또는 패키징될 수 있다. 용어 "단위 용량"은 본원의 개시내용의 약제학적 조성물과 관련하여 사용될 때 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 필요한 희석제; 즉, 담체, 또는 비히클과 관련하여 원하는 치료적 효과를 생성하기 위해 계산된 미리 결정된 활성 물질의 양을 함유한다.

또한, 약제학적 조성물은 (a) 동결건조된 형태의 본 발명의 화합물을 함유하는 용기 및 (b) 약제학적으로 허용되는 희석제(예를 들어, 본 발명의 동결건조된 화합물의 재구성 및 희석에 사용되는 멸균물을 함유하는 제2 용기를 포함하는 약제학적 키트로 제공될 수 있다. 이러한 용기(들)과 임의적으로 관련된 것은 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 안내문이며, 이 안내문은 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다.

또 다른 측면에서, 상기 기재된 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 포함된다. 일부 구현예에서, 제조 물품은 용기 또는 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 테스트 튜브를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 본원에 기재된 질환을 치료하기에 효과적인 조성물을 보유하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 스토퍼가 있는 바이알일 수 있다. 조성물 내 활성제는 본 발명의 화합물이다. 일부 구현예에서, 용기 상의 또는 관련된 라벨은 조성물이 선택 질환을 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 제조 물품은 약제학적으로-허용되는 완충제, 예컨대 포스페이트-완충 염수, 링거 용액, 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함한 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 융합 단백질, gRNA, 및/또는 복합체는 약제학적 조성물의 일부로 제공된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 제공된 임의의 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 gRNA 및 양이온성 지질과 복합체를 형성하는 RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)를 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서 약제학적 조성물은 gRNA, 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질, 양이온성 지질, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 약제학적 조성물은 임의적으로 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 물질을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 대상체 내에서 표적화된 게놈 변형을 달성하기 위해 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 수득되고, 본원에 제공된 임의의 약제학적 조성물과 접촉된다. 일부 구현예에서, 대상체로부터 제거되고 생체외에서 약제학적 조성물과 접촉된 세포는, 선택적으로 세포에서 원하는 게놈 변형이 달성되거나 검출된 후에, 대상체 내로 재도입된다. 뉴클레아제를 포함하는 약제학적 조성물을 전달하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824에 기재되어 있고; 이들 모두의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공된 약제학적 조성물에 대한 설명은 주로 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 당업자는 이러한 조성물이 일반적으로 동물 또는 각종 유기체, 예를 들어 수의학적 용도에 투여하기에 적합하다는 것을 이해할 것이다.

다양한 동물에게 투여하기에 적합한 조성물을 제공하기 위해 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되고, 통상적으로 숙련된 수의학적 약리학자는 단지 보통의 실험으로 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 포유동물, 가축, 반려동물, 및 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 및/또는 랫트와 같은 상업적으로 관련된 포유동물; 및/또는 닭, 오리, 거위, 및/또는 칠면조와 같은 상업적으로 관련된 조류를 포함하는 조류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에서 공지되거나 이후 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분(들)을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 부성분과 연관시키는 단계, 및 그 후, 필요하거나 및/또는 바람직한 경우, 생성물을 원하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 형상화 및/또는 패키징하는 단계를 포함한다. 약제학적 제형은 추가적으로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있으며, 이는 본원에서 사용되는 바와 같이, 원하는 특정 투약 형태에 적합하도록, 임의의 및 모든 용매, 분산 배지, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함한다. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)는 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용되는 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시한다. 뉴클레아제를 포함하는 약제학적 조성물을 생성하기 위한 추가의 적합한 방법, 시약, 부형제 및 용매에 대해, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 PCT 출원 PCT/US2010/055131 (공보 번호 WO2011/053982 A8, 2010 년 11 월 2 일 출원)을 또한 참조한다.

임의의 통상적인 부형제 배지가, 예컨대 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 또는 달리 약제학적 조성물의 임의의 다른 구성요소(들)와 유해한 방식으로 상호작용함으로써, 물질 또는 이의 유도체와 호환가능하지 않은 한, 이의 사용은 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 고려된다.

상기 기재된 바와 같은 조성물은 유효량으로 투여될 수 있다. 유효량은 투여 방식, 치료되는 특정 조건, 및 원하는 결과에 의존할 것이다. 이는 또한 병태의 단계, 대상체의 연령 및 신체 상태, 병행 요법의 성질(존재하는 경우), 및 의사에게 널리 공지된 유사 인자에 의존할 수 있다. 치료적 적용을 위해, 이는 의학적으로 바람직한 결과를 달성하기에 충분한 양이다.

일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 임의의 다양한 질환, 장애 및/또는 병태의 치료에 사용될 수 있다.

치료 방법

본 발명의 일부 측면은, 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본원에 기술된 바와 같은 유효 치료량의 약학 조성물을 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, 치료 방법은 적어도 하나의 편집된 유전자를 갖는 하나 이상의 세포를 포함하는 하나 이상의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 염기 편집기 폴리펩티드(예를 들어, 자기-불활성화 염기 편집기) 및 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 표적화할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA를 발현시키거나 세포 내로 도입하는 것을 포함한다.

일 구현예에서, 대상체는 적어도 0.1×10⁵ 세포, 적어도0.5×10⁵ 세포, 적어도 1×10⁵ 세포, 적어도 5×10⁵세포, 적어도 1×10⁶ 세포, 적어도 0.5×10⁷ 세포, 적어도 1×10⁷ 세포, 적어도 0.5×10⁸ 세포, 적어도 1×10⁸ 세포, 적어도 0.5×10⁹세포, 적어도 1×10⁹ 세포, 적어도 2×10⁹ 세포, 적어도 3×10⁹ 세포, 적어도 4×10⁹ 세포, 적어도 5×10⁹ 세포, 또는 적어도 1×10¹⁰ 세포가 투여된다. 특정 구현예에서, 약 1×10⁷ 세포 내지 약1×10⁹ 세포, 약 2×10⁷ 세포 내지 약 0.9×10⁹ 세포, 약 3×10⁷ 세포 내지 약 0.8×10⁹ 세포, 약 4×10⁷ 세포 내지 약 0.7×10⁹세포, 약5×10⁷ 세포 내지 약 0.6×10⁹ 세포, 또는 약 5×10⁷ 세포 내지 약 0.5×10⁹ 세포가 투여된다.

일부 구현예에서, 대상체는 체중의 적어도 0.1×10⁴ cells/kg, 체중의 적어도 0.5× 10⁴ cells/kg, 체중의 적어도 1×10⁴ cells/kg, 체중의 적어도 5×10⁴cells/kg, 체중의 적어도 1×10⁵ cells/kg, 체중의 적어도 0.5×10⁶cells/kg, 체중의 적어도 1×10⁶ cells/kg, 체중의 적어도 0.5×10⁷ cells/kg, 체중의 적어도 1×10⁷ cells/kg, 체중의 적어도 0.5×10⁸ cells/kg, 체중의 적어도 1×10⁸ cells/kg, 체중의 적어도 2×10⁸ cells/kg, 체중의 적어도 3×10⁸cells/kg, 체중의 적어도 4×10⁸ cells/kg, 체중의 적어도 5×10⁸ cells/kg, 또는 체중의 적어도 1×10⁹ cells/kg으로 투여된다. 특정 구현예에서, 체중의 약 1×10⁶ cells/kg 내지 체중의 약 1×10⁸ cells/kg, 체중의 약 2×10⁶ cells/kg 내지 체중의 약 0.9× 10⁸ cells/kg, 체중의 약 3×10⁶ cells/kg 내지 체중의 약 0.8×10⁸ cells/kg, 체중의 약 4×10⁶ cells/kg내지 체중의 약 0.7×10⁸ cells/kg, 체중의 약 5×10⁶ cells/kg 내지 체중의 약 0.6×10⁸ cells/kg, 체중의 약 5×10⁶ cells/kg 내지 체중의 약 0.5×10⁸ cells/kg로 대상체에 투여된다.

당업자는 특정 구현예에서 고려되는 제약 조성물의 다중 투여가 원하는 치료법에 영향을 미치기 위해 필요할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 조성물은 대상체에게 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 5년, 10년 이상의 기간에 걸쳐 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 이상 투여될 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 방법은 대상체에게 유효량의 편집된 세포, 염기 편집기 시스템 또는 이러한 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 방법은 편집된 세포의 유효량을 하루에 1회 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 방법은 편집된 세포의 유효량을 하루에 2회 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 방법은 편집된 세포의 유효량을 하루에 3회 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 방법은 편집된 세포의 유효량을 주당 1회 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 방법은 편집된 세포의 유효량을 주당 2회 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 방법은 편집된 세포의 유효량을 주당 3회 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 방법은 편집된 세포의 유효량을 매월 1회 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 방법은 편집된 세포의 유효량을 매월 2회 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 이러한 방법에서, 방법은 편집된 세포의 유효량을 매월 3회 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본원에서 고려되는 약제학적 조성물의 투여는 주입, 수혈 또는 비경구를 포함하나 이에 제한되지 않는 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 비경구 투여에는 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 종양내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하 및 흉골내로 주입 또는 주사하는 것이 포함된다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물(예를 들어, 편집된 세포, 염기 편집기 시스템)은 인간 대상체의 체중 1kg당 약 0.5-30mg의 투여량으로 투여된다. 다른 구현예에서, 투여되는 조성물의 양은 인간 대상체의 체중 1kg당 약 0.5-20mg이다. 다른 구현예에서, 투여되는 조성물의 양은 인간 대상체의 체중 1kg당 약 0.5-10mg이다. 또 다른 구현예에서, 투여되는 조성물의 양은 인간 대상체의 체중 1kg 당 약 0.04 mg, 약 0.08 mg, 약 0.16 mg, 약 0.32 mg, 약 0.64 mg, 약 1.25 mg, 약 1.28 mg, 약 1.92 mg, 약 2.5 mg, 약 3.56 mg, 약 3.75 mg, 약 5.0 mg, 약 7.12 mg, 약 7.5 mg, 약 10 mg, 약 14.24 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 또는 약 30 mg이다. 또 다른 구현예에서, 투여되는 복합 조성물의 양은 인간 대상체의 체중 1kg 당 약 1.92 mg, 약 3.75 mg, 약 7.5 mg, 약 15.0 mg, 또는 약 30.0 mg이고, 조성물은 주 2회 투여된다. 다른 구현예에서, 투여되는 조성물의 양은 인간 대상체의 체중 1kg당 약 1.28 mg, 약 2.56 mg, 약 5.0 mg, 약 10 mg, 또는 약 20 mg이고, 조성물은 일주일에 2회 투여된다. 다른 구현예에서, 투여되는 조성물의 양은 인간 대상체의 체중 1kg당 약 1.92 mg, 약 3.75 mg, 약 7.5 mg, 약 15.0 mg, 또는 약 30.0 mg이고, 조성물은 일주일에 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 투여되는 조성물의 양은 인간 대상체의 체중 1kg당 약 1.28 mg, 약 2.56 mg, 약 5.0 mg, 약 10 mg, 또는 약 20 mg이고, 조성물은 일주일에 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 투여되는 조성물의 양은 인간 대상체의 체중 1kg당 약 1.92 mg, 약 3.75 mg, 약 7.5 mg, 약 15.0 mg, 또는 약 30.0 mg이고, 조성물은 3일, 5일 1회 또는 7일 동안 7번 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 1일 1회, 7일 기간에 7회 정맥내로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 투여되는 조성물의 양은 인간 대상체의 체중 1kg당 약 1.28mg, 약 2.56mg, 약 5.0mg, 약 10mg, 또는 약 20mg이고, 조성물은 3일, 5일 1회 또는 7일 동안 7번 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 1일 1회, 7일 기간에 7회 정맥내로 투여된다.

일부 구현예에서, 조성물은 0.25시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 또는 12시간의 기간에 걸쳐 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 0.25-2시간의 기간에 걸쳐 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 1시간에 걸쳐 점진적으로 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 2시간에 걸쳐 점진적으로 투여된다.

키트

본 발명은 염기 편집기를 자기-불활성화하는 기능을 갖춘 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 이종성 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 존재한다. 일부 구현예에서, 인트론은 데아미나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 존재한다. 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 게놈 서열을 표적으로 하는 가이드 폴리뉴클레오티드, 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 이종성 인트론을 표적으로 하는 가이드 폴리뉴클레오티드)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 및 데아미나아제를 포함하는 자기-불활성화 염기 편집기, 및 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 염기 편집기 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임은 이종성 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트에는 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드, 염기 편집기, 염기 편집기 시스템, 세포 또는 벡터 중 임의의 것을 포함하는 세포가 포함된다.

키트는 본 명세서에 기술된 염기 편집기(예를 들어 자기-불활성화 염기 편집기)를 사용하거나 불활성화하기 위한 지시서를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 지시서는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 주의 사항; 경고; 임상 연구; 및/또는 참조. 지시서는 용기에 직접 인쇄되거나(있는 경우), 용기에 부착된 라벨로, 또는 용기에 들어 있거나 용기와 함께 제공되는 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로 인쇄될 수 있다. 추가 구현예에서, 키트는 적합한 작동 매개변수에 대한 라벨 또는 별도의 삽입물(포장 삽입물) 형태의 지시서를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 키트는 검출, 교정 또는 표준화를 위한 표준(들)으로 사용될 적절한 양성 및 음성 대조 또는 대조 샘플이 들어 있는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 (멸균) 인산염 완충 식염수, 링거액 또는 포도당 용액과 같은 약학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 두 번째 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 지침이 포함된 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 설명서는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 예방책; 경고; 임상 연구; 및/또는 참고문헌. 설명서는 용기(존재하는 경우) 상에 직접 인쇄되거나, 또는 용기에 부착된 라벨로, 또는 용기 내에 또는 용기와 함께 공급되는 별도의 시트, 팜플렛, 카드, 또는 폴더로 인쇄될 수 있다. 추가 구현예에서, 키트는 적합한 작동 매개변수에 대한 라벨 또는 별도의 삽입물(패키지 삽입물) 형태의 설명서를 포함할 수 있다. 또한 또 다른 구현예에서, 키트는 검출, 교정, 또는 표준화를 위한 표준(들)으로 사용될 적절한 양성 및 음성 대조군 또는 대조군 샘플이 있는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 (멸균) 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액, 또는 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함한다.

본 발명의 실행은, 달리 나타내지 않는 한, 당업자의 이해의 범위 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용한다. 이러한 기술은 “Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller 및 Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)와 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 이러한 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생산에 적용가능하며, 그 자체로 구현예에 본 발명을 제조하고 실행하는 데 고려될 수 있다. 특정 구현예에 특히 유용한 기술은 하기 섹션에서 논의될 것이다.

하기 실시예는 본 발명의 검정, 스크리닝, 및 치료 방법을 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명과 함께 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 발명자가 자신의 발명으로 간주하는 범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다.

실시예

실시예 1: 데아미나아제 도메인의 촉매 불활성화에 의한 자기-불활성화

통상적인 아데닌 염기 편집기(ABE)는 진화된 TadA 효소를 활용하여 아데닌 DNA 염기를 탈아미노화하여 2'-데옥시 이노신 생성물을 생성하며, 이는 DNA 복구 동안 세포에 의해 2'-데옥시구아노신으로 인식된다 (Gaudelli, N. M., 등. (2017). Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464-471; Gaudelli, N. M., 등. (2020). Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nat Biotechnol, 38(7), 892-900; Richter, M. F., 등. (2020). Phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved Cas domain compatibility and activity. Nature Biotechnology, 38(7), 883-891). TaA는 데탈아미노화 활성을 갖는 4개의 촉매성 잔기를 함유한다: His57 (H57), Glu59 (E59), Cys87 (C87), or Cys90 (C90) (Kim, J., 등. (2006). Structural and kinetic characterization of Escherichia coli TadA, the wobble-specific tRNA deaminase. Biochemistry, 45(20), 6407-6416).

1) 코딩 DNA를 세포에 전달한 후 ABE의 자기-불활성화에 이러한 부위를 활용할 수 있는지, 및 2) 두 개의 가이드 RNA 및 ABE를 코딩하는 DNA의 공동 전달이, 관심 대상 게놈 표적 부위 및 ABE를 코딩하는 에피소멀(episomal) DNA 를 동시에 효과적으로 편집하여 TadA 촉매 잔기를 비활성 아미노산으로 변환할 수 있는지를 확인하기 위하여 개념 증명 분석이 수립되었다 (도 1A). 분석은 HEK293T 세포의 플라스미드 리포펙션(plasmid lipofection)을 사용하였는데, DNA 벡터는 4개의 TadA 촉매 잔기(His57 (H57), Glu59 (E59), Cys87 (C87), 또는 Cys90 (C90)) 중 하나를 표적으로 하는 가이드 RNA 및 세포 게놈 내의 특정 부위를 표적하는 제2 가이드 RNA를 코딩한다. 세포를 리포펙션 후 5일 동안 배양하고, 세포 게놈 DNA와 회수된 플라스미드 DNA를 모두 포함하는 세포 용해물에서 생성된 각 표적 앰플리콘에 대해 일루미나 차세대 시퀀싱을 수행하였다. 편집된 경우 TadA 잔기가 촉매적으로 불활성인지 확인하기 위해 상응하는 돌연변이가 ABE7.10-m의 TadA 서브유닛에 있는 대조 플라스미드(아미노산 치환 H57R, E59G, C87R, 또는 C90R를 제공)에 미리 장착(pre-installed)되었고, 이들의 염기 편집 활성은 세포 게놈 표적 부위에서만 평가되었다. 각 경우에, 미리 장착된 돌연변이는 관심 부위에서 사실상 편집을 생성하지 않았고 (A에서 G로의 변환 <0.1%), 이는 이러한 TadA 돌연변이가 비활성화되었음을 컨펌하였다(도 1B). 기능성 ABE7.10-m으로 형질감염된 샘플에서 게놈 부위에서의 편집과 회수된 염기 편집기 플라스미드에서의 편집을 모두 평가하였다. TadA의 표적 부위 중 2개(H57R 및 E59G)만이 해당 자기-불활성화 가이드 RNA에 의해 상당히 편집된 반면, 게놈 표적에서의 편집 속도는 스크램블된 자기-불활성화 가이드 RNA(scrambled self-inactivating guide RNA)를 함유하는 대조군의 속도와 유사했다. 이는 촉매 부위에서의 자기-편집 비율이 상대적으로 낮았지만 (A에서 G로의 변환 <5%), 염기 편집기 ABE를 코딩하는 DNA를 표적하는 것이 가능했고, 호스트 게놈 내에서 온-타겟 편집 효율은 편집기의 자기-불활성화로 인해 부정적 영향을 받지 않았다.

자기-불활성화 속도가 향상될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 TadA 내의 코돈 사용을 최적화하여 편집이 발생하도록 최적화된 스페이서 서열을 생성하였다. TadA 내에서 사용가능한 NGG PAM이 주어지면, E59 코돈의 표적 아데노신은 ABE7.10의 편집 윈도우 내에서 더 유리한 위치로 예상되는 위치와 최근 설명된 ABE8 변이체 (E59의 경우 A7 위치 vs. H57의 경우 A9 위치)(도 1C)에 위치한다. 따라서 E59 위치가 최적화되었다. 표적 영역에서 TadA의 가능한 모든 동의어 코돈 사용은 생물정보학적으로 분석되었으며, 높은 RSCU (relative synonymous codon usage) 점수에 우선순위를 부여하고 각각의 상응하는 가이드 RNA에 대해 낮은 in silico 오프 타겟 예측 프로파일에 우선순위를 지정하여 순위를 매겼다. 그런 다음, ABE7.10-m에 비해 관심있는 세포 게놈 표적에 대해 더 높은 편집 효율성을 별도로 입증한 ABE8.5-m의 맥락에서 17개의 후보를 테스트했다. 플라스미드 기반 분석을 사용하여 분석한 편집의 자기-불활성화 비율은 다양하고 전반적으로 낮았으나(<5%)(도 1D), 반면 세포 게놈 부위에서의 편집은 변이체 전반에 걸쳐 약 30~50% 범위였다. 새로운 변이체 4개, 1세대 변이체 2개, 스크램블 가이드 RNA를 특징으로 하는 1세대 변이체 (모두ABE8.5-m의 맥락에 있음)이, 이후에 AAV2로 패키징되어 ARPE로 변환되었다. 세포 게놈 및 AAV 이식유전자(transgene) 내 편집 결과는 최대 5주까지 여러 시점에서 평가되었다. 세포 게놈 유전자좌는 5주차에 테스트된 모든 변종에 걸쳐 NGS 판독의 약 70~76%에서 편집되었지만(도 1E), 가장 최적화된 변이체에서 동일 시점에서의 복구된 편집 DNA에서는 자기-불활성화 편집량(abundance of self-inactivation edits)이 낮았다 (3.54%) (도 1F). 그러나 동일 분석에서 최적화되지 않은 1세대 변이체와 비교하면 새로운 변이체의 자기-불활성화 비율은 최대 10.4-배까지 향상되었다.

ABE DNA의 자기-불활성화 비율은 일반적으로 플라스미드-기반 및 바이러스-기반 in vitro 분석에서 낮았지만, 회수된 에피소멀 DNA에 대한 자기 불활성화를 측정하는 것에서는 기능적 불활성화 비율이 과소보고될 수 있다는 점이 의심되었다. 예를 들어, 형질 도입된 AAV2의 일부만이 in vitro에서 세포핵으로 수송되는 것으로 보고되었다. (Xiao, P.-J., Li, C., 등. (2012). Quantitative 3D Tracing of Gene-delivery Viral Vectors in Human Cells and Animal Tissues. Molecular Therapy, 20(2), 317-328). 분석에서 AAV 또는 LNP 입자의 일부가 세포질 내에 캡슐화되어 있는 경우, 아마도 염기 편집기에서 접근할 수 없으며, 추가 염기 편집기 mRNA 및 단백질을 만들기 위해 전사되지도 않을 것이다. 세포 내 mRNA는 주어진 시간에 발현되는 단백질을 더 잘 나타내기 때문에, 측정된 양의 차이를 조사하기 위해 mRNA에서 준비된 DNA와 cDNA 모두에 대해 표적화된 앰플리콘 시퀀싱을 수행하였고, 새로운 실험에서 자기-불활성화의 측정된 양의 차이를 조사하였다. 5개의 AAV2-패키지 편집기 변이체와 가이드 RNA가 ARPE-19 세포에 형질도입되었다. 게놈 표적 부위에서, 형질도입 후 2주 후에 테스트된 5개 변이체 모두에서 편집이 강력하였다 (A에서 G로 편집 ~80%) (도 1G). 자기-불활성화 비율은 회수된 에피소멀 DNA에서 측정했을 때 다른 변이체를 사용한 이전 연구와 다시 유사했지만 (<3%), mRNA에서 제조된 cDNA의 표적화된 앰플리콘 시퀀싱은 편집된 ABE 전사체의 비율이 5가지 변이체에서 평균 48.5%에 근접한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 성공적으로 핵으로 전달되어 활발하게 전사된 ABE DNA의 비율이 효율적으로 자기-불활성화되어-2주 후에 거의 50% 가까이 비활성화됨-게놈 표적에서의 동시 편집이 매우 효율적으로 유지됨을 시사한다. 이러한 결과는 또한 유사한 접근방식이 CBE의 자기-불활성화를 위해 수행될 수 있음을 시사하는데, 예를 들어 아연 배위를 담당하는 APOBEC 활성 부위 잔기(Cys 또는 His)는 C에서 T 염기로의 변환을 목표로 하여 두 경우 모두 Tyr을 생성할 수 있다.

실시예 2. 염기 편집 시작 코돈의 돌연변이에 의한 자기-불활성화

또 다른 접근법에서는 ABE의 시작 코돈이 편집기 시작 코돈의 첫 번째 뉴클레오티드를 염기 편집하여 자기-불활성화를 목표로 하였으며, Met1Val 돌연변이(ATG>GTG)가 발생하였다. 대안적으로, 상보적인 DNA 가닥을 표적화함으로써 시작 코돈의 두 번째 뉴클레오티드에서 염기 편집이 가능하며, 이는 Met1Thr 돌연변이(ATG>ACG)를 초래한다. 먼저 이러한 돌연변이가 염기 편집기의 번역을 효과적으로 방지하는지 확인하기 위해 원하는 돌연변이를 ABE8.5-m 발현 플라스미드에 미리 설치하였다. Met1이 돌연변이되면 TadA의 다운스트림 Met12가 대체 시작 코돈으로 기능하는 경우 절단 편집기(truncated editor)가 생성될 가능성이 있다. 이 문제를 회피하기 위한 노력의 일환으로 프레임 외부 ATG 서열이 Met12의 업스트림에 존재하도록 His8의 코돈 사용을 조정하고 세포 게놈 내 관심 부위에서의 염기 편집을 측정하여 돌연변이들의 편집 발현 방지능을 결정하였다 (도 2A). Met1Thr 돌연변이는 Met1Val보다 관심 부위에서의 편집을 더 효과적으로 방지하였고, 프레임외 시작 코돈의 추가로 편집이 절반으로 더 감소하였다 (도 2B).

스트렙토코쿠스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9의 니카아제 변이체를 함유하는 ABE8.5-m DNA에서 Met1Thr 염기 편집을 수행하기 위해 TadA 내에서 프로토스페이서의 편집 윈도우 내부에 자기-불활성화를 위한 표적 염기를 배치할 위치에 NGG PAM서열이 요구되었다. 이러한 조정을 수행하기 위해, TadA 돌연변이 Phe8Trp, Phe8Val 또는 Phe8Ala를 갖는 편집기의 변이체를 제조하여 Met1에서 염기 편집에 활용될 수 있는 3개의 서로 다른 NGG PAM 서열을 생성하였다 (도 2C). 각 변이체는 변경되지 않은 대조군 ABE8.5-m과 비교하여 동일한 효율성으로 세포 개놈 부위를 편집할 수 있었으며, 이는 TadA에서 Phe8의 이러한 돌연변이가 잘 허용된다는 것을 시사한다. 회수된 에피소멀 편집기 DNA의 표적 앰플리콘 시퀀싱에 의해 측정된 자기-불활성화 비율은 각 변이체에 대해 가변적이고 낮았으며 (<3% 염기 변환), 모든 새로운 변이체에 걸쳐 게놈 표적의 동시 편집은 불활성화 가이드 RNA가 결여된 대조군 ABE8.5-m 만큼 효율적이었다 (도 2E). 이러한 결과는 세포 게놈 내의 원하는 위치에서 편집 효율성을 희생하지 않고 단일 A-to-G (A에서 G로의) 염기 편집을 통해 시작 코돈을 비-Met 아미노산으로 변환함으로써 염기 편집기를 자기-불활성화할 수도 있음을 보여준다. 이러한 결과는 또한 번역 개시를 방지하거나 억제하기 위해 Met 시작 코돈이 Ile로 전환될 수 있는 CBE 의 자기-불활성화에 대해 유사한 접근법이 수행될 수 있음을 시사한다.

실시예 3. 맞춤형, 자기-불활성화를 위해 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 인트론 삽입

ABE 자기-불활성화의 유용성을 최대화하기 위해서는, 선택된 ABE의 임의의 변이체에 전반에 걸쳐 이상적 접근 방식이 일반화되어야 하며, 이는 PAM 요구사항(PAM requirement), 편집 윈도우, 및 주어진 표적 부위에서의 상대적 활성에 따라 달라질 수 있다. TadA 활성 부위 잔기, 시작 코돈, 또는 편집기 내 기타 특정 잔기 내에서 편집하여 ABE를 자기-불활성화하기 위한 전략은, 각각 표적 부위의 국소 아미노산 서열 및 효소에 의해 허용되는(tolerated) 임의의 허용 돌연변이(permissive mutations)에 의해 제한된다. 이러한 한계에 대한 해결책 개발을 위해, ABE를 코딩하는 DNA에 작은 인트론을 혼입하는 것의 유용성을 조사하였다 (도 3A). 인트론은 일반적으로 5'-말단에 콘센서스 스플라이스 공여체 서열인 GT, 및 3'-말단에 콘센서스 스플라이스 수용체 서열, AG를 특징으로 한다. 이러한 각 부위는 ABE의 표적이 되어 콘센서스 서열을 각각 GC 및 GG로 변환함으로써 스플라이싱을 중단할 수 있다. 편집기 내의 스플라이스 부위 중 하나가 중단되면, 인트론 시퀀스가 완전히 또는 부분적으로 유지될 수 있으며 이로 인해 염기 편집기 시퀀스의 조기 종료 또는 프레임 이동(frameshift)이 발생할 수 있다. 이 접근법의 주요 진보는 인트론을 맞춤화하고, 이상적인 편집 위치, 프로토스페이서 및 PAM을 제공하는 편집기의 도움이 되는 부분 내에 삽입할 수 있어 자기-불활성화 표적 서열의 설계에 유연성을 제공한다는 것이며, 선택한 염기 편집기 변이체에 따라 지시하는 바와 같은, 효율적인 염기 편집을 촉진할 수 있다는 점이다.

CBE의 인트론-기반 불활성화는 비코딩 DNA 가닥의 C에서 T로의 편집을 통해 GT를 AT로 변환하거나 AG를 AA로 각각 변환함으로써 표준(canonical) 스플라이스 공여체 또는 수용체 부위를 파괴함으로써 가능하다. 또한, 인트론은 대안적으로 Cas9 또는 링커 영역과 같은 편집기의 다른 서브유닛에 삽입될 수 있고, 이는 순환 순열된(circularly permuted) 염기 편집기 변이체 또는 편집기의 다른 구성을 불활성화하는 데 더 유리할 수 있다(Huang, T. P., 등. (2019). Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors. Nat Biotechnol, 37(6), 626-631; Nguyen Tran, M. T., 등. (2020) Engineering domain-inlaid SaCas9 adenine base editors with reduced RNA off-targets and increased on-target DNA editing. Nat Commun, 11(1), 4871).

ABE의 진화된 TadA 컴포넌트는 원래 박테리아에서 유래하였으므로 기본적으로 인트론이 부족하다. 인트론의 포함이 ABE 발현에 해로운지 확인하기 위해 인트론 함유 ABE 변이체에 의해 촉매되는 게놈 표적 부위에서 편집 속도를 측정하고 인트론이 없는 대조군 ABE와 비교하였다. 자기-불활성화 가이드 RNA는 실험에 포함되지 않았다. 편집기의 전체 크기를 최대한 작게 유지하기 위해 작은 인트론(≤ ~150 bp)만 테스트하였다. 인간 베타 글로빈 및 마우스 IgG 유전자로부터 유래된 9개의 인간 인트론 세트와 1개의 키메라 인트론을 TadA의 코돈 87 바로 뒤에 삽입하였다. 또한, 인트론의 위치가 편집 속도에 영향을 미치는지 확인하기 위해 인트론의 서브유닛을 TadA에서 코돈 62 바로 뒤 또는 코돈 23의 두 번째 뉴클레오티드 뒤에 삽입하였다. 각각의 인트론 위치는 검사 중인 편집기 변이체의 알려진 염기 편집 윈도우 내에 필요한 인트론 편집을 배치하는 TadA 코딩 서열 내의 NGG PAM 서열에 대한 상대적인 근접성을 위해 선택되었다. HEK293T 세포의 게놈 표적 부위에서 이러한 인트론 함유 변이체의 편집 효율성은 인트론 서열과 TadA 내 삽입 위치에 따라 달라졌으며 (도 3B), 이는 일부 구성이 다른 구성보다 더 효율적으로 스플라이싱되었음을 시사한다. TadA 잔기 87 (NF1, PAX2, EEF1A1, Chimera, and SLC50A1)에 있는 5개의 서로 다른 인트론은 게놈 DNA에서 높은 편집 효율성을 유지하였다. 또한 인트론 키메라 및 ABCB11은 TadA의 잔기 62 또는 23에 삽입될 때 상대적으로 높은 수준의 편집을 허용하였다. 나머지 4개의 인트론(BRSK2, PLXNB3, TMPRSS6, and IL32)을 포함하는 ABE 변이체는 관심 부위에서 편집을 생성하지 않거나 대조군에 비해 편집 속도가 크게 감소하였다. TadA 잔기 87에서 7개의 추가 인트론의 활성을 테스트한 결과 모두 동등하게 잘 허용되었다(tolerated) (도 3C). 이러한 데이터는 맞춤형 인트론 서열이 게놈 부위에서 편집 활성을 희생하지 않고 ABE 유전자의 TadA 서브유닛에 삽입될 수 있음을 나타낸다.

