CN117561074A - 腺苷脱氨酶变体及其用途 - Google Patents

腺苷脱氨酶变体及其用途 Download PDF

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妮可·古德利
李胜柱
帕特里夏·罗莎·费利西亚诺
迪特尔·嘉扬·林
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Abstract

本发明提供了能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和/或胞嘧啶脱氨的腺苷脱氨酶变体。本公开还提供了包含具有腺嘌呤和胞嘧啶脱氨酶活性和/或胞嘧啶脱氨酶特异性的腺苷脱氨酶变体的多分子复合物、融合蛋白、碱基编辑器和碱基编辑器系统及其使用方法。

Description

腺苷脱氨酶变体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月3日提交的美国临时申请号63/229,057和2021年3月26日提交的美国临时申请号63/166,778的优先权，所述临时申请的全部内容以引用方式整体特此并入。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交并且以引用方式整体特此并入。所述ASCII拷贝于2022年3月25日创建，名为180802-048002PCT_SL并且大小为2,073,042字节。
背景技术
脱氨酶(诸如腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶)已在可用于靶向编辑核酸序列的系统和组合物中使用。例如，基因组DNA的靶向切割和/或靶向修饰是一种极具前景的基因功能研究的方法，并且也有可能为人类遗传疾病提供新的疗法。目前可用的碱基编辑器和碱基编辑器系统利用将靶C·G碱基对转化为T·A的胞苷脱氨酶和/或将A·T碱基对转化为G·C的腺苷脱氨酶。先前已描述的示例性碱基编辑器包括胞苷碱基编辑器(例如，BE4)、腺嘌呤碱基编辑器(例如，ABE7.10)以及包括腺嘌呤脱氨酶和胞苷脱氨酶的碱基编辑器。本领域需要能够以更高的多样性、特异性和效率在靶序列内诱导修饰的改进的碱基编辑器。
发明内容
如下所述，本发明的特征在于能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和/或胞嘧啶脱氨的腺苷脱氨酶变体和能够主要使靶多核苷酸中的胞嘧啶脱氨的腺苷脱氨酶变体。例如，本公开的方面提供了相对于参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20或TadA*8.19)具有增加的胞嘧啶脱氨酶活性和/或胞嘧啶脱氨酶特异性(例如，增加约10倍、30倍、50倍、70倍或更多倍)的腺苷脱氨酶变体。在实施方案中，腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20、TadA*8.19或表1A至1F中所列的任何变体(例如，1.2、1.4、1.6、1.12、1.14、1.17或1.19))的腺苷脱氨酶活性水平(例如，活性的至少约30％、40％、50％、60％、70％或更多)。
本发明的方面涉及新型工程化脱氨酶，以及包含所述脱氨酶的方法和组合物，所述脱氨酶已经由蛋白质工程化(例如，定向进化、结构导向的组合筛选和突变导向的组合筛选)的多次迭代来生成。例如，能够使DNA中的腺嘌呤脱氨的腺苷脱氨酶(例如，ABE8 TadA*)由作用于ssDNA的腺嘌呤脱氨酶工程化为可以使腺嘌呤和胞嘧啶两者脱氨的脱氨酶(例如，在核酸分子的情况下)。进一步的工程化努力成功地改变了腺苷脱氨酶的特异性，使得其能够使胞嘧啶(例如，在DNA中)脱氨，而不具有显著的腺苷脱氨酶活性。此类连续几轮的定向进化、晶体结构导向的组合筛选和突变导向的组合筛选已经产生了至少两类源自TadA*的新碱基编辑器：(1)胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器(CABE)，其可以在同一编辑窗口内进行腺嘌呤到鸟嘌呤(A到G)和胞嘧啶到胸腺嘧啶(C到T)的碱基编辑，以及(2)源自TadA*的胞嘧啶碱基编辑器(CBE-T)，其主要具有胞苷脱氨酶活性(例如，几乎没有或没有可检测的腺苷脱氨酶活性)。
本文提供的工程化脱氨酶比现有脱氨酶具有优势。例如，当在碱基编辑器的情况下使用此类脱氨酶时，它们会改善脱靶概况(CBE-T/TadC相对于BE4 rAPOBEC具有更低的指导物非依赖性脱靶)，并且可以具有更精确的编辑窗口(CBE-T/TadC相对于BE4rAPOBEC具有更集中的编辑窗口，并且等位基因分布数据支持这一点)。此外，关于中靶编辑，本文提供的数据显示CBE-T的活性可以至少与BE4一样或更大。
在一方面，本公开的发明特征在于一种腺苷脱氨酶变体，其相对于参考腺苷脱氨酶具有增加的胞苷脱氨酶活性和/或增加的胞苷脱氨酶特异性。腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶含有两个或更多个氨基酸改变。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种腺苷脱氨酶变体，其相对于参考腺苷脱氨酶具有增加的胞苷脱氨酶活性和/或增加的胞苷脱氨酶特异性。腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶包含有包含氨基酸残基82-84的A区、包含氨基酸残基27-30和47-49的B区、包含残基107-115的C区中的一个或多个或包含残基139-167的C端螺旋中的改变：
在另一方面，本公开的发明特征在于一种腺苷脱氨酶变体，其含有与以下序列具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列中的一个或多个改变：
腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有增加的胞苷脱氨酶活性和/或增加的胞苷脱氨酶特异性。一个或多个改变不含有SEQ ID NO:1的位置48处的R氨基酸或另一腺苷脱氨酶中的相应改变。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种腺苷脱氨酶变体，其含有选自与以下序列具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列的2、4、6、13、27、29、100、112、114、115、162和165中的一个或多个的氨基酸位置处或另一腺苷脱氨酶中的相应位置处的一个或多个改变：
在另一方面，本公开的发明特征在于一种腺苷脱氨酶变体，其含有选自以下的一个或多个氨基酸改变：与以下序列具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列的S2H、V4K、V4S、V4T、V4Y、F6G、F6H、F6Y、H8Q、R13G、T17A、T17W、R23Q、E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q、E27S、E27G、P29A、P29G、P29K、V30F、V30I、R47G、R47S、A48G、I49K、I49M、I49N、I49Q、I49T、G67W、I76H、I76R、I76W、Y76H、Y76R、Y76W、F84A、F84M、H96N、G100A、G100K、T111H、G112H、A114C、G115M、M118L、H122G、H122R、H122T、N127I、N127K、N127P、A142E、R147H、A158V、Q159S、A162C、A162N、A162Q和S165P中的一个或多个：
或另一脱氨酶中的相应改变。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种腺苷脱氨酶变体，其含有选自以下中的一个或多个的氨基酸改变组合：E27H、Y76I和F84M；E27H、I49K和Y76I；E27S、I49K、Y76I和A162N；E27K和D119N；E27H和Y76I；E27S、I49K和G67W；E27S、I49K和Y76I；I49T、G67W和H96N；E27C、Y76I和D119N；R13G、E27Q和N127K；T17A、E27H、I49M、Y76I和M118L；I49Q、Y76I和G115M；S2H、I49K、Y76I和G112H；R47S和R107C；H8Q、I49Q和Y76I；T17A、A48G、S82T和A142E；E27G和I49N；E27G、D77G和S165P；E27S、I49K和S82T；E27S、I49K、S82T和G115M；E27S、V30I、I49K和S82T；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G112H和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L和R107C；E27S、I49K、S82T、F84L和G112H；E27S、I49K、S82T、F84L和G115M；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；E27S、P29G、I49K和S82T；E27S、P29G、I49K、S82T和G115M；E27S、P29G、I49K、S82T和A142E；P29G、I49K和S82T；E27G、I49K和S82T；E27G、I49K、S82T、R107C和A142E；V4K、E27H、I49K、Y76I和A114C；V4K、E27H、I49K、Y76I和D77G；F6Y、E27H、I49K、Y76I、G100A和H122R；V4T、E27H、I49K、Y76R和H122G；F6Y、E27H、I49K和Y76W；F6Y、E27H、I49K、Y76I和D119N；F6Y、E27H、I49K、Y76I和A114C；F6Y、E27H、I49K和Y76I；V4K、E27H、I49K、Y76W和H122T；F6G、E27H、I49K、Y76R和G100K；F6H、E27H、I49K、Y76I和H122N；E27H、I49K、Y76I和A114C；F6Y、E27H、I49K、Y76H、H122R和T166I；E27H、I49K、Y76I和N127P；R23Q、E27H、I49K和Y76R；E27H、I49K、Y76H、H122R和A158V；F6Y、E27H、I49K、Y76I和T111H；E27H、I49K、Y76I和R147H；E27H、I49K、Y76I和A143E；F6Y、E27H、I49K和Y76R；T17W、E27H、I49K、Y76H、H122G和A158V；V4S、E27H、I49K、A143E和Q159S；E27H、I49K、Y76I、N127I和A162Q；T17A、E27H和A48G；T17A、E27K和A48G；T17A、E27S和A48G；T17A、E27S、A48G和I49K；T17A、E27G和A48G；T17A、A48G和I49N；T17A、E27G、A48G和I49N；T17A、E27Q和A48G；E27S、I49K、S82T和R107C；E27S、I49K、S82T和G112H；E27S、I49K、S82T和A142E；E27S、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和R107C；E27S、V30I、I49K、S82T和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K和S82T；E27S、V30L、I49K、S82T和R107C；E27S、V30L、I49K、S82T和G112H；E27S、V30L、I49K、S82T和G115M；E27S、V30L、I49K、S82T和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T和F84A；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和R107C；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G112H；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G115M；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G112H；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G115M；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T和F84L；E27S、I49K、S82T、F84L和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T和R107C；E27S、P29G、I49K、S82T和G112H；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29G、I49K、S82T和R107C；P29G、I49K、S82T和G112H；P29G、I49K、S82T和G115M；P29G、I49K、S82T和A142E；P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K和S82T；P29K、I49K、S82T和R107C；P29K、I49K、S82T和G112H；P29K、I49K、S82T和G115M；P29K、I49K、S82T和A142E；P29K、I49K、S82T、R107C和G112H；P29K、I49K、S82T、R107C和G115M；P29K、I49K、S82T、R107C和A142E；P29K、I49K、S82T、G112H和A142E；P29K、I49K、S82T、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K和S82T；P29K、V30I、I49K、S82T和R107C；P29K、V30I、I49K、S82T和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T和F84L；P29K、I49K、S82T、F84L和R107C；P29K、I49K、S82T、F84L和G112H；P29K、I49K、S82T、F84L和G115M；P29K、I49K、S82T、F84L和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T和F84L；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27G、I49K、S82T和R107C；E27G、I49K、S82T和G112H；E27G、I49K、S82T和G115M；E27G、I49K、S82T和A142E；E27G、I49K、S82T、R107C和G112H；E27G、I49K、S82T、R107C和G115M；E27G、I49K、S82T、G112H和A142E；E27G、I49K、S82T、G115M和A142E；E27G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27H、I49K和S82T；E27H、I49K、S82T和R107C；E27H、I49K、S82T和G112H；E27H、I49K、S82T和G115M；E27H、I49K、S82T和A142E；E27H、I49K、S82T、R107C和G112H；E27H、I49K、S82T、R107C和G115M；E27H、I49K、S82T、R107C和A142E；E27H、I49K、S82T、G112H和A142E；E27H、I49K、S82T、G115M和A142E；E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S和S82T；E27S、S82T和R107C；E27S、S82T和G112H；E27S、S82T和G115M；E27S、S82T和A142E；E27S、S82T、R107C和G112H；E27S、S82T、R107C和G115M；E27S、S82T、R107C和A142E；E27S、S82T、G112H和A142E；E27S、S82T、G115M和A142E；E27S、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A和S82T；P29A、S82T和R107C；P29A、S82T和G112H；P29A、S82T和G115M；P29A、S82T和A142E；P29A、S82T、R107C和G112H；P29A、S82T、R107C和G115M；P29A、S82T、R107C和A142E；P29A、S82T、G112H和A142E；P29A、S82T、G115M和A142E；P29A、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I和S82T；E27S、V30I、S82T和R107C；E27S、V30I、S82T和G112H；E27S、V30I、S82T和G115M；E27S、V30I、S82T和A142E；E27S、V30I、S82T、R107C和G112H；E27S、V30I、S82T、R107C和G115M；E27S、V30I、S82T、R107C和A142E；E27S、V30I、S82T、G112H和A142E；E27S、V30I、S82T、G115M和A142E；E27S、V30I、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T和F84L；P29A、V30I、S82T、F84L和R107C；P29A、V30I、S82T、F84L和G112H；P29A、V30I、S82T、F84L和G115M；P29A、V30I、S82T、F84L和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G112H；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G115M；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、G112H和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、P29A、V30L、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；V4K和A114C；V4K和D77G；F6Y、G100A和H122R；V4T、I76R和H122G；F6Y和I76W；F6Y和D119N；F6Y和A114C；V4K、I76W和H122T；F6G、I76R和G100K；F6H和H122N；F6Y、I76H、H122R和T166I；R23Q和I76R；I76H、H122R和A158V；F6Y和T111H；T111H、H122G和A162C；F6Y和I76R；T17W、I76H、H122G和A158V；V4S、I76Y、A143E和Q159S；N127I和A162Q；E27H、Y76I、F84M和F149Y；E27H、I49K、Y76I和F149Y；T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L和F149Y；T17A、A48G、S82T、A142E和F149Y；E27G和F149Y；E27G、I49N和F149Y；E27H、Y76I、F84M、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27H、I49K、Y76I、Y147D、F149Y、T166I、D167N；T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L、Y147D、F149Y、T166I和D167N；T17A、A48G、S82T、A142E、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27G、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27G、I49N、Y147D、F149Y、T166I和D167N；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；以及F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；以上改变属于与以下序列具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列：
或另一腺苷脱氨酶中的相应改变组合。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种融合蛋白，其含有多核苷酸可编程DNA结合结构域和如上述任一方面或其实施方案所述的腺苷脱氨酶变体。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种多分子复合物，其含有多核苷酸可编程DNA结合结构域、如上述任一方面或其实施方案所述的腺苷脱氨酶变体和指导RNA的。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种碱基编辑器系统，其含有如上述任一方面或其实施方案所述的腺苷脱氨酶变体、多核苷酸可编程DNA结合结构域和一种或多种指导多核苷酸。碱基编辑器系统实现靶多核苷酸中的A到G和C到T编辑。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种碱基编辑器系统，其含有如上述任一方面或其实施方案所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸。碱基编辑器系统实现靶多核苷酸中的A到G和C到T编辑。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种多核苷酸，其编码如上述任一方面或其实施方案所述的腺苷脱氨酶变体、如上述任一方面或其实施方案所述的融合蛋白、如上述任一方面或其实施方案所述的多分子复合物或如上述任一方面或其实施方案所述的碱基编辑器系统。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种细胞，其含有如上述任一方面或其实施方案所述的载体。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种载体，其含有如上述任一方面或其实施方案所述的多核苷酸。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种组合物，其含有如上述任一方面或其实施方案所述的腺苷脱氨酶变体、如上述任一方面或其实施方案所述的融合蛋白、如上述任一方面或其实施方案所述的多分子复合物、如上述任一方面或其实施方案所述的碱基编辑器系统、如上述任一方面或其实施方案所述的多核苷酸、如上述任一方面或其实施方案所述的载体或如上述任一方面或其实施方案所述的细胞。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种编辑细胞基因组的方法。所述方法包括使细胞中的靶多核苷酸序列与如上述任一方面或其实施方案所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸接触，并在所述细胞基因组中生成一个或多个改变，从而编辑所述细胞基因组。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种编辑细胞基因组的方法。所述方法包括使生物体的细胞中的靶多核苷酸序列与如上述任一方面或其实施方案所述的多分子复合物或如上述任一方面或其实施方案所述的碱基编辑器系统接触，并在所述细胞基因组中生成一个或多个改变，从而编辑所述细胞基因组。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种治疗受试者的遗传疾病或病症的方法。所述方法包括使所述受试者的细胞中的靶多核苷酸与如上述任一方面或其实施方案所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸接触，并在所述细胞基因组中生成一个或多个改变，从而治疗所述受试者的遗传疾病或病症。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种治疗受试者的遗传疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者的细胞施用如上述任一方面或其实施方案所述的多分子复合物、如上述任一方面或其实施方案所述的碱基编辑器系统、如上述任一方面或其实施方案所述的载体、如上述任一方面或其实施方案所述的细胞或如上述任一方面或其实施方案所述的组合物，并在所述细胞基因组中生成一个或多个改变，从而治疗所述受试者的遗传疾病或病症。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种用于在靶多核苷酸中将C编辑为T的方法。所述方法包括使靶多核苷酸与如上述任一方面或其实施方案所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸接触，从而编辑所述靶多核苷酸。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种用于在靶多核苷酸中将C编辑为T的方法。所述方法包括使靶多核苷酸序列与如上述任一方面或其实施方案所述的多分子复合物或如上述任一方面或其实施方案所述的碱基编辑器系统接触，从而编辑所述靶多核苷酸。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种用于将A到G和/或C到T编辑引入到细胞基因组中的方法。所述方法包括将如上述任一方面或其实施方案所述的融合蛋白和在所述细胞基因组中实现A到G编辑、C到T编辑或其组合的指导多核苷酸引入到细胞中。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种用于将A到G和/或C到T编辑引入到细胞基因组中的方法。所述方法包括将如上述任一方面或其实施方案所述的多分子复合物或如上述任一方面或其实施方案所述的碱基编辑器系统引入到细胞中，以在所述细胞基因组中实现A到G编辑、C到T编辑或其组合。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种用于在多核苷酸中校正单核苷酸多态性(SNP)的方法。所述方法包括使靶多核苷酸与如上述任一方面或其实施方案所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸接触，从而通过使所述SNP或其互补核碱基脱氨来编辑所述SNP。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种用于在多核苷酸中校正单核苷酸多态性(SNP)的方法。所述方法包括使靶多核苷酸序列与如上述任一方面或其实施方案所述的多分子复合物或如上述任一方面或其实施方案所述的碱基编辑器系统接触，从而通过使所述SNP或其互补核碱基脱氨来编辑所述SNP。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种编辑存在于细胞基因组中的调节序列的方法。所述方法包括使调节序列与如上述任一方面或其实施方案所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸接触，从而编辑所述调节序列。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种编辑存在于细胞基因组中的调节序列的方法。所述方法包括使调节序列与如上述任一方面或其实施方案所述的多分子复合物或如上述任一方面或其实施方案所述的碱基编辑器系统接触，从而编辑所述调节序列。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种产生具有增加的胞苷脱氨酶活性和/或胞苷脱氨酶特异性的腺苷脱氨酶变体的方法。所述方法包括在与以下序列具有至少70％氨基酸同一性的氨基酸序列中生成一个或多个改变：
所述一个或多个改变选自以下中的一个或多个：S2H、V4K、V4S、V4T、V4Y、F6G、F6H、F6Y、H8Q、R13G、T17A、T17W、R23Q、E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q、E27S、E27G、P29A、P29G、P29K、V30F、V30I、R47G、R47S、A48G、I49K、I49M、I49N、I49Q、I49T、G67W、I76H、I76R、I76W、Y76H、Y76R、Y76W、F84A、F84M、H96N、G100A、G100K、T111H、G112H、A114C、G115M、M118L、H122G、H122R、H122T、N127I、N127K、N127P、A142E、R147H、A158V、Q159S、A162C、A162N、A162Q和S165P，或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置的改变。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种腺苷脱氨酶变体，其通过如上述任一方面或其实施方案所述的方法产生。
在另一方面，本公开的发明特征在于一种试剂盒，其含有如上述任一方面或其实施方案所述的融合蛋白、如上述任一方面或其实施方案所述的多分子复合物、如上述任一方面或其实施方案所述的碱基编辑器系统、如上述任一方面或其实施方案所述的多核苷酸、如上述任一方面或其实施方案所述的载体、如上述任一方面或其实施方案所述的细胞或如上述任一方面或其实施方案所述的组合物以及其在碱基编辑中的使用说明书。
在上述任一方面或其实施方案中，含有所述改变的所述腺苷脱氨酶变体与以下氨基酸序列具有至少约70％或更高氨基酸序列同一性：
在上述任一方面或其实施方案中，所述改变位于选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处：与SEQ ID NO 1具有至少约70％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列的2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167，或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置处。在上述任一方面或其实施方案中，所述两个或更多个改变选自以下中的一个或多个：与SEQ ID NO:1具有至少约70％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列的S2X、V4X、F6X、H8X、R13X、T17X、R23X、E27X、P29X、V30X、R47X、A48X、I49X、G67X、Y76X、D77X、S82X、F84X、H96X、G100X、R107X、G112X、A114X、G115X、M118X、D119X、H122X、N127X、A142X、A143X、R147X、Y147X、F149X、A158X、Q159X、A162X、S165X、T166X和D167X，或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置的改变。在上述任一方面或其实施方案中，所述两个或更多个改变位于与SEQID NO:1具有至少约70％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列的氨基酸位置处，所述改变选自以下中的一个或多个：氨基酸位置2处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置4处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置6处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置13处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置27处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置29处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置100处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置112处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置114处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置115处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置162处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、165、166和167；或氨基酸位置165处的第一改变和选自以下中的一个或多个的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、166和167。
在上述任一方面或其实施方案中，所述改变选自以下中的一个或多个：与SEQ ID:1具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列的S2H、V4K、V4S、V4T、V4Y、F6G、F6H、F6Y、H8Q、R13G、T17A、T17W、R23Q、E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q、E27S、E27G、P29A、P29G、P29K、V30F、V30I、V30L、R47G、R47S、A48G、I49K、I49M、I49N、I49Q、I49T、G67W、I76H、I76R、I76W、I76Y、Y76H、Y76I、Y76R、Y76W、D77G、S82T、F84A、F84L、F84M、H96N、G100A、G100K、R107C、T111H、G112H、A114C、G115M、M118L、D119N、H122G、H122N、H122R、H122T、N127I、N127K、N127P、A142E、A143E、R147H、Y147D、F149Y、A158V、Q159S、A162C、A162N、A162Q、S165P、T166I和D167N，或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置的改变。在上述任一方面或其实施方案中，所述改变选自表1A至1F中任一个所列的那些。
在上述任一方面或其实施方案中，所述改变含有选自以下中的一个或多个的改变组合：E27H、Y76I和F84M；E27H、I49K和Y76I；E27S、I49K和Y76I；E27S、I49K、Y76I和A162N；E27K和D119N；E27H和Y76I；E27S、I49K和G67W；I49T、G67W和H96N；E27C、Y76I和D119N；R13G、E27Q和N127K；T17A、E27H、I49M、Y76I和M118L；I49Q、Y76I和G115M；S2H、I49K、Y76I和G112H；R47S和R107C；H8Q、I49Q和Y76I；T17A、A48G、S82T和A142E；E27G和I49N；E27G、D77G和S165P；E27S、I49K和S82T；E27S、I49K、S82T和G115M；E27S、V30I、I49K和S82T；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G112H和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L和R107C；E27S、I49K、S82T、F84L和G112H；E27S、I49K、S82T、F84L和G115M；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；E27S、P29G、I49K和S82T；E27S、P29G、I49K、S82T和G115M；E27S、P29G、I49K、S82T和A142E；P29G、I49K和S82T；E27G、I49K和S82T；E27G、I49K、S82T、R107C和A142E；V4K、E27H、I49K、Y76I和A114C；V4K、E27H、I49K、Y76I和D77G；F6Y、E27H、I49K、Y76I、G100A和H122R；V4T、E27H、I49K、Y76R和H122G；F6Y、E27H、I49K和Y76W；F6Y、E27H、I49K、Y76I和D119N；F6Y、E27H、I49K、Y76I和A114C；F6Y、E27H、I49K和Y76I；V4K、E27H、I49K、Y76W和H122T；F6G、E27H、I49K、Y76R和G100K；F6H、E27H、I49K、Y76I和H122N；E27H、I49K、Y76I和A114C；F6Y、E27H、I49K、Y76H、H122R和T166I；E27H、I49K、Y76I和N127P；R23Q、E27H、I49K和Y76R；E27H、I49K、Y76H、H122R和A158V；F6Y、E27H、I49K、Y76I和T111H；E27H、I49K、Y76I和R147H；E27H、I49K、Y76I和A143E；F6Y、E27H、I49K和Y76R；T17W、E27H、I49K、Y76H、H122G和A158V；V4S、E27H、I49K、A143E和Q159S；E27H、I49K、Y76I、N127I和A162Q；T17A、E27H和A48G；T17A、E27K和A48G；T17A、E27S和A48G；T17A、E27S、A48G和I49K；T17A、E27G和A48G；T17A、A48G和I49N；T17A、E27G、A48G和I49N；T17A、E27Q和A48G；E27S、I49K、S82T和R107C；E27S、I49K、S82T和G112H；E27S、I49K、S82T和A142E；E27S、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和R107C；E27S、V30I、I49K、S82T和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K和S82T；E27S、V30L、I49K、S82T和R107C；E27S、V30L、I49K、S82T和G112H；E27S、V30L、I49K、S82T和G115M；E27S、V30L、I49K、S82T和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T和F84A；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和R107C；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G112H；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G115M；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G112H；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G115M；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T和F84L；E27S、I49K、S82T、F84L和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T和R107C；E27S、P29G、I49K、S82T和G112H；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29G、I49K、S82T和R107C；P29G、I49K、S82T和G112H；P29G、I49K、S82T和G115M；P29G、I49K、S82T和A142E；P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K和S82T；P29K、I49K、S82T和R107C；P29K、I49K、S82T和G112H；P29K、I49K、S82T和G115M；P29K、I49K、S82T和A142E；P29K、I49K、S82T、R107C和G112H；P29K、I49K、S82T、R107C和G115M；P29K、I49K、S82T、R107C和A142E；P29K、I49K、S82T、G112H和A142E；P29K、I49K、S82T、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K和S82T；P29K、V30I、I49K、S82T和R107C；P29K、V30I、I49K、S82T和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T和F84L；P29K、I49K、S82T、F84L和R107C；P29K、I49K、S82T、F84L和G112H；P29K、I49K、S82T、F84L和G115M；P29K、I49K、S82T、F84L和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T和F84L；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27G、I49K、S82T和R107C；E27G、I49K、S82T和G112H；E27G、I49K、S82T和G115M；E27G、I49K、S82T和A142E；E27G、I49K、S82T、R107C和G112H；E27G、I49K、S82T、R107C和G115M；E27G、I49K、S82T、G112H和A142E；E27G、I49K、S82T、G115M和A142E；E27G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27H、I49K和S82T；E27H、I49K、S82T和R107C；E27H、I49K、S82T和G112H；E27H、I49K、S82T和G115M；E27H、I49K、S82T和A142E；E27H、I49K、S82T、R107C和G112H；E27H、I49K、S82T、R107C和G115M；E27H、I49K、S82T、R107C和A142E；E27H、I49K、S82T、G112H和A142E；E27H、I49K、S82T、G115M和A142E；E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S和S82T；E27S、S82T和R107C；E27S、S82T和G112H；E27S、S82T和G115M；E27S、S82T和A142E；E27S、S82T、R107C和G112H；E27S、S82T、R107C和G115M；E27S、S82T、R107C和A142E；E27S、S82T、G112H和A142E；E27S、S82T、G115M和A142E；E27S、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A和S82T；P29A、S82T和R107C；P29A、S82T和G112H；P29A、S82T和G115M；P29A、S82T和A142E；P29A、S82T、R107C和G112H；P29A、S82T、R107C和G115M；P29A、S82T、R107C和A142E；P29A、S82T、G112H和A142E；P29A、S82T、G115M和A142E；P29A、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I和S82T；E27S、V30I、S82T和R107C；E27S、V30I、S82T和G112H；E27S、V30I、S82T和G115M；E27S、V30I、S82T和A142E；E27S、V30I、S82T、R107C和G112H；E27S、V30I、S82T、R107C和G115M；E27S、V30I、S82T、R107C和A142E；E27S、V30I、S82T、G112H和A142E；E27S、V30I、S82T、G115M和A142E；E27S、V30I、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T和F84L；P29A、V30I、S82T、F84L和R107C；P29A、V30I、S82T、F84L和G112H；P29A、V30I、S82T、F84L和G115M；P29A、V30I、S82T、F84L和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G112H；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G115M；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、G112H和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、P29A、V30L、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；V4K和A114C；V4K和D77G；F6Y、G100A和H122R；V4T、I76R和H122G；F6Y和I76W；F6Y和D119N；F6Y和A114C；V4K、I76W和H122T；F6G、I76R和G100K；F6H和H122N；F6Y、I76H、H122R和T166I；R23Q和I76R；I76H、H122R和A158V；F6Y和T111H；T111H、H122G和A162C；F6Y和I76R；T17W、I76H、H122G和A158V；V4S、I76Y、A143E和Q159S；N127I和A162Q；E27H、Y76I、F84M和F149Y；E27H、I49K、Y76I和F149Y；T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L和F149Y；T17A、A48G、S82T、A142E和F149Y；E27G和F149Y；E27G、I49N和F149Y；E27H、Y76I、F84M、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27H、I49K、Y76I、Y147D、F149Y、T166I、D167N；T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L、Y147D、F149Y、T166I和D167N；T17A、A48G、S82T、A142E、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27G、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27G、I49N、Y147D、F149Y、T166I和D167N；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；以及F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；以上改变属于与SEQ ID NO:1具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置。在上述任一方面或其实施方案中，所述改变含有选自以下中的一个或多个的改变组合：E27S、I49K和S82T；E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；以及F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E。在上述任一方面或其实施方案中，所述改变含有选自表1A至1F中任一个所列的那些的改变组合。
在上述任一方面或其实施方案中，相对于参考腺苷脱氨酶，所述一个或多个改变增加胞苷脱氨酶活性和/或胞苷脱氨酶特异性。
在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体是TadA脱氨酶变体或其片段。在实施方案中，所述TadA脱氨酶或其片段是细菌TadA脱氨酶。
在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体含有选自以下中的一个或多个的改变组合：与SEQ ID NO:1具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列的E27H、Y76I和F84M；以及E27H、I49K和Y76I，或另一腺苷脱氨酶中的相应改变组合。
在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体还含有在SEQ ID NO.1的氨基酸位置166处的R。在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体不含在SEQID NO.1的位置48处的R氨基酸。
在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体表现出增加的胞苷脱氨酶活性和/或胞苷脱氨酶特异性，其为参考腺苷脱氨酶的至少约30倍或更多倍。在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体表现出增加的胞苷脱氨酶活性和/或胞苷脱氨酶特异性，其为参考腺苷脱氨酶的至少约50倍或更多倍。在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体表现出增加的胞苷脱氨酶活性和/或胞苷脱氨酶特异性，其为参考腺苷脱氨酶的至少约70倍或更多倍。在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约30％或更多。在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约50％或更多。在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约70％或更多。
在上述任一方面或其实施方案中，所述参考腺苷脱氨酶为TadA*8.20或TadA*8.19。
在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体能够使单链或双链靶多核苷酸中的胞苷和腺嘌呤脱氨。在实施方案中，所述靶多核苷酸为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。
在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体的胞苷脱氨活性与腺嘌呤脱氨活性比率为至少约1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在上述任一方面或其实施方案中，相对于参考腺苷脱氨酶，所述改变增加了使胞苷脱氨的选择性。
在上述任一方面或其实施方案中，所述多核苷酸可编程DNA结合结构域为Cas9、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i或Cas12j/CasΦ结构域。在上述任一方面或其实施方案中，所述多核苷酸可编程DNA结合结构域为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)1Cas9(St1Cas9)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9(SpCas9)或其变体。在上述任一方面或其实施方案中，所述多核苷酸可编程DNA结合结构域含有具有改变的原型间隔区相邻基序(PAM)特异性的修饰的SaCas9。在上述任一方面或其实施方案中，所述多核苷酸可编程DNA结合结构域含有具有改变的原型间隔区相邻基序(PAM)特异性的SpCas9变体。在上述任一方面或其实施方案中，所述多核苷酸可编程DNA结合结构域为无核酸酶活性变体或切口酶变体。
在上述任一方面或其实施方案中，所述融合蛋白含有多核苷酸可编程DNA结合结构域和所述脱氨酶结构域之间的接头。在上述任一方面或其实施方案中，所述融合蛋白含有一个或多个核定位信号。在上述任一方面或其实施方案中，所述融合蛋白含有一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)结构域。
在上述任一方面或其实施方案中，所述碱基编辑器系统具有增加的C到T碱基编辑活性，其相对于参考碱基编辑器系统的C到T碱基编辑活性为至少约30倍。在上述任一方面或其实施方案中，所述碱基编辑器系统具有增加的C到T碱基编辑活性，其相对于参考碱基编辑器系统的C到T碱基编辑活性为至少约50倍。在上述任一方面或其实施方案中，所述碱基编辑器系统具有增加的C到T碱基编辑活性，其相对于参考碱基编辑器系统的C到T碱基编辑活性为至少约70倍。在上述任一方面或其实施方案中，所述碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统活性的至少约30％。在上述任一方面或其实施方案中，所述碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统活性的至少约50％。在上述任一方面或其实施方案中，所述碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统活性的至少约70％。在上述任一方面或其实施方案中，所述碱基编辑器系统在所述靶多核苷酸中具有至少约30％的C到T编辑活性。在上述任一方面或其实施方案中，所述碱基编辑器系统在所述靶多核苷酸中具有至少约50％的C到T编辑活性。在上述任一方面或其实施方案中，所述碱基编辑器系统在所述靶多核苷酸中具有至少约70％的C到T编辑活性。
在上述任一方面或其实施方案中，所述参考碱基编辑器系统为ABE8.20、ABE8.19、B93、B88、变体1.17(表1A)或变体1.2(表1A)。
在上述任一方面或其实施方案中，所述靶多核苷酸为双链或单链。在上述任一方面或其实施方案中，所述靶多核苷酸为DNA或RNA。在上述任一方面或其实施方案中，所述靶多核苷酸是在细胞基因组中。
在上述任一方面或其实施方案中，所述靶多核苷酸中的A到G和/或C到T编辑与遗传疾病相关。
在上述任一方面或其实施方案中，所述载体为哺乳动物表达载体。在上述任一方面或其实施方案中，所述载体为病毒载体。在实施方案中，所述病毒载体选自以下中的一个或多个：腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒(Sendaivirus)载体和疱疹病毒载体。在上述任一方面或其实施方案中，所述载体含有启动子。
在上述任一方面或其实施方案中，所述细胞为人细胞。在上述任一方面或其实施方案中，所述细胞是在体外或在体内。在上述任一方面或其实施方案中，所述细胞为细菌、酵母、真菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
在上述任一方面或其实施方案中，所述组合物还含有药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
在上述任一方面或其实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在实施方案中，所述哺乳动物为人。
在上述任一方面或其实施方案中，腺苷脱氨酶变体含有选自139-167中的一个或多个的氨基酸位置处的氨基酸改变。在实施方案中，选自139-167中的一个或多个的氨基酸位置处的改变与α螺旋5的一部分解旋相关。
在上述任一方面或其实施方案中，包含所述改变的所述腺苷脱氨酶变体与SEQ IDNO.1具有至少约70％或更高氨基酸序列同一性。
在上述任一方面或其实施方案中，A区中的改变改变了所述脱氨酶的活性位点。在上述任一方面或其实施方案中，B区中的改变是在包含残基25-30的环1、包含残基46-47的环3或包含残基48-51的螺旋2中的一个或多个中。在上述任一方面或其实施方案中，所述改变是在环1中。在上述任一方面或其实施方案中，所述改变是在环3中。在上述任一方面或其实施方案中，所述改变是在包含残基139-167的C端螺旋中。在上述任一方面或其实施方案中，所述改变与所述螺旋的解旋相关。在实施方案中，所述螺旋的解旋是在残基145-155之间。在实施方案中，所述螺旋的解旋是在约残基150处。
在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体保留至少约0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性。在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体保留少于约0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性。在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体具有胞苷脱氨酶活性和腺苷脱氨酶活性，其中胞苷脱氨酶活性为其腺苷脱氨酶活性的约或至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍或更多倍。在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体缺乏显著的腺苷脱氨酶活性。在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体缺乏可检测的腺苷脱氨酶活性。
在上述任一方面或其实施方案中，所述腺苷脱氨酶变体不包含选自由以下组成的组的氨基酸位置：30、47-49、82-84、107-111、139、142、143、146-149、151-161、166和167；或不是选自由以下组成的组的改变：V30I、V30L、V30、R47F、R47M、R47Q、R47W、P48A、P48D、P48E、P48H、P48K、P48L、P48R、P48S、P48T、I49V、V82G、V82S、V82T、L84F、L84I、R107A、R107C、R107H、R107K、R107N、R107P、D108A、D108E、D108F、D108G、D108I、D108K、D108L、D108M、D108N、D108Q、D108S、D108V、D108W、D108Y、A109S、K110I、T111R、D139L、D139M、A142N、A143D、A143E、A143G、A143L、S146C、S146R、S146T、D147A、D147R、D147T、D147Y、F148A、F149A、F149N、F149Y、M151V、R152H、R152P、R153C、Q154H、Q154L、Q154R、Q154S、E155D、E155G、E155V、I156D、I156F、I156Y、K157N、A158K、Q159L、K160E、K161T、T166I、T166R和D167N。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有由本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。以下参考文献为技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编,1988)；TheGlossary of Genetics,第5版,R.Rieger等人(编),Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另外详细说明，否则如本文所用的以下术语具有它们下文所述的含义。
“腺嘌呤”或”9H-嘌呤-6-胺”意指具有分子式C5H5N5、具有结构并且对应于CAS号73-24-5的嘌呤核碱基。
“腺苷”或“4-氨基-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)氧杂环戊烷-2-基]嘧啶-2(1H)-酮“意指经由糖苷键附接到核糖上、具有结构并且对应于CAS号65-46-3的腺嘌呤分子。其分子式为C10H13N5O4。
“腺苷脱氨酶”或“腺嘌呤脱氨酶”意指能够催化腺嘌呤或腺苷的水解脱氨的多肽或其片段。在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶结构域是催化腺苷水解脱氨为肌苷或脱氧腺苷水解脱氢为脱氧肌苷的腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶催化脱氧核糖核酸(DNA)中的腺嘌呤或腺苷的水解脱氨。本文提供的腺苷脱氨酶(例如工程化的腺苷脱氨酶、进化的腺苷脱氨酶)可以来自任何生物体，诸如细菌。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是具有一个或多个改变的腺苷脱氨酶变体，并且能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，靶多核苷酸为单链或双链。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体能够使DNA中的腺嘌呤和胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体能够使单链DNA中的腺嘌呤和胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体能够使RNA中的腺嘌呤和胞嘧啶脱氨。
“腺苷脱氨酶活性”意指催化多核苷酸中的腺嘌呤脱氨为鸟嘌呤。在一些实施方案中，如本文提供的腺苷脱氨酶变体保持腺苷脱氨酶活性(例如，参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20或TadA*8.19)活性的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体主要具有胞苷脱氨酶活性，并且保留小于约0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的腺苷脱氨酶活性。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体具有大致相等的腺苷脱氨酶活性和胞苷脱氨酶活性(例如，在约或至少约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％内的活性)。在一些情况下，腺苷脱氨酶变体的胞嘧啶脱氨酶活性为变体的腺苷脱氨酶活性的约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、1倍、2倍、3倍、4倍5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或更多倍。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体主要具有胞嘧啶脱氨酶活性，并且具有很少的(如果有的话)腺苷脱氨酶活性。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体具有胞嘧啶脱氨酶活性，并且不具有显著的或不具有可检测的腺苷脱氨酶活性。
“腺苷碱基编辑器(ABE)”意指包含腺苷脱氨酶的碱基编辑器。
“腺苷碱基编辑器(ABE)多核苷酸”意指编码ABE的多核苷酸。
“腺苷脱氨酶碱基编辑器8(ABE8)多核苷酸”或“ABE8”意指如本文所定义的包含腺苷脱氨酶或腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器，其包含表14中所列的一个或多个改变、表14中所列的改变组合中的一个或表14中所列的一个或多个氨基酸位置处的改变，其中此类改变是相对于以下参考序列：MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPV GAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方案中，如本文所述，ABE8包含相对于参考序列的进一步改变。在一些实施方案中，ABE8的腺苷脱氨酶结构域中的这些进一步改变赋予的C到T编辑活性高于(例如，至少约30倍、40倍、50倍、60倍、70倍或更多倍)参考ABE8(例如，ABE8.20)中的C到T编辑活性。
“腺苷脱氨酶碱基编辑器8(ABE8)多核苷酸”意指编码ABE8的多核苷酸。
“施用”在本文中是指向患者或受试者提供本文所述的一种或多种组合物。
“剂”意指任何小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
“改变”意指分析物、基因或多肽的水平、结构或活性的变化(增加或减少)，如通过标准的本领域已知的方法(诸如本文所述的那些方法)所检测的。如本文所用，改变包括表达水平的10％变化、表达水平的25％变化、40％变化和50％或更大变化。在一些实施方案中，改变包括核碱基或氨基酸的插入、缺失或取代。
“改善”意指减少、抑制、减弱、消除、阻止或稳定疾病的发展或进展。
“类似物”意指不相同但具有类似功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留了对应天然存在的多肽的生物活性，同时具有相对于天然存在的多肽增强类似物功能的某些生化修饰。此类生化修饰可以增加类似物的蛋白酶抗性、膜通透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可以包括非天然氨基酸。
“碱基编辑器(BE)”或“核碱基编辑器多肽(NBE)”意指结合多核苷酸并具有核碱基修饰活性的剂。在各种实施方案中，碱基编辑器包含核碱基修饰多肽(例如，腺苷脱氨酶变体)和与指导多核苷酸(例如，指导RNA(gRNA))结合的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域(例如，Cas9或Cpf1)。碱基编辑器的代表性核酸和蛋白质序列在序列表中提供为SEQ IDNO:3-12。
碱基编辑器的实例可以包括胞苷或胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)。胞苷碱基编辑器(CBE)的非限制性实例包括BE1(APOBEC1-XTEN-dCas9)、BE2(APOBEC1-XTEN-dCas9-UGI)、BE3(APOBEC1-XTEN-dCas9(A840H)-UGI)、BE3-Gam、sa BE3、saBE4-Gam、BE4、BE4-Gam、saBE4或saB4E-Gam。BE4将APOBEC1-Cas9n(D10A)接头扩展到32个氨基酸，将Cas9n-UGI接头扩展到9个氨基酸，并且将UGI的第二个拷贝附加到构建体的C端，并将另一个9个氨基酸的接头附加到单个碱基编辑器构建体中。碱基编辑器saBE3和saBE4将化脓性链球菌Cas9n(D10A)置换为较小的金黄色葡萄球菌Cas9n(D10A)。BE3-Gam、saBE3-Gam、BE4-Gam和saBE4-Gam具有经由16个氨基酸的XTEN接头与BE3、saBE3、BE4和saBE4的N端融合的174个Gam蛋白残基。
腺苷碱基编辑器的非限制性实例包括包含TadA脱氨酶的碱基编辑器。在一些实施方案中，腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)包含TadA脱氨酶变体(例如，TadA*8变体)。在一些实施方案中，腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)包含细菌TadA脱氨酶变体(例如，ecTadA)。在一些实施方案中，腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)包含截短的TadA脱氨酶变体。在一些实施方案中，腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)包含TadA脱氨酶变体的片段。在一些实施方案中，腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)包含TadA*8.20变体。在一些实施方案中，腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)为ABE8变体。在一些实施方案中，ABE8变体为ABE8.20变体。在一些实施方案中，碱基编辑器是腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)，其包含具有腺嘌呤和胞嘧啶脱氨活性的腺苷脱氨酶变体。在一些实施方案中，包含如本文提供的ABE变体(例如，ABE8.20变体)的碱基编辑器系统具有A到G和C到T碱基编辑活性。
“碱基编辑活性”意指发生作用以化学改变多核苷酸内的碱基。在一个实施方案中，将第一个碱基转化为第二个碱基。在一个实施方案中，碱基编辑活性是胞嘧啶或胞苷脱氨酶活性，例如，将靶C·G转化为T·A。在另一个实施方案中，碱基编辑活性是腺苷或腺嘌呤脱氨酶活性，例如，将A·T转化为G·C。在一些实施方案中，包含如本文提供的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统具有C到T碱基编辑活性和A到G碱基编辑活性。在一些实施方案中，如本文提供的碱基编辑器系统相对于参考碱基编辑器系统(例如，ABE8.20或ABE8.19)具有至少约30％、40％、50％、60％、70％或更高的C到T碱基编辑活性。
术语“碱基编辑器系统”是指用于编辑靶核苷酸序列的核碱基的分子间复合物。在各种实施方案中，碱基编辑器(BE)系统包含(1)多核苷酸可编程核苷酸结合结构域、用于使靶核苷酸序列中的核碱基脱氨的脱氨酶结构域(例如，胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶)；和(2)与多核苷酸可编程核苷酸结合结构域结合的一种或多种指导多核苷酸(例如，指导RNA)。在各种实施方案中，碱基编辑器(BE)系统包含核碱基编辑器结构域(例如，腺苷脱氨酶变体结构域)和具有核酸序列特异性结合活性的结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含(1)碱基编辑器(BE)，其包含用于多核苷酸可编程DNA结合结构域和使靶核苷酸序列中的一个或多个核碱基脱氨的脱氨酶结构域(例如，腺苷脱氨酶变体结构域)；和(2)与多核苷酸可编程DNA结合结构域结合的一种或多种指导RNA。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域是多核苷酸可编程DNA结合结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含具有腺嘌呤和胞嘧啶脱氨活性的腺苷脱氨酶变体。在一些实施方案中，包含本文提供的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统在靶多核苷酸(例如，DNA)中具有至少约30％、40％、50％、60％、70％或更高的C到T编辑活性。在一些实施方案中，相对于包含参考腺苷脱氨酶(例如，ABE8.20或ABE8.19)的碱基编辑器系统的C到T碱基编辑活性，包含如本文所提供的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统具有增加的C到T碱基编辑活性(例如，至少约30倍、40倍、50倍、60倍、70倍或更多倍)。
术语“Cas9”或“Cas9结构域”是指RNA指导的核酸酶，其包含Cas9蛋白或其片段(例如，包含Cas9的活性、无活性或部分活性的DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白质)。Cas9核酸酶有时也称为casnl核酸酶或CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)相关核酸酶。
术语“保守氨基酸取代”或“保守突变”是指一种氨基酸被另一种具有共同特性的氨基酸置换。定义单个氨基酸之间共同特性的功能途径是分析同源生物体的对应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz,G.E.和Schirmer,R.H.,Principles of ProteinStructure,Springer-Verlag,New York(1979))。根据此类分析，可以定义氨基酸组，其中组内的氨基酸优先彼此交换，因此在它们对整体蛋白质结构的影响方面彼此最相似(Schulz,G.E.和Schirmer,R.H.,同上)。保守突变的非限制性实例包括氨基酸的氨基酸取代，例如赖氨酸取代精氨酸，反之亦然，使得可以保持正电荷；谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，使得可以保持负电荷；丝氨酸取代苏氨酸，使得可以保持游离-OH；以及谷氨酰胺取代天冬酰胺，使得可以保持游离-NH2。
如本文可互换使用的术语“编码序列”或“蛋白质编码序列”是指编码蛋白质的多核苷酸片段。编码序列也可以称为开放阅读框。所述区域或序列在更靠近5'末端处以起始密码子为界，并且在更靠近3'末端处以终止密码子为界。对本文所述的碱基编辑器有用的终止密码子包括以下：
谷氨酰胺CAG→TAG终止密码子
CAA→TAA
精氨酸CGA→TGA
色氨酸TGG→TGA
TGG→TAG
TGG→TAA
“复合物”意指两个或更多个分子的组合，其相互作用依赖于分子间作用力。分子间力的非限制性实例包括共价和非共价相互作用。非共价相互作用的非限制性实例包括氢键、离子键、卤键、疏水键、范德华相互作用(例如，偶极-偶极相互作用、偶极诱导的偶极相互作用和伦敦色散力)和π效应。在一个实施方案中，复合物包含多肽、多核苷酸或一种或多种多肽与一种或多种多核苷酸的组合。在一个实施方案中，复合物包含缔合以形成碱基编辑器(例如，包含核酸可编程DNA结合蛋白(诸如Cas9)和脱氨酶的碱基编辑器)的一种或多种多肽和多核苷酸(例如，指导RNA)。在一个实施方案中，复合物通过氢键结合在一起。应当理解，碱基编辑器的一种或多种组分(例如，脱氨酶或核酸可编程DNA结合蛋白)可以共价或非共价缔合。例如，碱基编辑器可以包括与核酸可编程DNA结合蛋白共价连接(例如，通过肽键)的脱氨酶。或者，碱基编辑器可以包括非共价缔合的脱氨酶和核酸可编程DNA结合蛋白(例如，其中碱基编辑器的一种或多种组分以反式提供并直接缔合或经由另一分子诸如蛋白质或核酸缔合)。在一个实施方案中，复合物的一种或多种组分通过氢键结合在一起。
“胞嘧啶”或”4-氨基嘧啶-2(1H)-酮”意指具有分子式C4H5N3O、具有结构并且对应于CAS号71-30-7的嘌呤核碱基。
“胞苷”意指经由糖苷键附接至核糖、具有结构并且对应于CAS号65-46-3的胞嘧啶分子。其分子式为C9H13N3O5。
“胞苷碱基编辑器(CBE)”意指包含胞苷脱氨酶的碱基编辑器。
“胞苷碱基编辑器(CBE)多核苷酸”意指编码CBE的多核苷酸。
“胞苷脱氨酶”意指能够催化将胞苷的氨基转化为羰基的脱氨反应的多肽或其片段。在一个实施方案中，胞苷脱氨酶将胞嘧啶转化为尿嘧啶或将5-甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。术语“胞苷脱氨酶”和“胞嘧啶脱氨酶”在整个申请中可互换使用。来源于海七鳃鳗(Petromyzon marinus)的PmCDA1(SEQ ID NO:13-14)(海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶1，“PmCDA1”)、来源于哺乳动物(例如，人、猪、牛、马、猴等)的AID(激活诱导的胞苷脱氨酶；AICDA)(示例性AID多肽序列在序列表中提供为SEQ ID NO:15-21)和APOBEC是示例性胞苷脱氨酶(示例性APOBEC多肽序列在序列表中提供为SEQ ID NO:22-62)。其他示例性胞苷脱氨酶(CDA)序列在序列表中提供为SEQ ID NO:63--67。另外的示例性胞苷脱氨酶序列(包括APOBEC多肽序列)在序列表中提供为SEQ ID NO:68-190。
“胞嘧啶”意指具有分子式C4H5N3O的嘧啶核碱基。
“胞嘧啶脱氨酶活性”意指催化多核苷酸中胞嘧啶的脱氨，从而将氨基转化为羰基。在一个实施方案中，具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽将胞嘧啶转化为尿嘧啶(即，C到U)或将5-甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(即，5mC到T)。在一些实施方案中，如本文所提供的腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20或TadA*8.19)具有增加的胞嘧啶脱氨酶活性(例如，至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍)。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶衍生自参考腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体主要具有胞苷脱氨酶活性，并且保留小于约0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的腺苷脱氨酶活性。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体具有大致相等的腺苷脱氨酶活性和胞苷脱氨酶活性(例如，在约或至少约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％内的活性)。在一些情况下，腺苷脱氨酶变体的胞嘧啶脱氨酶活性为变体的腺苷脱氨酶活性的约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、1倍、2倍、3倍、4倍5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或更多倍。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体主要具有胞嘧啶脱氨酶活性，并且具有很少的(如果有的话)腺苷脱氨酶活性。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体具有胞嘧啶脱氨酶活性，并且不具有显著的或不具有可检测的腺苷脱氨酶活性。如本文所用，术语“脱氨酶”或“脱氨酶结构域”是指催化脱氨反应的蛋白质或酶。
“检测”是指鉴定待检测分析物的存在、不存在或量。在一个实施方案中，检测多核苷酸或多肽中的序列改变。在另一个实施方案中，检测插入缺失的存在。
“可检测标记”意指一种组合物，当其与感兴趣的分子连接时使后者可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测。例如，有用的标记包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)中常用的)、生物素、地高辛或半抗原。
“疾病”意指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何疾患或病症。
“双重编辑活性”意指具有腺苷脱氨酶活性和胞苷脱氨酶活性。在一个实施方案中，具有双重编辑活性的碱基编辑器具有A→G和C→T活性两者，其中两种活性大致相等或彼此相差约10％或20％以内。在另一个实施方案中，双重编辑器的A→G活性比C→T活性高不超过约10％或20％。在另一个实施方案中，双重编辑器的A→G活性比C→T活性低不超过约10％或20％。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体主要具有胞嘧啶脱氨酶活性，并且具有很少的(如果有的话)腺苷脱氨酶活性。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体具有胞嘧啶脱氨酶活性，并且不具有显著的或不具有可检测的腺苷脱氨酶活性。
“有效量”意指相对于未治疗的患者或未患疾病的个体(即，健康个体)而言改善疾病症状所需的剂或活性化合物(例如，如本文所述的碱基编辑器)的量，或者是足以引发所需生物反应的剂或活性化合物的量。用于实践本发明以治疗疾病的活性化合物的有效量根据施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。此量称为“有效”量。在一个实施方案中，有效量是足以在细胞(例如，体外或体内细胞)的感兴趣的基因中引入改变的本发明碱基编辑器的量。在一个实施方案中，有效量是实现治疗效果所需的碱基编辑器的量。这种治疗效果不需要足以改变受试者、组织或器官的所有细胞中的致病基因，而只需要改变存在于受试者、组织或器官中细胞的约1％、5％、10％、25％、50％、75％或更多。在一个实施方案中，有效量足以改善疾病的一种或多种症状。
“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。这部分含有参考核酸分子或多肽全长的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。
一般而言，“基因”是能够转录成具有调节功能、催化功能和/或编码蛋白质的RNA的多核苷酸。在实施方案中，多核苷酸是在细胞基因组中。真核基因通常具有内含子和外显子，它们可以组织在一起以产生编码成熟蛋白质的替代版本的不同RNA剪接变体。技术人员将理解，本公开涵盖编码感兴趣的多肽的所有转录物，包括剪接变体、等位基因变体和由于替代启动子位点或替代聚腺苷酸化位点而出现的转录物。因此，“全长”基因或RNA涵盖任何天然存在的剪接变体、等位基因变体、其他替代转录物、通过重组技术生成的与天然存在的变体具有相同功能的剪接变体，以及所得RNA分子。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含来自至少两个不同蛋白质的蛋白质结构域的杂交多肽。本领域技术人员将理解，任何在融合时起作用的蛋白质也将是功能性未融合的，即，在多分子复合物的情况下。
“指导RNA”或“gRNA”意指多核苷酸或多核苷酸复合物，其对靶序列具有特异性并且可以与多核苷酸可编程核苷酸结合结构域蛋白(例如，Cas9或Cpf1)形成复合物。在一个实施方案中，指导多核苷酸是指导RNA(gRNA)。gRNA可以作为两个或更多个RNA的复合物存在，或作为单个RNA分子存在。
“杂交”意指互补核碱基之间的氢键合，所述氢键合可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。例如，腺嘌呤与胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补核碱基。
“增加”意指至少约10％、25％、50％、75％或100％的正改变。在一些实施方案中，增加为相对于参考的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。
术语“碱基修复抑制剂(inhibitor of base repair/base repair inhibitor)”、“IBR”或它们的语法等同物是指能够抑制核酸修复酶(例如碱基切除修复酶)活性的蛋白质。
“内含肽”是蛋白质片段，其能够自切割并在称为蛋白质剪接的过程中将剩余的片段(外显肽)与肽键连接起来。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指在不同程度上与在其天然状态下发现的通常伴随其的组分分离的物质。“分离”表示与原始来源或周围环境的分离程度。“纯化”表示高于分离的分离程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质充分不含其他物质，使得任何杂质不会实质性地影响蛋白质的生物学特性或导致其他不利后果。也就是说，如果当本发明的核酸和肽通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质，则所述核酸或肽是纯化的。纯度和均匀性通常使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可以进行修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可能会产生不同的分离的蛋白质，这些蛋白质可以单独纯化。
“分离的多核苷酸”意指不含在本发明的核酸分子所来源的生物体的天然存在的基因组中位于所述基因侧翼的基因的核酸(例如，DNA)。因此，此术语包括，例如，重组DNA，其被并入载体中；被并入自主复制质粒或病毒中；或被并入原核生物或真核生物的基因组DNA中；或以独立于其他序列的单独分子(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)的形式存在。此外，此术语包括从DNA分子以及编码另外的多肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA转录的RNA分子。
“分离的多肽”意指本发明的已经从天然伴随它的组分中分离出来的多肽。通常，当多肽按重量不含至少60％与其天然结合的蛋白质和天然存在的有机分子时，多肽是分离的。优选地，制备物按重量计占本发明的多肽的至少75％，更优选地占至少90％并且最优选地占至少99％。本发明的分离的多肽可以例如通过从天然来源中提取、通过表达编码这一多肽重组核酸或通过化学合成蛋白质来获得。可以通过任何适当的方法(例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过HPLC分析)测量纯度。
如本文所用，术语“接头”是指连接两个部分的分子。在一个实施方案中，术语“接头”是指共价接头(例如，共价键)或非共价接头。
“标志物”意指具有与疾病或病症相关的表达水平或活性改变的任何蛋白质或多核苷酸。
如本文所用，术语“突变”是指序列(例如核酸或氨基酸序列)内的残基被另一残基取代，或序列内一个或多个残基的缺失或插入。本文通常通过鉴定原始残基，然后是残基在序列内的位置以及新取代残基的身份来描述突变。用于进行本文提供的氨基酸取代(突变)的各种方法在本领域中是熟知的，并且由例如Green和Sambrook，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2012))提供。
如本文所用，术语“核酸”和“核酸分子”是指包含核碱基和酸性部分的化合物，例如，核苷、核苷酸或核苷酸的聚合物。通常，聚合核酸例如包含三个或更多个核苷酸的核酸分子是线性分子，其中相邻的核苷酸经由磷酸二酯键相互连接。在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含三个或更多个单个核苷酸残基的寡核苷酸链。如本文所用，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互换使用以指代核苷酸的聚合物(例如，至少三个核苷酸的链)。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA。核酸可以是天然存在的，例如，在基因组、转录物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、质粒、粘粒、染色体、染色单体或其他天然存在的核酸分子的情况下。另一方面，核酸分子可以是非天然存在的分子，例如重组DNA或RNA、人工染色体、工程化基因组或其片段，或合成DNA、RNA、DNA/RNA杂交体，或包括非天然存在的核苷酸或核苷。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，例如，不具有磷酸二酯主链的类似物。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，核酸可以包含核苷类似物，诸如具有化学修饰的碱基或糖和骨架修饰的类似物。除非另有说明，否则核酸序列以5’到3’方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、和脱氧胞苷)，核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫胞苷)，化学修饰的碱基，生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)，插入碱基，修饰糖(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)，和/或修饰磷酸酯基(例如，硫代磷酸酯和5′-N-氨基磷酸酯键)。
术语“核定位序列”、“核定位信号”或“NLS”是指促进蛋白质输入细胞核的氨基酸序列。核定位序列在本领域中是已知的并且描述于例如Plank等人提交于2000年11月23日，2001年5月31日出版为WO/2001/038547的国际PCT申请PCT/EP2000/011690，其内容以引用方式并入本文，因为它们公开了示例性核定位序列。在其他实施方案中，NLS是优化的NLS，例如通过Koblan等人,Nature Biotech.2018doi:10.1038/nbt.4172描述。在一些实施方案中，NLS包含氨基酸序列KRTADGSEFESPKKKRKV(SEQ ID NO:191)、KRPAATKK AGQAKKKK(SEQID NO:192)、KKTELQTTNAENKTKKL(SEQ ID NO:193)、KRGINDRNFWRGENGRKTR(SEQ ID NO:194)、RKSGKIAAIVVKRPRK(SEQ ID NO:195)、PKKKRKV(SEQ IDNO:196)或MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(SEQ ID NO:197)。
本文可互换使用的术语“核碱基”、“含氮碱基”或“碱基”是指形成核苷的含氮生物化合物，核苷又是核苷酸的组分。核碱基形成碱基对和彼此堆叠的能力直接导致长链螺旋结构，诸如核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。五种核碱基(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U))被称为一级的或典型的。腺嘌呤和鸟嘌呤来源于嘌呤，并且胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶来源于嘧啶。DNA和RNA还可以含有其他修饰的(非一级)碱基。非限制性示例性修饰核碱基可以包括次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-氢甲基胞嘧啶。次黄嘌呤和黄嘌呤可以通过诱变剂的存在产生，两者都通过脱氨作用(用羰基替换胺基)产生。次黄嘌呤可以由腺嘌呤经修饰而得。黄嘌呤可以由鸟嘌呤经修饰而得。尿嘧啶可以由胞嘧啶脱氨而得。“核苷”由一个核碱基和一个五碳糖(核糖或脱氧核糖)组成。核苷的实例包括腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、5-甲基尿苷(m5U)、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷和脱氧胞苷。具有修饰的核碱基的核苷的实例包括肌苷(I)、黄苷(X)、7-甲基鸟苷(m7G)、二氢尿苷(D)、5-甲基胞苷(5mC)和假尿苷(Ψ)。“核苷酸”由核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸基团组成。修饰的核碱基和/或修饰的核碱基可以包含的化学修饰的非限制性实例如下：假尿苷、5-甲基-胞嘧啶、2′-O-甲基-3′-膦酰基乙酸酯、2′-O-甲基硫基PACE(MSP)、2′-O-甲基-PACE(MP)、2’-氟RNA(2′-F-RNA)、受限乙基(S-cEt)、2′-O-甲基(‘M’)、2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯(‘MS’)、2'-O-甲基-3'-硫代膦酰基乙酸酯(‘MSP’)、5-甲氧基尿苷、硫代磷酸酯和N1-甲基假尿苷。
术语“核酸可编程DNA结合蛋白”或“napDNAbp”可以与“多核苷酸可编程核苷酸结合结构域”互换使用，以指代与将napDNAbp导向特定核酸序列的核酸(例如，DNA或RNA)缔合的蛋白质，所述核酸诸如指导核酸或指导多核苷酸(例如，gRNA)。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域是多核苷酸可编程DNA结合结构域。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域是多核苷酸可编程RNA结合结构域。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域是Cas9蛋白。Cas9蛋白可以与将Cas9蛋白导向与指导RNA互补的特定DNA序列的指导RNA缔合。在一些实施方案中，napDNAbp是Cas9结构域，例如有核酸酶活性的Cas9、Cas9切口酶(nCas9)或无核酸酶活性的Cas9(dCas9)。核酸可编程DNA结合蛋白的非限制性实例包括Cas9(例如，dCas9和nCas9)、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i和Cas12j/CasΦ(Cas12j/Casphi)。Cas酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9(也称为Csn1或Csx12)、Cas10、Cas10d、Cas12a/Cpfl、Cas12b/C2cl、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j/CasΦ、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Csy4、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csx11、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Csd1、Csd2、Cst1、Cst2、Csh1、Csh2、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、II型Cas效应蛋白、V型Cas效应蛋白、VI型Cas效应蛋白、CARF、DinG、其同系物或其经修饰的或工程化的版本。其他核酸可编程DNA结合蛋白也在本公开的范围内，尽管它们可能未在本公开中具体列出。参见，例如，Makarova等人“Classification and Nomenclature ofCRISPR-Cas Systems:Where from Here？”CRISPR J.2018年10月；1:325-336.doi:10.1089/crispr.2018.0033；Yan等人,“Functionally diverse type VCRISPR-Cassystems”Science.2019年1月4日；363(6422):88-91.doi:10.1126/science.aav7271，所述文献各自的全部内容以引用方式特此并入。示例性核酸可编程DNA结合蛋白和编码核酸可编程DNA结合蛋白的核酸序列在序列表中提供为SEQ ID NO:198-231和390。
如本文所用，术语“核碱基编辑结构域”或“核碱基编辑蛋白”是指可以催化RNA或DNA中的核碱基修饰(诸如胞嘧啶(或胞苷)至尿嘧啶(或尿苷)或胸腺嘧啶(或胸苷)和腺嘌呤(或腺苷)至次黄嘌呤(或肌苷)的脱氨作用，以及非模板化的核苷酸添加和插入)的蛋白质或酶。在一些实施方案中，核碱基编辑结构域是脱氨酶结构域(例如，腺嘌呤脱氨酶或腺苷脱氨酶)。在一些实施方案中，核碱基编辑结构域是具有腺苷和胞嘧啶脱氨酶活性的腺苷脱氨酶变体。
如本文所用，如“获得剂”中的“获得”包括合成、购买或以其他方式获取剂。
如本文所用，“患者”或“受试者”是指被诊断为患有疾病或病症、处于患有或发展疾病或病症的风险下或疑似患有或发展疾病或病症的哺乳动物受试者或个体。在一些实施方案中，术语“患者”是指具有高于患上疾病或病症的平均可能性的哺乳动物受试者。示例性患者可以是人、非人灵长类动物、猫、狗、猪、牛、猫、马、骆驼、美洲驼、山羊、绵羊、啮齿动物(例如，小鼠、兔子、大鼠或豚鼠)和其他可以受益于本文公开的治疗的哺乳动物。示例性人患者可以是男性和/或女性。
“有需要的患者”或“有需要的受试者”在本文中是指被诊断患有、有风险或患有、预先确定患有或被怀疑患有疾病或病症的患者。
术语“致病突变(pathogenic mutation)”、“致病变异(pathogenic variant)”、“致病突变(disease causing mutation)”、“致病变异(disease causing variant)”、“有害突变”或“易感突变”是指增加个体对某种疾病或病症的易感性或倾向性的基因改变或突变。在一些实施方案中，致病突变包括由基因编码的蛋白质中的至少一个致病氨基酸取代的至少一个野生型氨基酸。
术语“蛋白质”和“肽”和“多肽”和它们的语法等同物在本文中可以互换使用，并且是指通过肽(酰胺)键连接的氨基酸残基的聚合物。蛋白质、肽或多肽可以是天然存在的、重组的或合成的，或它们的任何组合。
如本文在蛋白质或核酸的上下文中使用的术语“重组体”是指不存在于自然界中而是人工程产物的蛋白质或核酸。例如，在一些实施方案中，重组蛋白质或核酸分子包含氨基酸或核苷酸序列，所述氨基酸或核苷酸序列与任何天然存在的序列相比包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个突变。
“减少”意指至少10％、25％、50％、75％或100％的负改变。
“参考”意指标准或对照条件。在一个实施方案中，将具有赋予胞嘧啶脱氨酶活性的改变的腺苷脱氨酶变体的活性与缺乏所述改变的参考腺苷脱氨蛋白酶的活性进行比较。在一个实施方案中，将包含具有赋予胞嘧啶脱氨酶活性的改变的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器的活性与包含缺乏所述改变的参考腺苷脱氨酶的碱基编辑器活性进行比较。
“参考序列”是定义的用作序列比较基础的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常为至少约50个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约75个核苷酸、约100个核苷酸或约300个核苷酸或它们附近或它们之间的任何整数。在一些实施方案中，参考序列是感兴趣的蛋白质的野生型序列。在其他实施方案中，参考序列是编码野生型蛋白质的多核苷酸序列。
术语“RNA可编程核酸酶”和“RNA指导的核酸酶”与一种或多种不是切割靶标的RNA一起使用(例如，结合或缔合)。在一些实施方案中，当与RNA形成复合物时，RNA可编程核酸酶可以被称为核酸酶:RNA复合物。通常，结合的RNA被称为指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，RNA可编程核酸酶是(CRISPR相关系统)Cas9内切核酸酶，例如，来自化脓性链球菌的Cas9(Csnl)(例如，SEQ ID NO:198)、来自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的Cas9(NmeCas9；SEQ ID NO:209)、Nme2Cas9(SEQ ID NO:210)或其衍生物(例如，与Cas9具有至少约85％序列同一性的序列，诸如Nme2Cas9或spCas9)。
术语“单核苷酸多态性(SNP)”是发生在基因组特定位点的单个核苷酸的变异，其中每种变异在群体中以一定程度存在(例如，>1％)。SNP可以落入基因的编码区、基因的非编码区或基因间区(基因之间的区域)。在一些实施方案中，由于遗传密码的简并性，编码序列内的SNP不一定改变所产生的蛋白质的氨基酸序列。编码区的SNP有两种类型：同义和非同义SNP。同义SNP不影响蛋白质序列，而非同义SNP改变蛋白质的氨基酸序列。非同义SNP有两种类型：错义和无义。不在蛋白质编码区的SNP仍然可以影响基因剪接、转录因子结合、信使RNA降解或非编码RNA的序列。受此类SNP影响的基因表达称为eSNP(表达SNP)，并且其可以位于基因的上游或下游。单核苷酸变体(SNV)是单个核苷酸的变异，没有任何频率限制，并且可以在体细胞中出现。体细胞单核苷酸变异也可以称为单核苷酸改变。
“基本上同一”意指多肽或核酸分子表现出与参考氨基酸序列至少50％的同一性。在一个实施方案中，参考序列是野生型氨基酸或核酸序列。在另一个实施方案中，参考序列是本文所述的任何一种氨基酸或核酸序列。在一个实施方案中，这样的序列与用于比较的序列在氨基酸水平或核酸水平上至少有60％、80％、85％、90％、95％甚至99％的同一性。
序列同一性通常使用序列分析软件(例如，Sequence Analysis SoftwarePackage of the Genetics Computer Group,University of Wisconsin BiotechnologyCenter,1710University Avenue,Madison,Wis.53705,BLAST,BESTFIT,GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量。此类软件通过对各种替换、删除和/或其他修饰分配同源程度来匹配同一或类似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3与e-100之间的概率评分指示密切相关的序列。
例如，COBALT与以下参数一起使用：
a)比对参数：空位罚分-11、-1和末端空位罚分-5、-1，
b)CDD参数：使用RPS BLAST(on)；Blast E值0.003；查找保守列并重新计算(on)，以及
c)查询聚类参数：使用查询聚类(on)；字长(Word Size)4；最大聚类距离0.8；常规字符(Alphabet Regular)。
例如，EMBOSS Needle与以下参数一起使用：
a)矩阵：BLOSUM62；
b)空位开放(GAP OPEN)：10；
c)空位扩展(GAP EXTEND)：0.5；
d)输出格式(OUTPUT FORMAT)：配对(pair)；
e)末端空位罚分(END GAP PENALTY)：假(false)；
f)末端空位开放(END GAP OPEN)：10；以及
g)末端空位扩展(END GAP EXTEND)：0.5。
可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％同一，但通常会表现出实质上的同一性。与内源序列具有“实质同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％同一，但通常会表现出实质上的同一性。与内源序列具有“实质同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意指在各种严格性条件下配对以在互补多核苷酸序列(例如，本文所述的基因)或其部分之间形成双链分子。(参见例如，Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
例如，严格的盐浓度一般小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选地小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，并且更优选地小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可以在不存在有机溶剂(例如甲酰胺)的情况下获得，而高严格性杂交可以在存在至少约35％甲酰胺，并且更优选地存在至少约50％甲酰胺的情况下获得。严格的温度条件一般包括至少约30℃、更优选地至少约37℃，并且最优选地至少约42℃的温度。不同的另外的参数，诸如杂交时间、洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))的浓度，以及包含或排除载剂DNA对于本领域技术人员来说是熟知的。通过根据需要组合这些不同的条件来实现不同级别的严格性。在一个优选的实施方案中，杂交将在30℃在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％ SDS中发生。在一个更优选的实施方案中，杂交将在37℃在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％ SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中发生。在一个最优选的实施方案中，杂交将在42℃在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％ SDS、50％甲酰胺和200μg/mlssDNA中发生。这些条件的有用变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格性也会不同。洗涤严格性条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上所述，可以通过降低盐浓度或通过提高温度来增加洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格盐浓度优选地小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，并且最优选地小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件一般包括至少约25℃、更优选地至少约42℃、甚至更优选地至少约68℃的温度。在一个实施方案中，洗涤步骤将在25℃下在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中发生。在另一个实施方案中，洗涤步骤将在42℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中发生。在一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中发生。这些条件的另外变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员所熟知的，并且描述于例如Benton和Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols inMolecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger和Kimmel(Guide toMolecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；以及Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork。
“分裂”意指分成两个或更多个片段。
“分裂的Cas9蛋白”或“分裂的Cas9”是指提供为由两个单独的核苷酸序列编码的N端片段和C端片段的Cas9蛋白。对应于Cas9蛋白的N端部分和C端部分的多肽可以剪接形成“重构的”Cas9蛋白。
术语“靶位点”是指被脱氨酶(例如，腺嘌呤脱氨酶变体)或包含脱氨酶的融合蛋白或多分子复合物(例如，本文公开的dCas9-腺苷脱氨酶融合蛋白或碱基编辑器)脱氨的核酸分子内的位点。
如本文所使用，术语“治疗(treat/treating/treatment等)”是指减少或改善病症和/或与其相关的症状或获得所需药理和/或生理效应。应当理解，虽然不排除，但治疗病症或疾患不需要完全消除与其相关的病症、疾患或症状。在一些实施方案中，所述效应是治疗性的，即(但不限于)，所述效应部分或完全减少、减弱、消除、减轻、缓解、降低疾病的强度或治愈疾病和/或疾病引起的不良症状。在一些实施方案中，所述效应是预防性的，即，所述效应保护或防止疾病或疾患的发生或复发。为此，目前公开的方法包括施用治疗有效量的如本文所述的组合物。
“尿嘧啶糖基化酶抑制剂”或“UGI”意指抑制尿嘧啶切除修复系统的剂。包含胞苷脱氨酶的碱基编辑器将胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后通过DNA复制或修复将其转化为胸腺嘧啶。在碱基编辑器中包括尿嘧啶DNA糖基化酶(UGI)的抑制剂可以防止将U变回C的碱基切除修复。示例性UGI包含如下氨基酸序列：
>splP14739IUNGI_BPPB2尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVH TAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML(SEQ ID NO:232)。
术语“载体”是指将核酸序列引入到细胞中从而得到转化细胞的手段。载体包括质粒、转座子、噬菌体、病毒、脂质体和附加体。“表达载体”是包含有待在受体细胞中表达的核苷酸序列的核酸序列。表达载体可以包含促进和/或有利于所引入序列(诸如起始序列、终止序列、增强子、启动子和分泌序列)的表达的另外的核酸序列。
本文提供的范围应理解为所述范围内的所有值的速记法。例如，1至50的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任何数字、数字组合或子范围。
在本文中变量的任何定义中引述化学基团的清单包括定义所述变量作为任何单一基团或所列基团的组合。在本文中引述变量或方面的实施方案包括作为任何单一实施方案或与任何其它实施方案组合或其部分的所述实施方案。
所有术语旨在以它们由本领域技术人员所理解的方式来理解。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
在本申请中，除非另外确切说明，否则使用单数包括复数。必须注意，除非上下文另外清楚指明，否则如本说明书中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括多个指代物。在本申请中，除非另外说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，使用术语“包括(including)”以及其它形式如“include”、“includes”和“included”不具有限制性。
如本说明书和权利要求中所用，词“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)，或“含有(containing)”(以及含有(containing)的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)为包括性的或开放式的并且不排除另外的、未提及的要素或方法步骤。在一些实施方案中，指定为“包含”特定组件或元件的任何实施方案也被设想为“由特定组分或元件组成”或“基本上由特定组件或元件组成”。可以设想本说明书中讨论的任何实施方案可以以本公开的任何方法或组合物实现，并且反之亦然。此外，本公开的组合物可以用于实现本公开的方法。
术语“约”或“近似”意指由本领域普通技术人员测定的特定值处于可接受的误差范围内，这将部分取决于所述值的测量或测定方式，即，测量系统的限制性。
在本说明书中提及“一些实施方案”、“一个实施方案(anembodiment/oneembodiment)”或“其他实施方案”意指结合所述实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一些实施方案但不一定是所有实施方案中。
附图说明
图1A至1C描绘了使用靶序列5’-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-3’(SEQ ID NO:233)的单链DNA特异性腺苷和胞苷脱氨酶(ssDacd)碱基编辑器1.1-1.20的编辑百分比。靶位点以加粗字体提供，并且PAM序列为带下划线的字体。将腺苷碱基编辑器ABE8.20和ABE8.2b用作C到非C编辑的阴性对照和A到G编辑的阳性对照。将胞苷碱基编辑器BE4、BE4max和BE3b用作C到非C编辑的阳性对照和A到G编辑的阴性对照。将包含具有腺苷和胞嘧啶脱氨酶结构域(ME-1和ME-2)两者的融合蛋白的碱基编辑器用作对照。图1A是描绘每个碱基编辑器在没有UGI结构域的情况下在位置C4(加粗字体)处的C到非C编辑百分比的图表。图1B是描绘每个碱基编辑器在没有UGI结构域的情况下在位置A5(加粗字体)处的A到G编辑百分比的图表。图1C是描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。
图2A至2C描绘了使用序列5’-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-3’(SEQ ID NO:233)的ssDacd1.1-ssDacd1.20碱基编辑器的编辑百分比。靶位点以加粗字体提供，并且PAM序列为带下划线的字体。将腺苷碱基编辑器ABE8.20和ABE8.2b用作C到非C编辑的阴性对照和A到G编辑的阳性对照。将胞苷碱基编辑器BE4、BE4max和BE3b用作C到非C编辑的阳性对照和A到G编辑的阴性对照。将ME-1和ME-2用作对照。图2A是描绘每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下在位置C4(加粗字体)处的C到非C编辑百分比的图表。图2B是描绘每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下在位置A5(加粗字体)处的A到G编辑百分比的图表。图2C是描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。
图3A至3B描绘了使用Hek位点2(“299”)序列5’-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-3’(SEQ ID NO:233)的ssDacd1.1、ssDacd1.2、ssDacd1.9、ssDacd1.12、ssDacd1.17、ssDacd1.18和ssDacd1.19碱基编辑器的编辑百分比。靶位点以加粗字体提供，并且PAM序列为带下划线的字体。将腺苷碱基编辑器ABE8.20用作A到G编辑的阳性对照和C到非C编辑的阴性对照。将胞苷碱基编辑器BE4用作C到非C编辑的阳性对照和A到G编辑的阴性对照。将ME-1和ME-2用作对照。图3A是描绘每个碱基编辑器在位置C4T、A5G、C6R和A7G(用粗体显示)处的脱氨百分比的图表。图3B是描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。
图4A至4E描绘了ssDacd1.1-ssDacd1.20碱基编辑器的编辑百分比。将腺苷碱基编辑器ABE8.20和ABE8.2b用作C到T编辑的阴性对照和A到G编辑的阳性对照。将胞苷碱基编辑器BE4、BE4max和BE3b用作C到T编辑的阳性对照和A到G编辑的阴性对照。将ME-1和ME-2用作对照。图4A是描绘每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下使用RNF2序列5’-GTCATCTTAGTCATTACCTGAGG-3’(SEQ ID NO:234)的A到G和C到T最大编辑的脱氨百分比的图表。PAM序列为带下划线的字体。图4B是描绘每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下使用Emx1序列5’-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGG-3’(SEQ ID NO:235)的A到G和C到T编辑的脱氨百分比的图表。图4C是描绘每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下在EMX1 v2(“B415”)序列5’-GCTCCCATCACATCAACCGGTGG-3’(SEQ ID NO:236)的位点1处的A到G和C到T最大编辑的脱氨百分比的图表。图4D是描绘每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下使用Hek2位点3序列5’-GGCCCAGACTGAGCACGTGATGG-3’(SEQ ID NO:237)的A到G和C到T编辑的脱氨百分比的图表。图4E是描绘每个碱基编辑器的RNF2、Emx1、Hek位点1和Hek2位点3各自的插入缺失百分比的热图。
图5是描绘碱基编辑器ssDacd1.1-ssDacd1.20各自在具有UGI结构域的情况下使用Hek2位点2序列5’-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-3’(SEQ ID NO:233)的A到G和C到T编辑的脱氨百分比的图表。PAM序列为带下划线的字体。将腺苷碱基编辑器ABE8.20和ABE8.2b用作C到T编辑的阴性对照和A到G编辑的阳性对照。将胞苷碱基编辑器BE4、BE4max和BE3b用作C到T编辑的阳性对照和A到G编辑的阴性对照。将ME-1和ME-2用作对照。
图6A和6B描绘了在Hek位点2上具有和没有UGI结构域的情况下ssDacd1.1-ssDacd1.20碱基编辑器的编辑百分比。将仅指导物且没有转染(NoTxCtr和NoTxCtr1)用作阴性对照。将B433、B434、B970、B88、B120、B802、YY-B2、B93和B110用作对照。图6A是描绘每个碱基编辑器的A到G、C到T或C到G的编辑百分比的图表。图6B是描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的图表。
图7A和7B描绘了在EMX1(ack115)上具有和没有UGI结构域的情况下ssDacd1.1-ssDacd1.20碱基编辑器的编辑百分比。将仅指导物、NoTxCtr和NoTxCtr1用作阴性对照。B433、B434、B970、B88、B120、B802、YY-B2、B93和B110。图7A是描绘每个碱基编辑器的A到G、C到T或C到G的编辑百分比的图表。图7B是描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的图表。
图8A和8B描绘了在Hek位点3(ack115)上具有和没有UGI结构域的情况下ssDacd1.1-ssDacd1.20碱基编辑器的编辑百分比。将仅指导物、NoTxCtr和NoTxCtr1用作阴性对照。B433、B434、B970、B88、B120、B802、YY-B2、B93和B110。图8A是描绘每个碱基编辑器的A到G、C到T或C到G的编辑百分比的图表。图8B是描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的图表。
图9A和9B描绘了在RNF2(ack121)上具有和没有UGI结构域的情况下ssDacd1.1-ssDacd1.20碱基编辑器的编辑百分比。将仅指导物、NoTxCtr和NoTxCtr1用作阴性对照。B433、B434、B970、B88、B120、B802、YY-B2、B93和B110。图9A是描绘每个碱基编辑器的A到G、C到T或C到G的编辑百分比的图表。图9B是描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的图表。
图10A和10B描绘了在EMX1位点2(B415)上具有和没有UGI结构域的情况下ssDacd1.1-ssDacd1.20碱基编辑器的编辑百分比。将仅指导物、NoTxCtr和NoTxCtr1用作阴性对照。B433、B434、B970、B88、B120、B802、YY-B2、B93和B110。图10A是描绘每个碱基编辑器的A到G、C到T或C到G的编辑百分比的图表。图10B是描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的图表。
图11A和11B描绘了在spA12(YY-A12)上具有和没有UGI结构域的情况下ssDacd1.1-ssDacd1.20碱基编辑器的编辑百分比。将仅指导物、NoTxCtr和NoTxCtr1用作阴性对照。B433、B434、B970、B88、B120、B802、YY-B2、B93和B110。图11A是描绘每个碱基编辑器的A到G、C到T或C到G的编辑百分比的图表。图11B是描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的图。
图12是描绘使用序列5’-GTATTACTATTATTATCTGAGA-3’(YY-A1)(SEQ ID NO:238)的腺苷碱基编辑器变体的最大效率的图表，以及描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。靶序列由下划线表示。
图13是描绘使用序列5’-GTGGGACTGATCCCTTAATGTG-3’(YY-A2)(SEQ ID NO:239)的腺苷碱基编辑器变体的最大效率的图表，以及描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。靶序列由下划线表示。
图14A和14B是描绘腺苷碱基编辑器变体在位点A6(图14A)和位点C7(图14B)对YY-A2序列的编辑的图表。图14A和14B顶部的序列为SEQ ID NO:239。
图15是描绘使用序列5’-GACCAGGTCAGCAAACATGTT-3’(YY-A6)(SEQ ID NO:240)的腺苷碱基编辑器变体的最大效率的图表，以及描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。靶序列由下划线表示。
图16是描绘使用序列5’-GACTCAGCGCCCCTGCCGGGCC-3’(YY-A7)(SEQ ID NO:241)的具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体的最大效率的图表，以及描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。靶序列由下划线表示。
图17是描绘使用序列5’-GCCACAGTGGGAGGGGACATG-3’(YY-A15)(SEQ ID NO:242)的具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体的最大效率的图表，以及描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。靶序列由下划线表示。
图18是描绘使用序列5’-GCCCAGCAATTCACTGTGAAG-3’(YY-A16)(SEQ ID NO:243)的具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体的最大效率的图表，以及描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。靶序列由下划线表示。
图19是描绘使用序列5’-GCCCAGCTCCAGCCTCTGATG-3’(YY-A17)(SEQ ID NO:244)的具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体的最大效率的图表，以及描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。靶序列由下划线表示。
图20是描绘使用序列5’-GGTCGACCCTTGGTATCCATG-3’(YY-A27)(SEQ ID NO:245)的具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体的最大效率的图表，以及描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。靶序列由下划线表示。
图21A至21D是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体在位点C4(图21A)、位点A6(图21B)、位点C7(图21C)和位点C8(图21D)对YY-A27序列的编辑的图表。图21A至21D顶部的序列为SEQ ID NO:245。
图22是描绘使用序列5’-GGTCGTAGCCAGTCCGAACCC-3’(YY-A28)(SEQ ID NO:246)的具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体的最大效率的图表，以及描绘每个碱基编辑器的插入缺失百分比的热图。靶序列由下划线表示。
图23A至23S是描绘腺苷碱基编辑器变体在九个位点(YY-A1、YY-A2、YY-A6、YY-A7、YY-A15、YY-A16、YY-A17、YY-A27和YY-A28)的最大编辑效率的图表。图23A是描绘腺苷碱基编辑器变体1.1的最大编辑效率的图表。图23B是描绘腺苷碱基编辑器变体1.2的最大编辑效率的图表。图23C是描绘腺苷碱基编辑器变体1.3的最大编辑效率的图表。图23D是描绘腺苷碱基编辑器变体1.4的最大编辑效率的图表。图23E是描绘腺苷碱基编辑器变体1.5的最大编辑效率的图表。图23F是描绘腺苷碱基编辑器变体1.6的最大编辑效率的图表。图23G是描绘腺苷碱基编辑器变体1.7的最大编辑效率的图表。图23H是描绘腺苷碱基编辑器变体1.9的最大编辑效率的图表。图23I是描绘腺苷碱基编辑器变体1.10的最大编辑效率的图表。图23J是描绘腺苷碱基编辑器变体1.11的最大编辑效率的图表。图23K是描绘腺苷碱基编辑器变体1.12的最大编辑效率的图表。图23L是描绘腺苷碱基编辑器变体1.13的最大编辑效率的图表。图23M是描绘腺苷碱基编辑器变体1.14的最大编辑效率的图表。图23N是描绘腺苷碱基编辑器变体1.15的最大编辑效率的图表。图23O是描绘腺苷碱基编辑器变体1.16的最大编辑效率的图表。图23P是描绘腺苷碱基编辑器变体1.17的最大编辑效率的图表。图23Q是描绘腺苷碱基编辑器变体1.18的最大编辑效率的图表。图23R是描绘腺苷碱基编辑器变体1.19的最大编辑效率的图表。图23S是描绘腺苷碱基编辑器变体1.20的最大编辑效率的图表。
图24A至24T是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体在18个靶位点的每个窗口位置处的平均编辑效率(A到G或C到T)的方框图。图24A是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.1的平均编辑效率的图表。图24B是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.2的平均编辑效率的图表。图24C是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.3的平均编辑效率的图表。图24D是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.4的平均编辑效率的图表。图24E是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.5的平均编辑效率的图表。图24F是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.6的平均编辑效率的图表。图24G是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.7的平均编辑效率的图表。图24H是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.8的平均编辑效率的图表。图24I是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.9的平均编辑效率的图表。图24J是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.10的平均编辑效率的图表。图24K是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.11的平均编辑效率的图表。图24L是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.12的平均编辑效率的图表。图24M是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.13的平均编辑效率的图表。图24N是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.14的平均编辑效率的图表。图24O是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.15的平均编辑效率的图表。图24P是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.16的平均编辑效率的图表。图24Q是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.17的平均编辑效率的图表。图24R是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.18的平均编辑效率的图表。图24S是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.19的平均编辑效率的图表。图24T是描绘具有UGI结构域的腺苷碱基编辑器变体1.20的平均编辑效率的图表。
图25A至25I是描绘所选对照的平均编辑效率(A到G或C到T)的方框图。图25A是描绘ABE 8.19m的平均编辑效率的图表。图25B是描绘具有UGI结构域的ABE 8.19m的平均编辑效率的图表。图25C是描绘ABE 8.20m的平均编辑效率的图表。图25D是描绘具有UGI结构域的ABE 8.20m的平均编辑效率的图表。图25E是描绘BE4-max的平均编辑效率的图表。图25F是描绘BE4的平均编辑效率的图表。图25G是描绘组合的ABE/CBE融合蛋白的平均编辑效率的图表。图25H是描绘没有UGI结构域的BE3b的平均编辑效率的图表。图25I是描绘nCas9的平均编辑效率的图表。
图26A至26F提供了显示总读数百分比的条形图，所述总读数百分比显示每个指定的碱基编辑器所实现的C到T或A到G的改变。在图26A至26F中的每一个中，对于每个碱基编辑器，C到T的改变显示在左边的条形中，并且A到G的改变显示在右边的条形中。在图26A至26F中的每一个中，靶位点以加粗字体显示。图26A中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:237的前12个核苷酸。图26B中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:239的前12个核苷酸。图26C中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:240的前12个核苷酸。图26D中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:241的前12个核苷酸。图26E中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:386的前12个核苷酸。图26F中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:244的前12个核苷酸。将碱基编辑器8.20m+UGI、B93、B88(rAPOBEC1 BE4)、变体1.17(表1A)和变体1.2(表1B)用作对照。
图27A至27F提供了显示总读数百分比的条形图，所述总读数百分比显示每个指定的碱基编辑器所实现的C到T或A到G的改变。在图27A至27F中的每一个中，对于每个碱基编辑器，C到T的改变显示在左边的条形中，并且A到G的改变显示在右边的条形中。在图27A至27F中的每一个中，靶位点以加粗字体显示。图27A中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:237的前12个核苷酸。图27B中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:239的前12个核苷酸。图27C中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:240的前12个核苷酸。图27D中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:241的前12个核苷酸。图27E中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:386的前12个核苷酸。图27F中的序列对应于核苷酸序列SEQ ID NO:244的前12个核苷酸。将碱基编辑器B88(rAPOBEC1 BE4)、ABE8.20、B93、变体1.2(表1A)和变体1.17(表1A)用作对照。
图28A至28F提供了显示总读数百分比的条形图，所述总读数百分比显示每个指定的碱基编辑器所实现的C到T或A到G的改变。在图28A至28F中的每一个中，对于每个碱基编辑器，C到T的改变显示在左边的条形中，并且A到G的改变显示在右边的条形中。在图28A至28F中的每一个中，靶位点在条形图上方显示。将碱基编辑器B93、B88(rAPOBEC1 BE4)、8.20m+UGI、变体1.17(表1A)和变体1.2(表1A)用作对照。
图29A至29F提供了显示总读数百分比的条形图，所述总读数百分比显示每个指定的碱基编辑器所实现的C到T或A到G的改变。在图29A至29F中的每一个中，对于每个碱基编辑器，C到T的改变显示在左边的条形中，并且A到G的改变显示在右边的条形中。在图29A至29F中的每一个中，靶位点在条形图上方显示。将碱基编辑器B93、B88(rAPOBEC1 BE4)、8.20m+UGI、变体1.17(表1A)和变体1.2(表1A)用作对照。
图30提供了显示表25中列出的腺苷脱氨酶变体的A到G和C到T碱基编辑活性的热图。在图30中，已基于测量的A到G和C到T活性对碱基编辑器进行聚类。在图30中，较深的阴影表示活性增加。
图31提供了显示表25中列出的腺苷脱氨酶变体的A到G和C到T碱基编辑活性的热图。在图31中，已基于测量的A到G和C到T活性对碱基编辑器进行聚类。在图31中，较深的阴影表示活性增加。
图32A至32F呈现了条形图，其显示在以下靶位点处指定碱基编辑器的C到T、A到G和C到G编辑活性(对于碱基编辑器的描述，参见表26)：YY-A2、YY-A6、YY-A7、YY-A12、YY-A17和ACK119。在图32A至32F中的每一个中，紧靠每个影线标记左侧的条形表示C到T的活性，紧靠每个影线标记上方的条形表示A到G的活性，并且紧靠每个影线标记右侧的条形表示C到G的活性。用于制备条形图的对照包括ABE/CBE融合蛋白。
图33A至33F呈现了热图，其显示在以下靶位点处与指定碱基编辑器相关的插入缺失形成的频率(对于碱基编辑器的描述，参见表26)：YY-A2、YY-A6、YY-A7、YY-A12、YY-A17和ACK119。在图33A至33F中，较深的灰色阴影表示插入缺失形成的相对频率较高。用于制备热图的对照包括ABE/CBE融合蛋白。
图34A和34B呈现了条形图，其显示在以下靶位点处指定碱基编辑器的C到T、A到G和C到G编辑活性(对于碱基编辑器的描述，参见表26)：YY-A2和Hek位点3。在图34A和34B中的每一个中，紧靠每个影线标记左侧的条形表示C到T的活性，紧靠每个影线标记上方的条形表示A到G的活性，并且紧靠每个影线标记右侧的条形表示C到G的活性。在图34A和34B中，未标记的条形对应于组合的ABE/CBE融合蛋白。
图35A和35B呈现了热图，其显示在以下靶位点处与指定碱基编辑器相关的插入缺失形成的频率(对于碱基编辑器的描述，参见表26)：HEK位点3和YY-A2。在图35A和35B中，较深的灰色阴影表示插入缺失形成的相对频率较高。在图35A和35B中，未标记的单元对应于组合的ABE/CBE融合蛋白。
图36A至36S呈现了描绘图24A至24T的腺苷碱基编辑器变体的平均编辑效率(A到G或C到T)的图。图36A至36S各自呈现了与图24A至24T中的相应图中的数据相同，但格式不同的数据。
图37A至37E呈现了描绘图25A至25I的所选对照的平均编辑效率(A到G或C到T)的图。图37A至37E各自呈现了与图25A至25I中的相应图中呈现的数据类似或相同，但格式不同的数据。
图38呈现了热图，其显示指定碱基编辑器变体(对于变体的描述，参见表1E)在指定靶位点(对于靶位点的描述，参见表24)处的AT到GC编辑的最大百分比(％)。碱基编辑器变体879和882与增加的中靶活性和最小的指导物非依赖性脱靶活性相关。
图39A至39R呈现了描绘腺苷碱基编辑器变体(参见表1A和1F)在6个靶位点(参见表24中的299、ACK 119、ACK 115、ACK121、B415和sA12)或表24中列出的所有18个靶位点的每个窗口位置处的平均编辑效率(A到G或C到T)的图，如其所示。图39A是描绘腺苷碱基编辑器变体1.12的平均编辑效率的图表。图39B是描绘腺苷碱基编辑器变体1.12+8e(B869)的平均编辑效率的图表。图39C是描绘腺苷碱基编辑器变体1.12+8e(B882)的平均编辑效率的图表。图39D是描绘腺苷碱基编辑器变体1.17的平均编辑效率的图表。图39E是描绘腺苷碱基编辑器变体1.17+8e(B869)的平均编辑效率的图表。图39F是描绘腺苷碱基编辑器变体1.17+8e(B882)的平均编辑效率的图表。图39G是描绘腺苷碱基编辑器变体1.18的平均编辑效率的图表。图39H是描绘腺苷碱基编辑器变体1.18+8e(B869)的平均编辑效率的图表。图39I是描绘腺苷碱基编辑器变体1.18+8e(B882)的平均编辑效率的图表。图39J是描绘腺苷碱基编辑器变体1.19的平均编辑效率的图表。图39K是描绘腺苷碱基编辑器变体1.19+8e(B869)的平均编辑效率的图表。图39L是描绘腺苷碱基编辑器变体1.19+8e(B882)的平均编辑效率的图表。图39M是描绘腺苷碱基编辑器变体1.1的平均编辑效率的图表。图39N是描绘腺苷碱基编辑器变体1.1+8e(B869)的平均编辑效率的图表。图39O是描绘腺苷碱基编辑器变体1.1+8e(B882)的平均编辑效率的图表。图39P是描绘腺苷碱基编辑器变体1.2的平均编辑效率的图表。图39Q是描绘腺苷碱基编辑器变体1.2+8e(B869)的平均编辑效率的图表。图39R是描绘腺苷碱基编辑器变体1.2+8e(B882)的平均编辑效率的图。
图40呈现了条形图，其显示指定碱基编辑器(对于碱基编辑器的描述，参见表1D)在以下靶位点处的C到T、A到G和C到G编辑活性：YY-A2。在图40中，紧靠每个影线标记左侧的条形表示C到T的活性，紧靠每个影线标记上方的条形表示A到G的活性，并且紧靠每个影线标记右侧的条形表示C到G的活性。用于制备条形图的对照包括ABE/CBE融合蛋白。候选编辑器S2.20从图40中省略，因为它未能在所评估的靶位点处显示出高水平的C→T特异性活性。
图41呈现了示意图，其提供开发胞嘧啶脱氨酶活性增加的TadA*多肽所进行的实验的概述。在图41中，TADAC表示“作用于DNA腺嘌呤和胞嘧啶的TadA*”，TADC表示“作用于DNA胞嘧啶的TadA*”，TadA*表示“tRNA作用的腺苷脱氨酶A变体”在实施方案中，TADAC和TADC是TadA的工程化变体，当与Cas9连接时，其能够在DNA中产生A·T到G·C和C·G到T·A或C·G到T·A突变。
图42提供了具有显示不同TadA*多肽(参见表1A)之间的关系的蛋白质结构的带状图的示意图。
图43A至43C提供了蛋白质结构、化学结构的带状图以及条形图。图43A提供了显示TadA*8.20的晶体结构的带状图。使用图43A和43B中提供的序列5'-GCTCGGCT/d8AZ/CGGA-3’(SEQ ID NO:411)制备晶体结构。图43A和43B的化学结构显示了2'-脱氧-8-氮杂水粉蕈素(azanebularine)(d8AZ)如何用于捕获与腺苷脱氨有关的过渡态类似物。不受理论约束，TadA*8.20的结构提供了对蛋白质单链DNA(ssDNA)结合的基础的结构见解，并显示在定向进化期间引入的突变改变了C端蛋白质结构，从而有利于ssDNA结合而非tRNA。图43B提供了表1A的变体1.17、1.14和1.19的晶体结构的带状图。图43C提供了条形图，其显示了如ABE8.20和变体1.14，1.17和1.19在靶位点YY-A2处测量的C→T和A→G活性。在图43C中，每个散列标记左边的条形表示C→T活性，并且每个散列标记右边的条形表示A→G或车型。
图44提供了带状图，其显示表1A的变体1.17和TadA*8.20的结构的重叠。不受理论约束，S82T和A142E取代可能与TadA变体1.17的C到T编辑的小值有关。
图45提供了带状图，其显示表1A的变体1.14和TadA*8.20的重叠。不受理论约束，1.14变体中的G112H取代诱导了环-5的结构紊乱(虚线)和构象变化。
图46提供了带状图，其显示对应于表1A的变体1.14的氨基酸取代影响ssDNA结合。不受理论约束，蛋白质结构环-5之后的取代影响ssDNA结合。
图47提供了带状图，其显示表1A的变体1.19和TadA*8.20的晶体结构的重叠。
图48提供了带状图，其显示表1A的变体1.19和TadA*8.20的晶体结构的重叠。不受理论约束，对应于表1A的变体1.19的氨基酸取代诱导C端α-螺旋的结构构象变化(环-1和α-1)和展开。
图49提供了带状图，其显示表1A的变体1.19的晶体结构以及氨基酸取代如何影响ssDNA结合。不受理论约束，蛋白质结构(环-1、α-1和C端)之后的取代影响ssDNA结合。
图50提供了带状图，其显示表1A的变体1.14、1.17和1.19的晶体结构之间的叠加。位置27、49、82、112和/或142处的氨基酸取代影响DNA结合。
图51A和51B提供具有用球体表示的改变位点的TadA*8.20的带状图。图51A提供了带状图，其显示对于组合筛选所选择的10个位点。对应于表1A中的变体1.19、1.17和1.14的位点被圈出，并对应于三个区域。对应于改变的位点用球体显示。来自任何一个区域的突变都足以增加胞嘧啶脱氨的特异性。在定向进化中没有鉴定出在所有三个区域都含有突变的变体，并且几乎没有在超过一个区域中包含突变的变体。制备了199个变体的组合文库，其中每个变体在三个区域的每个区域中都含有至少一个突变：A区中1-2个位点改变；B区中1-2个位点改变；以及C区中1-4个位点改变。图51B提供了TadA*8.20的带状图，其以深灰色圆圈显示对应于表1B的变体S1.154的TadA*8.20多肽的改变，并且以浅灰色圆圈显示在第二轮定向进化筛选中鉴定的8个改变位点的位置(参见表1C)。
图52提供了堆积条形图，其显示在表1D的变体S2.14、S2.46和S2.52的靶位点YY-A2处观察到的最大C→T、A→G和C→G编辑百分比。
图53提供了热图，其显示表1D的变体S2.14、S2.46和S2.52以及BE4、ABE8对照、nCas9和阴性对照在靶位点YY-A2、YY-A17和HEK位点3处的插入缺失形成百分比(参见表24)。
图54A至54E提供了方框图，其描绘表1D的腺苷碱基编辑器变体S2.14、S2.46和S2.52、BE4和ABE8对照在靶位点YY-A2、YY-A6、YY-A7、YY-A12、YY-A17和Hek位点3处评估的平均编辑效率(A→G或C→T)(参见表24)。表1D中列出的变体的碱基编辑窗口的大小为约4至约8个碱基。
图55提供了堆叠条形图，其显示表1D的碱基编辑器变体S2.14、S2.46和S2.52、BE4、ABE8对照、nCas9和阴性对照在靶位点YY-A2处的等位基因分布(即，编辑的特定碱基的分布)(参见表24)。与BE4相比，表1D中的变体具有更紧密的等位基因分布，这与变体也具有更紧密的编辑窗口(即，约4个碱基至约8个碱基)的观察一致。S2.14、S2.46和S2.52变体在位置7处显示出编辑的高度特异性。在另一方面，BE4具有更宽的编辑窗口，许多等位基因在位置12处具有编辑的C。
图56A和56B提供了热图，其显示了R环测定的结果，所述结果证明表1D的变体S2.14、S2.46和S1.52相对于BE4、ABE8对照和nCas9在所示靶位点处表现出低A→G指导物非依赖性脱靶活性(参见表24的A2、A6、A15、A16、A17和A27)。S2.14、S2.46和S1.52变体具有非常低至没有顺式或反式A→G编辑活性，具有低至没有反式C→T编辑活性，并且具有高顺式C→T编辑活性。这些数据表明，表1D的变体具有指导物非依赖性且脱靶的特性，所述特性被降低，因此优于BE4的特性。
图57提供了带状图和阴影图，其描述在实施例4的候选碱基编辑器的合理设计中使用的A区、B区和C区。
具体实施方式
本发明提供具有腺嘌呤和胞嘧啶脱氨酶活性或增加的胞嘧啶脱氨酶活性和降低的腺苷脱氨酶活性的腺苷脱氨蛋白酶变体。本公开还提供包含腺苷脱氨酶变体的融合蛋白、多分子复合物、碱基编辑器和碱基编辑器系统以及使用此类变体的方法。
在一个方面，本发明至少部分基于以下发现：腺苷脱氨酶可以被工程化以使靶多核苷酸(例如，DNA)中的胞嘧啶脱氨，同时保留腺嘌呤脱氨活性。特别地，当在细胞(例如，哺乳动物细胞)中表达时，包含腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统能够将靶多核苷酸(例如，DNA)中的A转化为G且将C转化为T。因此，C到T和A到G编辑可以用单个脱氨酶催化。在一些实施方案中，本文所述的腺苷脱氨酶变体具有近似相等的腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶活性。包含具有腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶活性(例如，近似相等的活性)的脱氨酶变体的碱基编辑器被认为具有“双重编辑活性”。不受理论约束，本文所述的腺苷脱氨酶变体具有提供各种优点的潜力，包括相对于目前可用的双rAPOBEC+TadA编辑器更小的双C到T和A到G编辑器；TadA作为脱氨酶相对于APOBEC的优越特性(例如，更低的脱靶编辑、在嵌入式碱基编辑器(IBE)中使用)，相对于基于两种脱氨酶的系统的均匀等位基因分布；以及在细胞工程化中使用A和C靶标两者的多重编辑的增强应用。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体主要具有胞嘧啶脱氨酶活性，并且具有很少的(如果有的话)腺苷脱氨酶活性。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体具有胞嘧啶脱氨酶活性，并且不具有显著的或不具有可检测的腺苷脱氨酶活性。在实施方案中，腺苷脱氨酶活性小于胞嘧啶脱氨酶活性的约0.01％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。
在另一方面，本发明至少部分基于以下发现：腺苷脱氨酶可以被工程化以使靶多核苷酸(例如，DNA)中的胞嘧啶脱氨，同时最小化腺嘌呤脱氨活性。特别地，当在细胞(例如，哺乳动物细胞)中表达时，包含腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统能够将靶多核苷酸中的C转化为T，并且基本上不会将靶多核苷酸(例如，DNA)中的A转化为G。在一些实施方案中，本文所述的腺苷脱氨酶变体主要具有C到T编辑活性，即，具有比腺苷脱氨酶活性大30％或更多的胞苷脱氨酶活性。不受理论约束，本文所述的腺苷脱氨酶变体具有提供各种优点的潜力，包括相对于APOBEC蛋白更小的尺寸以及因此相对于目前可用的基于rAPOBEC的编辑器更小的C到T编辑器；TadA作为脱氨酶相对于APOBEC的优越特性(例如，更低的脱靶编辑、在嵌入式碱基编辑器(IBE)中使用)，以及扩展C到T应用和细胞工程化的碱基编辑工具库。
本发明的腺苷脱氨酶碱基编辑器变体尤其可用于靶向编辑DNA，例如引入改变调节序列(例如，剪接位点、增强子和转录调节元件)活性的突变或改变编码蛋白(例如，抗体的互补性决定区(CDR))活性的突变。在实施方案中，本发明的腺苷碱基编辑器变体相对于参考CBE(例如，rAPOBEC或BE4)具有减少的指导物非依赖性脱靶编辑特性，与嵌入式碱基编辑器(IBE)架构兼容，相对于基于APOBEC的CBE(例如，BE4)具有更窄的编辑窗口，且/或可以相对于参考CBE(例如，BE4)与增加的中靶编辑进行复用。
靶基因的编辑
本发明提供具有腺嘌呤和胞嘧啶脱氨酶活性的腺苷脱氨酶变体。将包含本文所述的腺苷脱氨酶变体的组合物用于使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶脱氨化。在一些实施方案中，靶多核苷酸为单链或双链。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体使DNA中的腺嘌呤和胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体使单链DNA中的腺嘌呤和胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体使RNA中的腺嘌呤和胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体主要使DNA和/或RNA中的胞嘧啶脱氨(例如，由腺苷脱氨酶变体催化的所有脱氨的大于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或由变体催化的胞嘧啶脱氨的数量是由变体催化的腺嘌呤脱氨的数量的约或至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、500倍或1000倍)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体具有近似相等的胞嘧啶和腺苷脱氨酶活性(例如，这两种活性在彼此相差约10％或20％内)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体主要具有胞嘧啶脱氨酶活性，并且具有很少的(如果有的话)腺苷脱氨酶活性。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体具有胞嘧啶脱氨酶活性，并且不具有显著的或不具有可检测的腺苷脱氨酶活性。在一些实施方案中，靶多核苷酸存在于体外或体内细胞中。在一些实施方案中，细胞为细菌、酵母、真菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)包含细菌TadA脱氨酶变体(例如，ecTadA)。在一些实施方案中，腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)包含截短的TadA脱氨酶变体。在一些实施方案中，腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)包含TadA脱氨酶变体的片段。在一些实施方案中，腺嘌呤或腺苷碱基编辑器(ABE)包含TadA*8.20变体。
在一些实施方案中，本发明的腺苷脱氨酶变体包含一个或多个改变。在一些实施方案中，本发明的腺苷脱氨酶变体是包含一个或多个改变的TadA腺苷脱氨酶，所述改变增加胞嘧啶脱氨酶活性(例如，增加至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍或更多倍)，同时保持腺苷脱氨酸酶活性(例如，参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20或TadA*8.19)活性的至少约30％、40％、50％或更多)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体为细菌TadA脱氨酶变体(例如，ecTadA)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体为截短的TadA脱氨酶变体。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体为TadA脱氨酶变体的片段。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含一个或多个改变的TadA*8变体，所述改变增加胞嘧啶脱氨酶活性(例如，增加至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍或更多倍)，同时保持腺苷脱氨酶活性为参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20或TadA*8.19)的腺苷脱氨酶活性的至少约30％、40％、50％或更多。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含一个或多个改变的TadA*8.20腺苷脱氨酶，所述改变增加胞嘧啶脱氨酶活性(例如，增加至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍或更多倍)，同时保持腺苷脱氨酶活性为参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20或TadA*8.19)活性的至少30％、40％、50％。在一些实施方案中，如本文所提供的腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20或TadA*8.19)具有至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍的增加的胞嘧啶脱氨酶活性。在一些实施方案中，如本文所提供的腺苷脱氨酶变体保持腺苷脱氨蛋白酶活性水平为参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20或TadA*8.19)活性的至少约30％、40％、50％、60％、70％。在一些实施方案中，参考腺苷脱氨酶为TadA*8.20或TadA*8.19。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含一个或多个增加胞嘧啶脱氨酶活性的改变的腺苷脱氨酶，并且具有与以下SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列：
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列和增加胞嘧啶脱氨酶活性的一个或多个改变的腺苷脱氨酶。在各种实施方案中，本发明的一个或多个改变不包括SEQ ID NO:1的位置48处的R氨基酸或另一腺苷脱氨酶中的相应改变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含选自与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的2、4、6、13、27、29、100、112、114、115、162和165的氨基酸位置处的一个或多个改变或另一脱氨酶中的相应改变的腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含选自由与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167组成的组的氨基酸位置处的两个或更多个改变或另一脱氨酶中的相应改变的腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，两个或更多个改变位于选自由以下组成的组的氨基酸位置处：与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的S2X、V4X、F6X、H8X、R13X、T17X、R23X、E27X、P29X、V30X、R47X、A48X、I49X、G67X、Y76X、D77X、S82X、F84X、H96X、G100X、R107X、G112X、A114X、G115X、M118X、D119X、H122X、N127X、A142X、A143X、R147X、Y147X、F149X、A158X、Q159X、A162X、S165X、T166X和D167X，或另一脱氨酶中的相应改变。在各种实施方案中，本发明的改变不包括48R突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含选自与SEQID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的2、4、6、13、27、29、100、112、114、115、162和165的氨基酸位置处的一个或多个改变或另一脱氨酶中的相应改变的腺苷脱氨酶。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含选自由以下组成的组的一个或多个改变的腺苷脱氨酶：与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的S2H、V4K、V4S、V4T、V4Y、F6G、F6H、F6Y、H8Q、R13G、T17A、T17W、R23Q、E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q、E27S、E27G、P29A、P29G、P29K、V30F、V30I、R47G、R47S、A48G、I49K、I49M、I49N、I49Q、I49T、G67W、I76H、I76R、I76W、Y76H、Y76R、Y76W、F84A、F84M、H96N、G100A、G100K、T111H、G112H、A114C、G115M、M118L、H122G、H122R、H122T、N127I、N127K、N127P、A142E、R147H、A158V、Q159S、A162C、A162N、A162Q和S165P，或另一脱氨酶中的相应改变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含选自以下的氨基酸改变组合的腺苷脱氨酶：
E27H、Y76I和F84M；E27H、I49K和Y76I；E27S、I49K、Y76I和A162N；E27K和D119N；E27H和Y76I；E27S、I49K和G67W；E27S、I49K和Y76I；I49T、G67W和H96N；E27C、Y76I和D119N；R13G、E27Q和N127K；T17A、E27H、I49M、Y76I和M118L；I49Q、Y76I和G115M；S2H、I49K、Y76I和G112H；R47S和R107C；H8Q、I49Q和Y76I；T17A、A48G、S82T和A142E；E27G和I49N；E27G、D77G和S165P；E27S、I49K和S82T；E27S、I49K、S82T和G115M；E27S、V30I、I49K和S82T；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G112H和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L和R107C；E27S、I49K、S82T、F84L和G112H；E27S、I49K、S82T、F84L和G115M；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；E27S、P29G、I49K和S82T；E27S、P29G、I49K、S82T和G115M；E27S、P29G、I49K、S82T和A142E；P29G、I49K和S82T；E27G、I49K和S82T；E27G、I49K、S82T、R107C和A142E；V4K、E27H、I49K、Y76I和A114C；V4K、E27H、I49K、Y76I和D77G；F6Y、E27H、I49K、Y76I、G100A和H122R；V4T、E27H、I49K、Y76R和H122G；F6Y、E27H、I49K和Y76W；F6Y、E27H、I49K、Y76I和D119N；F6Y、E27H、I49K、Y76I和A114C；F6Y、E27H、I49K和Y76I；V4K、E27H、I49K、Y76W和H122T；F6G、E27H、I49K、Y76R和G100K；F6H、E27H、I49K、Y76I和H122N；E27H、I49K、Y76I和A114C；F6Y、E27H、I49K、Y76H、H122R和T166I；E27H、I49K、Y76I和N127P；R23Q、E27H、I49K和Y76R；E27H、I49K、Y76H、H122R和A158V；F6Y、E27H、I49K、Y76I和T111H；E27H、I49K、Y76I和R147H；E27H、I49K、Y76I和A143E；F6Y、E27H、I49K和Y76R；T17W、E27H、I49K、Y76H、H122G和A158V；V4S、E27H、I49K、A143E和Q159S；E27H、I49K、Y76I、N127I和A162Q；T17A、E27H和A48G；T17A、E27K和A48G；T17A、E27S和A48G；T17A、E27S、A48G和I49K；T17A、E27G和A48G；T17A、A48G和I49N；T17A、E27G、A48G和I49N；T17A、E27Q和A48G；E27S、I49K、S82T和R107C；E27S、I49K、S82T和G112H；E27S、I49K、S82T和A142E；E27S、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和R107C；E27S、V30I、I49K、S82T和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K和S82T；E27S、V30L、I49K、S82T和R107C；E27S、V30L、I49K、S82T和G112H；E27S、V30L、I49K、S82T和G115M；E27S、V30L、I49K、S82T和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T和F84A；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和R107C；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G112H；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G115M；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G112H；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G115M；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T和F84L；E27S、I49K、S82T、F84L和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T和R107C；E27S、P29G、I49K、S82T和G112H；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29G、I49K、S82T和R107C；P29G、I49K、S82T和G112H；P29G、I49K、S82T和G115M；P29G、I49K、S82T和A142E；P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K和S82T；P29K、I49K、S82T和R107C；P29K、I49K、S82T和G112H；P29K、I49K、S82T和G115M；P29K、I49K、S82T和A142E；P29K、I49K、S82T、R107C和G112H；P29K、I49K、S82T、R107C和G115M；P29K、I49K、S82T、R107C和A142E；P29K、I49K、S82T、G112H和A142E；P29K、I49K、S82T、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K和S82T；P29K、V30I、I49K、S82T和R107C；P29K、V30I、I49K、S82T和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T和F84L；P29K、I49K、S82T、F84L和R107C；P29K、I49K、S82T、F84L和G112H；P29K、I49K、S82T、F84L和G115M；P29K、I49K、S82T、F84L和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T和F84L；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27G、I49K、S82T和R107C；E27G、I49K、S82T和G112H；E27G、I49K、S82T和G115M；E27G、I49K、S82T和A142E；E27G、I49K、S82T、R107C和G112H；E27G、I49K、S82T、R107C和G115M；E27G、I49K、S82T、G112H和A142E；E27G、I49K、S82T、G115M和A142E；E27G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27H、I49K和S82T；E27H、I49K、S82T和R107C；E27H、I49K、S82T和G112H；E27H、I49K、S82T和G115M；E27H、I49K、S82T和A142E；E27H、I49K、S82T、R107C和G112H；E27H、I49K、S82T、R107C和G115M；E27H、I49K、S82T、R107C和A142E；E27H、I49K、S82T、G112H和A142E；E27H、I49K、S82T、G115M和A142E；E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S和S82T；E27S、S82T和R107C；E27S、S82T和G112H；E27S、S82T和G115M；E27S、S82T和A142E；E27S、S82T、R107C和G112H；E27S、S82T、R107C和G115M；E27S、S82T、R107C和A142E；E27S、S82T、G112H和A142E；E27S、S82T、G115M和A142E；E27S、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A和S82T；P29A、S82T和R107C；P29A、S82T和G112H；P29A、S82T和G115M；P29A、S82T和A142E；P29A、S82T、R107C和G112H；P29A、S82T、R107C和G115M；P29A、S82T、R107C和A142E；P29A、S82T、G112H和A142E；P29A、S82T、G115M和A142E；P29A、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I和S82T；E27S、V30I、S82T和R107C；E27S、V30I、S82T和G112H；E27S、V30I、S82T和G115M；E27S、V30I、S82T和A142E；E27S、V30I、S82T、R107C和G112H；E27S、V30I、S82T、R107C和G115M；E27S、V30I、S82T、R107C和A142E；E27S、V30I、S82T、G112H和A142E；E27S、V30I、S82T、G115M和A142E；E27S、V30I、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T和F84L；P29A、V30I、S82T、F84L和R107C；P29A、V30I、S82T、F84L和G112H；P29A、V30I、S82T、F84L和G115M；P29A、V30I、S82T、F84L和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G112H；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G115M；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、G112H和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、P29A、V30L、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；V4K和A114C；V4K和D77G；F6Y、G100A和H122R；V4T、I76R和H122G；F6Y和I76W；F6Y和D119N；F6Y和A114C；V4K、I76W和H122T；F6G、I76R和G100K；F6H和H122N；F6Y、I76H、H122R和T166I；R23Q和I76R；I76H、H122R和A158V；F6Y和T111H；T111H、H122G和A162C；F6Y和I76R；T17W、I76H、H122G和A158V；V4S、I76Y、A143E和Q159S；N127I、A162Q；E27H、Y76I、F84M和F149Y；E27H、I49K、Y76I和F149Y；T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L和F149Y；T17A、A48G、S82T、A142E和F149Y；E27G和F149Y；E27G、I49N和F149Y；E27H、Y76I、F84M、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27H、I49K、Y76I、Y147D、F149Y、T166I、D167N；T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L、Y147D、F149Y、T166I和D167N；T17A、A48G、S82T、A142E、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27G、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27G、I49N、Y147D、F149Y、T166I和D167N；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；以及F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；以上改变属于与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或另一脱氨酶中的相应改变组合。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含选自表1A至1F中任一个列出的那些的氨基酸改变或氨基酸改变组合的腺苷脱氨酶。
能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和/或胞苷脱氨的示例性腺苷脱氨酶变体的残基同一性在下表1A至1F中提供。腺苷脱氨酶变体的进一步实例包括以下1.17变体(参见表1A)：1.17+E27H；1.17+E27K；1.17+E27S；1.17+E27S+I49K；1.17+E27G；1.17+I49N；1.17+E27G+I49N；和1.17+E27Q。在一些实施方案中，本文提供的任何氨基酸改变被保守氨基酸取代。本领域已知的另外的突变还可以添加到本文提供的任何腺苷脱氨酶变体中。
在一些实施方案中，进行碱基编辑以诱导受试者(例如，人)的细胞基因组中的治疗性变化。从受试者收集细胞，并使其与一种或多种指导RNA和核碱基编辑器多肽接触，所述核碱基编辑器多肽包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)(例如，Cas9)和能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶两者脱氨的腺苷脱氨酶变体。在一些实施方案中，使细胞与一种或多种指导RNA和融合蛋白接触，所述融合蛋白包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)(例如，Cas9)和能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶两者脱氨的腺苷脱氨酶变体。在一些实施方案中，napDNAbp是Cas9。
在一些实施方案中，使细胞与多分子复合物接触。在一些实施方案中，使细胞与如本文所提供的碱基编辑器系统接触。在一些实施方案中，如本文所提供的碱基编辑器系统包含腺苷碱基编辑器(ABE)变体。在一些实施方案中，ABE变体为ABE8变体。在一些实施方案中，ABE8变体为ABE8.20变体。在一些实施方案中，包含如本文所提供的ABE变体(例如，ABE8.20变体)的碱基编辑器系统具有A到G和C到T碱基编辑活性。因此，可以将多个编辑引入到受试者(例如，人)的基因组中。靶向A到G和C到T碱基编辑活性两者的能力允许不同地靶向受试者基因组中的多核苷酸以治疗遗传性疾病或病症。