이 시스템에서는, 진행생물에서 발견되는 공통 스플라이스 공여체 및 수용체 서열을 특징으로 하는 인트론이 선택되었다. 그러나 이러한 디뉴클레오티드 서열은 모든 진핵생물 인트론에 걸쳐 완전히 보존되지 않으며 돌연변이에 대한 민감도는 다양할 수 있다. 따라서 원하는 스플라이스 수용체 부위 또는 공여체 부위 편집은 TadA 인트론 내에 미리 설치되었고, 염기 편집 활동을 게놈 부위에서 평가하여 인트론이 없는 ABE8.5-m과 비교하여 해당 불활성화 수준을 결정하였다. TadA 잔기 87의 인트론 NF1, PAX2, EEF1A1, ANTXRL, PKHD1L1, PADI1, HMCN2, ENPEP-gecko, 및 HMCN2-salmon은 미리 설치된 스플라이스 수용체 돌연변이에 의해 완전히 파괴되었다 (도 3D). 이 9개의 인트론 구성은 이전 실험에서 볼 수 있듯이 돌연변이가 없는 경우 가장 효율적인 ABE 변이체 중 하나였고, 이는 이러한 변이체가 단일 A-to-G(A에서 G로의 변환) 염기의 존재 여부에 따라 바이너리 모드(binary fashion)로 기능함을 시사한다. NR1 및 PAX2 인트론도 스플라이스 공여체 돌연변이에 의해 불활성화 되었지만 EEF1A1은 그렇지 않았다. 키메라 인트론은 스플라이스 공여체 또는 수용체 부위의 돌연변이에 의해 완전히 교란되지 않은 유일한 변종이었다. 미리 설치된 스플라이스 수용체 또는 공여체 돌연변이가 있거나 없는 추가 구성도 테스트되었으며, 이는 TadA 잔기 18, 59 또는 129에 위치한 NF1 인트론이 스플라이스 수용체 돌연변이에 의해 완전히 불활성화되고 EEF1A1이 TadA 잔기 18 또는 59에 위치할 때 스플라이스 수용체 돌연변이에 의해 불활성화되었음을 추가로 입증하였다 (도 3E). 이러한 데이터는 TadA 내의 비천연 인트론(unnatural intron)의 스플라이싱이 스플라이싱 부위에서 A에서 G로의 치환에 의해 완전히 중단될 수 있으며, 편집이 DNA의 염기 편집 활동을 제거할 수 있음을 보여주었다. 또한, 이러한 데이터는 편집기를 사용하여 인트론을 배치하면 스플라이스 부위 돌연변이에 대한 민감도와 인트론의 전반적인 스플라이싱 성능에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.

인트론 변이체가 각각의 스플라이스 부위에서 효율적으로 염기 편집될 수 있는지 확인하기 위해 HEK293T 세포를 ABE 변이체, 매칭되는 자기-불활성화 가이드 RNA, 및 게놈 부위를 표적으로 하는 가이드 RNA를 코딩하는 플라스미드로 리포펙션하였다. TadA 잔기 87에 있는 인트론 NF1 및 PAX2의 스플라이스 공여체 부위를 표적으로 하여 게놈 부위에서 높은 편집 속도를 유지하였고, 인트론 공여체 부위 내 자기-불활성화 편집 정도는 회수된 플라스미드 DNA에서 ~6%만큼 높았다 (도 3F). 대안적으로, TadA 잔기 87에서 NF1의 스플라이스 수용체 부위에서의 자기-불활성화 편집 양은 30%였으며, 동시에 게놈 부위에서도 효율적인 편집을 유지하였다 (도 3G).

TadA 잔기 87 (NF1, PAX2, 및 EEF1A1)에서 잘 수행된 인트론의 추가 구성을 평가하였다. 이 세트는 TadA의 코돈 129, 59, 및 18 뒤에 삽입되었고, 상응하는 미리 설치된 스플라이스-수용체 돌연변이도 준비되었다. 미리 설치된 돌연변이가 결여된 NF1 변이체의 편집 효율은 인트론이 삽입된 위치에 따라 달라졌다 (도 3H). PAX2 및 EEF1A1은 모든 구성에서 높은 게놈 편집을 유지했으나, 돌연변이가 사전 설치된 경우 이러한 인트론은 TadA 내의 모든 위치에서 일관되게 불활성화되지 않았다.

자기-불활성화 가이드 RNA에 의해 표적화되는 이들 변이체 각각의 능력을 조사하였다. TadA 잔기 59에서 NF1의 자기-불활성화 속도는 TadA 잔기 87에서 NF1의 것과 유사했다 (도 3I). 또한, 인트론 서열 ANTXRL, PKHD1L1, PADI1 및 ENPEP-gecko는 스플라이스 수용체 부위에서 가이드 의존적 자기-불활성화에 대해 TadA 잔기 87에서 테트스되었으며, 이는 이 인트론 세트는 이 구성에서 돌연변이에 의해 완전히 불활성화되는 것으로 이전에 검증되었기 때문이다. 이들은 동일 실험에서 NF1, PAX2 및 EEF1A1과 비교되었으며, NF1이 자기-불활성화 가이드 RNA에 의해 가장 효율적으로 표적화되었고, PAX2 및 ANTXRL이 그 뒤를 이었다 (도 3J). 나머지 인트론 각각은 유사하고 낮은 수준의 가이드 RNA 의존적 자기-불활성화를 나타냈다. 특히, 인트론 또는 자기-불활성화 가이드 RNA가 결여된 ABE8.5-m 변이체와 비교하여, 이들 예 중 어느 것에서도 자기-불활성화 가이드 RNA의 존재로 인해 게놈 부위의 염기 편집 활동이 방해받지 않았다. 이러한 데이터는 인트론이 TadA 내에 전략적으로 배치되어 가이드 RNA 의존적 방식으로 시간이 지남에 따라 염기 편집 활동을 차단하는 데 활용될 수 있는 수정 가능한 염기 편집 표적 부위를 제공할 수 있음을 보여주었다. 이러한 결과는 또한 자기-불활성화 속도가 추가 가이드 RNA에 의해 지시되는 호스트 게놈 DNA 내의 원하는 부위에서 효율적인 염기 편집을 동시에 허용할 만큼 충분히 느리다는 것을 입증하였다.

회수된 에피소멀 DNA의 시퀀싱에 의한 자기-불활성화 비율이 인트론 기반 연구에서 자기-불활성화의 기능적 수준을 과소보고하는지 확인하기 위해, TadA 잔기 87에서 NF1 또는 PAX2 인트론, 스플라이스 수용체 부위를 표적하는 매칭 자기-불활성화 가이드 RNA, 및 게놈 부위를 표적하는 제2 가이드 RNA를 함유하는 ABE8.5-m을 발현하는 플라스미드로 리포펙션을 다시 수행하였다. 표적 앰플리콘 시퀀싱을 통해 인트론 변이체로 처리된 세포의 게놈 DNA에서 관찰된 편집양은 인트론 또는 자기-표적화 가이드 RNA가 없는 대조군 ABE8.5-m 편집기의 편집양과 유사했다. 회수된 에피소멀 DNA로부터 측정된 자기-불활성화 편집양은 NF1 및 PAX2에 대해 각각 5.38% 및 4.16%였다. 세포의 RNA로부터 기능성 불활성화 비율을 결정하기 위해, RNAseq 분석을 수행하였으며, 스플라이싱된 ABE 전사체와 스플라이싱되지 않은 ABE 전사체 사이의 크기 차이로 인하여 발생할 수 있는 가능한 PCR 편향을 피하기 위해 전체 mRNA에 대해 분석하였다. 플라스미드에서 측정된 인지된 불활성화 비율과는 완전히 대조적으로, NF1 전사체의 >84%는 편집되고, 스플라이싱되지 않은 인트론을 함유했으며, 전사체의 3.7%만이 기능적으로 스플라이싱되었다 (도 3L). 나머지 ABE 전사체의 대부분 (11.25%)에는 전사체 내에 유지된 편집되지 않은 인트론이 함유되어 있어 번역 중에 조기 종료가 발생하고, 소수의 전사체(0.66%)가 대안적으로 스플라이싱되었다. 유사하게, PAX2 전사체의 >79%는 편집되고, 스플라이싱되지 않은 인트론을 포함하였으며, 전사체의 ~16.5%는 기능적으로 스플라이싱되었다 (도 3M). 이러한 데이터는 5일간의 실험이 끝났을 때 활발하게 전사된 ABE DNA의 대부분이 스플라이싱 발생을 방지하는 편집된 인트론 서열을 포함하고 있음을 시사하므로 염기 편집기의 발현이 감소했을 것이라고 또한 합리적으로 가정할 수 있다.

마지막으로, TadA 잔기 87에 위치한 NF1 인트론을 AAV 전달로 테스트하였다. 편집기 및 가이드 RNA는 AAV2에 패키징되었고, 이는 in vitro에서 ARPE-19 세포를 변환하는데 사용되었으며, 편집 속도는 변환 후 2-주에 평가되었다. 표적 앰플리콘 시퀀싱을 통해 게놈 DNA 편집은 원하는 표적 부위(~76% A-에서-G)에서 강력했지만, 회수된 AAV 게놈의 편집 비율은 인트론의 스플라이스 수용체 부위에서 낮았다(~5.4% A-에서-G) (도 3N). 대조적으로, 전체 mRNA에 대한 RNA-seq 분석은 전사체의 ~88.5%가 편집되고, 유지된 인트론을 포함하는 훨씬 더 높은 자기-불활성화 효율을 보여주었다. 이 데이터는 AAV에 의해 전달된 염기 편집기가 두 번째 가이드 RNA에 의해 수행되는 효율적인 게놈 편집을 허용하는 시간 단위로 스플라이싱을 변경하여 자기-불활성화될 수 있음을 보여준다.

실시예 4: 표적 게놈 부위의 동시 자기-불활성화 및 염기 편집의 효율성 평가

ABE8.5-m 및 가이드 RNA의 다양한 조합을 포함하는 염기 편집기 시스템을 사용하여 동시 자기-불활성화 및 표적(즉, “원하는”) 게놈 부위 염기 편집의 효율성을 평가하기 위한 실험이 수행되었다. 가이드 RNA 중 하나는 표적 게놈 부위를 편집하는 데 사용되었고, 다른 하나는 ABE8.5-m의 자기-불활성화에 사용되었다. 자기-불활성화를 위한 두 가지 다른 전략을 사용하여 자기-불활성화 및 대상 부위 염기 편집의 효율성 평가를 위한 실험이 수행되었다. 전략에는 1) E59G 변경을 통한 ABE8.5-m의 TadA 촉매 부위 변경을 통한 자기-불활성화, 2) ABE8.5-m을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내에 삽입되는 NF1 또는 PAX2 인트론의 스플라이스-수용체 부위 변경을 통한 자기-불활성화가 포함되었다. 인트론은 ABE8.5-m의 TadA 데아미나아제의 코돈 87 다음에 ABE8.5-m을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내에 삽입되었다. E59G 자기-불활성화 변경은 가이드 RNA v1, v122, v224, v139, v110, 또는 v113을 사용하여 도입되었다 (서열은 표 1B에 제공된다). NF1의 스플라이스-수용체 부위에 대한 자기-불활성화 변경은 가이드 g235를 사용하여 도입되었고 (표 1B 참조), PAX2의 스플라이스 수용체 부위에 대한 자기-불활성화 변경은 가이드 g239를 사용하여 도입되었다 (표 1B 참조). 이 예 전체에서, 표적 게놈 부위를 편집하는 데 사용된 가이드는 g756이었다 (표 1B 참조). ARPE-19 세포는 NF1 또는 PAX2 인트론 삽입 유무에 관계없이 ABE8.5-m을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 AAV2 바이러스 입자를 사용하여, 도 4A 내지 4C에 도시된 바와 같이, 표적 게놈 부위의 염기 편집 및 ABE8.5-m의 TadA 데아미나아제 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부위에 대해 자기-불활성화를 촉진하기 위한 가이드 RNA와 함께 감염되었다. 게놈 부위에서의 원하는 (즉, “표적”) 염기 변환 및 ABE8.5-m의 자기-불활성화에 대한 백분율(%)을 DNA 차세대 시퀀싱 및/또는 RNA-seq.을 사용하여 측정하였다. 측정은 형질도입 후 1, 3, 5주에 이루어졌다. 음성 대조군으로서, 세포는 또한 서열-스크램블(“scrmbl”가이드를 사용하여 형질도입되었다. 도 4A 내지 4C에 도시된 바와 같이, ABE8.5-m 염기 편집기 시스템은 표적 게놈 부위를 자기-불활성화하고 편집하는 것이 동시에 가능했다. 다음으로, 표적 게놈 부위의 염기 편집 및 ABE8.5-m의 자기-불활성화에 대한 AAV2 용량의 효과를 결정하기 위해 적정 실험을 수행하였다 (도 5A 및 5B 참조). ABE8.5-m는 위에서 설명한 대로 ABE8.5-m 내에 삽입된 NF1 인트론의 스플라이스 수용체 부위를 변경하거나, 또는 위에서 설명한 대로, 가이드 RNA v110을 사용하여, E59G 변경을 도입하여 자기-불활성화되었다 (표 1B 참조). ARPE-19 세포는 NF1 또는 AAV2 인트론 삽입 유무에 관계없이 ABE8.5-m을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 AAV2 바이러스 입자를 사용하여, 도 5A 및 5B에 도시된 바와 같이, 표적 게놈 부위의 염기 편집 및 ABE8.5-m의 TadA 데아미나아제 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부위에 대해 자기-불활성화 염기-편집을 촉진하기 위한 가이드 RNA와 함께 감염되었다. 세포는 89k vg/세포 (높음), 17 k vg/세포 (중간) 또는 9k vg/세포 (낮음)의 용량으로 AAV2 입자를 사용하여 형질도입되었다. 형질도입 후 3, 7, 14주 후에 수행된 차세대 DNA 시퀀싱 측정을 통해 결정된 바와 같이, 표적 게놈 부위의 염기 편집 효율성은 투여량에 따라 증가하는 반면, 자기-불활성화 비율은 평가된 투여량 전반에 걸쳐 동일하게 유지되는 것으로 확인되었다. 또한 자기-불활성화 및 표적 게놈 부위 변경 모두에 대한 염기 편집 효율성은 시간에 따라 증가하는 것으로 관찰되었다.

다음으로, 위에서 설명한 두 가지 자기-불활성화 전략을 사용하여 동시 표적 게놈 부위 염기 편집 및 자기-불활성화에 대한 효율성을 결정하기 위한 실험을 수행하였다 (도 6A 및 6B 참조). E59G 자기-불활성화 변경은 가이드 RNA v110을 사용하여 도입되었다 (표 1B 참조). NF1의 스플라이스-수용체 부위에 대한 자기-불활성화 변경은 가이드 g235를 사용하여 도입되었고, PAX2의 스플라이스 수용체 부위에 대한 자기-불활성화 변경은 가이드 g239를 사용하여 도입되었다. 표적 게놈 부위를 편집하는 데 사용된 가이드는 g756이었다 (표 1B 참조).

ARPE-19 세포는 NF1 또는 PAX2인트론 삽입 유무에 관계없이 ABE8.5-m을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 AAV2 바이러스 입자를 사용하여, 도 6A 및 6B에 도시된 바와 같이, 표적 게놈 부위의 염기 편집 및 ABE8.5-m의 TadA 데아미나아제 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부위에 대해 자기-불활성화를 촉진하기 위한 가이드 RNA와 함께 감염되었다. 게놈 부위에서의 원하는 (즉, “표적”) 염기 변환 및 ABE8.5-m의 자기-불활성화에 대한 백분율(%)을 DNA 차세대 시퀀싱 및/또는 RNA-seq.을 사용하여 측정하였다. 측정은 형질도입 후 4, 7, 및 14주에 이루어졌다. 도 6A 및 6B에 도시된 바와 같이, ABE8.5-m 염기 편집기 시스템은 표적 게놈 부위를 동시에 자기-불활성화하고 편집할 수 있었다.

위에서 설명한 두 가지 자기-불활성화 전략을 사용하여 동시 표적 게놈 부위 염기 편집 및 자기-불활성화에 대한 효율성을 결정하기 위한 실험을 수행하였으며 (도 7A 및 7B 참조), 여기서 세포는 플라스미드를 사용하여 형질도입되었다 (즉, 리포펙션). E59G 자기-불활성화 변경은 가이드 RNA v110을 사용하여 도입되었다 (표 1B 참조). NF1의 스플라이스-수용체 부위에 대한 자기-불활성화 변경은 가이드 g235를 사용하여 도입되었다. 표적 게놈 부위를 편집하는 데 사용된 가이드는 g756이었다 (표 1A 참조).

HEK293T 세포는, 도 7A 및 7B에 도시된 바와 같이, 표적 게놈 부위의 염기 편집 및 ABE8.5-m의 TadA 데아미나아제 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부위에 대해 자기-불활성화 염기 편집을 촉진하기 위한 가이드 RNA와 함께, NF1 인트론 삽입 유무에 관계없이 ABE8.5-m을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 지질 나노 입자와 접촉시켰다. 게놈 부위에서의 원하는 (즉, “표적”) 염기 변환 및 ABE8.5-m의 자기-불활성화에 대한 백분율(%)을 각각 DNA 차세대 시퀀싱 및/또는 RNA-seq.을 사용하여 측정하였다. 음성 대조군으로서, 세포는 또한 서열-스크램블(“”가이드를 사용하여 형질도입되었다. 형질도입 후 2주 및 7주에 측정을 수행하였다. 도 7A 및 7B에 도시된 바와 같이, ABE8.5-m 염기 편집기 시스템은 표적 게놈 부위를 자기-불활성화하고 편집하는 것을 동시에 수행할 수 있었으며, 자기-불활성화 및 표적 게놈 부위 편집의 효율성은 모두 시간이 지남에 따라 증가하였다.

다음으로, AAV8 바이러스 입자를 사용하여 세포를 형질도입한 위에서 설명한 두 가지 자기-불활성화 전략 (도 8A 및 8B 참조)을 사용하여 동시 표적 게놈 부위 염기 편집 및 자기-불활성화에 대한 효율성을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. E59G 자기-불활성화 변경은 가이드 RNA v110을 사용하여 도입되었다 (표 1B 참조). NF1의 스플라이스-수용체 부위에 대한 자기-불활성화 변경은 가이드 g235를 사용하여 도입되었다. 표적 게놈 부위 편집에 사용된 가이드는 g756이었다 (표 1B 참조). ARPE-19 세포는, 도 8A 및 8B에 도시된 바와 같이, 표적 게놈 부위의 염기 편집 및 ABE8.5-m의 TadA 데아미나아제 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부위에 대한 자기-불활성화 염기-편집을 촉진하기 위하여 가이드 RNA와 함께, NF1 인트론 삽입 유무에 관계없이, ABE8.5-m을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 AAV8 바이러스 입자를 사용하여 감염되었다. 게놈 부위에서의 원하는 (즉, “표적”) 염기 변환 및 ABE8.5-m의 자기-불활성화에 대한 백분율(%)을 DNA 차세대 시퀀싱 및/또는 RNA-seq.을 사용하여 측정하였다. 음성 대조군으로서, 세포는 또한 서열-스크램블(“”가이드를 사용하여 형질도입되었다. 형질도입 후 4주(도 8A) 및 4주(도 8B)에 측정을 수행하였다. 도 8A 및 8B에 도시된 바와 같이, ABE8.5-m 염기 편집기 시스템은 표적 게놈 부위를 자기-불활성화하고 편집하는 것을 동시에 수행할 수 있었다.

상기 실시예는 다음의 재료 및 방법을 사용하였다.

일반적인 방법

실시예 1-3에서 사용된 작제물은 USER 효소 클로닝, 제한 효소 소화 및 T4 DNA 결찰, Gibson 어셈블리를 통해 생성되거나, 또는 Genewiz에 의해 합성되었다. 모든 PCR 반응에는 푸션 U DNA 폴리머라아제 그린 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스(Phusion U DNA Polymerase Green MultiPlex PCR Master Mix, Thermo Fisher) 또는 Q5 핫 스타트 HiFi 2x 마스터 믹스 (Q5 Hot Start HiFi 2x Master Mix, New England Biolabs)가 사용되었다. 인트론은 IDT(Integrated DNA Technologies)로부터 유전자 단편을 주문하였다. 플라스미드 리포펙션에 의해 수행된 실험 및 AAV 형질도입에 의해 수행된 실험을 포함한 모든 실험은, Cfa(GEP) 스플릿 인테인 융합을 사용하여 재조합된 스플릿 염기 편집기를 사용하였고, 여기서 편집기는 Asn309와 Thr310에 해당하는 아미노산 잔기 사이에서 스플릿되었고, Cas9 및 잔기 310은 Thr310Cys으로 돌연변이 되었다. 스플릿 편집기는 각각 공동-형질감염 또는 공동-형질도입이 필요한 두 개의 개별 플라스미드 또는 AAV 벡터에 의해 코딩되었다. 각 ABE 단편은 CMV 프로모터로부터 발현되었다. 하나 이상의 가이드 RNA는 또한 염기 편집기의 N-말단 스플릿을 코딩하는 벡터에서 직렬로(in tandem) 코딩되었고, 가이드 RNA는 U6 프로모터를 사용하여 발현되었다. 가이드 RNA는 IDT에서 주문한 어닐링된, 상보적 올리고의 결찰을 통해 소화된 수용체 플라스미드(digested recipient plasmids)에 삽입되었다. 가이드 올리고는 샘플을 95℃에서 3분 동안 가열하고, 0.1℃/초의 속도로 20℃로 냉각하여 IDT 이중 완충액에서 어닐링되었다. 플라스미드 DNA는 100 μg/mL 카르베니실린(carbenicillin)을 함유하는 LB 배지에서 성장한 Mach1 (Thermo Fisher) 또는 NEB 안정한 세포 배양물 (New England Biolabs) 35 mL로부터 QIAGEN 플라스미드 플러스 키트를 사용하여 준비되었다. 게놈 표적 부위를 표적으로 하는 모든 실험에서, 원하는 편집은 연구에 사용된 모든 세포주에 렌티바이러스로 혼입된 ABCA4 c.5882G>A 점 돌연변이의 A에서 G로의 변환에 해당한다. 세포의 리포펙션 또는 형질도입으로 인한 편집 활성은 기술적 복제물로부터 측정하였다.

AAV 생산 및 적정

rAAV 벡터는 HEK293T 세포의 현탁배양물을 (a) AAV Rep 유전자 및 Cap 유전자, (b) 반전 말단 반복부 (inverted terminal repeat, ITR) 서열이 측면에 있는 트랜스유전자, 및 (c) AAV 복제에 필요한(헬퍼 플라스미드) 아데노바이러스 유전자 (E4, E2a 및 VA)를 함유하는 플라스미드로 일시적 삼중 형질감염(transient triple transfection)을 사용하여 제조되었다. 형질감염 72시간 후, 세포를 용해시키고 Triton X-100, MgCl₂및 터보뉴클레아제(Turbonuclease)를 각각 최종농도 0.25% (v/v), 2 mM, 및 10 U/ml로 첨가하여 패키징되지 않은 DNA를 제거하였다. 용해는 쉐이커 인큐베이터에서 37°C에서 2-5시간 동안 수행되었다. 세포 용해물은 정제 심층 필터(clarification depth filter)를 통해 여과된 후 0.2-마이크론 여과를 수행하였다. 정제된 용해물을 Cytiva AKTA 퓨어 크로마토그래피 시스템을 사용하여, 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 포획된 AAV는 pH 2.5-3에서 용출 완충액을 사용하여 용출되었다. 용출액을 포착하고 pH를 즉시 중화하였다. 차거나 빈(full and empty) AAV 입자를 염화세슘 밀도 구배 초원심분리에 의해 분리하였다. 찬(full) AAV 입자를 함유하는 밴드를 수집하고, 역가를 qPCR로 결정하였다. 찬 입자 샘플을 CsCl 스톡 용액에서 최종 목표 농도로 희석하고, 적절한 사이즈의 투석 카세트(MWCO 100 kDa)을 사용하여 제형 완충액(10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, 2.7 mM KCl, 192 mM NaCl, 0.001% Pluronic F-68; pH 7.4)으로 투석하였다. 투석액은 단백질 결합이 낮은 0.1-마이크론 주사기 필터를 사용하여 여과한 후 분취하여 -80°C에서 보관하였다. 최종 AAV 역가는 바이알화된 물질로부터 액적 디지털 PCR (ddPCR)을 사용하여 결정되었다. 내독소 수준, 응집 상태, 삼투압 및 pH와 같은 기타 품질 속성도 또한 결정되었다.

렌티바이러스 삽입을 사용한 혼입된 관심 표적 부위를 함유하는 세포주의 생성

렌티바이러스 생산 플라스미드는 엑손 42 전 72-bp에서 시작하여 엑손 42 후 123-bp까지의 서열 및 ABCA4 c.5882G>A 에 해당하는 점 돌연변이를 포함하는 인간 ABCA4 유전자 단편을 코딩하는 5' Hpal 및 3' Apal 측면 g-블록 (5' HpaI and 3' ApaI flanked g-block, IDT에서 입수)을 사용한 제한 클로닝(restriction cloning)에 의해 생성되었다. G-블록을 Hpal/Apal 분해된 pLenti6.4 R4R2 V5-DEST벡터 (Thermo Fisher Scientific)에 연결하고, 최종 플라스미드를 Vigene Biosciences에서 소규모 렌티바이러스 생산에 사용하였다. 렌티바이러스는 HEK293T 세포 [CRL-3216, American Type Cell Culture Collection (ATCC)] 및 ARPE-19 세포 (CRL-2302, ATCC)를 감염 다중도 (multiplicity of infection, MOI) 0.3-10 IFU/세포로 형질도입하는 데 사용되었다. 안정적으로 혼입된 세포는 10 μg/mL 블라스티시딘(blasticidin)이 보충된 기본 배지(base media)에서 성장하여 선택되었고, 일단 확립되면, 세포는 5 μg/mL의 블라스티시딘이 보충된 기본 배지에서 유지되었다. MOI에 의해 풀링된 각 세포 집단 내의 세포당 렌티바이러스 혼입(lentiviral integrations) 평균 수는 바이러스 혼입된 ABCA4 단편(virally integrated ABCA4 fragment)과 내인성 ABCA4 유전자좌(endogenous ABCA4 locus)를 동시에 증폭시키기 위해 프라이머 oBTx361 및 oBTx362를 사용하는 표적 앰플리콘 서열분석에 의해 평가되었다. 각 샘플의 바이러스 혼입수는 ABCA4 c.5882G>A 돌연변이를 함유하는 NGS 판독수에 2를 곱하고, 야생형 판독수로 나눈 값으로 추정하였다 (혼입수 = 돌연변이 판독수 X 2 / WT 판독수). 모든 염기 편집 실험에는 세포당 평균 2개 이하의 혼입을 함유하는 세포주 풀이 사용되었다.

HEK293T 세포의 배양

세포를 5% CO₂와 함께 37°C에서 배양하였다. 렌티바이러스 혼입 세포는 10%(v/v) 우태아 혈청 (A31606-02, Thermo Fisher Scientific) 및 5 μg/ml 블라스티시딘 S HCl (A1113903, Thermo Fisher Scientific)이 함유된 둘베코 변형 이글스 배지 플러스 글루타맥스 (Dulbecco's modified Eagles medium plus Glutamax, 10566-016, Thermo Fisher Scientific)에서 유지하였고, ATCC에 의한 배양 방법을 따랐다.

ARPE-19 세포의 배양

세포를 5% CO₂와 함께 37°C에서 배양하였다. 렌티바이러스 혼입 세포는 10%(v/v) 우태아 혈청 (A31606-02, Thermo Fisher Scientific) 및 5 μg/ml 블라스티시딘 S HCl (A1113903, Thermo Fisher Scientific)이 함유된 둘베코 변형 이글 배지/배양 혼합물 F-12(DMEM/F-12) (11320033, Thermo Fisher Scientific)에서 유지하였고, ATCC에 의한 배양 방법을 따랐다.

플라스미드 형질감염

HEK293T 세포를 Corning® CellBIND®웰 다중 웰 플레이트 (3338, Corning)에 10% (v/v) FBS를 포함하고, 블라스티시딘이 없는 둘베코 변형 이글스 배지 플러스 글루타맥스에 웰당 35,000 세포 밀도로 접종하였다. 세포는 접종 후 ~24시간 동안 형질감염되었다. 스플릿 염기 편집기 및 최대 2개의 가이드 RNA를 함유하는 상보적 플라스미드 쌍을 1:1 몰비로 결합하여 총 1000 ng에 도달한 후 1.5 μL 리포펙타민 2000 (Thermo Fisher Scientific) 및 Opti-MEM 환원 혈청 배지 (Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 총 부피 25 μl로 하였다. 반응 혼합물을 제조사 지시서에 따라 웰에 첨가하였다. 세포 용해 전 5-일(120 시간) 동안 48시간마다 배지를 교체하였다.

AAV 형질도입

ARPE-19 세포를 Corning® CellBIND® 48웰 다중 웰 플레이트에 웰당 23,000개 세포의 밀도로 10% FBS를 포함하고, 블라스티시딘이 없는 DMEM/F-12 배지에 접종하였다. 접종 후 약 24시간 후에 배지를 제거하고 스플릿 염기 편집기를 포함하는 2개의 AAV 각각을 FBS가 결여된 DMEM/F-12의 웰당 총 부피 125μl로 세포당 바이러스당 50,000개의 바이러스 게놈으로 희석하였다. 세포를 37°C, 5% CO₂, 3시간 동안 바이러스와 함께 배양하고 20% FBS가 포함된 DMEM/F-12 125μl를 각 샘플에 첨가하여 최종 농도가 10% FBS가 되도록 하였다. 표준 AAV 형질도입 실험을 위해 세포 용해 전 14-일 동안 48시간마다 배지를 DMEM/F-12 및 10% FBS로 교체하였다. 시간 경과 실험의 경우, 5-주 동안 7일마다 복제물을 용해시켰다.

게놈 DNA 및 편집기 DNA의 추출

배지를 제거하고 세포를 100μl의 1x PBS(Thermo Fisher)로 두 번 세척한 후 75 μl의 세포 용해 완충액(10mM Tris·HCl(pH 8.0) + 0.05% SDS + 100μg/mL Proteinase K)을 첨가하였다. 웰을 피펫 팁(다중 채널 사용)으로 긁어내고 즉시 96웰 플레이트로 옮겼다. 96웰 플레이트를 55°C에서 1시간 동안 배양한 후 95°C에서 20분 동안 열 불활성화하였다. 그런 다음 샘플을 -20°C에 보관하였다.

대안적으로, 자기-불활성화 분석에 영향을 미치는 잔류 세포외 플라스미드 DNA의 존재 가능성을 완화하기 위한 시도로 용해 전에 Turbo DNAse(Thermo Fisher)를 포함한 추가 세척 단계를 테스트하였다. Turbo DNase를 첨가하거나 첨가하지 않은 경우 NGS 분석에서도 동일한 결과가 나오므로 후속 실험에서는 Turbo DNAse를 제외하였다.

표적 앰플리콘 서열분석을 위한 mRNA의 cDNA로의 역전사

제조사의 프로토콜에 따라 MagMAX™ mirVana™를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. RevertAid RT Reverse Transcription Kit(K1691, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 총 RNA를 cDNA로 역전사시켰으며, 반응에서 무작위 6량체 프라이머(random hexamer primer)를 제외하고 고정된 올리고 dT 프라이머를 대신 사용했다는 점을 제외하고는 제조업체의 프로토콜을 따랐다(5' - TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTNN(서열번호 481)). 역전사 반응을 25°C에서 10분, 37°C에서 60분, 95°C에서 5분 동안 배양하였다. 조 cDNA는 다운스트림 응용 분야에서 직접 사용되었다.

표적 앰플리콘 시퀀싱 DNA 및 cDNA 샘플

세포 용해물 (2 μL) 또는 cDNA를 Q5 Hot Start HiFi 2x 마스터 믹스와 5' Illumina 어댑터 오버행을 포함하는 각 프라이머 0.5 μM이 포함된 25 μL PCR 반응에 첨가하였다. 각 샘플은 두 개의 고유한 프라이머 쌍을 사용하여 두 개의 별도 반응으로 증폭되었다: 한 쌍은 관심 있는 세포 게놈 부위(oBTx360 및 oBTx368) 옆에 있고 다른 쌍은 편집기 DNA 서열의 원하는 편집 부위 옆에 있다. 프라이머 oBTx360 및 oBTx368은 ABCA4의 엑손 42 및 ABCA4 단편 옆에 있는 V5 태그에 프라이밍하여 렌티바이러스로 혼입된 게놈 표적 부위를 선택적으로 증폭시킨다. PCR 반응은 다음과 같이 수행되었다: 95°C에서 2분, 30주기 (95°C에서 15초, 65°C에서 20초, 72°C에서 20초), 및 최종 72°C 연장 2분 동안. 증폭 후, 증폭된 관심 부위를 포함하는 2μL의 조 PCR 산물은 0.5 μM의 각 고유 Illumina 바코드 프라이머 쌍과 Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix 총 부피 25μL를 사용하여 바코드화되었다. 반응은 다음과 같이 수행되었다: 98°C에서 2분, 10주기 (98°C에서 20초, 60°C에서 30초, 72°C에서 30초), 최종 72°C 연장 2 분 동안. 그런 다음 동일한 양의 바코드 PCR 산물을 모으고 0.6X 비드/샘플 비율을 사용하는 SPRISelect 상자성 비드(Beckman Coulter)를 사용하여 세척하였다. 용출된 DNA 농축액은 Qubit 4(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정량화하고 제조사의 프로토콜에 따라 Illumina MiSeq 장비를 사용하여 서열을 분석하였다.