在一些实施方案中，包含本文提供的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统在靶多核苷酸(例如，DNA)中具有至少约30％、40％、50％、60％、70％或更高的C到T编辑活性。在一些实施方案中，相对于包含参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20或TadA*8.19)的参考碱基编辑器系统，包含如本文所提供的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统具有增加的C到T碱基编辑活性(例如，增加至少约30倍、40倍、50倍、60倍、70倍或更多倍)。
在各种情况下，指导RNA中的间隔区序列包含5'和/或3'“G”核苷酸是有利的。在一些情况下，例如，本文提供的任何间隔区序列或指导多核苷酸包含或还包含5'“G”，其中在一些实施方案中，5'“G”与靶序列互补或不互补。在一些实施方案中，将5'“G”添加到尚未含有5'“G”的间隔区序列中。例如，当指导RNA在U6启动子等的控制下表达时，指导RNA包含5'端“G”可能是有利的，因为U6启动子在转录起始位点更倾向于“G”(参见Cong,L.等人“Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science 339:819-823(2013)doi:10.1126/science.1231143)。在一些情况下，将5'端“G”添加到将在启动子的控制下表达的指导多核苷酸(例如，指导RNA)中，但如果或当指导多核苷酸未在启动子的控制下表达时，任选地不添加到指导多核苷酸中。
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表1B.合理设计的候选编辑器(CABE-2s；TADAC-2s)。参考TadA*8.20表示突变。
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在某些实施方案中，本文提供的融合蛋白和多分子复合物包含一个或多个改善融合蛋白或高分子复合物的碱基编辑活性的特征。例如，本文提供的任何融合蛋白或多分子复合物可以包含具有降低的核酸酶活性的Cas9结构域。在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白可以具有不具有核酸酶活性的Cas9结构域(dCas9)，或切割双链DNA分子的一条链的Cas9结构域(称为Cas9切口酶(nCas9))。不受任何特定理论的束缚，催化残基(例如，H840)的存在保持Cas9的活性以切割与靶核碱基相对的未编辑(例如，未甲基化)链。催化残基(例如，D10至A10)的突变阻止了含有靶A残基的编辑链的切割。此类Cas9变体可以根据gRNA定义的靶序列在特定位置产生单链DNA断裂(切口)，从而修复未编辑链，最终导致未编辑链上的核碱基发生变化。
核碱基编辑器
在本文所述的方法和组合物中有用的是编辑、修饰或改变多核苷酸的靶核苷酸序列的核碱基编辑器。本文所述的核碱基编辑器通常包含多核苷酸可编程核苷酸结合结构域和核碱基编辑结构域(例如，腺苷脱氨酶变体结构域)。当与结合的指导多核苷酸(例如，gRNA)结合时，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域可以特异性结合靶多核苷酸序列，从而将碱基编辑器定位到需要被编辑的靶核酸序列。
多核苷酸可编程核苷酸结合结构域
多核苷酸可编程核苷酸结合结构域结合多核苷酸(例如，RNA、DNA)。碱基编辑器的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域本身可以包含一个或多个结构域(例如，一个或多个核酸酶结构域)。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域的核酸酶结构域可以包含核酸内切酶或核酸外切酶。核酸内切酶可以切割双链核酸的单链或双链核酸分子的两条链。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域的核酸酶结构域可以切割靶多核苷酸的零条、一条或两条链。
可并入碱基编辑器的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域的非限制性实例包括CRISPR蛋白衍生结构域、限制性核酸酶、大范围核酸酶、TAL核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)。在一些实施方案中，碱基编辑器包含多核苷酸可编程核苷酸结合结构域，所述多核苷酸可编程核苷酸结合结构域包含天然或修饰的蛋白质或其部分，其通过结合的指导核酸能够在核酸的CRISPR(即，成簇的规律间隔的短回文重复序列)介导的修饰期间结合核酸序列。这种蛋白质在本文中被称为“CRISPR蛋白质”。因此，本文公开了一种碱基编辑器，所述碱基编辑器包含有包含全部或部分CRISPR蛋白(即，包含作为结构域的全部或部分CRISPR蛋白的碱基编辑器，也称为碱基编辑器的“CRISPR蛋白衍生结构域”)的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域。与CRISPR蛋白的野生型或天然版本相比，并入碱基编辑器的CRISPR蛋白衍生结构域可以被修饰。例如，如下所述，CRISPR蛋白衍生结构域可以包含相对于CRISPR蛋白的野生型或天然版本的一个或多个突变、插入、缺失、重排和/或重组。
本文可用的Cas蛋白包括1类和2类。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1或Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Csy4、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Csd1、Csd2、Cst1、Cst2、Csh1、Csh2、Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2c1(例如SEQ ID NO:247)、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i和Cas12j/CasΦ、CARF、DinG、其同系物或其经修饰版本。CRISPR酶可以在靶序列处指导一条或两条链，诸如靶序列内和/或靶序列的互补序列内切割。例如，CRISPR酶可以指导一条或两条链在距靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对内切割。
可使用编码相对于相应的野生型酶突变的CRISPR酶的载体，其使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。Cas蛋白(例如，Cas9、Cas12)或Cas结构域(例如，Cas9、Cas12)可以指与野生型示例性Cas多肽或Cas结构域具有至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性和/或的序列同源性的多肽或结构域。Cas(例如，Cas9、Cas12)可以指Cas蛋白的野生型或修饰形式，其可以包括氨基酸变化，诸如缺失、插入、取代、变体、突变、融合、嵌合体或其任何组合。
在一些实施方案中，碱基编辑器的CRISPR蛋白衍生结构域可以包括来自以下的全部或部分Cas9：溃疡棒状杆菌(Corynebacterium ulcerans)(NCBI Ref：NC_015683.1、NC_017317.1)；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)(NCBI Ref：NC_016782.1、NC_016786.1)；梅毒螺旋体(Spiroplasma syrphidicola)(NCBI Ref：NC_021284.1)；中间普氏菌(Prevotella intermedia)(NCBI Ref：NC_017861.1)；台湾螺原体(Spiroplasmataiwanense)(NCBI Ref：NC_021846.1)；海豚链球菌(Streptococcus iniae)(NCBI Ref：NC_021314.1)；波罗的海贝尔氏菌(Belliella baltica)(NCBI Ref：NC_018010.1)；扭曲冷弯曲菌(Psychroflexus torquis)(NCBI Ref：NC_018721.1)；嗜热链球菌(NCBI Ref：YP_820832.1)；无害李斯特菌(Listeria innocua)(NCBI Ref：NP_472073.1)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(NCBI Ref：YP_002344900.1)；脑膜炎奈瑟菌(NCBI Ref：YP_002342100.1)、化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌。
Cas9核酸酶序列和结构是本领域技术人员熟知的(参见，例如，“Complete genomesequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.等人,Nature 471:602-607(2011)；和“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptivebacterial immunity.”Jinek M.等人,Science 337:816-821(2012)，所述文献各自的全部内容以引用方式并入本文)。Cas9直向同源物已在各种物种中描述，包括但不限于化脓性链球菌和嗜热链球菌。基于本公开，另外的合适的Cas9核酸酶和序列对于本领域技术人员将是显而易见的，并且此类Cas9核酸酶和序列包括来自公开于Chylinski、Rhun和Charpentier,“The tracrRNA and Cas9 families of type IICRISPR-Cas immunitysystems”(2013)RNA Biology 10:5,726-737中的生物体和基因座的Cas9序列；所述文献的全部内容以引用方式并入本文。
高保真Cas9结构域
本公开的一些方面提供了高保真Cas9结构域。高保真Cas9结构域在本领域中是已知的并且描述于例如Kleinstiver,B.P.等人“High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleaseswith no detectable genome-wide off-target effects.”Nature 529,490-495(2016)；和Slaymaker,I.M.等人“Rationally engineered Cas9 nucleases with improvedspecificity.”Science 351,84-88(2015)；所述文献各自的全部内容以引用方式并入本文。示例性高保真Cas9结构域在序列表中提供为SEQ ID NO:248。在一些实施方案中，高保真Cas9结构域是工程化的Cas9结构域，其包含相对于相应的野生型Cas9结构域而言减少Cas9结构域和DNA的糖-磷酸骨架之间的静电相互作用的一个或多个突变。与DNA的糖-磷酸骨架的静电相互作用减少的高保真Cas9结构域具有较少的脱靶效应。在一些实施方案中，Cas9结构域(例如，野生型Cas9结构域(SEQ ID NO:198和201))包含减少Cas9结构域和DNA的糖-磷酸骨架之间的关联的一个或多个突变。在一些实施方案中，Cas9结构域包含一个或多个突变，所述突变将Cas9结构域和DNA的糖-磷酸骨架之间的关联减少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％。
在一些实施方案中，本文提供的任何Cas9融合蛋白包含D10A、N497X、R661X、Q695X和Q926X突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变中的一个或多个，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，高保真Cas9酶为SpCas9(K855A)、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1或超精确Cas9变体(HypaCas9)。在一些实施方案中，修饰的Cas9 eSpCas9(1.1)含有丙氨酸取代，其削弱了HNH/RuvC槽和非靶DNA链之间的相互作用，防止链分离并且在脱靶位点切割。类似地，SpCas9-HF1通过破坏Cas9和DNA磷酸骨架相互作用的丙氨酸取代来减少脱靶编辑。HypaCas9在REC3结构域中含有突变(SpCas9 N692A/M694A/Q695A/H698A)，其增加Cas9校对和靶识别。与野生型Cas9相比，所有三种高保真酶生成更少的脱靶编辑。
排他性减小的Cas9结构域
通常，Cas9蛋白(诸如来自化脓性链球菌的Cas9(spCas9))需要“原型间隔区相邻基序(PAM)”或PAM样基序，其是紧接在被CRISPR细菌适应性免疫系统中的Cas9核酸酶的靶向DNA序列之后的2-6个碱基对的DNA序列。NGG PAM序列的存在是结合特定核酸区域所必需的，其中“NGG”中的“N”是腺苷(A)、胸苷(T)或胞嘧啶(C)，并且G是鸟苷。这可能会限制在基因组中编辑所需碱基的能力。在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑融合蛋白可能需要放置在精确位置，例如包含位于PAM上游的靶碱基的区域。参见例如Komor,A.C.等人,“Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-strandedDNA cleavage”Nature 533,420-424(2016)，其全部内容以引用方式特此并入。能够结合PAM序列的spCas9蛋白的示例性多肽序列在序列表中提供为SEQ ID NO:198、202和249-252。因此，在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白可以含有能够结合不含规范(例如，NGG)PAM序列的核苷酸序列的Cas9结构域。与非规范PAM序列结合的Cas9结构域已在本领域中进行了描述，并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。例如，结合非规范PAM序列的Cas9结构域已描述于Kleintiver,B.P.等人,“Engineered CRISPR-Cas9nucleaseswith altered PAM specificities”Nature 523,481-485(2015)；和Kleintiver,B.P.等人,“Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 bymodifying PAM recognition”Nature Biotechnology 33,1293-1298(2015)中；每一个的全部内容以引用方式特此并入。
切口酶
在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域可以包含切口酶结构域。在本文中，术语“切口酶”是指包含核酸酶结构域的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域，所述核酸酶结构域能够仅切割双链核酸分子(例如，DNA)中两条链中的一条链。在一些实施方案中，切口酶可以通过将一个或多个突变引入活性多核苷酸可编程核苷酸结合结构域中而来源于多核苷酸可编程核苷酸结合结构域的完全催化活性(例如，天然)形式。例如，当多核苷酸可编程核苷酸结合结构域包含来源于Cas9的切口酶结构域时，Cas9衍生的切口酶结构域在位置840处可以包含D10A突变和组氨酸。在这样的实施方案中，残基H840保留催化活性并因此可以切割核酸双链体的单链。在另一个实例中，Cas9衍生的切口酶结构域可以包含H840A突变，而位置10处的氨基酸残基仍然是D。在一些实施方案中，切口酶可以通过去除全部或部分的切口酶活性不需要的核酸酶结构域而来源于多核苷酸可编程核苷酸结合结构域的完全催化活性(例如，天然)形式。例如，在多核苷酸可编程核苷酸结合结构域包含来源于Cas9的切口酶结构域的情况下，Cas9衍生的切口酶结构域可以包含全部或部分RuvC结构域或HNH结构域的缺失。
在一些实施方案中，野生型Cas9对应于或包含以下氨基酸序列：
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(单下划线：HNH结构域；双下划线：RuvC结构域)。
在一些实施方案中，被包含切口酶结构域(例如，Cas9衍生的切口酶结构域、Cas12衍生的切口酶结构域)的碱基编辑器切割的核酸双链体靶多核苷酸序列的链是未被碱基编辑器编辑的链(即，被碱基编辑器切割的链与包含待编辑的碱基的链相反)。在其他实施方案中，包含切口酶结构域(例如，Cas9衍生的切口酶结构域、Cas12衍生的切口酶结构域)的碱基编辑器可以切割被靶向用于编辑的DNA分子的链。在此类实施方案中，非靶向链不被切割。
在一些实施方案中，Cas9核酸酶具有无活性(例如，失活的)DNA切割结构域，即，Cas9是切口酶，被称为“nCas9”蛋白(对于“切口酶”Cas9)。Cas9切口酶可以是能够仅切割双链核酸分子(例如，双链DNA分子)的一条链的Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas9切口酶切割双链核酸分子的靶链，意味着Cas9切口酶切割与结合至Cas9的gRNA(例如，sgRNA)碱基配对(互补)的链。在一些实施方案中，Cas9切口酶包含D10A突变并且在位置840处具有组氨酸。在一些实施方案中，Cas9切口酶切割双链核酸分子的非靶、非碱基编辑的链，意味着Cas9切口酶切割与结合至Cas9的gRNA(例如，sgRNA)非碱基配对的链。在一些实施方案中，Cas9切口酶包含H840A突变并且在位置10处具有天冬氨酸残基，或相应的突变。在一些实施方案中，Cas9切口酶包含与本文提供的任何一种Cas9切口酶至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。基于本公开和本领域知识，另外的合适的Cas9切口酶对于本领域技术人员将是显而易见的，并且在本公开的范围内。
示例性催化Cas9切口酶(nCas9)的氨基酸序列如下：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:202)
Cas9核酸酶具有两个功能性核酸内切酶结构域：RuvC和HNH。Cas9在定位核酸酶结构域的靶结合时经历构象变化，以切割靶DNA的相反链。Cas9介导的DNA切割的最终结果是靶DNA(PAM序列上游约3-4个核苷酸)内的双链断裂(DSB)。然后通过两种一般修复途径之一修复所得DSB：(1)有效但容易出错的非同源末端连接(NHEJ)途径；或(2)效率较低但高保真的同源定向修复(HDR)途径。
非同源末端连接(NHEJ)和/或同源定向修复(HDR)的“效率”可以通过任何方便的方法计算。例如，在一些实施方案中，效率可以用成功的HDR的百分比来表示。例如，surveyor核酸酶测定可以用于产生切割产物，并且产物与底物的比率可以用于计算百分比。例如，作为成功的HDR的结果，可以使用直接切割含有新整合的限制性序列的DNA的surveyor核酸酶。更多切割的底物表示更高百分比的HDR(更高的HDR效率)。作为说明性实施例，可以使用以下等式[(切割产物)/(底物加切割产物)](例如，(b+c)/(a+b+c),其中“a”是DNA底物的谱带强度，并且“b”和“c”是切割产物)计算HDR的分数(百分比)。
在一些实施方案中，效率可以用成功的NHEJ的百分比来表示。例如，T7核酸内切酶I测定可以用于生成切割产物，并且产物与底物的比率可以用于计算NHEJ百分比。T7核酸内切酶I切割由野生型和突变DNA链杂交产生的错配异源双链DNA(NHEJ在原始断裂位点生成小的随机插入或缺失(indel))。更多的切割表示更高百分比的NHEJ(更高的NHEJ效率)。作为说明性实施例，可以使用以下等式(1-(1-(b+c)/(a+b+c))1/2)×100计算NHEJ的分数(百分比)，其中“a”是DNA底物的谱带强度，并且“b”和“c”是切割产物(Ran等人,Cell.2013Sep.12；154(6):1380-9；和Ran等人,Nat Protoc.2013Nov.；8(11):2281–2308)。
NHEJ修复途径是活性最强的修复机制，并且它经常在DSB位点导致小的核苷酸插入或缺失(插入缺失(indels))。NHEJ介导的DSB修复的随机性具有重要的实际意义，因为表达Cas9和gRNA或指导多核苷酸的细胞群体可以导致多种突变。在大多数实施方案中，NHEJ在靶DNA中产生小的插入缺失，导致氨基酸缺失、插入或移码突变，从而导致靶基因的开放阅读框(ORF)内的提前终止密码子。理想的最终结果是靶基因内的功能丧失突变。
虽然NHEJ介导的DSB修复通常会破坏基因的开放阅读框，但同源定向修复(HDR)可以用于产生特定的核苷酸变化，其范围从单个核苷酸变化到大的插入如添加荧光团或标签。
为了利用HDR进行基因编辑，可以使用一种或多种gRNA和Cas9或Cas9切口酶将含有所需序列的DNA修复模板递送到感兴趣的细胞类型中。修复模板可以含有所需的编辑以及紧邻靶标上游和下游的另外的同源序列(称为左同源臂和右同源臂)。每个同源臂的长度可以取决于引入的变化的大小，较大的插入需要更长的同源臂。修复模板可以是单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或双链DNA质粒。HDR的效率普遍较低(＜10％的修饰等位基因)，即使在表达Cas9、gRNA和外源修复模板的细胞中也是如此。HDR的效率可以通过同步细胞来增强，因为HDR发生在细胞周期的S期和G2期。参与NHEJ的化学或遗传抑制基因也可以增加HDR频率。
在一些实施方案中，Cas9是修饰的Cas9。给定的gRNA靶向序列可以在存在部分同源性的整个基因组中具有另外的位点。这些位点称为脱靶位点，并且在设计gRNA时需要考虑。除了优化gRNA设计，还可以通过对Cas9的修饰来增加CRISPR的特异性。Cas9通过两种核酸酶结构域(RuvC和HNH)的组合活性生成双链断裂(DSB)。Cas9切口酶(SpCas9的D10A突变体)保留一个核酸酶结构域并生成DNA缺口而不是DSB。切口酶系统还可以与HDR介导的基因编辑相结合，以进行特定的基因编辑。
催化失活的核酸酶
本文还提供了碱基编辑器，其包含催化失活(即，不能切割靶多核苷酸序列)的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域。在本文中，术语“催化失活”和“核酸酶失活”可以互换使用，指具有导致其不能切割核酸链的一个或多个突变和/或缺失的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域。在一些实施方案中，催化失活的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域碱基编辑器可能由于一个或多个核酸酶结构域中的特定点突变而缺乏核酸酶活性。例如，在碱基编辑器包含Cas9结构域的情况下，Cas9可以包含D10A突变和H840A突变。此类突变使两个核酸酶结构域失活，从而导致核酸酶活性丧失。在其他实施方案中，催化失活的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域可以包含全部或部分催化结构域(例如，RuvC1和/或HNH结构域)的一个或多个缺失。在其他实施方案中，催化死亡的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域包含点突变(例如，D10A或H840A)以及全部或部分核酸酶结构域的缺失。dCas9结构域是本领域已知的，并且描述于例如Qi等人,“Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform forsequence-specific control of gene expression.”Cell.2013；152(5):1173-83中，其全部内容以引用方式并入本文。
基于本公开和本领域知识，另外的合适的无核酸酶活性的dCas9结构域对于本领域技术人员将是显而易见的，并且在本公开的范围内。此类另外的示例性合适的无核酸酶活性的Cas9结构域包括但不限于D10A/H840A、D10A/D839A/H840A和D10A/D839A/H840A/N863A突变结构域(参见，例如，Prashant等人,CAS9 transcriptional ac tivators fortarget specificity screening and paired nickases for coop erative genomeengineering.Nature Biotechnology.2013；31(9):833-838，其全部内容以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，dCas9对应于或包含部分或全部具有一个或多个使Cas9核酸酶活性失活的突变的Cas9氨基酸序列。在一些实施方案中，无核酸酶活性的dCas9结构域包含本文说明的氨基酸序列的D10X突变和H840X突变，或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变，其中X是任何氨基酸变化。在一些实施方案中，无核酸酶活性的dCas9结构域包含本文说明的氨基酸序列的D10A突变和H840A突变，或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变，其中X是任何氨基酸变化。在一些实施方案中，无核酸酶活性的Cas9结构域包含克隆载体pPlatTET-gRNA2(登录号BAV54124)中说明的氨基酸序列。
在一些实施方案中，变体Cas9蛋白可以切割指导靶序列的互补链，但切割双链指导靶序列的非互补链的能力减小。例如，变体Cas9蛋白可以具有减小RuvC结构域的功能的突变(氨基酸取代)。作为非限制性实例，在一些实施方案中，变体Cas9蛋白具有D10A(氨基酸位置10处的天冬氨酸变为丙氨酸)，因此可以切割双链指导靶序列的互补链，但切割双链指导靶序列的非互补链的能力减小(因此当变体Cas9蛋白切割双链靶核酸时导致单链断裂(SSB)而不是双链断裂(DSB))(参见，例如Jinek等人,Science.2012年8月17日；337(6096):816-21)。
在一些实施方案中，变体Cas9蛋白可以切割双链指导靶序列的非互补链，但切割指导靶序列的互补链的能力减小。例如，变体Cas9蛋白可以具有减小HNH结构域(RuvC/HNH/RuvC结构域基序)的功能的突变(氨基酸取代)。作为非限制性实例，在一些实施方案中，变体Cas9蛋白具有H840A(氨基酸位置840处的组氨酸变为丙氨酸)突变，因此可以切割指导靶序列的非互补链，但切割指导靶序列的互补链的能力减小(因此当变体Cas9蛋白切割双链指导靶序列时导致SSB而不是DSB)。此类Cas9蛋白切割指导靶序列(例如，单链指导靶序列)的能力减小，但保留了结合指导靶序列(例如，单链指导靶序列)的能力。
作为另一个非限制性实例，在一些实施方案中，变体Cas9蛋白具有W476A和W1126A突变，使得多肽切割靶DNA的能力减小。此类Cas9蛋白切割靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力减小，但保留了结合靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力。
作为另一个非限制性实例，在一些实施方案中，变体Cas9蛋白具有P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A和D1127A突变，使得多肽切割靶DNA的能力减小。此类Cas9蛋白切割靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力减小，但保留了结合靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力。
作为另一个非限制性实例，在一些实施方案中，变体Cas9蛋白具有H840A、W476A和W1126A突变，使得多肽切割靶DNA的能力减小。此类Cas9蛋白切割靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力减小，但保留了结合靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力。作为另一个非限制性实例，在一些实施方案中，变体Cas9蛋白具有H840A、D10A、W476A和W1126A突变，使得多肽切割靶DNA的能力减小。此类Cas9蛋白切割靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力减小，但保留了结合靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力。在一些实施方案中，变体Cas9已恢复Cas9 HNH结构域(A840H)中位置840处的催化His残基。
作为另一个非限制性实例，在一些实施方案中，变体Cas9蛋白具有H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A和D1127A突变，使得多肽切割靶DNA的能力减小。此类Cas9蛋白切割靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力减小，但保留了结合靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力。作为另一个非限制性实例，在一些实施方案中，变体Cas9蛋白具有D10A、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A和D1127A突变，使得多肽切割靶DNA的能力减小。此类Cas9蛋白切割靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力减小，但保留了结合靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力。在一些实施方案中，当变体Cas9蛋白具有W476A和W1126A突变或当变体Cas9蛋白具有P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A和D1127A突变时，变体Cas9蛋白不能有效地结合PAM序列。因此，在一些此类实施方案中，当此类变体Cas9蛋白用于结合的方法时，所述方法不需要PAM序列。换言之，在一些实施方案中，当此类变体Cas9蛋白用于结合的方法时，所述方法可以包括指导RNA，但是此方法可以在不存在PAM序列的情况下进行(并且因此由指导RNA的靶向片段提供结合的特异性)。可以使其它残基突变以实现以上作用(即，使一个或另一个核酸酶部分失活)。作为非限制性实例，残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986和/或A987可以被改变(即，取代)。同样，除了丙氨酸取代以外的突变也为适合的。
具有减小的催化活性(例如，当Cas9蛋白具有D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986和/或A987突变，例如D10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A和/或D986A时)的变体Cas9蛋白的一些实施方案中，变体Cas9蛋白仍可以以位点特异性方式结合靶DNA(因为它仍被指导DNA导向靶DNA序列)，只要所述变体Cas9蛋白保留了与指导RNA相互作用的能力。
在一些实施方案中，变体Cas蛋白可以是spCas9、spCas9-VRQR、spCas9-VRER、xCas9(sp)、saCas9、saCas9-KKH、spCas9-MQKSER、spCas9-LRKIQK或spCas9-LRVSQL。
在一些实施方案中，Cas9结构域是来自金黄色葡萄球菌的Cas9结构域(SaCas9)。在一些实施方案中，SaCas9结构域是核酸酶活性SaCas9、无核酸酶活性的SaCas9(SaCas9d)或SaCas9切口酶(SaCas9n)。在一些实施方案中，SaCas9包含N579A突变，或在随同提交的序列表中提供的任何氨基酸序列中的相应突变。
在一些实施方案中，SaCas9结构域、SaCas9d结构域或SaCas9n结构域可以结合具有非规范PAM的核酸序列。在一些实施方案中，SaCas9结构域、SaCas9d结构域或SaCas9n结构域可以结合具有NNGRRT或NNGRRV PAM序列的核酸序列。在一些实施方案中，SaCas9结构域包含E781X、N967X和R1014X突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变中的一个或多个，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，SaCas9结构域包含E781K、N967K和R1014H突变中的一个或多个，或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变中的一个或多个。在一些实施方案中，SaCas9结构域包含E781K、N967K和R1014H突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变。
在一些实施方案中，融合蛋白中存在的Cas9结构域之一可以被对PAM序列没有要求的指导核苷酸序列可编程DNA结合蛋白结构域替换。在一些实施方案中，Cas9是SaCas9。SaCas9的残基A579可以从N579突变而得以产生SaCas9切口酶。残基K781、K967和H1014可以从E781、N967和R1014突变而得以产生SaKKH Cas9。
在一些实施方案中，使用包括氨基酸取代D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E和T1337R(SpCas9-MQKFRAER)并且对改变的PAM5'-NGC-3'具有特异性的修饰的SpCas9。
化脓性链球菌Cas9的替代方案可以包括来自在哺乳动物细胞中显示切割活性的Cpf1家族的RNA指导的核酸内切酶。来自普氏菌和弗朗西斯氏菌属1(Francisella 1)的CRISPR(CRISPR/Cpf1)是类似于CRISPR/Cas9系统的DNA编辑技术。Cpf1是II类CRISPR/Cas系统的RNA指导的核酸内切酶。这种获得性免疫机制存在于普氏菌和弗朗西斯氏菌属的细菌中。Cpf1基因与CRISPR基因座相关，编码使用指导RNA以寻找和切割病毒DNA的核酸内切酶。Cpf1是比Cas9更小、更简单的核酸内切酶，克服了一些CRISPR/Cas9系统限制。与Cas9核酸酶不同，Cpf1介导的DNA切割的结果是具有短3'悬突的双链断裂。Cpf1的交错切割模式可以开辟定向基因转移的可能性，类似于传统的限制酶克隆，这可以提高基因编辑的效率。与上述Cas9变体和直向同源物一样，Cpf1也可以将可以被CRISPR靶向的位点数量扩展至缺乏SpCas9所偏爱的NGG PAM位点的富含AT的区域或富含AT的基因组。Cpf1基因座含有混合α/β结构域、RuvC-I(后跟螺旋区域)、RuvC-II和锌指样结构域。Cpf1蛋白具有与Cas9的RuvC结构域类似的RuvC样核酸内切酶结构域。
此外，与Cas9不同，Cpf1没有HNH核酸内切酶结构域，并且Cpf1的N端没有Cas9的α-螺旋识别叶。Cpf1 CRISPR-Cas结构域架构显示Cpf1在功能上是独特的，被归类为2类V型CRISPR系统。Cpf1基因座编码Cas1、Cas2和Cas4蛋白，所述蛋白相比于II型系统更类似I型和III型系统。功能性Cpf1不需要反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)，因此，只需要CRISPR(crRNA)。这有利于基因组编辑，因为Cpf1不仅比Cas9小，而且它具有更小的sgRNA分子(大约是Cas9的核苷酸的一半)。与Cas9靶向的富含G的PAM相比，Cpf1-crRNA复合物通过鉴定原型间隔区相邻基序5'-YTN-3'或5'-TTN-3'来切割靶DNA或RNA。在鉴定出PAM后，Cpf1引入了具有4或5个核苷酸悬突的粘性末端样DNA双链断裂。
在一些实施方案中，Cas9是对改变的PAM序列具有特异性的Cas9变体。在一些实施方案中，另外的Cas9变体和PAM序列描述于Miller,S.M.等人Continuous evolution ofSpCas9 variants compatible with non-G PAMs,Nat.Biotechnol.(2020)，其全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，Cas9变体没有特定的PAM要求。在一些实施方案中，Cas9变体例如SpCas9变体对NRNH PAM具有特异性，其中R是A或G并且H是A、C或T。在一些实施方案中，SpCas9变体对PAM序列AAA、TAA、CAA、GAA、TAT、GAT或CAC具有特异性。在一些实施方案中，SpCas9变体包含在位置1114、1134、1135、1137、1139、1151、1180、1188、1211、1218、1219、1221、1249、1256、1264、1290、1318、1317、1320、1321、1323、1332、1333、1335、1337或1339或其相应位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，SpCas9变体包含在位置1114、1135、1218、1219、1221、1249、1320、1321、1323、1332、1333、1335或1337或其相应位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，SpCas9变体包含在位置1114、1134、1135、1137、1139、1151、1180、1188、1211、1219、1221、1256、1264、1290、1318、1317、1320、1323、1333或其相应位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，SpCas9变体包含在位置1114、1131、1135、1150、1156、1180、1191、1218、1219、1221、1227、1249、1253、1286、1293、1320、1321、1332、1335、1339或其相应位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，SpCas9变体包含在位置1114、1127、1135、1180、1207、1219、1234、1286、1301、1332、1335、1337、1338或1349或其相应位置处的氨基酸取代。SpCas9变体的示例性氨基酸取代和PAM特异性显示在表2A至表2D中。
表2A SpCas9变体
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具有修饰的PAM识别的其他示例性Cas9(例如，SaCas9)多肽描述于Kleinstiver等人"Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 bymodifying PAM recognition,"Nature Biotechnology,33:1293-1298(2015)DOI:10.1038/nbt.3404，出于所有目的，其公开内容以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，包含改变E782K、N929R、N968K和/或R1015H中的一个或多个的Cas9变体(例如，SaCas9变体)相对于参考多肽(例如，SaCas9)在NNNRRT或NNHRRT PAM序列处具有对增加的编辑活性的特异性或与其相关，其中N表示任何核苷酸，H表示除G以外的任何核苷酸(即，“非G”)，并且R表示嘌呤。在实施方案中，Cas9变体(例如，SaCas9变体)包含改变E782K、N968K和R1015H或改变E782K、K929R和R1015H。
在一些实施方案中，核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)是微生物CRISPR-Cas系统的单效应子。微生物CRISPR-Cas系统的单效应子包括但不限于Cas9、Cpf1、Cas12b/C2c1和Cas12c/C2c3。通常，微生物CRISPR-Cas系统分为1类和2类系统。1类系统具有多亚基效应子复合物，而2类系统具有单蛋白质效应子。例如，Cas9和Cpf1是2类效应子。除了Cas9和Cpf1，三种不同的2类CRISPR-Cas系统(Cas12b/C2c1和Cas12c/C2c3)已经描述于Shmakov等人,“Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2CRISPR CasSystems”,Mol.Cell,2015年11月5日；60(3):385-397，其全部内容以引用方式特此并入。两个系统的效应子Cas12b/C2c1和Cas12c/C2c3含有与Cpf1相关的RuvC样核酸内切酶结构域。第三个系统含有具有两个预测的HEPN RNA酶结构域的效应子。成熟CRISPR RNA的产生不依赖于tracrRNA，与通过Cas12b/C2c1产生CRISPR RNA不同。Cas12b/C2c1依赖于用于DNA切割的CRISPR RNA和tracrRNA。
在一些实施方案中，napDNAbp是环状置换物(例如，SEQ ID NO:253)。
据报道，酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobaccillus acidoterrastris)Cas12b/C2c1(AacC2c1)的晶体结构与嵌合单分子指导RNA(sgRNA)复合。参见例如，Liu等人,“C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism”,Mol.Cell,2017年1月19日；65(2):310-322，其全部内容以引用方式特此并入。还报道了与靶DNA结合为三元复合物的酸土脂环酸芽孢杆菌C2c1中的晶体结构。参见例如，Yang等人,“PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Casendonuclease”,Cell,2016年12月15日；167(7):1814-1828，其全部内容以引用方式特此并入。AacC2c1的具有催化能力的构象(具有靶DNA链和非靶DNA链)已被独立捕获，定位在单个RuvC催化口袋内，具有Cas12b/C2c1介导的导致靶DNA的交错的7个核苷酸断裂的切割。Cas12b/C2c1三元复合物和先前鉴定的Cas9和Cpf1对应物之间的结构比较证明了CRISPR-Cas9系统使用的机制的多样性。
在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白的核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)可以是Cas12b/C2c1或Cas12c/C2c3蛋白质。在一些实施方案中，napDNAbp是Cas12b/C2c1蛋白质。在一些实施方案中，napDNAbp是Cas12c/C2c3蛋白质。在一些实施方案中，napDNAbp包含与天然存在的Cas12b/C2c1或Cas12c/C2c3蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，napDNAbp是天然存在的Cas12b/C2c1或者Cas12c/C2c3蛋白。在一些实施方案中，napDNAbp包含与本文提供的napDNAbp序列中的任何一个至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。应当理解，根据本公开也可以使用来自其他菌种的Cas12b/C2c1或Cas12c/C2c3。
在一些实施方案中，napDNAbp是指Cas12c。在一些实施方案中，Cas12c蛋白是Cas12c1(SEQ ID NO:254)或Cas12c1的变体。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12c2(SEQID NO:255)或Cas12c2的变体。在一些实施方案中，Cas12蛋白是来自嗜油菌属(Oleiphilussp.)HI0009的Cas12c蛋白(即，OspCas12c；SEQ ID NO:256)或OspCas12c的变体。这些Cas12c分子已描述于Yan等人,“Functionally Diverse Type V CRISPR-Cas Systems,”Science,2019年1月4日；363:88-91；其全部内容以引用方式特此并入。在一些实施方案中，napDNAbp包含与天然存在的Cas12c1、Cas12c2或OspCas12c蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，napDNAbp是天然存在的Cas12c1、Cas12c2或OspCas12c蛋白。在一些实施方案中，napDNAbp包含与本文提供的任何Cas12c1、Cas12c2或OspCas12c蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。应当理解，根据本公开也可以使用来自其他菌种的Cas12c1、Cas12c2或OspCas12c。
在一些实施方案中，napDNAbp是指Cas12g、Cas12h或Cas12i，它们已描述于例如Yan等人,“Functionally Diverse Type VCRISPR-Cas Systems,”Science,2019年1月4日；363:88-91；每一个的全部内容均以引用方式特此并入。示例性Cas12g、Cas12h和Cas12i多肽序列在序列表中提供为SEQ ID NO:257-260。通过聚合超过10垓字节的序列数据，鉴定了V型Cas蛋白的新分类，这些分类与先前表征的V类蛋白(包括Cas12g、Cas12h和Cas12i)表现出弱类似性。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12g或Cas12g的变体。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12h或Cas12h的变体。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12i或Cas12i的变体。应当理解，其他RNA指导的DNA结合蛋白可以用作napDNAbp，并且在本公开的范围内。在一些实施方案中，napDNAbp包含与天然存在的Cas12g、Cas12h或Cas12i蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，napDNAbp是天然存在的Cas12g、Cas12h或Cas12i蛋白。在一些实施方案中，napDNAbp包含与本文提供的任何Cas12g、Cas12h或Cas12i蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。应当理解，根据本公开也可以使用来自其他菌种的Cas12g、Cas12h或Cas12i。在一些实施方案中，Cas12i是Cas12i1或Cas12i2。
在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白的核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)可以是或Cas12j/CasΦ蛋白。Cas12j/CasΦ描述于Pausch等人,“CRISPR-CasΦfrom huge phages is ahypercompact genome editor,”Science,17July 2020,Vol.369,Issue6501,pp.333-337，其以引用方式全文并入本文。在一些实施方案中，napDNAbp包含与Cas12j/CasΦ蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，napDNAbp是天然存在的Cas12j/CasΦ蛋白。在一些实施方案中，napDNAbp是无核酸酶活性的(“失活的”)Cas12j/CasΦ蛋白。应当理解，根据本公开也可以使用来自其他菌种的Cas12j/CasΦ。
具有内部插入的融合蛋白
本文提供了包含与核酸可编程核酸结合蛋白(例如，napDNAbp)融合的异源多肽的融合蛋白。异源多肽可以是在天然或野生型napDNAbp多肽序列中未发现的多肽。异源多肽可以在napDNAbp的C端、napDNAbp的N端融合到napDNAbp，或插入到napDNAbp的内部位置。在一些实施方案中，异源多肽是脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)或其功能片段。例如，融合蛋白可以包含侧翼为Cas9或Cas12(例如，Cas12b/C2c1)多肽的N端片段和C端片段的脱氨酶。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是TadA变体(例如，TadA*8变体)。在一些实施方案中，TadA是TadA*8变体。在一些实施方案中，TadA*8是包含增加胞苷脱氨活性的一个或多个改变的TadA*8.20。如本文所述的TadA序列(例如，TadA*8)是用于上述融合蛋白的合适的脱氨酶。
在一些实施方案中，融合蛋白包括以下结构：
NH2-[napDNAbp的N端片段]-[脱氨酶]-[napDNAbp的C端片段]-COOH；
NH2-[Cas9的N端片段]-[腺苷脱氨酶]-[Cas9的C端片段]-COOH；
NH2-[Cas12的N端片段]-[腺苷脱氨酶]-[Cas12的C端片段]-COOH；
其中“]-[”的每个实例是任选的接头。
脱氨酶可以是环状置换脱氨酶。例如，脱氨酶可以是环状置换腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，脱氨酶是环状置换物TadA，在TadA参考序列中编号的氨基酸残基116、136或65处环状置换。
融合蛋白可以包含多于一种脱氨酶。融合蛋白可以包含例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种脱氨酶。在一些实施方案中，融合蛋白包含一种或两种脱氨酶。两种或更多种脱氨酶可以是同二聚体或异二聚体。两种或更多种脱氨酶可以串联插入到napDNAbp中。在一些实施方案中，两种或更多种脱氨酶在napDNAbp中可以不串联。
在一些实施方案中，融合蛋白中的napDNAbp是Cas9多肽或其片段。Cas9多肽可以是变体Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9多肽是Cas9切口酶(nCas9)多肽或其片段。在一些实施方案中，Cas9多肽是核酸酶失活的Cas9(dCas9)多肽或其片段。融合蛋白中的Cas9多肽可以是全长Cas9多肽。在一些情况下，融合蛋白中的Cas9多肽可以不是全长Cas9多肽。Cas9多肽可以例如在相对于天然存在的Cas9蛋白的N端或C端被截短。Cas9多肽可以是环状置换的Cas9蛋白。Cas9多肽可以是仍然能够结合靶多核苷酸和指导核酸序列的Cas9多肽的片段、部分或结构域。
在一些实施方案中，Cas9多肽是化脓性链球菌Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、嗜热链球菌1Cas9(St1Cas9)或本文所述的任何Cas9多肽的片段或变体。
在各种实施方案中，催化结构域具有DNA修饰活性(例如，脱氨酶活性)，诸如腺苷脱氨酶活性和/或胞嘧啶脱氨酶活性。在各种实施方案中，催化结构域具有腺苷脱氨酶活性和/或胞嘧啶脱氨酶活性两者。在各种实施方案中，腺苷脱氨酶变体的结构域包含一个或多个增加胞嘧啶脱氨酶活性的改变。
异源多肽(例如，脱氨酶)可以插入到napDNAbp(例如，Cas9或Cas12(例如，Cas12b/C2c1))的合适位置中，例如使得napDNAbp保留其结合靶多核苷酸和指导核酸的能力。脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)可以插入到napDNAbp中而不损害脱氨酶的功能(例如，碱基编辑活性)或napDNAbp的功能(例如，结合靶核酸和指导核酸的能力)。脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)可以插入到napDNAbp中的例如如晶体学研究所示的无序区域或包含高温因子或B因子的区域处。不太有序、无序或非结构化的蛋白质区域，例如溶剂暴露区域和环，可以用于插入而不损害结构或功能。脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)可以插入到napDNAbp中的柔性环区域或溶剂暴露区域。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入到Cas9的柔性环或Cas12b/C2c1多肽中。
在一些实施方案中，通过Cas9多肽的晶体结构的B因子分析来确定脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)的插入位置。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入到包含高于平均水平的B因子(例如，与包含无序区域的总蛋白或蛋白质结构域相比更高的B因子)的Cas9多肽区域中。B因子或温度因子可以指示原子相对于其平均位置的波动(例如，由于晶格中的温度依赖性原子振动或静态无序)。主链原子的高B因子(例如，高于平均B因子)可以指示具有相对高局部迁移率的区域。此区域可以用于插入脱氨酶而不损害结构或功能。可以将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在有具有Cα原子的残基的位置，所述Cα原子的B因子比总蛋白质的平均B因子多50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或高于200％。可以将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在有具有Cα原子的残基的位置，所述Cα原子的B因子比包含残基的Cas9蛋白结构域的平均B因子多50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或高于200％。包含高于平均水平的B因子的Cas9多肽的位置可以包括例如在以上Cas9参考序列中编号的残基768、792、1052、1015、1022、1026、1029、1067、1040、1054、1068、1246、1247和1248。包含高于平均水平的B因子的Cas9多肽区域可以包含例如在以上Cas9参考序列中编号的残基792-872、792-906和2-791。
可以将异源多肽(例如，脱氨酶)插入到napDNAbp中选自由以下组成的组的氨基酸残基处：在以上Cas9参考序列中编号的768、791、792、1015、1016、1022、1023、1026、1029、1040、1052、1054、1067、1068、1069、1246、1247和1248，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。在一些实施方案中，将异源多肽插入到在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸位置768-769、791-792、792-793、1015-1016、1022-1023、1026-1027、1029-1030、1040-1041、1052-1053、1054-1055、1067-1068、1068-1069、1247-1248或1248-1249或其相应氨基酸位置之间。在一些实施方案中，将异源多肽插入到在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸位置769-770、792-793、793-794、1016-1017、1023-1024、1027-1028、1030-1031、1041-1042、1053-1054、1055-1056、1068-1069、1069-1070、1248-1249或1249-1250或其相应氨基酸位置之间。在一些实施方案中，将异源多肽替换选自由以下组成的组的氨基酸残基：在以上Cas9参考序列中编号的768、791、792、1015、1016、1022、1023、1026、1029、1040、1052、1054、1067、1068、1069、1246、1247和1248，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。应当理解，对以上Cas9参考序列关于插入位置的引用是出于说明性目的。如本文所讨论的插入不限于以上Cas9参考序列的Cas9多肽序列，但包括在变体Cas9多肽(例如Cas9切口酶(nCas9)、核酸酶失活的Cas9(dCas9)、缺少核酸酶结构域的Cas9变体、截短的Cas9或缺少部分或完整HNH结构域的Cas9结构域)中的相应位置的插入。
可以将异源多肽(例如，腺苷脱氨酶变体)插入到napDNAbp中选自由以下组成的组的氨基酸残基处：在以上Cas9参考序列中编号的768、792、1022、1026、1040、1068和1247，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。在一些实施方案中，将异源多肽插入到以上Cas9参考序列中编号的氨基酸位置768-769、792-793、1022-1023、1026-1027、1029-1030、1040-1041、1068-1069或1247-1248或其相应氨基酸位置之间。在一些实施方案中，将异源多肽插入到以上Cas9参考序列中编号的氨基酸位置769-770、793-794、1023-1024、1027-1028、1030-1031、1041-1042、1069-1070或1248-1249或其相应氨基酸位置之间。在一些实施方案中，将异源多肽替换选自由以下组成的组的氨基酸残基：在以上Cas9参考序列中编号的768、792、1022、1026、1040、1068和1247，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
可以将异源多肽(例如，腺苷脱氨酶变体)插入到如本文所述的napDNAbp中的氨基酸残基处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一个实施方案中，可以将异源多肽(例如，脱氨酶)插入到napDNAbp中选自由以下组成的组的氨基酸残基处：在以上Cas9参考序列中编号的1002、1003、1025、1052-1056、1242-1247、1061-1077、943-947、686-691、569-578、530-539和1060-1077，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。可以将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在残基的N端或C端或替换残基。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在残基的C端。
在一些实施方案中，将腺苷脱氨酶变体(例如，TadA变体)插入在选自由以下组成的组的氨基酸残基处：在以上Cas9参考序列中编号的1015、1022、1029、1040、1068、1247、1054、1026、768、1067、1248、1052和1246，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。在一些实施方案中，插入腺苷脱氨酶变体(例如，TadA变体)替换在以上Cas9参考序列中编号的残基792-872、792-906或2-791，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。在一些实施方案中，将腺苷脱氨酶变体插入在选自由以下组成的组的氨基酸的N端：在以上Cas9参考序列中编号的1015、1022、1029、1040、1068、1247、1054、1026、768、1067、1248、1052和1246，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。在一些实施方案中，将腺苷脱氨酶变体插入在选自由以下组成的组的氨基酸的C端：在以上Cas9参考序列中编号的1015、1022、1029、1040、1068、1247、1054、1026、768、1067、1248、1052和1246，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。在一些实施方案中，插入腺苷脱氨酶变体以替换选自由以下组成的组的氨基酸：在以上Cas9参考序列中编号的1015、1022、1029、1040、1068、1247、1054、1026、768、1067、1248、1052和1246，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基768处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基768的N端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基768的C端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，插入脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)以替换在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基768，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基791或氨基酸残基792处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基791的N端或氨基酸792的N端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸791的C端或氨基酸792的N端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，插入脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)以替换在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸791或氨基酸792，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1016处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1016的N端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1016的C端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，插入脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)以替换在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1016，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1022或氨基酸残基1023处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1022的N端或氨基酸残基1023的N端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1022的C端或氨基酸残基1023的C端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，插入脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)以替换在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1022或氨基酸残基1023，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1026或氨基酸残基1029处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1026的N端或氨基酸残基1029的N端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1026的C端或氨基酸残基1029的C端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，插入脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)以替换在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1026或氨基酸残基1029，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1040处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1040的N端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1040的C端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，插入脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)以替换在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1040，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1052或氨基酸残基1054处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1052的N端或氨基酸残基1054的N端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1052的C端或氨基酸残基1054的C端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，插入脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)以替换在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1052或氨基酸残基1054，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1067或氨基酸残基1068或氨基酸残基1069处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1067的N端或氨基酸残基1068的N端或氨基酸残基1069的N端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1067的C端或氨基酸残基1068的C端或氨基酸残基1069的C端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，插入脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)以替换在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1067或氨基酸残基1068或氨基酸残基1069，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1246或氨基酸残基1247或氨基酸残基1248处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1246的N端或氨基酸残基1247的N端或氨基酸残基1248的N端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，将脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)插入在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1246的C端或氨基酸残基1247的C端或氨基酸残基1248的C端处，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。在一些实施方案中，插入脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)以替换在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1246或氨基酸残基1247或氨基酸残基1248，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
在一些实施方案中，将异源多肽(例如，腺苷脱氨酶变体)插入到Cas9多肽的柔性环中。柔性环部分可以选自由以下组成的组：在以上Cas9参考序列中编号的530-537、569-570、686-691、943-947、1002-1025、1052-1077、1232-1247或1298-1300，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。柔性环部分可以选自由以下组成的组：在以上Cas9参考序列中编号的1-529、538-568、580-685、692-942、948-1001、1026-1051、1078-1231或1248-1297，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
可以将异源多肽(例如，腺嘌呤脱氨酶变体)插入到对应于以下氨基酸残基的Cas9多肽区域：在以上Cas9参考序列中编号的1017-1069、1242-1247、1052-1056、1060-1077、1002-1003、943-947、530-537、568-579、686-691、1242-1247、1298–1300、1066-1077、1052-1056或1060-1077，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。
可以插入异源多肽(例如，腺嘌呤脱氨酶变体)替换Cas9多肽的缺失区域。缺失的区域可以对应于Cas9多肽的N端或C端部分。在一些实施方案中，缺失的区域对应于在以上Cas9参考序列中编号的残基792-872，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。在一些实施方案中，缺失的区域对应于在以上Cas9参考序列中编号的残基792-906，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。在一些实施方案中，缺失的区域对应于在以上Cas9参考序列中编号的残基2-791，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。在一些实施方案中，缺失的区域对应于在以上Cas9参考序列中编号的残基1017-1069，或其响应氨基酸残基。
示例性内部融合碱基编辑器提供于下表3中：
表3：Cas9蛋白中的插入基因座
可以将异源多肽(例如，腺苷脱氨酶变体)插入到Cas9多肽的结构或功能结构域内。可以将异源多肽(例如，腺苷脱氨酶变体)插入到Cas9多肽的两个结构或功能结构域之间。可以插入异源多肽(例如，腺苷脱氨酶变体)替换Cas9多肽的结构或功能结构域，例如在从Cas9多肽删除结构域之后。Cas9多肽的结构或功能结构域可以包括例如RuvC I、RuvCII、RuvC III、Rec1、Rec2、PI或HNH。
在一些实施方案中，Cas9多肽不含一个或多个选自由以下组成的组的结构域：RuvC I、RuvC II、RuvC III、Rec1、Rec2、PI或HNH结构域。在一些实施方案中，Cas9多肽不含核酸酶结构域。在一些实施方案中，Cas9多肽不含HNH结构域。在一些实施方案中，Cas9多肽不含部分HNH结构域，使得Cas9多肽具有减小的或消除的HNH活性。在一些实施方案中，Cas9多肽包含核酸酶结构域的缺失，并且插入脱氨酶以替换核酸酶结构域。在一些实施方案中，删除HNH结构域并且在其位置插入脱氨酶。在一些实施方案中，删除一个或多个RuvC结构域并且在其位置插入脱氨酶。
包含异源多肽的融合蛋白的侧翼可以是napDNAbp的N端和C端片段。在一些实施方案中，融合蛋白包含侧翼为Cas9多肽的N端片段和C端片段的腺苷脱氨酶变体。N端片段或C端片段可以结合靶多核苷酸序列。N端片段的C端或C端片段的N端可以包含Cas9多肽的柔性环的一部分。N端片段的C端或C端片段的N端可以包含Cas9多肽的α-螺旋结构的一部分。N端片段或C端片段可以包含DNA结合结构域。N端片段或C端片段可以包含RuvC结构域。N端片段或C端片段可以包含HNH结构域。在一些实施方案中，N端片段和C端片段都不包含HNH结构域。
在一些实施方案中，N端Cas9片段的C端包含当融合蛋白使靶核碱基脱氨时接近靶核碱基的氨基酸。在一些实施方案中，C端Cas9片段的N端包含当融合蛋白使靶核碱基脱氨时接近靶核碱基的氨基酸。不同脱氨酶的插入位置可以不同，以使靶核碱基与N端Cas9片段的C端或C端Cas9片段的N端中的氨基酸接近。例如，脱氨酶的插入位置可以在选自由以下组成的组的氨基酸残基处：在以上Cas9参考序列中编号的1015、1022、1029、1040、1068、1247、1054、1026、768、1067、1248、1052和1246，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基处。
融合蛋白的N端Cas9片段(即融合蛋白中脱氨酶侧翼的N端Cas9片段)可以包含Cas9多肽的N端。融合蛋白的N端Cas9片段可以包含至少约100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个或1300个氨基酸的长度。融合蛋白的N端Cas9片段可以包含对应于以下氨基酸残基的序列：在以上Cas9参考序列中编号的1-56、1-95、1-200、1-300、1-400、1-500、1-600、1-700、1-718、1-765、1-780、1-906、1-918或1-1100，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。N端Cas9片段可以包含与在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1-56、1-95、1-200、1-300、1-400、1-500、1-600、1-700、1-718、1-765、1-780、1-906、1-918或1-1100或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
融合蛋白的C端Cas9片段(即融合蛋白中脱氨酶侧翼的C端Cas9片段)可以包含Cas9多肽的C端。融合蛋白的C端Cas9片段可以包含至少约100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个或1300个氨基酸的长度。融合蛋白的C端Cas9片段可以包含对应于以下氨基酸残基的序列：在以上Cas9参考序列中编号的1099-1368、918-1368、906-1368、780-1368、765-1368、718-1368、94-1368或56-1368，或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基。N端Cas9片段可以包含与在以上Cas9参考序列中编号的氨基酸残基1099-1368、918-1368、906-1368、780-1368、765-1368、718-1368、94-1368或56-1368或另一Cas9多肽中的相应氨基酸残基具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
融合蛋白的N端Cas9片段和C端Cas9片段合在一起可能不对应于全长天然存在的Cas9多肽序列，例如，如在以上Cas9参考序列中说明的。
本文所述的融合蛋白可以实现靶向脱氨，同时减少非靶位点(例如脱靶位点)的脱氨，诸如减少全基因组的假脱氨。本文所述的融合蛋白可以实现靶向脱氨，同时减少非靶位点的旁观者脱氨。与例如包含与Cas9多肽的N端或C端融合的脱氨酶的末端融合蛋白相比，不需要的脱氨或脱靶脱氨可以减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。与例如包含与Cas9多肽的N端或C端融合的脱氨酶的末端融合蛋白相比，不需要的脱氨或脱靶脱氨可以减少至少一倍、至少二倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少十倍、至少十五倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍、至少五十倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少一百倍。
在一些实施方案中，融合蛋白的脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)使R环范围内的不超过两个核碱基脱氨。在一些实施方案中，融合蛋白的脱氨酶使R环范围内的不超过三个核碱基脱氨。在一些实施方案中，融合蛋白的脱氨酶使R环范围内的不超过2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核碱基脱氨。R环是包含DNA:RNA杂交、DNA:DNA或RNA:RNA互补结构并与单链DNA缔合的三链核酸结构。如本文所用，当靶多核苷酸与CRISPR复合物或碱基编辑复合物接触时可以形成R环，其中指导多核苷酸(例如指导RNA)的一部分与靶多核苷酸的一部分杂交并用靶多核苷酸(例如靶DNA)的一部分置换。在一些实施方案中，R环包含间隔区序列和靶DNA互补序列的杂交区域。R环区域的长度可以是约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核碱基对。在一些实施方案中，R环区域的长度为约20个核碱基对。应当理解，如本文所用，R环区域不限于与指导多核苷酸杂交的靶DNA链。例如，R环区域内的靶核碱基的编辑可以针对包含指导RNA互补链的DNA链，或者可以针对作为指导RNA互补链的相反链的DNA链。在一些实施方案中，R环中的编辑包括将非互补链(原型间隔链)上的核碱基编辑为靶DNA序列中的指导RNA。
本文所述的融合蛋白可以在不同于规范碱基编辑的编辑窗口中实现靶标脱氨。在一些实施方案中，靶核碱基位于靶多核苷酸序列中PAM序列上游约1至约20个碱基处。在一些实施方案中，靶核碱基位于靶多核苷酸序列中PAM序列上游约2至约12个碱基处。在一些实施方案中，靶核碱基在远离PAM序列或PAM序列上游约1至9个碱基对、约2至10个碱基对、约3至11个碱基对、约4至12个碱基对、约5至13个碱基对、约6至14个碱基对、约7至15个碱基对、约8至16个碱基对、约9至17个碱基对、约10至18个碱基对、约11至19个碱基对、约12至20个碱基对、约1至7个碱基对、约2至8个碱基对、约3至9个碱基对、约4至10个碱基对、约5至11个碱基对、约6至12个碱基对、约7至13个碱基对、约8至14个碱基对、约9至15个碱基对、约10至16个碱基对、约11至17个碱基对、约12至18个碱基对、约13至19个碱基对、约14至20个碱基对、约1至5个碱基对、约2至6个碱基对、约3至7个碱基对、约4至8个碱基对、约5至9个碱基对、约6至10个碱基对、约7至11个碱基对、约8至12个碱基对、约9至13个碱基对、约10至14个碱基对、约11至15个碱基对、约12至16个碱基对、约13至17个碱基对、约14至18个碱基对、约15至19个碱基对、约16至20个碱基对、约1至3个碱基对、约2至4个碱基对、约3至5个碱基对、约4至6个碱基对、约5至7个碱基对、约6至8个碱基对、约7至9个碱基对、约8至10个碱基对、约9至11个碱基对、约10至12个碱基对、约11至13个碱基对、约12至14个碱基对、约13至15个碱基对、约14至16个碱基对、约15至17个碱基对、约16至18个碱基对、约17至19个碱基对、约18至20个碱基对。在一些实施方案中，靶核碱基在远离PAM序列或PAM序列上游1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个碱基对。在一些实施方案中，靶核碱基在PAM序列上游约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个碱基对处。在一些实施方案中，靶核碱基在PAM序列上游约2个、3个、4个或6个碱基对处。
融合蛋白可以包含多于一种异源多肽。例如，融合蛋白可以另外包含一个或多个UGI结构域和/或一种或多种核定位信号。两个或更多个异源结构域可以串联插入。两个或更多个异源结构域可以插入到使得它们在NapDNAbp中不串联的位置。
融合蛋白可以在脱氨酶和napDNAbp多肽之间包含接头。接头可以是肽或非肽接头。例如，接头可以是XTEN、(GGGS)n(SEQ ID NO:261)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:262)、(G)n、(EAAAK)n(SEQ ID NO:263)、(GGS)n、SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:264)。在一些实施方案中，融合蛋白在N端Cas9片段和脱氨酶之间包含接头。在一些实施方案中，融合蛋白在C端Cas9片段和脱氨酶之间包含接头。在一些实施方案中，napDNAbp的N端和C端片段在有接头的情况下与脱氨酶连接。在一些实施方案中，N端和C端片段在没有接头的情况下与脱氨酶结构域连接。在一些实施方案中，融合蛋白在N端Cas9片段和脱氨酶之间包含接头，但在C端Cas9片段和脱氨酶之间不包含接头。在一些实施方案中，融合蛋白在C端Cas9片段和脱氨酶之间包含接头，但在N端Cas9片段和脱氨酶之间不包含接头。
在一些实施方案中，融合蛋白中的napDNAbp是Cas12多肽(例如，Cas12b/C2c1)或其片段。Cas12多肽可以是变体Cas12多肽。在其他实施方案中，Cas12多肽的N端或C端片段包含核酸可编程DN A结合结构域或RuvC结构域。在其他实施方案中，融合蛋白在Cas12多肽和催化结构域之间含有接头。在其他实施方案中，接头的氨基酸序列是GGSGGS(SEQ ID NO:265)或GSSGSETPGTSESATPE SSG(SEQ ID NO:266)。在其他实施方案中，接头是刚性接头。在上述方面的其他实施方案中，接头由GGAGGCTCTGGAGGAAGC(SEQ ID NO:267)或GGCTCTTCTGGATCTGAAACACCTGGCACAA GCGAGAGCGCCACCCCTGAGAGCTCTGGC(SEQ ID NO:268)编码。
包含侧翼为Cas12多肽的N-和C-末端片段的异源催化结构域的融合蛋白对如本文所述方法中的碱基编辑也是有用的。包含Cas12和一个或多个脱氨酶结构域(例如，腺苷脱氨酶变体)或包含侧翼为Cas12序列的腺苷脱氨酶变体结构域的融合蛋白对于靶序列的高度特异性和有效的碱基编辑也是有用的。在一个实施方案中，嵌合Cas12融合蛋白含有插入在Cas12多肽内的异源催化结构域(例如，腺苷脱氨酶变体)。
在其他实施方案中，融合蛋白含有一个或多个催化结构域。在其他实施方案中，一个或多个催化结构域中的至少一个被插入Cas12多肽内或融合在Cas12 N端或C端。在其他实施方案中，一个或多个催化结构域中的至少一个插入Cas12多肽的环、α螺旋区、非结构化部分或溶剂可及部分内。在其他实施方案中，Cas12多肽是Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、Cas12i或Cas12j/CasΦ。在其他实施方案中，Cas12多肽与外村尚芽孢杆菌(Bacillus hisashii)Cas12b、嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillusthermoamylovorans)Cas12b、芽孢杆菌属V3-13 Cas12b或嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)Cas12b(SEQ ID NO:269)具有至少约85％氨基酸序列同一性。在其他实施方案中，Cas12多肽与外村尚芽孢杆菌Cas12b(SEQ ID NO:270)、嗜热淀粉芽孢杆菌Cas12b、芽孢杆菌属V3-13 Cas12b或嗜酸脂环酸芽孢杆菌Cas12b具有至少约90％氨基酸序列同一性。在其他实施方案中，Cas12多肽与外村尚芽孢杆菌Cas12b、嗜热淀粉芽孢杆菌Cas12b(SEQ ID NO:271)、芽孢杆菌属V3-13 Cas12b(SEQ ID NO:272)或嗜酸脂环酸芽孢杆菌Cas12b具有至少约95％氨基酸序列同一性。在其他实施方案中，Cas12多肽含有外村尚芽孢杆菌Cas12b、嗜热淀粉芽孢杆菌Cas12b、芽孢杆菌属V3-13 Cas12b或嗜酸脂环酸芽孢杆菌Cas12b的片段或基本上由其组成。在实施方案中，Cas12多肽含有BvCas12b(V4)，其在一些实施方案中表达为5’mRNA Cap---5’UTR---bhCas12b---终止序列---3’UTR---120polyA尾(SEQ ID NO:273-275)。
在其他实施方案中，催化结构域插入到BhCas12b或Cas12a、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、Cas12i或Cas12j/CasΦ的相应氨基酸残基的位置153-154、255-256、306-307、980-981、1019-1020、534-535、604-605或344-345之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BhCas12b的氨基酸P153和S154之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BhCas12b的氨基酸K255和E256之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BhCas12b的氨基酸D980和G981之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BhCas12b的氨基酸K1019和L1020之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BhCas12b的氨基酸F534和P535之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BhCas12b的氨基酸K604和G605之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BhCas12b的氨基酸H344和F345之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BvCas12b或Cas12a、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、Cas12i或Cas12j/CasΦ的相应氨基酸残基的位置147和148、248和249、299和300、991和992或1031和1032之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BvCas12b的氨基酸P147和D148之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BvCas12b的氨基酸G248和G249之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BvCas12b的氨基酸P299和E300之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BvCas12b的氨基酸G991和E992之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到BvCas12b的氨基酸K1031和M1032之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到AaCas12b或Cas12a、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、Cas12i或Cas12j/CasΦ的相应氨基酸残基的位置157和158、258和259、310和311、1008和1009或1044和1045之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到AaCas12b的氨基酸P157和G158之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到AaCas12b的氨基酸V258和G259之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到AaCas12b的氨基酸D310和P311之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到AaCas12b的氨基酸G1008和E1009之间。在其他实施方案中，催化结构域插入到AaCas12b的氨基酸G1044和K1045之间。
在其他实施方案中，融合蛋白含有核定位信号(例如，二分核定位信号)。在其他实施方案中，核定位信号的氨基酸序列是MAPKKK RKVGIHGVPAA(SEQ ID NO:276)。在以上方面的其他实施方案中，核定位信号由以下序列编码：ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCC(SEQ ID NO:277)。在其他实施方案中，Cas12b多肽含有沉默RuvC结构域的催化活性的突变。在其他实施方案中，Cas12b多肽含有D574A、D829A和/或D952A突变。在其他实施方案中，融合蛋白还含有标签(例如，流感血凝素标签)。
在一些实施方案中，融合蛋白包含具有内部融合的核碱基编辑结构域(例如，全部或部分脱氨酶结构域，例如，腺苷脱氨酶变体结构域)的napDNAbp结构域(例如，Cas12衍生的结构域)。在一些实施方案中，napDNAbp是Cas12b。在一些实施方案中，碱基编辑器包含BhCas12b结构域，所述结构域具有插入到下表4中提供的基因座处的内部融合的TadA*8变体结构域。
表4：Cas12b蛋白中的插入基因座
BhCas12b 插入位点 插入aa之间
位置1 153 PS
位置2 255 KE
位置3 306 DE
位置4 980 DG
位置5 1019 KL
位置6 534 FP
位置7 604 KG
位置8 344 HF
BvCas12b 插入位点 插入aa之间
位置1 147 PD
位置2 248 GG
位置3 299 PE
位置4 991 GE
位置5 1031 KM
AaCas12b 插入位点 插入aa之间
位置1 157 PG
位置2 258 VG
位置3 310 DP
位置4 1008 GE
位置5 1044 GK
作为非限制性实例，腺苷脱氨酶变体(例如，TadA*8.20)可以插入BhCas12b中以产生有效编辑核酸序列的融合蛋白(例如，TadA*8.20-BhCas12b)。
在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑系统是具有插入Cas9中的TadA变体的ABE。具有插入Cas9中的TadA的有关ABE的多肽序列的实例在所附序列表中提供为SEQ IDNO:278-323。
在一些实施方案中，生成腺苷脱氨酶碱基编辑器以将TadA或其变体插入Cas9多肽中鉴定的位置。
示例性但非限制性的融合蛋白描述于国际PCT申请号PCT/US2020/016285和美国临时申请号62/852,228和62/852,224中，其内容以引用方式整体并入本文。
A到G的编辑
在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑器变体(例如，ABE8.20变体)包含腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA变体结构域)。碱基编辑器的此种腺苷脱氨酶变体结构域可以通过使A脱氨以形成肌苷(I)来促进将腺嘌呤(A)核碱基编辑为鸟嘌呤(G)核碱基，所述肌苷(I)表现出G的碱基配对特性。腺苷脱氨酶能够使脱氧核糖核酸(DNA)中的脱氧腺苷残基的腺嘌呤脱氨(即，去除胺基)。在一些实施方案中，A到G碱基编辑器还包含肌苷碱基切除修复抑制剂，例如，尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)结构域或无催化活性的肌苷特异性核酸酶。不受任何特定理论的束缚，UGI结构域或无催化活性的肌苷特异性核酸酶可以抑制或阻止脱氨腺苷残基(例如肌苷)的碱基切除修复，这可以提高碱基编辑器的活性或效率。在一些实施方案中，此类腺苷脱氨酶的活性充当腺苷脱氨蛋白酶变体活性的比较基础(即，作为参考)。
包含腺苷脱氨酶变体(例如，TadA变体结构域)的碱基编辑器变体(例如，ABE8.20变体)可以作用于任何多核苷酸，包括DNA、RNA和DNA-RNA杂交体。在某些实施方案中，包含腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器可以使包含RNA的多核苷酸的靶A脱氨。例如，碱基编辑器可以包含能够使RNA多核苷酸和/或DNA-RNA杂交多核苷酸的靶A脱氨的腺苷脱氨酶变体结构域。在一个实施方案中，并入碱基编辑器的腺苷脱氨酶变体包含作用于RNA(ADAR，例如，ADAR1或ADAR2)或tRNA(ADAT)的全部或部分腺苷脱氨酶。包含腺苷脱氨酶变体结构域的碱基编辑器也能够使DNA多核苷酸的A核碱基脱氨。在一个实施方案中，碱基编辑器的腺苷脱氨酶变体结构域包含全部或部分ADAT，所述ADAT包含允许ADAT将DNA中的靶A脱氨的一个或多个突变。例如，碱基编辑器变体可以包含全部或部分来自大肠杆菌(Escherichia coli)的ADAT(EcTadA)，其包含以下突变中的一个或多个：D108N、A106V、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。示例性ADAT同源物多肽序列在序列表中提供为SEQ ID NO:2和324-330。
腺苷脱氨酶变体可以来源于任何合适的生物体(例如，大肠杆菌(E.coli))。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体来自原核生物。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体来自细菌。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体来自大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是天然存在的腺苷脱氨酶，其包括对应于本文提供的任何突变(例如，ecTadA中的突变)的一个或多个突变。在一些实施方案中，一个或多个突变是非天然存在的突变，得到自然界中不存在的腺苷脱氨酶变体。任何同源蛋白质中的相应残基可以通过例如序列比对和同源残基的确定来鉴定。可以相应地产生对应于本文描述的任何突变(例如，在ecTadA中鉴定的任何突变)的任何天然存在的腺苷脱氨酶(例如，与ecTadA具有同源性)中的突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含与本文提供的任何腺苷脱氨酶中说明的氨基酸序列中的任何一个至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。应当理解，本文提供的腺苷脱氨酶变体可以包含一个或多个突变(例如，本文提供的任何突变)。本公开提供了本文所述的具有一定百分比同一性的任何脱氨酶结构域加上任何突变或其组合。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含与本文提供的参考序列或任何腺苷脱氨酶相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、21个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含与本领域已知或本文描述的任何一种氨基酸序列相比具有至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个或至少170个相同的连续氨基酸残基的氨基酸序列。
应当理解，本文提供的任何突变(例如，基于TadA参考序列)可以被引入其他腺苷脱氨酶，诸如大肠杆菌TadA(ecTadA)、金黄色葡萄球菌TadA(saTadA)或其他腺苷脱氨酶(例如，细菌腺苷脱氨酶)。对本领域技术人员显而易见的是，可以类似地比对另外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。因此，在SEQ ID NO:1或TadA参考序列中鉴定的任何突变都可以在具有同源氨基酸残基的其他腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中出现。还应理解，本文提供的任何突变可以单独或以任何组合在TadA参考序列或另一腺苷脱氨酶中出现。
在一些实施方案中，能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的胞嘧啶脱氨的腺苷脱氨酶变体保持腺苷脱氨酶活性(例如，参考腺苷脱氨酶(例如，TadA*8.20)活性的至少约30％、40％、50％或更高)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约90％或更高。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约80％或更高。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约70％或更高。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约60％或更高。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约50％或更高。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约40％或更高。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约30％或更高。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约20％或更高。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约10％或更高。在一些实施方案中，参考腺苷脱氨酶为TadA*8.20或TadA*8.19。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含增加胞嘧啶脱氨酶活性同时保持腺苷脱氨酶活性的一个或多个改变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考(例如，TadA*8.20)具有增加的胞嘧啶脱氨酶活性(例如，至少约30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有至少约10倍或更多倍的胞嘧啶脱氨酶活性增加。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有至少约20倍或更多倍的胞嘧啶脱氨酶活性增加。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有至少约30倍或更多倍的胞嘧啶脱氨酶活性增加。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有至少约40倍或更多倍的胞嘧啶脱氨酶活性增加。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有至少约50倍或更多倍的胞嘧啶脱氨酶活性增加。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有至少约60倍或更多倍的胞嘧啶脱氨酶活性增加。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有至少约70倍或更多倍的胞嘧啶脱氨酶活性增加。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有至少约80倍或更多倍的胞嘧啶脱氨酶活性增加。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有至少约90倍或更多倍的胞嘧啶脱氨酶活性增加。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有至少约100倍或更多倍的胞嘧啶脱氨酶活性增加。
在一些实施方案中，包含本文提供的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统在靶多核苷酸中具有至少约30％或更高的C到T编辑活性。在一些实施方案中，包含本文提供的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统在靶多核苷酸中具有至少约40％或更高的C到T编辑活性。在一些实施方案中，包含本文提供的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统在靶多核苷酸中具有至少约50％或更高的C到T编辑活性。在一些实施方案中，包含本文提供的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统在靶多核苷酸中具有至少约60％或更高的C到T编辑活性。在一些实施方案中，包含本文提供的腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器系统在靶多核苷酸中具有至少约70％或更高的C到T编辑活性。
在以下实施方案中，在腺苷脱氨酶的情况下描述的突变也可以存在于腺苷脱氨酶变体中。在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D108X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D108G、D108N、D108V、D108A或D108Y突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的V4X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的V4K、V4T或V4S突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的S2X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的S2H突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的V4X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的V4K、V4S或V4T突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的F6X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的F6Y、F6G或F6H突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H8X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H8Q突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R13X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R13G突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的T17X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的T17A或T17W突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R23X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R23W或R23Q突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的E27X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q或E27S突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的P29X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的P29G、P29A或P29K突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的V30X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的V30F、V30L或V30I突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R47X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R47S突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A48X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A48G突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的I49X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的I49K突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的I49X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的I49M、I49N、I49Q或I49T突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的G67X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的G67W突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的I76X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的I76H、I76R、I76W、I76Y、Y76H、Y76I、Y76R或Y76W突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D77X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D77G突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的S82X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的S82T突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的F84X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的F84A、F84L或F84M突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H96X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H96N突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的G100X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的G100A或G100K突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R107X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R107C突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的T111X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的T111H突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的G112X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的G112H突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A114X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A114C突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H122X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H122N、H122G、H122T或H122R突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的G115X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的G115M突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的M118X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的M118L突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D119X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D119N突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的N127X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的N127K、N127P或N127I突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A142X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A142E突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的F149X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的F149Y突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A143X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A143E突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A147X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A147H或Y147D突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A158X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A158V突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的Q159X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的Q159S突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A162X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A162C、A162N或A162Q突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的S165X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的S165P突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的T166X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的T166I突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D167X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D167N突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。然而，应当理解，可以类似地比对额外的脱氨酶以鉴定可以如本文提供的那样突变的同源氨基酸残基。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A106X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A106V突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的E155X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中存在X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的E155D、E155G或E155V突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D147X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中存在X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D147Y突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A106X、E155X或D147X突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含E155D、E155G或E155V突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含D147Y。
还应理解，本文提供的任何突变可以单独或以任何组合在ecTadA或另一腺苷脱氨酶中出现。例如，腺苷脱氨酶变体可以含有TadA参考序列中的D108N、A106V、E155V和/或D147Y突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含以下TadA参考序列中的突变或另一腺苷脱氨酶中的相应突变的组(突变组由“；”分隔)：D108N和A106V；D108N和E155V；D108N和D147Y；A106V和E155V；A106V和D147Y；E155V和D147Y；D108N、A106V和E155V；D108N、A106V和D147Y；D108N、E155V和D147Y；A106V、E155V、D147Y；D108N、A106V、E155V和D147Y。然而，应当理解，本文提供的相应突变的任何组合可以在腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中出现。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含TadA参考序列(例如，TadA*7.10)中的突变或另一腺苷脱氨酶中的相应突变的组合：V82G+Y147T+Q154S；I76Y+V82G+Y147T+Q154S；L36H+V82G+Y147T+Q154S+N157K；V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147T+Q154S+N157K；I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；或L36H+I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H8X、T17X、L18X、W23X、L34X、W45X、R51X、A56X、E59X、E85X、M94X、I95X、V102X、F104X、A106X、R107X、D108X、K110X、M118X、N127X、A138X、F149X、M151X、R153X、Q154X、I156X和/或K157X突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中存在X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H8Y、T17S、L18E、W23L、L34S、W45L、R51H、A56E，或A56S、E59G、E85K，或E85G、M94L、I95L、V102A、F104L、A106V、R107C，或R107H，或R107P，D108G，或D108N，或D108V，或D108A，或D108Y、K110I、M118K、N127S、A138V、F149Y、M151V、R153C、Q154L、I156D和/或K157R突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H8X、D108X和/或N127X突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中X表示存在任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H8Y、D108N或N127S突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H8X、R26X、M61X、L68X、M70X、A106X、D108X、A109X、N127X、D147X、R152X、Q154X、E155X、K161X、Q163X和/或T166X突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H8Y、R26W、M61I、L68Q、M70V、A106T、D108N、A109T、N127S、D147Y、R152C、Q154H或Q154R、E155G或E155V或E155D、K161Q、Q163H和/或T166P突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由TadA参考序列中的H8X、D108X、N127X、D147X、R152X和Q154X组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个选自由TadA参考序列中的H8X、M61X、M70X、D108X、N127X、Q154X、E155X和Q163X组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个或五个选自由TadA参考序列中的H8X、D108X、N127X、E155X和T166X组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由H8X、A106X和D108X组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个选自由H8X、R26X、L68X、D108X、N127X、D147X和E155X组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个选自由TadA参考序列中的H8X、R126X、L68X、D108X、N127X、D147X和E155X组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个或五个选自由TadA参考序列中的H8X、D108X、A109X、N127X和E155X组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由TadA参考序列中的H8Y、D108N、N127S、D147Y、R152C和Q154H组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个选自由TadA参考序列中的H8Y、M61I、M70V、D108N、N127S、Q154R、E155G和Q163H组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个或五个选自由TadA参考序列中的H8Y、D108N、N127S、E155V和T166P组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由TadA参考序列中的H8Y、A106T、D108N、N127S、E155D和K161Q组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个选自由TadA参考序列中的H8Y、R26W、L68Q、D108N、N127S、D147Y和E155V组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个或五个选自由TadA参考序列中的H8Y、D108N、A109T、N127S和E155G组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D108N、D108G或D108V突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A106V和D108N突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R107C和D108N突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H8Y、D108N、N127S、D147Y和Q154H突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H8Y、D108N、N127S、D147Y和E155V突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的D108N、D147Y和E155V突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶包含TadA参考序列中的H8Y、D108N和N127S突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A106V、D108N、D147Y和E155V突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的S2X、H8X、I49X、L84X、H123X、N127X、I156X和/或K160X突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中存在X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的S2A、H8Y、I49F、L84F、H123Y、N127S、I156F和/或K160S突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包括L84X突变腺苷脱氨酶，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的L84F突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H123X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H123Y突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的I156X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的I156F突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个选自由TadA参考序列中的L84X、A106X、D108X、H123X、D147X、E155X和I156X组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由TadA参考序列中的S2X、I49X、A106X、D108X、D147X和E155X组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个或五个选自由TadA参考序列中的H8X、A106X、D108X、N127X和K160X组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中X表示存在除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个选自由TadA参考序列中的L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V和I156F组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由TadA参考序列中的S2A、I49F、A106V、D108N、D147Y和E155V组成的组的突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个、两个、三个、四个或五个选自由TadA参考序列中的H8Y、A106T、D108N、N127S和K160S组成的组的突变，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的E25X、R26X、R107X、A142X和/或A143X突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中存在X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的E25M、E25D、E25A、E25R、E25V、E25S、E25Y、R26G、R26N、R26Q、R26C、R26L、R26K、R107P、R107K、R107A、R107N、R107W、R107H、R107S、A142N、A142D、A142G、A143D、A143G、A143E、A143L、A143W、A143M、A143S、A143Q和/或A143R突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含一个或多个本文所述的对应于TadA参考序列的突变，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的E25X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的E25M、E25D、E25A、E25R、E25V、E25S或E25Y突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R26X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R26G、R26N、R26Q、R26C、R26L或R26K突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R107X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R107P、R107K、R107A、R107N、R107W、R107H或R107S突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A142X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A142N、A142D、A142G突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A143X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A143D、A143G、A143E、A143L、A143W、A143M、A143S、A143Q和/或A143R突变，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H36X、N37X、P48X、I49X、R51X、M70X、N72X、D77X、E134X、S146X、Q154X、K157X和/或K161X突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶中的一个或多个相应突变，其中存在X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在各种实施方案中，本发明的改变不包括48R突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H36L、N37T、N37S、P48T、P48L、I49V、R51H、R51L、M70L、N72S、D77G、E134G、S146R、S146C、Q154H、K157N和/或K161T突变中的一个或多个，或另一腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中的一个或多个相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H36X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的H36L突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的N37X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的N37T或N37S突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的P48X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的P48T或P48L突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体不包含P48R突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R51X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R51H或R51L突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的S146X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的S146R或S146C突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的K157X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的K157N突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的P48X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的P48S、P48T或P48A突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体不包含P48R突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A142X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的A142N突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的W23X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的W23R或W23L突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R152X突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变，其中X表示除野生型腺苷脱氨酶中相应氨基酸之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含TadA参考序列中的R152P或R52H突变，或另一腺苷脱氨酶中的相应突变。
在一个实施方案中，腺苷脱氨酶变体可以包含突变H36L、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F和K157N。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含以下相对于TadA参考序列的突变组合，其中组合的每个突变由“_”分隔，并且每个突变组合都在括号之间：
(A106V_D108N)、
(R107C_D108N)、
(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H)、
(H8Y_D108N_N127S_D147Y_E155V)、
(D108N_D147Y_E155V)、
(H8Y_D108N_N127S)、
(H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H)、
(A106V_D108N_D147Y_E155V)、
(D108Q_D147Y_E155V)、
(D108M_D147Y_E155V)、
(D108L_D147Y_E155V)、
(D108K_D147Y_E155V)、
(D108I_D147Y_E155V)、
(D108F_D147Y_E155V)、
(A106V_D108N_D147Y)、
(A106V_D108M_D147Y_E155V)、
(E59A_A106V_D108N_D147Y_E155V)、
(E59A催化失活_A106V_D108N_D147Y_E155V),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156Y)、(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)、
(D103A_D104N)、
(G22P_D103A_D104N)、
(D103A_D104N_S138A)、
(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F)、
(E25G_R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F)、
(E25D_R26G_L84F_A106V_R107K_D108N_H123Y_A142N_A143G_D147Y_E155V_I156F)、
(R26Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F)、
(E25M_R26G_L84F_A106V_R107P_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F)、
(R26C_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F)、
(L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_A143L_D147Y_E155V_I156F)、
(R26G_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F)、
(E25A_R26G_L84F_A106V_R107N_D108N_H123Y_A142N_A143E_D147Y_E155V_I156F)、
(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F)、
(A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V)、
(R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V)、
(E25D_R26G_A106V_R107K_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V)、
(R26G_A106V_D108N_R107H_A142N_A143D_D147Y_E155V)、
(E25D_R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V)、
(A106V_R107K_D108N_A142N_D147Y_E155V)、
(A106V_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V)、
(A106V_D108N_A142N_A143L_D147Y_E155V)、
(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(N37T_P48T_M70L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_I49V_E155V_I156F)、
(N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K161T)、
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_Q154H_E155V_I156F)、
(N72S_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F)、
(H36L_P48L_L84F_A106V_D108N_H123Y_E134G_D147Y_E155V_I156F)、
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N)
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F)、
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T)、
(N37S_R51H_D77G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)、
(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(D24G_Q71R_L84F_H96L_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K160E)、
(H36L_G67V_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146T_D147Y_E155V_I156F)、
(Q71L_L84F_A106V_D108N_H123Y_L137M_A143E_D147Y_E155V_I156F)、
(E25G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L)、
(L84F_A91T_F104I_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)、
(N72D_L84F_A106V_D108N_H123Y_G125A_D147Y_E155V_I156F)、
(P48S_L84F_S97C_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)、
(W23G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)、
(D24G_P48L_Q71R_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L)、
(L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F)、
(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_K161T)、
(L84F_A106V_D108N_D147Y_E155V_I156F)、
(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K161T)、
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K161T)、
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E_K161T)、
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E)、
(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)、
(R74A_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)、
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)、
(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)、
(L84F_R98Q_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)、
(L84F_A106V_D108N_H123Y_R129Q_D147Y_E155V_I156F)、
(P48S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F)、
(P48S_A142N)、
(P48T_I49V_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_L157N)、
(P48T_I49V_A142N)、
(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F
(H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T)、
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152H_E155V_I156F_K157N)、
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)、
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)、
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)、
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)、
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T)、
(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)、
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)。
在一些实施方案中，TadA脱氨酶为TadA变体。在一些实施方案中，TadA变体为TadA*7.10。在特定实施方案中，本发明的融合蛋白或多分子复合物包含单个TadA*7.10结构域(例如，作为单体提供)。在其他实施方案中，融合蛋白包含TadA*7.10和TadA(wt)，它们能够形成异二聚体。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含与TadA*7.10连接的野生型TadA，TadA*7.10与Cas9切口酶连接。
在一些实施方案中，TadA*7.10包含至少一个改变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含以下序列中的改变：
TadA*7.10
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD(SEQ ID NO:2)
在一些实施方案中，TadA*7.10包含氨基酸82和/或166处的改变。在特定实施方案中，TadA*7.10包含以下改变中的一个或多个：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R和/或Q154R。在其他实施方案中，TadA*7.10的变体包含选自下组的改变组合：Y147T+Q154R；Y147T+Q154S；Y147R+Q154S；V82S+Q154S；V82S+Y147R；V82S+Q154R；V82S+Y123H；I76Y+V82S；V82S+Y123H+Y147T；V82S+Y123H+Y147R；V82S+Y123H+Q154R；Y147R+Q154R+Y123H；Y147R+Q154R+I76Y；Y147R+Q154R+T166R；Y123H+Y147R+Q154R+I76Y；V82S+Y123H+Y147R+Q154R；以及I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R。
在一些实施方案中，TadA*7.10的变体包含选自下组的改变中的一个或多个：L36H、I76Y、V82G、Y147T、Y147D、F149Y、Q154S、N157K和/或D167N。在一些实施方案中，TadA*7.10的变体包含V82G、Y147T/D、Q154S，以及L36H、I76Y、F149Y、N157K和D167N中的一个或多个。在其他实施方案中，TadA*7.10的变体包含选自下组的改变组合：V82G+Y147T+Q154S；I76Y+V82G+Y147T+Q154S；L36H+V82G+Y147T+Q154S+N157K；V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147T+Q154S+N157K；I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体(例如，TadA*8)包含缺失。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含C端的缺失。在特定实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)从残基149、150、151、152、153、154、155、156和157开始的C端缺失，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体(例如，TadA*8)是单体，其包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R和/或Q154R，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体(TadA*8)是单体，其包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：Y147T+Q154R；Y147T+Q154S；Y147R+Q154S；V82S+Q154S；V82S+Y147R；V82S+Q154R；V82S+Y123H；I76Y+V82S；V82S+Y123H+Y147T；V82S+Y123H+Y147R；V82S+Y123H+Q154R；Y147R+Q154R+Y123H；Y147R+Q154R+I76Y；Y147R+Q154R+T166R；Y123H+Y147R+Q154R+I76Y；V82S+Y123H+Y147R+Q154R；以及I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含两个腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的同二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域各自具有相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R和/或Q154R，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含两个腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的同二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域各自具有相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：Y147T+Q154R；Y147T+Q154S；Y147R+Q154S；V82S+Q154S；V82S+Y147R；V82S+Q154R；V82S+Y123H；I76Y+V82S；V82S+Y123H+Y147T；V82S+Y123H+Y147R；V82S+Y123H+Q154R；Y147R+Q154R+Y123H；Y147R+Q154R+I76Y；Y147R+Q154R+T166R；Y123H+Y147R+Q154R+I76Y；V82S+Y123H+Y147R+Q154R；以及I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，本公开的碱基编辑器包含腺苷脱氨酶变体(例如，TadA*8)单体，所述单体包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：R26C、V88A、A109S、T111R、D119N、H122N、Y147D、F149Y、T166I和/或D167N，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体(TadA*8)单体包含选自下组的相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的改变组合：R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N；V88A+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；V88A+T111R+D119N+F149Y；以及A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N，或另一TadA中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体(例如，MSP828)是单体，其包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：L36H、I76Y、V82G、Y147T、Y147D、F149Y、Q154S、N157K和/或D167N，或另一TadA中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体(例如，MSP828)是单体，其包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的V82G、Y147T/D、Q154S，以及L36H、I76Y、F149Y、N157K和D167N中的一个或多个，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体(TadA变体)是单体，其包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：V82G+Y147T+Q154S；I76Y+V82G+Y147T+Q154S；L36H+V82G+Y147T+Q154S+N157K；V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147T+Q154S+N157K；I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是野生型腺苷脱氨酶结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R和/或Q154R，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是野生型腺苷脱氨酶结构域和腺苷脱氨酶变体结构域的(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：Y147T+Q154R；Y147T+Q154S；Y147R+Q154S；V82S+Q154S；V82S+Y147R；V82S+Q154R；V82S+Y123H；I76Y+V82S；V82S+Y123H+Y147T；V82S+Y123H+Y147R；V82S+Y123H+Q154R；Y147R+Q154R+Y123H；Y147R+Q154R+I76Y；Y147R+Q154R+T166R；Y123H+Y147R+Q154R+I76Y；V82S+Y123H+Y147R+Q154R；以及I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，本公开的碱基编辑器包含腺苷脱氨酶变体(例如，TadA*8)同二聚体，其包含两个腺苷脱氨酶结构域(例如，TadA*8)，所述腺苷脱氨酶结构域各自具有相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：R26C、V88A、A109S、T111R、D119N、H122N、Y147D、F149Y、T166I和/或D167N，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含两个腺苷脱氨酶结构域(例如，TadA*8)的单体，所述腺苷脱氨酶结构域各自具有相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N；V88A+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；V88A+T111R+D119N+F149Y；以及A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N，或另一TadA中的相应突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含两个腺苷脱氨酶结构域(例如，TadA*7.10)的同二聚体，所述腺苷脱氨酶结构域各自具有相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：L36H、I76Y、V82G、Y147T、Y147D、F149Y、Q154S、N157K和/或D167N，或另一TadA中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含两个腺苷脱氨酶变体结构域(例如，MSP828)的同二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域各自具有相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变：V82G、Y147T/D、Q154S，以及L36H、I76Y、F149Y、N157K和D167N中的一个或多个，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含两个腺苷脱氨酶结构域(例如，TadA*7.10)的同二聚体，所述腺苷脱氨酶结构域各自具有相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：V82G+Y147T+Q154S；I76Y+V82G+Y147T+Q154S；L36H+V82G+Y147T+Q154S+N157K；V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147T+Q154S+N157K；I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R和/或Q154R，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：Y147T+Q154R；Y147T+Q154S；Y147R+Q154S；V82S+Q154S；V82S+Y147R；V82S+Q154R；V82S+Y123H；I76Y+V82S；V82S+Y123H+Y147T；V82S+Y123H+Y147R；V82S+Y123H+Q154R；Y147R+Q154R+Y123H；Y147R+Q154R+I76Y；Y147R+Q154R+T166R；Y123H+Y147R+Q154R+I76Y；V82S+Y123H+Y147R+Q154R；以及I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，碱基编辑器包含野生型腺苷脱氨酶结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：R26C、V88A、A109S、T111R、D119N、H122N、Y147D、F149Y、T166I和/或D167N，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，碱基编辑器包含野生型腺苷脱氨酶结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N；V88A+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；V88A+T111R+D119N+F149Y；以及A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是野生型腺苷脱氨酶结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*7.10)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：L36H、I76Y、V82G、Y147T、Y147D、F149Y、Q154S、N157K和/或D167N，或另一TadA中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含野生型腺苷脱氨酶结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，MSP828)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域具有相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变：V82G、Y147T/D、Q154S，以及L36H、I76Y、F149Y、N157K和D167N中的一个或多个，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是野生型腺苷脱氨酶结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*7.10)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：V82G+Y147T+Q154S；I76Y+V82G+Y147T+Q154S；L36H+V82G+Y147T+Q154S+N157K；V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147T+Q154S+N157K；I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R和/或Q154R，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：Y147T+Q154R；Y147T+Q154S；Y147R+Q154S；V82S+Q154S；V82S+Y147R；V82S+Q154R；V82S+Y123H；I76Y+V82S；V82S+Y123H+Y147T；V82S+Y123H+Y147R；V82S+Y123H+Q154R；Y147R+Q154R+Y123H；Y147R+Q154R+I76Y；Y147R+Q154R+T166R；Y123H+Y147R+Q154R+I76Y；V82S+Y123H+Y147R+Q154R；以及I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R，或另一TadA中的相应突变。
在特定实施方案中，腺苷脱氨酶异二聚体包含TadA*8结构域和腺苷脱氨酶结构域，其选自金黄色葡萄球菌(S.aureus)TadA、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)TadA、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)TadA、腐败希瓦氏菌(S.putrefaciens)TadA、流感嗜血杆菌F3031(H.influenzae)TadA、新月柄杆菌(C.crescentus)TadA、硫还原地杆菌(G.sulfurreducens)TadA，或TadA*7.10。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶为TadA*8变体。在一个实施方案中，腺苷脱氨酶为TadA*8变体，其包含具有腺苷脱氨酶活性的以下序列或其片段，或基本上由具有腺苷脱氨酶活性的以下序列或其片段组成：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD(SEQ ID NO:331)
在一些实施方案中，TadA*8被截短。在一些实施方案中，截短的TadA*8变体相对于全长TadA*8丢失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个N端氨基酸残基。在一些实施方案中，截短的TadA*8变体相对于全长TadA*8丢失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个C端氨基酸残基。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体为全长TadA*8。
在一些实施方案中，TadA*8是TadA*8.1,TadA*8.2、TadA*8.3、TadA*8.4、TadA*8.5、TadA*8.6、TadA*8.7、TadA*8.8、TadA*8.9、TadA*8.10、TadA*8.11、TadA*8.12、TadA*8.13、TadA*8.14、TadA*8.15、TadA*8.16、TadA*8.17、TadA*8.18、TadA*8.19、TadA*8.20、TadA*8.21、TadA*8.22、TadA*8.23或TadA*8.24。
在其他实施方案中，本公开的碱基编辑器包含腺苷脱氨酶变体(例如，TadA*8)单体，所述单体包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：R26C、V88A、A109S、T111R、D119N、H122N、Y147D、F149Y、T166I和/或D167N，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体(TadA*8)单体包含选自下组的相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的改变组合：R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N；V88A+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；V88A+T111R+D119N+F149Y；以及A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，碱基编辑器包含野生型腺苷脱氨酶结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：R26C、V88A、A109S、T111R、D119N、H122N、Y147D、F149Y、T166I和/或D167N，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，碱基编辑器包含野生型腺苷脱氨酶结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N；V88A+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；V88A+T111R+D119N+F149Y；以及A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N，或另一TadA中的相应突变。
在其他实施方案中，碱基编辑器包含TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：R26C、V88A、A109S、T111R、D119N、H122N、Y147D、F149Y、T166I和/或D167N，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，碱基编辑器包含TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*8)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N；V88A+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；R26C+A109S+T111R+D119N+H122N+F149Y+T166I+D167N；V88A+T111R+D119N+F149Y；以及A109S+T111R+D119N+H122N+Y147D+F149Y+T166I+D167N，或另一TadA中的相应突变。
在一些实施方案中，TadA*8是如表5所示的变体。表5显示了TadA氨基酸序列中的某些氨基酸位置编号以及TadA-7.10腺苷脱氨酶中这些位置中存在的氨基酸。表5还显示了在噬菌体辅助非连续进化(PANCE)和噬菌体辅助连续进化(PACE)后TadA变体中相对于TadA-7.10的氨基酸变化，如M.Richter等人,2020,Nature Biotechnology,doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z中所述，其全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，TadA*8是TadA*8a、TadA*8b、TadA*8c、TadA*8d或TadA*8e。在一些实施方案中，TadA*8是TadA*8e。
在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*7.10)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变中的一个或多个：L36H、I76Y、V82G、Y147T、Y147D、F149Y、Q154S、N157K和/或D167N，或另一TadA中的相应突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，MSP828)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域具有相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的以下改变：V82G、Y147T/D、Q154S，以及L36H、I76Y、F149Y、N157K和D167N中的一个或多个，或另一TadA中的相应突变。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶变体是TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体结构域(例如，TadA*7.10)的异二聚体，所述腺苷脱氨酶变体结构域包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的选自下组的改变组合：V82G+Y147T+Q154S；I76Y+V82G+Y147T+Q154S；L36H+V82G+Y147T+Q154S+N157K；V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147T+Q154S+N157K；I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+D167N；L36H+I76Y+V82G+Y147D+F149Y+Q154S+N157K+D167N，或另一TadA中的相应突变。
表5.选择TadA*8变体
在一些实施方案中，TadA变体是如表5.1所示的变体。表5.1显示了TadA氨基酸序列中的某些氨基酸位置编号以及TadA*7.10腺苷脱氨酶中这些位置中存在的氨基酸。在一些实施方案中，TadA变体是MSP605、MSP680、MSP823、MSP824、MSP825、MSP827、MSP828或MSP829。在一些实施方案中，TadA变体为MSP828。在一些实施方案中，TadA变体为MSP829。
表5.1.TadA变体
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白或多分子复合物包含与本文所述的腺苷脱氨酶变体(例如，TadA*8)连接的野生型TadA，所述腺苷脱氨酶变体与Cas9切口酶连接。在特定实施方案中，融合蛋白包含单个TadA*8结构域(例如，作为单体提供)。在其他实施方案中，融合蛋白包含TadA*8和TadA(wt)，它们能够形成异二聚体。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含与本文提供的任何腺苷脱氨酶中说明的氨基酸序列中的任何一个至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。应当理解，本文提供的腺苷脱氨酶可以包括一个或多个突变(例如，本文提供的任何突变)。本公开提供了本文所述的具有一定百分比同一性的任何脱氨酶结构域加上任何突变或其组合。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含与本文提供的参考序列或任何腺苷脱氨酶相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、21个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含与本领域已知或本文描述的任何一种氨基酸序列相比具有至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个或至少170个相同的连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在特定实施方案中，TadA*8包含在以下粗体显示的任何位置的一个或多个突变。在其他实施方案中，TadA*8包含在下划线显示的任何位置的一个或多个突变：