총 mRNA의 RNA-seq

위에서 설명한대로 세포를 배양하고 형질 감염시켰다. 실험이 끝나면 배지를 제거하고 세포를 50 μL TrypLE™Express Enzyme(1X), 페놀 레드(12605036, Thermo Fisher Scientific)로 분리 및 해리하였다. 그런 다음 세포를 펠렛화하고 완전 배지로 한 번 세척한 다음 두 개의 펠렛으로 나누었다: 하나는 위에서 설명한 대로 DNA의 표적 서열 분석에 사용하고 다른 하나는 RNA-seq에 사용되었다. 제조사의 프로토콜에 따라 MagMAX™ mirVana™를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 다음으로, 제조사의 지시서 (NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module(NEB E7490)과 함께 사용하기 위한 프로토콜)에 따라 Illumina (E7760L, New England Biolabs)용 NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit를 사용하여 200ng의 총 RNA를 처리하였다. 최종 cDNA 산물은 TapeStation(Agilent)로 정량하고, 4nM으로 노멀라이즈하였으며, 동일 부피로 모은 다음 제조사의 프로토콜에 따라 Illumina NextSeq 550 기기를 사용하여 시퀀싱하였다.

앰플리콘(Amplicon) 시퀀싱 분석 세부정보

1. FASTQ 파일은, 다음 파라미터와 함께, 일루미나 blc2fastq (v2.20.0.422)를 사용하여 MiSeq 기기에서 생성된 베이스 콜 파일(BCF)에서 생성되었다.

Bcl2fastq ＼

--무시-미싱-bcls＼

--무시-미싱-필터 ＼

--무시-미싱-포지션＼

--무시-미싱-컨트롤＼

--오토-셋-to-제로-바코드-미스매치＼

--파인드-어댑터-함께(with)-슬라이딩-윈도우＼

--어댑터-스트린전시 0.9＼

--마스크-쇼트-어댑터-리드(reads) 35＼

--미니멈-트림드(trimmed)-리드(read)-길이 35＼

2. 그런 다음 생성된 FASTQ 파일은 일루미나 TruSeq 어댑터를 클립(clip)하도록 설정된 파라미터와 함께 트리모메틱(Trimmomatic, v0.39)를 사용하여 처리되었고, 20개 염기보다 더 짧은 리드(reads)는 제외되고, 4-bp 슬라이딩 윈도우에서 평균 염기 양(Phread 점수)이 15 아래로 떨어지는 경우 남아있는 리드(reads)의 3'말단을 트리밍(trim)하고, 3 또는 그 이하의 양 점수인 임의의 염기를 리드의 말단에서 트리밍하였으며, 1라운드 PCR 프라이머로부터 도입된 4개의 랜덤화된 염기를 트리밍하였다.

트리모메틱을 실행하는 데 다음 명령이 사용되었다:

트리모메틱 SE-phread33 $인풋_fastq $아웃풋_fastq＼

일루미나클립:일루민_어댑터.fa:2:30:10＼

리딩:3 트레이닝:3＼

슬라이딩 윈도우:4:15＼

민렌(MINLEN):20＼

헤드크롭(HEADCROP):4

3. 트리밍된 리드는 --매우-센시티브 플래그가 지정된 말단-에서-말단(end-to-end) 모드에서 bowtie2(v.2.35)를 사용하여 예상된 앰플리콘 서열로 정렬되었다.bowtie2로 생성된 SAM 파일은 샘툴(samtools, v1.9)를 사용하여 BAM 파일로 변환, 정렬 및 색인화되었다.

4. (3) 단계에서 생성된 BAM 파일은 뱀-리드카운트(bam-readcounts) 도구를 사용하여 처리되었으며 (github.com/genome/bam-readcount) 정렬의 각 위치에서 비참조 염기, 삭제 및 삽입 수를 요약하는 일반 텍스트 파일을 생성한다. 편집률에 대한 통계에서 신뢰도가 낮은 베이스 콜을 제외하기 위해 비참조 베이스를 계산하기 위한 최소 베이스 품질(Phred 점수)을 29로 설정했다. 대상 부위의 각 위치에 대한 편집 비율은 정렬의 지정된 위치에서 베이스 품질 임계값을 통과하는 총 염기 수에 대한 지정된 유형(예: G)의 비참조 염기의 비율로 계산되었다.

총 mRNA 시퀀싱 세부정보(Total mRNA sequencing analysis details)

레인 수준 FASTQ 파일은 ReadGroup을 지정하고 게놈 정렬 BAM 파일 및 전사체 정렬 BAM 파일을 출력하도록 파라미터가 설정된 STAR(v2.7.2a)를 사용하여 인간 게놈(Gencode GRCh38v31 기본 어셈블리) 및 염기 편집기 구성을 포함하는 맞춤형 게놈에 별도로 정렬되었다. 단계에서 생성된 각 샘플에 대한 레인 수준 게놈 정렬을 병합하고 좌표별로 정렬하고 Picard(v2.20.5)를 사용하여 중복 표시하였다. 그런 다음 편집 속도의 시각화 및 정량화를 위해 BAM 파일을 IGV에 로드하였다.

다른 구현예

전술된 설명으로부터, 다양한 용법 및 조건으로 조정되도록 본원에 기재된 발명에 변경 및 변형이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 구현예는 또한 다음 청구범위의 범주 내에 있다. 본원의 변수의 임의의 정의에서 요소 목록의 인용은 해당 변수를 나열된 요소의 임의의 단일 요소로 또는 조합(또는 하위조합)하여 정의하는 것을 포함한다.