MSEVEFSHEY WMRHALTLAK RARDEREVPVGAVLVLNNRV IGEGWNRAIG 50LHDPTAHAEIMALRQGGLVM QNYRLIDATL YVTFEPCVMC AGAMIHSRIG 100RVVFGVRNAK TGAAGSLMDVLHYPGMNHRV EITEGILADE CAALLCYFFR 150MPRQVFNAQK KAQSSTD(SEQ ID NO:2)
例如，TadA*8在氨基酸位置82和/或166处包含相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的单独改变(例如，V82S、T166R)或与以下Y147T、Y147R、Q154S、Y123H和/或Q154R中的任何一个或多个组合的改变，或另一TadA中的相应突变。在特定实施方案中，相对于TadA*7.10(TadA参考序列)的改变组合选自下组：Y147T+Q154R；Y147T+Q154S；Y147R+Q154S；V82S+Q154S；V82S+Y147R；V82S+Q154R；V82S+Y123H；I76Y+V82S；V82S+Y123H+Y147T；V82S+Y123H+Y147R；V82S+Y123H+Q154R；Y147R+Q154R+Y123H；Y147R+Q154R+I76Y；Y147R+Q154R+T166R；Y123H+Y147R+Q154R+I76Y；V82S+Y123H+Y147R+Q154R；以及I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R，或另一TadA中的相应突变。
在一些实施方案中，TadA*8被截短。在一些实施方案中，截短的TadA*8变体相对于全长TadA*8丢失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个N端氨基酸残基。在一些实施方案中，截短的TadA*8变体相对于全长TadA*8丢失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个C端氨基酸残基。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体为全长TadA*8。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含与本文所述的腺苷脱氨酶变体(例如，TadA*8)连接的野生型TadA，所述腺苷脱氨酶变体与Cas9切口酶连接。在特定实施方案中，融合蛋白包含单个TadA*8结构域(例如，作为单体提供)。在其他实施方案中，碱基编辑器包含TadA*8和TadA(wt)，它们能够形成异二聚体。
在特定实施方案中，融合蛋白包含单个(例如，作为单体提供)TadA*8。在一些实施方案中，TadA*8与Cas9切口酶连接。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含作为野生型TadA(TadA(wt))与TadA*8连接的异二聚体。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含作为TadA*7.10与TadA*8连接的异二聚体。在一些实施方案中，碱基编辑器是ABE8，其包含TadA*8变体单体。在一些实施方案中，碱基编辑器是ABE8，其包含TadA*8和TadA(wt)的异二聚体。在一些实施方案中，碱基编辑器是ABE8，其包含TadA*8和TadA*7.10的异二聚体。在一些实施方案中，碱基编辑器是ABE8，其包含TadA*8的异二聚体。在一些实施方案中，TadA*8选自表5、11或12。在一些实施方案中，ABE8选自表11、12或14。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是TadA*9变体。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是TadA*9变体，其选自下述变体并且参考以下序列(称为TadA*7.10)：
MSEVEFSHEY WMRHALTLAK RARDEREVPVGAVLVLNNRV IGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVM QNYRLIDATLYVTFEPCVMC AGAMIHSRIGRVVFGVRNAK TGAAGSLMDV LHYPGMNHRVEITEGILADE CAALLCYFFRMPRQVFNAQK KAQSSTD(SEQ ID NO:2)
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含以下改变中的一个或多个：R21N、R23H、E25F、N38G、L51W、P54C、M70V、Q71M、N72K、Y73S、V82T、M94V、P124W、T133K、D139L、D139M、C146R和A158K。一个或多个改变在上面的序列中以下划线和粗体显示。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含以下改变组合中的一个或多个：V82S+Q154R+Y147R；V82S+Q154R+Y123H；V82S+Q154R+Y147R+Y123H；Q154R+Y147R+Y123H+I76Y+V82S；V82S+I76Y；V82S+Y147R；V82S+Y147R+Y123H；V82S+Q154R+Y123H；Q154R+Y147R+Y123H+I76Y；V82S+Y147R；V82S+Y147R+Y123H；V82S+Q154R+Y123H；V82S+Q154R+Y147R；V82S+Q154R+Y147R；Q154R+Y147R+Y123H+I76Y；Q154R+Y147R+Y123H+I76Y+V82S；I76Y_V82S_Y123H_Y147R_Q154R；Y147R+Q154R+H123H；以及V82S+Q154R。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含以下改变组合中的一个或多个：E25F+V82S+Y123H、T133K+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；L51W+V82S+Y123H+C146R+Y147R+Q154R；Y73S+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N72K+V82S+Y123H+D139L+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+P124W+Y147R+Q154R；L51W+V82S+Y123H+C146R+Y147R+Q154R；P54C+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Y73S+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+Y147R+Q154R+A158K；N72K+V82S+Y123H+D139L+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；以及M70V+V82S+M94V+Y123H+Y147R+Q154R。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含以下改变组合中的一个或多个：Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Y73S+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Y73S+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；以及V82S+Q154R；N72K_V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M_V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R+A158K；M70V+Q71M+N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N72K_V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M_V82S+Y123H+Y147R+Q154R；M70V+V82S+M94V+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R+A158K；以及M70V+Q71M+N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶表达为单体。在其他实施方案中，腺苷脱氨酶表达为异二聚体。在一些实施方案中，脱氨酶或其他多肽序列不含甲硫氨酸，例如当被包含为融合蛋白的组分时。这可以改变位置的编号。然而，本领域技术人员将理解此类相应突变指相同的突变，例如，Y73S和Y72S以及D139M和D138M。
在一些实施方案中，TadA*9变体包含如本文所述的表15中所述的改变。在一些实施方案中，TadA*9变体是单体。在一些实施方案中，TadA*9变体是具有野生型TadA腺苷脱氨酶的异二聚体。在一些实施方案中，TadA*9变体是具有另一个TadA变体(例如，TadA*8、TadA*9)的异二聚体。TadA*9腺苷脱氨酶的另外的详情描述于国际PCT申请号PCT/US2020/049975中，其以引用方式整体并入本文。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是包含一个或多个改变的变体，并且能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺苷脱氨。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是包含一个或多个改变的变体，并且能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是包含一个或多个改变的变体，并且能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺苷和胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含一个或多个改变的TadA腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是包含一个或多个改变的TadA*8.20腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体具有与SEQ ID NO:1：
具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，并且相对于参考腺苷脱氨酶包含增加胞嘧啶脱氨酶活性的一个或多个改变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于没有改变的腺苷脱氨酶包含增加胞苷脱氨活性的两个或更多个氨基酸改变。在一些实施方案中，两个或更多个改变选自由以下组成的组：与SEQ ID NO 1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的序列的位置2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167，或另一脱氨酶中的相应改变。在一些实施方案中，两个或更多个改变选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:1的S2X、V4X、F6X、H8X、R13X、T17X、R23X、E27X、P29X、V30X、R47X、A48X、I49X、G67X、Y76X、D77X、S82X、F84X、H96X、G100X、R107X、G112X、A114X、G115X、M118X、D119X、H122X、N127X、A142X、A143X、R147X、Y147X、F149X、A158X、Q159X、A162X、S165X、T166X和D167X，或另一脱氨酶中的相应改变。在各种实施方案中，本发明的改变不包括48R突变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体相对于没有改变的腺苷脱氨酶包含增加胞苷脱氨酶活性的两个或更多个氨基酸改变。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸改变选自由以下组成的组：与SEQ ID NO 1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的序列的位置4、6、29、100、114、143或159，或另一脱氨酶中的相应改变。在一些实施方案中，改变选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的V4X、F6X、P29X、G100X、A114X、A143X和Q159X，或另一脱氨酶中的相应改变。
在一些实施方案中，两个或更多个改变为与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的序列的氨基酸位置处的改变，或另一脱氨酶中的相应改变，所述改变选自由以下组成的组：氨基酸位置2处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置4处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和1675；氨基酸位置6处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置13处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置27处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置29处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置67处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置77处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置96处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置107处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置100处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置112处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置114处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置115处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置143处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、147、149、158、159、162、165、166和167；氨基酸位置159处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、162、165、166和167；氨基酸位置162处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、165、166和167；或氨基酸位置165处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、166和167。在一些实施方案中，两个或更多个改变选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的序列的S2H、V4K、V4S、V4T、V4Y、F6G、F6H、F6Y、H8Q、R13G、T17A、T17W、R23Q、E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q、E27S、E27G、P29A、P29G、P29K、V30F、V30I、V30L、R47G、R47S、A48G、I49K、I49M、I49N、I49Q、I49T、G67W、I76H、I76R、I76W、I76Y、Y76H、Y76I、Y76R、Y76W、D77G、S82T、F84A、F84L、F84M、H96N、G100A、G100K、R107C、T111H、G112H、A114C、G115M、M118L、D119N、H122G、H122N、H122R、H122T、N127I、N127K、N127P、A142E、A143E、R147H、Y147D、F149Y、A158V、Q159S、A162C、A162N、A162Q、S165P、T166I和D167N，或另一脱氨酶中的相应改变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含选自由以下组成的组的改变组合：E27H、Y76I和F84M；E27H、I49K和Y76I；E27S、I49K、Y76I和A162N；E27K和D119N；E27H和Y76I；E27S、I49K和G67W；E27S、I49K和Y76I；I49T、G67W和H96N；E27C、Y76I和D119N；R13G、E27Q和N127K；T17A、E27H、I49M、Y76I和M118L；I49Q、Y76I和G115M；S2H、I49K、Y76I和G112H；R47S和R107C；H8Q、I49Q和Y76I；T17A、A48G、S82T和A142E；E27G和I49N；E27G、D77G和S165P；E27S、I49K和S82T；E27S、I49K、S82T和G115M；E27S、V30I、I49K和S82T；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G112H和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L和R107C；E27S、I49K、S82T、F84L和G112H；E27S、I49K、S82T、F84L和G115M；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；E27S、P29G、I49K和S82T；E27S、P29G、I49K、S82T和G115M；E27S、P29G、I49K、S82T和A142E；P29G、I49K和S82T；E27G、I49K和S82T；E27G、I49K、S82T、R107C和A142E；V4K、E27H、I49K、Y76I和A114C；V4K、E27H、I49K、Y76I和D77G；F6Y、E27H、I49K、Y76I、G100A和H122R；V4T、E27H、I49K、Y76R和H122G；F6Y、E27H、I49K和Y76W；F6Y、E27H、I49K、Y76I和D119N；F6Y、E27H、I49K、Y76I和A114C；F6Y、E27H、I49K和Y76I；V4K、E27H、I49K、Y76W和H122T；F6G、E27H、I49K、Y76R和G100K；F6H、E27H、I49K、Y76I和H122N；E27H、I49K、Y76I和A114C；F6Y、E27H、I49K、Y76H、H122R和T166I；E27H、I49K、Y76I和N127P；R23Q、E27H、I49K和Y76R；E27H、I49K、Y76H、H122R和A158V；F6Y、E27H、I49K、Y76I和T111H；E27H、I49K、Y76I和R147H；E27H、I49K、Y76I和A143E；F6Y、E27H、I49K和Y76R；T17W、E27H、I49K、Y76H、H122G和A158V；V4S、E27H、I49K、A143E和Q159S；E27H、I49K、Y76I、N127I和A162Q；T17A、E27H和A48G；T17A、E27K和A48G；T17A、E27S和A48G；T17A、E27S、A48G和I49K；T17A、E27G和A48G；T17A、A48G和I49N；T17A、E27G、A48G和I49N；T17A、E27Q和A48G；E27S、I49K、S82T和R107C；E27S、I49K、S82T和G112H；E27S、I49K、S82T和A142E；E27S、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和R107C；E27S、V30I、I49K、S82T和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K和S82T；E27S、V30L、I49K、S82T和R107C；E27S、V30L、I49K、S82T和G112H；E27S、V30L、I49K、S82T和G115M；E27S、V30L、I49K、S82T和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T和F84A；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和R107C；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G112H；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G115M；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G112H；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G115M；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T和F84L；E27S、I49K、S82T、F84L和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T和R107C；E27S、P29G、I49K、S82T和G112H；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29G、I49K、S82T和R107C；P29G、I49K、S82T和G112H；P29G、I49K、S82T和G115M；P29G、I49K、S82T和A142E；P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K和S82T；P29K、I49K、S82T和R107C；P29K、I49K、S82T和G112H；P29K、I49K、S82T和G115M；P29K、I49K、S82T和A142E；P29K、I49K、S82T、R107C和G112H；P29K、I49K、S82T、R107C和G115M；P29K、I49K、S82T、R107C和A142E；P29K、I49K、S82T、G112H和A142E；P29K、I49K、S82T、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K和S82T；P29K、V30I、I49K、S82T和R107C；P29K、V30I、I49K、S82T和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T和F84L；P29K、I49K、S82T、F84L和R107C；P29K、I49K、S82T、F84L和G112H；P29K、I49K、S82T、F84L和G115M；P29K、I49K、S82T、F84L和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T和F84L；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27G、I49K、S82T和R107C；E27G、I49K、S82T和G112H；E27G、I49K、S82T和G115M；E27G、I49K、S82T和A142E；E27G、I49K、S82T、R107C和G112H；E27G、I49K、S82T、R107C和G115M；E27G、I49K、S82T、G112H和A142E；E27G、I49K、S82T、G115M和A142E；E27G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27H、I49K和S82T；E27H、I49K、S82T和R107C；E27H、I49K、S82T和G112H；E27H、I49K、S82T和G115M；E27H、I49K、S82T和A142E；E27H、I49K、S82T、R107C和G112H；E27H、I49K、S82T、R107C和G115M；E27H、I49K、S82T、R107C和A142E；E27H、I49K、S82T、G112H和A142E；E27H、I49K、S82T、G115M和A142E；E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S和S82T；E27S、S82T和R107C；E27S、S82T和G112H；E27S、S82T和G115M；E27S、S82T和A142E；E27S、S82T、R107C和G112H；E27S、S82T、R107C和G115M；E27S、S82T、R107C和A142E；E27S、S82T、G112H和A142E；E27S、S82T、G115M和A142E；E27S、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A和S82T；P29A、S82T和R107C；P29A、S82T和G112H；P29A、S82T和G115M；P29A、S82T和A142E；P29A、S82T、R107C和G112H；P29A、S82T、R107C和G115M；P29A、S82T、R107C和A142E；P29A、S82T、G112H和A142E；P29A、S82T、G115M和A142E；P29A、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I和S82T；E27S、V30I、S82T和R107C；E27S、V30I、S82T和G112H；E27S、V30I、S82T和G115M；E27S、V30I、S82T和A142E；E27S、V30I、S82T、R107C和G112H；E27S、V30I、S82T、R107C和G115M；E27S、V30I、S82T、R107C和A142E；E27S、V30I、S82T、G112H和A142E；E27S、V30I、S82T、G115M和A142E；E27S、V30I、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T和F84L；P29A、V30I、S82T、F84L和R107C；P29A、V30I、S82T、F84L和G112H；P29A、V30I、S82T、F84L和G115M；P29A、V30I、S82T、F84L和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G112H；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G115M；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、G112H和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、P29A、V30L、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；V4K和A114C；V4K和D77G；F6Y、G100A和H122R；V4T、I76R和H122G；F6Y和I76W；F6Y和D119N；F6Y和A114C；V4K、I76W和H122T；F6G、I76R和G100K；F6H和H122N；F6Y、I76H、H122R和T166I；R23Q和I76R；I76H、H122R和A158V；F6Y和T111H；T111H、H122G和A162C；F6Y和I76R；T17W、I76H、H122G和A158V；V4S、I76Y、A143E和Q159S；N127I和A162Q；E27H、Y76I、F84M和F149Y；E27H、I49K、Y76I和F149Y；T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L和F149Y；T17A、A48G、S82T、A142E和F149Y；E27G和F149Y；E27G、I49N和F149Y；E27H、Y76I、F84M、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27H、I49K、Y76I、Y147D、F149Y、T166I、D167N；T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L、Y147D、F149Y、T166I和D167N；T17A、A48G、S82T、A142E、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27G、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27G、I49N、Y147D、F149Y、T166I和D167N；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；以及F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；以上改变属于与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的序列，或另一脱氨酶中的相应改变。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个改变：与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的2、13、27、67、77、96、107、112、115、162、165，或另一脱氨酶中的相应改变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个改变：与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的S2H、V4K、V4S、V4T、V4Y、F6G、F6H、F6Y、H8Q、R13G、T17A、T17W、R23Q、E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q、E27S、E27G、P29A、P29G、P29K、V30F、V30I、R47G、R47S、A48G、I49K、I49M、I49N、I49Q、I49T、G67W、I76H、I76R、I76W、Y76H、Y76R、Y76W、F84A、F84M、H96N、G100A、G100K、T111H、G112H、A114C、G115M、M118L、H122G、H122R、H122T、N127I、N127K、N127P、A142E、R147H、A158V、Q159S、A162C、A162N、A162Q和S165P，或另一脱氨酶中的相应改变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是如表1A至1F中的任一个所示的变体。
本文提供的任何突变和任何另外的突变(例如，基于ecTadA氨基酸序列)可以被引入任何另外的腺苷脱氨酶中。本文提供的任何突变可以单独或以任何组合在TadA参考序列或另一种腺苷脱氨酶(例如，ecTadA)中出现。本文提供的任何氨基酸改变和任何另外的突变可以用保守氨基酸取代。
A到G核碱基编辑蛋白的详情描述于国际PCT申请号PCT/US2017/045381(WO2018/027078)和Gaudelli,N.M.等人,“Programmable base editing of A·T to G·C ingenomic DNA without DNA cleavage”Nature,551,464-471(2017)，其全部内容以引用方式特此并入。
本领域技术人员将理解，包含腺苷脱氨酶变体的碱基编辑器可以以融合蛋白的形式提供，也可以以包含napDNAbp和腺苷脱氨酶变体的分子复合物的形式提供。
C到T的编辑
在一些实施方案中，本文公开的碱基编辑器包含融合蛋白或多分子复合物，所述融合蛋白或多分子复合物包含能够使多核苷酸的靶胞苷(C)碱基脱氨以产生尿苷(U)的腺苷脱氨酶变体，所述尿苷具有胸腺嘧啶的碱基配对特性。在一些实施方案中，例如当多核苷酸为双链(例如，DNA)时，然后尿苷碱基可以被胸苷碱基取代(例如，通过细胞修复机制)以得到C:G到T:A转变。在其他实施方案中，通过碱基编辑器使核酸中的C脱氨为U不能伴随U到T的取代。
使多核苷酸中的靶C脱氨以产生U是可以由本文描述的碱基编辑器执行的碱基编辑类型的非限制性实例。在另一个实例中，包含胞苷脱氨酶结构域的碱基编辑器可以介导胞嘧啶(C)碱基向鸟嘌呤(G)碱基的转化。例如，通过碱基编辑器的胞苷脱氨酶结构域使胞苷脱氨产生的多核苷酸的U可以通过碱基切除修复机制(例如，通过尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)结构域)从多核苷酸切除，产生脱碱基位点。然后，脱碱基位点对面的核碱基可通过例如跨损伤聚合酶用另一个碱基(诸如C)取代(例如，通过碱基修复机制)。尽管脱碱基位点对面的核碱基通常被C替代，但也可能发生其他取代(例如，A、G或T)。
因此，在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑器包含能够将多核苷酸中的靶C脱氨为U的脱氨结构域(例如，腺苷脱氨酶变体结构域)。此外，如下所述，碱基编辑器可以包含另外的结构域，其促进由脱氨所得的U在一些实施方案中转化为T或G。例如，包含腺苷脱氨酶变体结构域的碱基编辑器还可以包含尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)结构域以介导U被T取代，完成C到T碱基编辑事件。在另一个实例中，碱基编辑器可以并入跨损伤聚合酶以提高C到G碱基编辑的效率，因为跨损伤聚合酶可以促进脱碱基位点对面的C的并入(即，导致在脱碱基位点处并入G，完成C到G碱基编辑事件)。
包含腺苷脱氨酶变体作为结构域的碱基编辑器可以使任何多核苷酸(包括DNA、RNA和DNA-RNA杂交体)中的靶C脱氨。通常，胞苷脱氨酶催化位于多核苷酸单链部分背景中的C核碱基。在一些实施方案中，包含靶C的完整多核苷酸可以是单链的。例如，并入碱基编辑器中的腺苷脱氨酶变体可以使单链RNA多核苷酸中的靶C脱氨。在其他实施方案中，包含腺苷脱氨酶变体结构域的碱基编辑器可以作用于双链多核苷酸，但是靶C可以位于在脱氨反应时处于单链状态下的多核苷酸的一部分中。例如，在NAGPB结构域包含Cas9结构域的实施方案中，在形成Cas9-gRNA-靶DNA复合物的过程中，若干核苷酸可以保持不配对，从而导致形成Cas9“R环复合物”。这些不配对的核苷酸可以形成单链DNA泡状物，其可以充当单链特异性核苷酸脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)的底物。
腺苷脱氨酶变体的胞嘧啶脱氨酶活性可以与包含全部或部分载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶的胞苷脱氨酶进行比较。APOBEC是进化上保守的胞苷脱氨酶家族。这个家族的成员是C到U编辑酶。APOBEC样蛋白的N端结构域是催化结构域，而C端结构域则是假催化结构域。更具体地，催化结构域是锌依赖性胞苷脱氨酶结构域，并且对于胞苷脱氨是重要的。APOBEC家族成员包括APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D(“APOBEC3E”现在是指这个)、APOBEC3F、APOBECT3G、APOBEC3H、APOBECT4和激活诱导的(胞苷)脱氨酶。
下面提供了根据本公开的方面可以与Cas9融合的其他示例性脱氨酶。应当理解，在一些实施方案中，可以使用相应序列的活性结构域，例如，没有定位信号的结构域(没有核输出信号、细胞质定位信号的核定位序列)。
本公开的一些方面基于以下认识：例如通过在脱氨酶结构域中进行点突变来调节本文所述的任何融合蛋白的脱氨酶结构域催化活性，影响了融合蛋白(例如，碱基编辑器)的持续性。例如，降低但不消除碱基编辑融合蛋白内脱氨酶结构域的催化活性的突变可以使得脱氨酶结构域不太可能催化与靶残基相邻的残基的脱氨，从而缩小脱氨窗口。缩小脱氨窗口的能力可以防止与特定靶残基相邻的残基发生不需要的脱氨，这可以减少或防止脱靶效应。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白或多分子复合物包含一个或多个腺苷脱氨酶变体结构域。在一些实施方案中，本文提供的腺苷脱氨酶变体能够将胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶脱氨为尿嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施方案中，本文提供的腺苷脱氨酶变体能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的胞嘧啶脱氨。腺苷脱氨酶变体可以来源于任何合适的生物体。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体来源于天然存在的腺苷脱氨酶，其包含对应于本文提供的任何突变的一个或多个突变。在一些实施方案中，一个或多个突变是非天然存在的突变，得到自然界中不存在的腺苷脱氨酶变体。本领域技术人员将能够例如通过序列比对和同源残基的测定来鉴定任何同源蛋白质中的相应残基。因此，本领域技术人员将能够在任何天然存在的腺苷脱氨酶中生成对应于本文描述的任何突变的突变。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体来自原核生物。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体来自细菌。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体来自哺乳动物(例如，人)
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含与本文阐述的任何一种腺苷脱氨酶氨基酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。应当理解，本文提供的腺苷脱氨酶可以包括一个或多个突变(例如，本文提供的任何突变)。在一些实施方案中，如本文所提供的突变增加腺苷脱氨酶的胞苷脱氨活性。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶活性相对于没有突变的腺苷脱氨酶增加至少约30％。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶活性相对于没有突变的腺苷脱氨酶增加至少约50％。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶活性相对于没有突变的腺苷脱氨酶增加至少约70％。一些实施方案提供了编码任何前述方面或如本文所描述的腺苷脱氨酶核碱基编辑器多肽的多核苷酸分子。在一些实施方案中，多核苷酸是密码子优化的。
本公开提供了本文所述的具有一定百分比同一性的任何脱氨酶结构域加上任何突变或其组合。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含与本文提供的参考序列或任何腺苷脱氨酶相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、21个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体包含与本领域已知或本文描述的任何一种氨基酸序列相比具有至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个或至少170个相同的连续氨基酸残基的氨基酸序列。
C到T核碱基编辑蛋白的详情描述于国际PCT申请号PCT/US2016/058344(WO2017/070632)和Komor,A.C.等人,“Programmable editing of a target base in genomic DNAwithout double-stranded DNA cleavage”Nature 533,420-424(2016)，其全部内容以引用方式特此并入。
指导多核苷酸
当与结合的指导多核苷酸(例如，gRNA)结合时，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域可以特异性结合靶多核苷酸序列(即，通过结合的指导核酸的碱基和靶多核苷酸序列的碱基之间的互补碱基配对)，从而将碱基编辑器定位到需要被编辑的靶核酸序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列包括单链DNA或双链DNA。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列包括RNA。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列包括DNA-RNA杂交体。
CRISPR是适应性免疫系统，提供针对移动遗传因子(病毒、转座因子和接合质粒)的保护。CRISPR簇含有间隔区、与先行移动元件互补的序列和靶入侵核酸。CRISPR簇被转录并加工成CRISPR RNA(crRNA)。在II型CRISPR系统中，正确处理pre-crRNA需要反式编码的小RNA(tracrRNA)、内源性核糖核酸酶3(rnc)和Cas9蛋白。tracrRNA作为核糖核酸酶3辅助处理pre-crRNA的指导物。随后，Cas9/crRNA/tracrRNA核酸内切切割与间隔区互补的线性或环状dsDNA靶标。与crRNA不互补的靶链首先被核酸内切切割，然后被3’-5’核酸外切修剪。在自然界中，DNA结合和切割通常需要蛋白质和两种RNA。然而，可以对单指导RNA(“sgRNA”，或简称“gRNA”)进行工程化改造，以将crRNA和tracrRNA的各个方面并入单个RNA物种中。参见例如Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)，其全部内容以引用方式特此并入。Cas9识别CRISPR重复序列中的一个短基序(PAM或原型间隔区相邻基序)，以帮助区分自身与非自身。参见例如，“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes”Ferretti,J.J.等人,Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；“CRISPR RNAmaturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.等人,Nature 471:602-607(2011)；以及“Programmable dual-RNA-guided DNAendonuclease in adaptive bacterial immunity.”Jinek M.et al,Science 337:816-821(2012)，所述文献各自的全部内容都以引用方式并入本文。
PAM序列可以是本领域已知的任何PAM序列。合适的PAM序列包括但不限于NGG、NGA、NGC、NGN、NGT、NGCG、NGAG、NGAN、NGNG、NGCN、NGCG、NGTN、NNGRRT、NNNRRT、NNGRR(N)、TTTV、TYCV、TYCV、TATV、NNNNGATT、NNAGAAW或NAAAAC。Y是嘧啶；N是任何核苷酸碱基；W是A或T。
在一个实施方案中，本文所述的指导多核苷酸可以是RNA或DNA。在一个实施方案中，指导多核苷酸是gRNA。RNA/Cas复合物可以协助将Cas蛋白“指导”到靶DNA。Cas9/crRNA/tracrRNA核酸内切切割与间隔区互补的线性或环状dsDNA靶标。与crRNA不互补的靶链首先被核酸内切切割，然后被3’-5’核酸外切修剪。在自然界中，DNA结合和切割通常需要蛋白质和两种RNA。然而，可以对单指导RNA(“sgRNA”，或简称“gRNA”)进行工程化改造，以将crRNA和tracrRNA的各个方面并入单个RNA物种中。参见例如Jinek M.等人,Science 337:816-821(2012),其全部内容以引用方式特此并入。
在一些实施方案中，指导多核苷酸是至少一个单指导RNA(“sgRNA”或“gNRA”)。在一些实施方案中，指导多核苷酸包含两个或更多个单独的多核苷酸，它们可以通过例如互补碱基配对(例如，双指导多核苷酸、双gRNA)彼此相互作用。例如，指导多核苷酸可以包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)或可以包含一种或多种反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。
在一些实施方案中，指导多核苷酸是至少一种tracrRNA。在一些实施方案中，指导多核苷酸不需要PAM序列来将多核苷酸可编程DNA结合结构域(例如，Cas9或Cpf1)指导至靶核苷酸序列。
指导多核苷酸可以包含天然的或非天然的(non-natural或unnatural)核苷酸(例如，肽核酸或核苷酸类似物)。在一些情况下，指导核酸序列的靶区域的长度可以是至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。指导核酸的靶区域的长度可以在10-30个核苷酸之间，或在15-25个核苷酸之间，或在15-20个核苷酸之间。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器利用一个或多个指导多核苷酸(例如，多个gRNA)。在一些实施方案中，单指导多核苷酸用于本文所述的不同碱基编辑器。例如，单指导多核苷酸可以用于胞苷碱基编辑器和腺苷碱基编辑器。
在一些实施方案中，本文所述的方法可以利用工程化Cas蛋白。指导RNA(gRNA)是短合成RNA，其由Cas结合所必需的支架序列和使用者定义的约20个核苷酸的间隔区组成，所述间隔区定义了要修饰的基因组靶标。示例性gRNA支架序列在序列表中提供为SEQ IDNO:332-338、198和339-342。因此，熟练的技术人员可以改变Cas蛋白特异性的基因组靶标，部分取决于与基因组的其余部分相比，gRNA靶向序列对基因组靶标的特异性。
在其他实施方案中，指导多核苷酸可以在单个分子(即，单分子指导核酸)中包含核酸的多核苷酸靶向部分和核酸的支架部分。例如，单分子指导多核苷酸可以是单指导RNA(sgRNA或gRNA)。在本文中，术语指导多核苷酸序列涵盖能够与靶多核苷酸序列相互作用并将碱基编辑器导向靶多核苷酸序列的任何单分子、双分子或多分子核酸。
通常，指导多核苷酸(例如，crRNA/trRNA复合物或gRNA)包含有包含能够识别并结合靶多核苷酸序列的序列的“多核苷酸靶向片段”，以及在碱基编辑器的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域组分内稳定指导多核苷酸的“蛋白质结合片段”。在一些实施方案中，指导多核苷酸的多核苷酸靶向片段识别并结合DNA多核苷酸，从而促进DNA中碱基的编辑。在其他情况下，指导多核苷酸的多核苷酸靶向片段识别并结合RNA多核苷酸，从而促进RNA中碱基的编辑。在本文中，“片段”是指分子的部分或区域，例如，指导多核苷酸中的一段连续的核苷酸。片段还可以指复合物的区域/部分，使得片段可以包含多于一个分子的区域。例如，在指导多核苷酸包含多个核酸分子的情况下，其蛋白质结合片段可以包含例如沿着互补区域杂交的全部或部分多个单独分子。在一些实施方案中，包含两个单独分子的靶向DNA的RNA的蛋白质结合片段可以包含(i)长度为100个碱基对的第一RNA分子的碱基对40-75；和(ii)长度为50个碱基对的第二RNA分子的碱基对10-25。除非另外在特定背景下确切地定义，否则“片段”的定义不限于特定数目的总碱基对，不限于来自给定RNA分子的任何特定数目的碱基对，不限于复合物内的特定数目的单独分子，并且可以包括具有任何总长度的RNA分子的区域并且可以包括与其他分子具有互补性的区域。
指导多核苷酸可以化学合成、酶促合成或其组合合成。例如，可以使用标准的基于亚磷酰胺的固相合成方法合成gRNA。或者，可以通过将编码gRNA的DNA可操作地连接到由噬菌体RNA聚合酶识别的启动子控制序列来体外合成gRNA。合适的噬菌体启动子序列的实例包括T7、T3、SP6启动子序列或其变体。在gRNA包含两个单独分子(例如，crRNA和tracrRNA)的实施方案中，crRNA可以是化学合成的并且tracrRNA可以是酶促合成的。
gRNA分子可以体外转录。
指导多核苷酸可以例如通过编码gRNA的DNA(例如，包含编码gRNA的序列的DNA载体)来表达。gRNA可以单独编码，或与编码的碱基编辑器一起编码。这样的DNA序列可以一起或单独引入表达系统，例如细胞。例如，可以将编码多核苷酸可编程核苷酸结合结构域和gRNA的DNA序列引入到细胞中，每个DNA序列可以是单独分子的一部分(例如，含有多核苷酸可编程核苷酸结合结构域编码序列的载体和含有gRNA编码序列的第二载体),或两者可以是同一分子的一部分(例如，含有多核苷酸可编程核苷酸结合结构域和gRNA两者的编码(和调节)序列的载体)。RNA可以从合成的DNA分子(例如,基因片段)转录。
gRNA或指导多核苷酸可以包含三个区域：可以与染色体序列中的靶位点互补的5'末端的第一区域，可以形成茎环结构的第二内部区域，以及可以是单链的第三3'区域。每个gRNA的第一区域也可以不同，使得每个gRNA将融合蛋白或多分子复合物导向特定靶位点。此外，每个gRNA的第二和第三区域在所有gRNA中可以是相同的。
gRNA或指导多核苷酸的第一区域可以与染色体序列中靶位点处的序列互补，使得gRNA的第一区域可以与靶位点碱基配对。在一些情况下，gRNA的第一区域可以包含10个或约10个核苷酸至25个核苷酸(即，10个核苷酸至约25个核苷酸；或约10个核苷酸至约25个核苷酸；或10个核苷酸至约25个核苷酸；或约10个核苷酸至25个核苷酸)或更多。例如，gRNA的第一区域和染色体序列中的靶位点之间的碱基配对区域的长度可以是或可以是约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、23个、24个、25个或更多个核苷酸。有时，gRNA的第一区域的长度可以是或可以是约19个、20个或21个核苷酸。
gRNA或指导多核苷酸还可以包含形成二级结构的第二区域。例如，由gRNA形成的二级结构可以包含茎(或发夹)和环。环和茎的长度可以变化。例如，环的长度可以在约3至约10个核苷酸的范围内，并且茎的长度可以在约6至约20个碱基对的范围内。茎可以包含1至约10个或约10个核苷酸的一个或多个凸起。第二区域的总长度可以在16或约16至60个核苷酸长度的范围内。例如，环的长度可以是或可以是约4个核苷酸，并且茎可以是或可以是约12个碱基对。
gRNA或指导多核苷酸还可以在3'末端包含第三区域，所述第三区域基本上可以是单链的。例如，第三区域有时与感兴趣的细胞中的任何染色体序列不互补，并且有时与gRNA的其余部分不互补。此外，第三区域的长度可以变化。第三区域的长度可以多于4个或多于约4个核苷酸。例如，第三区域的长度可以在5或约5至60个核苷酸的范围内。
gRNA或指导多核苷酸可以靶向基因靶标的任何外显肽或内含肽。在某些情况下，指导物可以靶向基因的外显肽1或2；在其他情况下，指导物可以靶向基因的外显肽3或4。在一些实施方案中，组合物包含全部靶向相同外显肽的多个gRNA或靶向不同外显肽的多个gRNA。可以靶向基因的外显肽和/或内含肽。
gRNA或指导多核苷酸可以靶向约20个核苷酸或少于约20个核苷酸(例如，至少约5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个核苷酸)或约1-100个之间任何数量的核苷酸(例如，5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个)的核酸序列。靶核酸序列可以是紧邻PAM的第一个核苷酸的5'的20个碱基或可以是紧邻PAM的第一个核苷酸的5'的约20个碱基。gRNA可以靶向核酸序列。靶核酸可以是至少或至少约1-10个、1-20个、1-30个、1-40个、1-50个、1-60个、1-70个、1-80个、1-90或1-100个核苷酸。
用于选择、设计和验证指导多核苷酸例如gRNA和靶向序列的方法在本文中描述并且为本领域技术人员所知。例如，为了最小化核碱基编辑器系统中脱氨酶结构域(例如，AID结构域)的潜在底物混乱的影响，可能无意中被靶向以脱氨的残基(例如，靶核酸基因座内的单链DNA上的可能潜在的脱靶C残基)的数量可以被最小化。此外，软件工具可以用于优化对应于靶核酸序列的gRNA，例如，用于最小化整个基因组的总脱靶活性。例如，对于使用化脓性链球菌Cas9的每个可能的靶向结构域选择，可以在整个基因组中鉴定所有脱靶序列(在选择的PAM之前，例如NAG或NGG)，所述基因组含有多达一定数量(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的错配的碱基对。可以鉴定与靶位点互补的gRNA的第一区域，并且可以根据其总预测脱靶分数对所有第一区域(例如，crRNA)排序；排名靠前的靶结构域表示那些可能具有最大靶上和最小脱靶活性的结构域。可以通过使用本领域已知的方法和/或如本文说明对候选靶向gRNA进行功能评估。
作为非限制性实例，gRNA的crRNA中用于与Cas9一起使用的靶DNA杂交序列可以使用DNA序列搜索算法来鉴定。gRNA设计使用基于公共工具cas-offinder的自定义gRNA设计软件进行，如Bae S.,Park J.,&Kim J.-S.Cas-OFFinder:A fast and versatilealgorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guidedendonucleases.Bioinformatics 30,1473-1475(2014)中所述。此软件在计算指导物全基因组脱靶倾向后对其进行评分。对于长度在17至24范围内的指导物，通常会考虑从完全匹配到7个错配的匹配。一旦计算确定脱靶位点，就会为每个指导物计算总分，并使用Web界面以表格输出形式进行汇总。除了鉴定与PAM序列相邻的潜在靶位点外，所述软件还鉴定与选定靶位点相差1个、2个、3个或超过3个核苷酸的所有PAM相邻序列。可以获得靶核酸序列(例如，靶基因)的基因组DNA序列，并且使用公开可用的工具(例如RepeatMasker程序)可以筛选重复元件。RepeatMasker在输入DNA序列中搜索重复元件和低复杂性区域。输出是给定查询序列中存在的重复序列的详细注释。
鉴定后，gRNA的第一区域(例如，crRNA)基于它们与靶位点的距离、它们的正交性以及与相关PAM序列紧密匹配的5'核苷酸(例如，基于含有相关PAM的人基因组中密切匹配的鉴定的5'G，例如，化脓性链球菌的NGG PAM、金黄色葡萄球菌的NNGRRT或NNGRRV PAM)的存在进行分级。如本文所用，正交性是指人基因组中含有与靶序列最少的错配数量的序列的数量。例如，“高水平正交性”或“良好正交性”是指在人基因组中除预期靶标外没有相同序列的20-mer靶向结构域，或指在靶序列中含有一个或两个错配的任何序列。可以选择具有良好正交性的靶向结构域以最小化脱靶DNA切割。
然后gRNA可以作为RNA分子或非RNA核酸分子(例如,DNA分子)被引入到细胞中或胚胎中。在一个实施方案中，编码gRNA的DNA能够可操作地连接至启动子控制序列，以用于在感兴趣的细胞或胚胎中表达所述gRNA。RNA编码序列能够可操作地连接至由RNA聚合酶III(Pol III)识别的启动子序列。可用于表达gRNA的质粒载体包括但不限于px330载体和px333载体。在一些情况下，质粒载体(例如，px333载体)可以包含至少两个编码gRNA的DNA序列。此外，载体可以包含另外的表达控制序列(例如，增强子序列、Kozak序列、聚腺苷酸化序列、转录终止序列等)、选择性标志物序列(例如，GFP或抗生素抗性基因诸如嘌呤霉素)、复制起点等。编码gRNA的DNA分子还可以是线性的。编码gRNA或指导多核苷酸的DNA分子还可以是环状的。
在一些实施方案中，报告系统用于检测碱基编辑活性和测试候选指导多核苷酸。在一些实施方案中，报告系统包括基于报告基因的测定，其中碱基编辑活性导致报告基因的表达。例如，报告系统可以包括包含灭活起始密码子的报告基因，例如，模板链上从3'-TAC-5'到3'-CAC-5'的突变。在靶C成功脱氨后，相应的mRNA将被转录为5'-AUG-3'而不是5'-GUG-3'，从而实现报告基因的翻译。合适的报告基因对于本领域技术人员是显而易见的。报告基因的非限制性实例包括编码绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的基因，或者其表达对于本领域技术人员来说为可检测的和显而易见的任何其他基因。报告系统可以用于测试许多不同的gRNA，例如，以确定相应脱氨酶将靶向哪些相对于靶DNA序列的残基。还可以测试靶向非模板链的sgRNA，以评估特定碱基编辑蛋白(例如，Cas9脱氨酶融合蛋白或多分子复合物)的脱靶效应。在一些实施方案中，可以设计这样的gRNA，使得突变的起始密码子不会与gRNA碱基配对。指导多核苷酸可以包括标准核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸(例如，假尿苷)、核糖核苷酸异构体和/或核糖核苷酸类似物。在一些实施方案中，指导多核苷酸可以包含至少一种可检测标记。可检测标记可以是荧光团(例如，FAM、TMR、Cy3、Cy5、Texas Red、Oregon Green、Alexa Fluors、Halo标签或合适的荧光染料)、检测标签(例如，生物素、地高辛等)、量子点或金粒子。
在一些实施方案中，碱基编辑器系统可以包含多个指导多核苷酸，例如gRNA。例如，gRNA可以靶向一个或多个包含在碱基编辑器系统中的靶基因座(例如，至少1个gRNA、至少2个gRNA、至少5个gRNA、至少10个gRNA、至少20个gRNA、至少30个gRNA、至少50个gRNA)。多个gRNA序列可以串联排列并且优选地通过直接重复分开。
修饰的多核苷酸
为了增强表达、稳定性和/或基因组/碱基编辑效率，和/或减少可能的毒性，可以修饰碱基编辑器编码序列(例如，mRNA)和/或指导多核苷酸(例如，gRNA)以包含一种或多种修饰的核苷酸和/或化学修饰，例如，使用假尿苷、5-甲基-胞嘧啶、2′-O-甲基-3′-膦酰基乙酸酯、2′-O-甲基硫基PACE(MSP)、2′-O-甲基-PACE(MP)、2′-氟RNA(2′-F-RNA)、＝受限乙基(S-cEt)、2′-O-甲基(‘M’)、2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯(‘MS’)、2'-O-甲基-3'-硫代膦酰基乙酸酯(‘MSP’)、5-甲氧基尿苷、硫代磷酸酯和N1-甲基假尿苷。化学保护的gRNA可以增强体内和离体的稳定性和编辑效率。使用化学修饰的mRNA和指导RNA的方法是本领域已知的，并且例如由Jiang等人,Chemical modifications of a denine base editor mRNA andguide RNA expand its application scope.Nat Commun 11,1979(2020).doi.org/ 10.1038/s41467-020-15892-8；Callum等人,N1-Methylpseudouridine substitutionenhances the performance of synthetic mRNA switches in cells,Nucleic AcidsResearch,第48卷,第6期,2020年4月6日,第35页，以及Andries等人,Journal ofControlled Release,第217卷,2015年11月10日,第337-344页描述，所述文献各自都以引用方式并入本文。
在特定实施方案中，化学修饰是2'-O-甲基(2'-OMe)修饰。修饰的指导RNA可以提高saCas9的功效和特异性。单个修饰的效果基于所用化学修饰的位置和组合以及与其他修饰的核苷酸的分子间和分子内相互作用而变化。举例而言，S-cEt已被用于改善寡核苷酸分子内折叠。
在一些实施方案中，指导多核苷酸在指导物的5'末端和/或3'末端包含一个或多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，指导多核苷酸在指导物的5'末端和/或3'末端包含两个、三个、四个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，指导多核苷酸在指导物的5'末端和/或3'末端包含两个、三个、四个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，指导多核苷酸在指导物的5'末端包含四个修饰的核苷酸，并且在指导物的3'末端包含四个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包含2'-O-甲基或硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，指导物包含至少约50％-75％的修饰的核苷酸。在一些实施方案中，指导物包含至少约85％或更多的修饰的核苷酸。在一些实施方案中，gRNA的5'末端处的至少约1-5个核苷酸被修饰并且gRNA的3'末端处的至少约1-5个核苷酸被修饰。在一些实施方案中，gRNA的5'端和3'端各处至少约3-5个连续核苷酸被修饰。在一些实施方案中，同向重复或反向重复中存在的至少约20％的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，同向重复或反向重复中存在的至少约50％的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，同向重复或反向重复中存在的至少约50％-75％的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，同向重复或反向重复中存在的至少约100个核苷酸被修饰。在一些实施方案中，gRNA支架中存在的发夹中存在的至少约20％或更多的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，gRNA支架中存在的发夹中存在的至少约50％或更多的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，指导物包含可变长度间隔区。在一些实施方案中，指导物包含20-40个核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，指导物包含间隔区，其包含至少约20-25个核苷酸或至少约30-35个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区包含修饰的核苷酸。在一些实施方案中，指导物包含以下中的两者或更多者：
gRNA的5'末端处的至少约1-5个核苷酸被修饰并且gRNA的3'末端处的至少约1-5个核苷酸被修饰；
同向重复或反向重复中存在的至少约20％的核苷酸被修饰；
同向重复或反向重复中存在的至少约50％-75％的核苷酸被修饰；
gRNA支架中存在的发夹中存在的至少约20％或更多的核苷酸被修饰；
可变长度间隔区；以及
包含修饰的核苷酸的间隔区。
在实施方案中，gRNA含有许多修饰的核苷酸和/或化学修饰(“重修饰”)。此类重修饰可以在体内或体外将碱基编辑增加约2倍。对于此类修饰，mN＝2′-OMe；Ns＝硫代磷酸酯(PS)，其中“N”表示任何核苷酸，如本领域技术人员所理解的。在一些情况下，核苷酸(N)可以含有两种修饰，例如2'-OMe和PS修饰两者。例如，具有硫代磷酸酯和2'OMe的核苷酸表示为“mNs”；当有两个修饰彼此相邻时，符号为“mNsmNs”。
在修饰的gRNA的一些实施方案中，gRNA包含选自由以下组成的组的一种或多种化学修饰：2'-O-甲基(2'-OMe)、硫代磷酸酯(PS)、2'-O-甲基硫基PACE(MSP)、2'-O-甲基-PACE(MP)、2'-O-甲基硫基PACE(MSP)、2'-氟RNA(2'-F-RNA)和受限乙基(S-cEt)。在实施方案中，gRNA包含2'-O-甲基或硫代磷酸酯修饰。在一个实施方案中，gRNA包含2'-O-甲基和硫代磷酸酯修饰。在一个实施方案中，修饰将碱基编辑增加至少约2倍。
指导多核苷酸可以包含一种或多种修饰以提供具有新的或增强的特征的核酸。指导多核苷酸可以包含核酸亲和标签。指导多核苷酸可以包含合成核苷酸、合成核苷酸类似物、核苷酸衍生物和/或修饰的核苷酸。
在一些情况下，gRNA或指导多核苷酸可以包括修饰。可以在gRNA或指导多核苷酸的任何位置进行修饰。可以对单个gRNA或指导多核苷酸进行超过一种修饰。gRNA或指导多核苷酸可以在修饰后进行质量控制。在一些情况下，质量控制可以包括PAGE、HPLC、MS或其任何组合。
gRNA或指导多核苷酸的修饰可以是取代、插入、缺失、化学修饰、物理修饰、稳定化、纯化或其任何组合。
gRNA或指导多核苷酸也可以被以下修饰：5'腺苷酸、5'鸟苷-三磷酸帽、5'N7-甲基鸟苷-三磷酸帽、5'三磷酸帽、3'磷酸、3'硫代磷酸、5'磷酸、5'硫代磷酸、Cis-Syn胸苷二聚体、三聚体、C12间隔区、C3间隔区、C6间隔区、dSpacer、PC间隔区、rSpacer、间隔区18、间隔区9、3'-3'修饰、2′-O-甲基硫基PACE(MSP)、2′-O-甲基-PACE(MP)和受限乙基(S-cEt)、5'-5'修饰、脱碱基、吖啶、偶氮苯、生物素、生物素BB、生物素TEG、胆固醇TEG、脱硫生物素TEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-生物素、双生物素、PC生物素、补骨脂素C2、补骨脂素C6、TINA、3'DABCYL、Black Hole1、Black Hole/>2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、羧基接头、硫醇接头、2'-脱氧核糖核苷类似物嘌呤、2'-脱氧核糖核苷类似物嘧啶、核糖核苷类似物、2'-O-甲基核糖核苷类似物、糖修饰类似物、摇摆/通用碱基、荧光染料标记、2'-氟RNA、2'-O-甲基RNA、甲基膦酸盐、磷酸二酯DNA、磷酸二酯RNA、硫代磷酸酯DNA、硫代磷酸酯RNA、UNA、假尿苷-5'-三磷酸、5'-甲基胞苷-5'-三磷酸盐，或其任何组合。
在一些情况下，修饰是永久性的。在其他情况下，修饰是瞬时的。在一些情况下，对gRNA或指导多核苷酸进行多种修饰。gRNA或指导多核苷酸修饰可以改变核苷酸的物理化学特性，诸如它们的构象、极性、疏水性、化学反应性、碱基配对相互作用或其任何组合。
通过用分离的gRNA或包含编码指导RNA的序列和启动子的质粒DNA转染细胞，可以将指导多核苷酸转移至细胞中。gRNA或指导多核苷酸也可以通过其他方式转移到细胞中，诸如使用病毒介导的基因递送。可以分离gRNA或指导多核苷酸。例如，gRNA可以以分离的RNA的形式转染到细胞或生物体中。gRNA可以通过使用本领域已知的任何体外转录系统进行体外转录来制备。gRNA可以以分离的RNA的形式而不是以包含gRNA编码序列的质粒的形式转移到细胞中。
修饰也可以是硫代磷酸酯取代。在一些情况下，天然磷酸二酯键可以易于被细胞核酸酶快速降解；并且使用硫代磷酸酯(PS)键取代物的核苷酸间键联的修饰对于通过细胞降解水解可以更稳定。修饰可以增加gRNA或指导多核苷酸的稳定性。修饰还可以增强生物活性。在一些情况下，硫代磷酸酯增强的RNA gRNA可以抑制RNA酶A、RNA酶T1、小牛血清核酸酶或其任何组合。这些特性可以允许PS-RNA gRNA用于在体内或体外暴露于核酸酶的可能性较高的应用中。例如，可以在gRNA的5'或3'末端的最后3-5个核苷酸之间引入硫代磷酸酯(PS)键，其可以抑制核酸外切酶降解。在一些情况下，可以在整个gRNA中添加硫代磷酸酯键以减少核酸内切酶的攻击。
在一些实施方案中，设计指导RNA以破坏剪接位点(即，剪接受体(SA)或剪接供体(SD))。在一些实施方案中，设计指导RNA使得碱基编辑导致提前终止密码子。
原型间隔区相邻基序
术语“原型间隔区相邻基序(PAM)”或PAM样基序是指紧随CRISPR细菌适应性免疫系统中Cas9核酸酶靶向的DNA序列的2-6个碱基对DNA序列。在一些实施方案中，PAM可以是5'PAM(即，位于原型间隔区5'末端的上游)。在其他实施方案中，PAM可以是3'PAM(即，位于原型间隔区5'末端的下游)。PAM序列对于靶标结合至关重要，但确切的序列取决于Cas蛋白的类型。PAM序列可以是本领域已知的任何PAM序列。合适的PAM序列包括但不限于NGG、NGA、NGC、NGN、NGT、NGTT、NGCG、NGAG、NGAN、NGNG、NGCN、NGCG、NGTN、NNGRRT、NNNRRT、NNGRR(N)、TTTV、TYCV、TYCV、TATV、NNNNGATT、NNAGAAW或NAAAAC。Y是嘧啶；N是任何核苷酸碱基；W是A或T。
本文提供的碱基编辑器可以包含CRISPR蛋白衍生结构域，所述结构域能够结合含有规范或非规范原型间隔区相邻基序(PAM)序列的核苷酸序列。PAM位点是接近靶多核苷酸序列的核苷酸序列。本公开的一些方面提供了碱基编辑器，其包含具有不同PAM特异性的全部或部分CRISPR蛋白。
例如，Cas9蛋白，诸如来自化脓性链球菌的Cas9(spCas9)，通常需要规范的NGGPAM序列来结合特定的核酸区域，其中“NGG”中的“N”是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)，并且G是鸟嘌呤。PAM可以是CRISPR蛋白质特异性的，并且在包含不同CRISPR蛋白质衍生结构域的不同碱基编辑器之间可以不同。PAM可以是靶序列的5'或3'。PAM可以位于靶序列的上游或下游。PAM的长度可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核苷酸。通常，PAM的长度在2-6个核苷酸之间。
在一些实施方案中，PAM是“NRN”PAM，其中“NRN”中的“N”是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)，并且R是腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)；或PAM为“NYN”PAM，其中NYN中的“N”是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)，并且Y是胞苷(C)或胸腺嘧啶(T)，例如，如R.T.Walton等人,2020,Science,10.1126/science.aba8853(2020)中所描述的，其全部内容以引用方式并入本文。
下表6中描述了几种PAM变体。
表6.Cas9蛋白和对应PAM序列
变体 PAM
spCas9 NGG
spCas9-VRQR NGA
spCas9-VRER NGCG
xCas9(sp) NGN
saCas9 NNGRRT
saCas9-KKH NNNRRT
spCas9-MQKSER NGCG
spCas9-MQKSER NGCN
spCas9-LRKIQK NGTN
spCas9-LRVSQK NGTN
spCas9-LRVSQL NGTN
spCas9-MQKFRAER NGC
Cpf1 5'(TTTV)
SpyMac 5'-NAA-3'
在一些实施方案中，PAM是NGC。在一些实施方案中，NGC PAM被Cas9变体识别。在一些实施方案中，NGC PAM变体包含一个或多个选自D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E和T1337R(统称为“MQKFRAER”)的氨基酸取代。
在一些实施方案中，PAM是NGT。在一些实施方案中，NGT PAM被Cas9变体识别。在一些实施方案中，NGT PAM变体是通过在一个或多个残基1335、1337、1135、1136、1218和/或1219处的靶向突变产生的。在一些实施方案中，NGT PAM变体是通过在一个或多个残基1219、1335、1337、1218处的靶向突变产生的。在一些实施方案中，NGT PAM变体是通过在一个或多个残基1135、1136、1218、1219和或1335处的靶向突变产生的。在一些实施方案中，NGT PAM变体选自下表7A和6B中提供的靶向突变组。
表7A：在残基1219、1335、1337、1218处的NGT PAM变体突变
变体 E1219V R1335Q T1337 G1218
1 F V T
2 F V R
3 F V Q
4 F V L
5 F V T R
6 F V R R
7 F V Q R
8 F V L R
9 L L T
10 L L R
11 L L Q
12 L L L
13 F I T
14 F I R
15 F I Q
16 F I L
17 F G C
18 H L N
19 F G C A
20 H L N V
21 L A W
22 L A F
23 L A Y
24 I A W
25 I A F
26 I A Y
表7B：在残基1135、1136、1218、1219和1335处的NGT PAM变体突变
变体 D1135L S1136R G1218S E1219V R1335Q
27 G
28 V
29 I
30 A
31 W
32 H
33 K
34 K
35 R
36 Q
37 T
38 N
39 I
40 A
41 N
42 Q
43 G
44 L
45 S
46 T
47 L
48 I
49 V
50 N
51 S
52 T
53 F
54 Y
55 N1286Q I1331F
在一些实施方案中，NGT PAM变体选自表7A和表7B中的变体5、7、28、31或36。在一些实施方案中，变体具有改进的NGT PAM识别。
在一些实施方案中，NGT PAM变体在残基1219、1335、1337和/或1218处具有突变。在一些实施方案中，NGT PAM变体是从下表8中提供的变体中选择的具有改进识别的突变。
表8：在残基1219、1335、1337和1218处的NGT PAM变体突变
变体 E1219V R1335Q T1337 G1218
1 F V T
2 F V R
3 F V Q
4 F V L
5 F V T R
6 F V R R
7 F V Q R
8 F V L R
在一些实施方案中，NGT PAM选自下表9中提供的变体。
表9.NGT PAM变体
NGTN变体 D1135 S1136 G1218 E1219 A1322R R1335 T1337
变体1 LRKIQK L R K I - Q K
变体2 LRSVQK L R S V - Q K
变体3 LRSVQL L R S V - Q L
变体4 LRKIRQK L R K I R Q K
变体5 LRSVRQK L R S V R Q K
变体6 LRSVRQL L R S V R Q L
在一些实施方案中，NGTN变体是变体1。在一些实施方案中，NGTN变体是变体2。在一些实施方案中，NGTN变体是变体3。在一些实施方案中，NGTN变体是变体4。在一些实施方案中，NGTN变体是变体5。在一些实施方案中，NGTN变体是变体6。
在一些实施方案中，Cas9结构域是来自化脓性链球菌的Cas9结构域(SpCas9)。在一些实施方案中，SpCas9结构域是核酸酶活性SpCas9、无核酸酶活性的SpCas9(SpCas9d)或SpCas9切口酶(SpCas9n)。在一些实施方案中，SpCas9包含D9X突变，或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变，其中X是除D之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，SpCas9包含D9A突变，或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变。在一些实施方案中，SpCas9结构域、SpCas9d结构域或SpCas9n结构域可以结合具有非规范PAM的核酸序列。在一些实施方案中，SpCas9结构域、SpCas9d结构域或SpCas9n结构域可以结合具有NGG、NGA或NGCGPAM序列的核酸序列。
在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135X、R1335X和T1337X突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变中的一个或多个，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135E、R1335Q和T1337R突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变中的一个或多个。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135E、R1335Q和T1337R突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135X、R1335X和T1337X突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变中的一个或多个，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135V、R1335Q和T1337R突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变中的一个或多个。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135V、R1335Q和T1337R突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135X、G1218X、R1335X和T1337X突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变中的一个或多个，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135V、G1218R、R1335Q和T1337R突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变中的一个或多个。在一些实施方案中，SpCas9结构域包含D1135V、G1218R、R1335Q和T1337R突变或本文提供的任何氨基酸序列中的相应突变。
在一些实施例中，可将由本文公开的碱基编辑器的CRISPR蛋白衍生结构域识别的PAM提供到细胞的编码碱基编辑器的插入物(例如，AAV插入物)的单独寡核苷酸上。在这样的实施方案中，提供单独寡核苷酸上的PAM可以允许切割否则将不能被切割的靶序列，因为在与靶序列相同的多核苷酸上不存在相邻的PAM。
在一个实施方案中，化脓性链球菌Cas9(SpCas9)可以用作用于基因组工程化的CRISPR核酸内切酶。然而，也可以使用其他的。在一些实施方案中，可以使用不同的核酸内切酶来靶向某些基因组靶标。在一些实施方案中，可以使用具有非NGG PAM序列的合成SpCas9衍生变体。此外，已经鉴定了来自不同物种的另外的Cas9直向同源物，并且这些“非SpCas9”可以结合也可以用于本公开的多种PAM序列。例如，相对较大的SpCas9(大约4kb编码序列)可以导致携带不能在细胞中有效表达的SpCas9 cDNA的质粒。相反，金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)的编码序列比SpCas9短大约1千碱基，可能使其能够在细胞中有效表达。与SpCas9类似，SaCas9核酸内切酶能够体外修饰哺乳动物细胞中的靶基因和体内修饰小鼠中的靶基因。在一些实施方案中，Cas蛋白可以靶向不同的PAM序列。在一些实施方案中，靶基因可以与例如Cas9 PAM、5'-NGG相邻。在其他实施方案中，其他Cas9直向同源物可以具有不同的PAM需求。例如，其他PAM，诸如嗜热链球菌(CRISPR1的5'-NNAGAA和CRISPR3的5'-NGGNG)和脑膜炎奈瑟菌(5'-NNNNGATT)的PAM，也可以与靶基因相邻。
在一些实施方案中，对于化脓性链球菌系统，靶基因序列可以在5'-NGG PAM之前(即，5'至)，并且20-nt的指导RNA序列可以与相反链碱基配对以介导与PAM相邻的Cas9切割。在一些实施方案中，相邻的切口可以是PAM上游的3个或约3个碱基对。在一些实施方案中，相邻的切口可以是PAM上游的10个或约10个碱基对。在一些实施方案中，相邻的切口可以是PAM上游的0-20个或约0-20个碱基对。例如，相邻切口可以在PAM上游1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个碱基对旁。相邻的切口也可以在PAM下游1到30个碱基对。能够结合PAM序列的示例性SpCas9蛋白的序列如下。
在一些实施方案中，工程化SpCas9变体能够识别侧翼为3′H(非G PAM)的原型间隔区相邻基序(PAM)序列(参见表2A至2D)。在一些实施方案中，SpCas9变体识别NRNH PAM(其中R是A或G并且H是A、C或T)。在一些实施方案中，非G PAM是NRRH、NRTH或NRCH(参见例如，Miller,S.M.等人Continuous evolution of SpCas9variants compatible with non-GPAMs,Nat.Biotechnol.(2020)，其内容以引用方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，Cas9结构域是重组Cas9结构域。在一些实施方案中，重组Cas9结构域是SpyMacCas9结构域。在一些实施方案中，SpyMacCas9结构域是核酸酶活性SpyMacCas9、无核酸酶活性的SpyMacCas9(SpyMacCas9d)或SpyMacCas9切口酶(SpyMacCas9n)。在一些实施方案中，SaCas9结构域、SaCas9d结构域或SaCas9n结构域可以结合具有非规范PAM的核酸序列。在一些实施方案中，SpyMacCas9结构域、SpCas9d结构域或SpCas9n结构域可以结合具有NAA PAM序列的核酸序列。
猕猴链球菌(Streptococcus macacae)中具有天然5'-NAAN-3'PAM特异性的SpyCas9的示例性Cas9 A同源物的序列是本领域已知的并且例如由Chatterjee等人,“A Cas9with PAM recognition for adenine dinucleotides”,Nature Communications,第11卷,文章号2474(2020)描述，并且在序列表中为SEQ ID NO:252。
在一些实施方案中，变体Cas9蛋白具有H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A和D1218A突变，使得多肽切割靶DNA或RNA的能力减小。此类Cas9蛋白切割靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力减小，但保留了结合靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力。作为另一个非限制性实例，在一些实施方案中，变体Cas9蛋白具有D10A、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A和D1218A突变，使得多肽切割靶DNA的能力减小。此类Cas9蛋白切割靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力减小，但保留了结合靶DNA(例如，单链靶DNA)的能力。在一些实施方案中，当变体Cas9蛋白具有W476A和W1126A突变或当变体Cas9蛋白具有P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A和D1218A突变时，变体Cas9蛋白不能有效地结合PAM序列。因此，在一些此类情况下，当此类变体Cas9蛋白用于结合的方法时，所述方法不需要PAM序列。换言之，在一些实施方案中，当此类变体Cas9蛋白用于结合的方法时，所述方法可以包括指导RNA，但是此方法可以在不存在PAM序列的情况下进行(并且因此由指导RNA的靶向片段提供结合的特异性)。可以使其它残基突变以实现以上作用(即，使一个或另一个核酸酶部分失活)。作为非限制性实例，残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986和/或A987可以被改变(即，取代)。同样，除了丙氨酸取代以外的突变也为适合的。
在一些实施方案中，碱基编辑器的CRISPR蛋白衍生结构域可以包含具有规范PAM序列(NGG)的全部或部分Cas9蛋白。在其他实施方案中，碱基编辑器的Cas9衍生结构域可以采用非规范PAM序列。此类序列已在本领域中描述并且对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，结合非规范PAM序列的Cas9结构域已描述于Kleintiver,B.P.等人,“EngineeredCRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities”Nature 523,481-485(2015)；和Kleintiver，B.P.等人,“Broadening the targeting range ofStaphylococcus aureus CRISPR-Cas9by modifying PAM recognition”NatureBiotechnology 33,1293-1298(2015)；R.T.Walton等人“Unconstrained genometargeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants”Science10.1126/science.aba8853(2020)；Hu等人“Evolved Cas9 variants with broad PAMcompatibility and high DNA specificity,”Nature,2018Apr.5,556(7699),57-63；Miller等人,“Continuous evolution of SpCas9variants compatible with non-GPAMs”Nat.Biotechnol.,2020Apr；38(4):471-481；每一个的全部内容以引用方式特此并入。
包含NapDNAbp和腺苷脱氨酶变体的融合蛋白和多分子复合物
本公开的一些方面提供了包含Cas9结构域或其他核酸可编程DNA结合蛋白(例如，Cas12)和一个或多个腺苷脱氨酶变体结构域的融合蛋白或多分子复合物。应当理解，Cas9结构域可以是本文提供的任何Cas9结构域或Cas9蛋白(例如，dCas9或nCas9)。在一些实施方案中，本文提供的任何Cas9结构域或Cas9蛋白(例如，dCas9或nCas9)可以与本文提供的任何腺苷脱氨酶变体融合。本文公开的碱基编辑器的结构域可以以任何顺序排列。
例如但不限于，在一些实施方案中，融合蛋白包含以下结构：
NH2-[腺苷脱氨酶]-[Cas9结构域]-COOH；
NH2-[Cas9结构域]-[腺苷脱氨酶]-COOH；
在一些实施方案中，本文提供的任何Cas12结构域或Cas12蛋白可以与本文提供的任何腺苷脱氨酶变体融合。例如但不限于，在一些实施方案中，融合蛋白包含以下结构：
NH2-[腺苷脱氨酶]-[Cas12结构域]-COOH；
NH2-[Cas12结构域]-[腺苷脱氨酶]-COOH；
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是TadA*8变体。示例性融合蛋白结构包括以下：
NH2-[TadA*8]-[Cas9结构域]-COOH；
NH2-[Cas9结构域]-[TadA*8]-COOH；
NH2-[TadA*8]-[Cas12结构域]-COOH；或
NH2-[Cas12结构域]-[TadA*8]-COOH。
在一些实施方案中，TadA*8变体是TadA*8.1,TadA*8.2、TadA*8.3、TadA*8.4、TadA*8.5、TadA*8.6、TadA*8.7、TadA*8.8、TadA*8.9、TadA*8.10、TadA*8.11、TadA*8.12、TadA*8.13、TadA*8.14、TadA*8.15、TadA*8.16、TadA*8.17、TadA*8.18、TadA*8.19、TadA*8.20、TadA*8.21、TadA*8.22、TadA*8.23或TadA*8.24。在一些实施方案中，TadA*8变体是TadA*20，其包含增加胞嘧啶脱氨酶活性的一个或多个改变。
在一些实施方案中，融合蛋白可以包含侧翼为Cas9或Cas12多肽的N端片段和C端片段的脱氨酶。在一些实施方案中，融合蛋白可以包含侧翼为Cas9或Cas12多肽的N端片段和C端片段的腺苷脱氨酶变体。
在一些实施方案中，包含腺苷脱氨酶变体和napDNAbp(例如，Cas9或Cas12结构域)的融合蛋白不包含接头序列。在一些实施方案中，接头存在于腺苷脱氨酶变体与napDNAbp之间。在一些实施方案中，以上通用架构中使用的“]-[”表示存在任选的接头。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体和napDNAbp经由本文提供的任何接头融合。例如，在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体和napDNAbp经由本文提供的任何接头融合。
应当理解，本公开的融合蛋白或多分子复合物可以包含一个或多个另外的特征。例如，在一些实施方案中，融合蛋白或多分子复合物可以包含抑制剂、细胞质定位序列、输出序列(诸如核输出序列)或其他定位序列，以及可用于溶解、纯化或检测融合蛋白或多分子复合物的序列标签。本文提供的合适的蛋白质标签包括但不限于生物素羧化酶载剂蛋白(BCCP)标签、myc标签、钙调蛋白标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、多组氨酸标签(也称为组氨酸标签或His标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、nus标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、绿色荧光蛋白(GFP)标签、硫氧还蛋白标签、S标签、Softag(例如，Softag 1、Softag 3)、链球菌标签、生物素连接酶标签、FlAsH标签、V5标签和SBP标签。另外的合适序列对于本领域技术人员将是显而易见的。在一些实施方案中，融合蛋白包含一个或多个His标签。
示例性但非限制性融合蛋白描述于国际PCT申请号PCT/US2017/045381、PCT/US2019/044935和PCT/US2020/016288，其各自以引用方式整体并入本文。
包含核定位序列(NLS)的融合蛋白和多分子复合物
在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白或多分子复合物还包含一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个)核靶向序列，例如核定位序列(NLS)。在一个实施方案中，使用二分NLS。在一些实施方案中，NLS包含有助于将蛋白质(包含NLS)输入细胞核(例如，通过核转运)的氨基酸序列。在一些实施方案中，NLS与融合蛋白的N端或C端融合。在一些实施方案中，NLS与nCas9结构域或dCas9结构域的C端或N端融合。在一些实施方案中，NLS与Cas12结构域的N端或C端融合。在一些实施方案中，NLS与腺苷脱氨酶变体的N端或C端融合。在一些实施方案中，NLS通过一个或多个接头与融合蛋白融合。在一些实施方案中，NLS在没有接头的情况下与融合蛋白融合。在一些实施方案中，NLS包含本文提供或引用的任何一种NLS序列的氨基酸序列。另外的核定位序列在本领域中是已知的并且对于技术人员来说是显而易见的。例如，NLS序列描述于Plank等人,PCT/EP 2000/011690，其内容以引用方式并入本文，因为其公开了示例性核定位序列。在一些实施方案中，NLS包括氨基酸序列PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV(SEQ ID NO:343)、KRTADGSEFE SPKKKRKV(SEQ ID NO:191)、KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:192)、KKTELQTTNAENKTKKL(SEQ ID NO:193)、KRGINDRNFWRGENGRKTR(SEQ ID NO:194)、RKSGKIAAIVVKRP RKPKKKRKV(SEQ ID NO:344)或MDSLLMNRRKFLYQFKNVR WAKGRRETYLC(SEQ ID NO:197)。
在一些实施方案中，包含腺苷脱氨酶变体、Cas9结构域和NLS的融合蛋白不包含接头序列。在一些实施方案中，存在在一个或多个结构域或蛋白质(例如，腺苷脱氨酶、Cas9结构域或NLS)之间的接头序列。在一些实施方案中，接头存在于腺苷脱氨酶变体结构域与napDNAbp之间。在一些实施方案中，以下通用架构中使用的“-”表示存在任选的接头。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体和napDNAbp经由本文提供的任何接头融合。例如，在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体和napDNAbp经由本文提供的任何接头融合。
在一些实施方案中，具有腺苷脱氨酶变体和napDNAbp(例如，Cas9或Cas12)结构域的示例性napDNAbp(例如，Cas9或Cas12)融合蛋白的一般架构包含以下结构中的任何一种，其中NLS是核定位序列(例如，本文提供的任何NLS)，NH2是融合蛋白的N端，COOH是融合蛋白的C端：
NH2-NLS-[腺苷脱氨酶]-[napDNAbp结构域]-COOH；
NH2-NLS[napDNAbp结构域]-[腺苷脱氨酶]-COOH；
NH2-[腺苷脱氨酶]-[napDNAbp结构域]-NLS-COOH；
NH2-[napDNAbp结构域]-[腺苷脱氨酶]-NLS-COOH；
NH2-NLS-[腺苷脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-[UGI]-COOH；
NH2-NLS-[UGI]-[腺苷脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-NLS-[核碱基编辑结构域]-[腺苷脱氨酶]-[UGI]-COOH；或
NH2-NLS-[UGI]-[核碱基编辑结构域]-[腺苷脱氨酶]-COOH；
NH2-[腺苷脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-[UGI]-[UGI]-NLS-COOH；
NH2-[UGI]-[UGI]-[腺苷脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-NLS-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[腺苷脱氨酶]-[UGI]-[UGI]-NLS-COOH；或
NH2-[UGI]-[UGI]-[核碱基编辑结构域]-[腺苷脱氨酶]-NLS-COOH；
其中以上“]-[”的每个实例是任选的接头。
在一些实施方案中，NLS存在于接头中或NLS侧接接头，例如本文所述。二分NLS包含两个碱性氨基酸簇，它们由相对较短的间隔区序列分隔(因此二分-2个部分，而单组分NLS不是)。核质蛋白的NLS，KR[PAATKKAGQA]KKKK(SEQ ID NO:192)，是普遍存在的二分信号的原型：两个碱性氨基酸簇，由约10个氨基酸的间隔区分隔。示例性二分NLS的序列如下：
PKKKRKVEGADKRTADGSEFESPKKKRKV(SEQ ID NO:343)
可以使用编码包含一个或多个核定位序列(NLS)的CRISPR酶的载体。例如，可以使用或使用约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个NLS。CRISPR酶可以在氨基端处或附近包含NLS，在羧基端处或附近包含约或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个NLS，或其任何组合(例如，在氨基端的一个或多个NLS和在羧基端的一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，每个NLS可以独立于其他NLS选择，使得单个NLS可以存在于多于一个拷贝中和/或与一个或多个其他NLS组合存在于一个或多个拷贝中。
所述方法中使用的CRISPR酶可以包含约6个NLS。当离NLS最近的氨基酸在距N端或C端的多肽链约50个氨基酸范围内(例如，在1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个或50个氨基酸范围内)时，NLS被认为靠近N端或C端。
另外的结构域
本文所述的碱基编辑器可以包含有助于促进多核苷酸的核碱基的核碱基编辑、修饰或改变的任何结构域或与其复合。在一些实施方案中，碱基编辑器包含多核苷酸可编程核苷酸结合结构域(例如，Cas9)、核碱基编辑结构域(例如，脱氨酶结构域)和一个或多个另外的结构域。在一些实施方案中，另外的结构域可以促进碱基编辑器的酶或催化功能、碱基编辑器的结合功能，或者是可能干扰所需碱基编辑结果的细胞机制的抑制剂(例如，酶)。在一些实施方案中，碱基编辑器可以包含核酸酶、切口酶、重组酶、脱氨酶、甲基转移酶、甲基化酶、乙酰化酶、乙酰转移酶、转录激活因子或转录抑制因子结构域。
在一些实施方案中，碱基编辑器可以包含一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)结构域。在一些实施方案中，对存在U:G异源双链DNA的细胞DNA修复反应可以导致细胞中核碱基编辑效率的降低。在这样的实施方案中，尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)可以催化从细胞中的DNA中去除U，这可以启动碱基切除修复(BER)，主要导致U:G对逆转为C:G对。在这样的实施方案中，可以在包含一个或多个结构域的碱基编辑器中抑制BER，所述结构域结合单链、阻断编辑的碱基、抑制UGI、抑制BER、保护编辑的碱基和/或促进未编辑链的修复。因此，本公开考虑了包含UGI结构域的碱基编辑器融合蛋白或多分子复合物。
在一些实施方案中，碱基编辑器包含作为结构域的全部或部分双链断裂(DSB)结合蛋白。例如，DSB结合蛋白可以包括噬菌体Mu的Gam蛋白，所述Gam蛋白可以结合到DSB的末端并且可以保护它们免于降解。参见Komor,A.C.,等人,“Improved base excision repairinhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editorswith higher efficiency and product purity”Science Advances3:eaao4774(2017)，其全部内容以引用方式特此并入。
此外，在一些实施方案中，Gam蛋白可以融合到碱基编辑器的N端。在一些实施方案中，Gam蛋白可以融合到碱基编辑器的C端。噬菌体Mu的Gam蛋白可以结合到双链断裂(DSB)的末端并保护它们免于降解。在一些实施方案中，使用Gam结合DSB的自由端可以减少碱基编辑过程中的插入缺失形成。在一些实施方案中，174个残基的Gam蛋白融合到碱基编辑器的N端。参见Komor,A.C.,等人,“Improved base excision repair inhibition andbacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higherefficiency and product purity”Science Advances 3:eaao4774(2017)。在一些实施方案中，一个或多个突变可以改变碱基编辑器结构域相对于野生型结构域的长度。例如，至少一个结构域中的至少一个氨基酸的缺失可以减少碱基编辑器的长度。在另一种情况下，一个或多个突变不会改变结构域相对于野生型结构域的长度。例如，任何结构域中的取代都不会改变碱基编辑器的长度。
此类碱基编辑器的非限制性实例(其中所有结构域的长度与野生型结构域相同)可以包括：
NH2-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-[UGI]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-[UGI]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-[UGI]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-[UGI]-COOH；
NH2-[UGI]-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[UGI]-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[UGI]-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[UGI]-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH。
NH2-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-[UGI]-[UGI]-COOH；
NH2-[UGI]-[UGI]-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-[UGI]-[UGI]-COOH；或
NH2-[UGI]-[UGI]-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-COOH；
其中以上“]-[”的每个实例是任选的接头。
碱基编辑器系统
本文提供了用于使用碱基编辑器系统编辑核碱基的系统、组合物和方法。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含(1)碱基编辑器(BE)，其包含多核苷酸可编程核苷酸结合结构域和用于编辑核碱基的核碱基编辑结构域(例如，腺苷脱氨酶变体结构域)；和(2)与多核苷酸可编程核苷酸结合结构域结合的指导多核苷酸(例如，指导RNA)。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含腺苷碱基编辑器(ABE)。在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含ABE变体(例如，ABE8.20)。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域是多核苷酸可编程DNA或RNA结合结构域。在一些实施方案中，核碱基编辑结构域是脱氨酶结构域。在一些实施方案中，脱氨酶结构域可以是腺嘌呤脱氨酶变体(例如，TadA*8.20变体)。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器可以使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤脱氨。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶两者脱氨。在一些实施方案中，靶多核苷酸为单链或双链。在一些实施方案中，靶多核苷酸为DNA。在一些实施方案中，靶多核苷酸为单链DNA。在一些实施方案中，靶多核苷酸为RNA。
在一些实施方案中，如本文提供的碱基编辑系统提供了基因组编辑的新方法，所述方法使用含有催化缺陷的化脓性链球菌Cas9、脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)和碱基切除修复抑制剂的融合蛋白或多分子复合物以诱导DNA中的可编程单核苷酸(C→T或A→G)变化而不会生成双链DNA断裂，不需要供体DNA模板，并且不会诱导过多的随机插入和缺失。
核碱基编辑蛋白的详情描述于国际PCT申请号PCT/US2017/045381(WO2018/027078)和PCT/US2016/058344(WO2017/070632)，其各自以引用方式整体并入本文。还参见Komor,A.C.等人,“Programmable editing of a target base in genomic DNA withoutdouble-stranded DNA cleavage”Nature 533,420-424(2016)；Gaudelli,N.M.等人,“Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNAcleavage”Nature 551,464-471(2017)；以及Komor,A.C.等人,“Improved base excisionrepair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A baseeditors with higher efficiency and product purity”Science Advances 3:eaao4774(2017)；其全部内容以引用方式特此并入。
本文提供的碱基编辑器系统的使用包括以下步骤：(a)使受试者的多核苷酸(例如，双链或单链DNA或RNA)的靶核苷酸序列与包含核碱基编辑器(例如，腺苷碱基编辑器变体)和指导多核苷酸(例如，gRNA)的碱基编辑器系统接触，其中所述靶核苷酸序列包含靶向核碱基对；(b)诱导所述靶区域的链分离；(c)将靶区域单链中的所述靶核碱基对的第一核碱基转化为第二核碱基；和(d)切割不超过一条所述靶区域的链，其中与第一核碱基互补的第三核碱基被与第二核碱基互补的第四核碱基替换。应当理解，在一些实施方案中，步骤(b)被省略。在一些实施方案中，所述靶向核碱基对是一个或多个基因中的多个核碱基对。在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器系统能够对一个或多个基因中的多个核碱基对进行多重编辑。在一些实施方案中，多个核碱基对位于同一基因中。在一些实施方案中，多个核碱基对位于一个或多个基因中，其中至少一个基因位于不同的基因座中。
在一些实施方案中，切口单链(切口链)与指导核酸杂交。在一些实施方案中，切口单链与包含第一核碱基的链相反。在一些实施方案中，碱基编辑器包含Cas9结构域。在一些实施方案中，第一碱基是腺嘌呤，并且第二碱基不是G、C、A或T。在一些实施方案中，第二碱基是肌苷。
在一些实施方案中，可以利用单指导多核苷酸使脱氨酶靶向靶核酸序列。在一些实施方案中，可以利用一对指导多核苷酸使不同的脱氨酶靶向靶核酸序列。
碱基编辑器系统的组分(例如，脱氨酶结构域、指导RNA和/或多核苷酸可编程核苷酸结合结构域)可以彼此共价或非共价缔合。例如，在一些实施方案中，脱氨酶结构域可以通过多核苷酸可编程核苷酸结合结构域来靶向靶核苷酸序列，任选地其中多核苷酸可编程核苷酸结合结构域与多核苷酸(例如，指导RNA)复合。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域可以与脱氨酶结构域融合或连接。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域可以通过与脱氨酶结构域非共价相互作用或缔合将脱氨酶结构域靶向靶核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，核碱基编辑组分(例如，脱氨酶组分)包含另外的异源部分或结构域，其能够与作为多核苷酸可编程核苷酸结合结构域和/或与其复合的指导多核苷酸(例如，指导RNA)的一部分的对应异源部分、抗原或结构域相互作用、缔合或能够与其形成复合物。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域和/或与其复合的指导多核苷酸(例如，指导RNA)包含能够与作为核苷酸编辑结构域(例如，脱氨酶组分)的一部分的对应异源部分、抗原或结构域相互作用、缔合或能够与其形成复合物的另外的异源部分或结构域。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够与多肽结合、相互作用、缔合或与多肽形成复合物。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够与多核苷酸结合、相互作用、缔合或与多肽形成复合物。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够结合指导多核苷酸。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够结合指导多肽接头。在一些实施方案中，另外的异源部分能够结合多核苷酸接头。另外的异源部分可以是蛋白质结构域。在一些实施方案中，另外的异源部分包含多肽，诸如λ噬菌体抗终止子蛋白N(N22p)的22个氨基酸的RNA结合结构域、2G12 IgG同二聚体结构域、ABI、抗体(例如结合碱基编辑系统的组分或其异源部分的抗体)或其片段(例如IgM(MHD2)或IgE(EHD2)的重链结构域2(CH2)、免疫球蛋白Fc区、IgG或IgA的重链结构域3(CH3))、IgM或IgE的重链结构域4(CH4)、Fab、Fab2、小抗体和/或ZIP抗体)、芽孢杆菌RNA酶-芽孢杆菌二聚体(barnase-barstar dimer)结构域、Bcl-xL结构域、钙调磷酸酶A(CAN)结构域、心脏受磷蛋白跨膜五聚体结构域、胶原蛋白结构域、Com RNA结合蛋白结构域(例如SfMu Com外壳蛋白结构域和SfMu Com结合蛋白结构域)、亲环蛋白-Fas融合蛋白(CyP-Fas)结构域、Fab结构域、Fe结构域、纤维蛋白折叠子结构域(fibritin foldon domain)、FK506结合蛋白(FKBP)结构域、mTOR的FKBP结合结构域(FRB)结构域、折叠子结构域、片段X结构域、GAI结构域、GID1结构域、血型糖蛋白A跨膜结构域、GyrB结构域、Halo标签、HIV Gp41三聚化结构域、HPV45癌蛋白E7 C端二聚体结构域、疏水性多肽、K同源性(KH)结构域、Ku蛋白结构域(例如，Ku异二聚体)、亮氨酸拉链、LOV结构域、线粒体抗病毒信号传导蛋白CARD丝结构域、MS2外壳蛋白结构域(MCP)、结合相应RNA基序/适体的非天然RNA适体配体、甲状旁腺激素二聚化结构域、PP7外壳蛋白(PCP)结构域、PSD95-Dlgl-zo-1(PDZ)结构域、PYL结构域、SNAP标签、捕谍器(SpyCatcher)部分、谍标签(SpyTag)部分、链霉亲和素结构域、链霉亲和素结合蛋白结构域、链霉亲和素结合蛋白(SBP)结构域、端粒酶Sm7蛋白结构域(例如Sm7同七聚体或单体Sm样蛋白)和/或其片段。在实施方案中，另外的异源部分包含多核苷酸(例如，RNA基序)，诸如MS2噬菌体操纵子茎环(例如MS2、MS2 C-5突变体或MS2 F-5突变体)、非天然RNA基序、PP7操纵子茎环、SfMu phate Com茎环、无菌α基序、端粒酶Ku结合基序、端粒酶Sm7结合基序和/或其片段。另外的异源部分的非限制性实例包括与SEQ ID NO:392、394、396、398-400中的任何一个或多个具有至少约85％序列同一性的多肽或其片段。另外的异源部分的非限制性实例包括与SEQ ID NO:391、393、395、397中的任何一个或多个具有至少约85％序列同一性的多核苷酸或其片段。
碱基编辑器系统还可以包括指导多核苷酸组分。应当理解，碱基编辑器系统的组分可以通过共价键、非共价相互作用或其缔合和相互作用的任何组合相互缔合。在一些实施方案中，脱氨酶结构域可以通过指导多核苷酸来靶向靶核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，碱基编辑器系统的核碱基编辑组分(例如，脱氨酶组分)包含能够与指导多核苷酸的异源部分或片段(例如，多核苷酸基序)或抗原相互作用、缔合或能够与其形成复合物的另外的异源部分或结构域(例如，多核苷酸结合结构域诸如RNA或DNA结合蛋白)。在一些实施方案中，另外的异源部分或结构域(例如，多核苷酸结合结构域，诸如RNA或DNA结合蛋白)可以与脱氨酶结构域融合或连接。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够与多肽结合、相互作用、缔合或与多肽形成复合物。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够与多核苷酸结合、相互作用、缔合或与多肽形成复合物。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够结合指导多核苷酸。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够结合指导多肽接头。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够结合指导多核苷酸接头。另外的异源部分可以是蛋白质结构域。在一些实施方案中，另外的异源部分包含多肽，诸如λ噬菌体抗终止子蛋白N(N22p)的22个氨基酸的RNA结合结构域、2G12IgG同二聚体结构域、ABI、抗体(例如结合碱基编辑系统的组分或其异源部分的抗体)或其片段(例如IgM(MHD2)或IgE(EHD2)的重链结构域2(CH2)、免疫球蛋白Fc区、IgG或IgA的重链结构域3(CH3))、IgM或IgE的重链结构域4(CH4)、Fab、Fab2、小抗体和/或ZIP抗体)、芽孢杆菌RNA酶-芽孢杆菌二聚体(barnase-barstar dimer)结构域、Bcl-xL结构域、钙调磷酸酶A(CAN)结构域、心脏受磷蛋白跨膜五聚体结构域、胶原蛋白结构域、Com RNA结合蛋白结构域(例如SfMu Com外壳蛋白结构域和SfMu Com结合蛋白结构域)、亲环蛋白-Fas融合蛋白(CyP-Fas)结构域、Fab结构域、Fe结构域、纤维蛋白折叠子结构域、FK506结合蛋白(FKBP)结构域、mTOR的FKBP结合结构域(FRB)结构域、折叠子结构域、片段X结构域、GAI结构域、GID1结构域、血型糖蛋白A跨膜结构域、GyrB结构域、Halo标签、HIV Gp41三聚化结构域、HPV45癌蛋白E7 C端二聚体结构域、疏水性多肽、K同源性(KH)结构域、Ku蛋白结构域(例如，Ku异二聚体)、亮氨酸拉链、LOV结构域、线粒体抗病毒信号传导蛋白CARD丝结构域、MS2外壳蛋白结构域(MCP)、结合相应RNA基序/适体的非天然RNA适体配体、甲状旁腺激素二聚化结构域、PP7外壳蛋白(PCP)结构域、PSD95-Dlgl-zo-1(PDZ)结构域、PYL结构域、SNAP标签、捕谍器(SpyCatcher)部分、谍标签(SpyTag)部分、链霉亲和素结构域、链霉亲和素结合蛋白结构域、链霉亲和素结合蛋白(SBP)结构域、端粒酶Sm7蛋白结构域(例如Sm7同七聚体或单体Sm样蛋白)和/或其片段。在实施方案中，另外的异源部分包含多核苷酸(例如，RNA基序)，诸如MS2噬菌体操纵子茎环(例如MS2、MS2 C-5突变体或MS2 F-5突变体)、非天然RNA基序、PP7操纵子茎环、SfMu phate Com茎环、无菌α基序、端粒酶Ku结合基序、端粒酶Sm7结合基序和/或其片段。另外的异源部分的非限制性实例包括与SEQ ID NO:392、394、396、398-400中的任何一个或多个具有至少约85％序列同一性的多肽或其片段。另外的异源部分的非限制性实例包括与SEQ ID NO:391、393、395、397中的任何一个或多个具有至少约85％序列同一性的多核苷酸或其片段。
在一些实施方案中，碱基编辑器系统还可以包含碱基切除修复(BER)组分的抑制剂。应当理解，碱基编辑器系统的组分可以通过共价键、非共价相互作用或其缔合和相互作用的任何组合相互缔合。BER组分的抑制剂可以包括碱基切除修复抑制剂。在一些实施方案中，碱基切除修复抑制剂可以是尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)。在一些实施方案中，碱基切除修复抑制剂可以是肌苷碱基切除修复抑制剂。在一些实施方案中，碱基切除修复抑制剂可以通过多核苷酸可编程核苷酸结合结构域来靶向靶核苷酸序列，任选地其中多核苷酸可编程核苷酸结合结构域与多核苷酸(例如，指导RNA)复合。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域可以与碱基切除修复抑制剂融合或连接。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域可以与脱氨酶结构域和碱基切除修复抑制剂融合或连接。在一些实施方案中，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域可以通过与碱基切除修复抑制剂非共价相互作用或缔合使碱基切除修复抑制剂靶向靶核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，碱基切除修复抑制剂组分包含能够与作为多核苷酸可编程核苷酸结合结构域的一部分的对应的另外异源部分、抗原或结构域相互作用、缔合或能够与其形成复合物的另外的异源部分或结构域。在一些实施方案中，多核苷酸编程核苷酸结合结构域组分和/或与其复合的指导多核苷酸(例如，指导RNA)包含能够与作为碱基切除修复组分的一部分的对应异源部分、抗原或结构域相互作用、缔合或能够与其形成复合物的另外的异源部分或结构域。在一些实施方案中，碱基切除修复抑制剂可以通过指导多核苷酸靶向靶核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，碱基切除修复抑制剂包含能够与指导多核苷酸的部分或片段(例如，多核苷酸基序)相互作用、缔合或能够其形成复合物的另外的异源部分或结构域(例如，多核苷酸结合结构域诸如RNA或DNA结合蛋白)。在一些实施方案中，指导多核苷酸的另外的异源部分或结构域(例如，多核苷酸结合结构域，诸如RNA或DNA结合蛋白)可以与碱基切除修复抑制剂融合或连接。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够与多核苷酸结合、相互作用、缔合或与多肽形成复合物。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够结合指导多核苷酸。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够结合指导多肽接头。在一些实施方案中，另外的异源部分可能能够结合指导多核苷酸接头。另外的异源部分可以是蛋白质结构域。在一些实施方案中，另外的异源部分包含多肽，诸如λ噬菌体抗终止子蛋白N(N22p)的22个氨基酸的RNA结合结构域、2G12 IgG同二聚体结构域、ABI、抗体(例如结合碱基编辑系统的组分或其异源部分的抗体)或其片段(例如IgM(MHD2)或IgE(EHD2)的重链结构域2(CH2)、免疫球蛋白Fc区、IgG或IgA的重链结构域3(CH3))、IgM或IgE的重链结构域4(CH4)、Fab、Fab2、小抗体和/或ZIP抗体)、芽孢杆菌RNA酶-芽孢杆菌二聚体(barnase-barstar dimer)结构域、Bcl-xL结构域、钙调磷酸酶A(CAN)结构域、心脏受磷蛋白跨膜五聚体结构域、胶原蛋白结构域、Com RNA结合蛋白结构域(例如SfMu Com外壳蛋白结构域和SfMu Com结合蛋白结构域)、亲环蛋白-Fas融合蛋白(CyP-Fas)结构域、Fab结构域、Fe结构域、纤维蛋白折叠子结构域、FK506结合蛋白(FKBP)结构域、mTOR的FKBP结合结构域(FRB)结构域、折叠子结构域、片段X结构域、GAI结构域、GID1结构域、血型糖蛋白A跨膜结构域、GyrB结构域、Halo标签、HIVGp41三聚化结构域、HPV45癌蛋白E7 C端二聚体结构域、疏水性多肽、K同源性(KH)结构域、Ku蛋白结构域(例如，Ku异二聚体)、亮氨酸拉链、LOV结构域、线粒体抗病毒信号传导蛋白CARD丝结构域、MS2外壳蛋白结构域(MCP)、结合相应RNA基序/适体的非天然RNA适体配体、甲状旁腺激素二聚化结构域、PP7外壳蛋白(PCP)结构域、PSD95-Dlgl-zo-1(PDZ)结构域、PYL结构域、SNAP标签、捕谍器(SpyCatcher)部分、谍标签(SpyTag)部分、链霉亲和素结构域、链霉亲和素结合蛋白结构域、链霉亲和素结合蛋白(SBP)结构域、端粒酶Sm7蛋白结构域(例如Sm7同七聚体或单体Sm样蛋白)和/或其片段。在实施方案中，另外的异源部分包含多核苷酸(例如，RNA基序)，诸如MS2噬菌体操纵子茎环(例如MS2、MS2 C-5突变体或MS2 F-5突变体)、非天然RNA基序、PP7操纵子茎环、SfMu phate Com茎环、无菌α基序、端粒酶Ku结合基序、端粒酶Sm7结合基序和/或其片段。另外的异源部分的非限制性实例包括与SEQ ID NO:392、394、396、398-400中的任何一个或多个具有至少约85％序列同一性的多肽或其片段。另外的异源部分的非限制性实例包括与SEQ ID NO:391、393、395、397中的任何一个或多个具有至少约85％序列同一性的多核苷酸或其片段。
在一些情况下，碱基编辑系统的组分通过亮氨酸拉链结构域(例如，SEQ ID NO:387和388)的相互作用彼此缔合。在一些情况下，碱基编辑系统的组分通过多肽结构域(例如，FokI结构域)彼此缔合，所述多肽结构域缔合以形成含有约、至少约或不超过约1、2(即，二聚化)、3、4、5、6、7、8、9、10个多肽结构域单元的蛋白质复合物，任选地，多肽结构域可以包含降低或消除其活性的改变。
在一些情况下，碱基编辑系统的组分通过多聚抗体或其片段(例如，IgG、IgD、IgA、IgM、IgE、IgM、IgM(MHD2)或IgE(EHD2)的重链结构域2(CH2)、免疫球蛋白Fc区、IgG或IgA的重链结构域3(CH3)、IgM或IgE的重链结构域4(CH4)、Fab和Fab2)的相互作用彼此缔合。在一些情况下，抗体是二聚体、三聚体或四聚体。在实施方案中，二聚体抗体结合碱基编辑系统的多肽或多核苷酸组分。
在一些情况下，碱基编辑系统的组分通过多核苷酸结合蛋白结构域与多核苷酸的相互作用而彼此缔合。在一些情况下，碱基编辑系统的组分通过一个或多个多核苷酸结合蛋白结构域与自我互补和/或彼此互补的多核苷酸的相互作用彼此缔合，使得多核苷酸彼此的互补结合将它们各自结合的多核苷酸结合蛋白结构域缔合在一起。
在一些情况下，碱基编辑系统的组分通过多肽结构域与小分子(例如，二聚化化学诱导剂(CID)，也称为“二聚化剂”)的相互作用彼此缔合。CID的非限制性实例包括Amara等人,“A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-proteininteractions,”PNAS,94:10618-10623(1997)；和Voβ等人“Chemically induceddimerization:reversible and spatiotemporal control of protein function incells,”Current Opinion in Chemical Biology,28:194-201(2015)中公开的那些，出于所有目的，所述文献各自的公开内容以引用方式整体并入本文。下表10.1中提供了可以二聚化的多肽及其相应二聚化剂的非限制性实例。
表10.1.化学诱导的二聚化系统。
在实施方案中，另外的异源部分是指导RNA分子的一部分。在一些情况下，另外的异源部分含有或者是RNA基序。RNA基序可以位于指导RNA分子的5'或3'末端或指导RNA分子的各个位置。在实施方案中，RNA基序位于指导RNA内以减少空间位阻，任选地，其中此类位阻与RNA支架的其他大环相关。在一些情况下，有利的是，通过接头将RNA基序连接至指导RNA的其他部分，其中接头的长度可以是约、至少约或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸。任选地，接头含有富含GC的核苷酸序列。指导RNA可以含有RNA基序的1、2、3、4、5个或更多个拷贝，任选地其中它们连续定位，和/或任选地其中它们各自通过接头彼此分开。RNA基序可以包含本文所述的任何一种或多种多核苷酸修饰。RNA基序的合适修饰的非限制性实例包括2’脱氧-2-氨基嘌呤、2’核糖-2-氨基嘌呤、硫代磷酸酯修饰、2’-O甲基修饰、2’-氟修饰和LNA修饰。有利地，修饰有助于增加稳定性并促进由RNA基序形成的发夹的更强的键/折叠结构。
在一些实施方案中，RNA基序被修饰以包含延伸。在实施方案中，延伸含有约、至少约或不超过约2、3、4、5、10、15、20或25个核苷酸。在一些情况下，延伸导致由RNA基序形成的茎长度的改变(例如，延长或缩短)。有利的是，由RNA基序形成的茎长度为约、至少约或不超过约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸。在各种实施方案中，延伸增加RNA基序的灵活性和/或增加与相应RNA基序的结合。
在一些实施方案中，碱基编辑器抑制编辑链的碱基切除修复(BER)。在一些实施方案中，碱基编辑器保护或结合未编辑链。在一些实施方案中，碱基编辑器包括UGI活性。在一些实施方案中，碱基编辑器包含无催化活性的肌苷特异性核酸酶。在一些实施方案中，碱基编辑器包括切口酶活性。在一些实施方案中，碱基对的预期编辑在PAM位点的上游。在一些实施方案中，碱基对的预期编辑在PAM位点上游1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸处。在一些实施方案中，碱基对的预期编辑在PAM位点的下游。在一些实施方案中，碱基对的预期编辑在PAM位点下游1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸处。
在一些实施方案中，此方法不需要规范(例如，NGG)PAM位点。在一些实施方案中，核碱基编辑器包含接头或间隔区。在一些实施方案中，接头或间隔区的长度为1-25个氨基酸。在一些实施方案中，接头或间隔区的长度为5-20个氨基酸。在一些实施方案中，接头或间隔区的长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑融合蛋白或多分子复合物需要定位在精确位置，例如，其中靶碱基被放置在限定区域(例如，“脱氨窗口”)内。在一些实施方案中，靶标可以在4个碱基区域内。在一些实施方案中，此限定靶区域可以在PAM上游大约15个碱基处。参见Komor,A.C.等人,“Programmable editing of a target base in genomic DNAwithout double-stranded DNA cleavage”Nature 533,420-424(2016)；Gaudelli,N.M.等人,“Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNAcleavage”Nature 551,464-471(2017)；以及Komor,A.C.等人,“Improved base excisionrepair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A baseeditors with higher efficiency and product purity”Science Advances3:eaao4774(2017)；其全部内容以引用方式特此并入。
在一些实施方案中，靶区域包含靶窗口，其中所述靶窗口包含靶核碱基对。在一些实施方案中，靶窗口包含1-10个核苷酸。在一些实施方案中，靶窗口长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。在一些实施方案中，碱基对的预期编辑在靶窗口内。在一些实施方案中，靶窗口包括碱基对的预期编辑。在一些实施方案中，使用本文提供的任何碱基编辑器来执行此方法。在一些实施方案中，靶窗口是脱氨窗口。脱氨窗口可以是碱基编辑器作用于靶核苷酸并使靶核苷酸脱氨的限定区域。在一些实施方案中，脱氨窗口在2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碱基区域内。在一些实施方案中，脱氨窗口在PAM上游5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个碱基处。
本公开的碱基编辑器可以包含促进靶多核苷酸序列的编辑的任何结构域、特征或氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，碱基编辑器包含核定位序列(NLS)。在一些实施方案中，碱基编辑器的NLS位于脱氨酶结构域和多核苷酸可编程核苷酸结合结构域之间。在一些实施方案中，碱基编辑器的NLS位于多核苷酸可编程核苷酸结合结构域的C端。
可以存在于如本文公开的碱基编辑器中的其他示例性特征是定位序列，诸如细胞质定位序列、输出序列(诸如核输出序列)，或其他定位序列，以及可用于溶解、纯化或检测融合蛋白或多分子复合物的序列标签。本文提供的合适的蛋白质标签包括但不限于生物素羧化酶载剂蛋白(BCCP)标签、myc标签、钙调蛋白标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、多组氨酸标签(也称为组氨酸标签或His标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、nus标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、绿色荧光蛋白(GFP)标签、硫氧还蛋白标签、S标签、Softag(例如，Softag1、Softag 3)、链球菌标签、生物素连接酶标签、FlAsH标签、V5标签和SBP标签.另外的合适序列对于本领域技术人员将是显而易见的。在一些实施方案中，融合蛋白或多分子复合物包含一个或多个His标签。
在一些实施方案中，本文的碱基编辑器系统包含ABE。在一些实施方案中，ABE是第二代ABE。在一些实施方案中，ABE是ABE2.1，其在TadA*(TadA*2.1)中包含另外的突变D147Y和E155V。在一些实施方案中，ABE是与无催化活性形式的人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(具有E125Q突变的AAG)融合的ABE2.2、ABE2.1。在一些实施方案中，ABE是与无催化活性形式的大肠杆菌Endo V(因D35A突变而失活)融合的ABE2.3、ABE2.1。在一些实施方案中，ABE是ABE2.6，其具有长度为ABE2.1中的接头的两倍(32个氨基酸，(SGGS)2(SEQ ID NO:345)-XTEN-(SGGS)2(SEQ ID NO:345))的接头。在一些实施方案中，ABE是ABE2.7，其是与另外的野生型TadA单体相连的ABE2.1。在一些实施方案中，ABE是ABE2.8，其是与另外的TadA*2.1单体相连的ABE2.1。在一些实施方案中，ABE是ABE2.9，其是进化的TadA(TadA*2.1)与ABE2.1的N端的直接融合。在一些实施方案中，ABE是ABE2.10，其是野生型TadA与ABE2.1的N端的直接融合。在一些实施方案中，ABE是ABE2.11，其是在TadA*单体的N端处具有失活E59A突变的ABE2.9。在一些实施方案中，ABE是ABE2.12，其是在内部TadA*单体中具有失活E59A突变的ABE2.9。
在一些实施方案中，ABE是第三代ABE。在一些实施方案中，ABE是ABE3.1，其是具有三个另外的TadA突变(L84F、H123Y和I156F)的ABE2.3。
在一些实施方案中，ABE是第四代ABE。在一些实施方案中，ABE是ABE4.3，其是具有另外的TadA突变A142N(TadA*4.3)的ABE3.1。
在一些实施方案中，ABE是第五代ABE。在一些实施方案中，ABE是ABE5.1，其通过将来自存活克隆(H36L、R51L、S146C和K157N)的共有突变组导入ABE3.1而生成。在一些实施方案中，ABE是ABE5.3，其具有含有与内部进化的TadA*融合的野生型大肠杆菌TadA的异二聚体构建体。在一些实施方案中，ABE是ABE5.2、ABE5.4、ABE5.5、ABE5.6、ABE5.7、ABE5.8、ABE5.9、ABE5.10、ABE5.11、ABE5.12、ABE5.13或ABE5.14，如下表10所示。在一些实施方案中，ABE是第六代ABE。在一些实施方案中，ABE是ABE6.1、ABE6.2、ABE6.3、ABE6.4、ABE6.5或ABE6.6，如下表10所示。在一些实施方案中，ABE是第七代ABE。在一些实施方案中，ABE是ABE7.1、ABE7.2、ABE7.3、ABE7.4、ABE7.5、ABE7.6、ABE7.7、ABE7.8、ABE7.9或ABE7.10，如如下表10所示。
表10.ABE的基因型··
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在一些实施方案中，碱基编辑器是第八代ABE(ABE8)。在一些实施方案中，ABE8含有TadA*8变体。在一些实施方案中，ABE8具有含有TadA*8变体的单体构建体(“ABE8.x-m”)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.1-m，所述单体构建体含有具有Y147T突变的TadA*7.10(TadA*8.1)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.2-m，所述单体构建体含有具有Y147R突变的TadA*7.10(TadA*8.2)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.3-m，所述单体构建体含有具有Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.3)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.4-m，所述单体构建体含有具有Y123H突变的TadA*7.10(TadA*8.4)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.5-m，所述单体构建体含有具有V82S突变的TadA*7.10(TadA*8.5)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.6-m，所述单体构建体含有具有T166R突变的TadA*7.10(TadA*8.6)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.7-m，所述单体构建体含有具有Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.7)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.8-m，所述单体构建体含有具有Y147R、Q154R和Y123H突变的TadA*7.10(TadA*8.8)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.9-m，所述单体构建体含有具有Y147R、Q154R和I76Y突变的TadA*7.10(TadA*8.9)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.10-m，所述单体构建体含有具有Y147R、Q154R和T166R突变的TadA*7.10(TadA*8.10)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.11-m，所述单体构建体含有具有Y147T和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.11)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.12-m，所述单体构建体含有具有Y147T和Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.12)。
在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.13-m，所述单体构建体含有具有Y123H(从H123Y复原的Y123H)、Y147R、Q154R和I76Y突变的TadA*7.10(TadA*8.13)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.14-m，所述单体构建体含有具有I76Y和V82S突变的TadA*7.10(TadA*8.14)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.15-m，所述单体构建体含有具有V82S和Y147R突变的TadA*7.10(TadA*8.15)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.16-m，所述单体构建体含有具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)和Y147R突变的TadA*7.10(TadA*8.16)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.17-m，所述单体构建体含有具有V82S和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.17)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.18-m，所述单体构建体含有具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.18)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.19-m，所述单体构建体含有具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)、Y147R和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.19)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.20-m，所述单体构建体含有具有I76Y、V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)、Y147R和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.20)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.21-m，所述单体构建体含有具有Y147R和Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.21)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.22-m，所述单体构建体含有具有V82S和Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.22)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.23-m，所述单体构建体含有具有V82S和Y123H(从H123Y复原的Y123H)突变的TadA*7.10(TadA*8.23)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8.24-m，所述单体构建体含有具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)和Y147T突变的TadA*7.10(TadA*8.24)。
在一些实施方案中，ABE8具有含有与TadA*8变体融合的野生型大肠杆菌TadA的异二聚体构建体(“ABE8.xd”)。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.1-d，所述异二聚体构建体含有与具有Y147T突变的TadA*7.10(TadA*8.1)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.2-d，所述异二聚体构建体含有与具有Y147R突变的TadA*7.10(TadA*8.2)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.3-d，所述异二聚体构建体含有与具有Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.3)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.4-d，所述异二聚体构建体含有与具有Y123H突变的TadA*7.10(TadA*8.4)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.5-d，所述异二聚体构建体含有与具有V82S突变的TadA*7.10(TadA*8.5)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.6-d，所述异二聚体构建体含有与具有T166R突变的TadA*7.10(TadA*8.6)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.7-d，所述异二聚体构建体含有与具有Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.7)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.8-d，所述异二聚体构建体含有与具有Y147R、Q154R和Y123H突变的TadA*7.10(TadA*8.8)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.9-d，所述异二聚体构建体含有与具有Y147R、Q154R和I76Y突变的TadA*7.10(TadA*8.9)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.10-d，所述异二聚体构建体含有与具有Y147R、Q154R和T166R突变的TadA*7.10(TadA*8.10)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.11-d，所述异二聚体构建体含有与具有Y147T和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.11)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.12-d，所述异二聚体构建体含有与具有Y147T和Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.12)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.13-d，所述异二聚体构建体含有与具有Y123H(从H123Y复原的Y123H)、Y147R、Q154R和I76Y突变的TadA*7.10(TadA*8.13)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.14-d，所述异二聚体构建体含有与具有I76Y和V82S突变的TadA*7.10(TadA*8.14)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.15-d，所述异二聚体构建体含有与具有V82S和Y147R突变的TadA*7.10(TadA*8.15)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.16-d，所述异二聚体构建体含有与具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)和Y147R突变的TadA*7.10(TadA*8.16)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.17-d，所述异二聚体构建体含有与具有V82S和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.17)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.18-d，所述异二聚体构建体含有与具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.18)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.19-d，所述异二聚体构建体含有与具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)、Y147R和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.19)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.20-d，所述异二聚体构建体含有与具有I76Y、V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)、Y147R和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.20)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.21-d，所述异二聚体构建体含有与具有Y147R和Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.21)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.22-d，所述异二聚体构建体含有与具有V82S和Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.22)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.23-d，所述异二聚体构建体含有与具有V82S和Y123H(从H123Y复原的Y123H)突变的TadA*7.10(TadA*8.23)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.24-d，所述异二聚体构建体含有与具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)和Y147T突变的TadA*7.10(TadA*8.24)融合的野生型大肠杆菌TadA。
在一些实施方案中，ABE8具有含有与TadA*8变体融合的TadA*7.10的异二聚体构建体(“ABE8.x-7”)。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.1-7，所述异二聚体构建体含有与具有Y147T突变的TadA*7.10(TadA*8.1)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.2-7，所述异二聚体构建体含有与具有Y147R突变的TadA*7.10(TadA*8.2)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.3-7，所述异二聚体构建体含有与具有Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.3)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.4-7，所述异二聚体构建体含有与具有Y123H突变的TadA*7.10(TadA*8.4)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.5-7，所述异二聚体构建体含有与具有V82S突变的TadA*7.10(TadA*8.5)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.6-7，所述异二聚体构建体含有与具有T166R突变的TadA*7.10(TadA*8.6)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.7-7，所述异二聚体构建体含有与具有Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.7)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.8-7，所述异二聚体构建体含有与具有Y147R、Q154R和Y123H突变的TadA*7.10(TadA*8.8)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.9-7，所述异二聚体构建体含有与具有Y147R、Q154R和I76Y突变的TadA*7.10(TadA*8.9)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.10-7，所述异二聚体构建体含有与具有Y147R、Q154R和T166R突变的TadA*7.10(TadA*8.10)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.11-7，所述异二聚体构建体含有与具有Y147T和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.11)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.12-7，所述异二聚体构建体含有与具有Y147T和Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.12)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.13-7，所述异二聚体构建体含有与具有Y123H(从H123Y复原的Y123H)、Y147R、Q154R和I76Y突变的TadA*7.10(TadA*8.13)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.14-7，所述异二聚体构建体含有与具有I76Y和V82S突变的TadA*7.10(TadA*8.14)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.15-7，所述异二聚体构建体含有与具有V82S和Y147R突变的TadA*7.10(TadA*8.15)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.16-7，所述异二聚体构建体含有与具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)和Y147R突变的TadA*7.10(TadA*8.16)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.17-7，所述异二聚体构建体含有与具有V82S和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.17)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.18-7，所述异二聚体构建体含有与具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.18)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.19-7，所述异二聚体构建体含有与具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)、Y147R和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.19)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.20-7，所述异二聚体构建体含有与具有I76Y、V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)、Y147R和Q154R突变的TadA*7.10(TadA*8.20)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.21-7，所述异二聚体构建体含有与具有Y147R和Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.21)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.22-7，所述异二聚体构建体含有与具有V82S和Q154S突变的TadA*7.10(TadA*8.22)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.23-7，所述异二聚体构建体含有与具有V82S和Y123H(从H123Y复原的Y123H)突变的TadA*7.10(TadA*8.23)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8.24-7，所述异二聚体构建体含有与具有V82S、Y123H(从H123Y复原的Y123H)和Y147T突变的TadA*7.10(TadA*8.24)融合的TadA*7.10。
在一些实施方案中，ABE是ABE8.1-m、ABE8.2-m、ABE8.3-m、ABE8.4-m、ABE8.5-m、ABE8.6-m、ABE8.7-m、ABE8.8-m、ABE8.9-m、ABE8.10-m、ABE8.11-m、ABE8.12-m、ABE8.13-m、ABE8.14-m、ABE8.15-m、ABE8.16-m、ABE8.17-m、ABE8.18-m、ABE8.19-m、ABE8.20-m、ABE8.21-m、ABE8.22-m、ABE8.23-m、ABE8.24-m、ABE8.1-d、ABE8.2-d、ABE8.3-d、ABE8.4-d、ABE8.5-d、ABE8.6-d、ABE8.7-d、ABE8.8-d、ABE8.9-d、ABE8.10-d、ABE8.11-d、ABE8.12-d、ABE8.13-d、ABE8.14-d、ABE8.15-d、ABE8.16-d、ABE8.17-d、ABE8.18-d、ABE8.19-d、ABE8.20-d、ABE8.21-d、ABE8.22-d、ABE8.23-d或ABE8.24-d，如下表11所示。
表11：腺苷脱氨酶碱基编辑器8(ABE8)变体
/>
在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8a-m，所述单体构建体含有具有R26C、A109S、T111R、D119N、H122N、Y147D、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8a)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8b-m，所述单体构建体含有具有V88A、A109S、T111R、D119N、H122N、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8b)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8c-m，所述单体构建体含有具有R26C、A109S、T111R、D119N、H122N、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8c)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8d-m，所述单体构建体含有具有V88A、T111R、D119N和F149Y突变的TadA*7.10(TadA*8d)。在一些实施方案中，ABE8是具有单体构建体的ABE8e-m，所述单体构建体含有具有A109S、T111R、D119N、H122N、Y147D、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8e)。
在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8a-d，所述异二聚体构建体含有与具有R26C、A109S、T111R、D119、H122N、Y147D、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8a)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8b-d，所述异二聚体构建体含有与具有V88A、A109S、T111R、D119N、H122N、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8b)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8c-d，所述异二聚体构建体含有与具有R26C、A109S、T111R、D119N、H122N、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8c)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8d-d，所述异二聚体构建体含有与具有V88A、T111R、D119N和F149Y突变的TadA*7.10(TadA*8d)融合的野生型大肠杆菌TadA。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8e-d，所述异二聚体构建体含有与具有A109S、T111R、D119N、H122N、Y147D、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8e)融合的野生型大肠杆菌TadA。
在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8a-7，所述异二聚体构建体含有与具有R26C、A109S、T111R、D119、H122N、Y147D、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8a)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8b-7，所述异二聚体构建体含有与具有V88A、A109S、T111R、D119N、H122N、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8b)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8c-7，所述异二聚体构建体含有与具有R26C、A109S、T111R、D119N、H122N、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8c)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8d-7，所述异二聚体构建体含有与具有V88A、T111R、D119N和F149Y突变的TadA*7.10(TadA*8d)融合的TadA*7.10。在一些实施方案中，ABE8是具有异二聚体构建体的ABE8e-7，所述异二聚体构建体含有与具有A109S、T111R、D119N、H122N、Y147D、F149Y、T166I和D167N突变的TadA*7.10(TadA*8e)融合的TadA*7.10。
在一些实施方案中，ABE是ABE8a-m、ABE8b-m、ABE8c-m、ABE8d-m、ABE8e-m、ABE8a-d、ABE8b-d、ABE8c-d、ABE8d-d或ABE8e-d，如下表12所示。在一些实施方案中，ABE是ABE8e-m或ABE8e-d。当ABE8e与除SpCas9以外的Cas同源物(例如，SaCas9、SaCas9-KKH、Cas12a同源物，例如LbCas12a、enAs-Cas12a、SpCas9-NG和环状置换的CP1028-SpCas9和CP1041-SpCas9)一起使用时显示出高效的腺嘌呤碱基编辑活性和低插入缺失形成。除了表12中显示的ABE8e突变外，通过将V106W取代引入到TadA结构域中减少了脱靶RNA和DNA编辑(如描述于M.Richter等人,2020,Nature Biotechnology,doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z，其全部内容以引用方式并入本文)。
表12：另外的腺苷脱氨酶碱基编辑器8变体。在表中，“单体”表示包含单个TadA*7.10的ABE，所述TadA*7.10包含指定的改变，并且“异二聚体”表示包含与大肠杆菌TadA腺苷脱氨酶融合的TadA*7.10的ABE，所述TadA*7.10包含指定的改变。
在一些实施方案中，碱基编辑器(例如，ABE8)通过将腺苷脱氨酶变体(例如，TadA*8)克隆到包括环状置换Cas9(例如，CP5或CP6)和二分核定位序列的支架中而产生。在一些实施方案中，碱基编辑器(例如，ABE7.9、ABE7.10或ABE8)是NGC PAM CP5变体(化脓性链球菌Cas9或spVRQR Cas9)。在一些实施方案中，碱基编辑器(例如，ABE7.9、ABE7.10或ABE8)是AGA PAM CP5变体(化脓性链球菌Cas9或spVRQR Cas9)。在一些实施方案中，碱基编辑器(例如，ABE7.9、ABE7.10或ABE8)是NGC PAM CP6变体(化脓性链球菌Cas9或spVRQR Cas9)。在一些实施方案中，碱基编辑器(例如，ABE7.9、ABE7.10或ABE8)是AGA PAM CP6变体(化脓性链球菌Cas9或spVRQR Cas9)。
在一些实施方案中，ABE具有如下表13中所示的基因型。
表13.ABE的基因型
如下表14所示，描述了40个ABE8的基因型。表示了ABE的进化大肠杆菌TadA部分中的残基位置。当与ABE7.10突变不同时，显示了ABE8中的突变变化。在一些实施方案中，ABE具有如下表14中所示的ABE之一的基因型。
表14.进化的TadA中的残基身份
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在一些实施方案中，碱基编辑器是ABE8.1，其包含或基本上由以下具有腺苷脱氨酶活性的序列或其片段组成：
ABE8.1_Y147T_CP5_NGC PAM_单体
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上述序列中，纯文本表示腺苷脱氨酶序列，粗体序列表示来源于Cas9的序列，斜体序列表示接头序列，并且加下划线的序列表示二分核定位序列。其他ABE8序列提供于所附的序列表中(SEQ ID NO:347-369)。
在一些实施方案中，碱基编辑器是第九代ABE(ABE9)。在一些实施方案中，ABE9含有TadA*9变体。ABE9碱基编辑器包含腺苷脱氨酶变体，所述变体包含含有如本文所述的相对于ABE7*10参考序列含有改变的氨基酸序列。示例性ABE9变体列于表15中。ABE9碱基编辑器的详情描述于国际PCT申请号PCT/US2020/049975，其以引用方式整体并入本文。
表15.腺苷脱氨酶碱基编辑器9(ABE9)变体。在表中，“单体”表示包含单个TadA*7.10的ABE，所述TadA*7.10包含指定的改变，并且“异二聚体”表示包含与大肠杆菌TadA腺苷脱氨酶融合的TadA*7.10的ABE，所述TadA*7.10包含指定的改变。
/>
在一些实施方案中，碱基编辑器包含腺苷脱氨酶变体，其包含如本文所述的相对于ABE7*10参考序列含有改变的氨基酸序列。如表15.1中使用的术语“单体”是指包含所描述改变的TadA*7.10的单体形式。如表15.1中使用的术语“异二聚体”是指与包含所述改变的TadA*7.10融合的特定野生型大肠杆菌TadA腺苷脱氨酶。
表15.1.腺苷脱氨酶碱基编辑器变体
在一些实施方案中，包含腺苷碱基编辑器(ABE)变体的碱基编辑器系统可以使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤脱氨。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器(ABE)可以使靶多核苷酸(例如，DNA)中的胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，腺苷碱基编辑器(ABE)可以使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶脱氨。在一些实施方案中，ABE是通过用天然的或工程化的大肠杆菌TadA、人ADAR2、小鼠ADA或人ADAT2替换BE3的APOBEC1组分而产生的。在一些实施方案中，ABE包含进化的TadA变体。在一些实施方案中，ABE是ABE1.2(TadA*-XTEN-nCas9-NLS)。
在一些实施方案中，碱基编辑器系统包含可以使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶两者脱氨的ABE变体。在一些实施方案中，ABE变体包含ABE8变体(例如，ABE8.20)。在一些实施方案中，ABE8变体为ABE8.20变体。在一些实施方案中，ABE8变体包含TadA变体(TadA*)。在一些实施方案中，TadA变体为TadA*8变体。在一些实施方案中，TadA*8变体为TadA*8.20变体。在一些实施方案中，TadA*包含A106V和D108N突变。
在一些实施方案中，碱基编辑器系统的ABE包含腺苷脱氨酶变体，其具有与SEQ IDNO:1：
具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列和一个或多个增加胞嘧啶脱氨酶活性的改变。在一些实施方案中，碱基编辑器系统的ABE包含腺苷脱氨酶变体，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列和一个或多个增加胞嘧啶脱氨酶活性的改变。在各种实施方案中，本发明的改变不包括48R突变。
在一些实施方案中，碱基编辑器系统的ABE包含具有相对于参考腺苷脱氨酶或没有改变的腺苷脱氨酶具有增加胞苷脱氨活性的两个或更多个氨基酸改变的腺苷脱氨酶变体。在一些实施方案中，两个或更多个改变选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的序列的2、8、13、17、27、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、112、115、118、119、127、142、162和165，或另一脱氨酶中的相应改变。在一些实施方案中，两个或更多个改变选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:1具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的序列的S2X、V4X、F6X、H8X、R13X、T17X、R23X、E27X、P29X、V30X、R47X、A48X、I49X、G67X、Y76X、D77X、S82X、F84X、H96X、G100X、R107X、G112X、A114X、G115X、M118X、D119X、H122X、N127X、A142X、A143X、R147X、Y147X、F149X、A158X、Q159X、A162X、S165X、T166X和D167X，或另一脱氨酶中的相应改变。在各种实施方案中，本发明的改变不包括48R突变。
在一些实施方案中，两个或更多个改变是与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的序列的氨基酸位置，选自由以下组成的组：氨基酸位置2处的第一改变和选自由以下组成的组的一个或多个另外的改变：氨基酸位置2处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置4处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置6处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置13处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置27处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置29处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置67处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、76、77、82、84、96、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置77处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、82、84、96、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置96处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置107处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置100处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、112、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置112处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、114、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置114处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、115、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置115处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、114、118、119、127、142、143、159、162和165；氨基酸位置143处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、115、118、119、127、142、159、162和165；氨基酸位置159处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、115、118、119、127、142、143、162和165；氨基酸位置162处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159和165；或氨基酸位置165处的第一改变和一个或多个选自以下中的一个或多个氨基酸位置处的另外的改变：2、4、6、8、13、17、27、29、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、100、112、114、115、118、119、127、142、143、159和162，或另一脱氨酶中的相应改变。