본원에서 구현예의 언급은 해당 구현예를 임의의 단일 구현예로 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 부분과 조합하여 포함한다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 각각의 개별 특허 및 간행물이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 표시된 것과 동일한 범위로 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> BEAM THERAPEUTICS INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE SELF-INACTIVATION OF BASE EDITORS <130> 180802-049001/PCT <140> PCT/US22/31419 <141> 2022-05-27 <150> 63/194,431 <151> 2021-05-28 <160> 547 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 167 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(167) <223> TadA*7.10 (ecTadA) polypeptide sequence <400> 1 Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala 20 25 30 Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala 35 40 45 Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His 85 90 95 Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His 115 120 125 Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys 145 150 155 160 Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp 165 <210> 2 <211> 4092 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20 at P153 polynucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(57) <223> Sequence encoding N-terminal nuclear localization signal <220> <221> misc_feature <222> (58)..(513) <223> Sequence encoding BhCas12b <220> <221> misc_feature <222> (514)..(531) <223> Sequence encoding a linker <220> <221> misc_feature <222> (532)..(1029) <223> Sequence encoding TadA*8 <220> <221> misc_feature <222> (1030)..(1089) <223> Sequence encoding Xten20 linker <220> <221> misc_feature <222> (1090)..(3954) <223> Sequence encoding BhCas12b <220> <221> misc_feature <222> (3955)..(4002) <223> Sequence encoding C-terminal NLS <220> <221> misc_feature <222> (4003)..(4008) <223> Seqquence encoding GS linker <220> <221> misc_feature <222> (4009)..(4089) <223> Sequence encoding 3x hemagglutinin (HA) tag <400> 2 gccaccatgg ccccaaagaa gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgcc 60 accagatcct tcatcctgaa gatcgagccc aacgaggaag tgaagaaagg cctctggaaa 120 acccacgagg tgctgaacca cggaatcgcc tactacatga atatcctgaa gctgatccgg 180 caagaggcca tctacgagca ccacgagcag gaccccaaga atcccaagaa ggtgtccaag 240 gccgagatcc aggccgagct gtgggatttc gtgctgaaga tgcagaagtg caacagcttc 300 acacacgagg tggacaagga cgaggtgttc aacatcctga gagagctgta cgaggaactg 360 gtgcccagca gcgtggaaaa gaagggcgaa gccaaccagc tgagcaacaa gtttctgtac 420 cctctggtgg accccaacag ccagtctgga aagggaacag ccagcagcgg cagaaagccc 480 agatggtaca acctgaagat tgccggcgat cccggaggct ctggaggaag ctccgaagtc 540 gagttttccc atgagtactg gatgagacac gcattgactc tcgcaaagag ggctcgagat 600 gaacgcgagg tgcccgtggg ggcagtactc gtgctcaaca atcgcgtaat cggcgaaggt 660 tggaataggg caatcggact ccacgacccc actgcacatg cggaaatcat ggcccttcga 720 cagggagggc ttgtgatgca gaattatcga ctttatgatg cgacgctgta cgtcacgttt 780 gaaccttgcg taatgtgcgc gggagctatg attcactccc gcattggacg agttgtattc 840 ggtgttcgca acgccaagac gggtgccgca ggttcactga tggacgtgct gcatcatcca 900 ggcatgaacc accgggtaga aatcacagaa ggcatattgg cggacgaatg tgcggcgctg 960 ttgtgtcgtt tttttcgcat gcccaggcgg gtctttaacg cccagaaaaa agcacaatcc 1020 tctactgacg gctcttctgg atctgaaaca cctggcacaa gcgagagcgc cacccctgag 1080 agctctggct cctgggaaga agagaagaag aagtgggaag aagataagaa aaaggacccg 1140 ctggccaaga tcctgggcaa gctggctgag tacggactga tccctctgtt catcccctac 1200 accgacagca acgagcccat cgtgaaagaa atcaagtgga tggaaaagtc ccggaaccag 1260 agcgtgcggc ggctggataa ggacatgttc attcaggccc tggaacggtt cctgagctgg 1320 gagagctgga acctgaaagt gaaagaggaa tacgagaagg tcgagaaaga gtacaagacc 1380 ctggaagaga ggatcaaaga ggacatccag gctctgaagg ctctggaaca gtatgagaaa 1440 gagcggcaag aacagctgct gcgggacacc ctgaacacca acgagtaccg gctgagcaag 1500 agaggcctta gaggctggcg ggaaatcatc cagaaatggc tgaaaatgga cgagaacgag 1560 ccctccgaga agtacctgga agtgttcaag gactaccagc ggaagcaccc tagagaggcc 1620 ggcgattaca gcgtgtacga gttcctgtcc aagaaagaga accacttcat ctggcggaat 1680 caccctgagt acccctacct gtacgccacc ttctgcgaga tcgacaagaa aaagaaggac 1740 gccaagcagc aggccacctt cacactggcc gatcctatca atcaccctct gtgggtccga 1800 ttcgaggaaa gaagcggcag caacctgaac aagtacagaa tcctgaccga gcagctgcac 1860 accgagaagc tgaagaaaaa gctgacagtg cagctggacc ggctgatcta ccctacagaa 1920 tctggcggct gggaagagaa gggcaaagtg gacattgtgc tgctgcccag ccggcagttc 1980 tacaaccaga tcttcctgga catcgaggaa aagggcaagc acgccttcac ctacaaggat 2040 gagagcatca agttccctct gaagggcaca ctcggcggag ccagagtgca gttcgacaga 2100 gatcacctga gaagataccc tcacaaggtg gaaagcggca acgtgggcag aatctacttc 2160 aacatgaccg tgaacatcga gcctacagag tccccagtgt ccaagtctct gaagatccac 2220 cgggacgact tccccaaggt ggtcaacttc aagcccaaag aactgaccga gtggatcaag 2280 gacagcaagg gcaagaaact gaagtccggc atcgagtccc tggaaatcgg cctgagagtg 2340 atgagcatcg acctgggaca gagacaggcc gctgccgcct ctattttcga ggtggtggat 2400 cagaagcccg acatcgaagg caagctgttt ttcccaatca agggcaccga gctgtatgcc 2460 gtgcacagag ccagcttcaa catcaagctg cccggcgaga cactggtcaa gagcagagaa 2520 gtgctgcgga aggccagaga ggacaatctg aaactgatga accagaagct caacttcctg 2580 cggaacgtgc tgcacttcca gcagttcgag gacatcaccg agagagagaa gcgggtcacc 2640 aagtggatca gcagacaaga gaacagcgac gtgcccctgg tgtaccagga tgagctgatc 2700 cagatccgcg agctgatgta caagccttac aaggactggg tcgccttcct gaagcagctc 2760 cacaagagac tggaagtcga gatcggcaaa gaagtgaagc actggcggaa gtccctgagc 2820 gacggaagaa agggcctgta cggcatctcc ctgaagaaca tcgacgagat cgatcggacc 2880 cggaagttcc tgctgagatg gtccctgagg cctaccgaac ctggcgaagt gcgtagactg 2940 gaacccggcc agagattcgc catcgaccag ctgaatcacc tgaacgccct gaaagaagat 3000 cggctgaaga agatggccaa caccatcatc atgcacgccc tgggctactg ctacgacgtg 3060 cggaagaaga aatggcaggc taagaacccc gcctgccaga tcatcctgtt cgaggatctg 3120 agcaactaca acccctacga ggaaaggtcc cgcttcgaga acagcaagct catgaagtgg 3180 tccagacgcg agatccccag acaggttgca ctgcagggcg agatctatgg cctgcaagtg 3240 ggagaagtgg gcgctcagtt cagcagcaga ttccacgcca agacaggcag ccctggcatc 3300 agatgtagcg tcgtgaccaa agagaagctg caggacaatc ggttcttcaa gaatctgcag 3360 agagagggca gactgaccct ggacaaaatc gccgtgctga aagagggcga tctgtaccca 3420 gacaaaggcg gcgagaagtt catcagcctg agcaaggatc ggaagtgcgt gaccacacac 3480 gccgacatca acgccgctca gaacctgcag aagcggttct ggacaagaac ccacggcttc 3540 tacaaggtgt actgcaaggc ctaccaggtg gacggccaga ccgtgtacat ccctgagagc 3600 aaggaccaga agcagaagat catcgaagag ttcggcgagg gctacttcat tctgaaggac 3660 ggggtgtacg aatgggtcaa cgccggcaag ctgaaaatca agaagggcag ctccaagcag 3720 agcagcagcg agctggtgga tagcgacatc ctgaaagaca gcttcgacct ggcctccgag 3780 ctgaaaggcg aaaagctgat gctgtacagg gaccccagcg gcaatgtgtt ccccagcgac 3840 aaatggatgg ccgctggcgt gttcttcgga aagctggaac gcatcctgat cagcaagctg 3900 accaaccagt actccatcag caccatcgag gacgacagca gcaagcagtc tatgaaaagg 3960 ccggcggcca cgaaaaaggc cggccaggca aaaaagaaaa agggatccta cccatacgat 4020 gttccagatt acgcttatcc ctacgacgtg cctgattatg catacccata tgatgtcccc 4080 gactatgcct aa 4092 <210> 3 <211> 1361 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: BhCas12b GGSGGS-ABE8-Xten20 at P153 polypeptide sequence <400> 3 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val 20 25 30 Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala 35 40 45 Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ala Ile Tyr Glu 50 55 60 His His Glu Gln Asp Pro Lys Asn Pro Lys Lys Val Ser Lys Ala Glu 65 70 75 80 Ile Gln Ala Glu Leu Trp Asp Phe Val Leu Lys Met Gln Lys Cys Asn 85 90 95 Ser Phe Thr His Glu Val Asp Lys Asp Glu Val Phe Asn Ile Leu Arg 100 105 110 Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Val Pro Ser Ser Val Glu Lys Lys Gly Glu 115 120 125 Ala Asn Gln Leu Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn 130 135 140 Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ala Ser Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp 145 150 155 160 Tyr Asn Leu Lys Ile Ala Gly Asp Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser 165 170 175 Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu 180 185 190 Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu 195 200 205 Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly 210 215 220 Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly 225 230 235 240 Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Tyr Asp Ala Thr Leu Tyr Val 245 250 255 Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser Arg 260 265 270 Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala 275 280 285 Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg Val 290 295 300 Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys 305 310 315 320 Arg Phe Phe Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala 325 330 335 Gln Ser Ser Thr Asp Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser 340 345 350 Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Ser Trp Glu Glu Glu Lys Lys 355 360 365 Lys Trp Glu Glu Asp Lys Lys Lys Asp Pro Leu Ala Lys Ile Leu Gly 370 375 380 Lys Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Pro Tyr Thr Asp 385 390 395 400 Ser Asn Glu Pro Ile Val Lys Glu Ile Lys Trp Met Glu Lys Ser Arg 405 410 415 Asn Gln Ser Val Arg Arg Leu Asp Lys Asp Met Phe Ile Gln Ala Leu 420 425 430 Glu Arg Phe Leu Ser Trp Glu Ser Trp Asn Leu Lys Val Lys Glu Glu 435 440 445 Tyr Glu Lys Val Glu Lys Glu Tyr Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ile Lys 450 455 460 Glu Asp Ile Gln Ala Leu Lys Ala Leu Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Arg 465 470 475 480 Gln Glu Gln Leu Leu Arg Asp Thr Leu Asn Thr Asn Glu Tyr Arg Leu 485 490 495 Ser Lys Arg Gly Leu Arg Gly Trp Arg Glu Ile Ile Gln Lys Trp Leu 500 505 510 Lys Met Asp Glu Asn Glu Pro Ser Glu Lys Tyr Leu Glu Val Phe Lys 515 520 525 Asp Tyr Gln Arg Lys His Pro Arg Glu Ala Gly Asp Tyr Ser Val Tyr 530 535 540 Glu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Asn His Phe Ile Trp Arg Asn His Pro 545 550 555 560 Glu Tyr Pro Tyr Leu Tyr Ala Thr Phe Cys Glu Ile Asp Lys Lys Lys 565 570 575 Lys Asp Ala Lys Gln Gln Ala Thr Phe Thr Leu Ala Asp Pro Ile Asn 580 585 590 His Pro Leu Trp Val Arg Phe Glu Glu Arg Ser Gly Ser Asn Leu Asn 595 600 605 Lys Tyr Arg Ile Leu Thr Glu Gln Leu His Thr Glu Lys Leu Lys Lys 610 615 620 Lys Leu Thr Val Gln Leu Asp Arg Leu Ile Tyr Pro Thr Glu Ser Gly 625 630 635 640 Gly Trp Glu Glu Lys Gly Lys Val Asp Ile Val Leu Leu Pro Ser Arg 645 650 655 Gln Phe Tyr Asn Gln Ile Phe Leu Asp Ile Glu Glu Lys Gly Lys His 660 665 670 Ala Phe Thr Tyr Lys Asp Glu Ser Ile Lys Phe Pro Leu Lys Gly Thr 675 680 685 Leu Gly Gly Ala Arg Val Gln Phe Asp Arg Asp His Leu Arg Arg Tyr 690 695 700 Pro His Lys Val Glu Ser Gly Asn Val Gly Arg Ile Tyr Phe Asn Met 705 710 715 720 Thr Val Asn Ile Glu Pro Thr Glu Ser Pro Val Ser Lys Ser Leu Lys 725 730 735 Ile His Arg Asp Asp Phe Pro Lys Val Val Asn Phe Lys Pro Lys Glu 740 745 750 Leu Thr Glu Trp Ile Lys Asp Ser Lys Gly Lys Lys Leu Lys Ser Gly 755 760 765 Ile Glu Ser Leu Glu Ile Gly Leu Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly 770 775 780 Gln Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ile Phe Glu Val Val Asp Gln Lys 785 790 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Gln Glu Leu 100 105 110 Arg Gly Asn Gly His Thr Leu Lys Ile Trp Ala Cys Lys Leu Tyr Tyr 115 120 125 Glu Lys Asn Ala Arg Asn Gln Ile Gly Leu Trp Asn Leu Arg Asp Asn 130 135 140 Gly Val Gly Leu Asn Val Met Val Ser Glu His Tyr Gln Cys Cys Arg 145 150 155 160 Lys Ile Phe Ile Gln Ser Ser His Asn Gln Leu Asn Glu Asn Arg Trp 165 170 175 Leu Glu Lys Thr Leu Lys Arg Ala Glu Lys Arg Arg Ser Glu Leu Ser 180 185 190 Ile Met Ile Gln Val Lys Ile Leu His Thr Thr Lys Ser Pro Ala Val 195 200 205 <210> 13 <211> 766 <212> DNA <213> Petromyzon marinus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(766) <223> EF094822.1 Petromyzon marinus isolate PmCDA.21 cytosine deaminase mRNA, complete cds; PmCDA1 polynucleotide sequence <400> 13 tgacacgaca cagccgtgta tatgaggaag ggtagctgga tggggggggg gggaatacgt 60 tcagagagga cattagcgag cgtcttgttg gtggccttga gtctagacac ctgcagacat 120 gaccgacgct gagtacgtga gaatccatga gaagttggac atctacacgt ttaagaaaca 180 gtttttcaac aacaaaaaat ccgtgtcgca tagatgctac gttctctttg aattaaaacg 240 acggggtgaa cgtagagcgt gtttttgggg ctatgctgtg aataaaccac agagcgggac 300 agaacgtgga attcacgccg aaatctttag cattagaaaa gtcgaagaat acctgcgcga 360 caaccccgga caattcacga taaattggta ctcatcctgg agtccttgtg cagattgcgc 420 tgaaaagatc ttagaatggt ataaccagga gctgcggggg aacggccaca ctttgaaaat 480 ctgggcttgc aaactctatt acgagaaaaa tgcgaggaat caaattgggc tgtggaacct 540 cagagataac ggggttgggt tgaatgtaat ggtaagtgaa cactaccaat gttgcaggaa 600 aatattcatc caatcgtcgc acaatcaatt gaatgagaat agatggcttg agaagacttt 660 gaagcgagct gaaaaacgac ggagcgagtt gtccattatg attcaggtaa aaatactcca 720 caccactaag agtcctgctg tttaagaggc tatgcggatg gttttc 766 <210> 14 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(145) <223> tr|Q6QJ80|Q6QJ80_HUMAN Activation-induced cytidine deaminase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=AICDA PE=2 SV=1; AID polypeptide sequence <400> 14 Met Asp Ser Leu Leu Met Asn Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Gln Phe Lys 1 5 10 15 Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg Arg Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val 20 25 30 Val Lys Arg Arg Asp Ser Ala Thr Ser Phe Ser Leu Asp Phe Gly Tyr 35 40 45 Leu Arg Asn Lys Asn Gly Cys His Val Glu Leu Leu Phe Leu Arg Tyr 50 55 60 Ile Ser Asp Trp Asp Leu Asp Pro Gly Arg Cys Tyr Arg Val Thr Trp 65 70 75 80 Phe Thr Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Arg His Val Ala Asp 85 90 95 Phe Leu Arg Gly Asn Pro Asn Leu Ser Leu Arg Ile Phe Thr Ala Arg 100 105 110 Leu Tyr Phe Cys Glu Asp Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gly Leu Arg Arg 115 120 125 Leu His Arg Ala Gly Val Gln Ile Ala Ile Met Thr Phe Lys Ala Pro 130 135 140 Val 145 <210> 15 <211> 10681 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10681) <223> NG_011588.1:5001-15681 Homo sapiens activation induced cytidine deaminase (AICDA), RefSeqGene (LRG_17) on chromosome 12; nucleic acid sequence of the CDS of human AID; polynucleotide sequence <400> 15 agagaaccat cattaattga agtgagattt ttctggcctg agacttgcag ggaggcaaga 60 agacactctg gacaccacta tggacaggta aagaggcagt cttctcgtgg gtgattgcac 120 tggccttcct ctcagagcaa atctgagtaa tgagactggt agctatccct ttctctcatg 180 taactgtctg actgataaga tcagcttgat caatatgcat atatattttt tgatctgtct 240 ccttttcttc tattcagatc ttatacgctg tcagcccaat tctttctgtt tcagacttct 300 cttgatttcc ctctttttca tgtggcaaaa gaagtagtgc gtacaatgta ctgattcgtc 360 ctgagatttg taccatggtt gaaactaatt tatggtaata atattaacat agcaaatctt 420 tagagactca aatcatgaaa aggtaatagc agtactgtac taaaaacggt agtgctaatt 480 ttcgtaataa ttttgtaaat attcaacagt aaaacaactt gaagacacac tttcctaggg 540 aggcgttact gaaataattt agctatagta agaaaatttg taattttaga aatgccaagc 600 attctaaatt aattgcttga aagtcactat gattgtgtcc attataagga gacaaattca 660 ttcaagcaag ttatttaatg ttaaaggccc aattgttagg cagttaatgg cacttttact 720 attaactaat ctttccattt gttcagacgt agcttaactt acctcttagg tgtgaatttg 780 gttaaggtcc tcataatgtc tttatgtgca gtttttgata ggttattgtc atagaactta 840 ttctattcct acatttatga ttactatgga tgtatgagaa taacacctaa tccttatact 900 ttacctcaat ttaactcctt tataaagaac ttacattaca gaataaagat tttttaaaaa 960 tatatttttt tgtagagaca gggtcttagc ccagccgagg ctggtctcta agtcctggcc 1020 caagcgatcc tcctgcctgg gcctcctaaa gtgctggaat tatagacatg agccatcaca 1080 tccaatatac agaataaaga tttttaatgg aggatttaat gttcttcaga aaattttctt 1140 gaggtcagac aatgtcaaat gtctcctcag tttacactga gattttgaaa acaagtctga 1200 gctataggtc cttgtgaagg gtccattgga aatacttgtt caaagtaaaa tggaaagcaa 1260 aggtaaaatc agcagttgaa attcagagaa agacagaaaa ggagaaaaga tgaaattcaa 1320 caggacagaa gggaaatata ttatcattaa ggaggacagt atctgtagag ctcattagtg 1380 atggcaaaat gacttggtca ggattatttt taacccgctt gtttctggtt tgcacggctg 1440 gggatgcagc tagggttctg cctcagggag cacagctgtc cagagcagct gtcagcctgc 1500 aagcctgaaa cactccctcg gtaaagtcct tcctactcag gacagaaatg acgagaacag 1560 ggagctggaa acaggcccct aaccagagaa gggaagtaat ggatcaacaa agttaactag 1620 caggtcagga tcacgcaatt catttcactc tgactggtaa catgtgacag aaacagtgta 1680 ggcttattgt attttcatgt agagtaggac ccaaaaatcc acccaaagtc ctttatctat 1740 gccacatcct tcttatctat acttccagga cactttttct tccttatgat aaggctctct 1800 ctctctccac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acaaacacac 1860 accccgccaa ccaaggtgca tgtaaaaaga tgtagattcc tctgcctttc tcatctacac 1920 agcccaggag ggtaagttaa tataagaggg atttattggt aagagatgat gcttaatctg 1980 tttaacactg ggcctcaaag agagaatttc ttttcttctg tacttattaa gcacctatta 2040 tgtgttgagc ttatatatac aaagggttat tatatgctaa tatagtaata gtaatggtgg 2100 ttggtactat ggtaattacc ataaaaatta ttatcctttt aaaataaagc taattattat 2160 tggatctttt ttagtattca ttttatgttt tttatgtttt tgatttttta aaagacaatc 2220 tcaccctgtt acccaggctg gagtgcagtg gtgcaatcat agctttctgc agtcttgaac 2280 tcctgggctc aagcaatcct cctgccttgg cctcccaaag tgttgggata cagtcatgag 2340 ccactgcatc tggcctagga tccatttaga ttaaaatatg cattttaaat tttaaaataa 2400 tatggctaat ttttacctta tgtaatgtgt atactggcaa taaatctagt ttgctgccta 2460 aagtttaaag tgctttccag taagcttcat gtacgtgagg ggagacattt aaagtgaaac 2520 agacagccag gtgtggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctctgggagg ctgaggtggg 2580 tggatcgctt gagccctgga gttcaagacc agcctgagca acatggcaaa acgctgtttc 2640 tataacaaaa attagccggg catggtggca tgtgcctgtg gtcccagcta ctagggggct 2700 gaggcaggag aatcgttgga gcccaggagg tcaaggctgc actgagcagt gcttgcgcca 2760 ctgcactcca gcctgggtga caggaccaga ccttgcctca aaaaaataag aagaaaaatt 2820 aaaaataaat ggaaacaact acaaagagct gttgtcctag atgagctact tagttaggct 2880 gatattttgg tatttaactt ttaaagtcag ggtctgtcac ctgcactaca ttattaaaat 2940 atcaattctc aatgtatatc cacacaaaga ctggtacgtg aatgttcata gtacctttat 3000 tcacaaaacc ccaaagtaga gactatccaa atatccatca acaagtgaac aaataaacaa 3060 aatgtgctat atccatgcaa tggaatacca ccctgcagta caaagaagct acttggggat 3120 gaatcccaaa gtcatgacgc taaatgaaag agtcagacat gaaggaggag ataatgtatg 3180 ccatacgaaa ttctagaaaa tgaaagtaac ttatagttac agaaagcaaa tcagggcagg 3240 catagaggct cacacctgta atcccagcac tttgagaggc cacgtgggaa gattgctaga 3300 actcaggagt tcaagaccag cctgggcaac acagtgaaac tccattctcc acaaaaatgg 3360 gaaaaaaaga aagcaaatca gtggttgtcc tgtggggagg ggaaggactg caaagaggga 3420 agaagctctg gtggggtgag ggtggtgatt caggttctgt atcctgactg tggtagcagt 3480 ttggggtgtt tacatccaaa aatattcgta gaattatgca tcttaaatgg gtggagttta 3540 ctgtatgtaa attatacctc aatgtaagaa aaaataatgt gtaagaaaac tttcaattct 3600 cttgccagca aacgttattc aaattcctga gccctttact tcgcaaattc tctgcacttc 3660 tgccccgtac cattaggtga cagcactagc tccacaaatt ggataaatgc atttctggaa 3720 aagactaggg acaaaatcca ggcatcactt gtgctttcat atcaaccatg ctgtacagct 3780 tgtgttgctg tctgcagctg caatggggac tcttgatttc tttaaggaaa cttgggttac 3840 cagagtattt ccacaaatgc tattcaaatt agtgcttatg atatgcaaga cactgtgcta 3900 ggagccagaa aacaaagagg aggagaaatc agtcattatg tgggaacaac atagcaagat 3960 atttagatca ttttgactag ttaaaaaagc agcagagtac aaaatcacac atgcaatcag 4020 tataatccaa atcatgtaaa tatgtgcctg tagaaagact agaggaataa acacaagaat 4080 cttaacagtc attgtcatta gacactaagt ctaattatta ttattagaca ctatgatatt 4140 tgagatttaa aaaatcttta atattttaaa atttagagct cttctatttt tccatagtat 4200 tcaagtttga caatgatcaa gtattactct ttcttttttt tttttttttt ttttttttga 4260 gatggagttt tggtcttgtt gcccatgctg gagtggaatg gcatgaccat agctcactgc 4320 aacctccacc tcctgggttc aagcaaagct gtcgcctcag cctcccgggt agatgggatt 4380 acaggcgccc accaccacac tcggctaatg tttgtatttt tagtagagat ggggtttcac 4440 catgttggcc aggctggtct caaactcctg acctcagagg atccacctgc ctcagcctcc 4500 caaagtgctg ggattacaga tgtaggccac tgcgcccggc caagtattgc tcttatacat 4560 taaaaaacag gtgtgagcca ctgcgcccag ccaggtattg ctcttataca ttaaaaaata 4620 ggccggtgca gtggctcacg cctgtaatcc cagcactttg ggaagccaag gcgggcagaa 4680 cacccgaggt caggagtcca aggccagcct ggccaagatg gtgaaacccc gtctctatta 4740 aaaatacaaa cattacctgg gcatgatggt gggcgcctgt aatcccagct actcaggagg 4800 ctgaggcagg aggatccgcg gagcctggca gatctgcctg agcctgggag gttgaggcta 4860 cagtaagcca agatcatgcc agtatacttc agcctgggcg acaaagtgag accgtaacaa 4920 aaaaaaaaaa atttaaaaaa agaaatttag atcaagatcc aactgtaaaa agtggcctaa 4980 acaccacatt aaagagtttg gagtttattc tgcaggcaga agagaaccat cagggggtct 5040 tcagcatggg aatggcatgg tgcacctggt ttttgtgaga tcatggtggt gacagtgtgg 5100 ggaatgttat tttggaggga ctggaggcag acagaccggt taaaaggcca gcacaacaga 5160 taaggaggaa gaagatgagg gcttggaccg aagcagagaa gagcaaacag ggaaggtaca 5220 aattcaagaa atattggggg gtttgaatca acacatttag atgattaatt aaatatgagg 5280 actgaggaat aagaaatgag tcaaggatgg ttccaggctg ctaggctgct tacctgaggt 5340 ggcaaagtcg ggaggagtgg cagtttagga cagggggcag ttgaggaata ttgttttgat 5400 cattttgagt ttgaggtaca agttggacac ttaggtaaag actggagggg aaatctgaat 5460 atacaattat gggactgagg aacaagttta ttttattttt tgtttcgttt tcttgttgaa 5520 gaacaaattt aattgtaatc ccaagtcatc agcatctaga agacagtggc aggaggtgac 5580 tgtcttgtgg gtaagggttt ggggtccttg atgagtatct ctcaattggc cttaaatata 5640 agcaggaaaa ggagtttatg atggattcca ggctcagcag ggctcaggag ggctcaggca 5700 gccagcagag gaagtcagag catcttcttt ggtttagccc aagtaatgac ttccttaaaa 5760 agctgaagga aaatccagag tgaccagatt ataaactgta ctcttgcatt ttctctccct 5820 cctctcaccc acagcctctt gatgaaccgg aggaagtttc tttaccaatt caaaaatgtc 5880 cgctgggcta agggtcggcg tgagacctac ctgtgctacg tagtgaagag gcgtgacagt 5940 gctacatcct tttcactgga ctttggttat cttcgcaata aggtatcaat taaagtcggc 6000 tttgcaagca gtttaatggt caactgtgag tgcttttaga gccacctgct gatggtatta 6060 cttccatcct tttttggcat ttgtgtctct atcacattcc tcaaatcctt ttttttattt 6120 ctttttccat gtccatgcac ccatattaga catggcccaa aatatgtgat ttaattcctc 6180 cccagtaatg ctgggcaccc taataccact ccttccttca gtgccaagaa caactgctcc 6240 caaactgttt accagctttc ctcagcatct gaattgcctt tgagattaat taagctaaaa 6300 gcatttttat atgggagaat attatcagct tgtccaagca aaaattttaa atgtgaaaaa 6360 caaattgtgt cttaagcatt tttgaaaatt aaggaagaag aatttgggaa aaaattaacg 6420 gtggctcaat tctgtcttcc aaatgatttc ttttccctcc tactcacatg ggtcgtaggc 6480 cagtgaatac attcaacatg gtgatcccca gaaaactcag agaagcctcg gctgatgatt 6540 aattaaattg atctttcggc tacccgagag aattacattt ccaagagact tcttcaccaa 6600 aatccagatg ggtttacata aacttctgcc cacgggtatc tcctctctcc taacacgctg 6660 tgacgtctgg gcttggtgga atctcaggga agcatccgtg gggtggaagg tcatcgtctg 6720 gctcgttgtt tgatggttat attaccatgc aattttcttt gcctacattt gtattgaata 6780 catcccaatc tccttcctat tcggtgacat gacacattct atttcagaag gctttgattt 6840 tatcaagcac tttcatttac ttctcatggc agtgcctatt acttctctta caatacccat 6900 ctgtctgctt taccaaaatc tatttcccct tttcagatcc tcccaaatgg tcctcataaa 6960 ctgtcctgcc tccacctagt ggtccaggta tatttccaca atgttacatc aacaggcact 7020 tctagccatt ttccttctca aaaggtgcaa aaagcaactt cataaacaca aattaaatct 7080 tcggtgaggt agtgtgatgc tgcttcctcc caactcagcg cacttcgtct tcctcattcc 7140 acaaaaaccc atagccttcc ttcactctgc aggactagtg ctgccaaggg ttcagctcta 7200 cctactggtg tgctcttttg agcaagttgc ttagcctctc tgtaacacaa ggacaatagc 7260 tgcaagcatc cccaaagatc attgcaggag acaatgacta aggctaccag agccgcaata 7320 aaagtcagtg aattttagcg tggtcctctc tgtctctcca gaacggctgc cacgtggaat 7380 tgctcttcct ccgctacatc tcggactggg acctagaccc tggccgctgc taccgcgtca 7440 cctggttcac ctcctggagc ccctgctacg actgtgcccg acatgtggcc gactttctgc 7500 gagggaaccc caacctcagt ctgaggatct tcaccgcgcg cctctacttc tgtgaggacc 7560 gcaaggctga gcccgagggg ctgcggcggc tgcaccgcgc cggggtgcaa atagccatca 7620 tgaccttcaa aggtgcgaaa gggccttccg cgcaggcgca gtgcagcagc ccgcattcgg 7680 gattgcgatg cggaatgaat gagttagtgg ggaagctcga 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tgatagcaac ttccaggaat 8580 gtcacacacg atgaaatatc tctgctgaag acagtggata aaaaacagtc cttcaagtct 8640 tctctgtttt tattcttcaa ctctcacttt cttagagttt acagaaaaaa tatttatata 8700 cgactcttta aaaagatcta tgtcttgaaa atagagaagg aacacaggtc tggccaggga 8760 cgtgctgcaa ttggtgcagt tttgaatgca acattgtccc ctactgggaa taacagaact 8820 gcaggacctg ggagcatcct aaagtgtcaa cgtttttcta tgacttttag gtaggatgag 8880 agcagaaggt agatcctaaa aagcatggtg agaggatcaa atgtttttat atcaacatcc 8940 tttattattt gattcatttg agttaacagt ggtgttagtg atagattttt ctattctttt 9000 cccttgacgt ttactttcaa gtaacacaaa ctcttccatc aggccatgat ctataggacc 9060 tcctaatgag agtatctggg tgattgtgac cccaaaccat ctctccaaag cattaatatc 9120 caatcatgcg ctgtatgttt taatcagcag aagcatgttt ttatgtttgt acaaaagaag 9180 attgttatgg gtggggatgg aggtatagac catgcatggt caccttcaag ctactttaat 9240 aaaggatctt aaaatgggca ggaggactgt gaacaagaca ccctaataat gggttgatgt 9300 ctgaagtagc aaatcttctg gaaacgcaaa ctcttttaag gaagtcccta atttagaaac 9360 acccacaaac ttcacatatc ataattagca aacaattgga aggaagttgc ttgaatgttg 9420 gggagaggaa aatctattgg ctctcgtggg tctcttcatc tcagaaatgc caatcaggtc 9480 aaggtttgct acattttgta tgtgtgtgat gcttctccca aaggtatatt aactatataa 9540 gagagttgtg acaaaacaga atgataaagc tgcgaaccgt ggcacacgct catagttcta 9600 gctgcttggg aggttgagga gggaggatgg cttgaacaca ggtgttcaag gccagcctgg 9660 gcaacataac aagatcctgt ctctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagaaag agagagggcc 9720 gggcgtggtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggga ggccgagccg ggcggatcac 9780 ctgtggtcag gagtttgaga ccagcctggc caacatggca aaaccccgtc tgtactcaaa 9840 atgcaaaaat tagccaggcg tggtagcagg cacctgtaat cccagctact tgggaggctg 9900 aggcaggaga atcgcttgaa cccaggaggt ggaggttgca gtaagctgag atcgtgccgt 9960 tgcactccag cctgggcgac aagagcaaga ctctgtctca gaaaaaaaaa aaaaaaagag 10020 agagagagag aaagagaaca atatttggga gagaaggatg gggaagcatt gcaaggaaat 10080 tgtgctttat ccaacaaaat gtaaggagcc aataagggat ccctatttgt ctcttttggt 10140 gtctatttgt ccctaacaac tgtctttgac agtgagaaaa atattcagaa taaccatatc 10200 cctgtgccgt tattacctag caacccttgc aatgaagatg agcagatcca caggaaaact 10260 tgaatgcaca actgtcttat tttaatctta ttgtacataa gtttgtaaaa gagttaaaaa 10320 ttgttacttc atgtattcat ttatatttta tattattttg cgtctaatga ttttttatta 10380 acatgatttc cttttctgat atattgaaat ggagtctcaa agcttcataa atttataact 10440 ttagaaatga ttctaataac aacgtatgta attgtaacat tgcagtaatg gtgctacgaa 10500 gccatttctc ttgattttta gtaaactttt atgacagcaa atttgcttct ggctcacttt 10560 caatcagtta aataaatgat aaataatttt ggaagctgtg aagataaaat accaaataaa 10620 ataatataaa agtgatttat atgaagttaa aataaaaaat cagtatgatg gaataaactt 10680 g 10681 <210> 16 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(198) <223> human AID polypeptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> Nuclear localization sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (183)..(198) <223> Nuclear export signal <400> 16 Met Asp Ser Leu Leu Met Asn Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Gln Phe Lys 1 5 10 15 Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg Arg Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val 20 25 30 Val Lys Arg Arg Asp Ser Ala 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<213> Canis lupus familiaris <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(198) <223> Canine AID (clAID) polypeptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> Nuclear localization sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (183)..(198) <223> Nuclear export signal <400> 18 Met Asp Ser Leu Leu Met Lys Gln Arg Lys Phe Leu Tyr His Phe Lys 1 5 10 15 Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg His Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val 20 25 30 Val Lys Arg Arg Asp Ser Ala Thr Ser Phe Ser Leu Asp Phe Gly His 35 40 45 Leu Arg Asn Lys Ser Gly Cys His Val Glu Leu Leu Phe Leu Arg Tyr 50 55 60 Ile Ser Asp Trp Asp Leu Asp Pro Gly Arg Cys Tyr Arg Val Thr Trp 65 70 75 80 Phe Thr Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Arg His Val Ala Asp 85 90 95 Phe Leu Arg Gly Tyr Pro Asn Leu Ser Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg 100 105 110 Leu Tyr Phe Cys Glu Asp Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gly Leu Arg Arg 115 120 125 Leu His Arg Ala Gly Val Gln Ile Ala Ile Met Thr Phe Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Tyr Cys Trp Asn Thr Phe Val Glu Asn Arg Glu Lys Thr 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<213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(236) <223> Human APOBEC-1 polypeptide sequence <400> 49 Met Thr Ser Glu Lys Gly Pro Ser Thr Gly Asp Pro Thr Leu Arg Arg 1 5 10 15 Arg Ile Glu Pro Trp Glu Phe Asp Val Phe Tyr Asp Pro Arg Glu Leu 20 25 30 Arg Lys Glu Ala Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Trp Gly Met Ser Arg 35 40 45 Lys Ile Trp Arg Ser Ser Gly Lys Asn Thr Thr Asn His Val Glu Val 50 55 60 Asn Phe Ile Lys Lys Phe Thr Ser Glu Arg Asp Phe His Pro Ser Met 65 70 75 80 Ser Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Trp Glu Cys 85 90 95 Ser Gln Ala Ile Arg Glu Phe Leu Ser Arg His Pro Gly Val Thr Leu 100 105 110 Val Ile Tyr Val Ala Arg Leu Phe Trp His Met Asp Gln Gln Asn Arg 115 120 125 Gln Gly Leu Arg Asp Leu Val Asn Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met 130 135 140 Arg Ala Ser Glu Tyr Tyr His Cys Trp Arg Asn Phe Val Asn Tyr Pro 145 150 155 160 Pro Gly Asp Glu Ala His Trp Pro Gln Tyr Pro Pro Leu Trp Met Met 165 170 175 Leu Tyr Ala Leu Glu Leu His Cys Ile Ile Leu Ser Leu Pro Pro 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Leu Arg Ser Pro Leu Asp Arg Ile 195 200 205 Arg Gln Lys Asp Phe Ser Ile His Phe Arg Asn Ser Leu Trp Leu Asp 210 215 220 Asp Lys Ser Thr Trp Leu Cys Phe Glu Val Lys Arg Thr Lys Ser Pro 225 230 235 240 Val Pro Leu Tyr Arg Gly Val Phe Arg Asn Gln Ser Pro Pro Lys Thr 245 250 255 Pro Cys His Ala Glu Val Arg Phe Phe Thr Trp Leu Gln Asp Leu Pro 260 265 270 Pro Asp Phe Cys Cys Gln Phe Thr Trp Tyr Leu Ser Trp Ser Pro Cys 275 280 285 Ala Asp Cys Ala Asp Leu Val Ala Asn Phe Leu Ala Lys His Arg Asn 290 295 300 Val Ser Leu Thr Ile Phe Val Ala Arg Leu Tyr Tyr Tyr Arg Asp Pro 305 310 315 320 Glu Met His Arg Gly Leu Arg Arg Met Tyr Gln Glu Gly Ala Asn Val 325 330 335 Asp Ile Met Ser Val Ile Glu Phe Glu Tyr Cys Trp Asp Asn Phe Val 340 345 350 Tyr Asn Gln Gly Lys Gln Phe Val Pro Trp Asn Gly Leu Asn Glu Asn 355 360 365 Tyr Glu Phe Leu Val Pro Arg Leu Gln Glu Ile Leu Glu 370 375 380 <210> 78 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.8; tr|A0A3M0K4Y7|A0A3M0K4Y7_HIRRU polypeptide sequence <400> 78 Met Tyr Ile Ser Lys Lys Ala Leu Arg Arg His Phe Asp Pro Arg Val 1 5 10 15 Tyr Pro Arg Glu Thr Tyr Leu Leu Cys Glu Leu Gln Trp Glu Gly Ser 20 25 30 Arg Arg Val Trp Ile His Trp Ile Arg Asn Val Pro Asp His His Ala 35 40 45 Glu Glu Tyr Phe Leu Glu Glu Val Phe Glu Pro Arg Asn Tyr Gly Phe 50 55 60 Cys Asn Ile Thr Leu Tyr Leu Ser Trp Ser Pro Cys Cys Thr Cys Cys 65 70 75 80 Ser Lys Ile Arg Asp Phe Leu Lys Arg Asn Pro Asn Val Lys Ile Asp 85 90 95 Ile Arg Val Ala Arg Leu Ile Tyr Pro Asp Tyr Ala Glu Thr Arg Ser 100 105 110 Ser Leu Arg Glu Leu Asn Gly Leu Gln Arg Val Ser Ile Gln Val Met 115 120 125 Glu Ala Ala Gly Leu Ser Cys Ile Glu Ser Lys Asn His Arg Ile Ser 130 135 140 Gln Val Glu Arg Asp Pro Lys Gly Ser Ser Ser Pro Thr Leu Phe Thr 145 150 155 160 Leu Gln Asp His Leu Lys Leu Ser Asn Met Thr Glu Ser Val Ile Gln 165 170 175 Asp Ser Val Ser Ile Gln Ile Cys Tyr Gln Met Arg Ile Leu Gly Phe 180 185 190 Gln Cys His Ile Arg Trp Lys Leu Gln 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Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.10; tr|G5BPM8|G5BPM8_HETGA polypeptide sequence <400> 80 Arg Arg Arg Ile Glu Pro Trp Gln Phe Glu Ala Ser Phe Asp Pro Arg 1 5 10 15 Gln Leu Arg Arg Glu Thr Cys Leu Leu Ser Glu Val Arg Trp Gly Thr 20 25 30 Ser Pro Arg Ala Trp Arg Gly Cys Ser Leu Asn Thr Ala Arg His Ala 35 40 45 Glu Val Ser Phe Met Asp Arg Leu Thr Ser Glu Gly Arg Leu Arg Gly 50 55 60 Pro Val Arg Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Gly 65 70 75 80 Ala Cys Ala Gln Ala Ile Gly Glu Phe Leu Arg Gln His Pro Asn Val 85 90 95 Ser Leu Val Ile Tyr Ile Ala Arg Leu Phe Trp His Val Asp Glu Gln 100 105 110 Asn Arg Gln Gly Leu Arg Asp Leu Val Thr Arg Gly Val Arg Met Gln 115 120 125 Val Met Ser Asp Pro Glu Phe Ala His Cys Trp Arg Asn Phe Val Asn 130 135 140 Tyr Ser Pro Gly Gln Glu Ala Arg Trp Pro Gln Val Pro Pro Val Trp 145 150 155 160 Thr Trp Leu Tyr Ser Leu Glu Leu His Cys Ile Leu Leu Asn Leu Pro 165 170 175 Pro Cys Leu Lys Ile Ser Arg Arg His His Asn Gln Leu 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Ser Pro Cys Trp Glu Cys 85 90 95 Ser Lys Ala Ile Arg Glu Phe Leu Asn Gln His Pro Arg Val Thr Leu 100 105 110 Phe Ile Tyr Val Ala Arg Leu Phe Gln His Met Asp Pro Gln Asn Arg 115 120 125 Gln Gly Leu Arg Asp Leu Ile His Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met 130 135 140 Gly Pro Thr Glu Tyr Asp Tyr Cys Trp Arg Asn Phe Val Asn Tyr Pro 145 150 155 160 Pro Gly Lys Glu Ala His Trp Pro Arg Tyr Pro Pro Pro Leu Met Lys 165 170 175 Leu Tyr Ala Leu Glu Leu His Cys Ile Ile Leu Val Pro 180 185 <210> 91 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.22; tr|E2D879|E2D879_MUSMI polypeptide sequence <400> 91 Arg Asn Leu Ile Ser Arg Glu Thr Phe Asn Phe Asn Phe Glu Asn Leu 1 5 10 15 Cys Tyr Ala Lys Gly Arg Lys Asn Thr Phe Leu Cys Tyr Glu Val Thr 20 25 30 Arg Lys Asp Cys Asp Ser Pro Val Ser Leu Cys His Gly Val Phe Lys 35 40 45 Asn Lys Gly Ser Ile His Ala Glu Ile Cys Phe Leu Tyr Trp Phe His 50 55 60 Asp Lys Val Leu Lys Val Leu Thr Pro Arg Glu Glu Phe Lys Val 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Met Asn Arg Ser Thr Val Ser 65 70 75 80 Trp Lys Ser Gly Val Phe Arg Asn Gln Val Gly Ser Asp Pro Phe Cys 85 90 95 His Ala Glu Met Cys Phe Leu Ser Trp Phe Arg His Asn Met Leu Ser 100 105 110 Pro Lys Lys Asp Tyr Glu Val Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Ser Pro Cys 115 120 125 Pro Glu Cys Ala Gly Gln Val Ala Glu Phe Leu Ala Arg His Gly Asn 130 135 140 Val Arg Leu Thr Ile Phe Thr Ala His Leu Tyr Tyr Phe Trp Asn Pro 145 150 155 160 Ser Phe Arg Gln Gly Leu Arg Arg Leu Ser Gln Glu Gly Ala Ser Val 165 170 175 Leu Ile Met Gly Tyr Glu Asp Phe Glu Tyr Cys Trp Asp Asn Phe Val 180 185 190 Tyr Asn Asp Gly Gln Pro Phe Lys Pro Trp Lys Arg Leu Gln Asp Asn 195 200 205 Ser Leu Ser Leu Tyr Ile Thr Leu Gln Glu Ile Leu Gln 210 215 220 <210> 93 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.24; tr|A0A2K5RDN7|A0A2K5RDN7_CEBCA polypeptide sequence <400> 93 Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Arg Pro Arg Pro Leu Met Gly Pro Arg 1 5 10 15 Thr Phe Thr Glu Asn Phe Thr Asn Asn Pro Glu Val Phe Gly Arg His 20 25 30 Gln Thr Tyr Leu Cys Tyr Glu Val Lys Cys Gln Gly Pro Asp Gly Thr 35 40 45 Arg Asp Leu Met Thr Glu Gln Arg Asp Phe Leu Cys Asn Gln Ala Arg 50 55 60 Asn Leu Leu Ser Gly Phe Asp Gly Arg His Ala Glu Arg Cys Phe Leu 65 70 75 80 Asp Arg Val Pro Ser Trp Arg Leu Asp Pro Ala Gln Thr Tyr Arg Val 85 90 95 Thr Cys Phe Ile Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Cys Ala Arg Glu Val 100 105 110 Ala Glu Phe Leu Gln Glu Asn Pro His Val Asn Leu Arg Ile Phe Ala 115 120 125 Ala Arg Ile Tyr Asp Cys Arg Pro Arg Tyr Glu Glu Gly Leu Gln Met 130 135 140 Leu Gln Asn Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Ser Glu Glu Phe 145 150 155 160 Arg His Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly His Pro Phe Gln 165 170 175 Pro Trp Glu Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Arg Arg Leu 180 185 190 Gln Ala Ile Leu Gln Gly Asn Arg Trp Met Ile Leu Ser Leu 195 200 205 <210> 94 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.25; tr|A0A1C9CJ69|A0A1C9CJ69_CERAL polypeptide sequence <400> 94 Asn Pro Met Lys Ala Met Asp Pro His Ile Phe Tyr Phe His Phe Lys 1 5 10 15 Asn Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Arg Asn Glu Thr Trp Leu Cys Phe Ala 20 25 30 Val Glu Ile Ile Lys Gln Arg Ser Thr Val Pro Trp Arg Thr Gly Val 35 40 45 Phe Arg Asn Gln Val Asp Pro Glu Ser His Cys His Ala Glu Arg Cys 50 55 60 Phe Leu Ser Trp Phe Cys Glu Asp Ile Leu Ser Pro Asn Thr Asp Tyr 65 70 75 80 Arg Val Thr Trp Tyr Thr Ser Trp Ser Pro Cys Leu Asp Cys Ala Gly 85 90 95 Glu Val Ala Glu Phe Leu Ala Arg His Ser Asn Val Glu Leu Ala Ile 100 105 110 Phe Ala Ala Arg Leu Tyr Tyr Phe Trp Asp Thr His Tyr Gln Gln Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Ser Glu Lys Gly Ala Ser Val Glu Ile Met Gly Tyr 130 135 140 Glu Asp Phe Lys Tyr Cys Arg Glu Asn Phe Val Cys Asp Asp Gly Lys 145 150 155 160 Pro Phe Lys Pro Trp Lys Gly Leu Lys Thr Asn Phe Arg Phe Leu Lys 165 170 175 Arg Arg Leu Gln Glu Ile Leu Glu 180 <210> 95 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.26; tr|A0A2R2Z4D2|A0A2R2Z4D2_PTEAL polypeptide sequence <400> 95 Met His Leu Gln Val Trp Arg Lys Val Thr Glu Ala Trp Arg Glu Gly 1 5 10 15 Tyr Thr Leu Lys Pro Trp Ser Arg Asn Pro Met Glu Arg Leu Tyr His 20 25 30 Asp Tyr Phe Tyr Phe His Phe Tyr Asn Leu Pro Thr Pro Lys His Arg 35 40 45 Asn Gly Cys Tyr Ile Cys Tyr Gln Val Glu Gly Thr Lys Lys His Ser 50 55 60 Arg Met Pro Leu Leu Arg Gly Val Phe Glu Asn Gln Glu Ser Leu Asp 65 70 75 80 Met Met Leu Ser Pro Gly Glu Lys Tyr Arg Val Thr Trp Tyr Ile Ser 85 90 95 Trp Ser Pro Cys Phe Ala Cys Val Asp Glu Val Ile Lys Phe Leu Arg 100 105 110 Glu His Thr Asn Val Glu Leu Ile Ile Phe Ala Ala Arg Leu Tyr His 115 120 125 Ser Asp Ile Leu Gln Tyr Arg Gln Gly Leu Arg Lys Leu His Asp Ala 130 135 140 Gly Val His Val Ala Ile Met Ser Tyr Tyr Glu Phe Lys His Cys Leu 145 150 155 160 Asn Asp Phe Val Phe His Gln Gly Arg Ser Phe Cys Pro Trp Asn Asp 165 170 175 Leu Asn Lys Asn Ser Lys Asn Leu Ser Asn Thr Leu Glu Asp Ile Leu 180 185 190 Arg Asn Gln Glu Asp 195 <210> 96 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.27; tr|B7T161|B7T161_SHEEP polypeptide sequence <400> 96 Met Thr Glu Gly Trp Ala Gly Ser Gly Leu Pro Gly Arg Gly Asp Cys 1 5 10 15 Val Trp Thr Pro Gln Thr Arg Asn Thr Met Asn Leu Leu Arg Glu Thr 20 25 30 Leu Phe Lys Gln Gln Phe Gly Asn Gln Pro Arg Val Pro Pro Pro Tyr 35 40 45 Tyr Arg Arg Lys Thr Tyr Leu Cys Tyr Gln Leu Lys Glu Leu Asp Asp 50 55 60 Leu Met Leu Asp Lys Gly Cys Phe Arg Asn Lys Lys Gln Arg His Ala 65 70 75 80 Glu Ile Arg Phe Ile Asp Lys Ile Asn Ser Leu Asn Leu Asn Pro Ser 85 90 95 Gln Ser Tyr Lys Ile Ile Cys Tyr Ile Thr Trp Ser Pro Cys Pro Asn 100 105 110 Cys Ala Ser Glu Leu Val Asp Phe Ile Thr Arg Asn Asp His Leu Asn 115 120 125 Leu Gln Ile Phe Ala Ser Arg Leu Tyr Phe His Trp Ile Lys Pro Phe 130 135 140 Cys Arg Gly Leu His Gln Leu Gln Lys Ala Gly Ile Ser Val Ala Val 145 150 155 160 Met Thr His Thr Glu Phe Glu Asp Cys Trp Glu Gln Phe Val Asp Asn 165 170 175 Gln Leu Arg Pro Phe Gln Pro Trp Asp Lys Leu Glu Gln Tyr Ser Ala 180 185 190 Ser Ile Arg Arg Arg Leu Gln Arg Ile Leu Thr Ala Pro Thr 195 200 205 <210> 97 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.28; tr|A0A2R2X2G4|A0A2R2X2G4_PTEAL polypeptide sequence <400> 97 Met Ala Gly Leu Gly Gln Ala Cys Glu Gly Cys Cys Gly Gln Met Pro 1 5 10 15 Glu Ile Ser Tyr Pro Met Gly Arg Leu Asp Pro Lys Thr Phe Ser Phe 20 25 30 Glu Phe Lys Asn Leu Pro Tyr Ala Tyr Gly Arg Lys Ser Ser Tyr Leu 35 40 45 Cys Phe Gln Val Glu Arg Glu Gln His Ser Ser Pro Val Pro Ser Asp 50 55 60 Trp Gly Val Phe Lys Asn Gln Phe Cys Gly Thr Glu Pro Tyr His Ala 65 70 75 80 Glu Leu Cys Phe Leu Asn Trp Phe Arg Ala Glu Lys Leu Ser Pro Tyr 85 90 95 Glu His Tyr Asp Val Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Ser Thr 100 105 110 Cys Ala Glu Glu Ile Ala Ile Phe Leu Ser Asn His Lys Asn Val Arg 115 120 125 Leu Asn Ile Phe Val Ser Arg Ile Tyr Tyr Phe Trp Lys Pro Ala Phe 130 135 140 Arg Gln Gly Leu Gln Glu Leu Asp His Leu Gly Val Gln Leu Asp Ala 145 150 155 160 Met Ser Phe Asp Glu Phe Lys Tyr Cys Trp Glu Asn Phe Val Asp Asn 165 170 175 Gln Gly Met Pro Phe Arg Cys Trp Lys Lys Val His Gln Asn Tyr Lys 180 185 190 Ser Val Leu Arg Lys Leu Asn Glu Ile Leu Arg Arg Arg 195 200 205 <210> 98 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.29; tr|G1Q1M4|G1Q1M4_MYOLU polypeptide sequence <400> 98 Tyr Ala Glu Leu Ser Phe Leu Asp Leu Phe Gln Ser Trp Asn Leu Asp 1 5 10 15 Arg Gly Arg Gln Tyr Arg Leu Thr Trp Tyr Met Ser Trp Ser Pro Tyr 20 25 30 Pro Asp Cys Ala Gln Lys Leu Val Glu Phe Leu Gly Glu Asn Ser His 35 40 45 Val Thr Leu Arg Ile Phe Ala Ala Asp Ile His Ser Leu Cys Ser Gly 50 55 60 Tyr Glu Asp Gly Leu Arg Lys Leu Arg Asp Ala Arg Ala Gln Leu Ala 65 70 75 80 Ile Met Thr Arg Asp Glu Leu Gln Tyr Cys Trp Val Thr Phe Val Asp 85 90 95 Asn Gln Gly Gln Pro Phe Arg Pro Trp Pro Asn Leu Val Glu His Ile 100 105 110 Lys Thr Lys Lys Gln Glu Leu Lys Asp Ile Leu Gly Asn Pro Met Arg 115 120 125 Arg Met Tyr Pro Lys Thr Phe Asn Phe Asn Phe Gln Asn Leu Asn Ser 130 135 140 Tyr Gly Arg Lys Ser Thr Phe Leu Cys Phe Glu Val Glu Thr Trp Glu 145 150 155 160 Asp Gly Ser Val Leu Asp Tyr Gln Asn Gly Val Phe Gln Asn Gln Leu 165 170 175 Asp Pro Gly His Ala Glu Leu Cys Phe Ile Glu Trp Phe His Glu Lys 180 185 190 Val Leu Phe Pro Asp Glu Val Arg Cys Pro Asp Ala Gln Tyr His Val 195 200 205 Thr Trp Tyr Ile Ser Trp Ser Pro Cys Phe Glu Cys Ala Glu Gln Val 210 215 220 Ala Gly Phe Leu Asn Glu His Glu Asn Val Asp Leu Ser Ile Ser Ala 225 230 235 240 Ala Arg Leu Tyr Leu Cys Glu Asp Glu Asp Glu Gln Gly Leu Gln Asp 245 250 255 Leu Val Ala Ala Gly Ala Lys Val Ala Met Met Ala Pro Glu Asp Phe 260 265 270 Glu Tyr Cys Trp Asp Asn Phe Val Tyr Asn Arg Gly Trp Pro Phe Thr 275 280 285 Tyr Trp Lys His Val Arg Arg Asn Tyr Gly Arg Leu Gln Glu Lys Leu 290 295 300 Asp Glu Ile Leu Trp 305 <210> 99 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.30; tr|A0A1S3AN78|A0A1S3AN78_ERIEU polypeptide sequence <400> 99 Arg Arg Ile Glu Pro Trp Glu Phe Glu Asp Phe Phe Asp Pro Arg Gln 1 5 10 15 Phe Arg Pro Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Val Arg Trp Gly Ser Ser 20 25 30 Arg Asn Ala Trp Arg Ser Thr Ala Arg Asn Thr Thr Arg His Ala Glu 35 40 45 Val Asn Phe Leu Glu Arg Phe Ala Ala Glu Arg His Phe Asp Lys Pro 50 55 60 Val Ser Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Trp Glu 65 70 75 80 Cys Ser Gln Ala Ile Gly Ala Phe Leu Ser Gln His Pro Gln Val Thr 85 90 95 Leu Ala Ile His Val Thr Arg Leu Phe His His Glu Asp Glu Gln Asn 100 105 110 Arg Gln Gly Leu Arg Asp Leu Leu Ala Arg Gly Val Thr Leu Gln Val 115 120 125 Met Gly Asp Ser Glu Tyr Ala His Cys Trp Arg Thr Phe Val Asn Ser 130 135 140 Pro Pro Gly Ala Glu Gly His Tyr Pro Arg Tyr Pro Ser Asp Phe Thr 145 150 155 160 Arg Leu Tyr Ala Leu Glu Leu His Cys Ile Ile Leu Gly Leu Pro Pro 165 170 175 Cys Leu Glu Ile Leu Arg Arg Tyr Gln Asn Gln Phe Thr Leu Phe Arg 180 185 190 Leu Val Pro Gln Asn Cys His Tyr Gln Met Ile Pro His Leu Asn Phe 195 200 205 Phe Val Val Arg His Tyr Phe Phe 210 215 <210> 100 <211> 201 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.32; tr|Q4VUI3|Q4VUI3_XENLA polypeptide sequence <400> 100 Met Thr Met Asp Ser Met Leu Leu Lys Arg Asn Lys Phe Ile Tyr His 1 5 10 15 Tyr Lys Asn Leu Arg Trp Ala Arg Gly Arg His Glu Thr Tyr Leu Cys 20 25 30 Tyr Ile Val Lys Arg Arg Tyr Ser Ser Val Ser Cys Ala Leu Asp Phe 35 40 45 Gly Tyr Leu Arg Asn Arg Asn Gly Cys His Ala Glu Met Leu Phe Leu 50 55 60 Arg Tyr Leu Ser Ile Trp Val Gly His Asp Pro His Arg Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Val Thr Trp Phe Ser Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Lys Arg 85 90 95 Thr Leu Glu Phe Leu Lys Gly His Pro Asn Phe Ser Leu Arg Ile Phe 100 105 110 Ser Ala Arg Leu Tyr Phe Cys Glu Glu Arg Asn Ala Glu Pro Glu Gly 115 120 125 Leu Arg Lys Leu Gln Lys Ala Gly Val Arg Leu Ser Val Met Ser Tyr 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Tyr Cys Trp Asn Thr Phe Val Glu Thr Arg Glu Ser 145 150 155 160 Gly Phe Glu Ala Trp Asp Gly Leu His Glu Asn Ser Val Arg Leu Ala 165 170 175 Arg Lys Leu Arg Arg Ile Leu Gln Pro Pro Tyr Asp Met Glu Asp Leu 180 185 190 Arg Glu Val Phe Val Leu Leu Gly Leu 195 200 <210> 101 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.33; tr|E2RL86|E2RL86_CANLF polypeptide sequence <400> 101 Met Asn Pro Leu Gln Glu Glu Thr Phe Tyr Gln Gln Phe Ser Asn Gln 1 5 10 15 Arg Val Pro Lys Pro Thr Tyr Gln Arg Arg Thr Tyr Leu Cys Tyr Gln 20 25 30 Leu Lys Pro His Glu Gly Ser Val Ile Ala Lys Val Cys Leu Gln Asn 35 40 45 Gln Glu Lys Arg His Ala Glu Ile Cys Phe Ile Asp Asp Ile Lys Ser 50 55 60 Arg Gln Leu Asp Pro Ser Gln Lys Phe Glu Ile Thr Cys Tyr Val Thr 65 70 75 80 Trp Ser Pro Cys Pro Thr Cys Ala Lys Lys Leu Ile Ala Phe Val Asn 85 90 95 Asp His Pro His Ile Ser Leu Arg Leu Phe Ala Ser Arg Leu Tyr Phe 100 105 110 His Trp Arg Gln Lys Tyr Lys Arg Glu Leu Arg His Leu Gln Lys Ser 115 120 125 Gly Ile Pro Leu Ala Val Met Ser Tyr Leu Glu Phe Lys Asp Cys Trp 130 135 140 Glu Lys Phe Val Asp His Lys Gly Arg Pro Phe Gln Pro Trp Asn Lys 145 150 155 160 Leu Lys Gln Tyr Ser Glu Ser Ile Gly Arg Arg Leu Gln Arg Ile Leu 165 170 175 Gln Pro Leu Asn Asn Leu Glu Asn Asp Phe Arg Asn Leu Arg Leu 180 185 190 <210> 102 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.34; tr|G1LWB0|G1LWB0_AILME polypeptide sequence <400> 102 Ser Ser Ala Ala Pro Ala Ser Ile His Leu Leu Asp Glu Asp Thr Phe 1 5 10 15 Thr Glu Asn Phe Arg Asn Asp Asp Trp Pro Ser Arg Thr Tyr Leu Cys 20 25 30 Tyr Lys Val Glu Gly Pro Asp Gln Gly Ser Gly Val Pro Leu Gly Gln 35 40 45 Asp Lys Gly Ile Leu His Asn Lys Pro Ala Gln Gly Pro Glu Pro Ser 50 55 60 Arg His Ala Glu Cys Tyr Leu Leu Glu Gln Ile Gln Ser Trp Asn Leu 65 70 75 80 Asp Pro Lys Leu His Tyr Gly Val Thr Cys Phe Leu Ser Trp Ser Pro 85 90 95 Cys Ala Lys Cys Ala Gln Lys Met Ala Arg Phe Leu Gln Glu Asn Ser 100 105 110 His Val Ser Leu Lys Leu Phe Ala Ser Arg Leu Tyr Thr Arg Glu Arg 115 120 125 Trp Asp Glu Asp Tyr Lys Glu Gly Leu Arg Thr Leu Lys Arg Ala Gly 130 135 140 Ala Ser Ile Ala Ile Met Thr Tyr Arg Glu Phe Glu His Cys Trp Lys 145 150 155 160 Thr Phe Val Leu His Asp Gln Glu Gly Ser Cys Phe Gln Pro Trp Pro 165 170 175 Phe Leu His Lys Glu Ser Gln Lys Phe Ser Glu Lys Leu Gln Ala Ile 180 185 190 Leu Gln Val Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Pro Pro Pro Leu Pro Ser 195 200 205 Ser Pro Leu Ser Ser Pro Trp Pro Phe Pro Ala Pro Leu Arg Ala Ser 210 215 220 Thr Gly 225 <210> 103 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.35; tr|A0A1U7S7K7|A0A1U7S7K7_ALLSI polypeptide sequence <400> 103 Met Gly Glu His Trp Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Glu Tyr Ile Pro Gln 1 5 10 15 Asp Gln Phe Glu Glu Asn Phe Asp Pro Ser Val Leu Leu Ala Glu Thr 20 25 30 His Leu Leu Ser Glu Leu Thr Trp Gly Gly Arg Pro Tyr Lys His Trp 35 40 45 Tyr Glu Asn Thr Glu His Cys His 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tr|A0A2R2X2J8|A0A2R2X2J8_PTEVA polypeptide sequence <400> 104 Met Pro Arg Ile Gly Asn Met Asn Leu Leu Ser Glu Lys Thr Phe Asn 1 5 10 15 Tyr His Phe Gly Asn Gln Leu Arg Val Lys Lys Pro Gln Gly Arg Arg 20 25 30 Arg Thr Tyr Leu Cys Tyr Lys Leu Lys Leu Pro Asn Glu Thr Leu Val 35 40 45 Lys Gly Tyr Phe Ile Asn Lys Lys Lys Asn His Ala Glu Ile Arg Phe 50 55 60 Ile Asn Lys Ile Arg Ser Leu Asn Leu Asp Gln Thr Gln Ser Tyr Lys 65 70 75 80 Ile Thr Cys Tyr Ile Thr Trp Ser Pro Cys Ser Tyr Cys Ala Gly Lys 85 90 95 Leu Val Ala Leu Val Lys Ser Cys Pro His Leu Ser Leu Gln Ile Phe 100 105 110 Thr Ser Arg Leu Tyr Tyr His Trp Leu Trp Lys Asn Gln Ala Gly Leu 115 120 125 Arg Tyr Leu Trp Lys Ile Asn Ile Ser Val Leu Val Met Lys Glu Pro 130 135 140 Glu Phe Ala Asp Cys Trp Asp Asn Phe Val Asn His Gln Ser Arg Arg 145 150 155 160 Phe Lys Pro Trp Glu Lys Leu Thr Gln Tyr Ser Asn Ser Thr Glu Arg 165 170 175 Arg Leu Leu Arg Ile Leu Arg Ile Asn Arg Thr Asp Leu Phe Leu Ala 180 185 190 Gln Ser Ser Glu Gln Asp Pro Gly Leu 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Val Ser His 145 150 155 160 Pro His Glu Gly Glu Gly Asp Phe Trp Pro Trp Phe Phe Pro Leu Trp 165 170 175 Ile Thr Phe Tyr Thr Leu Glu Leu Gln His Ile Leu Leu Gln Gln His 180 185 190 Ala Leu Ser Tyr Asn Leu 195 <210> 106 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM3.38; tr|A0A2K6MNR2|A0A2K6MNR2_RHIBE polypeptide sequence <400> 106 Ile Trp Leu Cys Phe Thr Met Glu Ile Ile Lys Gln Cys Ser Thr Val 1 5 10 15 Ser Trp Lys Arg Gly Val Phe Arg Asn Gln Val Asp Pro Glu Thr His 20 25 30 Cys His Ala Glu Arg Cys Phe Leu Ser Trp Phe Trp Glu Asp Thr Leu 35 40 45 Ser Pro Asn Thr Asn Tyr Gln Val Thr Trp Tyr Thr Ser Trp Ser Pro 50 55 60 Cys Leu Asp Cys Ala Gly Glu Val Ala Glu Phe Leu Ala Arg His Ser 65 70 75 80 Asn Val Lys Leu Ala Ile Phe Ala Ala Arg Leu Tyr Tyr Phe Trp Asp 85 90 95 Thr Asp Tyr Gln Gln Gly Leu Arg Ser Leu Ser Glu Glu Gly Thr Ser 100 105 110 Val Glu Ile Met Gly Tyr Glu Asp Phe Lys Tyr Cys Trp Glu Asn Phe 115 120 125 Val Tyr Asn Gly Asp 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tr|A0A316TX77|A0A316TX77_9BACT polypeptide sequence <400> 124 Met Ile Asn Gly Tyr Thr Pro Tyr Ser Gly Asn Gln Asn Thr Cys Tyr 1 5 10 15 Val Lys Gly Glu Ser Gly Thr Phe Tyr Pro Gly Val Arg Ile Glu Asn 20 25 30 Val Ser Tyr Pro Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Ala Val Cys Ser 35 40 45 Cys Leu Ala Asn Ser Asp Asn Pro Val Glu Tyr Tyr Thr Gly Asp His 50 55 60 Gln Pro Glu Leu Leu Gln Val Trp Ala Asp Glu Tyr Asp Met Lys Pro 65 70 75 80 Gly Gly Lys Leu Pro Asp Ser Pro Leu Lys Leu Phe Asp Pro Leu Val 85 90 95 Pro Ser Ile Pro Asp Ile Lys Lys Glu Leu Asp Val Leu Thr Glu Lys 100 105 110 Ser Val Thr Pro Asn Ser Gly Phe Pro Val Ser Ala Leu Leu Gln Thr 115 120 125 Glu Lys Gly Tyr Ile Arg Gly Val Asn Ile Glu Leu Ser Ser Trp Ala 130 135 140 Leu Gly Leu Cys Ala Glu Arg Val Ala Ile Ser Arg Ala Leu Thr Ala 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Gln Phe Lys Ser Ile His Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Asp 165 170 175 Phe Val Ser Pro Cys Gly Ala Cys Arg Gln Val Leu Leu Glu Val Met 180 185 190 Pro Asp Ala Asp Thr Glu Leu Tyr His 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Ala Asn Tyr Glu Val Arg Ser 35 40 45 Asp Ser Lys Val Leu Thr Pro Ala Asp Leu Pro Ala Asp Glu Leu Ala 50 55 60 Val His Glu Ser Arg Met Arg His Ile Ile Asp Ile Ala Arg Val Asn 65 70 75 80 Asn Lys Lys Phe Val Ser Ser Ile Tyr Phe Pro Asn Gly Thr Leu Ala 85 90 95 Cys Ile Gly Ile Asn Thr Gly Lys Pro Asn Met Ile Ala His Gly Glu 100 105 110 Ile Val Ala Ile Gln Asn Cys Thr Glu Ile His Gly Ile Ser Met Tyr 115 120 125 Thr Asn Tyr Ser Ile Tyr Thr Thr Gly Glu Pro Cys Ser Met Cys Ala 130 135 140 Ser Ala Ile Leu Trp Ser Arg Phe Lys Thr Val Val Trp Ser Thr Tyr 145 150 155 160 Asn Ser Asp Leu Tyr Cys Lys Ile Cys Met Ser Asn Ile Pro Ile Asp 165 170 175 Ser Ser Tyr Ile Phe Ser Arg Ala Tyr Gly Leu Gly Ile Glu Ala Pro 180 185 190 Val Ala Ile Gly Gly Val Val Lys Ala Glu Gly Asp Ala Trp Phe Gly 195 200 205 Thr Tyr Cys Asn Arg Pro Thr Ser Ile Tyr Tyr Ile Ala Pro Lys Cys 210 215 220 Ala Cys Gln Asp Pro Ala Lys Val Ser Pro Leu Lys Phe Thr Gln Thr 225 230 235 240 Arg Thr Thr Val Trp Val Glu Gly Gly Asp Lys Val Val Thr Gln Trp 245 250 255 Asn Ala Ile Ile Ser Asn Pro Ser Asn Ser Thr Ile Val Asp Pro Pro 260 265 270 Ile Val Ile Ser Pro Ser Val Val Phe Lys Gly Ala Pro Trp Gly Ile 275 280 285 Ser Ala Ala Ser Glu Pro Asn Thr Tyr Lys Leu Ser Tyr Asn Lys Val 290 295 300 Leu Phe Pro Gly Gln Thr Phe Ser Phe Gly Tyr Ser Val Tyr Gly Leu 305 310 315 320 Glu Glu Val Ala Phe Thr Ala Leu Glu Ala 325 330 <210> 131 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.21; tr|U7QZM1|U7QZM1_PHOTE polypeptide sequence <400> 131 Met Asn Lys Thr Arg Arg Lys Leu Leu Ala Thr Leu Gly Ile Met Ser 1 5 10 15 Ile Ser Met Ser Phe Ile Ala Gln Ala Gly Glu Lys Lys Thr Gln Val 20 25 30 Ile Asn Asn Ile Leu Ser Lys Gln Glu Ile Thr Glu His Glu Lys Tyr 35 40 45 Met Arg Glu Ala Ile Lys Glu Ala Ile Lys Asn Pro Lys His Pro Phe 50 55 60 Gly Ala Val Ile Val Asn Arg Asn Asn Gly Glu Ile Leu Ser Arg Gly 65 70 75 80 Val Asn Thr Gly Arg Asn Asn Pro Ile Leu His Gly Glu Ile Gln Ala 85 90 95 Ile 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285 Pro Asn Trp Gln Lys Leu Val Arg Leu Glu Tyr Ser Glu Asp Ser Arg 290 295 300 Val Gly Ser Glu Pro Val Ala His Thr Pro Leu His Leu Glu Leu 305 310 315 <210> 133 <211> 203 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.23; tr|A0A3D3HMU1|A0A3D3HMU1_9GAMM polypeptide sequence <400> 133 Met Asp Tyr Ser Asp Ala Ile Leu Gly Ala Ile Thr Ser Ile Arg Arg 1 5 10 15 Asn Ser Lys Gln Pro Gly Val Asn Val Thr Asp Asn Val Thr Asp Ser 20 25 30 Ser Thr Gln Tyr Asn Asn Asp Glu Tyr Trp Met Arg Arg Ala Leu Ala 35 40 45 Leu Ala Arg Glu Ala Gly Glu Ala Gly Glu Ile Pro Val Gly Ala Val 50 55 60 Leu Val Lys Asp Asn Gln Gln Val Ala Gly Gly Phe Asn Gln Pro Ile 65 70 75 80 Arg Ser His Asp Pro Ala Ala His Ala Glu Ile Leu Thr Leu Arg Glu 85 90 95 Ala Gly Ala Val Leu Gly Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Thr Thr Leu Tyr 100 105 110 Val Thr Leu Glu Pro Cys Met Met Cys Ala Gly Ala Leu Val His Ser 115 120 125 Arg Ile Lys Arg Leu Val Phe Gly Ala Ala Glu Pro Lys Thr Gly Ala 130 135 140 Ala Gly Ser Phe Ile Asp Leu Leu Thr Leu Pro Arg Leu Asn His Tyr 145 150 155 160 Met Glu Val Thr Gly Gly Val Leu Gly Glu Glu Cys Ser Val Leu Leu 165 170 175 Ser Asp Phe Phe Arg Arg Arg Arg Ala Glu Lys Lys Ala Leu Lys Arg 180 185 190 Gln Asn Ser Glu Ser Gly Ser Asp Ser Ala Ser 195 200 <210> 134 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.24; tr|A0A1N5WT13|A0A1N5WT13_9ACTN polypeptide sequence <400> 134 Met Leu Glu Lys Ile Glu Arg Arg Leu Val Ala Ala Ala Glu Ala Val 1 5 10 15 Val Arg Ser Pro Ser Thr Gly Asp Ala His Thr Val Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Met Asp Ala Asn Gly Asp Ile Tyr Ser Gly Val Asn Val Phe His Phe 35 40 45 Thr Gly Gly Pro Cys Ala Glu Leu Val Val Ile Gly Ser Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Asn Ala Pro Pro Leu Ile Thr Ile Val Ala Val Gly Asp Gly Asp 65 70 75 80 Arg Gly Val Ile Ala Pro Cys Gly Arg Cys Arg Gln Val Met Leu Asp 85 90 95 Leu His Pro Asp Val Phe Val Ile Val Pro Thr Gly Asp Gly Gln Leu 100 105 110 Ala Ala Lys Pro Val 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Arg Arg Phe Tyr Leu Leu Gln Asn 165 170 175 Glu Ser Ala Pro Lys Pro Ala Leu Lys Ser Thr Arg Val Leu Lys Glu 180 185 190 His Phe Asp Glu 195 <210> 140 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.30; tr|A0A239CVF7|A0A239CVF7_9DELT polypeptide sequence <400> 140 Met Ser Pro Ala Ser Lys Lys His Phe Pro Ser Leu Phe Ser Phe Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Ile Gly Leu Ile Cys Gly Thr Ala His Ala Gln Pro Gln 20 25 30 Gly His Thr Ala Asp Asp Thr Ala Ala Thr Leu Ala Asn Ala Ser Leu 35 40 45 Lys Glu His Glu Pro Phe Ile Arg Arg Cys Tyr Gln Leu Ala Ile Asp 50 55 60 Ala Gly Lys Lys Gly Asn His Pro Phe Gly Ala Leu Leu Val His Lys 65 70 75 80 Gly Lys Ile Val Leu Glu Ala Glu Asn Thr Val Leu Thr Asp Asn Asp 85 90 95 Phe Thr Asn His Ala Glu Met Asn Leu Ile Ala Glu Ala Ala Arg Thr 100 105 110 Leu Ser Arg Gln Ile Ile Pro Glu Ala Thr Val Tyr Thr Ser Cys Ala 115 120 125 Pro Cys Ala Met Cys Thr Ala Thr Leu Ala Met Ala Gly Phe Thr Arg 130 135 140 Ile Val Tyr 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100 105 110 Pro Arg Val Val Gly Ile His Gly Ser Trp His His Ser Phe His Thr 115 120 125 Leu Pro Ile Tyr Tyr Leu Leu Ser Glu Lys Arg Ile Pro Tyr Gln Leu 130 135 140 Val Ala Ala Phe Ser Asp Glu Asp Glu Ala Arg Ala Tyr Glu Val Ala 145 150 155 160 Thr Asp Lys Lys Ile Val Arg Pro Thr Leu Glu Gly Ser Phe Asp Asp 165 170 175 Thr Thr Val Leu Gln Leu Thr Asp Glu Val Ala Lys Ser Ser Tyr Asp 180 185 190 Tyr Gly Phe Gln Thr Gly Ala Ile Leu Ala Glu Lys Val Asn Gly Val 195 200 205 Tyr Gln Pro Val Ala Ala Gly Phe Asn Lys Val Val Pro Tyr Gln Thr 210 215 220 Tyr Ala Leu Leu Asn Gly Ala Ser Arg Glu Thr Asn Phe Ser Pro Ala 225 230 235 240 Asn Asp Met Asn His Tyr Asp Thr Ile His Ala Glu Met Gln Ile Leu 245 250 255 Val Glu Ala Ala Lys Gln Gly Ile Ser Leu Lys Asp Lys Thr Leu Phe 260 265 270 Val Asn Leu Met Pro Cys Pro Ser Cys Ala Arg Thr Leu Ser Gln Thr 275 280 285 Glu Leu Ser Glu Ile Val Tyr Arg Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Ala 290 295 300 Val Asp Leu Leu Thr Lys Val Gly Lys Asp Ile Arg Arg Ile Val Tyr 305 310 315 320 <210> 142 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.32; tr|A0A2G6N4N7|A0A2G6N4N7_9DELT polypeptide sequence <400> 142 Met Lys Glu Arg Thr Val Ser Tyr Ser Asp Arg His Phe Met Ala Glu 1 5 10 15 Ala Leu Glu Met Ala Glu Ser Ala Leu Thr Gln Gly Glu Phe Pro Val 20 25 30 Gly Cys Val Ile Ala Asp Gly Thr Ala Val Val Ala Arg Gly His Arg 35 40 45 Thr Gly Thr Thr Ala Gly Ala Val Asn Glu Ile Asp His Ala Glu Ile 50 55 60 Asn Ala Leu Arg His Leu Gly Leu Ala Gly Glu His Leu Asp Arg Thr 65 70 75 80 Asp Leu Thr Ile Tyr Ser Thr Met Glu Pro Cys Leu Met Cys Phe Ala 85 90 95 Ala Ile Val Leu Ser Gly Ile Asn Arg Ile Val Tyr Ala Tyr Glu Asp 100 105 110 Val Met Gly Gly Gly Thr Gly Cys Asp Leu Thr Gly Leu Pro Pro Leu 115 120 125 Tyr Arg Asp Ala Pro Leu Thr Leu Val Ala Gly Val Arg Arg Arg Ala 130 135 140 Ser Leu Asn Leu Phe Arg Arg Phe Phe Thr Asp Pro Glu Asn Gly Tyr 145 150 155 160 Trp Ala Gly Ser Leu Leu Ser Arg Tyr Thr Leu Asn Gln Thr Lys 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<220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.34; tr|A0A327L2Q5|A0A327L2Q5_9RHIZ polypeptide sequence <400> 144 Met Val Thr Ser Arg Asp Gly Glu Asp Glu Ala Met Met Ala Arg Cys 1 5 10 15 Val Ala Leu Ser Arg Ile Ala Val Gly Lys Gly Glu Tyr Pro Phe Gly 20 25 30 Ala Val Val Ala Arg Glu Gly Arg Ile Val Ala Glu Ala Ile Asn Arg 35 40 45 Thr Ile Arg Asp Gly Asp Val Ser Arg His Ala Glu Val Ile Ala Leu 50 55 60 Ala Arg Ala Gln Lys Ala Ile Gly Arg Arg Glu Leu Arg Glu Cys Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Ser Asn Val Glu Pro Cys Ala Met Cys Ser Tyr Cys Ile Arg 85 90 95 Glu Ala Trp Val Gly Arg Val Val Tyr Ala Leu Gly Ser Pro Val Met 100 105 110 Gly Gly Val Ser Lys Trp Asn Ile Leu Arg Asp Asp Gly Leu Ser Gly 115 120 125 Arg Met Pro Gln Val Phe Asp Ala Ala Pro Glu Val Val Ser Gly Val 130 135 140 Leu Val Glu Gln Ala Gln Ala Ala Trp Arg Asp Trp Ser Pro Leu Ala 145 150 155 160 Trp Glu Met Ile Thr Leu Arg Gly Leu Met Thr Asp Pro Ser Ala Arg 165 170 175 Pro Glu Cys Arg Thr Arg Ala Ala Arg Pro Arg Ser Leu 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Ile Asp Gln Leu Leu Pro Phe Arg Phe Asn Asp Leu 145 150 155 160 Asn Ser <210> 146 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.36; tr|A0A369QGF1|A0A369QGF1_9BACT polypeptide sequence <400> 146 Met Glu Glu His Glu Lys Trp Met His Trp Cys Leu Asn Leu Ala Gln 1 5 10 15 Gln Ala Leu Gln Gln Gly Asp Phe Pro Val Gly Ala Val Val Val Gln 20 25 30 Lys Gly Lys Leu Ile Gly Gln Gly Val Glu Ala Gly Gln Leu Lys Lys 35 40 45 Asp Ile Thr Cys His Ala Glu Met Glu Ala Ile Arg Asp Ala Arg Gln 50 55 60 Thr Ile Asn Thr Ala Asp Leu Gln Asn Cys Ile Leu Tyr Ser Thr His 65 70 75 80 Glu Pro Cys Ile Met Cys Ser Tyr Val Ile Arg His His Lys Ile Ser 85 90 95 Arg Val Val Val Gly Thr Thr Val Pro Glu Val Gly Gly Ser Ser Ser 100 105 110 Ala Tyr Pro Leu Leu Ser Ala Pro Asp Ile Ser Ile Trp Val Ala Pro 115 120 125 Pro His Leu Val Thr Gly Val Leu Ala Glu Ala Cys Gln Ala Leu Ser 130 135 140 Gln Ala Tyr Lys Gln Lys Phe Lys Lys 145 150 <210> 147 <211> 159 <212> PRT <213> 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pYY-BEM4.38; tr|A0A238BW09|A0A238BW09_9BILA polypeptide sequence <400> 148 Met Glu Glu Met Ala Arg Lys Ile Arg Thr Lys Ala Lys Lys Ala Asn 1 5 10 15 Ser Tyr Cys Asn Thr Met Thr Phe Leu Ile Ser Lys Ala Ser Ile Val 20 25 30 Leu Leu Lys Ala Glu Cys Lys Arg Ile Glu Leu Thr Val Val Ile Phe 35 40 45 Arg Phe Leu Ile Lys Met Asn Ala Ser Glu Pro Asn Asn Glu Leu Cys 50 55 60 Asp Met Thr Val Ile Lys Ser Met Leu Lys Ile Thr His Val Ile Phe 65 70 75 80 Asp Leu Asp Gly Leu Leu Ile Asp Thr Glu Val Val Phe Ser Lys Val 85 90 95 Asn Gln Cys Leu Leu Ser Lys Tyr Asn Lys Lys Phe Thr Pro His Leu 100 105 110 Arg Gly Leu Val Thr Gly Met Pro Lys Lys Ala Ala Val Thr Tyr Ile 115 120 125 Leu Glu His Glu Lys Leu Ser Ala Lys Val Asp Val Asp Glu Tyr Cys 130 135 140 Lys Lys Tyr Asp Glu Met Ala Glu Glu Met Leu Pro Lys Cys Ser Leu 145 150 155 160 Met Pro Gly Val Met Lys Leu Val Arg His Leu Lys Thr His Ser Ile 165 170 175 Pro Met Ala Ile Cys Thr Gly Ala Thr Lys Lys Glu Phe Glu Ile Lys 180 185 190 Thr Arg Tyr His Lys Glu 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110 Thr Arg Ser Gly Glu Val Ser Thr Val Thr Leu Gly Glu Leu Leu Pro 115 120 125 Leu Ala Phe Asp Ser Leu 130 <210> 162 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.52; tr|A0A2A9NC86|A0A2A9NC86_9AGAR polypeptide sequence <400> 162 Met Thr Asn Ser Thr Leu Ser Asn Glu Asp Arg Thr Arg Leu Ile Gln 1 5 10 15 Gly Ala Phe Gln Ala Arg Lys Lys Thr Tyr Ser Pro Tyr Ser Asn Phe 20 25 30 Pro Val Gly Ala Ala Leu Leu Thr Thr Asp Gly Arg Ile Ile Glu Gly 35 40 45 Ala Asn Ile Glu Asn Ala Ser Tyr Gly Gly Thr Ile Cys Ala Glu Arg 50 55 60 Thr Ala Ile Val Lys Ala Val Ser Asp Gly Tyr Arg His Phe Ala Gly 65 70 75 80 Ile Ala Val Thr Thr Lys Met Pro Thr Arg Val Ser Pro Cys Gly Ile 85 90 95 Cys Arg Gln Val Leu Arg Glu Phe Cys Ser Leu Asp Met Pro Val Leu 100 105 110 Leu Val Pro Gly Asp Tyr Pro Gln Arg Asn Pro Val Asp Asp Asp Gly 115 120 125 Ala Asp Lys Pro Gly Val Ile Thr Glu Gly Gly Val Arg Glu Thr Thr 130 135 140 Leu Gly Ala Leu Leu Pro Asp Ser Phe Gly Pro 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<211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.68; tr|A0A3E2VN88|A0A3E2VN88_9FIRM polypeptide sequence <400> 178 Met Glu Lys Glu Ile Thr Asn Met Asp Lys Gln Lys Leu Ile Gln Met 1 5 10 15 Ala Val Asp Gly Leu Gly Arg Ser Tyr Ala Pro Tyr Ser His Phe His 20 25 30 Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Ala Asp Gly Thr Val Tyr Thr Gly Asn 35 40 45 Asn Ile Glu Asn Ala Ala Tyr Thr Pro Ser Val Cys Ala Glu Arg Cys 50 55 60 Ala Ile Phe Lys Ala Val Gly Asp Gly Arg Arg Glu Phe Glu Ala Ile 65 70 75 80 Ala Val Cys Gly Gly Pro Asp Gly Val Ile Glu Asp Tyr Cys Pro Pro 85 90 95 Cys Gly Val Cys Arg Gln Val Met Arg Glu Phe Cys Asp Pro Ser Ser 100 105 110 Phe Arg Val Leu Val Ala Lys Thr Ala Glu Asp Tyr Arg Glu Tyr Thr 115 120 125 Leu Glu Gln Leu Leu Pro Asp Gly Phe Gly Pro Asp His Leu Thr Gly 130 135 140 Ser Gly Glu Arg 145 <210> 179 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.69; tr|A0A2D5ZRJ2|A0A2D5ZRJ2_9BACT polypeptide sequence <400> 179 Met Ala Arg Pro Val His Leu His Thr Gly Glu Arg Arg Thr Glu Glu 1 5 10 15 Gly Ala Thr Glu Ser Arg Ala Val Ala Ala Val Ala Thr Ala Ile Thr 20 25 30 Arg Ala Pro Arg Ala Pro Pro Arg Pro Ala Thr Gly Arg Glu Arg Asp 35 40 45 Gly Pro Pro Pro Arg Arg Val Phe Gly Gly Gly Leu Arg Val Gly Asp 50 55 60 Pro Ser Gly Tyr Asp Arg Gly Glu Ser Lys Pro Ile Gly Gly Pro Leu 65 70 75 80 Thr Glu Lys Arg Ser Asp Trp His Ser Tyr Phe Met Arg Ile Ala Gly 85 90 95 Glu Val Ala Thr Arg Ala Thr Cys Asp Arg Lys His Val Gly Ala Val 100 105 110 Ile Val Arg Asn Arg Thr Ile Leu Ser Thr Gly Tyr Asn Gly Ser Ile 115 120 125 Arg Gly Met Pro His Cys Asp Asp Val Gly His Asp Met Val Asp Gly 130 135 140 His Cys Ile Ala Thr Ile His Ala Glu Ala Asn Ala Ile Leu Gln Ala 145 150 155 160 Ala Arg Asn Gly Val Met Ile Gln Asp Gly Ser Ile Tyr Ile Thr Ala 165 170 175 Ser Pro Cys Trp Asn Cys Phe Lys Leu Val Ala Asn Ala Gly Leu Lys 180 185 190 Arg Val Tyr Tyr Gly Glu Phe Tyr Arg Asp Lys Arg Ser Phe Glu Val 195 200 205 Ala