在一些实施方案中，碱基编辑器系统的ABE包含具有选自由以下组成的组的改变组合的腺苷脱氨酶变体：E27H、Y76I和F84M；E27H、I49K和Y76I；E27S、I49K、Y76I和A162N；E27K和D119N；E27H和Y76I；E27S、I49K和G67W；E27S、I49K和Y76I；I49T、G67W和H96N；E27C、Y76I和D119N；R13G、E27Q和N127K；T17A、E27H、I49M、Y76I和M118L；I49Q、Y76I和G115M；S2H、I49K、Y76I和G112H；R47S和R107C；H8Q、I49Q和Y76I；T17A、A48G、S82T和A142E；E27G和I49N；E27G、D77G和S165P；E27S、I49K和S82T；E27S、I49K、S82T和G115M；E27S、V30I、I49K和S82T；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G112H和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L和R107C；E27S、I49K、S82T、F84L和G112H；E27S、I49K、S82T、F84L和G115M；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；E27S、P29G、I49K和S82T；E27S、P29G、I49K、S82T和G115M；E27S、P29G、I49K、S82T和A142E；P29G、I49K和S82T；E27G、I49K和S82T；E27G、I49K、S82T、R107C和A142E；V4K、E27H、I49K、Y76I和A114C；V4K、E27H、I49K、Y76I和D77G；F6Y、E27H、I49K、Y76I、G100A和H122R；V4T、E27H、I49K、Y76R和H122G；F6Y、E27H、I49K和Y76W；F6Y、E27H、I49K、Y76I和D119N；F6Y、E27H、I49K、Y76I和A114C；F6Y、E27H、I49K和Y76I；V4K、E27H、I49K、Y76W和H122T；F6G、E27H、I49K、Y76R和G100K；F6H、E27H、I49K、Y76I和H122N；E27H、I49K、Y76I和A114C；F6Y、E27H、I49K、Y76H、H122R和T166I；E27H、I49K、Y76I和N127P；R23Q、E27H、I49K和Y76R；E27H、I49K、Y76H、H122R和A158V；F6Y、E27H、I49K、Y76I和T111H；E27H、I49K、Y76I和R147H；E27H、I49K、Y76I和A143E；F6Y、E27H、I49K和Y76R；T17W、E27H、I49K、Y76H、H122G和A158V；V4S、E27H、I49K、A143E和Q159S；E27H、I49K、Y76I、N127I和A162Q；T17A、E27H和A48G；T17A、E27K和A48G；T17A、E27S和A48G；T17A、E27S、A48G和I49K；T17A、E27G和A48G；T17A、A48G和I49N；T17A、E27G、A48G和I49N；T17A、E27Q和A48G；E27S、I49K、S82T和R107C；E27S、I49K、S82T和G112H；E27S、I49K、S82T和A142E；E27S、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和R107C；E27S、V30I、I49K、S82T和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K和S82T；E27S、V30L、I49K、S82T和R107C；E27S、V30L、I49K、S82T和G112H；E27S、V30L、I49K、S82T和G115M；E27S、V30L、I49K、S82T和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T和F84A；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和R107C；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G112H；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G115M；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G112H；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G115M；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T和F84L；E27S、I49K、S82T、F84L和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T和R107C；E27S、P29G、I49K、S82T和G112H；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；E27S、P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29G、I49K、S82T和R107C；P29G、I49K、S82T和G112H；P29G、I49K、S82T和G115M；P29G、I49K、S82T和A142E；P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K和S82T；P29K、I49K、S82T和R107C；P29K、I49K、S82T和G112H；P29K、I49K、S82T和G115M；P29K、I49K、S82T和A142E；P29K、I49K、S82T、R107C和G112H；P29K、I49K、S82T、R107C和G115M；P29K、I49K、S82T、R107C和A142E；P29K、I49K、S82T、G112H和A142E；P29K、I49K、S82T、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K和S82T；P29K、V30I、I49K、S82T和R107C；P29K、V30I、I49K、S82T和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T和F84L；P29K、I49K、S82T、F84L和R107C；P29K、I49K、S82T、F84L和G112H；P29K、I49K、S82T、F84L和G115M；P29K、I49K、S82T、F84L和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T和F84L；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27G、I49K、S82T和R107C；E27G、I49K、S82T和G112H；E27G、I49K、S82T和G115M；E27G、I49K、S82T和A142E；E27G、I49K、S82T、R107C和G112H；E27G、I49K、S82T、R107C和G115M；E27G、I49K、S82T、G112H和A142E；E27G、I49K、S82T、G115M和A142E；E27G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27H、I49K和S82T；E27H、I49K、S82T和R107C；E27H、I49K、S82T和G112H；E27H、I49K、S82T和G115M；E27H、I49K、S82T和A142E；E27H、I49K、S82T、R107C和G112H；E27H、I49K、S82T、R107C和G115M；E27H、I49K、S82T、R107C和A142E；E27H、I49K、S82T、G112H和A142E；E27H、I49K、S82T、G115M和A142E；E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S和S82T；E27S、S82T和R107C；E27S、S82T和G112H；E27S、S82T和G115M；E27S、S82T和A142E；E27S、S82T、R107C和G112H；E27S、S82T、R107C和G115M；E27S、S82T、R107C和A142E；E27S、S82T、G112H和A142E；E27S、S82T、G115M和A142E；E27S、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A和S82T；P29A、S82T和R107C；P29A、S82T和G112H；P29A、S82T和G115M；P29A、S82T和A142E；P29A、S82T、R107C和G112H；P29A、S82T、R107C和G115M；P29A、S82T、R107C和A142E；P29A、S82T、G112H和A142E；P29A、S82T、G115M和A142E；P29A、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I和S82T；E27S、V30I、S82T和R107C；E27S、V30I、S82T和G112H；E27S、V30I、S82T和G115M；E27S、V30I、S82T和A142E；E27S、V30I、S82T、R107C和G112H；E27S、V30I、S82T、R107C和G115M；E27S、V30I、S82T、R107C和A142E；E27S、V30I、S82T、G112H和A142E；E27S、V30I、S82T、G115M和A142E；E27S、V30I、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T和F84L；P29A、V30I、S82T、F84L和R107C；P29A、V30I、S82T、F84L和G112H；P29A、V30I、S82T、F84L和G115M；P29A、V30I、S82T、F84L和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G112H；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G115M；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、G112H和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、P29A、V30L、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；V4K和A114C；V4K和D77G；F6Y、G100A和H122R；V4T、I76R和H122G；F6Y和I76W；F6Y和D119N；F6Y和A114C；V4K、I76W和H122T；F6G、I76R和G100K；F6H和H122N；F6Y、I76H、H122R和T166I；R23Q和I76R；I76H、H122R和A158V；F6Y和T111H；T111H、H122G和A162C；F6Y和I76R；T17W、I76H、H122G和A158V；V4S、I76Y、A143E和Q159S；N127I和A162Q；E27H、Y76I、F84M和F149Y；E27H、I49K、Y76I和F149Y；T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L和F149Y；T17A、A48G、S82T、A142E和F149Y；E27G和F149Y；E27G、I49N和F149Y；E27H、Y76I、F84M、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27H、I49K、Y76I、Y147D、F149Y、T166I、D167N；T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L、Y147D、F149Y、T166I和D167N；T17A、A48G、S82T、A142E、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27G、Y147D、F149Y、T166I和D167N；E27G、I49N、Y147D、F149Y、T166I和D167N；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；以及F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；或另一脱氨酶中的相应改变。
在一些实施方案中，碱基编辑器系统的ABE包含具有选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个改变的腺苷脱氨酶变体：与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的4、6、13、27、29、67、77、96、100、107、112、114、115、143、159、162和165，或另一脱氨酶中的相应改变。在一些实施方案中，ABE包含具有选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个改变的腺苷脱氨酶变体：与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的S2H、V4K、V4S、V4T、V4Y、F6G、F6H、F6Y、H8Q、R13G、T17A、T17W、R23Q、E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q、E27S、E27G、P29A、P29G、P29K、V30F、V30I、R47G、R47S、A48G、I49K、I49M、I49N、I49Q、I49T、G67W、I76H、I76R、I76W、Y76H、Y76R、Y76W、F84A、F84M、H96N、G100A、G100K、T111H、G112H、A114C、G115M、M118L、H122G、H122R、H122T、N127I、N127K、N127P、A142E、R147H、A158V、Q159S、A162C、A162N、A162Q和S165P，或另一脱氨酶中的相应改变。在一些实施方案中，ABE包含如表1A至1F中任一个中提供的腺苷脱氨酶变体。
在一些实施方案中，包含本文提供的ABE变体(例如，ABE8.20变体)的碱基编辑器系统相对于参考碱基编辑器系统具有A到G和C到T编辑活性。在一些实施方案中，包含ABE变体(例如，ABE8.20变体)的碱基编辑系统相对于参考碱基编辑系统具有至少约30％的C到T碱基编辑活性。在一些实施方案中，包含ABE变体(例如，ABE8.20变体)的碱基编辑系统相对于参考碱基编辑系统具有至少约40％的C到T碱基编辑活性。在一些实施方案中，包含ABE变体(例如，ABE8.20变体)的碱基编辑系统相对于参考碱基编辑系统具有至少约50％的C到T碱基编辑活性。在一些实施方案中，包含ABE变体(例如，ABE8.20变体)的碱基编辑系统相对于参考碱基编辑系统具有至少约60％的C到T碱基编辑活性。在一些实施方案中，包含ABE变体(例如，ABE8.20变体)的碱基编辑系统相对于参考碱基编辑系统具有至少约70％的C到T碱基编辑活性。
在一些实施方案中，包含ABE变体的碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统(例如，ABE8.20)活性的至少约30％。在一些实施方案中，包含ABE变体的碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统(例如，ABE8.20)活性的至少约40％。在一些实施方案中，包含ABE变体的碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统(例如，ABE8.20)活性的至少约50％。在一些实施方案中，包含ABE变体的碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统(例如，ABE8.20)活性的至少约60％。在一些实施方案中，包含ABE变体的碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统(例如，ABE8.20)活性的至少约70％。在各种实施方案中，参考碱基编辑器系统是ABE8.20或ABE8.19、B93、B88、变体1.17(表1A)或变体1.2(表1A)。
在一些实施方案中，碱基编辑器包含有包含全部或部分尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)的结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器包含一个或多个UGI结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器包含两个UGI结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器包含有包含全部或部分核酸聚合酶的结构域。在一些实施方案中，碱基编辑器可以包含作为结构域的全部或部分核酸聚合酶(NAP)。例如，碱基编辑器可以包含全部或部分真核生物NAP。在一些实施方案中，并入碱基编辑器的NAP或其部分是DNA聚合酶。在一些实施方案中，并入碱基编辑器的NAP或其部分具有跨损伤聚合酶活性。在一些实施方案中，并入碱基编辑器的NAP或其部分是跨损伤DNA聚合酶。在一些实施方案中，并入碱基编辑器的NAP或其部分是Rev7、Rev1复合物、聚合酶ι、聚合酶κ或聚合酶η。在一些实施方案中，并入碱基编辑器的NAP或其部分是真核聚合酶α、β、γ、δ、ε、γ、η、ι、κ、λ、μ或ν组分。在一些实施方案中，并入碱基编辑器的NAP或其部分包含与核酸聚合酶(例如，跨损伤DNA聚合酶)至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，并入碱基编辑器的核酸聚合酶或其部分是跨损伤DNA聚合酶。
在一些实施方案中，碱基编辑器的结构域可以包含多个结构域。例如，包含来源于Cas9的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域的碱基编辑器可以包含对应于野生型或天然Cas9的REC叶和NUC叶的REC叶和NUC叶。在另一个实例中，碱基编辑器可以包含RuvCI结构域、BH结构域、REC1结构域、REC2域、RuvCII结构域、L1结构域、HNH结构域、L2结构域、RuvCIII结构域、WED结构域、TOPO结构域或CTD结构域中的一个或多个。在一些实施方案中，碱基编辑器的一个或多个结构域包含相对于包含所述结构域的多肽的野生型形式的突变(例如，取代、插入、缺失)。例如，多核苷酸可编程DNA结合结构域的HNH结构域可以包含H840A取代。在另一个实例中，多核苷酸可编程DNA结合结构域的RuvCI域可以包含D10A取代。
本文公开的碱基编辑器的不同结构域(例如，相邻结构域)可以在使用或不使用一个或多个接头结构域(例如，XTEN接头结构域)的情况下彼此连接。在一些实施方案中，接头结构域可以是键(例如，共价键)、化学基团或连接两个分子或部分(例如，融合蛋白的两个结构域，例如像第一结构域(例如，Cas9衍生结构域)和第二结构域(例如，腺苷脱氨酶变体结构域))的分子。在一些实施方案中，接头是共价键(例如，碳-碳键、二硫键、碳-杂原子键等)。在某些实施方案中，接头是酰胺键的碳氮键。在某些实施方案中，接头是环状或无环、取代或未取代、支链或非支链的脂族或杂脂族接头。在某些实施方案中，接头是聚合的(例如，聚乙烯、聚乙二醇、聚酰胺、聚酯等)。在某些实施方案中，接头包含氨基链烷酸的单体、二聚体或聚合物。在一些实施方案中，接头包含氨基链烷酸(例如，甘氨酸、乙酸、丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-戊酸等)。在一些实施方案中，接头包含氨基己酸(Ahx)的单体、二聚体或聚合物。在某些实施方案中，接头基于碳环部分(例如，环戊烷、环己烷)。在其他实施方案中，接头包含聚乙二醇部分(PEG)。在某些实施方案中，接头包含芳基或杂芳基部分。在某些实施方案中，接头基于苯环。接头可以包含功能化部分以促进亲核物质(例如，硫醇、氨基)从肽连接到接头。任何亲电试剂都可以用作接头的一部分。示例性亲电试剂包括但不限于活化酯、活化酰胺、迈克尔受体、卤代烷、芳基卤、酰卤和异硫氰酸酯。在一些实施方案中，接头连接RNA可编程核酸酶的gRNA结合结构域，包括Cas9核酸酶结构域和核酸编辑蛋白的催化结构域。在一些实施方案中，接头连接dCas9和第二结构域(例如，UGI等)。
接头
在某些实施方案中，接头可以用于连接本发明的任何肽或肽结构域。接头可以像共价键一样简单，或者它可以是长度为许多原子的聚合接头。在某些实施方案中，接头是多肽或基于氨基酸。在其他实施方案中，接头不是肽样的。在某些实施方案中，接头是共价键(例如，碳-碳键、二硫键、碳-杂原子键等)。在某些实施方案中，接头是酰胺键的碳-氮键。在某些实施方案中，接头是环状或无环、取代或未取代、支链或非支链的脂族或杂脂族接头。在某些实施方案中，接头是聚合的(例如，聚乙烯、聚乙二醇、聚酰胺、聚酯等)。在某些实施方案中，接头包含氨基链烷酸的单体、二聚体或聚合物。在某些实施方案中，接头包含氨基链烷酸(例如，甘氨酸、乙酸、丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-戊酸等)。在某些实施方案中，接头包含氨基己酸(Ahx)的单体、二聚体或聚合物。在某些实施方案中，接头基于碳环部分(例如，环戊烷、环己烷)。在其他实施方案中，接头包含聚乙二醇部分(PEG)。在其他实施方案中，接头包含氨基酸。在某些实施方案中，接头包含肽。在某些实施方案中，接头包含芳基或杂芳基部分。在某些实施方案中，接头基于苯环。接头可以包含功能化部分以促进亲核物质(例如，硫醇、氨基)从肽连接到接头。任何亲电试剂都可以用作接头的一部分。示例性亲电试剂包括但不限于活化酯、活化酰胺、迈克尔受体、卤代烷、芳基卤、酰卤和异硫氰酸酯。
通常，接头位于两个基团、分子或其他部分之间或侧翼为两个基团、分子或其他部分，并通过共价键连接到每一个，从而将两者连接起来。在一些实施方案中，接头是一个氨基酸或多个氨基酸(例如，肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头是有机分子、基团、聚合物或化学部分。在一些实施方案中，接头长度为2-100个氨基酸，例如长度为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、30-35个、35-40个、40-45个、45-50个、50-60个、60-70个、70-80个、80-90个、90-100个、100-150个或150-200个氨基酸。在一些实施方案中，接头长度为约3个至约104个(例如，5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个)氨基酸。也考虑了更长或更短的接头。
在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白或多分子复合物包含经由接头彼此融合的腺苷脱氨酶变体和Cas9结构域。可以使用腺苷脱氨酶变体与Cas9结构域之间的各种接头长度和柔性(例如，范围从非常具有柔性的接头形式(GGGS)n(SEQ ID NO:261)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:262)和(G)n到更刚性的接头形式(EAAAK)n(SEQ ID NO:263)、(SGGS)n(SEQ ID NO:370)、SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:264)(参见，例如，Guilinger JP等人Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves thespecificity of genome modification.Nat.Biotechnol.2014；32(6):577-82；全部内容以引用方式并入本文)和(XP)n)以获得腺苷脱氨酶核碱基编辑器变体的最佳活性长度。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，接头包含(GGS)n基序，其中n是1、3或7。在一些实施方案中，本文提供的腺苷脱氨酶变体和任何融合蛋白或多分子复合物的Cas9结构域经由包含氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQ IDNO:264)的接头融合，所述接头也可以称为XTEN接头。
在一些实施方案中，碱基编辑器的结构域经由包含以下氨基酸序列的接头融合：
SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS(SEQ ID NO:371)、
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(SEQ ID NO:372)或
GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS(SEQ ID NO:373)。
在一些实施方案中，碱基编辑器的结构域经由包含氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:264)的接头融合，所述接头也可以称为XTEN接头。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGS。在一些实施方案中，接头的长度为24个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:374)。在一些实施方案中，接头的长度为40个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列：SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES SGGSSGGSSGGSSGGS(SEQ ID NO:375)。在一些实施方案中，接头的长度为64个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列：SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPG TSESATPESSGGSSGGS(SEQ ID NO:376)。在一些实施方案中，接头的长度为92个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列：PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS(SEQ ID NO:377)。
在一些实施方案中，接头包含多个脯氨酸残基并且长度为5-21个、5-14个、5-9个、5-7个氨基酸，例如PAPAP(SEQ ID NO:378)、PAPAPA(SEQ ID NO:379)、PAPAPAP(SEQ ID NO:380)、PAPAPAPA(SEQ ID NO:381)、P(AP)4(SEQ ID NO:382)、P(AP)7(SEQ ID NO:383)、P(AP)10(SEQ ID NO:384)(参见，例如Tan J,Zhang F,Karcher D,Bock R.Engineering ofhigh-precision base editors for site-specific single nucleotidereplacement.Nat Commun.2019年1月25日；10(1):439；全部内容以引用方式并入本文)。这种富含脯氨酸的接头也称为“刚性”接头。
在另一个实施方案中，碱基编辑器系统包含与脱氨酶(DNA脱氨酶)例如腺苷脱氨酶变体非共价相互作用的组分(蛋白质)，并将腺苷脱氨酶变体瞬时吸引至靶多核苷酸序列中的靶核碱基以进行特定编辑，具有最小的或减少的旁观者或靶相邻效应。这种涉及脱氨酶相互作用蛋白的非共价系统和方法用于将DNA脱氨酶吸引到特定的基因组靶核碱基，并解耦靶上和靶相邻编辑事件，从而增强更精确的单碱基取代突变的实现。在一个实施方案中，脱氨酶相互作用蛋白与脱氨酶(例如，腺苷脱氨酶变体)结合，而不阻断或干扰脱氨酶的活性(催化)位点与靶核碱基(例如，分别为腺苷和/或胞苷)接合。诸如，称为“MagnEdit”的系统包括与Cas9和gRNA复合物相连的相互作用蛋白，并且可以吸引共表达的腺苷或胞苷脱氨酶(外源性或内源性)以编辑特定的基因组靶位点，并描述于McCann,J.等人,2020,“MagnEdit–interacting factors that recruit DNA-editing enzymes to single basetargets,”Life-Science-Alliance,第3卷,第4期(e201900606),(doi10.26508/Isa.201900606)，其内容以引用方式整体并入本文。在一个实施方案中，DNA脱氨酶是如本文所述的腺苷脱氨酶变体(例如，能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和/或胞嘧啶脱氨的腺苷脱氨酶变体)。
在另一个实施方案中，称为“Suntag”的系统包括用于将碱基编辑器的蛋白质(例如，腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶)组分或其多个拷贝募集到多核苷酸靶位点以在相邻靶编辑减少的位点处实现碱基编辑的非共价相互作用组分，例如，如Tanenbaum,M.E.等人,“Aprotein tagging system for signal amplification in gene expression andfluorescence imaging,”Cell.2014年10月23日；159(3):635–646.doi:10.1016/j.cell.2014.09.039；和Huang,Y.-H.等人,2017,“DNA epigenome editing usingCRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A,”Genome Biol 18:176.doi:10.1186/s13059-017-1306-z中所述，所述文献各自的内容都以引用方式整体并入本文。在一个实施方案中，DNA脱氨酶是如本文所述的腺苷脱氨酶变体(例如，能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和/或胞嘧啶脱氨的腺苷脱氨酶变体)。
具有指导RNA的核酸可编程DNA结合蛋白
本文提供了用于细胞中碱基编辑的组合物和方法。本文还提供了组合物，其包含指导多核酸序列，例如指导RNA序列，或如本文提供的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个指导RNA的组合。在一些实施方案中，如本文提供的用于碱基编辑的组合物还包含编码碱基编辑器，例如C-碱基编辑器和/或A-碱基编辑器的多核苷酸。例如，用于碱基编辑的组合物可以包含编码ABE变体的mRNA序列和所提供的一种或多种指导RNA的组合。用于碱基编辑的组合物可以包含碱基编辑多肽和本文提供的任何指导RNA中的一种或多种的组合。这种组合物可以用于通过不同的递送途径(例如电穿孔、核转染、病毒转导或转染)在细胞中实现碱基编辑。在一些实施方案中，用于碱基编辑的组合物包含本文提供的用于电穿孔的编码碱基编辑器的mRNA序列和一种或多种指导RNA序列的组合。
本公开的一些方面提供了复合物，所述复合物包含本文提供的任何融合蛋白或多分子复合物，以及与融合蛋白或多分子复合物的核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)结构域(例如，Cas9(例如，dCas9、核酸酶活性Cas9，或Cas9切口酶)或Cas12)结合的指导RNA。这些复合物也称为核糖核蛋白(RNP)。在一些实施方案中，指导核酸(例如，指导RNA)为15-100个核苷酸长，并且包含与靶序列互补的至少10个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，指导RNA为15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49或50个核苷酸长。在一些实施方案中，指导RNA包含15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个与靶序列互补的连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，靶序列是DNA序列。在一些实施方案中，靶序列是RNA序列。在一些实施方案中，靶序列是细菌、酵母、真菌、昆虫、植物或动物的基因组中的序列。在一些实施方案中，靶序列是人基因组中的序列。在一些实施方案中，靶序列的3'末端紧邻规范PAM序列(NGG)。在一些实施方案中，靶序列的3'末端紧邻非规范PAM序列(例如，表6中列出的序列或5'-NAA-3')。在一些实施方案中，指导核酸(例如，指导RNA)与感兴趣的基因(例如，与疾病或病症相关的基因)中的序列互补。
本公开的一些方面提供了使用本文提供的融合蛋白或多分子复合物的方法。例如，本公开的一些方面提供的方法包括使DNA分子与本文提供的任何融合蛋白或多分子复合物和至少一种指导RNA接触，其中指导RNA为约15-100个核苷酸长并且包含与靶序列互补的至少10个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，靶序列的3'末端紧邻AGC、GAG、TTT、GTG或CAA序列。在一些实施方案中，靶序列的3'末端紧邻NGA、NGCG、NGN、NNGRRT、NNNRRT、NGCG、NGCN、NGTN、NGTN、NGTN或5'(TTTV)序列。在一些实施方案中，靶序列的3'末端紧邻例如TTN、DTTN、GTTN、ATTN、ATTC、DTTNT、WTTN、HATY、TTTN、TTTV、TTTC、TG、RTR或YTN PAM位点。
应当理解，各个序列中特定位置或残基的编号取决于所使用的特定蛋白质和编号方案。编号可能不同，例如，成熟蛋白质的前体和成熟蛋白质本身的编号不同，并且物种之间的序列差异可能会影响编号。本领域技术人员将能够通过本领域熟知的方法，例如通过序列比对和同源残基的测定，鉴定任何同源蛋白质和相应编码核酸中的相应残基。
对本领域技术人员将显而易见的是，为了使本文公开的任何融合蛋白或多分子复合物靶向靶位点(例如，包含待编辑的突变的位点)，通常需要将融合蛋白或多分子复合物与指导RNA一起共表达。如本文其他地方更详细解释，指导RNA通常包含允许napDNAbp(例如，Cas9或Cas12)结合的tracrRNA框架和指导序列，其赋予napDNAbp:核酸编辑酶/结构域融合蛋白或多分子复合物序列特异性。或者，可以单独提供指导RNA和tracrRNA，作为两个核酸分子。在一些实施方案中，指导RNA包含一种结构，其中指导序列包含与靶序列互补的序列。指导序列通常为20个核苷酸长。基于本公开，用于将napDNAbp:核酸编辑酶/结构域融合蛋白或多分子复合物靶向特定基因组靶位点的合适指导RNA的序列对于本领域技术人员将是显而易见的。这种合适的指导RNA序列通常包含与待编辑的靶核苷酸上游或下游50个核苷酸内的核酸序列互补的指导序列。本文提供了一些示例性指导RNA序列，所述指导RNA序列适用于将任何所提供的融合蛋白或多分子复合物靶向特定的靶序列。
预计sgRNA的不同部分会形成与Cas9(例如，SpyCas9)和/或DNA靶标相互作用的各种特征。已在指导Cas9核酸内切酶活性的天然crRNA:tracrRNA双链体和单导向RNA(sgRNA)内鉴定出六个保守模块(参见Briner等人,Guide RNA Functional Modules DirectCas9Activity and Orthogonality Mol Cell.2014年10月23日；56(2):333-339)。这六个模块包括负责DNA靶向的间隔区、由CRISPR重复:tracrRNA双链体形成的上位茎、凸起、下位茎、连接、来自tracrRNA 3'末端的发夹。上位茎和下位茎主要通过与磷酸骨架的序列非依赖性相互作用与Cas9相互作用。在一些实施方案中，上位茎是可有可无的。在一些实施方案中，下位茎基部的保守尿嘧啶核苷酸序列是可有可无的。凸起参与与Cas9的Rec1结构域的特定侧链相互作用。U44的核碱基与Tyr 325和His 328的侧链相互作用，而G43与Tyr 329相互作用。连接形成sgRNA:Cas9相互作用的核心，并且位于sgRNA与Cas9和靶DNA之间的交叉点。A51和A52的核碱基与Phe 1105的侧链相互作用；U56与Arg 457和Asn 459相互作用；U59的核碱基插入由Arg74、Asn 77、Pro 475、Leu 455、Phe 446和Ile 448的侧链限定的疏水口袋中；C60与Leu 455、Ala 456和Asn 459相互作用，并且C61与Arg 70的侧链相互作用，Arg70的侧链又与C15相互作用。在一些实施方案中，这些突变中的一个或多个在凸起和/或Cas9(例如spyCas9)的sgRNA的连接中进行以优化sgRNA:Cas9相互作用。
此外，tracrRNA连接和发夹对Cas9配对至关重要，并且可以互换以跨越分离不同Cas9蛋白的正交障碍，这有助于进一步利用正交Cas9蛋白。在一些实施方案中，连接和发夹互换以靶向正交Cas9蛋白。在一些实施方案中，sgRNA被免除上位茎、发夹1和/或下位茎的序列灵活性以设计更紧凑和构象稳定的指导RNA。在一些实施方案中，使用具有各种嵌合指导物的单个Cas9或通过同时使用具有不同嵌合sgRNA组合的正交系统对模块进行修饰以优化多重编辑。关于指导功能性模块及其方法的详情描述于例如，Briner等人,Guide RNAFunctional Modules Direct Cas9 Activity and Orthogonality Mol Cell.2014年10月23日；56(2):333-339中，其内容以引用方式整体并入本文。
本文公开的碱基编辑器的结构域可以以任何顺序排列。包含有包含例如多核苷酸可编程核苷酸结合结构域(例如，Cas9或Cas12)和脱氨酶结构域(例如，腺苷脱氨酶变体)的融合蛋白的碱基编辑器的非限制性实例可以如下排列：
NH2-[核碱基编辑结构域]-接头1-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[脱氨酶]-接头1-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[脱氨酶]-接头1-[核碱基编辑结构域]-接头2-[UGI]-COOH；
NH2-[脱氨酶]-接头1-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[腺苷脱氨酶]-接头1-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-COOH；
NH2-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-[肌苷BER抑制剂]-COOH；
NH2-[脱氨酶]-[肌苷BER抑制剂]-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[肌苷BER抑制剂]-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-[肌苷BER抑制剂]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[肌苷BER抑制剂]-[脱氨酶]-COOH；
NH2-[肌苷BER抑制剂]-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-[肌苷BER抑制剂]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-[肌苷BER抑制剂]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-[肌苷BER抑制剂]-COOH；
NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-[肌苷BER抑制剂]-COOH；
NH2-[肌苷BER抑制剂]-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[肌苷BER抑制剂]-[核碱基编辑结构域]-接头1-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH；
NH2-[肌苷BER抑制剂]-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-接头2-[核碱基编辑结构域]-COOH；或
NH2-[肌苷BER抑制剂]NH2-[核碱基编辑结构域]-[脱氨酶]-[核碱基编辑结构域]-COOH。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑融合蛋白或多分子复合物需要定位在精确位置，例如，其中靶碱基被放置在限定区域(例如，“脱氨窗口”)内。在一些实施方案中，靶标可以在4个碱基区域内。在一些实施方案中，此限定靶区域可以在PAM上游大约15个碱基处。参见Komor,A.C.等人,“Programmable editing of a target base in genomic DNAwithout double-stranded DNA cleavage”Nature 533,420-424(2016)；Gaudelli,N.M.等人,“Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNAcleavage”Nature 551,464-471(2017)；以及Komor,A.C.等人,“Improved base excisionrepair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A baseeditors with higher efficiency and product purity”Science Advances3:eaao4774(2017)；其全部内容以引用方式特此并入。
限定的靶区域可以是脱氨窗口。脱氨窗口可以是碱基编辑器作用于靶核苷酸并使靶核苷酸脱氨的限定区域。在一些实施方案中，脱氨窗口在2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碱基区域内。在一些实施方案中，脱氨窗口在PAM上游5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个碱基处。
本公开的碱基编辑器可以包含促进靶多核苷酸序列的编辑的任何结构域、特征或氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，碱基编辑器包含核定位序列(NLS)。在一些实施方案中，碱基编辑器的NLS位于脱氨酶结构域和napDNAbp结构域之间。在一些实施方案中，碱基编辑器的NLS位于napDNAbp结构域的C端。
可以包含在融合蛋白或多分子复合物中的蛋白质结构域的非限制性实例包括脱氨酶结构域(例如，腺苷脱氨酶变体)、尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)结构域、表位标签、报告基因序列和/或具有本文所述的一种或多种活性的蛋白质结构域。
可以用表位标签、报告蛋白、其他结合结构域检测或标记结构域。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和自体荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(BFP)。另外的蛋白质序列可以包括结合DNA分子或结合其他细胞分子的氨基酸序列，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-tag、Lex ADNA结合结构域(DBD)融合体、GAL4 DNA结合结构域融合体和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合体。
使用包含腺苷脱氨酶变体和Cas9结构域的融合蛋白或多分子复合物的方法
本公开的一些方面提供了使用本文提供的融合蛋白或复合物的方法。例如，本公开的一些方面提供包括使DNA分子与本文提供的任何融合蛋白或复合物以及与本文所述的至少一种指导RNA接触的方法。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白或多分子复合物用于编辑感兴趣的靶基因。特别地，如本文所述的腺苷脱氨酶核碱基编辑器变体能够在靶序列内进行多个突变。这些突变可能会影响靶标的功能。例如，当使用腺苷脱氨酶核碱基编辑器变体靶向调节区时，调节区的功能被改变并且下游蛋白质的表达减少或消除。
应当理解，各个序列中特定位置或残基的编号取决于所使用的特定蛋白质和编号方案。编号可能不同，例如，成熟蛋白质的前体和成熟蛋白质本身的编号不同，并且物种之间的序列差异可能会影响编号。本领域技术人员将能够通过本领域熟知的方法，例如通过序列比对和同源残基的测定，鉴定任何同源蛋白质和相应编码核酸中的相应残基。
对本领域技术人员将显而易见的是，为了使如本文公开的包含Cas9结构域和腺苷脱氨酶变体的任何融合蛋白或多分子复合物靶向靶位点(例如，包含待编辑的突变的位点)，通常需要将融合蛋白或多分子复合物与指导RNA(例如，sgRNA)一起共表达。如本文其他地方更详细解释，指导RNA通常包含允许Cas9结合的tracrRNA框架和指导序列，其赋予Cas9:核酸编辑酶/结构域融合蛋白或多分子复合物序列特异性。或者，可以单独提供指导RNA和tracrRNA，作为两个核酸分子。在一些实施方案中，指导RNA包含一种结构，其中指导序列包含与靶序列互补的序列。指导序列通常为20个核苷酸长。基于本公开，用于将Cas9:核酸编辑酶/结构域融合蛋白或多分子复合物靶向特定基因组靶位点的合适指导RNA的序列对于本领域技术人员将是显而易见的。这种合适的指导RNA序列通常包含与待编辑的靶核苷酸上游或下游50个核苷酸内的核酸序列互补的指导序列。本文提供了一些示例性指导RNA序列，所述指导RNA序列适用于将任何所提供的融合蛋白或多分子复合物靶向特定的靶序列。
碱基编辑器效率
在一些实施方案中，本文提供的方法的目的是改变基因和/或通过基因编辑的基因产物。本文提供的核碱基编辑蛋白可以用于体外或体内基于基因编辑的人类治疗。本领域技术人员将理解，本文提供的核碱基编辑蛋白(例如，包含多核苷酸可编程核苷酸结合结构域(例如，Cas9)和核碱基编辑结构域(例如，腺苷脱氨酶变体结构域)的融合蛋白或多分子复合物)可以用于将核苷酸从A编辑到G或从C编辑到T。
有利地，如本文所提供的碱基编辑系统提供基因组编辑，而不生成双链DNA断裂，不需要供体DNA模板，并且不会像CRISPR那样诱导过量的随机插入和缺失。在一些实施方案中，本公开提供碱基编辑器，其在核酸(例如，受试者基因组内的核酸)中有效生成预期突变，诸如终止密码子，而不生成显著数量的非预期突变，诸如非预期点突变。在一些实施方案中，预期突变是由与指导多核苷酸(例如，gRNA)结合的特定碱基编辑器(例如，腺苷碱基编辑器或胞苷碱基编辑器)产生的突变，所述碱基编辑器被专门设计以产生预期突变。在一些实施方案中，预期突变在与靶抗原相关的基因中，所述靶抗原与疾病或病症相关。在一些实施方案中，预期突变是与靶抗原相关的基因中的腺嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)点突变(例如，SNP)，所述靶抗原与疾病或病症相关。在一些实施方案中，预期突变是基因的编码区或非编码区(例如，调节区或元件)内的腺嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)点突变。在一些实施方案中，预期突变是与靶抗原相关的基因中的胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)点突变(例如，SNP)，所述靶抗原与疾病或病症相关。在一些实施方案中，预期突变是基因的编码区或非编码区(例如，调节区或元件)内的胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)点突变。在一些实施方案中，预期突变是产生终止密码子(例如基因编码区内的提前终止密码子)的点突变。在一些实施方案中，预期突变是消除终止密码子的突变。
本发明的碱基编辑器有利地修饰编码蛋白质的特定核苷酸碱基而不产生显著比例的插入缺失。如本文所用，“插入缺失”是指核苷酸碱基在核酸内的插入或缺失。这种插入或缺失可以导致基因编码区内的框移突变。在一些实施方案中，需要产生有效修饰(例如，突变)核酸内的特定核苷酸而不在核酸中产生大量插入或缺失(即，插入缺失)的碱基编辑器。在一些实施方案中，需要产生有效修饰(例如，突变或甲基化)核酸内的特定核苷酸而不在核酸中产生大量插入或缺失(即，插入缺失)的碱基编辑器。在某些实施方案中，本文提供的任何碱基编辑器可以产生相对于插入缺失更大比例的预期修饰(例如，甲基化)。在某些实施方案中，本文提供的任何碱基编辑器可以产生相对于插入缺失更大比例的预期修饰(例如，突变)。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器能够生成大于1:1的预期突变比插入缺失比率(即，预期点突变:非预期突变)。在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器能够生成至少1.5:1、至少2:1、至少2.5:1、至少3:1、至少3.5:1、至少4:1、至少4.5:1、至少5:1、至少5.5:1、至少6:1、至少6.5:1、至少7:1、至少7.5:1、至少8:1、至少10:1、至少12:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少40:1、至少50:1、至少100:1、至少200:1、至少300:1、至少400:1、至少500:1、至少600:1、至少700:1、至少800:1、至少900:1或至少1000:1或更大的预期突变比插入缺失比率。可以使用任何合适的方法确定预期突变和插入缺失的数量。
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器可以限制核酸区域中插入缺失的形成。在一些实施方案中，所述区域位于碱基编辑器靶向的核苷酸处或碱基编辑器靶向的核苷酸的2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸内的区域。在一些实施方案中，本文提供的任何碱基编辑器可以将核酸区域处插入缺失的形成限制为小于1％、小于1.5％、小于2％、小于2.5％、小于3％、小于3.5％、小于4％、小于4.5％、小于5％、小于6％、小于7％、小于8％、小于9％、小于10％、小于12％、小于15％，或小于20％。在核酸区域形成的插入缺失的数量可以取决于核酸(例如，细胞基因组内的核酸)暴露于碱基编辑器的时间量。在一些实施方案中，在将核酸(例如，细胞基因组内的核酸)暴露于碱基编辑器至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少3天、至少4天、至少5天、至少7天、至少10天或至少14天后确定插入缺失的数量或比例。
本公开的一些方面基于以下认识：本文提供的任何碱基编辑器能够有效地在核酸(例如，受试者基因组内的核酸)中产生预期突变，而不会产生大量非预期突变(例如，伪脱靶编辑或旁观者编辑)。在一些实施方案中，预期突变是由与gRNA结合的特定碱基编辑器产生的突变，所述碱基编辑器被专门设计以产生预期突变。在一些实施方案中，预期突变是产生终止密码子(例如基因编码区内的提前终止密码子)的突变。在一些实施方案中，预期突变是消除终止密码子的突变。在一些实施方案中，预期突变是改变基因剪接的突变。在一些实施方案中，预期突变是改变基因的调节序列(例如基因启动子或基因阻遏物)的突变。在一些实施方案中，本文提供的任何碱基编辑器能够产生大于1:1的预期突变与非预期突变比率(例如，预期突变:非预期突变)。在一些实施方案中，本文提供的任何碱基编辑器能够产生至少1.5:1、至少2:1、至少2.5:1、至少3:1、至少3.5:1、至少4:1、至少4.5:1、至少5:1、至少5.5:1、至少6:1、至少6.5:1、至少7:1、至少7.5:1、至少8:1、至少10:1、至少12:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少40:1、至少50:1、至少100:1、至少150:1、至少200:1、至少250:1、至少500:1或至少1000:1或更大的预期突变与非预期突变比率。应当理解，本文所述的碱基编辑器的特征可以应用于任何融合蛋白或多分子复合物，或本文提供的使用融合蛋白或多分子复合物的方法。
碱基编辑通常被称为“修饰”，诸如遗传修饰、基因修饰和核酸序列的修饰，并且基于所述修饰是碱基编辑修饰的上下文可以清楚地理解。因此，碱基编辑修饰是核苷酸碱基水平的修饰(例如由于在整个公开中讨论的脱氨酶活性)，然后其导致基因序列的变化，并且可能影响基因产物。因此，本质上，本文所述的基因编辑修饰可以导致基因结构上和/或功能上的修饰，其中基因产物的表达可以被修饰，例如基因的表达被敲除；或相反，被增强，或在一些情况下，基因功能或活性可以被修饰。使用本文公开的方法，碱基编辑效率可以确定为进行碱基编辑的基因的敲低效率，其中碱基编辑旨在敲低基因的表达。敲低水平可以通过确定表达水平来定量验证，所述表达水平通过以下确定：任何检测测定，诸如蛋白质表达水平测定，例如流式细胞术；用于检测RNA表达的测定，诸如定量RT-PCR、RNA印迹分析，或任何其他合适的测定诸如焦磷酸法测序；并且可以通过核苷酸测序反应进行定性验证。
在一些实施方案中，修饰(例如单碱基编辑)导致基因靶向表达降低至少10％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少10％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少20％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少30％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少40％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少50％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少60％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少70％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少80％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少90％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少91％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少92％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少93％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少94％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少95％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少96％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少97％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少98％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致基因靶向表达降低至少99％。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以导致被靶向的基因的敲除(基因表达的100％敲低)。
在一些实施方案中，本文提供的任何碱基编辑器系统导致在靶多核苷酸序列中少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.9％、少于0.8％、少于0.7％、少于0.6％、少于0.5％、少于0.4％、少于0.3％、少于0.2％、少于0.1％、少于0.09％、少于0.08％、少于0.07％、少于0.06％、少于0.05％、少于0.04％、少于0.03％、少于0.02％或少于0.01％的插入缺失形成。
在一些实施方案中，靶向修饰(例如单碱基编辑)用于同时靶向至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个不同的内源序列，用于使用不同的指导RNA进行碱基编辑。在一些实施方案中，靶向修饰(例如单碱基编辑)用于连续靶向至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个不同的内源序列，用于使用不同的指导RNA进行碱基编辑。
本公开的一些方面基于以下认识：本文提供的任何碱基编辑器能够在核酸(例如，受试者基因组内的核酸)中有效地产生预期突变诸如点突变，而不会产生大量非预期突变诸如非预期点突变(即，旁观者突变)。在一些实施方案中，本文提供的任何碱基编辑器能够产生至少0.01％的预期突变(即，至少0.01％的碱基编辑效率)。在一些实施方案中，本文提供的任何碱基编辑器能够产生至少0.01％、1％、2％,3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的预期突变。
在一些实施方案中，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑器系统导致靶多核苷酸序列中少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.9％、少于0.8％、少于0.7％、少于0.6％、少于0.5％、少于0.4％、少于0.3％、少于0.2％、少于0.1％、少于0.09％、少于0.08％、少于0.07％、少于0.06％、少于0.05％、少于0.04％、少于0.03％、少于0.02％或少于0.01％的插入缺失形成。在一些实施方案中，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑器系统导致靶多核苷酸序列中少于0.8％的插入缺失形成。在一些实施方案中，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑器系统导致靶多核苷酸序列中至多0.8％的插入缺失形成。在一些实施方案中，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑器系统导致靶多核苷酸序列中少于0.3％的插入缺失形成。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器之一的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑器系统导致靶多核苷酸序列中的插入缺失形成更低。在一些实施方案中，与包含ABE7.10的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑器系统导致靶多核苷酸序列中的插入缺失形成更低。在一些实施方案中，与包含胞苷碱基编辑器(例如，BE4)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑器系统导致靶多核苷酸序列中的插入缺失形成更低。
在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器之一的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的碱基编辑器系统的插入缺失频率降低。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器之一的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑器系统的插入缺失频率降低至少0.01％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，与包含ABE7.10的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的碱基编辑器系统的插入缺失频率降低至少0.01％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在一些实施方案中，与包含胞苷碱基编辑器(例如，BE4)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的碱基编辑器系统的插入缺失频率降低。在一些实施方案中，与包含胞苷碱基编辑器(例如，BE4)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑器系统的插入缺失频率降低至少0.01％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。本发明提供了能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的胞嘧啶脱氨的腺苷脱氨酶变体。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体(例如，ABE8变体)具有增加的效率和特异性。特别地，本文所述的腺苷脱氨酶变体更有可能编辑多核苷酸内的所需碱基，并且不太可能编辑非预期改变的碱基(例如，“旁观者”)。
在一些实施方案中，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑系统的旁观者编辑或突变减少。在一些实施方案中，非预期编辑或突变是旁观者突变或旁观者编辑，例如，在靶核苷酸序列的靶目标窗口中的非预期或非靶位置中的靶碱基(例如，A或C)的碱基编辑。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器(例如，ABE7.10)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑系统的旁观者编辑或突变减少。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器(例如ABE7.10)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的碱基编辑器系统的旁观者编辑或突变减少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器(例如ABE7.10)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑系统的旁观者编辑或突变已减少至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍或至少3.0倍。
在一些实施方案中，与包含胞苷碱基编辑器(例如，BE4)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑系统的旁观者编辑或突变减少)。在一些实施方案中，与包含胞苷碱基编辑器(例如，BE4)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的碱基编辑器系统的旁观者编辑或突变减少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，与包含胞苷碱基编辑器(例如，BE4)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑系统的旁观者编辑或突变已减少至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍或至少3.0倍。
在一些实施方案中，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑系统的伪编辑减少。在一些实施方案中，非预期编辑或突变是伪突变或伪编辑，例如基因组的非预期或非靶区域中的靶碱基(例如，A或C)的非特异性编辑或指导物非依赖性编辑。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器(例如，ABE7.10)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑系统的伪编辑减少。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器(例如，ABE7.10)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的碱基编辑器系统的伪编辑减少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器(例如，ABE7.10)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑系统的伪编辑减少至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍或至少3.0倍。
在一些实施方案中，与包含胞苷碱基编辑器(例如，BE4)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑系统的伪编辑减少。在一些实施方案中，与包含胞苷碱基编辑器(例如，BE4)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的碱基编辑器系统的伪编辑减少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，与包含胞苷碱基编辑器(例如，BE4)的碱基编辑器系统相比，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑系统的伪编辑减少至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍或至少3.0倍。
在一些实施方案中，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有至少0.01％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或至少99％的碱基编辑效率。在一些实施方案中，碱基编辑效率可以通过计算细胞群体中编辑的核碱基的百分比来测量。在一些实施方案中，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有通过细胞群体中编辑的核碱基测量的至少0.01％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或至少99％的碱基编辑效率。
在一些实施方案中，与ABE7碱基编辑器相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有更高的碱基编辑效率。在一些实施方案中，与ABE7碱基编辑器(例如ABE7.10)相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少310％、至少320％、至少330％、至少340％、至少350％、至少360％、至少370％、至少380％、至少390％、至少400％、至少450％或至少500％的碱基编辑效率。
在一些实施方案中，与胞苷碱基编辑器(例如，BE4)相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有更高的碱基编辑效率。在一些实施方案中，与胞苷碱基编辑器(例如，BE4)相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少310％、至少320％、至少330％、至少340％、至少350％、至少360％、至少370％、至少380％、至少390％、至少400％、至少450％或至少500％的碱基编辑效率。
在一些实施方案中，与ABE7碱基编辑器(例如ABE7.10)相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.1倍、至少3.2倍、至少3.3倍、至少3.4倍、至少3.5倍、至少3.6倍、至少3.7倍、至少3.8倍、至少3.9倍、至少4.0倍、至少4.1倍、至少4.2倍、至少4.3倍、至少4.4倍、至少4.5倍、至少4.6倍、至少4.7倍、至少4.8倍、至少4.9倍或至少5.0倍的碱基编辑效率。
在一些实施方案中，与胞苷碱基编辑器(例如，BE4)相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.1倍、至少3.2倍、至少3.3倍、至少3.4倍、至少3.5倍、至少3.6倍、至少3.7倍、至少3.8倍、至少3.9倍、至少4.0倍、至少4.1倍、至少4.2倍、至少4.3倍、至少4.4倍、至少4.5倍、至少4.6倍、至少4.7倍、至少4.8倍、至少4.9倍或至少5.0倍的碱基编辑效率。
在一些实施方案中，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有至少0.01％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或至少99％的中靶碱基编辑效率。在一些实施方案中，本文所述的任何ABE8碱基编辑器变体具有通过细胞群体中编辑的靶核碱基测量的至少0.01％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或至少99％的中靶碱基编辑效率。
在一些实施方案中，与ABE7碱基编辑器相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有更高的中靶碱基编辑效率。在一些实施方案中，与ABE7碱基编辑器(例如ABE7.10)相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少310％、至少320％、至少330％、至少340％、至少350％、至少360％、至少370％、至少380％、至少390％、至少400％、至少450％或至少500％的中靶碱基编辑效率。
在一些实施方案中，与胞苷碱基编辑器(例如，BE4)相比，本文所述的腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有更高的中靶碱基编辑效率。在一些实施方案中，与胞苷碱基编辑器(例如，BE4)相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少310％、至少320％、至少330％、至少340％、至少350％、至少360％、至少370％、至少380％、至少390％、至少400％、至少450％或至少500％的中靶碱基编辑效率。
在一些实施方案中，与ABE7碱基编辑器(例如，ABE7.10)相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.1倍、至少3.2倍、至少3.3倍、至少3.4倍、至少3.5倍、至少3.6倍、至少3.7倍、至少3.8倍、至少3.9倍、至少4.0倍、至少4.1倍、至少4.2倍、至少4.3倍、至少4.4倍、至少4.5倍、至少4.6倍、至少4.7倍、至少4.8倍、至少4.9倍或至少5.0倍的中靶碱基编辑效率。
在一些实施方案中，与胞苷碱基编辑器(例如，BE4)相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.1倍、至少3.2倍、至少3.3倍、至少3.4倍、至少3.5倍、至少3.6倍、至少3.7倍、至少3.8倍、至少3.9倍、至少4.0倍、至少4.1倍、至少4.2倍、至少4.3倍、至少4.4倍、至少4.5倍、至少4.6倍、至少4.7倍、至少4.8倍、至少4.9倍或至少5.0倍的中靶碱基编辑效率。
本文所述的腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)可以经由质粒、载体、LNP复合物或mRNA递送至宿主细胞。在一些实施方案中，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)作为mRNA递送至宿主细胞。在一些实施方案中，经由基于核酸的递送系统(例如，mRNA)递送的腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有通过编辑的核碱基测量的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的中靶编辑效率。在一些实施方案中，与通过质粒或载体系统递送的腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)相比，由mRNA系统递送的腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)具有更高的碱基编辑效率。在一些实施方案中，与通过质粒和载体系统递送时相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)在通过mRNA系统递送时具有至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少310％、至少320％、至少330％、至少340％、至少350％、至少360％、至少370％、至少380％、至少390％、至少400％、至少450％或至少500％的中靶编辑效率。在一些实施方案中，与通过质粒和载体系统递送时相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)在通过mRNA系统递送时具有高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.1倍、至少3.2倍、至少3.3倍、至少3.4倍、至少3.5倍、至少3.6倍、至少3.7倍、至少3.8倍、至少3.9倍、至少4.0倍、至少4.1倍、至少4.2倍、至少4.3倍、至少4.4倍、至少4.5倍、至少4.6倍、至少4.7倍、至少4.8倍、至少4.9倍或至少5.0倍的中靶编辑效率。
在一些实施方案中，本文所述的包含腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)之一的任何碱基编辑器系统导致在靶多核苷酸序列中少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.9％、少于0.8％、少于0.7％、少于0.6％、少于0.5％、少于0.4％、少于0.3％、少于0.2％、少于0.1％、少于0.09％、少于0.08％、少于0.07％、少于0.06％、少于0.05％、少于0.04％、少于0.03％、少于0.02％或少于0.01％的脱靶编辑。
在一些实施方案中，与通过质粒和载体系统递送时相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)在通过mRNA系统递送时具有更低的指导脱靶编辑效率。在一些实施方案中，与通过质粒和载体系统递送时相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)在通过mRNA系统递送时具有低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的指导脱靶编辑效率。在一些实施方案中，与通过质粒和载体系统递送时相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)在通过mRNA系统递送时具有低至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍或至少3.0倍的指导脱靶编辑效率。在一些实施方案中，与通过质粒和载体系统递送时相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)在通过mRNA系统递送时具有降低至少约2.2倍的指导脱靶编辑效率。
在一些实施方案中，与通过质粒和载体系统递送时相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)在通过mRNA系统递送时具有更低的指导物非依赖性脱靶编辑效率。在一些实施方案中，与通过质粒和载体系统递送时相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)在通过mRNA系统递送时具有低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的指导物非依赖性脱靶编辑效率。在一些实施方案中，与通过质粒和载体系统递送时相比，本文所述的任何腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)在通过mRNA系统递送时具有低至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少5.0倍、至少10.0倍、至少20.0倍、至少50.0倍、至少70.0倍、至少100.0倍、至少120.0倍、至少130.0倍、至少150.0倍的指导物非依赖性编辑效率。在一些实施方案中，与通过质粒或载体系统递送时相比，本文所述的腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)在通过mRNA系统递送时具有降低134.0倍的指导物非依赖性编辑效率(例如，伪RNA脱氨作用)。在一些实施方案中，本文所述的腺苷碱基编辑器变体(例如，ABE8碱基编辑器变体)不增加整个基因组的指导物非依赖性突变率。
在一些实施方案中，单个基因递送事件(例如，通过转导、转染、电穿孔或任何其他方法)可以用于靶向细胞基因组内5个序列的碱基编辑。在一些实施方案中，单个基因递送事件可以用于靶向细胞基因组内6个序列的碱基编辑。在一些实施方案中，单个基因递送事件可以用于靶向细胞基因组内7个序列的碱基编辑。在一些实施方案中，单个电穿孔事件可以用于靶向细胞基因组内8个序列的碱基编辑。在一些实施方案中，单个基因递送事件可以用于靶向细胞基因组内9个序列的碱基编辑。在一些实施方案中，单个基因递送事件可以用于靶向细胞基因组内10个序列的碱基编辑。在一些实施方案中，单个基因递送事件可以用于靶向细胞基因组内20个序列的碱基编辑。在一些实施方案中，单个基因递送事件可以用于靶向细胞基因组内30个序列的碱基编辑。在一些实施方案中，单个基因递送事件可以用于靶向细胞基因组内40个序列的碱基编辑。在一些实施方案中，单个基因递送事件可以用于靶向细胞基因组内50个序列的碱基编辑。
在一些实施方案中，本文所述的方法，例如碱基编辑方法具有最小化到没有的脱靶效应。
在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致至少50％的细胞群体已被成功编辑(即，已成功工程化改造的细胞)。在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致至少55％的细胞群体已被成功编辑。在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致至少60％的细胞群体已被成功编辑。在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致至少65％的细胞群体已被成功编辑。在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致至少70％的细胞群体已被成功编辑。在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致至少75％的细胞群体已被成功编辑。在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致至少80％的细胞群体已被成功编辑。在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致至少85％的细胞群体已被成功编辑。在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致至少90％的细胞群体已被成功编辑。在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致至少95％的细胞群体已被成功编辑。在一些实施方案中，本文所述的碱基编辑方法导致约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞群体已被成功编辑。
在一些实施方案中，碱基编辑干预后的活细胞回收率大于碱基编辑事件发生时的起始细胞群体的至少60％、70％、80％、90％。在一些实施方案中，如上所述的活细胞回收率为约70％。在一些实施方案中，如上所述的活细胞回收率为约75％。在一些实施方案中，如上所述的活细胞回收率为约80％。在一些实施方案中，如上所述的活细胞回收率为约85％。在一些实施方案中，如上所述的活细胞回收率为碱基编辑事件发生时的群体中的细胞的约90％，或约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％，或100％。
在一些实施方案中，工程化细胞群体可以在体外进一步扩增约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍或约100倍。
可以使用任何合适的方法来确定预期突变和插入缺失的数量，例如，如国际PCT申请号PCT/US2017/045381(WO2018/027078)和PCT/US2016/058344(WO2017/070632)；Komor,A.C.等人,“Programmable editing of a target base in genomic DNA withoutdouble-stranded DNA cleavage”Nature 533,420-424(2016)；Gaudelli,N.M.等人,“Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNAcleavage”Nature 551,464-471(2017)；以及Komor,A.C.等人,“Improved base excisionrepair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A baseeditors with higher efficiency and product purity”Science Advances 3:eaao4774(2017)中所述；其全部内容以引用方式特此并入。
在一些实施方案中，为了计算插入缺失频率，扫描测序读取以对位于可以出现插入缺失的窗口两侧的两个10-bp序列进行精确匹配。如果没有定位到精确匹配，则从分析中排除读取。如果此插入缺失窗口的长度与参考序列精确匹配，则读取被分类为不包含插入缺失。如果插入缺失窗口比参考序列长或短两个或更多个碱基，则测序读取分别被分类为插入或缺失。在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器可以限制核酸区域中插入缺失的形成。在一些实施方案中，所述区域位于碱基编辑器靶向的核苷酸处或碱基编辑器靶向的核苷酸的2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸内的区域。
在靶核苷酸区域形成的插入缺失的数量可以取决于核酸(例如，细胞基因组内的核酸)暴露于碱基编辑器的时间量。在一些实施方案中，在将核酸靶核苷酸序列(例如，细胞基因组内的核酸)暴露于碱基编辑器至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少3天、至少4天、至少5天、至少7天、至少10天或至少14天后确定插入缺失的数量或比例。应当理解，如本文所述的碱基编辑器的特征可以应用于任何融合蛋白或多分子复合物，或本文提供的使用融合蛋白或多分子复合物的方法。
碱基编辑器效率的详情描述于国际PCT申请号PCT/US2017/045381(WO 2018/027078)和PCT/US2016/058344(WO 2017/070632)，其各自以引用方式整体并入本文。还参见Komor,A.C.等人,“Programmable editing of a target base in genomic DNAwithout double-stranded DNA cleavage”Nature 533,420-424(2016)；Gaudelli,N.M.等人,“Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNAcleavage”Nature 551,464-471(2017)；以及Komor,A.C.等人,“Improved base excisionrepair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A baseeditors with higher efficiency and product purity”Science Advances 3:eaao4774(2017)；其全部内容以引用方式特此并入。在一些实施方案中，使用本文提供的方法编辑一个或多个基因中的多个核碱基对导致形成至少一种预期突变。在一些实施方案中，所述至少一种预期突变结果的所述形成导致基因正常功能的破坏。在一些实施方案中，所述至少一种预期突变结果的所述形成减少或消除了由所述基因编码的蛋白质的表达。应当理解，可以使用本文提供的任何方法或方法的组合来完成多重编辑。