Arg Arg Leu Gly Ile Asp Leu Met His Ile Glu Val 210 215 220 <210> 180 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.70; tr|A0A1B8WPS3|A0A1B8WPS3_9BACI polypeptide sequence <400> 180 Met Glu Gly Val Gln Leu Ile Tyr Gln Phe Gln Trp Gly Asn Leu Ile 1 5 10 15 Met Thr Val Asn Lys Glu Asp Leu Tyr Leu Ile Asp Val Ala Arg Asn 20 25 30 Thr Ile Lys Thr Leu Tyr Val Asp Gly Lys His His Val Gly Ala Ala 35 40 45 Val Arg Thr Lys Thr Gly Lys Ile Tyr Ser Ala Val His Leu Glu Ala 50 55 60 Asn Ile Gly Arg Val Ser Val Cys Ala Glu Ala Ile Ala Leu Gly Lys 65 70 75 80 Ala Ile Ser Glu Gly Glu Ser Glu Phe Asp Thr Ile Val Ala Val Arg 85 90 95 His Pro Asp Pro Thr Gln Glu Asn Gln Lys Ile Glu Val Val Ser Pro 100 105 110 Cys Gly Ile Cys Arg Glu Leu Ile Ser Asp Tyr Gly Lys Gly Thr Asn 115 120 125 Val Ile Leu Lys Asn Lys Glu Gly Tyr Ile Lys Thr Val Ile Ser Asp 130 135 140 Leu Leu Pro Asn Lys Tyr Ile Arg Glu Asp Asn 145 150 155 <210> 181 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.71; tr|A0A1W5ZQK9|A0A1W5ZQK9_9BACI polypeptide sequence <400> 181 Met Asn Arg Phe Met Glu Arg Ala Val Ser Leu Ala Ala Glu Asn Val 1 5 10 15 Arg Val Gly Gly Gln Pro Phe Gly Ala Val Leu Val Lys Asp Asp Glu 20 25 30 Leu Val Ala Glu Gly Val Asn Glu Met His Leu Asn Tyr Asp Val Ser 35 40 45 Gly His Ala Glu Leu Leu Ala Ile Arg Arg Ala Gln Gly Glu Leu Gln 50 55 60 Thr His Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Met Tyr Ala Ser Gly Glu Pro Cys 65 70 75 80 Pro Met Cys Leu Ser Ala Met Tyr Phe Ala Gly Ile Lys Asp Val Phe 85 90 95 Tyr Cys Ala Thr Val Glu Glu Ala Ala Gln Val Gly Leu Glu Lys Ser 100 105 110 Lys Asn Val Tyr Asp Asp Leu Gln Lys Ser Lys Gly Glu Arg Ser Leu 115 120 125 Val Met Lys Gln Met Pro Leu Glu Asp Asp Gln Glu Asp Pro Met Lys 130 135 140 Leu Trp Asp Glu Arg Thr Asn His Asn Gly Thr Ser 145 150 155 <210> 182 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.72; tr|A0A378V0W4|A0A378V0W4_MYCFO polypeptide sequence <400> 182 Met Val His Ala Gln Phe Asp Pro Thr Ala Arg Gln Ala Leu Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Val Glu Ala Lys Thr Arg Lys Asp Leu Thr Trp Gln Gln Ile 20 25 30 Ala Asp Ala Ala Glu Leu Ser Pro Ala Phe Val Thr Ala Ala Val Leu 35 40 45 Gly Gln His Ala Leu Pro Ala Arg Ser Ala Glu Ala Val Ala Ala Leu 50 55 60 Leu Gly Leu Asp Asp Asp Ala Ala Leu Leu Leu Gln Thr Ile Pro Ile 65 70 75 80 Arg Gly Ser Ile Pro Gly Gly Ile Pro Thr Asp Pro Thr Ile Tyr Arg 85 90 95 Phe Tyr Glu Met Leu Gln Val Tyr Gly Thr Thr Leu Lys Ala Leu Val 100 105 110 His Glu Gln Phe Gly Asp Gly Ile Ile Ser Ala Ile Asn Phe Lys Leu 115 120 125 Asp Val Arg Lys Val Ala Asp Pro Glu Gly Gly Glu Arg Ala Val Ile 130 135 140 Thr Leu Asp Gly Lys Tyr Leu Pro Pro Asn Pro Phe Asp Arg Val Arg 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Gly Leu Met Asp Phe Ala Gln Arg Thr Ile Asp Ile Ala 165 170 175 Arg Gln Asn Val Ala Glu Gly Gly Arg Pro Phe Ala Thr Val Ile Val 180 185 190 Lys Asn Gly Glu Ile Leu Ala Glu Ser Pro Asn Leu Val Ala Gln Thr 195 200 205 His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Leu Ala Ile Arg Lys Ala Cys 210 215 220 Thr Arg Ile Gly Thr Glu His Leu Ile Gly Ala Thr Ile Tyr Val Leu 225 230 235 240 Ala Gln Pro Cys Pro Met Cys Leu Gly Ser Leu Tyr Tyr Cys Ser Pro 245 250 255 Asp Glu Val Val Phe Leu Thr Thr Arg Asp Ala Tyr Glu Pro His Tyr 260 265 270 Val Asp Asp Arg Lys Tyr Phe Glu Leu Asn Met Phe Tyr Asp Glu Phe 275 280 285 Ala Lys Pro Trp Asp Gln Arg Arg Leu Pro Met Arg Tyr Glu Pro Arg 290 295 300 Asp Ala Ala Val Asp Val Tyr Lys Leu Trp Gln Glu Arg Asn Gly Gly 305 310 315 320 Glu Arg Arg Val Pro Gly Ala Pro Thr Ser Thr Arg Pro Gly Lys Asn 325 330 335 Pro Arg Gly Glu 340 <210> 183 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.73; tr|I3XF03|I3XF03_RHIFR polypeptide sequence <400> 183 Met Lys Gln Arg Cys Met Ser Pro Lys Ser Ala Gln Arg Phe Trp Asp 1 5 10 15 Asn Asp Met His Asn Asn Lys Asp Arg Pro Met Ser Glu Asn Glu Leu 20 25 30 Phe Val Ala Ala Arg Glu Ala Met Ala Lys Ala His Ala Pro Tyr Ser 35 40 45 Lys Phe Pro Val Gly Ala Ala Ile Arg Ala Glu Asp Gly Gln Ile Tyr 50 55 60 Thr Gly Ala Asn Ile Glu Asn Leu Ser Phe Pro Glu Gly Trp Cys Ala 65 70 75 80 Glu Thr Thr Ala Ile Ser His Met Val Met Ala Gly Gln Arg Lys Ile 85 90 95 Met Glu Val Ala Val Ile Ala Glu Lys Leu Ala Leu Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Gly Gly Cys Arg Gln Arg Leu Ala Glu Phe Ser Gly Ala Ser Thr Arg 115 120 125 Ile Tyr Leu Cys Asp Glu Thr Gly Ile Lys Lys Ser Leu Ala Leu Ser 130 135 140 Asp Leu Leu Pro His Ser Phe Glu Thr Glu Ile Leu Gly 145 150 155 <210> 184 <211> 595 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.74; tr|F8IEF3|F8IEF3_ALIAT polypeptide sequence <400> 184 Met Asp Ala Lys Glu Leu Glu Thr Arg Gly Trp Leu Cys Met Arg Ala 1 5 10 15 Val Asp Val Ile Asp Lys Lys Arg Arg Gly Glu Ala Leu Ala Glu Glu 20 25 30 Glu Leu Arg Phe Leu Ile Glu Gly Tyr Val Ala Gly Arg Ile Pro Asp 35 40 45 Tyr Gln Met Ser Ala Phe Leu Met Ala Val Val Trp Arg Gly Met Thr 50 55 60 Arg Glu Glu Thr Leu Val Leu Thr Arg Leu Leu Ala Asp Ser Gly Glu 65 70 75 80 Arg Leu Asp Leu Ser Gly Ile Pro Gly Val Lys Val Asp Lys His Ser 85 90 95 Thr Gly Gly Val Gly Asp Lys Ala Thr Leu Val Val Leu Pro Leu Val 100 105 110 Ala Ser Ile Gly Val Pro Val Ile Lys Met Ser Gly Arg Gly Leu Gly 115 120 125 His Thr Gly Gly Thr Ile Asp Lys Leu Glu Ser Ile Pro Gly Phe Arg 130 135 140 Thr Asp Leu Ser Val Ala Glu Leu Val Ala Gln Val Arg Gln Val Gly 145 150 155 160 Ile Ala Leu Gly Gly Gln Thr Ala Asp Leu Ala Pro Ala Asp Lys Lys 165 170 175 Leu Tyr Ala Leu Arg Asp Val Thr Gly Thr Val Glu Ser Leu Pro Leu 180 185 190 Ile Ala Ser Ser Val Met Ser Lys Lys Leu Ala Gly Gly Ala Asp Ala 195 200 205 Ile Val Leu Asp Val Lys Val Gly Asp Gly Ala Phe Met Lys Ser Arg 210 215 220 Ser Asp Ala Arg Arg Leu Ala Arg Leu Met Val Glu Ile Gly Glu Ala 225 230 235 240 Ala Gly Arg Arg Thr Val Ala Val Leu Ser Asn Met Asp Gln Pro Leu 245 250 255 Gly Cys Ala Ile Gly Asn Ala Leu Glu Val Ala Glu Ala Ile Arg Val 260 265 270 Leu Ser Gly Glu Gly Pro Phe Asp Leu Ala Glu Ile Ala Leu Ala Leu 275 280 285 Ala Glu Glu Met Thr Val Leu Ala Gly Val Ala Ala Thr Arg Glu Glu 290 295 300 Ala Arg Arg Met Leu Arg Gln Ser Val Ala Glu Gly Arg Ala Leu Glu 305 310 315 320 Thr Leu Arg Arg Trp Ile Ala Ala Gln Gly Gly Asp Pro Ala Val Val 325 330 335 Asp Asp Pro Ser Arg Leu Pro Gln Ala Pro Val Gln Met Pro Tyr Leu 340 345 350 Pro Lys Lys Ala Gly Phe Val Ala Lys Leu Ser Ala Leu Ala Phe Gly 355 360 365 Leu Ala Ala Met Arg Leu Gly Ala Gly Arg Glu Thr Lys Glu Glu Ala 370 375 380 Ile Asp Pro Ser Val Gly Ile Val Leu His Ala Lys Val Gly Asp Arg 385 390 395 400 Val Gln Thr His Arg Pro Met Phe Thr Val His Ala Arg Thr Gly Glu 405 410 415 Asp Ala Leu Arg Cys Ile Gln Glu Leu Glu Ala Ala Ile Gln Ile Ser 420 425 430 Asp Asp Pro Val Glu Ala Pro Pro Leu Ile Leu Ala Arg Ile Asp Arg 435 440 445 Ser Glu Ala Leu Pro Tyr Ala Asp Leu Met Asp Ala Ala Arg Glu Ala 450 455 460 Arg Asp Arg Ala Tyr Val Pro Tyr Ser Gly Phe Ala Val Gly Ala Ala 465 470 475 480 Leu Glu Leu Ala Asp Gly Arg Met Val Thr Gly Ala Asn Val Glu Asn 485 490 495 Ala Ser Tyr Gly Leu Thr Asn Cys Ala Glu Arg Ser Ala Val Phe Arg 500 505 510 Ala Val Ala Glu Gly Gly Pro Gly Thr Lys Pro Glu Ile Arg Ala Val 515 520 525 Ala Val Ile Ala Asp Ser Pro Glu Pro Val Ser Pro Cys Gly Ala Cys 530 535 540 Arg Gln Val Leu Ala Glu Phe Cys Ser Pro Asp Thr Pro Val Tyr Leu 545 550 555 560 Gly Asn Leu Gln Gly Asp Val Arg Glu Thr Thr Val Gly Ala Leu Leu 565 570 575 Pro Gly Ala Phe Thr Asp Ala Gln Met Ala Asn Val Arg Arg Gln Asp 580 585 590 Lys Glu Ala 595 <210> 185 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.75; tr|A0A1G3M638|A0A1G3M638_9SPIR polypeptide sequence <400> 185 Met Lys Thr Thr Asn Ile Asn Ala Leu Asp Lys Trp Asp Leu Arg Phe 1 5 10 15 Leu Gln Met Ala Glu His Val Ala Glu Trp Ser Lys Asp Pro Ser Thr 20 25 30 Lys Val Gly Ala Val Ile Val Arg Pro Asp Arg Thr Ile Ala Ser Val 35 40 45 Gly Phe Asn Gly Phe Ala Arg Gly Val Arg Asp Thr Val Glu Arg Leu 50 55 60 Trp Asn Arg Glu Leu Lys Tyr Pro Leu Thr Val His Ala Glu Leu Asn 65 70 75 80 Ala Ile Leu Ser Ala His Glu Pro Val Arg Gly His Ser Leu Tyr Val 85 90 95 Ser Pro Leu Ser Pro Cys Ser Asn Cys Ala Gly Val Ile Ile Gln Ser 100 105 110 Gly Ile Ala Arg Val Val Ala Lys Cys Gly Gln Val Asn Asn Pro Ala 115 120 125 Gln Trp Ser Glu Ser Phe Asn Leu Ala Leu Thr Ala Phe Ala Glu Ala 130 135 140 Gly Val Ser Val Ile Leu Val Glu His 145 150 <210> 186 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.76; tr|A0A3D9LFR2|A0A3D9LFR2_9MICC polypeptide sequence <400> 186 Met Glu Gln Asn Asp His Gly Ser Ser Gly Ala Phe Ser Asp Pro Phe 1 5 10 15 Glu Asp Asp Ile Pro Leu Thr Ala Ser Leu Pro Arg Ile Thr Gly Thr 20 25 30 Gly Ser Gly Ile Asp Trp Gln Arg Leu Glu Ser Thr Ala Arg Ala Ala 35 40 45 Met Thr Arg Ala Tyr Val Pro Tyr Ser Arg Phe Pro Val Gly Ala Ala 50 55 60 Ala Leu Val Glu Asp Gly Arg Val Val Ala Gly Cys Asn Ile Glu Asn 65 70 75 80 Ala Ser Leu Gly Leu Thr Leu Cys Ala Glu Cys Ser Leu Val Ser Asn 85 90 95 Leu Gln Met Ser Gly Gly Gly Arg Ile Val Ala Phe Tyr Cys Val Asp 100 105 110 Gly Asn Gly Glu Val Leu Met Pro Cys Gly Arg Cys Arg Gln Leu Leu 115 120 125 Tyr Glu Phe His Ala Pro Gly Met Arg Leu Met Gly Pro Asp Gly Glu 130 135 140 Leu Thr Met Asp Glu Val Leu Pro Leu Ala Phe Gly Pro Ala Asp Met 145 150 155 160 Thr His Leu Ser Asp Ser Ala Ala Ser Thr Asp Asp Pro Gly Arg Thr 165 170 175 Arg <210> 187 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.77; tr|A0A3B9YGB5|A0A3B9YGB5_9BACT polypeptide sequence <400> 187 Met Ala Lys Pro Ile Ser Lys Lys Tyr Arg Lys Leu Ile Glu Thr Ala 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Lys Lys Ala Tyr Ser Pro Tyr Ser Arg Tyr Gln Val 20 25 30 Gly Ala Ala Val Leu Thr Glu Ser Gly Arg Ile Tyr Ser Gly Ala Asn 35 40 45 Met Glu Asn Ala Ser Tyr Gly Leu Cys Met Cys Ala Glu Arg Val Ala 50 55 60 Ile Ala Asn Ala Val Thr Arg Gly Glu Lys Val Leu Gln Ala Val Cys 65 70 75 80 Val Val Gly Lys Lys Ala Arg Pro Cys Gly Ala Cys Arg Gln Val Met 85 90 95 Leu Glu Phe Ser Thr Lys Glu Thr Glu Leu Leu Met Val Asp Ile Asp 100 105 110 Pro Asn Ala Arg Arg Asp Thr Val Ile Arg Thr Arg Val Tyr Ser Met 115 120 125 Leu Pro Asn Pro Phe Asp Pro Phe Glu Ser Gly Met Leu Pro Gln His 130 135 140 Pro Gln Asn Leu Leu Arg Arg Arg Lys Ser Pro Gln Pro Arg Arg Lys 145 150 155 160 Arg Arg Ser Arg Pro Val His Arg Glu Val Ser Arg 165 170 <210> 188 <211> 391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.78; tr|A0A182F569|A0A182F569_ANOAL polypeptide sequence <400> 188 Met Pro Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Ser Ser Gln Ser Leu Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gln Ile Gln Ala Ser Gln Ser Ser Asp Ser Val Val Asp Ile 20 25 30 Thr Ser Tyr Val Asn Ala Val Val Lys Ala Leu Leu Asn Leu Ser Cys 35 40 45 Thr Lys Thr Ile Ile Lys Arg Ala Asp Leu Val Asn Ile Ala Leu Lys 50 55 60 Gly Asn Gly Arg Leu Ile Gly Arg Val Leu Gln Asp Ala Asn Ile Glu 65 70 75 80 Leu Lys Glu Ile Tyr Gly Tyr Glu Leu Ile Glu Val Glu Lys Ser Lys 85 90 95 Thr Met Ile Leu Cys Ser Thr Leu Ala Ala Gly Ser Met Asp Glu Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Asn Arg Arg Arg Tyr Thr Phe Leu Tyr Leu Ile Leu Gly 115 120 125 Tyr Ile Phe Met Lys Asn Gly Ser Val Pro Glu Thr Ile Val Trp Glu 130 135 140 Phe Leu Glu Thr Leu Gly Ile Glu Glu Gln Gln Glu His Asn Tyr Phe 145 150 155 160 Gly Asp Val Arg Lys Leu Tyr Asp Ser Leu Phe Lys Gln Ala Tyr Leu 165 170 175 Thr Arg Thr Lys Gln Ala Leu Glu Gly Leu Asn Asp Asp Val Met Leu 180 185 190 Ile Ser Trp Gly Val Arg Ser Lys His Glu Val Ser Lys Lys Asp Ile 195 200 205 Leu Ala Gly Phe Cys Lys Val Met Asn Arg Asp Pro Val Asp Phe Lys 210 215 220 Ala Gln Tyr Ile Glu Ala Asn Glu Lys Asp Asp Lys Met Asn Asn Asn 225 230 235 240 Ile Asn Gly Thr Val Asp Gly Arg Asn Thr Val Glu Tyr Ser Ser Leu 245 250 255 Asp Ala Ser Val Lys Glu Leu Ile Glu Ala Ala Ile Lys Val Arg Asn 260 265 270 Asn Ala Tyr Cys Pro Tyr Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Leu Arg 275 280 285 Thr Val Gly Gly Asp Ile Val Thr Gly Cys Asn Val Glu Asn Gly Thr 290 295 300 Phe Gly Pro Ser Val Cys Ala Glu Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val 305 310 315 320 Ser Glu Gly His Arg Glu Phe Thr Ala Val Ala Val Val Ala Phe Gln 325 330 335 Glu Thr Glu Phe Thr Ala Pro Cys Gly Thr Cys Arg Gln Thr Leu Ser 340 345 350 Glu Phe Ser Arg Lys Asp Ile Pro Ile Tyr Leu Val Lys Pro Ser Pro 355 360 365 Val Arg Val Met Val Thr Ser Leu Phe Gln Leu Leu Pro His Ala Phe 370 375 380 Ser Pro Ser Phe Leu Asn Lys 385 390 <210> 189 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.79; tr|A0A264Z0D4|A0A264Z0D4_9BACI polypeptide sequence <400> 189 Met Glu Pro Lys Lys Leu Ile Glu Glu Ala Ile Val Ala Ser Lys Gln 1 5 10 15 Ala Tyr Val Gln Tyr Ser Asn Phe His Val Gly Ala Ala Leu Leu Thr 20 25 30 Lys Asp Gly Lys Leu Tyr His Gly Cys Asn Ile Glu Asn Ala Ser Tyr 35 40 45 Gly Leu Thr Asn Cys Ala Glu Arg Thr Ala Ile Phe Lys Ala Val Ser 50 55 60 Glu Gly Glu Lys Glu Phe Gln Ala Ile Ala Val Val Gly Asp Thr Glu 65 70 75 80 Gly Pro Ile Ser Pro Cys Gly Ala Cys Arg Gln Val Leu Ala Glu Phe 85 90 95 Phe Ser Pro Asp Thr Val Val Ile Leu Ala Asn Leu Lys Gly Asp His 100 105 110 Val Val Thr Asn Ile Asn Glu Leu Leu Pro Gly Phe Phe Ser Ser Lys 115 120 125 Asp Leu Gln Lys Lys Val Lys Asn Cys Phe Glu Lys Asn Ala Leu Gly 130 135 140 Ser Ser Cys Leu Arg Pro Ile 145 150 <210> 190 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pYY-BEM4.80; tr|A0A1L9Q1R3|A0A1L9Q1R3_ASPVE polypeptide sequence <400> 190 Met Pro Leu Ser Ala Glu Glu Ala Ala Leu Val Glu Thr Ala Thr Ala 1 5 10 15 Thr Ile Asn Ser Ile Pro Leu Ser Glu Asp Tyr Ser Val Ala Ser Ala 20 25 30 Ala Lys Ala Ser Asp Gly Arg Val Phe Thr Gly Val Asn Val Tyr His 35 40 45 Phe Thr Gly Gly Pro Cys Ala Glu Leu Val Val Leu Gly Val Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Gly Ala Ala Gln Leu Thr His Ile Val Ala Val Ala Asn Glu 65 70 75 80 Gln Arg Gly Ile Leu Ser Pro Cys Gly Arg Cys Arg Gln Val Leu Leu 85 90 95 Asp Leu Gln Pro Asn Ile Gln Val Ile Val Gly Lys Glu Gly Ser Glu 100 105 110 Gln Ser Val Pro Val Ala Gln Leu Leu Pro Phe Ser Tyr Arg Gln Pro 115 120 125 Asp Gln His Thr Pro Val Ile Phe Lys Ala Leu Thr Ser Ser Gly Pro 130 135 140 Val Val Val Asp Phe Phe Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys Lys Ala Val 145 150 155 160 Ala Pro Val Val Gly Lys Leu Ser Glu Thr Tyr Thr Asp Val Arg Phe 165 170 175 Ile Gln Val Asp Val Asp Lys Ala Arg Ser Ile Ser Gln Glu His Asp 180 185 190 Ile Arg Ala Met Pro Thr Phe Val Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Leu Leu 195 200 205 Asp Lys Arg Val Val Gly Gly Asn Met Lys Glu Leu Glu Glu Gln Ile 210 215 220 Lys Ala Ile Ile Ala 225 <210> 191 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 191 gguuuuaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 192 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 192 guuucuuaca cagggcucga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 193 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 193 gguuucaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 194 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 194 gccacuuaca cagggcucga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 195 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 195 gacauuaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 196 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 196 ggaucucaca cagggcucga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 197 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 197 guccuuaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 198 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 198 gucaccuaca cagggcucga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 199 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 199 gauuucaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 200 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 200 ggugcuuaca cagggcucga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 201 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 201 guccacaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 202 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 202 gauacuuaca cagggcucga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 203 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 203 guguuuuagc ugcggcaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 204 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 204 guuucuuaca gccauaauuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 205 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 205 gcuccacagc ugcggcaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 206 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 206 gauacuuaca gccauaauuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 207 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 207 guguuuuagg gacgaaagag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 208 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 208 guuaccuggc ucucuuagcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 209 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 209 gcuccacagg gacgaaagag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 210 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 210 gcuugcaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 211 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 211 gauugcaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 212 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 212 gucuccaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 213 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 213 gucugcaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 214 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 214 ggacucaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 215 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 215 gcacccaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 216 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 216 gaauuuaggu caugugugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 217 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 217 gcauuagguc gagaucacag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 218 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 218 gccuuagguc gagaucacag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 219 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 219 guuucagguc gagaucacag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 220 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 220 gacauuaggc uaagagagcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 221 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 221 guccuuaggc uaagagagcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 222 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 222 gguuucaggc uaagagagcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 223 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 223 gacauuagau uauggcucug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 224 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 224 guccuuagau uauggcucug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 225 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 225 gguuucagau uauggcucug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102 <210> 226 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 226 gtgagatcaa atgaaagttt catatagaaa tacaaaacct agagaactgg catgtaagag 60 aagcaaaaat tacttcagca aggccatgtt agtaaatttg catctgtttg tccacattag 120 <210> 227 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 227 gtaggtgaca atgctgcagc tgcctaatct aggtgggggg aactaaattg tgggtgagct 60 gctgaatggt ctgtagtctg aggctggggt ggggggagac acaacgtccc ctccctgcaa 120 accactgcta ttctgtccct ctctctcctt ag 152 <210> 228 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 228 gtaagtggct ttcaagacca ttgttaaaaa gctctgggaa tggcgatttc atgcttacat 60 aaattggcat gcttgtgttt cag 83 <210> 229 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 229 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtctaga 60 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120 tttctctcca cag 133 <210> 230 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 230 gtaagcacaa ctgggatggg gtgacagggg tgcaagattg aaaactggct cctctcctca 60 tagcagttct tgtgatttca g 81 <210> 231 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 231 gtaagaaatg ttatttttca gtaagtgatt tagttatttt tccttttttc tcattaaaat 60 ttctctaaca tctccctctt catgttttag 90 <210> 232 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 232 gtgagaccct agccccctca accctgccct ggcctctccc caaacctgcc cccccacgct 60 gacccccaca cccggccgcc cgcag 85 <210> 233 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 233 gtgggtgtca gaggcatcgg ggctgcgggg tagggggctg ccccacccct aacgaagtct 60 gctcctccag 70 <210> 234 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 234 gcagggaagt cctgcttccg tgccccaccg gtgctcagct gaggctccct tgaaaatgcg 60 aggctgtttc caactttggt ctgtttccct ggcag 95 <210> 235 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 235 gtggggagtt ggggtccccg aaggtgagga ccctctgggg atgagggtgc ttctctgaga 60 cactttcttt tcctcacacc tgttcctcgc cagcag 96 <210> 236 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 236 gtatagaccc cttgatctcc taaccctaac cctaacccta accctaacct acaaaatctt 60 agagcatcag tgggagcatc tcactgtcca ggctcaatat ttcttcattt tcttgcag 118 <210> 237 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 237 gtaattatga ttaaagatgg tgattgttta ttttctttta tgattgtcct tagtattatg 60 taacctgcaa attctattgc ag 82 <210> 238 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 238 gtgagtgaca caaggtgttg tctggggagt ggggaagggg gatggaagtg aatcctgttg 60 gtggggtgga gaaagggcga tctcaagagg gccactctct ccag 104 <210> 239 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 239 gtaagcatct ccaccatcct tctgtttact ctgatggggt ctgcaaaggg gagatgatgt 60 atagggttgg gtatctctgt aaatgtcaga tgtgaagttg atcttatgac cttctgttct 120 gcag 124 <210> 240 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 240 gtgagggtct cccaggctgg gcagggggag ggggctgctg ccttgattgc gtcccaggac 60 acagccctcc tccagcctgc cctcgccttg ctcatcccct ccccatctca gccccacccc 120 cactaactct ctctctgctc tgactcag 148 <210> 241 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 241 gtaatgattg attgcaatgt atgattacaa taatctcagt ataagttcag taataataac 60 cttccactgc tgtcctctgt gtgcacccag 90 <210> 242 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide sequence <400> 242 gtaaatatat acaacagttt ttcatttaaa taagtgcacg gcacaaataa gaaaaatatg 60 tcaaaaatgt aaccaatagt ttttttcaaa tttag 95 <210> 243 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 243 Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg 1 5 10 15 Lys Val <210> 244 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 244 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 245 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 245 Lys Lys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Asn Ala Glu Asn Lys Thr Lys Lys 1 5 10 15 Leu <210> 246 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 246 Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg 1 5 10 15 Lys Thr Arg <210> 247 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 247 Arg Lys Ser Gly Lys Ile Ala Ala Ile Val Val Lys Arg Pro Arg Lys 1 5 10 15 <210> 248 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 248 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 249 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 249 Met Asp Ser Leu Leu Met Asn Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Gln Phe Lys 1 5 10 15 Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg Arg Glu Thr Tyr Leu Cys 20 25 30 <210> 250 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1368) <223> Exemplary PAM-binding SpCas9 polypeptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(58) <223> RuvC domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (718)..(764) <223> RuvC domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (773)..(902) <223> HNH domain <400> 250 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 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Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu 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tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840 caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900 ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960 atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020 caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080 ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140 gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200 aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260 gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320 gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380 cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440 gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500 aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560 tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620 tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat 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Sulfolobus islandicus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(345) <223> tr|F0NN87|F0NN87_SULIHCRISPR-associatedCasx protein OS = Sulfolobus islandicus (strain HVE10/4) GN = SiH_0402 PE=4 SV=1); CasX polypeptide sequence <400> 257 Met Glu Val Pro Leu Tyr Asn Ile Phe Gly Asp Asn Tyr Ile Ile Gln 1 5 10 15 Val Ala Thr Glu Ala Glu Asn Ser Thr Ile Tyr Asn Asn Lys Val Glu 20 25 30 Ile Asp Asp Glu Glu Leu Arg Asn Val Leu Asn Leu Ala Tyr Lys Ile 35 40 45 Ala Lys Asn Asn Glu Asp Ala Ala Ala Glu Arg Arg Gly Lys Ala Lys 50 55 60 Lys Lys Lys Gly Glu Glu Gly Glu Thr Thr Thr Ser Asn Ile Ile Leu 65 70 75 80 Pro Leu Ser Gly Asn Asp Lys Asn Pro Trp Thr Glu Thr Leu Lys Cys 85 90 95 Tyr Asn Phe Pro Thr Thr Val Ala Leu Ser Glu Val Phe Lys Asn Phe 100 105 110 Ser Gln Val Lys Glu Cys Glu Glu Val Ser Ala Pro Ser Phe Val Lys 115 120 125 Pro Glu Phe Tyr Glu Phe Gly Arg Ser Pro Gly Met Val Glu Arg Thr 130 135 140 Arg Arg Val Lys Leu Glu Val Glu Pro His Tyr Leu Ile Ile Ala Ala 145 150 155 160 Ala Gly Trp Val Leu 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of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 287 gtttcaggtc atgtgtgctg gg 22 <210> 288 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 288 gccacttaca cagggctcga agg 23 <210> 289 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 289 acattaggtc atgtgtgctg gg 22 <210> 290 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 290 gatctcacac agggctcgaa gg 22 <210> 291 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 291 tccttaggtc atgtgtgctg gg 22 <210> 292 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 292 gtcacctaca cagggctcga agg 23 <210> 293 <211> 23 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<223> BhCas12b polypeptide sequence <400> 343 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val 20 25 30 Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala 35 40 45 Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ala Ile Tyr Glu 50 55 60 His His Glu Gln Asp Pro Lys Asn Pro Lys Lys Val Ser Lys Ala Glu 65 70 75 80 Ile Gln Ala Glu Leu Trp Asp Phe Val Leu Lys Met Gln Lys Cys Asn 85 90 95 Ser Phe Thr His Glu Val Asp Lys Asp Glu Val Phe Asn Ile Leu Arg 100 105 110 Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Val Pro Ser Ser Val Glu Lys Lys Gly Glu 115 120 125 Ala Asn Gln Leu Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn 130 135 140 Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ala Ser Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp 145 150 155 160 Tyr Asn Leu Lys Ile Ala Gly Asp Pro Ser Trp Glu Glu Glu Lys Lys 165 170 175 Lys Trp Glu Glu Asp Lys Lys Lys Asp Pro Leu Ala Lys Ile Leu Gly 180 185 190 Lys Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Pro 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1100 1105 <210> 345 <211> 1112 <212> PRT <213> Bacillus sp. V3-13 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1112) <223> BvCas12b (Bacillus sp. V3-13) polypeptide sequence <400> 345 Met Ala Ile Arg Ser Ile Lys Leu Lys Met Lys Thr Asn Ser Gly Thr 1 5 10 15 Asp Ser Ile Tyr Leu Arg Lys Ala Leu Trp Arg Thr His Gln Leu Ile 20 25 30 Asn Glu Gly Ile Ala Tyr Tyr Met Asn Leu Leu Thr Leu Tyr Arg Gln 35 40 45 Glu Ala Ile Gly Asp Lys Thr Lys Glu Ala Tyr Gln Ala Glu Leu Ile 50 55 60 Asn Ile Ile Arg Asn Gln Gln Arg Asn Asn Gly Ser Ser Glu Glu His 65 70 75 80 Gly Ser Asp Gln Glu Ile Leu Ala Leu Leu Arg Gln Leu Tyr Glu Leu 85 90 95 Ile Ile Pro Ser Ser Ile Gly Glu Ser Gly Asp Ala Asn Gln Leu Gly 100 105 110 Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn Ser Gln Ser Gly Lys 115 120 125 Gly Thr Ser Asn Ala Gly Arg Lys Pro Arg Trp Lys Arg Leu Lys Glu 130 135 140 Glu Gly Asn Pro Asp Trp Glu Leu Glu Lys Lys Lys Asp Glu Glu Arg 145 150 155 160 Lys Ala Lys Asp Pro Thr Val Lys Ile Phe Asp Asn Leu Asn Lys Tyr 165 170 175 Gly Leu Leu Pro Leu Phe Pro Leu Phe Thr Asn Ile Gln Lys Asp Ile 180 185 190 Glu Trp Leu Pro Leu Gly Lys Arg Gln Ser Val Arg Lys Trp Asp 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Salmonella typhimurium <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(183) <223> TadA polypeptide sequence <400> 399 Met Pro Pro Ala Phe Ile Thr Gly Val Thr Ser Leu Ser Asp Val Glu 1 5 10 15 Leu Asp His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg 20 25 30 Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val His Asn 35 40 45 His Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile Gly Arg His Asp 50 55 60 Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val 65 70 75 80 Leu Gln Asn Tyr Arg Leu Leu Asp Thr Thr Leu Tyr Val Thr Leu Glu 85 90 95 Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Val His Ser Arg Ile Gly Arg 100 105 110 Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu 115 120 125 Ile Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Ile 130 135 140 Glu Gly Val Leu Arg Asp Glu Cys Ala Thr Leu Leu Ser Asp Phe Phe 145 150 155 160 Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Leu Lys Lys Ala Asp Arg Ala 165 170 175 Glu Gly Ala Gly Pro Ala Val 180 <210> 400 <211> 164 <212> PRT <213> Shewanella putrefaciens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(164) <223> TadA polypeptide sequence <400> 400 Met Asp Glu Tyr Trp Met Gln Val Ala Met Gln Met Ala Glu Lys Ala 1 5 10 15 Glu Ala Ala Gly Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Lys Asp Gly 20 25 30 Gln Gln Ile Ala Thr Gly Tyr Asn Leu Ser Ile Ser Gln His Asp Pro 35 40 45 Thr Ala His Ala Glu Ile Leu Cys Leu Arg Ser Ala Gly Lys Lys Leu 50 55 60 Glu Asn Tyr Arg Leu Leu Asp Ala Thr Leu Tyr Ile Thr Leu Glu Pro 65 70 75 80 Cys Ala Met Cys Ala Gly Ala Met Val His Ser Arg Ile Ala Arg Val 85 90 95 Val Tyr Gly Ala Arg Asp Glu Lys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Val Val 100 105 110 Asn Leu Leu Gln His Pro Ala Phe Asn His Gln Val Glu Val Thr Ser 115 120 125 Gly Val Leu Ala Glu Ala Cys Ser Ala Gln Leu Ser Arg Phe Phe Lys 130 135 140 Arg Arg Arg Asp Glu Lys Lys Ala Leu Lys Leu Ala Gln Arg Ala Gln 145 150 155 160 Gln Gly Ile Glu <210> 401 <211> 173 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(173) <223> TadA polypeptide sequence <400> 401 Met Asp Ala Ala Lys Val Arg Ser Glu Phe Asp Glu Lys Met Met Arg 1 5 10 15 Tyr Ala Leu Glu Leu Ala Asp Lys Ala Glu Ala Leu Gly Glu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Ala Val Leu Val Asp Asp Ala Arg Asn Ile Ile Gly Glu Gly 35 40 45 Trp Asn Leu Ser Ile Val Gln Ser Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile 50 55 60 Ile Ala Leu Arg Asn Gly Ala Lys Asn Ile Gln Asn Tyr Arg Leu Leu 65 70 75 80 Asn Ser Thr Leu Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Thr Met Cys Ala Gly 85 90 95 Ala Ile Leu His Ser Arg Ile Lys Arg Leu Val Phe Gly Ala Ser Asp 100 105 110 Tyr Lys Thr Gly Ala Ile Gly Ser Arg Phe His Phe Phe Asp Asp Tyr 115 120 125 Lys Met Asn His Thr Leu Glu Ile Thr Ser Gly Val Leu Ala Glu Glu 130 135 140 Cys Ser Gln Lys Leu Ser Thr Phe Phe Gln Lys Arg Arg Glu Glu Lys 145 150 155 160 Lys Ile Glu Lys Ala Leu Leu Lys Ser Leu Ser Asp Lys 165 170 <210> 402 <211> 161 <212> PRT <213> Caulobacter crescentus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(161) <223> TadA polypeptide sequence <400> 402 Met Arg Thr Asp Glu Ser Glu Asp Gln Asp His Arg Met Met Arg Leu 1 5 10 15 Ala Leu Asp Ala Ala Arg Ala Ala Ala Glu Ala Gly Glu Thr Pro Val 20 25 30 Gly Ala Val Ile Leu Asp Pro Ser Thr Gly Glu Val Ile Ala Thr Ala 35 40 45 Gly Asn Gly Pro Ile Ala Ala His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile 50 55 60 Ala Ala Met Arg Ala Ala Ala Ala Lys Leu Gly Asn Tyr Arg Leu Thr 65 70 75 80 Asp Leu Thr Leu Val Val Thr Leu Glu Pro Cys Ala Met Cys Ala Gly 85 90 95 Ala Ile Ser His Ala Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Asp Asp 100 105 110 Pro Lys Gly Gly Ala Val Val His Gly Pro Lys Phe Phe Ala Gln Pro 115 120 125 Thr Cys His Trp Arg Pro Glu Val Thr Gly Gly Val Leu Ala Asp Glu 130 135 140 Ser Ala Asp Leu Leu Arg Gly Phe Phe Arg Ala Arg Arg Lys Ala Lys 145 150 155 160 Ile <210> 403 <211> 179 <212> PRT <213> Geobacter sulfurreducens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(179) <223> TadA polypeptide sequence <400> 403 Met Ser Ser Leu Lys Lys Thr Pro Ile Arg Asp Asp Ala Tyr Trp Met 1 5 10 15 Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ala Ala Lys Ala Ala Ala Arg Asp Glu Val 20 25 30 Pro Ile Gly Ala Val Ile Val Arg Asp Gly Ala Val Ile Gly Arg Gly 35 40 45 His Asn Leu Arg Glu Gly Ser Asn Asp Pro Ser Ala His Ala Glu Met 50 55 60 Ile Ala Ile Arg Gln Ala Ala Arg Arg Ser Ala Asn Trp Arg Leu Thr 65 70 75 80 Gly Ala Thr Leu Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Leu Met Cys Met Gly 85 90 95 Ala Ile Ile Leu Ala Arg Leu Glu Arg Val Val Phe Gly Cys Tyr Asp 100 105 110 Pro Lys Gly Gly Ala Ala Gly Ser Leu Tyr Asp Leu Ser Ala Asp Pro 115 120 125 Arg Leu Asn His Gln Val Arg Leu Ser Pro Gly Val Cys Gln Glu Glu 130 135 140 Cys Gly Thr Met Leu Ser Asp Phe Phe Arg Asp Leu Arg Arg Arg Lys 145 150 155 160 Lys Ala Lys Ala Thr Pro Ala Leu Phe Ile Asp Glu Arg Lys Val Pro 165 170 175 Pro Glu Pro <210> 404 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: TadA*8 polypeptide sequence <400> 404 Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala 20 25 30 Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala 35 40 45 Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His 85 90 95 Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His 115 120 125 Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Cys Thr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys 145 150 155 160 Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp 165 <210> 405 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: gRNA scaffold polynucleotide sequence <400> 405 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 406 <211> 125 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: gRNA scaffold polynucleotide sequence <400> 406 guuuuuguac ucucaagauu uaaguaacug uacaacgaaa cuuacacagu uacuuaaauc 60 uugcagaagc uacaaagaua aggcuucaug ccgaaaucaa cacccuguca uuuuauggca 120 gggug 125 <210> 407 <211> 76 <212> RNA <213> S. pyogenes <220> <221> misc_feature <222> (1)..(76) <223> S. pyogenes gRNA scaffold ologonucleotide sequence <400> 407 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugc 76 <210> 408 <211> 84 <212> RNA <213> S. aureus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(84) <223> S. aureus gRNA scaffold oligonucleotide sequence <400> 408 guuuuaguac ucuguaauga aaauuacaga aucuacuaaa acaaggcaaa augccguguu 60 uaucucguca acuuguuggc gaga 84 <210> 409 <211> 97 <212> RNA <213> Bacillus hisashii <220> <221> misc_feature <222> (1)..(97) <223> BhCas12b gRNA scaffold oligonucleotide sequence <400> 409 guucugucuu uuggucagga caaccgucua gcuauaagug cugcagggug ugagaaacuc 60 cuauugcugg acgaugucuc uuacgaggca uuagcac 97 <210> 410 <211> 88 <212> RNA <213> Bacillus sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(88) <223> BvCas12b gRNA scaffold oligonucleotide sequence <400> 410 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggagcaccug aaaacaggug cuuggcac 88 <210> 411 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: gRNA scaffold nucleotide sequence; oligonucleotide sequence <220> <221> modified_base <222> (78)..(80) <223> um <220> <221> misc_feature <222> (78)..(80) <223> In embodiments, a nucleotide(s) is linked to the preceding 5' nucleotide by a 3' phosphorothioate internucleotide liknage <400> 411 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 gggaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 412 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: gRNA scaffold nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (78)..(80) <223> In embodiments, a nucleotide(s) is linked to the preceding 5' nucleotide by a 3' phosphorothioate internucleotide liknage <220> <221> modified_base <222> (78)..(80) <223> um <400> 412 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 413 <211> 117 <212> RNA <213> Bacillus hisashii <220> <221> misc_feature <222> (1)..(117) <223> BhCas12b gRNA scaffold + guide sequence; oligonucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(97) <223> BhCas12b sgRNA scaffold <220> <221> misc_feature <222> (98)..(117) <223> n is a, c, g, or u <400> 413 guucugucuu uuggucagga caaccgucua gcuauaagug cugcagggug ugagaaacuc 60 cuauugcugg acgaugucuc uuacgaggca uuagcacnnn nnnnnnnnnn nnnnnnn 117 <210> 414 <211> 108 <212> RNA <213> Bacillus sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(108) <223> BvCas12b gRNA scaffold + guide sequence; oligonucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(88) <223> BvCas12b gRNA scaffold <220> <221> misc_feature <222> (89)..(108) <223> n is a, c, g, or u <400> 414 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggagcaccug aaaacaggug cuuggcacnn nnnnnnnnnn nnnnnnnn 108 <210> 415 <211> 119 <212> RNA <213> Alicyclobacillus acidiphilus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(119) <223> AaCas12b gRNA scaffold + guide sequence; oligonucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(99) <223> AaCas12b gRNA scaffold <220> <221> misc_feature <222> (100)..(119) <223> n is a, c, g, or u <400> 415 gucuaaagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggcc acuuuccagg uggcaaagcc 60 cguugaacuu cucaaaaaga acgaucugag aaguggcacn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 119 <210> 416 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide sequence <400> 416 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Gly Ala Asp Lys Arg Thr Ala Asp 1 5 10 15 Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 417 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 417 Arg Lys Ser Gly Lys Ile Ala Ala Ile Val Val Lys Arg Pro Arg Lys 1 5 10 15 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 418 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 418 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 419 <211> 1609 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pNMG-B335 ABE8.1_Y147T_CP5_NGC PAM_monomer polypeptide sequence <400> 419 Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala 20 25 30 Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala 35 40 45 Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His 85 90 95 Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His 115 120 125 Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Cys Thr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys 145 150 155 160 Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser 165 170 175 Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser 180 185 190 Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr 195 200 205 Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu 210 215 220 Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 225 230 235 240 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg 245 250 255 Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val 260 265 270 Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser 275 280 285 Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly 290 295 300 Gly Phe Met Gln Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys 305 310 315 320 Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu 325 330 335 Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp 340 345 350 Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile 355 360 365 Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg 370 375 380 Met Leu Ala Ser Ala Lys Phe Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu 385 390 395 400 Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys 405 410 415 Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu 420 425 430 Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe 435 440 445 Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser 450 455 460 Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 465 470 475 480 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Arg Ala Phe 485 490 495 Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Ala Arg Lys Glu Tyr Arg Ser Thr Lys 500 505 510 Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr 515 520 525 Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly 530 535 540 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 545 550 555 560 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 565 570 575 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 580 585 590 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 595 600 605 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 610 615 620 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 625 630 635 640 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 645 650 655 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 660 665 670 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 675 680 685 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 690 695 700 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 705 710 715 720 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 725 730 735 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 740 745 750 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 755 760 765 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 770 775 780 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 785 790 795 800 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 805 810 815 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 820 825 830 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 835 840 845 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 850 855 860 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 865 870 875 880 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 885 890 895 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 900 905 910 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 915 920 925 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 930 935 940 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 945 950 955 960 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 965 970 975 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 980 985 990 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 995 1000 1005 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala 1010 1015 1020 Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe 1025 1030 1035 Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu 1040 1045 1050 Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu 1055 1060 1065 Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu 1070 1075 1080 Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala 1085 1090 1095 Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe 1100 1105 1110 Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr 1115 1120 1125 Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val 1130 1135 1140 Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu 1145 1150 1155 Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu 1160 1165 1170 Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp 1175 1180 1185 Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe 1190 1195 1200 Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly 1205 1210 1215 Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys 1220 1225 1230 Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 1235 1240 1245 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr 1250 1255 1260 Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp 1265 1270 1275 Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile 1280 1285 1290 Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val 1295 1300 1305 Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met 1310 1315 1320 Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg 1325 1330 1335 Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser 1340 1345 1350 Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn 1355 1360 1365 Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr 1370 1375 1380 Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val 1385 1390 1395 Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp 1400 1405 1410 Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp 1415 1420 1425 Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp 1430 1435 1440 Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp 1445 1450 1455 Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys 1460 1465 1470 Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 1475 1480 1485 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr 1490 1495 1500 Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu 1505 1510 1515 Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr 1520 1525 1530 Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr 1535 1540 1545 Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys 1550 1555 1560 Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val 1565 1570 1575 Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Gly Ala Asp Lys Arg 1580 1585 1590 Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys 1595 1600 1605 Val <210> 420 <211> 1807 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: pNMG-357_ABE8.14 with NGC PAM CP5 polypeptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(174) <223> Adenosine deaminase sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (175)..(198) <223> Linker sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (199)..(365) <223> Adenosine deaminase sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (366)..(397) <223> Linker sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (398)..(738) <223> Sequence derived from Cas9 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (739)..(759) <223> Linker sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (760)..(1785) <223> Sequence derived from Cas9 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1786)..(1807) <223> Bipartite nuclear localization sequence <400> 420 Met 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from Cas9 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1765)..(1786) <223> Bipartite nuclear localization sequence <400> 424 Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala 20 25 30 Val Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro 35 40 45 Ile Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His 85 90 95 Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His 115 120 125 Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys 145 150 155 160 Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser 165 170 175 Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser 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Sequence derived from Cas9 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1765)..(1786) <223> Bipartite nuclear localization sequence <400> 428 Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala 20 25 30 Val Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro 35 40 45 Ile Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His 85 90 95 Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His 115 120 125 Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys 145 150 155 160 Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser 165 170 175 Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala 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1215 Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp 1220 1225 1230 Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile 1235 1240 1245 Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser 1250 1255 1260 Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr 1265 1270 1275 Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe 1280 1285 1290 Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 1295 1300 1305 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile 1310 1315 1320 Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys 1325 1330 1335 Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr 1340 1345 1350 Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe 1355 1360 1365 Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala 1370 1375 1380 Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro 1385 1390 1395 Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp 1400 1405 1410 Val Arg Lys Met Ile 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sequence <400> 429 Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala 20 25 30 Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala 35 40 45 Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His 85 90 95 Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His 115 120 125 Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Cys Thr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys 145 150 155 160 Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser 165 170 175 Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser 180 185 190 Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala 195 200 205 Ile 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<223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide sequence <400> 448 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 35 40 <210> 449 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide sequence <400> 449 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr 35 40 45 Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 50 55 60 <210> 450 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide sequence <400> 450 Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser 1 5 10 15 Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser 20 25 30 Glu 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Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 455 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 456 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 456 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 <210> 457 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 457 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Ala Pro Ala Pro 20 <210> 458 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 458 aaccgcacat gccgaaatta tgg 23 <210> 459 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 459 atgccgaaat tatggctctg cgg 23 <210> 460 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 460 Thr Ala His Ala Glu Ile Met 1 5 <210> 461 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 461 Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg 1 5 <210> 462 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 462 atgagcgagg tcgagttctc tcacga 26 <210> 463 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 463 gtgagcgagg tcgagttctc tcacga 26 <210> 464 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 464 gtgagcgagg tcgagttctc tcatga 26 <210> 465 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 465 acgagcgagg tcgagttctc tcacga 26 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oligonucleotide sequence <400> 471 atgagcgagg tcgagtggtc tcacga 26 <210> 472 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 472 atgagcgagg tcgagtggtc tcatga 26 <210> 473 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 473 atgagcgagg tcgaggggtc tcacga 26 <210> 474 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 474 atgagcgagg tcgaggggtc tcatga 26 <210> 475 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 475 atgagcgagg tcgaggcctc tcacga 26 <210> 476 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 476 atgagcgagg tcgaggcctc tcatga 26 <210> 477 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 477 Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His 1 5 <210> 478 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 478 Met Ser Glu Val Glu Trp Ser His 1 5 <210> 479 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 479 Met Ser Glu Val Glu Val Ser His 1 5 <210> 480 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide sequence <400> 480 Met Ser Glu Val Glu Ala Ser His 1 5 <210> 481 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic oligonucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 481 tttttttttt tttttttttt nn 22 <210> 482 <211> 306 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DnaE Intein-N polynucleotide sequence <400> 482 tgcctgtcat acgaaaccga gatactgaca gtagaatatg gccttctgcc aatcgggaag 60 attgtggaga aacggataga atgcacagtt tactctgtcg ataacaatgg taacatttat 120 actcagccag ttgcccagtg gcacgaccgg ggagagcagg aagtattcga atactgtctg 180 gaggatggaa gtctcattag ggccactaag gaccacaaat ttatgacagt cgatggccag 240 atgctgccta tagacgaaat ctttgagcga gagttggacc tcatgcgagt tgacaacctt 300 cctaat 306 <210> 483 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DnaE Intein-N polypeptide sequence <400> 483 Cys Leu Ser Tyr Glu Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Lys Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Ser 20 25 30 Val Asp Asn Asn Gly Asn Ile Tyr Thr Gln Pro Val Ala Gln Trp His 35 40 45 Asp Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Gly Ser 50 55 60 Leu Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Val Asp Gly Gln 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Glu Leu Asp 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gcatcatacg agcaactaaa gatcataaat tcatgaccac tgacgggcag 240 atgttgccaa tagatgagat attcgagcgg ggcttggatc tcaaacaagt ggatggattg 300 cca 303 <210> 487 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Cfa-N polypeptide sequence <400> 487 Cys Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Phe Leu 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Thr 20 25 30 Val Asp Lys Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Asn Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Gly Ser 50 55 60 Ile Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Thr Asp Gly Gln 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Gly Leu Asp Leu Lys Gln 85 90 95 Val Asp Gly Leu Pro 100 <210> 488 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Cfa-C polynucleotide sequence <400> 488 atgaagagga ctgccgatgg atcagagttt gaatctccca agaagaagag gaaagtaaag 60 ataatatctc gaaaaagtct tggtacccaa aatgtctatg atattggagt ggagaaagat 120 cacaacttcc ttctcaagaa cggtctcgta gccagcaac 159 <210> 489 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Cfa-C polypeptide sequence <400> 489 Met Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys 1 5 10 15 Arg Lys Val Lys Ile Ile Ser Arg Lys Ser Leu Gly Thr Gln Asn Val 20 25 30 Tyr Asp Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu Lys Asn Gly 35 40 45 Leu Val Ala Ser Asn 50 <210> 490 <211> 1081 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1081) <223> Nme3Cas9; WP_002217928.1 type II CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9 [Neisseria meningitidis] <400> 490 Met Ala Ala Phe Lys Pro Asn Pro Ile Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp 1 5 10 15 Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Met Val Glu Ile Asp Glu Glu 20 25 30 Glu Asn Pro Ile Arg Leu Ile Asp Leu Gly Val Arg Val Phe Glu Arg 35 40 45 Ala Glu Val Pro Lys Thr Gly Asp Ser Leu Ala Met Ala Arg Arg Leu 50 55 60 Ala Arg Ser Val Arg Arg Leu Thr Arg 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oligonucleotide sequence <400> 491 uucuugucgu acuuauagau cgcuacguua uuucaauuuu gaaaaucuga guccugggag 60 ugcgga 66 <210> 492 <211> 1094 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Telomerase Ku Heterodimer polypeptide sequence <400> 492 Met Ser Gly Trp Glu Ser Tyr Tyr Lys Thr Glu Gly Asp Glu Glu Ala 1 5 10 15 Glu Glu Glu Gln Glu Glu Asn Leu Glu Ala Ser Gly Asp Tyr Lys Tyr 20 25 30 Ser Gly Arg Asp Ser Leu Ile Phe Leu Val Asp Ala Ser Lys Ala Met 35 40 45 Phe Glu Ser Gln Ser Glu Asp Glu Leu Thr Pro Phe Asp Met Ser Ile 50 55 60 Gln Cys Ile Gln Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ile Ile Ser Ser Asp Arg 65 70 75 80 Asp Leu Leu Ala Val Val Phe Tyr Gly Thr Glu Lys Asp Lys Asn Ser 85 90 95 Val Asn Phe Lys Asn Ile Tyr Val Leu Gln Glu Leu Asp Asn Pro Gly 100 105 110 Ala Lys Arg Ile Leu Glu Leu Asp Gln Phe Lys Gly Gln Gln Gly Gln 115 120 125 Lys Arg Phe Gln Asp Met Met Gly His Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ser 130 135 140 Glu Val Leu Trp Val Cys Ala Asn Leu Phe Ser Asp Val 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24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 503 gtgtcgaagt tcgccctgga gagg 24 <210> 504 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 504 atgccgagat aatggccctc cgg 23 <210> 505 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 505 atgccgagat aatggccctt cgg 23 <210> 506 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 506 atgccgagat catggcacta cgg 23 <210> 507 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 507 atgccgagat catggcactc cgg 23 <210> 508 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 508 atgccgagat catggcactg cgg 23 <210> 509 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 509 atgccgagat catggcgcta cgg 23 <210> 510 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 510 atgccgagat catggcgctc cgg 23 <210> 511 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 511 atgccgagat catggcgtta cgg 23 <210> 512 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 512 atgccgagat tatggcacta cgg 23 <210> 513 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 513 atgccgagat tatggcactc cgg 23 <210> 514 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 514 atgccgagat tatggcactg cgg 23 <210> 515 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 515 atgccgagat tatggcactt cgg 23 <210> 516 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 516 atgccgagat tatggcgctg cgg 23 <210> 517 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 517 atgccgagat tatggctcta cgg 23 <210> 518 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 518 atgcggagat catggcgctg cgg 23 <210> 519 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide sequence <400> 519 atgctgagat aatggccctc cgg 23 <210> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 525 ggccaccaug agcgaggucg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60 guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuuu u 101 <210> 526 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 526 gugucgaagu ucgcccugga gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 527 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 527 gaugccgaga uaauggcccu cguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 528 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 528 gaugccgaga uaauggcccu uguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 529 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 529 gaugccgaga ucauggcacu aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 530 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 530 gaugccgaga ucauggcacu cguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 531 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 531 gaugccgaga ucauggcacu gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 532 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 532 gaugccgaga ucauggcgcu aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 533 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 533 gaugccgaga ucauggcgcu cguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 534 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 534 gaugccgaga ucauggcguu aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 535 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 535 gaugccgaga uuauggcacu aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 536 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 536 gaugccgaga uuauggcacu cguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 537 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 537 gaugccgaga uuauggcacu gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 538 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 538 gaugccgaga uuauggcacu uguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 539 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 539 gaugccgaga uuauggcgcu gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 540 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 540 gaugccgaga uuauggcucu aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 541 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 541 gaugcggaga ucauggcgcu gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 542 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 542 gaugcugaga uaauggcccu cguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 543 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 543 gaaccgcaca ugccgaaauu aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 544 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 544 ggcagguguc gacauaucua uguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 545 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 545 gaugccgaaa uuauggcucu gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 546 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 546 gacacaugac acagggcucg aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103 <210> 547 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic polynucleotide sequence <400> 547 ggccccagca cacaugacac aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60 ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uuu 103

Claims

데아미나아제 도메인 또는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하고, 여기서 인트론은 데마이나아제 또는 napDNApb 또는 이의 단편을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 삽입되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
인트론을 포함하는 데아미나아제 도메인 또는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 인트론은 스플라이드 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위에 변경을 포함하고, 여기서 변경은 염기 편집 mRNA의 스플라이싱 감소 또는 제거를 통해 염기 편집 폴리펩티드의 발현을 감소 또는 제거하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
염기 편집 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하고, 여기서 인트론은 염기 편집 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 삽입되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 3에 있어서, 염기 편집은 게놈 DNA에서 높은 편집 효율을 갖는 것인, 폴리뉴클레오티드.
인트론을 포함하는 염기 편집 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 인트론은 스플라이드 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위에 변경을 포함하고, 여기서 변경은 염기 편집 mRNA의 스플라이싱 감소 또는 제거를 통해 염기 편집 폴리펩티드의 발현을 감소 또는 제거하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 3 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 염기 편집은 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인 또는 데아미나아제 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인 또는 데아미나아제 도메인을 포함하는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하고, 여기서 인트론은 napDNAbp 도메인 또는 데아미나아제 도메인을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 삽입되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인, 및 데아미나아제 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하는 염기 편집기 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 인트론은 스플라이드 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위에 변경을 포함하며, 여기서 변경은 염기 편집기 mRNA의 스플라이싱을 감소시키는 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1, 2 또는 6 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 데아미나아제 도메인은 사이티딘 데아미나아제 도메인 또는 아데노신 데아미나아제 도메인인 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1, 2 또는 6 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 napDNAbp 도메인은 Cas9, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 및 Cas12j/CasΦ도메인으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 Cas 도메인인 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 인트론은 NF1, PAX2, EEF1A1, HBB, IGHG1, SLC50A1, ABCB11, BRSK2, PLXNB3, TMPRSS6, IL32, ANTXRL, PKHD1L1, PADI1, KRT6C, 및 HMCN2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열로부터 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 NF1에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 PAX2에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 EEF1A1에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 HBB 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 IGHG1 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 SLC50A1 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 ABCB11 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 BRSK2 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 PLXNB3 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 TMPRSS6 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 IL32 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 PKHD1L1 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 PADI1 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 KRT6C 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 11에 있어서, 인트론은 HMCN2 에서 유래한 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 포유류 유전자에 자연적으로 존재하는 인트론 대비 적어도 약 85% 핵산 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 비-포유류 유전자에 자연적으로 존재하는 인트론 대비 적어도 약 85% 핵산 서열 상동성을 갖는 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 합성 인트론인 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 다음 중 어느 하나 대비 적어도 약 85% 핵산 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드:
a) GTGAGATCAAATGAAAGTTTCATATAGAAATACAAAACCTAGAGAACTGGCATGTAAGAGAAGCAAAAATTACTTCAGCAAGGCCATGTTAGTAAATTTGCATCTGTTTGTCCACATTAG (서열번호: 226);
b) GTAGGTGACAATGCTGCAGCTGCCTAATCTAGGTGGGGGGAACTAAATTGTGGGTGAGCTGCTGAATGGTCTGTAGTCTGAGGCTGGGGTGGGGGGAGACACAACGTCCCCTCCCTGCAAACCACTGCTATTCTGTCCCTCTCTCTCCTTAG (서열번호: 227);
c) GTAAGTGGCTTTCAAGACCATTGTTAAAAAGCTCTGGGAATGGCGATTTCATGCTTACATAAATTGGCATGCTTGTGTTTCAG (서열번호: 228);
d) GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCTAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (서열번호: 229);
e) GTAAGCACAACTGGGATGGGGTGACAGGGGTGCAAGATTGAAAACTGGCTCCTCTCCTCATAGCAGTTCTTGTGATTTCAG (서열번호: 230);
f) GTAAGAAATGTTATTTTTCAGTAAGTGATTTAGTTATTTTTCCTTTTTTCTCATTAAAATTTCTCTAACATCTCCCTCTTCATGTTTTAG (서열번호: 231);
g) GTGAGACCCTAGCCCCCTCAACCCTGCCCTGGCCTCTCCCCAAACCTGCCCCCCCACGCTGACCCCCACACCCGGCCGCCCGCAG (서열번호: 232);
h) GTGGGTGTCAGAGGCATCGGGGCTGCGGGGTAGGGGGCTGCCCCACCCCTAACGAAGTCTGCTCCTCCAG (서열번호: 233);
i) GCAGGGAAGTCCTGCTTCCGTGCCCCACCGGTGCTCAGCTGAGGCTCCCTTGAAAATGCGAGGCTGTTTCCAACTTTGGTCTGTTTCCCTGGCAG (서열번호: 234);
j) GTGGGGAGTTGGGGTCCCCGAAGGTGAGGACCCTCTGGGGATGAGGGTGCTTCTCTGAGACACTTTCTTTTCCTCACACCTGTTCCTCGCCAGCAG (서열번호: 235);
k) GTATAGACCCCTTGATCTCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCTACAAAATCTTAGAGCATCAGTGGGAGCATCTCACTGTCCAGGCTCAATATTTCTTCATTTTCTTGCAG (서열번호: 236);
l) GTAATTATGATTAAAGATGGTGATTGTTTATTTTCTTTTATGATTGTCCTTAGTATTATGTAACCTGCAAATTCTATTGCAG (서열번호: 237);
m) GTGAGTGACACAAGGTGTTGTCTGGGGAGTGGGGAAGGGGGATGGAAGTGAATCCTGTTGGTGGGGTGGAGAAAGGGCGATCTCAAGAGGGCCACTCTCTCCAG (서열번호: 238);
n) GTAAGCATCTCCACCATCCTTCTGTTTACTCTGATGGGGTCTGCAAAGGGGAGATGATGTATAGGGTTGGGTATCTC TGTAAATGTCAGATGTGAAGTTGATCTTATGACCTTCTGTTCTGCAG (서열번호: 239);
o) GTGAGGGTCTCCCAGGCTGGGCAGGGGGAGGGGGCTGCTGCCTTGATTGCGTCCCAGGACACAGCCCTCCTCCAGCCTGCCCTCGCCTTGCTCATCCCCTCCCCATCTCAGCCCCACCCCCACTAACTCTCTCTCTGCTCTGACTCAG (서열번호: 240);
p) GTAATGATTGATTGCAATGTATGATTACAATAATCTCAGTATAAGTTCAGTAATAATAACCTTCCACTGCTGTCCTCTGTGTGCACCCAG (서열번호: 241); 또는
q) GTAAATATATACAACAGTTTTTCATTTAAATAAGTGCACGGCACAAATAAGAAAAATATGTCAAAAATGTAACCAATAGTTTTTTTCAAATTTAG (서열번호: 242).
청구항 1 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 다음 중 하나로부터의 핵산 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드:
a) GTGAGATCAAATGAAAGTTTCATATAGAAATACAAAACCTAGAGAACTGGCATGTAAGAGAAGCAAAAATTACTTCAGCAAGGCCATGTTAGTAAATTTGCATCTGTTTGTCCACATTAG (서열번호: 226);
b) GTAGGTGACAATGCTGCAGCTGCCTAATCTAGGTGGGGGGAACTAAATTGTGGGTGAGCTGCTGAATGGTCTGTAGTCTGAGGCTGGGGTGGGGGGAGACACAACGTCCCCTCCCTGCAAACCACTGCTATTCTGTCCCTCTCTCTCCTTAG (서열번호: 227);
c) GTAAGTGGCTTTCAAGACCATTGTTAAAAAGCTCTGGGAATGGCGATTTCATGCTTACATAAATTGGCATGCTTGTGTTTCAG (서열번호: 228);
d) GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCTAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (서열번호: 229);
e) GTAAGCACAACTGGGATGGGGTGACAGGGGTGCAAGATTGAAAACTGGCTCCTCTCCTCATAGCAGTTCTTGTGATTTCAG (서열번호: 230);
f) GTAAGAAATGTTATTTTTCAGTAAGTGATTTAGTTATTTTTCCTTTTTTCTCATTAAAATTTCTCTAACATCTCCCTCTTCATGTTTTAG (서열번호: 231);
g) GTGAGACCCTAGCCCCCTCAACCCTGCCCTGGCCTCTCCCCAAACCTGCCCCCCCACGCTGACCCCCACACCCGGCCGCCCGCAG (서열번호: 232);
h) GTGGGTGTCAGAGGCATCGGGGCTGCGGGGTAGGGGGCTGCCCCACCCCTAACGAAGTCTGCTCCTCCAG (서열번호: 233);
i) GCAGGGAAGTCCTGCTTCCGTGCCCCACCGGTGCTCAGCTGAGGCTCCCTTGAAAATGCGAGGCTGTTTCCAACTTTGGTCTGTTTCCCTGGCAG (서열번호: 234);
j) GTGGGGAGTTGGGGTCCCCGAAGGTGAGGACCCTCTGGGGATGAGGGTGCTTCTCTGAGACACTTTCTTTTCCTCACACCTGTTCCTCGCCAGCAG (서열번호: 235);
k) GTATAGACCCCTTGATCTCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCTACAAAATCTTAGAGCATCAGTGGGAGCATCTCACTGTCCAGGCTCAATATTTCTTCATTTTCTTGCAG (서열번호: 236);
l) GTAATTATGATTAAAGATGGTGATTGTTTATTTTCTTTTATGATTGTCCTTAGTATTATGTAACCTGCAAATTCTATTGCAG (서열번호: 237);
m) GTGAGTGACACAAGGTGTTGTCTGGGGAGTGGGGAAGGGGGATGGAAGTGAATCCTGTTGGTGGGGTGGAGAAAGGGCGATCTCAAGAGGGCCACTCTCTCCAG (서열번호: 238);
n) GTAAGCATCTCCACCATCCTTCTGTTTACTCTGATGGGGTCTGCAAAGGGGAGATGATGTATAGGGTTGGGTATCTCTGTAAATGTCAGATGTGAAGTTGATCTTATGACCTTCTGTTCTGCAG (서열번호: 239);
o) GTGAGGGTCTCCCAGGCTGGGCAGGGGGAGGGGGCTGCTGCCTTGATTGCGTCCCAGGACACAGCCCTCCTCCAGCCTGCCCTCGCCTTGCTCATCCCCTCCCCATCTCAGCCCCACCCCCACTAACTCTCTCTCTGCTCTGACTCAG (서열번호: 240);
p) GTAATGATTGATTGCAATGTATGATTACAATAATCTCAGTATAAGTTCAGTAATAATAACCTTCCACTGCTGTCCTCTGTGTGCACCCAG (서열번호: 241); 또는
q) GTAAATATATACAACAGTTTTTCATTTAAATAAGTGCACGGCACAAATAAGAAAAATATGTCAAAAATGTAACCAATAGTTTTTTTCAAATTTAG (서열번호: 242).
청구항 1 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 약 10 염기쌍 내지 약 500 염기쌍 사이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
청구항 32에 있어서, 인트론은 약 70 염기쌍 내지 150 염기쌍 사이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
청구항 32에 있어서, 인트론은 약 100 염기쌍 내지 200 염기쌍 사이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1 내지 34에 있어서, 인트론은 프로토스페이서(protospacer) 서열에 근접하게 삽입되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 35에 있어서, 인트론은 프로토스페이서 서열의 약 10 내지 30 염기쌍 내에 삽입되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 35 또는 36에 있어서, 프로토스페이서 서열은 NGG 또는 NNGRRT인 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1, 2 또는 6 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 데아미나아제 도메인은 TadA 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
청구항 38에 있어서, 인트론은 TadA의 코돈 18, 23, 59, 62, 87 또는 129의 내부 또는 바로 뒤에 삽입되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 39에 있어서, 인트론은 TadA의 코돈 87의 바로 뒤에 삽입되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 2, 5 또는 8 중 어느 한 항에 있어서, 변경은 단일-염기 편집인 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 41에 있어서, 단일-염기 편집은 A 에서 G로의 염기 편집인 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 41에 있어서, 단일-염기 편집은 C에서 T로의 염기 편집인 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
청구항 44에 있어서, 인트론은 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 1 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질 도메인은 Cas9 도메인인 것인, 폴리뉴클레오티드.
청구항 46에 있어서, Cas9 도메인은 Cas9의 Asn309 및 Thr310에 상응하는 아미노산 잔기 사이에 스플릿되고, 잔기 310은 Thr310Cys으로 돌연변이된 것인, 폴리뉴클레오티드.
다음을 포함하는 조성물:
(i) 데아미나아제 도메인 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 여기서 napDNAbp 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N에 융합된 것이고, 및
(ii) napDNAbp 도메인의 C-말단 단편을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 여기서 napDNAbp 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C에 융합되는 것이며,
제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하고, 여기서 인트론은 폴리뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임에 삽입된다.
다음을 포함하는 조성물:
(i) 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 여기서 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N에 융합되고, 및
(ii) 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 여기서 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C에 융합되는 것이며,
여기서 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하고, 여기서 인트론은 폴리뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임에 삽입된다.
청구항 48 또는 49 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위에 변경을 포함하고, 여기서 변경은 염기 편집기 mRNA의 스플라이싱을 감소 또는 제거하는, 조성물.
청구항 48 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 데아미나아제 도메인은 사이티딘 데아미나아제 도메인 또는 아데노신 데아미나아제 도메인인 것인, 조성물.
청구항 48 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 데아미나아제 도메인은 TadA 도메인인 것인, 조성물.
청구항 48 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, napDNAbp 도메인은 Cas9, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 및 Cas12j/CasΦ도메인으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 Cas 도메인인 것인, 조성물.
청구항 48 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, napDNAbp 도메인은 Cas9 도메인인 것인, 조성물.
청구항 54에 있어서, Cas9 도메인의 N- 및 C-말단 도메인이 아미노산 잔기 Asn309 및 Thr310 사이에서 스플릿되는 것인, 조성물.
청구항 54 또는 55에 있어서, Cas9 도메인은 Thr310Cys 돌연변이를 포함하는, 조성물.
청구항 48 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 NF1, PAX2, EEF1A1, HBB, IGHG1, SLC50A1, ABCB11, BRSK2, PLXNB3, TMPRSS6, IL32, ANTXRL, PKHD1L1, PADI1, KRT6C, 및 HMCN2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열로부터 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 NF1에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 PAX2에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 EEF1A1에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 HBB에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 IGHG1에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 SLC50A1에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 ABCB11에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 BRSK2에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 PLXNB3에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 TMPRSS6에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 IL32에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 PKHD1L1에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 PADI1에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 KRT6C에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 57에 있어서, 인트론은 HMCN2에서 유래한 것인, 조성물.
청구항 48 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
청구항 73에 있어서, 인트론은 링커 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입되는 것인, 조성물.
다음을 포함하는 염기 편집기 시스템:
(i) 데아미나아제 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(ii) 염기 편집기에서 세포 게놈의 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA; 및
(iii) 염기 편집기가 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하고, 여기서 편집은 코딩된 염기 편집기의 활성 및/또는 발현의 감소를 초래하는 것이다.
청구항 75에 있어서, 편집기는 데아미나아제 도메인의 촉매 잔기를 변경하는, 염기 편집기 시스템.
청구항 75 또는 76에 있어서, 데아미나아제 도메인은 아데노신 데아미나아제 도메인인 것인, 염기 편집기.
청구항 75 또는 76에 있어서, 데아미나아제 도메인은 사이티딘 데아미나아제 도메인인 것인, 염기 편집기.
청구항 77에 있어서, 데아미나아제 도메인의 변경된 촉매 잔기는 다음 참조 서열의 His57 (H57), Glu59 (E59), Cys87 (C87), 또는 Cys90 (C90)인 것인, 염기 편집기 시스템:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD (서열번호: 1), 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제의 상응하는 위치.
청구항 76 또는 79에 있어서, 변경된 촉매 잔기가 E59인 것인, 염기 편집기 시스템.
청구항 76 또는 79에 있어서, 촉매 잔기의 변경이 E59G인 것인, 염기 편집기 시스템.
청구항 76 또는 79에 있어서, 변경된 촉매 잔기가 H57인 것인, 염기 편집기 시스템.
청구항 76 또는 79에 있어서, 촉매 잔기의 변경이 H57R인 것인, 염기 편집기 시스템.
청구항 76 또는 79에 있어서, 변경된 촉매 잔기가 C87인 것인, 염기 편집기 시스템.
청구항 76 또는 79에 있어서, 촉매 잔기의 변경이 C87R인 것인, 염기 편집기 시스템.
청구항 76 또는 79에 있어서, 변경된 촉매 잔기가 C90인 것인, 염기 편집기 시스템.
청구항 76 또는 79에 있어서, 촉매 잔기의 변경이 C90R인 것인, 염기 편집기 시스템.
다음을 포함하는 염기 편집기 시스템:
(i) 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 포함하고;
(ii) 자기-불활성화 염기 편집기가 세포의 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA; 및
(iii) 자기-불활성화 염기 편집기가 자기-불활성화 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA.
다음을 포함하는 염기 편집기 시스템:
(i) 염기 편집기를 코딩하는 청구항 3 내지 47 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드;
(ii) 염기 편집기가 세포의 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA; 및
(iii) 염기 편집기가 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA.
다음을 포함하는 염기 편집기 시스템:
(i) 염기 편집기를 코딩하는 청구항 48 내지 74 중 어느 한 항의 조성물;
(ii) 염기 편집기가 세포의 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA; 및
(iii) 염기 편집기가 (i)의 조성물의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA.
다음을 포함하는 염기 편집기 시스템:
(i) 데아미나아제 도메인 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 여기서 napDNAbp 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N과 융합되고;
(ii) napDNAbp 도메인의 C-말단 단편을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 여기서 napDNAbp 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C와 융합되며,
여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하고, 여기서 인트론은 오픈 리딩 프레임에 삽입되며, 여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 염기 편집기를 코딩하고;
(iii) 염기 편집기가 세포의 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA; 및
(iv) 염기 편집기가 (i) 또는 (ii)의 조성물의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA.
다음을 포함하는 염기 편집기 시스템:
(i) 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 여기서 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N과 융합되고;
(ii) 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 여기서 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C와 융합되며;
여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하고, 여기서 인트론은 오픈 리딩 프레임에 삽입되며, 여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 염기 편집기를 코딩하고;
(iii) 염기 편집기가 세포의 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA; 및
(iv) 염기 편집기가 (i) 또는 (ii)의 조성물의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 하나 이상의 가이드 RNA.
청구항 75 내지 92 중 어느 한 항에 있어서, 염기 편집기 시스템은 다음에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 염기 편집기 시스템:
a) gGUUUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 191);
b) gUUUCUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 192);
c) gGUUUCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 193);
d) GCCACUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 194);
e) gACAUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 195);
f) gGAUCUCACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 196);
g) gUCCUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 197);
h) GUCACCUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 198);
i) GAUUUCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 190);
j) gGUGCUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 200);
k) gUCCACAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 201);
l) GAUACUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 202);
m) gUGUUUUAGCUGCGGCAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 203);
n) gUUUCUUACAGCCAUAAUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 204);
o) gCUCCACAGCUGCGGCAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 205);
p) GAUACUUACAGCCAUAAUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 206);
q) gUGUUUUAGGGACGAAAGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 207);
r) gUUACCUGGCUCUCUUAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 208 );
s) gCUCCACAGGGACGAAAGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 209);
t) gCUUGCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 210);
u) gAUUGCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 211);
v) gUCUCCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 212);
w) gUCUGCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 213);
x) gGACUCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 214);
y) GCACCCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 215);
z) gAAUUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 216);
aa) gCAUUAGGUCGAGAUCACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 217);
bb) gCCUUAGGUCGAGAUCACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 218);
cc) GUUUCAGGUCGAGAUCACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 219);
dd) gACAUUAGGCUAAGAGAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 220);
ee) gUCCUUAGGCUAAGAGAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 221);
ff) gGUUUCAGGCUAAGAGAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 222);
gg) gACAUUAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 223);
hh) gUCCUUAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 224);
ii) gGUUUCAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 225);
jj) gCACCAUGAGCGAGGUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 524);
kk) gGCCACCAUGAGCGAGGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 525);
ll) GUGUCGAAGUUCGCCCUGGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 526);
mm) gAUGCCGAGAUAAUGGCCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 527);
nn) gAUGCCGAGAUAAUGGCCCUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 528);
oo) gAUGCCGAGAUCAUGGCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 529);
pp) gAUGCCGAGAUCAUGGCACUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 530);
qq) gAUGCCGAGAUCAUGGCACUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 531);
rr) gAUGCCGAGAUCAUGGCGCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 532);
ss) gAUGCCGAGAUCAUGGCGCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 533);
tt) gAUGCCGAGAUCAUGGCGUUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 534);
uu) gAUGCCGAGAUUAUGGCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 535);
vv) gAUGCCGAGAUUAUGGCACUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 536);
ww) gAUGCCGAGAUUAUGGCACUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 537);
xx) gAUGCCGAGAUUAUGGCACUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 538);
yy) gAUGCCGAGAUUAUGGCGCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 539);
zz) gAUGCCGAGAUUAUGGCUCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 540);
aaa) gAUGCGGAGAUCAUGGCGCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 541);
bbb) gAUGCUGAGAUAAUGGCCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 542);
ccc) gAACCGCACAUGCCGAAAUUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 543);
ddd) gGCAGGUGUCGACAUAUCUAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 544);
eee) gAUGCCGAAAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 545);
fff) gACACAUGACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 546); 또는
ggg) gGCCCCAGCACACAUGACACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 547).
자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 포함하는 것인, 벡터.
청구항 1 내지 47 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 75 내지 93 중 어느 한 항의 염기 편집기 시스템을 포함하는 벡터.
청구항 48 내지 74 중 어느 한 항의 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
청구항 94 내지 96 중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터가 포유류 발현 벡터인 것인, 벡터.
청구항 94 내지 97 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 지질 나노입자인 것인, 벡터.
청구항 94 내지 98 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 및 헤르페스 바이러스 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 바이러스 벡터인 것인, 벡터.
청구항 99에 있어서, 벡터는 AAV 벡터인 것인, 벡터.
청구항 100에 있어서, AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV8인 것인, 벡터.
청구항 94 내지 101 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 프로모터를 포함하는, 벡터.
청구항 102에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터인, 벡터.
자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 포함하는 세포로서, 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 포함하는 것인, 세포.
청구항 1 내지 47 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 청구항 48 내지 74 중 어느 한 항의 조성물, 청구항 75 내지 93 중 어느 한 항의 염기 편집기 시스템, 또는 청구항 94 내지 103 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
청구항 104 또는 105에 있어서, 세포는 in vitro 또는 in vivo인 것인, 세포.
청구항 1 내지 47 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 청구항 75 내지 93 중 어느 한 항의 염기 편집기 시스템, 청구항 94 내지 103 중 어느 한 항의 벡터, 또는 청구항 104 내지 106 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 제약학적 조성물.
청구항 107에 있어서, 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 또는 담체를 추가로 포함하는, 제약학적 조성물.
청구항 1 내지 47 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 청구항 48 내지 74 중 어느 한 항의 조성물, 청구항 75 내지 93 중 어느 한 항의 염기 편집기 시스템, 청구항 94 내지 103 중 어느 한 항의 벡터, 또는 청구항 104 내지 106 중 어느 한 항의 세포, 청구항 107 또는 108의 제약학적 조성물을 포함하는 키트.
청구항 109에 있어서, 이를 사용하기 위한 지시서를 추가로 포함하는, 키트.
다음 단계를 포함하는 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소 또는 제거하는 방법:
(a) 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 여기서 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 포함하고; 및
(b) 폴리뉴클레오티드를 가이드 RNA 및 자기-불활성화 염기 편집기 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 여기서 가이드 RNA는 염기 편집기가 인트론의 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하여, 자기-불활성화 염기 편집기 발현이 감소 또는 제거되는 변경을 야기한다.
다음 단계를 포함하는 자기-불활성화 염기 편집 방법:
(a) 데아미나아제 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 발현시키는 단계;
(b) 세포를, 염기 편집기가 세포의 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 제1 가이드 RNA와 접촉시켜, 세포 게놈의 변경을 생성시키는 단계; 및
(c) 세포를, 염기 편집기가 염기 편집기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 접촉시키고, 여기서 편집은 코딩된 염기 편집기의 활성 및/또는 발현을 감소시켜, 염기 편집기의 발현을 감소 또는 제거하는 변경을 생성한다.
청구항 112에 있어서, 편집은 데아미나아제 도메인의 촉매 잔기를 변경하는, 방법.
청구항 112 또는 113에 있어서, 데아미나아제 도메인이 아데노신 데아미나아제 도메인인 것인, 방법.
청구항 112 또는 113에 있어서, 데아미나아제 도메인이 사이티딘 데아미나아제 도메인인 것인, 방법.
청구항 114에 있어서, 데아미나아제 도메인의 변경된 촉매 잔기는 다음 참조 서열의 His57 (H57), Glu59 (E59), Cys87 (C87), 또는 Cys90 (C90) 인 것인, 방법:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD (서열번호: 1), 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제의 상응하는 위치.
청구항 116에 있어서, 변경된 촉매 잔기가 변경된 촉매 잔기가 E59인 것인, 방법.
청구항 116에 있어서, 촉매 잔기의 변경이 E59G인 것인, 방법.
청구항 116에 있어서, 변경된 촉매 잔기가 H57인 것인, 방법.
청구항 116에 있어서, 촉매 잔기의 변경이 H57R인 것인, 방법.
청구항 116에 있어서, 변경된 촉매 잔기가 C87인 것인, 방법.
청구항 116에 있어서, 촉매 잔기의 변경이 C87R인 것인, 방법.
청구항 116에 있어서, 변경된 촉매 잔기가 C90인 것인, 방법.
청구항 116에 있어서, 촉매 잔기의 변경이 C90R인 것인, 방법.
다음을 포함하는 자기-불활성화 염기 편집 방법:
(a) 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 발현하는 단계, 여기서 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 포함하고;
(b) 자기-불활성화 염기 편집기가 세포의 게놈 부위를 편집하도록 지시하는 제1 가이드 RNA를 세포에 접촉시켜, 세포 게놈에 변화를 생성하는 단계; 및
(c) 자기-불활성화 염기 편집기가 (a)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA를 세포와 접촉시켜, 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소 또는 제거하는 단계.
다음 단계를 포함하는 유기체의 게놈 편집 방법:
(a) 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유기체의 세포에 발현시키고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 포함하는, 단계;
(b) 자기-불활성화 염기 편집기가 세포 게놈의 부위를 편집하도록 지시하는 제1 가이드 RNA와 세포를 접촉시켜, 세포 게놈 변경을 생성시키는 단계; 및
(c) 자기-불활성화 염기 편집기가 (a)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 세포를 접촉시켜, 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소 또는 제거하는 변경을 생성시키는 단계.
다음 단계를 포함하는 대상체를 치료하는 방법:
(a) 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 개체의 세포에 발현시키고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 자기-불활성화 염기 편집기 또는 이의 단편의 오픈 리딩 프레임에 삽입된 인트론을 포함하는, 단계;
(b) 자기-불활성화 염기 편집기가 세포 게놈의 부위를 편집하도록 지시하는 제1 가이드 RNA와 세포를 접촉시켜, 대상체를 치료하기 위해 세포 게놈의 변경을 생성하는 단계; 및
(c) 자기-불활성화 염기 편집기가 (a)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 세포를 접촉시켜, 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소 또는 제거하는 변경을 생성시키는 단계.
청구항 75 내지 93 중 어느 한 항의 염기 편집기 시스템, 청구항 94 내지 103 중 어느 한 항의 벡터, 청구항 104 내지 106 중 어느 한 항의 세포, 청구항 107 또는 108의 제약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하여, 대상체를 치료하는, 대상체를 치료하는 방법.
다음 단계를 포함하는 유기체 게놈 편집 방법:
(a) 데아미나아제 도메인을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인의 N-말단 단편, 및 napDNAbp 도메인의 C-말단 단편을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 유기체의 세포에 발현시키는 단계, 여기서 napDNAbp 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N과 융합되고, 여기서 napDNAbp 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C와 융합되며, 여기서 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하고, 여기서 인트론은 오픈 리딩 프레임에 삽입되며, 여기서 세포에서의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드의 발현은 자기-불활성화 염기 편집기의 형성을 초래하고;
(b) 세포를, 자기-불활성화 염기 편집기가 세포 게놈의 부위를 편집하도록 지시하는 제1 가이드 RNA와 접촉시켜, 세포 게놈의 변경을 생성하는 단계; 및
(c) 세포를, 자기-불활성화 염기 편집기가 (a)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 접촉시켜, 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소 또는 제거하는 변경을 생성하는 단계.
다음 단계를 포함하는 유기체 게놈 편집 방법:
(a) 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편 및 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 유기체 세포에 발현하는 단계로서, 여기서 데아미나아제 도메인의 N-말단 단편은 스플릿된 인테인-N과 융합되고, 여기서 데아미나아제 도메인의 C-말단 단편은 스플릿된 인테인-C와 융합되며, 여기서 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하고, 여기서 인트론은 오픈 리딩 프레임에 삽입되며, 여기서 세포에서의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드의 발현은 자기-불활성화 염기 편집기의 형성을 초래하는, 단계;
(b) 세포를, 자기-불활성화 염기 편집기가 세포 게놈의 부위를 편집하도록 지시하는 제1 가이드 RNA와 접촉시켜, 세포 게놈 변경을 생성하는 단계; 및
(c) 세포를, 자기-불활성화 염기 편집기가 (a)의 폴리뉴클레오티드의 인트론에 존재하는 스플라이스 수용체 또는 스플라이스 공여체 부위를 편집하도록 지시하는 제2 가이드 RNA와 접촉시켜, 자기-불활성화 염기 편집기의 발현을 감소 또는 제거하는 변경을 생성하는 단계.
청구항 111 내지 130 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 in vivo에서 수행되는 것인, 방법.
청구항 129 내지 130 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드는 벡터에 의해 세포에 발현되는 것인, 방법.
청구항 129 내지 130 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 별도의 벡터에 의해 세포에서 발현되는 것인, 방법.
청구항 112 내지 133 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가이드 RNA 및/또는 제2 가이드 RNA가 벡터에 의해 세포로 전달되는 것인, 방법.
청구항 112 내지 133 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가이드 RNA 및/또는 제2 가이드 RNA가 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드와 동일한 벡터로 세포에 전달되는 것인, 방법.
청구항 129 내지 135 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가이드 RNA 및/또는 제2 가이드 RNA가 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드와 다른 벡터로 세포에 전달되는 것인, 방법.
청구항 132 내지 136 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 지질 나노입자인 것인, 방법.
청구항 132 내지 137 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터인 것인, 방법.
청구항 138에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터인 것인, 방법.
청구항 139에 있어서, AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV8인 것인, 방법.
청구항 129 내지 140 중 어느 한 항에 있어서, napDNAbp 도메인은 Cas9 도메인인 것인, 방법.
청구항 141에 있어서, Cas9 도메인의 N- 및 C-말단 도메인이 아미노산 잔기 Asn309 및 Thr310 사이에서 스플릿되는 것인, 방법.
청구항 141 또는 142에 있어서, Cas9 도메인은 Thr310Cys 돌연변이를 포함하는, 방법.
청구항 111 내지 143 중 어느 한 항에 있어서, 염기 편집기는 핵산 프로그래밍 가능한 DNA 결합 단백질(napDNAbp) 도메인 및 데아미나아제 도메인을 포함하는, 방법.
청구항 144에 있어서, 인트론을 포함하는 오픈 리딩 프레임은 napDNAbp 도메인 또는 데아미나아제 도메인인 것인, 방법.
청구항 11 또는 125 내지 145 중 어느 한 항에 있어서, 자기-불활성화 염기 편집기 폴리펩티드는 게놈 DNA의 높은 편집 효율을 유지하는, 방법.
청구항 83, 84, 112 내지 124, 또는 129 내지 146 중 어느 한 항에 있어서, 데아미나아제 도메인은 사이티딘 데아미나아제 도메인 또는 아데노신 데아미나아제 도메인인 것인, 방법.
청구항 144 또는 145에 있어서, napDNAbp 도메인은 Cas9, Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, 및 Cas12j/CasΦ도메인으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 Cas 도메인인 것인, 방법.
청구항 111, 125 내지 127 또는 129 내지 148 중 어느 한 항에 있어서, 변경은 인트론의 5'말단에 있는 공통 스플라이스 공여체 부위 또는 인트론의 3'말단에 있는 공통 스플라이스 수용체 서열에 있는 것인, 방법.
청구항 111, 125 내지 127 또는 129 내지 149 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 약 10 염기쌍 내지 약 500 염기쌍 사이를 포함하는, 방법.
청구항 150에 있어서, 인트론은 약 70 염기쌍 내지 150 염기쌍 사이를 포함하는, 방법.
청구항 150에 있어서, 인트론은 약 100 염기쌍 내지 200 염기쌍 사이를 포함하는, 방법.
청구항 111, 125 내지 127, 또는 129 내지 152 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 프로토스페이서(protospacer) 서열에 근접하게 삽입되는 것인, 방법.
청구항 153에 있어서, 인트론은 프로토스페이서 서열의 약 10 내지 30 염기쌍 내에 삽인되는 것인, 방법.
청구항 153 또는 154에 있어서, 프로토스페이서 서열은 NGG 또는 NNGRRT인 것인, 방법.
청구항 147에 있어서, 아데노신 데아미나아제 도메인은 TadA 도메인을 포함하는, 방법.
청구항 156에 있어서, 인트론은 TadA의 코돈 18, 23, 59, 62, 87 또는 129의 내부 또는 바로 뒤에 삽입되는 것인, 방법.
청구항 157에 있어서, 인트론은 TadA의 코돈 87의 바로 뒤에 삽입되는 것인, 방법.
청구항 111 내지 127 또는 129 내지 158 중 어느 한 항에 있어서, 변경은 단일-염기 편집인 것인, 방법.
청구항 159에 있어서, 단일-염기 편집은 A 에서 G로의 염기 편집인 것인, 방법.
청구항 159에 있어서, 단일-염기 편집은 C에서 T로의 염기 편집인 것인, 방법.
청구항 111, 125 내지 127 또는 129 내지 161 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 NF1, PAX2, EEF1A1, HBB, IGHG1, SLC50A1, ABCB11, BRSK2, PLXNB3, TMPRSS6, IL32, ANTXRL, PKHD1L1, PADI1, KRT6C, 및 HMCN2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열로부터 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 NF1에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 PAX2에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 EEF1A1에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 HBB 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 IGHG1 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 SLC50A1 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 ABCB11 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 BRSK2 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 PLXNB3 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 TMPRSS6 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 IL32 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 PKHD1L1 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 PADI1 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 KRT6C 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 162에 있어서, 인트론은 HMCN2 에서 유래한 것인, 방법.
청구항 111, 125 내지 127 또는 129 내지 161 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 포유류 유전자에 자연적으로 존재하는 인트론 대비 적어도 약 85% 핵산 서열 상동성을 갖는 것인, 방법.
청구항 111, 125 내지 127 또는 129 내지 161 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 비-포유류 유전자에 자연적으로 존재하는 인트론 대비 적어도 약 85% 핵산 서열 상동성을 갖는 것인, 방법.
청구항 111, 125 내지 127 또는 129 내지 161 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 합성 인트론인 것인, 방법.
청구항 111, 125 내지 127 또는 129 내지 161 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 다음 중 어느 하나 대비 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99% 핵산 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 방법:
a) GTGAGATCAAATGAAAGTTTCATATAGAAATACAAAACCTAGAGAACTGGCATGTAAGAGAAGCAAAAATTACTTCAGCAAGGCCATGTTAGTAAATTTGCATCTGTTTGTCCACATTAG (서열번호: 226);
b) GTAGGTGACAATGCTGCAGCTGCCTAATCTAGGTGGGGGGAACTAAATTGTGGGTGAGCTGCTGAATGGTCTGTAGTCTGAGGCTGGGGTGGGGGGAGACACAACGTCCCCTCCCTGCAAACCACTGCTATTCTGTCCCTCTCTCTCCTTAG (서열번호: 227);
c) GTAAGTGGCTTTCAAGACCATTGTTAAAAAGCTCTGGGAATGGCGATTTCATGCTTACATAAATTGGCATGCTTGTGTTTCAG (서열번호: 228);
d) GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCTAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (서열번호: 229);
e) GTAAGCACAACTGGGATGGGGTGACAGGGGTGCAAGATTGAAAACTGGCTCCTCTCCTCATAGCAGTTCTTGTGATTTCAG (서열번호: 230);
f) GTAAGAAATGTTATTTTTCAGTAAGTGATTTAGTTATTTTTCCTTTTTTCTCATTAAAATTTCTCTAACATCTCCCTCTTCATGTTTTAG (서열번호: 231);
g) GTGAGACCCTAGCCCCCTCAACCCTGCCCTGGCCTCTCCCCAAACCTGCCCCCCCACGCTGACCCCCACACCCGGCCGCCCGCAG (서열번호: 232);
h) GTGGGTGTCAGAGGCATCGGGGCTGCGGGGTAGGGGGCTGCCCCACCCCTAACGAAGTCTGCTCCTCCAG (서열번호: 233);
i) GCAGGGAAGTCCTGCTTCCGTGCCCCACCGGTGCTCAGCTGAGGCTCCCTTGAAAATGCGAGGCTGTTTCCAACTTTGGTCTGTTTCCCTGGCAG (서열번호: 234);
j) GTGGGGAGTTGGGGTCCCCGAAGGTGAGGACCCTCTGGGGATGAGGGTGCTTCTCTGAGACACTTTCTTTTCCTCACACCTGTTCCTCGCCAGCAG (서열번호: 235);
k) GTATAGACCCCTTGATCTCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCTACAAAATCTTAGAGCATCAGTGGGAGCATCTCACTGTCCAGGCTCAATATTTCTTCATTTTCTTGCAG (서열번호: 236);
l) GTAATTATGATTAAAGATGGTGATTGTTTATTTTCTTTTATGATTGTCCTTAGTATTATGTAACCTGCAAATTCTATTGCAG (서열번호: 237);
m) GTGAGTGACACAAGGTGTTGTCTGGGGAGTGGGGAAGGGGGATGGAAGTGAATCCTGTTGGTGGGGTGGAGAAAGGGCGATCTCAAGAGGGCCACTCTCTCCAG (서열번호: 238);
n) GTAAGCATCTCCACCATCCTTCTGTTTACTCTGATGGGGTCTGCAAAGGGGAGATGATGTATAGGGTTGGGTATCTCTGTAAATGTCAGATGTGAAGTTGATCTTATGACCTTCTGTTCTGCAG (서열번호: 239);
o) GTGAGGGTCTCCCAGGCTGGGCAGGGGGAGGGGGCTGCTGCCTTGATTGCGTCCCAGGACACAGCCCTCCTCCAGCCTGCCCTCGCCTTGCTCATCCCCTCCCCATCTCAGCCCCACCCCCACTAACTCTCTCTCTGCTCTGACTCAG (서열번호: 240);
p) GTAATGATTGATTGCAATGTATGATTACAATAATCTCAGTATAAGTTCAGTAATAATAACCTTCCACTGCTGTCCTCTGTGTGCACCCAG (서열번호: 241); 또는
q) GTAAATATATACAACAGTTTTTCATTTAAATAAGTGCACGGCACAAATAAGAAAAATATGTCAAAAATGTAACCAATAGTTTTTTTCAAATTTAG (서열번호: 242).
청구항 111, 125 내지 127 또는 129 내지 161 중 어느 한 항에 있어서, 인트론은 다음 중 하나로부터의 핵산 서열을 포함하는 방법:
a) GTGAGATCAAATGAAAGTTTCATATAGAAATACAAAACCTAGAGAACTGGCATGTAAGAGAAGCAAAAATTACTTCAGCAAGGCCATGTTAGTAAATTTGCATCTGTTTGTCCACATTAG (서열번호: 226);
b) GTAGGTGACAATGCTGCAGCTGCCTAATCTAGGTGGGGGGAACTAAATTGTGGGTGAGCTGCTGAATGGTCTGTAGTCTGAGGCTGGGGTGGGGGGAGACACAACGTCCCCTCCCTGCAAACCACTGCTATTCTGTCCCTCTCTCTCCTTAG (서열번호: 227);
c) GTAAGTGGCTTTCAAGACCATTGTTAAAAAGCTCTGGGAATGGCGATTTCATGCTTACATAAATTGGCATGCTTGTGTTTCAG (서열번호: 228);
d) GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCTAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (서열번호: 229);
e) GTAAGCACAACTGGGATGGGGTGACAGGGGTGCAAGATTGAAAACTGGCTCCTCTCCTCATAGCAGTTCTTGTGATTTCAG (서열번호: 230);
f) GTAAGAAATGTTATTTTTCAGTAAGTGATTTAGTTATTTTTCCTTTTTTCTCATTAAAATTTCTCTAACATCTCCCTCTTCATGTTTTAG (서열번호: 231);
g) GTGAGACCCTAGCCCCCTCAACCCTGCCCTGGCCTCTCCCCAAACCTGCCCCCCCACGCTGACCCCCACACCCGGCCGCCCGCAG (서열번호: 232);
h) GTGGGTGTCAGAGGCATCGGGGCTGCGGGGTAGGGGGCTGCCCCACCCCTAACGAAGTCTGCTCCTCCAG (서열번호: 233);
i) GCAGGGAAGTCCTGCTTCCGTGCCCCACCGGTGCTCAGCTGAGGCTCCCTTGAAAATGCGAGGCTGTTTCCAACTTTGGTCTGTTTCCCTGGCAG (서열번호: 234);
j) GTGGGGAGTTGGGGTCCCCGAAGGTGAGGACCCTCTGGGGATGAGGGTGCTTCTCTGAGACACTTTCTTTTCCTCACACCTGTTCCTCGCCAGCAG (서열번호: 235);
k) GTATAGACCCCTTGATCTCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCTACAAAATCTTAGAGCATCAGTGGGAGCATCTCACTGTCCAGGCTCAATATTTCTTCATTTTCTTGCAG (서열번호: 236);
l) GTAATTATGATTAAAGATGGTGATTGTTTATTTTCTTTTATGATTGTCCTTAGTATTATGTAACCTGCAAATTCTATTGCAG (서열번호: 237);
m) GTGAGTGACACAAGGTGTTGTCTGGGGAGTGGGGAAGGGGGATGGAAGTGAATCCTGTTGGTGGGGTGGAGAAAGGGCGATCTCAAGAGGGCCACTCTCTCCAG (서열번호: 238);
n) GTAAGCATCTCCACCATCCTTCTGTTTACTCTGATGGGGTCTGCAAAGGGGAGATGATGTATAGGGTTGGGTATCTCTGTAAATGTCAGATGTGAAGTTGATCTTATGACCTTCTGTTCTGCAG (서열번호: 239);
o) GTGAGGGTCTCCCAGGCTGGGCAGGGGGAGGGGGCTGCTGCCTTGATTGCGTCCCAGGACACAGCCCTCCTCCAGCCTGCCCTCGCCTTGCTCATCCCCTCCCCATCTCAGCCCCACCCCCACTAACTCTCTCTCTGCTCTGACTCAG (서열번호: 240);
p) GTAATGATTGATTGCAATGTATGATTACAATAATCTCAGTATAAGTTCAGTAATAATAACCTTCCACTGCTGTCCTCTGTGTGCACCCAG (서열번호: 241); 또는
q) GTAAATATATACAACAGTTTTTCATTTAAATAAGTGCACGGCACAAATAAGAAAAATATGTCAAAAATGTAACCAATAGTTTTTTTCAAATTTAG (서열번호: 242).
청구항 112 내지 182 중 어느 한 항에 있어서, 제2 가이드 RNA는 다음으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법:
a) gGUUUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 191);
b) gUUUCUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 192);
c) gGUUUCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 193);
d) GCCACUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 194);
e) gACAUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 195);
f) gGAUCUCACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 196);
g) gUCCUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 197);
h) GUCACCUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 198);
i) GAUUUCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 190);
j) gGUGCUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 200);
k) gUCCACAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 201);
l) GAUACUUACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 202);
m) gUGUUUUAGCUGCGGCAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 203);
n) gUUUCUUACAGCCAUAAUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 204);
o) gCUCCACAGCUGCGGCAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 205);
p) GAUACUUACAGCCAUAAUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 206);
q) gUGUUUUAGGGACGAAAGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 207);
r) gUUACCUGGCUCUCUUAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 208 );
s) gCUCCACAGGGACGAAAGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 209);
t) gCUUGCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 210);
u) gAUUGCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 211);
v) gUCUCCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 212);
w) gUCUGCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 213);
x) gGACUCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 214);
y) GCACCCAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 215);
z) gAAUUUAGGUCAUGUGUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 216);
aa) gCAUUAGGUCGAGAUCACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 217);
bb) gCCUUAGGUCGAGAUCACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 218);
cc) GUUUCAGGUCGAGAUCACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 219);
dd) gACAUUAGGCUAAGAGAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 220);
ee) gUCCUUAGGCUAAGAGAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 221);
ff) gGUUUCAGGCUAAGAGAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 222);
gg) gACAUUAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 223);
hh) gUCCUUAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 224);
ii) gGUUUCAGAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 225);
jj) gCACCAUGAGCGAGGUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 524);
kk) gGCCACCAUGAGCGAGGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 525);
ll) GUGUCGAAGUUCGCCCUGGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 526);
mm) gAUGCCGAGAUAAUGGCCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 527);
nn) gAUGCCGAGAUAAUGGCCCUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 528);
oo) gAUGCCGAGAUCAUGGCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 529);
pp) gAUGCCGAGAUCAUGGCACUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 530);
qq) gAUGCCGAGAUCAUGGCACUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 531);
rr) gAUGCCGAGAUCAUGGCGCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 532);
ss) gAUGCCGAGAUCAUGGCGCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 533);
tt) gAUGCCGAGAUCAUGGCGUUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 534);
uu) gAUGCCGAGAUUAUGGCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 535);
vv) gAUGCCGAGAUUAUGGCACUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 536);
ww) gAUGCCGAGAUUAUGGCACUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 537);
xx) gAUGCCGAGAUUAUGGCACUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 538);
yy) gAUGCCGAGAUUAUGGCGCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 539);
zz) gAUGCCGAGAUUAUGGCUCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 540);
aaa) gAUGCGGAGAUCAUGGCGCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 541);
bbb) gAUGCUGAGAUAAUGGCCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 542);
ccc) gAACCGCACAUGCCGAAAUUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 543);
ddd) gGCAGGUGUCGACAUAUCUAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 544);
eee) gAUGCCGAAAUUAUGGCUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 545);
fff) gACACAUGACACAGGGCUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 546); 또는
ggg) gGCCCCAGCACACAUGACACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열번호: 547).
청구항 111 내지 127 또는 129 내지 183 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 방법.
청구항 184에 있어서, 인트론은 링커 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입되는 것인, 방법.
청구항 126 내지 130 중 어느 한 항에 있어서, 개체 또는 유기체가 인간인 것인, 방법.
청구항 186에 있어서, 개체 또는 유기체는 포유류인 것인, 방법.
청구항 187에 있어서, 포유류는 인간인 것인, 방법.