多重编辑
在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑器系统能够对一个或多个基因中的多个核碱基对进行多重编辑。在一些实施方案中，多个核碱基对位于同一基因或一个或多个基因中，其中至少一个基因位于不同的基因座中。在一些实施方案中，多重编辑可以包括一个或多个指导多核苷酸。在一些实施方案中，多重编辑可以包括一个或多个碱基编辑器系统。在一些实施方案中，多重编辑可以包括一个或多个碱基编辑器系统，其具有单指导多核苷酸或多指导多核苷酸。在一些实施方案中，多重编辑可以包括一个或多个指导多核苷酸和单碱基编辑器系统。在一些实施方案中，多重编辑可以包括至少一个指导多核苷酸，所述指导多核苷酸需要或不需要PAM序列以靶向结合靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，多重编辑可以包括至少一个不需要PAM序列以靶向结合靶多核苷酸序列的指导多核苷酸和至少一个需要PAM序列以靶向结合靶多核苷酸序列的指导多核苷酸的混合体。应当理解，使用如本文所述的任何碱基编辑器的多重编辑的特征可以应用于使用本文提供的任何碱基编辑器的方法的任何组合。还应当理解，使用如本文所述的任何碱基编辑器的多重编辑可以包括多个核碱基对的连续编辑。
在一些实施方案中，多个核碱基对在一个或多个基因中。在一些实施方案中，多个核碱基对在同一基因中。在一些实施方案中，一个或多个基因中的至少一个基因位于不同的基因座中。
在一些实施方案中，编辑是编辑至少一个蛋白质编码区、至少一个蛋白质非编码区或至少一个蛋白质编码区和至少一个蛋白质非编码区中的多个核碱基对。
在一些实施方案中，编辑与一个或多个指导多核苷酸结合。在一些实施方案中，碱基编辑器系统可以包含一个或多个碱基编辑器系统。在一些实施方案中，碱基编辑器系统可以包含一个或多个与单指导多核苷酸或多指导多核苷酸结合的碱基编辑器系统。在一些实施方案中，编辑与一个或多个指导多核苷酸和单个碱基编辑器系统结合。在一些实施方案中，编辑与至少一个不需要PAM序列以靶向结合靶多核苷酸序列的指导多核苷酸，或与至少一个需要PAM序列以靶向结合靶多核苷酸序列的指导多核苷酸，或与至少一个不需要PAM序列以靶向结合靶多核苷酸序列的指导多核苷酸和至少一个需要PAM序列以靶向结合靶多核苷酸序列的指导多核苷酸的混合体结合。应当理解，使用如本文所述的任何碱基编辑器的多重编辑的特征可以应用于使用本文提供的任何碱基编辑器的方法的任何组合。还应当理解，编辑可以包括多个核碱基对的连续编辑。
在一些实施方案中，能够对一个或多个基因中的多个核碱基对进行多重编辑的碱基编辑器系统包含ABE7、ABE8和/或ABE9碱基编辑器之一。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器之一的能够多重编辑的碱基编辑器系统相比，包含本文所述的ABE8碱基编辑器变体之一的能够多重编辑的碱基编辑器系统具有更高的多重编辑效率。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器之一的能够多重编辑的碱基编辑器系统相比，包含本文所述的ABE8碱基编辑器变体之一的能够多重编辑的碱基编辑器系统具有高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少310％、至少320％、至少330％、至少340％、至少350％、至少360％、至少370％、至少380％、至少390％、至少400％、至少450％或至少500％的多重编辑效率。在一些实施方案中，与包含ABE7碱基编辑器之一的能够多重编辑的碱基编辑器系统相比，包含本文所述的ABE8碱基编辑器变体之一的能够多重编辑的碱基编辑器系统具有高至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.1倍、至少3.2倍、至少3.3倍、至少3.4倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少5.5倍或至少6.0倍的多重编辑效率。
融合蛋白或多分子复合物在宿主细胞中的表达
包含腺苷脱氨酶变体的本发明的融合蛋白和多分子复合物可以使用技术人员已知的常规方法在几乎任何感兴趣的宿主细胞(包括但不限于细菌、酵母、真菌、昆虫、植物和动物细胞)中表达。例如，编码本发明的腺苷脱氨酶变体的DNA可以通过根据cDNA序列设计合适的CDS上游和下游引物来克隆。克隆的DNA可以直接，或在需要时经限制性酶消化后，或在添加合适的接头和/或核定位信号后，与编码碱基编辑系统的一个或多个另外的组分的DNA连接。碱基编辑系统在宿主细胞中翻译以形成复合物。
编码本文所述的蛋白结构域的DNA可以通过化学合成DNA，或通过利用PCR方法和Gibson组装方法连接合成的部分重叠的寡DNA短链来构建编码其全长的DNA获得。通过化学合成，或PCR方法或Gibson组装方法的组合构建全长DNA的优点是可以根据引入DNA的宿主将待使用的密码子设计成CDS全长。在异源DNA的表达中，通过将其DNA序列转化为宿主生物体中高频率使用的密码子，预计蛋白质表达水平会增加。例如，作为待使用的宿主中密码子使用频率的数据，可以使用Kazusa DNA Research Institute主页上公开的遗传密码使用频率数据库(kazusa.or.jp/codon/index.html)，或者可以参考显示每个宿主中密码子使用频率的文件。通过参考获得的数据和要引入的DNA序列，可以将用于DNA序列的密码子中在宿主中显示低使用频率的密码子转换为编码相同氨基酸并显示高使用频率的密码子。
可以例如通过将DNA连接到合适的表达载体中的启动子下游来产生含有编码核酸序列识别模块的DNA的表达载体和/或核酸碱基转化酶。
作为表达载体，来源于大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)；来源于枯草芽孢杆菌的质粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)；来源于酵母的质粒(例如，pSH19、pSH15)；昆虫细胞表达质粒(例如，pFast-Bac)；动物细胞表达质粒(例如，pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)；噬菌体，诸如λ噬菌体等；昆虫病毒载体，诸如杆状病毒等(例如，BmNPV、AcNPV)；动物病毒载体，诸如逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒等被使用。
关于待使用的启动子，可以使用适合用于基因表达的宿主的任何启动子。在使用双链断裂的常规方法中，因为宿主细胞的存活率有时会因毒性而显著降低，所以希望通过使用诱导性启动子在诱导开始时增加细胞数量。然而，因为通过表达本发明的核酸修饰酶复合物也可以提供足够的细胞增殖，所以可以不受限制地使用组成型启动子。
例如，当宿主是动物细胞时，可以使用SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMuLV)、LTR、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子等。其中，CMV启动子、SRα启动子等是优选的。
当宿主是大肠杆菌时，可以使用trp启动子、lac启动子、recA启动子、lamda.P.sub.L启动子、lpp启动子、T7启动子等。
当宿主属于芽孢杆菌属时，可以使用SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。
当宿主是酵母时，可以使用Gal1/10启动子、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。
当宿主是昆虫细胞时，可以使用多角体蛋白启动子、P10启动子等。
当宿主是植物细胞时，可以使用CaMV35S启动子、CaMV19S启动子、NOS启动子等。
本发明中使用的表达载体，除以上提及的以外还可以包括增强子、剪接信号、终止子、polyA添加信号、选择标志物(诸如耐药基因、营养缺陷型互补基因等)，可以施用复制起点等。
编码本文所述的蛋白质结构域的RNA可以通过例如体外转录编码本文公开的任何融合蛋白或多分子复合物的核酸序列来制备。
本发明的融合蛋白或多分子复合物可以通过将包含编码融合蛋白或多分子复合物的核酸序列的表达载体引入到细胞中而在细胞内表达。
感兴趣的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、真菌、昆虫、植物和动物细胞。例如，宿主细胞可以包含来自埃希氏菌属的细菌，诸如大肠杆菌K12.cndot.DH1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,160(1968)]、大肠杆菌JM103[Nucleic Acids Research,9,309(1981)]、大肠杆菌JA221[Journal of Molecular Biology,120,517(1978)]、大肠杆菌HB101[Journal of Molecular Biology,41,459(1969)]、大肠杆菌C600[Genetics,39,440(1954)]等。
宿主细胞可以包含来自芽孢杆菌属的细菌，例如枯草芽孢杆菌M1114[Gene,24,255(1983)]、枯草芽孢杆菌207-21[Journal of Biochemistry,95,87(1984)]等。
宿主细胞可以是酵母细胞。酵母细胞的实例包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AH22、AH22R.sup.-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913、NCYC2036、毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71等。
当病毒递送方法利用病毒AcNPV时，可以使用来源于甘蓝夜蛾幼虫的建立系的细胞(草地贪夜蛾细胞；Sf细胞)、来源于甘蓝尺蠖(Trichoplusia ni)中肠的MG1细胞、来源于甘蓝尺蠖卵巢的High FiveTM细胞、来源于大丽花夜盗蛾的细胞、来源于盐泽灯蛾(Estigmena acrea)的细胞等。当病毒是BmNPV时，使用来源于家蚕的建立系的细胞(家蚕N细胞；BmN细胞)等。例如，作为Sf细胞，Sf9细胞(ATCC CRL1711)、Sf21细胞[以上所有，体内,13，213-217(1977)]等被使用。
昆虫可以是任何昆虫，例如家蚕、果蝇、蟋蟀等的幼虫[Nature,315,592(1985)]。
本发明考虑的动物细胞包括但不限于细胞系，诸如猴COS-7细胞、猴Vero细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、dhfr基因缺陷型CHO细胞、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3细胞、人FL细胞等；多能干细胞诸如iPS细胞、来源于人和其他哺乳动物的ES细胞，以及从各种组织制备的原代培养细胞。此外，还可以使用斑马鱼胚胎、非洲爪蟾卵母细胞等。
本发明还考虑植物细胞。可以使用植物细胞，植物细胞包括但不限于由各种植物(例如，谷物诸如水稻、小麦、玉米等；产品作物诸如番茄、黄瓜、茄子等；园林植物诸如康乃馨、洋桔梗(Eustoma russellianum)等；以及其他植物诸如烟草、拟南芥(arabidopsisthaliana)等)制备的悬浮培养细胞、愈伤组织、原生质体、叶节、根段等。
上述所有宿主细胞可以是单倍体(一倍体)，或多倍体(例如，二倍体、三倍体、四倍体等)。使用常规方法，原则上，仅引入一条同源染色体的突变会产生异源细胞。因此，除非突变是显性的，否则不会表达所需表型。对于隐性突变，由于劳动和时间要求，获得纯合细胞可能不方便。相比之下，根据本发明，因为可以将突变引入基因组中同源染色体上的任何等位基因，所以即使在隐性突变的情况下也可以在单代中表达所需的表型，从而解决与常规诱变方法相关的问题。
表达载体可以根据宿主的种类通过已知方法(例如，溶菌酶法、感受态法、PEG法、CaCl2共沉淀法、电穿孔、显微注射、粒子枪法、脂质体转染、农杆菌介导的递送等)引入。
大肠杆菌可以根据描述于例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972),Gene,17,107(1982)中的方法进行转化。
可以根据描述于例如Molecular&General Genetics,168,111(1979)的方法将芽孢杆菌属引入载体中。
可以根据描述于例如Methods in Enzymology,194,182-187(1991),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)的方法将酵母引入载体中。
可以根据描述于例如Bio/Technology,6,47-55(1988)的方法将昆虫细胞和昆虫引入载体中。
可以根据描述于例如Cell Engineering附加卷8,New Cell EngineeringExperiment Protocol,263-267(1995)(由Shujunsha出版)，和Virology,52,456(1973)的方法将载体引入动物细胞。
包含载体的细胞可以根据宿主的种类按照已知的方法进行培养。例如，当培养大肠杆菌或芽孢杆菌属时，优选液体培养基作为用于培养的培养基。培养基优选地含有转化体生长必需的碳源、氮源、无机物等。碳源的实例包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等；氮源的实例包括无机物或有机物，诸如铵盐、硝酸盐、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、大豆饼、马铃薯提取物等；并且无机物的实例包括氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。培养基可以含有酵母提取物、维生素、生长促进因子等。培养基的pH值优选为约5至约8。
例如，作为用于培养大肠杆菌的培养基，优选含有葡萄糖、酪蛋白氨基酸的M9培养基[Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433,Cold Spring HarborLaboratory,New York 1972]。例如，在有需要的情况下，可以将试剂诸如3β-吲哚基丙烯酸添加到培养基中以确保启动子的有效功能。通常将大肠杆菌在约15℃至约43℃下培养。必要时可以进行曝气和搅拌。
通常将芽孢杆菌属在约30℃至约40℃下培养。必要时可以进行曝气和搅拌。
用于培养酵母的培养基的实例包括伯克霍尔德(Burkholder)基本培养基[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4505(1980)]、含有0.5％酪蛋白氨基酸的SD培养基[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,5330(1984)]等。培养基的pH优选为约5至约8。培养通常在约20℃至约35℃下进行。必要时可以进行曝气和搅拌。
例如，作为用于培养昆虫细胞或昆虫的培养基，含有适当的诸如灭活的10％牛血清等的添加剂等的格雷斯(Grace's)昆虫培养基[Nature,195,788(1962)]被使用。培养基的pH优选为约6.2至约6.4。培养通常在约27℃下进行。必要时可以进行曝气和搅拌。
例如，作为用于培养动物细胞的培养基，含有约5至约20％胎牛血清的最低基本培养基(MEM)[Science,122,501(1952)]、杜比柯(Dulbecco)改良Eagle培养基(DMEM)[Virology,8,396(1959)]、RPMI 1640培养基[The Journal of the American MedicalAssociation,199,519(1967)]、199培养基[Proceeding of the Society for theBiological Medicine,73,1(1950)]等被使用。培养基的pH优选为约6至约8。培养通常在约30℃至约40℃下进行。必要时可以进行曝气和搅拌。
例如，作为用于培养植物细胞的培养基，MS培养基、LS培养基、B5培养基等被使用。培养基的pH优选为约5至约8。培养通常在约20℃至约30℃下进行。必要时可以进行曝气和搅拌。
当高等真核细胞诸如动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等用作宿主细胞时，在诱导型启动子(例如，金属硫蛋白启动子(由重金属离子诱导)、热休克蛋白启动子(由热休克诱导)、Tet-ON/Tet-OFF系统启动子(由添加或去除四环素或其衍生物诱导)、类固醇响应型启动子(由类固醇激素或其衍生物诱导)等)的调节下将编码本发明的碱基编辑系统(例如，包括腺苷脱氨酶变体)的DNA引入宿主细胞中,在适当的阶段将诱导物质添加到培养基(或从培养基移除)以诱导核酸修饰酶复合物的表达，培养给定的时间以进行碱基编辑并将突变引入靶基因，可以实现碱基编辑系统的瞬时表达。
原核细胞诸如大肠杆菌等的可以利用诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于lac启动子(由IPTG诱导)、cspA启动子(由冷休克诱导)、araBAD启动子(由阿拉伯糖诱导)等。
或者，当高等真核细胞诸如动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等用作宿主细胞时，上述诱导型启动子也可以用作载体去除机制。即，载体装配有在宿主细胞中起作用的复制起点，和编码编码由上述诱导型启动子调节的蛋白质的核酸表达的复制所必需的蛋白质的核酸(例如，动物细胞的SV40和大T抗原、oriP和EBNA-1等)。因此，虽然载体在诱导物质存在的情况下可以自主复制，但当除去诱导物质时，不能进行自主复制，并且载体随着细胞分裂自然脱落(通过添加Tet-OFF系统载体中的四环素和强力霉素不能进行自主复制)。
递送系统
如本文所述评估核碱基编辑器靶向基因中的一个或多个核苷酸的适用性。在一个实施方案中，用编码本文所述的碱基编辑系统的一个或多个核酸分子连同少量编码报告基因(例如，GFP)的载体来转染、转导或以其他方式修饰单个感兴趣的细胞。这些细胞可以是本领域已知的任何细胞系。或者，可以使用原代细胞(例如，人)。细胞也可以是从受试者或个体，诸如从组织活检物、手术、血液、血浆、血清或其他生物流体中获得。此类细胞可能与最终的细胞靶标有关。
可以使用病毒载体进行递送。在一个实施方案中，可以使用脂质体转染(诸如脂质转染胺或Fugene)或通过电穿孔进行转染。转染后，报告基因(例如，GFP)的表达可以通过荧光显微镜或流式细胞术来确定，以确认一致和高水平的转染。这些初步转染可以包括不同的核碱基编辑器，以确定哪些编辑器组合具有最大活性。所述系统可以包括一种或多种不同的载体。在一个实施方案中，碱基编辑器被密码子优化以表达所需的细胞类型，优先真核细胞，优选哺乳动物细胞或人细胞。
如本文所述评估核碱基编辑器的活性，即通过对细胞基因组进行测序以检测靶序列中的改变。对于Sanger测序，将纯化的PCR扩增子克隆到质粒骨架中，转化、小规模制备并用单一引物进行测序。也可以使用下一代测序(NGS)技术进行测序。使用下一代测序时，扩增子可能为300-500bp，预期的切口位点不对称放置。在PCR之后，可以将下一代测序衔接子和条形码(例如，Illumina多重衔接子和索引)添加到扩增子的末端，例如用于高通量测序(例如，在Illumina MiSeq上)。可以选择在初始测试中诱导最大水平的靶特异性改变的融合蛋白或多分子复合物用于进一步评估。
在特定实施方案中，核碱基编辑器用于靶向感兴趣的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明的核碱基编辑器与一个或多个指导RNA一起被递送至细胞，所述指导RNA用于靶向细胞基因组内的一个或多个感兴趣的核酸序列，从而改变一个或多个靶基因。在一些实施方案中，碱基编辑器被一个或多个指导RNA靶向以将一种或多种编辑引入到一个或多个感兴趣的基因。在一些实施方案中，对一个或多个感兴趣的基因的序列的一种或多种编辑降低或消除宿主细胞中由所述基因编码的蛋白质的表达。在一些实施方案中，由一个或多个感兴趣的基因编码的一种或多种蛋白质的表达在宿主细胞中被完全敲除或消除。
在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人细胞。
碱基编辑器系统基于核酸的递送
可以将编码根据本发明的碱基编辑器系统的核酸分子通过本领域已知的方法或如本文所述的方法体外或体内施用于受试者或递送到细胞中。例如，可以通过载体(例如，病毒或非病毒载体)，或通过裸DNA、DNA复合物、脂质纳米颗粒或前述组分的组合递送包含脱氨酶(例如，胞苷或腺嘌呤脱氨酶)的碱基编辑器系统。
纳米颗粒(可以是有机或无机的)可以用于递送碱基编辑器系统或其组分。纳米粒子在本领域中是众所周知的，并且任何合适的纳米粒子都可以用于递送碱基编辑器系统或其组分，或编码这些组分的核酸分子。在一个实施例中，有机(例如，脂质和/或聚合物)纳米颗粒在本公开的某些实施方案中适合用作递送载体。用于纳米颗粒制剂和/或基因转移的示例性脂质，示于表16(下文)中。
表16
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表17列出了用于基因转移和/或纳米颗粒制剂的示例性聚合物。
表17
表18总结了编码本文所述的融合蛋白或多分子复合物的多核苷酸的递送方法。
表18
在另一个方面，碱基编辑系统组分或编码此类组分的核酸(例如，多核苷酸可编程核苷酸结合结构域(例如，Cas9)，例如像Cas9或其变体，以及靶向感兴趣的核酸序列的gRNA)的递送，可以通过向细胞递送核糖核蛋白(RNP)来完成。RNP包含与靶向gRNA复合的多核苷酸可编程核苷酸结合结构域(例如，Cas9)。本文所述的RNP或多核苷酸可以使用已知方法(诸如电穿孔、核转染或阳离子脂质介导的方法)递送至细胞，例如，如Zuris,J.A.等人,2015,Nat.Biotechnology,33(1):73-80所报道，其以引用方式整体并入本文。RNP有利于在CRISPR碱基编辑系统中使用，特别是对于难以转染的细胞，诸如原代细胞。此外，RNP还可以缓解细胞中蛋白质表达可能出现的困难，尤其是当可以用于CRISPR质粒的真核启动子(例如，CMV或EF1A)未良好表达时。有利地，RNP的使用不需要将外源DNA递送到细胞中。此外，因为包含核酸结合蛋白和gRNA复合物的RNP会随着时间降解，所以RNP的使用有可能限制脱靶效应。以类似于基于质粒的技术的方式，RNP可以用于递送结合蛋白(例如，Cas9变体)和指导同源定向修复(HDR)。
例如，编码碱基编辑器系统的核酸分子作为裸DNA或RNA，通过转染或电穿孔的方式可以直接递送至细胞，或者可以与促进靶细胞摄取的分子(例如，N-乙酰半乳糖胺)缀合。也可以使用编码碱基编辑器系统和/或它们的组分的载体。在特定实施方案中，多核苷酸(例如，编码碱基编辑器系统或其功能组分的mRNA)可以与一种或多种如本文所述的指导RNA共电穿孔。
核酸载体可以包含一个或多个编码本文所述的融合蛋白或多分子复合物的结构域的序列。载体还可以编码与核定位信号、核仁定位信号或线粒体定位信号可操作连接的碱基编辑器系统的蛋白质组分。例如，载体可以包含Cas9编码序列，其包括一种或多种核定位序列(例如，来自SV40的核定位序列)和一种或多种脱氨酶。
载体还可以包含任何合适数量的调节/控制元件，例如启动子、增强子、内含肽、聚腺苷酸化信号、Kozak共有序列或内部核糖体进入位点(IRES)。这些元件在本领域中是众所周知的。
根据本公开的载体包括重组病毒载体。示例性病毒载体如上文所说明。也可以使用本领域已知的其他病毒载体。此外，病毒颗粒可以用于以核酸和/或蛋白质形式递送碱基编辑器系统组分。例如，可以组装“空”病毒颗粒以含有碱基编辑器系统或组分作为货物。病毒载体和病毒颗粒也可以被工程化以掺入靶向配体来改变靶组织特异性。
本文所述的载体可以包括驱动碱基编辑器系统或其组件的表达的调节元件。这种载体包括具有反向长末端重复序列的腺相关病毒(AAV ITR)。使用AAV-ITR可以有利于消除对会占用载体中的空间的另外的启动子元件的需要。释放的另外的空间可以用于驱动另外的元件(诸如指导核酸或选择性标志物)的表达。ITR活性可以用于降低由于过度表达而导致的可能毒性。
可以使用任何合适的启动子来驱动碱基编辑系统或其组分以及(在适当情况下)指导核酸的表达。对于普遍表达，启动子包括CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、铁蛋白重链或轻链。对于脑或其他CNS细胞表达，合适的启动子包括：所有神经元的SynapsinI、兴奋性神经元的CaMKIIα、GABA能神经元的GAD67或GAD65或VGAT。对于肝细胞表达，合适的启动子包括白蛋白启动子。对于肺细胞表达，合适的启动子包括SP-B。对于内皮细胞，合适的启动子包括ICAM。对于造血细胞表达，合适的启动子包括IFNβ或CD45。对于成骨细胞表达，合适的启动子可以包括OG-2。
在一些实施方案中，本公开的碱基编辑器系统具有足够小的尺寸以允许单独的启动子驱动碱基编辑器和相容的指导核酸在相同核酸分子内的表达。例如，载体或病毒载体可以包含与编码碱基编辑器的核酸可操作地连接的第一启动子和与指导核酸可操作地连接的第二启动子。
用于驱动指导核酸表达的启动子可以包括：Pol III启动子，诸如使用Pol II启动子和内含肽盒表达gRNA腺相关病毒(AAV)的U6或H1。
在特定实施方案中，本发明的融合蛋白或多分子复合物由存在于病毒载体(例如，腺相关病毒(AAV)、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAV10及其变体)或任何病毒载体的合适衣壳蛋白中的多核苷酸编码。因此，在一些方面，本公开涉及融合蛋白或多分子复合物的病毒递送。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体(例如，莫洛尼(Maloney)鼠白血病病毒，MML-V)、腺病毒载体(例如，AD100)、慢病毒载体(基于HIV和FIV的载体)、疱疹病毒载体(例如，HSV-2)。
在一些方面，本文所述的用于编辑细胞中特定基因的方法可以用于遗传修饰细胞。
病毒载体
因此，本文所述的碱基编辑器可以与病毒载体一起递送。在一些实施方案中，本文公开的碱基编辑器可以在包含在病毒载体中的核酸上编码。在一些实施方案中，碱基编辑器系统的一个或多个组分可以在一个或多个病毒载体上编码。例如，碱基编辑器和指导核酸可以在单个病毒载体上编码。在其他实施方案中，碱基编辑器和指导核酸在不同的病毒载体上编码。在任一情况下，碱基编辑器和指导核酸可以各自可操作地连接到启动子和终止子。在病毒载体上编码的组分的组合可以通过所选病毒载体的货物大小限制来确定。
使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送碱基编辑器利用了使病毒靶向培养或宿主中的特定细胞，并将病毒有效载荷运输到核或宿主细胞基因组的高度进化过程。病毒载体可以直接向培养、患者中的细胞施用(体内)，或病毒载体可以用于体外处理细胞，并且修饰的细胞可以任选地向患者施用(离体)。基于病毒的常规系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关和单纯疱疹病毒载体。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法使宿主基因组中的整合成为可能，常常导致插入的转基因长期表达。此外，已在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
病毒载体可以包括慢病毒(例如，基于HIV和FIV的载体)、腺病毒(例如，AD100)、逆转录病毒(例如，莫洛尼鼠白血病病毒、MML-V)、疱疹病毒载体(例如，HSV-2)和腺相关病毒(AAV)或其他质粒或病毒载体类型，特别是使用来自例如美国专利号8,454,972(腺病毒的配方、剂量)、美国专利号8,404,658(AAV的配方、剂量)和美国专利号5,846,946(DNA质粒的配方、剂量)以及来自涉及慢病毒、AAV和腺病毒的临床试验相关临床试验和出版物的配方和剂量。例如，对于AAV，施用途径、配方和剂量可以如美国专利号8,454,972和涉及AAV的临床试验中那样。对于腺病毒，施用途径、配方和剂量可以如美国专利号8,404,658和涉及腺病毒的临床试验中那样。对于质粒递送，施用途径、配方和剂量可以如美国专利号5,846,946和涉及质粒的临床研究中那样。剂量可以基于或外推到平均70kg的个体(例如，男性成年人类)，并且可以针对不同体重和物种的患者、受试者、哺乳动物进行调整。施用频率在医疗或兽医从业者(例如，医生、兽医)的权力范围内，取决于通常的因素，包括患者或受试者的年龄、性别、一般健康状况、其他疾患以及所解决的特定疾患或症状。病毒载体可以注射到感兴趣的组织中。对于细胞类型特异性碱基编辑，碱基编辑器和任选的指导核酸的表达可以由细胞类型特异性启动子驱动。
逆转录病毒的趋向性可通过掺入外来包膜蛋白质、扩增靶细胞的潜在靶群体来改变。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒效价的逆转录病毒载体。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择将取决于靶组织。逆转录病毒载体包含封装能力高达6-10kb外来序列的顺式作用长末端重复序列。最小顺式作用LTR就足以用于载体的复制和封装，其接着用于将治疗基因整合至靶细胞中以提供持久的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些(参见例如，Buchscher等人,J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等人,J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommnerfelt等人,Virol.176:58-59(1990)；Wilson等人,J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等人,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。
逆转录病毒载体，尤其是慢病毒载体，可能需要小于给定长度的多核苷酸序列以有效整合到靶细胞中。例如，与较小尺寸的逆转录病毒载体相比，长度大于9kb的逆转录病毒载体会导致低病毒滴度。在一些方面，本公开的碱基编辑器具有足够的大小，以便能够通过逆转录病毒载体有效地封装和递送到靶细胞中。在一些实施方案中，碱基编辑器的大小使得即使在与指导核酸和/或可靶向核酸酶系统的其他组分一起表达时也允许有效封装和递送。
封装细胞通常用于形成能够感染宿主细胞的病毒粒子。这种细胞包括封装腺病毒的293细胞，以及封装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。用于基因疗法的病毒载体通常由生产细胞系产生，所述细胞系将核酸载体封装至病毒颗粒中。载体通常含有封装并随后整合至宿主中所需要的最小病毒序列，其他病毒序列由待表达的一个或多个多核苷酸的表达盒替换。缺失的病毒功能通常由封装细胞系以反式提供。例如，用于基因疗法的腺相关病毒(“AAV”)载体通常只具有来自AAV基因组的ITR序列，所述序列为封装并整合至宿主基因组中所需要。病毒DNA可以封装于细胞系中，其含有编码其他AAV基因，即rep和cap的辅助质粒，但是缺少ITR序列。细胞系也可以作为辅助感染腺病毒。辅助病毒可以促进AAV载体的复制以及AAV基因从辅助质粒的表达。在一些情况下，由于缺乏ITR序列，辅助质粒未大量封装。以腺病毒的污染可通过例如热处理来减少，与AAV相比，腺病毒对于热处理更敏感。
在优选瞬时表达的应用中，可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率且不需要细胞分裂。用所述载体已获得高效价和表达水平。此载体可在相对简单的系统中大量产生。腺相关病毒(“AAV”)载体还可以用于向细胞转导靶核酸，例如，在体外产生核酸和肽，和体内和离体基因治疗程序中(参见，例如，West等人,Virology 160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin,HumanGene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994))。许多出版物中描述了重组AAV载体的构建，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat和Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984)；以及Samulski等人,J.Virol.63:03822-3828(1989)。
AAV是一种小型的单链DNA依赖性病毒，属于细小病毒科。4.7kb野生型(wt)AAV基因组由两个基因组成，这两个基因分别编码四种复制蛋白和三种衣壳蛋白，并且任一端上侧接有145-bp反向末端重复序列(ITR)。病毒体由三种衣壳蛋白Vp1、Vp2和Vp3组成，所述衣壳蛋白以1:1:10的比率从相同开放阅读框产生，但从差异剪接(Vp1)和替代翻译起始位点(分别Vp2和Vp3)产生。Vp3是病毒粒子中最丰富的亚基，并且参与细胞表面的受体识别，从而定义了病毒的趋向性。已在Vp1的独特N端鉴定了一个在病毒感染中起作用的磷脂酶结构域。
与wt AAV类似，重组AAV(rAAV)利用顺式作用的145-bp ITR来侧接载体转基因盒，提供高达4.5kb的外源DNA封装。感染后，rAAV可以表达本发明的融合蛋白或多分子复合物，并且通过以环状头对尾多联体形式附加存在以继续存在而不整合到宿主基因组中。尽管在体外和体内使用此系统的rAAV成功的实例很多，但当基因编码序列的长度等于或大于wtAAV基因组的尺寸时，有限封装容量限制了AAV介导的根因递送的使用。
可以基于应用选择病毒载体。例如，对于体内基因递送，AAV可能优于其他病毒载体。在一些实施方案中，AAV允许低毒性，这可能是由于纯化方法不需要可以活化激活免疫反应的细胞颗粒超离心。在一些实施方案中，AAV允许引起插入诱变的低可能性，因为它不整合到宿主基因组中。腺病毒通常用作疫苗，因为它们引起强烈的免疫原性反应。病毒载体的封装容量可以限制可以封装到载体中的碱基编辑器的大小。
AAV的封装容量约为4.5Kb或4.75Kb，包括两个145个碱基的反向末端重复序列(ITR)。这意味着公开的碱基编辑器以及启动子和转录终止子可以装配到单个病毒载体中。大于4.5或4.75Kb的构建体可以导致病毒产量显著降低。例如，SpCas9相当大，基因本身超过4.1Kb，使得其很难包装到AAV中。因此，本公开的实施方案包括使用长度比常规碱基编辑器短的公开的碱基编辑器。在一些实例中，碱基编辑器小于4kb。公开的碱基编辑器可以小于4.5kb、4.4kb、4.3kb、4.2kb、4.1kb、4kb、3.9kb、3.8kb、3.7kb、3.6kb、3.5kb、3.4kb、3.3kb、3.2kb、3.1kb、3kb、2.9kb、2.8kb、2.7kb、2.6kb、2.5kb、2kb或1.5kb。在一些实施方案中，公开的碱基编辑器的长度为4.5kb或更小。
AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5或其任何组合。可以根据要靶向的细胞选择AAV的类型；例如，可以选择AAV血清型1、2、5或杂交衣壳AAV1、AAV2、AAV5或其任意组合用于靶向脑或神经元细胞；并且可以选择AAV4用于靶向心脏组织。AAV8可以用于递送至肝脏。关于这些细胞的某些AAV血清型的列表可以见于Grimm,D.等人,J.Virol.82:5887-5911(2008)。
在一些实施方案中，慢病毒载体用于用编码碱基编辑器系统的多核苷酸转导感兴趣的细胞。慢病毒是复杂的逆转录病毒，其具有在有丝分裂和有丝分裂后细胞中感染和表达其基因的能力。最常见的慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)，其使用其他病毒的包膜糖蛋白靶向广泛的细胞类型。
慢病毒可以如下制备。克隆pCasES10(含有慢病毒转移质粒骨架)后，低通路(p＝5)的HEK293FT在具有10％胎牛血清并且没有抗生素的DMEM中进行转染的前一天被接种到T-75烧瓶中至50％汇合度。20小时后，将培养基更换为OptiMEM(无血清)培养基，并且在4小时后进行转染。用10μg慢病毒转移质粒(pCasES10)和以下封装质粒转染细胞：5μg的pMD2.G(VSV-g假型)和7.5μg的psPAX2(gag/pol/rev/tat)。可以在4mL OptiMEM中使用阳离子脂质递送剂(50μl脂质转染胺2000和100μl Plus试剂)进行转染。6小时后，将培养基更换为具有10％胎牛血清的无抗生素DMEM。这些方法在细胞培养中使用血清，但优选无血清方法。
慢病毒可以如下纯化。48小时后收获病毒上清液。首先清除上清液中的碎片并通过0.45μm低蛋白结合(PVDF)过滤器过滤。然后将它们在超速离心机中以24,000rpm的速度旋转2小时。病毒颗粒在4℃下在50μl的DMEM中重悬过夜。然后将它们等分并立即在-80℃下冷冻。
在另一个实施方案中，还考虑了基于马传染性贫血病毒(EIAV)的最小非灵长类慢病毒载体。在另一个实施方案中，是一种基于马传染性贫血病毒的表达血管抑制蛋白内皮抑素和血管抑素的慢病毒基因治疗载体，其预期通过视网膜下注射递送。在另一个实施方案中，考虑使用自灭活慢病毒载体。
系统的任何RNA，例如指导RNA或碱基编辑器编码mRNA，都可以以RNA的形式递送。可以使用体外转录生成碱基编辑器编码mRNA。例如，可以使用含有以下元件的PCR盒合成核酸酶mRNA，所述PCR盒含有以下元件：T7启动子、任选的kozak序列(GCCACC)、核酸酶序列和3'UTR，诸如来自β珠蛋白-polyA尾的3'UTR。所述盒可以用于T7聚合酶的转录。指导多核苷酸(例如，gRNA)也可以使用体外转录从含有T7启动子的盒中转录，随后是序列“GG”和指导多核苷酸序列。
为了增强表达并降低可能的毒性，碱基编辑器编码序列和/或指导核酸可以被修饰以包含一个或多个修饰的核苷，例如使用伪-U或5-甲基-C。
AAV载体的小型封装能力使得许多超过这个大小的基因的递送和/或使用大型生理调节元件具有挑战性。例如，可以通过将待递送的一个或多个蛋白质分裂成两个或多个片段来解决这些挑战，其中N端片段与分裂的内含肽-N融合，C端片段与分裂的内含肽-C融合。然后将这些片段封装到两个或更多个AAV载体中。如本文所用，“内含肽”是指连接侧翼N端和C端外显肽(例如，待连接的片段)的自剪接蛋白内含肽(例如，肽)。用于连接异源蛋白质片段的某些内含肽的用途描述于例如Wood等人,J.Biol.Chem.289(21)；14512-9(2014)。例如，当融合以分离蛋白质片段时，内含肽IntN和IntC相互识别，将自身剪接并同时连接它们所融合的蛋白质片段的侧翼N端和C端外显肽，从而由两个蛋白质片段重构全长蛋白质。其他合适的内含肽对于本领域技术人员将是显而易见的。
本发明的融合蛋白片段的长度可以不同。在一些实施方案中，蛋白质片段的长度范围为2个氨基酸至约1000个氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质片段的长度范围为约5个氨基酸至约500个氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质片段的长度范围为约20个氨基酸至约200个氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质片段的长度范围为约10个氨基酸至约100个氨基酸。其他长度的合适蛋白质片段对于本领域技术人员将是显而易见的。
在一个实施方案中，双AAV载体是通过将一个大的转基因表达盒分裂成单独的两半(5'和3'末端，或头部和尾部)来产生的，其中所述盒的每一半被封装在单个AAV载体中(＜5KB)。然后两个双AAV载体共感染同一细胞后，实现全长转基因表达盒的重新组装，之后进行：(1)5'和3'基因组之间的同源重组(HR)(双AAV重叠载体)；(2)ITR介导的5'和3'基因组的尾对头串联(双AAV反式剪接载体)；或(3)这两种机制的组合(双AAV杂交载体)。体内使用双AAV载体导致全长蛋白质的表达。双AAV载体平台的使用表示了针对尺寸>4.7kb的转基因的有效且可行的基因转移策略。
内含肽
内含肽(插入蛋白)是存在于多种不同生物体中的自动加工结构域，它们执行称为蛋白质剪接的过程。蛋白质剪接是一个多步骤的生物化学反应，包括肽键的切割和形成。虽然蛋白质剪接的内源性底物是存在于含有内含肽的生物体中的蛋白质，但内含肽也可以用于化学处理几乎任何多肽骨架。
在蛋白质剪接中，内含肽通过切割两个肽键将自身从前体多肽中切除，从而通过形成新的肽键连接侧翼外显肽(外部蛋白质)序列。这种重排发生在翻译后(或可能是共翻译)。内含肽介导的蛋白质剪接自发发生，只需要折叠内含肽结构域。
约5％的内含肽是分裂的内含肽，它们被转录和翻译为两个单独的多肽，即N-内含肽和C-内含肽，每一个都与一个外显肽融合。翻译后，内含肽片段自发地且非共价地组装成规范的内含肽结构，以进行蛋白质反式剪接。蛋白质剪接的机制需要一系列酰基转移反应，所述反应导致内含肽-外显肽连接处的两个肽键断裂，并在N-外显肽和C-外显肽之间形成新的肽键。这个过程是通过激活连接N-外显肽和外显肽的N端的肽键来启动的。几乎所有内含肽在其N端都具有半胱氨酸或丝氨酸，它们攻击C端N-外显肽残基的羰基碳。保守的苏氨酸和组氨酸(称为TXXH基序(SEQ ID NO:385))以及常见的天冬氨酸促进了这一N到O/S酰基转变，这导致形成线性(硫)酯中间体。接下来，此中间体通过第一个C-外显肽残基(+1)的亲核攻击进行反式(硫)酯化，所述残基是半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸。所得支链(硫)酯中间体通过独特的转化被分解：内含肽高度保守的C端天冬酰胺环化。此过程由组氨酸(存在于高度保守的HNF基序中)和倒数第二个组氨酸促进，并且还可能涉及天冬氨酸。这种琥珀酰亚胺形成反应从反应性复合物中切除内含肽，并留下通过非肽键连接的外含肽。这种结构以内含肽非依赖性的方式迅速重排成稳定的肽键。
内含肽的非限制性实例包括本领域已知的任何内含肽或内含肽对，其包括基于dnaE内含肽的合成内含肽、Cfa-N(例如，分裂内含肽-N)和Cfa-C(例如，分裂内含肽-C)内含肽对，其已被描述(例如，在tevens等人,J Am Chem Soc.2016年2月24日；138(7):2162-5中，以引用方式并入本文)；以及DnaE。可根据本公开使用的内含肽对的非限制性实例包括：Cfa DnaE内含肽、Ssp GyrB内含肽、Ssp DnaX内含肽、Ter DnaE3内含肽、Ter ThyX内含肽、Rma DnaB内含肽和Cne Prp8内含肽(例如，如美国专利号8,394,604中所述，其以引用方式并入本文)。内含肽的示例性核苷酸和氨基酸序列在序列表中提供为SEQ ID NO:401-408。
内含肽-N和内含肽-C可以分别融合至分裂Cas9的N端部分和分裂Cas9的C端部分，用于连接分裂Cas9的N端部分和分裂Cas9的C端部分。例如，在一些实施方案中，内含肽-N融合至分裂Cas9的N端部分的C端，即形成结构N--[分裂Cas9的N端部分]-[内含肽-N]--C。在一些实施方案中，内含肽-C融合至分裂Cas9的C端部分的N端，即形成结构N-[内含肽-C]--[分裂Cas9的C端部分]-C。用于连接内含肽所融合的蛋白质(例如，分裂Cas9)的内含肽介导的蛋白质剪接的机制是本领域已知的，例如，如Shah等人,Chem Sci.2014；5(1):446-461中所述，其以引用方式并入本文。用于设计和使用内含肽的方法是本领域已知的，并且例如由WO2014004336、WO2017132580、US20150344549和US20180127780所描述，其各自以引用方式整体并入本文。
在一些实施方案中，核酸酶(例如，Cas9)的部分或片段与内含肽融合。核酸酶可以融合到内含肽的N端或C端。在一些实施方案中，融合蛋白的部分或片段与内含肽融合并与AAV衣壳蛋白融合。内含肽、核酸酶和衣壳蛋白可以以任何排列(例如，核酸酶-内含肽-衣壳、内含肽-核酸酶-衣壳、衣壳-内含肽-核酸酶等)融合在一起。在一些实施方案中，碱基编辑器(例如，ABE、CBE)的N端片段与分裂的内含肽-N融合，并且C端片段与分裂的内含肽-C融合。然后将这些片段包装成两个或更多个AAV载体。在一些实施方案中，内含肽的N端与融合蛋白的C端融合，并且内含肽的C端与AAV衣壳蛋白的N端融合。
在一个实施方案中，内含肽用于连接移植到AAV衣壳蛋白上的腺苷脱氨酶碱基编辑器变体蛋白的片段或部分。用于连接异源蛋白质片段的某些内含肽的用途描述于例如Wood等人,J.Biol.Chem.289(21)；14512-9(2014)。例如，当融合以分离蛋白质片段时，内含肽IntN和IntC相互识别，将自身剪接并同时连接它们所融合的蛋白质片段的侧翼N端和C端外显肽，从而由两个蛋白质片段重构全长蛋白质。其他合适的内含肽对于本领域技术人员将是显而易见的。
在一些实施方案中，ABE在SpCas9的选定区域内的Ala、Ser、Thr或Cys残基处分裂成N端子和C端片段。这些区域对应于Cas9晶体结构分析鉴定的环区域。
在氨基酸位置S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S577、A589和S590处，每个片段的N端与内含肽-N融合，并且每个片段的C端与内含肽-C融合，在下面的序列(称为“Cas9参考序列”)中用大写字母表示。
具有腺嘌呤脱氨酶活性和胞嘧啶脱氨酶活性的腺苷脱氨酶碱基编辑器变体的应用
本文提供的腺苷脱氨酶碱基编辑器变体可以用于靶向感兴趣的多核苷酸以产生修饰蛋白质表达的改变。在一个实施方案中，腺苷脱氨酶碱基编辑器变体用于修饰非编码或调节序列，包括但不限于剪接位点、增强子和转录调节元件。然后使用本领域已知的任何方法测定改变对受调节元件控制的基因表达的影响。在一个特定实施方案中，腺苷脱氨酶碱基编辑器变体能够显著改变调节序列，从而消除其调节基因表达的能力。有利的是，与其他RNA可编程核酸酶相比，这可以在基因组靶序列中不生成双链断裂的情况下完成。
腺苷脱氨酶碱基编辑器变体可以用于靶向感兴趣的多核苷酸以产生修饰蛋白质活性的改变。例如，在诱变的背景下，多效应子核碱基编辑器比易错PCR和其他基于聚合酶的方法具有许多优势。因为本发明的腺苷脱氨酶碱基编辑器变体在靶区域的多个碱基处产生改变，此类突变相对于由易错PCR引入的突变更有可能在蛋白质水平表达，考虑到密码子中的单个核苷酸变化仍可能编码相同的氨基酸(例如，由于密码子简并性)，所述易错PCR引入的突变不太可能在蛋白质水平表达。与诱导整个多核苷酸的随机改变的易错PCR不同，本发明的腺苷脱氨酶碱基编辑器变体可以用于靶向感兴趣蛋白质的小区域或限定区域内的特定氨基酸。
在其他实施方案中，本发明的腺苷脱氨酶碱基编辑器变体用于靶向生物体基因组内感兴趣的多核苷酸。在一个实施方案中，生物体是微生物组的细菌(例如，拟杆菌门(Bacteriodetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)；γ变形菌门(Gammaproteobacteria)、α变形菌门(Alphaproteobacteria)、拟杆菌门、梭菌纲(Clostridia)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)；肠杆菌目(Enterobacteriales)、拟杆菌目(Bacteriodales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、梭菌目(Clostridiales)、丹毒丝菌目(Erysiopelotrichales)、乳杆菌目(Lactobacillales)；肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、丹毒丝菌科(Erysiopelotrichaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)和产碱杆菌科(Alcaligenaceae)；埃希氏菌属(Escherichia)、拟杆菌属(Bacteroides)、另枝杆菌属(Alistipes)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus))。在另一个实施方案中，生物体是农业上重要的动物(例如，牛、绵羊、山羊、马、鸡、火鸡)或植物(例如，大豆、小麦、玉米、水稻、烟草、苹果、葡萄、桃子、李子、樱桃)。在一个实施方案中，本发明的腺苷脱氨酶碱基编辑器变体与用于靶向细胞基因组内的多种序列的指导RNA文库一起递送至细胞，从而系统地改变整个基因组中的序列。在一个实施方案中，本发明的腺苷脱氨酶碱基编辑器变体与用于靶向细胞基因组内的多种序列的指导RNA文库一起递送至细胞，从而系统地改变整个基因组中的序列。
可以在多种蛋白质中的任何一种中进行突变以促进结构功能分析或改变蛋白质的内源活性。突变可以例如在酶(例如，激酶、磷酸酶、羧化酶、磷酸二酯酶)中或在酶底物中、在受体中或其配体中以及在抗体及其抗原中进行。在一个实施方案中，腺苷脱氨酶碱基编辑器变体靶向编码酶的活性位点、受体的配体结合位点或抗体或抗原结合分子的互补决定区(CDR)的核酸分子。就酶而言，在活性位点处诱导突变可以增加、减少或消除酶的活性。突变对酶的影响通过进行酶活性测定来表征，所述测定包括本领域已知的和/或对本领域技术人员显而易见的多种测定中的任一种。就受体而言，配体结合位点处发生的突变可以增加、减少或消除受体对其配体的亲和力。此类突变的影响通常在受体/配体结合测定中进行测定，所述测定包括本领域已知的和/或对本领域技术人员显而易见的任何数量的测定。就抗体CDR而言，CDR内发生的突变可能会增加、减少或消除与同源抗原的结合。或者，CDR内发生的突变可以改变抗体或抗原结合分子对抗原的特异性。然后例如通过测量CDR与其抗原的特异性结合或以对本领域技术人员显而易见且在相关领域中通常使用的任何其他类型的免疫测定来测定这些改变对CDR功能的影响。
药物组合物
在一些方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述的任何遗传修饰细胞、碱基编辑器、融合蛋白、多分子复合物或融合蛋白-指导多核苷酸复合物。
本发明的药物组合物可以根据已知技术制备。参见，例如，Remington,TheScience And Practice of Pharmacy(第21版2005)。通常，细胞或其群体在施用或储存之前与合适的载剂混合，并且在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载剂。合适的药学上可接受的载剂通常包括惰性物质，所述惰性物质有助于将药物组合物施用于受试者，有助于将药物组合物加工成可递送的制剂，或有助于在施用前储存药物组合物。药学上可接受的载剂可以包括可以稳定、优化或以其他方式改变制剂的形式、稠度、粘度、pH、药代动力学、溶解度的剂。这样的试剂包括缓冲剂、润湿剂、乳化剂、稀释剂、包封剂和皮肤渗透促进剂。例如，载剂可以包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、精氨酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨醇、葡聚糖、羧甲基纤维素钠及其组合。
可以用作药学上可接受的载剂的物质的一些非限制性实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，诸如硬脂酸镁、月桂基磺酸钠和滑石；(8)赋形剂，诸如可可油和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)不含热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液(Ringer'ssolution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)填充剂，诸如多肽和氨基酸；(23)血清醇，诸如乙醇；以及(24)药物制剂中采用的其他无毒相容物质。制剂中还可以存在润湿剂、着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
药物组合物可以包含一种或多种pH缓冲化合物以将制剂的pH保持在反映生理pH的预定水平，诸如在约5.0至约8.0的范围内。用于水性液体制剂的pH缓冲化合物可以是氨基酸或氨基酸混合物，诸如组氨酸或氨基酸(诸如组氨酸和甘氨酸)混合物。或者，pH缓冲化合物优选为将制剂的pH保持在预定水平(诸如在约5.0至约8.0的范围内)，并且不螯合钙离子的剂。这种pH缓冲化合物的说明性实例包括但不限于咪唑和乙酸根离子。pH缓冲化合物可以以适合将制剂的pH保持在预定水平的任何量存在。
药物组合物还可以含有一种或多种渗透调节剂，即将制剂的渗透特性(例如，张力、渗透度和/或渗透压)调节到受体个体的血流和血细胞可以接受的水平。渗透调节剂可以是不螯合钙离子的剂。渗透调节剂可以是本领域技术人员已知或可获得的调节制剂的渗透特性的任何化合物。本领域技术人员可以凭经验确定给定渗透调节剂在本发明制剂中的适用性。合适的渗透调节剂类型的说明性实例包括但不限于：盐类，诸如氯化钠和乙酸钠；糖类，诸如蔗糖、右旋糖和甘露醇；氨基酸，诸如甘氨酸；以及一种或多种这些剂和/或剂型的混合物。一种或多种渗透调节剂可以以足以调节制剂的渗透特性的任何浓度存在。
除了修饰的细胞或其群体和载剂之外，本发明的药物组合物还可以包括至少一种用于治疗疾病的另外的治疗剂。例如，本文所述的药物组合物的一些实施方案还包括化疗剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含细胞因子肽或编码细胞因子肽的核酸序列。在一些实施方案中，包含细胞或其群体的药物组合物可以与另外的治疗剂分开施用。
关于本发明的基因修饰细胞的治疗用途的一个考虑因素是实现最佳或令人满意的效果所必需的细胞数量。待施用的细胞数量可以因治疗对象而异。在一个实施方案中，将104至1010、105至109或106至108个本发明的遗传修饰细胞施用于人受试者。在一些实施方案中，将至少约1x 108、2x 108、3x 108、4x 108和5x 108个本发明的遗传修饰细胞施用于人受试者。确定精确的有效剂量可以基于每个个体受试者的因素，包括他们的体型、年龄、性别、体重和疾患。本领域技术人员可以从本公开和本领域知识容易地判定剂量。
技术人员可以容易地确定在组合物中的并且在本发明的方法中要施用的细胞的数量和任选的添加剂、载体和/或载剂和将在本发明的方法中施用。通常，添加剂(除细胞外)存在于磷酸盐缓冲盐水中的0.001至50％(重量)溶液中，并且活性成分以微克到毫克的数量级存在，诸如约0.0001到约5重量％，优选约0.0001至约1重量％，还更优选约0.0001至约0.05重量％或约0.001至约20重量％，优选约0.01至约10重量％，并且还更优选约0.05至约5重量％。当然，对于要向动物或人施用的任何组合物，以及对于任何特定的施用方法，因此优选确定：毒性，诸如通过在合适的动物模型(例如，啮齿动物诸如老鼠)中确定致死剂量(LD)和LD50；以及组合物的剂量、其中组分的浓度和组合物的施用时间，这会引起合适的反应。这种确定不需要根据本领域技术人员的知识、本公开和本文引用的文件进行过度实验。并且，无需过度实验即可判定连续施用的时间。
在一些实施方案中，药物组合物被配制用于递送至受试者。施用本文所述药物组合物的合适途径包括但不限于：局部、皮下、透皮、真皮内、病灶内、关节内、腹膜内、膀胱内、经粘膜、牙龈、牙内、耳蜗内、经鼓膜、器官内、硬膜外、鞘内、肌肉内、静脉内、血管内、骨内、眼周、瘤内、脑内和脑室内施用。
在一些实施方案中，将本文所述的药物组合物局部施用至患病部位。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物施用于受试者，所述植入物是多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜，诸如唾液膜或纤维。
在其他实施方案中，本文所述的药物组合物在控释系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见，例如，Langer,1990,Science 249:1527-1533；Sefton,1989,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等人,1980,Surgery 88:507；Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料。(参见，例如，Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise编,CRC Press,BocaRaton,Fla.,1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design andPerformance(Smolen和Ball编,Wiley,New York,1984)；Ranger和Peppas,1983,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61。还参见Levy等人,1985,Science 228:190；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105。)讨论了其他控释系统，例如在Langer,同上中。
在一些实施方案中，根据常规程序将药物组合物配制成适于静脉内或皮下施用至受试者(诸如人)的组合物。在一些实施方案中，用于注射施用的药物组合物是无菌等渗溶液，用作增溶剂和局部麻醉剂，诸如减轻注射部位疼痛的利多卡因。一般来说，所述成分单独或混合在一起以单位剂型(例如作为干燥冻干粉末或无水浓缩物)提供于指示活性剂的量的密闭容器(如安瓿或药囊)中。当药物待通过输注施用时，所述组合物可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶来分配。在药物组合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿以使得成分可以在施用之前被混合。
用于全身施用的药物组合物可以是液体，例如无菌盐水、乳酸林格氏(Ringer's)液或汉克氏(Hank's)液。此外，药物组合物可以是固体形式并且再溶解或悬浮后立即使用。还考虑了冻干形式。药物组合物可以包含在脂质颗粒或囊泡中，诸如脂质体或微晶，其也适用于胃肠外施用。颗粒可以具有任何合适的结构，诸如单层或多层，只要其中含有组合物即可。化合物可以被包埋在“稳定的质粒脂质颗粒”(SPLP)中，所述颗粒含有融合脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(低水平的(5-10mol％)阳离子脂质)，并通过聚乙二醇(PEG)包被而稳定(Zhang Y.P.等人,Gene Ther.1999,6:1438-47)。带正电荷的脂质，诸如N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基-甲基硫酸铵，或“DOTAP”对于此类颗粒和囊泡是特别优选的。这种脂质颗粒的制备是众所周知的。参见，例如，美国专利号4,880,635、4,906,477、4,911,928、4,917,951、4,920,016、4,921,757；每一个都以引用方式并入本文。
例如，本文所述的药物组合物可以以单位剂量施用或封装。术语“单位剂量”在提及本公开治疗组合物使用时，是指适合作为用于受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算产生所需治疗效果的预定量的活性物质以及所需要的稀释剂；即，载剂或媒介物。
此外，药物组合物可以作为药物试剂盒提供，所述试剂盒包含(a)含有冻干形式的本发明化合物的容器和(b)含有药学上可接受的稀释剂(例如，用于重构或稀释本发明的冻干化合物无菌的稀释剂)的第二容器。任选地，与所述容器相伴的可为由管制医药或生物产品的制造、使用或销售的政府机构开具的呈表格形式的报告书，所述报告书反映由制造、使用或销售的机构核准供人施用。
在另一方面，包括含有用于治疗上述疾病的材料的制品。在一些实施方案中，制品包括容器和标签。适合容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。所述容器可以由诸如玻璃或塑料的各种材料制成。在一些实施方案中，所述容器容纳有效治疗本文所述疾病的组合物并且可以具有无菌入口。例如，所述容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶。组合物中的活性剂是本发明的化合物。在一些实施方案中，容器上或与容器相关的标签表明组合物用于治疗选择的疾病。制品还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲剂诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏液及右旋糖溶液。其还可以包括从商业和使用者观点来说所需的其他材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器以及带有使用说明的药品说明书。
在一些实施方案中，任何融合蛋白、gRNA和/或本文所述的复合物作为药物组合物的一部分提供。在一些实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何融合蛋白和/或多分子复合物。在一些实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何复合物。在一些实施方案中，药物组合物包含核糖核蛋白复合物，所述复合物包含与gRNA和阳离子脂质形成复合物的RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)。在一些实施方案中，药物组合物包含gRNA、核酸可编程DNA结合蛋白、阳离子脂质和药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的治疗活性物质。
在一些实施方案中，将本文提供的组合物施用于受试者，例如施用于人受试者，以在受试者内实现靶向基因组修饰。在一些实施方案中，细胞获得自受试者并与本文提供的任何药物组合物接触。在一些实施方案中，从受试者取出并离体与药物组合物接触的细胞被重新引入受试者，任选地在细胞中已实现或检测到所需的基因组修饰之后。递送包含核酸酶的药物组合物的方法是已知的，并且描述于例如美国专利号6,453,242、6,503,717、6,534,261、6,599,692、6,607,882、6,689,558、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824，所有这些的公开内容以引用方式整体并入本文。虽然本文提供的药物组合物的描述主要针对适合向人施用的药物组合物，但是技术人员将理解此类组合物通常适合向所有种类的动物或生物体施用，例如，用于兽医使用。
改变适用于向人施用的药物组合物以便使得组合物适用于向各种动物施用为众所周知的，并且普通兽医药理学家可仅仅通过普通实验(如果需要)来设计和/或进行此种改变。所想到的向其施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，家养动物、宠物和商业上相关的哺乳动物诸如牛、猪、马、绵羊、猫、犬、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业上相关的鸟类，诸如鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。一般来说，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，并且然后如果必要和/或需要，使产品成形和/或包装为所需的单剂量或多剂量单位。药物制剂可以另外包含如本文所使用的药学上可接受的赋形剂，包括适合于所需的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington的The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；其以引用方式整体并入本文)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于其制备的已知技术。还可参见PCT申请PCT/US2010/055131(公开号WO2011/053982A8，提交于2010年11月2日)，其以引用方式整体并入本文，以获得用于生产包含核酸酶的药物组合物的另外的合适的方法、试剂、赋形剂和溶剂。
除了诸如通过产生任何不需要的生物效应或另外以有害的方式与药物组合物的任何其它组分相互作用而与物质或其衍生物不相容的任何常规赋形剂介质以外，所述赋形剂的使用被考虑在本公开的范围内。
如上所述的组合物可以以有效量施用。有效量将取决于施用方式、所治疗的特定疾患和所需结果。它还可能取决于疾患的阶段、受试者的年龄和身体状况、同时治疗的性质(如果有的话)以及医生熟知的类似因素。对于治疗应用，其量足以达到医学上所需的结果。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物可以用于治疗多种疾病、病症和/或疾患中的任一个。
治疗方法
本发明的一些方面提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效治疗量的如本文所述的药物组合物。更具体地，治疗方法包括向有需要的受试者施用一种或多种药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种具有至少一种编辑的基因的细胞。在其他实施方案中，本发明的方法包括表达能够靶向编码至少一种多肽的核酸分子的碱基编辑器多肽和一个或多个指导RNA，或将其引入到细胞中。
在一个实施方案中，向受试者施用至少0.1×105个细胞、至少0.5×105个细胞、至少1×105个细胞、至少5×105个细胞、至少1×106个细胞、至少0.5×107个细胞、至少1×107个细胞、至少0.5×108个细胞、至少1×108个细胞、至少0.5×109个细胞、至少1×109个细胞、至少2×109个细胞、至少3×109个细胞、至少4×109个细胞、至少5×109个细胞或至少1×1010个细胞。在特定实施方案中，将约1×107个细胞至约1×109个细胞、约2×107个细胞至约0.9×109个细胞、约3×107个细胞至约0.8×109个细胞、约4×107个细胞至约0.7×109个细胞、约5×107个细胞至约0.6×109个细胞，或约5×107个细胞至约0.5×109个细胞施用于受试者。
在一个实施方案中，向受试者施用至少0.1×104个细胞/kg体重、至少0.5×104个细胞/kg体重、至少1×104个细胞/kg体重、至少5×104个细胞/kg体重、至少1×105个细胞/kg体重、至少0.5×106个细胞/kg体重、至少1×106个细胞/kg体重、至少0.5×107个细胞/kg体重、至少1×107个细胞/kg体重、至少0.5×108个细胞/kg体重、至少1×108个细胞/kg体重、至少2×108个细胞/kg体重、至少3×108个细胞/kg体重、至少4×108个细胞/kg体重、至少5×108个细胞/kg体重，或至少1×109个细胞/kg体重。在特定实施方案中，将约1×106个细胞/kg体重至约1×108个细胞/kg体重、约2×106个细胞/kg体重至约0.9×108个细胞/kg体重、约3×106个细胞/kg体重至约0.8×108个细胞/kg体重、约4×106个细胞/kg体重至约0.7×108个细胞/kg体重、约5×106个细胞/kg体重至约0.6×108个细胞/kg体重，或约5×106个细胞/kg体重至约0.5×10个细胞/kg体重施用于受试者。
本领域普通技术人员将认识到，可能需要多次施用特定实施方案中考虑的药物组合物以实现所需的治疗。例如，可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长时间的跨度内向受试者施用组合物1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次。在任何此类方法中，所述方法可以包括向受试者施用有效量的编辑的细胞或碱基编辑器系统或编码此类系统的多核苷酸。在任何此类方法中，所述方法可以包括每天施用一个或多个剂量的有效量的编辑的细胞。在任何此类方法中，所述方法可以包括每天施用两个或更多个剂量的有效量的编辑的细胞。在任何此类方法中，所述方法可以包括每天施用三个或更多个剂量的有效量的编辑的细胞。在任何此类方法中，所述方法可以包括每周施用一个或多个剂量的有效量的编辑的细胞。在任何此类方法中，所述方法可以包括每周施用两个或更多个剂量的有效量的编辑的细胞。在任何此类方法中，所述方法可以包括每周施用三个或更多个剂量的有效量的编辑的细胞。在任何此类方法中，所述方法可以包括每月施用一个或多个剂量的有效量的编辑的细胞。在任何此类方法中，所述方法可以包括每月施用两个或更多个剂量的有效量的编辑的细胞。在任何此类方法中，所述方法可以包括每月施用三个或更多个剂量的有效量的编辑的细胞。
本文考虑的药物组合物的施用可以使用常规技术进行，包括但不限于输注、输液或胃肠外施用。在一些实施方案中，胃肠外施用包括血管内、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、瘤内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下和胸骨内输注或注射。
在一些实施方案中，本文所述的组合物(例如，编辑的细胞、碱基编辑器系统)以每千克人受试者体重约0.5-30mg的剂量施用。在另一个实施方案中，施用的组合物的量为每千克人受试者体重约0.5-20mg。在另一个实施方案中，施用的组合物的量为每千克人受试者体重约0.5-10mg。在另一个实施方案中，施用的组合物的量为每千克人受试者体重约0.04mg、约0.08mg、约0.16mg、约0.32mg、约0.64mg、约1.25mg、约1.28mg、约1.92mg、约2.5mg、约3.56mg、约3.75mg、约5.0mg、约7.12mg、约7.5mg、约10mg、约14.24mg、约15mg、约20mg或约30mg。在另一个实施方案中，施用的组合物的量为每千克人受试者体重约1.92mg、约3.75mg、约7.5mg、约15.0mg或约30.0mg，并且每周施用组合物两次。在另一个实施方案中，施用的组合物的量为每千克人受试者体重约1.28mg、约2.56mg、约5.0mg、约10mg或约20mg，并且每周施用组合物两次。在另一个实施方案中，施用的组合物的量为每千克人受试者体重约1.92mg、约3.75mg、约7.5mg、约15.0mg或约30.0mg，并且每周施用组合物一次。在另一个实施方案中，施用的组合物的量为每千克人受试者体重约1.28mg、约2.56mg、约5.0mg、约10mg或约20mg，并且每周施用组合物一次。在另一个实施方案中，施用的组合物的量为每千克人受试者体重约1.92mg、约3.75mg、约7.5mg、约15.0mg或约30.0mg，并且每天施用组合物一次，在七天的时间段内施用三次、五次或七次。在另一个实施方案中，每天一次静脉内施用组合物，在七天的时间段内施用七次。在另一个实施方案中，施用的组合物的量为每千克人受试者体重约1.28mg、约2.56mg、约5.0mg、约10mg或约20mg，并且每天施用组合物一次，在七天的时间段内施用三次、五次或七次。在另一个实施方案中，每天一次静脉内施用组合物，在七天的时间段内施用七次。
在一些实施方案中，在0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h的时间段内施用组合物。在另一个实施方案中，在0.25-2h的时间段内施用组合物。在另一个实施方案中，在1h的时间段内逐渐施用组合物。在另一个实施方案中，在2h的时间段内逐渐施用组合物。
试剂盒
本发明提供了特征为腺苷脱氨酶碱基编辑器变体(例如，ABE8.20变体)的试剂盒，所述变体能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶两者脱氨。在一些实施方案中，试剂盒包括编码腺苷脱氨酶碱基编辑器变体(例如，ABE8.20变体)的多核苷酸，所述腺苷脱氨酶碱基编辑器变体能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶两者脱氨。在一些实施方案中，试剂盒还包括一种或多种指导多核苷酸(例如，靶向基因组序列的指导多核苷酸)。在一些实施方案中，试剂盒还包括多分子复合物、碱基编辑器系统或编码多分子复合物或碱基编辑器系统的多核苷酸。在一些实施方案中，其中多分子复合物或碱基编辑器系统包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)、能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和/或胞嘧啶脱氨的腺苷脱氨酶变体以及一种或多种指导RNA。在一些实施方案中，napDNAbp是Cas9或Cas12。在一些实施方案中，napDNAbp是Cas9切口酶(nCas9)。在一些实施方案中，编码碱基编辑器的多核苷酸是mRNA序列。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体是TadA脱氨酶变体(例如，TadA*8变体)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶变体选自表1A至1F、25和/或26中的任一个中的变体。在一些实施方案中，试剂盒包括编辑的细胞和关于关于使用此类细胞的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括载体，其包含编码能够使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶两者脱氨的腺苷脱氨酶碱基编辑器变体的多核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包括载体，其包含编码一种或多种指导多核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包括细胞，其包含如本文所提供的任何多核苷酸、多分子复合物、碱基编辑器、碱基编辑器系统、细胞或载体。
试剂盒还可以包括使用如本文所提供的碱基编辑器系统和/或编辑的细胞的书面说明书。在其他实施方案中，说明书包括以下至少一项：注意事项；警告；临床研究；和/或参考文献。说明书可以直接打印在容器上(当存在时)，或作为标签贴在容器上，或作为单独的纸张、小册子、卡片或容器中或随容器提供的文件夹。在进一步的实施方案中，试剂盒可以包括合适操作参数的标签或单独插页(包装插页)形式的说明书。在又一个实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个容器，所述容器具有适当的用作检测、校准或规范化的标准的阳性和阴性对照或对照样品。试剂盒还可以包括第二容器，所述第二容器包括药学上可接受的缓冲液，诸如(无菌)磷酸盐缓冲盐水、林格氏液或右旋糖溶液。其还可以包括从商业和使用者观点来说所需的其他材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器以及带有使用说明的药品说明书。
除非另有说明，否则本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术完全在技术人员的技术范围内。这些技术在文献中得到了充分的解释，诸如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",第二版(Sambrook,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(Gait,1984)；"Animal Cell Culture"(Freshney,1987)；"Methods in Enzymology""Handbook of Experimental Immunology"(Weir,1996)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller和Calos,1987)；"Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel,1987)；"PCR:The PolymeraseChain Reaction",(Mullis,1994)；"Current Protocols in Immunology"(Coligan,1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，因此可以在制造和实践本发明时考虑。用于特定实施方案的特别有用的技术将在以下部分中讨论。
提出下列实施例以为普通技术人员提供如何制造并使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完整公开和描述，但不意图限制发明人所认为的发明范围。
实施例
实施例1：开发具有增加的胞嘧啶脱氨酶活性的tRNA作用的腺苷脱氨酶A变体(TadA*’s)
如下文实施例1-5中进一步描述的，进行实验(参见图41)以开发具有增加的胞嘧啶脱氨酶活性的TadA*多肽。如图41中所示，使用定向进化和结构指导的合理设计方法的组合来开发TadA*多肽。
在第一定向进化实验(实施例2和表1A；进化编号1或E1)中，制备TadA*8.20和TadA*8.19的变体(ABE8 TadA*变体)以产生TADAC-1多肽(作用于DNA腺嘌呤和胞嘧啶并在第1轮定向进化中鉴定的TadA*)，并且这些变体也被称为CABE-1’s(在第1轮定向进化中鉴定的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器)。以大肠杆菌制备文库。
在第二轮定向进化(实施例3和表1C；进化编号2或E2)中，使用来自第一轮定向进化的变体1.2(参见表1A)制备进一步的变体。这些变体被称为TADAC-2e多肽(作用于DNA腺嘌呤和胞嘧啶并在第2轮定向进化中鉴定的TadA*)，并且这些变体也被称为CABE-2e多肽(在第2轮定向进化中鉴定的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器)。鉴定出的变体能够编辑A→G和C→T，但偏向于C→T。
在TadA*变体的第一轮结构指导的合理设计(实施例4和表1B)中，来自ABE8 TadA*多肽和TADAC-1多肽的突变和结构见解为TADAC-2多肽(作用于DNA腺嘌呤和胞嘧啶并使用结构指导的合理设计鉴定的TadA*)的设计提供了信息，并且变体也被称为CABE-2s多肽(使用结构指导的合理设计鉴定的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器)。结构指导的合理设计是基于ABE8.8、ABE8.20、变体1.14、1.17和1.19的晶体结构。使用HEK293T哺乳动物细胞筛选变体(结构筛选编号1)。鉴定的变体包括具有稳定A→G和C→T编辑的变体，以及具有高水平特定甚至专有C→T编辑活性的变体。
在TadA*变体的第二轮结构指导的合理设计(实施例5和表1D)中，来自TADAC-2e多肽和TADAC-2s多肽的突变和结构见解为TADC-1多肽(作用于DNA胞嘧啶的TadA*)的设计提供了信息，并且变体也被称为CBE-T1多肽(来源于TadA*的胞嘧啶碱基编辑器)。在HEK293T哺乳动物细胞中筛选变体。鉴定的变体包括对C→T编辑具有高特异性的那些。
TadA*变体被鉴定为具有广泛的胞嘧啶脱氨酶(即，C→T)活性/特异性和/或腺苷脱氨酶(即，A→G)活性/特异性。因此，从具有治疗上高的编辑效率的腺嘌呤脱氨酶(ABE8.20)开发具有组合的腺嘌呤和胞嘧啶脱氨酶活性或对胞嘧啶脱氨具有特异性的变体。
实施例2：鉴定具有腺嘌呤和胞嘧啶脱氨酶活性的腺苷脱氨酶变体候选物(TADAC-1多肽)的第一轮定向进化
进行进化实验以将突变引入到腺苷脱氨酶中，以使靶多核苷酸(例如，DNA)中的腺嘌呤和胞嘧啶能够脱氨。定向进化实验包括使用基于TadA*8.20序列的化学合成的突变体TadA*文库作为起始模板。鉴定了二十(20)个候选效应子(表1A)并将其克隆到哺乳动物构建体中以进行转染。将构建体设计为具有或没有UGI结构域。
没有UGI结构域的示例性腺苷脱氨酶变体构建体提供于表19中。
表19.腺苷脱氨酶变体构建体
编辑器质粒 构建体身份 注册ID
pDKL-11 1.1 pEd_BTx1077
pDKL-12 1.2 pEd_BTx1078
pDKL-13 1.3 pEd_BTx1079
pDKL-14 1.4 pEd_BTx1080
pDKL-15 1.5 pEd_BTx1081
pDKL-16 1.6 pEd_BTx1082
pDKL-17 1.7 pEd_BTx1083
pDKL-19 1.9 pEd_BTx1085
pDKL-20 1.10 pEd_BTx1086
pDKL-21 1.11 pEd_BTx1087
pDKL-22 1.12 pEd_BTx1088
pDKL-47 1.13 pEd_BTx1121
pDKL-48 1.14 pEd_BTx1131
pDKL-49 1.15 pEd_BTx1118
pDKL-50 1.16 pEd_BTx1117
pDKL-51 1.17 pEd_BTx1126
pDKL-52 1.18 pEd_BTx1128
pDKL-53 1.19 pEd_BTx1124
pDKL-54 1.20 pEd_BTx1120
具有UGI结构域的质粒构建体的组织设计如下：CMV启动子-进化衍生性突变体Tad*-切口酶Cas9(D10A)-UGIx2-BPNLS-质粒主链
具有两个UGI结构域的示例性腺苷脱氨酶变体构建体提供于表20中。
表20.具有UGI结构域的腺苷脱氨酶变体构建体
编辑器质粒 构建体身份 注册ID
pDKL-23 1.1 pEd_BTx1089
pDKL-24 1.2 pEd_BTx1090
pDKL-25 1.3 pEd_BTx1091
pDKL-26 1.4 pEd_BTx1092
pDKL-27 1.5 pEd_BTx1093
pDKL-28 1.6 pEd_BTx1094
pDKL-29 1.7 pEd_BTx1095
pDKL-31 1.9 pEd_BTx1097
pDKL-32 1.10 pEd_BTx1098
pDKL-33 1.11 pEd_BTx1099
pDKL-34 1.12 pEd_BTx1100
pDKL-55 1.13 pEd_BTx1125
pDKL-56 1.14 pEd_BTx1115
pDKL-57 1.15 pEd_BTx1127
pDKL-58 1.16 pEd_BTx1130
pDKL-59 1.17 pEd_BTx1119
pDKL-60 1.18 pEd_BTx1116
pDKL-61 1.19 pEd_BTx1122
pDKL-62 1.20 pEd_BTx1123
对照构建体提供于下表21中。
论了其他控释系统对照构建体
示例性指导RNA构建体提供于下表22中。
表22指导RNA构建体
使用Lipofectamine-2000(ThermoFisher)将20个编辑构建体转染到HEK293T细胞中，并在总共18个不同靶位点上评估碱基编辑活性(参见下表24)。孵育4天后，收获细胞，并提取基因组DNA用于后续高通量测序(HTS)分析。
示例性核苷酸位点提供于下表24中，其中靶序列为带下划线的字体。在每个指定位点观察每个编辑器构建体的最大效率。这允许一次检查一个位点内编辑器构建体和对照的有关活性。最大编辑是由对于在所有窗口位置的位点观察到的最大A→G和C→T编辑活性定义的。将腺苷碱基编辑器ABE8.20和ABE8.2b用作C到非C编辑的阴性对照和A到G编辑的阳性对照。将胞苷碱基编辑器BE4、BE4max和BE3b用作C到非C编辑的阳性对照和A到G编辑的阴性对照。
将包含具有腺苷和胞嘧啶脱氨酶结构域两者的融合蛋白或多分子复合物的碱基编辑器用作比较的对照(参见例如，PCT/US19/44935)。ME-1是具有Cas9、二聚体wtTadA-ABE7.10腺嘌呤脱氨酶、2xUGI结构域和APOBEC1的多效应子碱基编辑器。ME-2是具有环状排列体Cas9、二聚体wtTadA-ABE7.10腺嘌呤脱氨酶、2xUGI结构域和APOBEC1的多效应子碱基编辑器。也将仅指导物且没有转染(NoTxCtr和NoTxCtr1)用作阴性对照。
另外的对照提供于下表23中。
表23.腺苷脱氨酶变体的对照
表24.腺苷脱氨酶变体的靶位点
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测量了20个具有或没有UGI结构域的单链DNA特异性腺苷和胞苷脱氨酶(ssDacd)碱基编辑器的编辑效率。没有UGI结构域的20个碱基编辑器构建体对Hek位点2(“299”)靶序列的编辑效率显示在图1A至1C中。图1A描绘了每个碱基编辑器在没有UGI结构域的情况下在位置C4(加粗字体)处的C到非C编辑百分比。图1B描绘了每个碱基编辑器在没有UGI结构域的情况下在位置A5(加粗字体)处的A到G编辑百分比。图1C显示了每个碱基编辑器的插入缺失百分比。
具有UGI结构域的20个碱基编辑器对Hek位点2(“299”)靶序列的编辑效率显示在图2A至2C中。图2A描绘了每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下在位置C4(加粗字体)处的C到非C编辑百分比。图2B描绘了每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下在位置A5(加粗字体)处的A到G编辑百分比。图2C显示了每个碱基编辑器的插入缺失百分比。
碱基编辑器1.1、1.2、1.9、1.12、1.17、1.18和1.19碱基编辑器对Hek位点2(“299”)靶序列的编辑效率显示在图3A和3B中。图3A显示了每个碱基编辑器在位置C4T、A5G、C6R和A7G(用粗体显示)处的脱氨百分比。图3B显示了每个碱基编辑器的插入缺失百分比。
使用RNF2(“ACK121”)靶序列的每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下A到G和C到T最大编辑的脱氨百分比显示在图4A中。图4B显示了使用Emx1靶序列的A到G和C到T编辑的脱氨百分比。图4C显示了每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下在EMX1 v2(“B415”)靶序列的位点1处的A到G和C到T最大编辑的脱氨百分比。图4D显示了每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下使用Hek2位点3靶序列的A到G和C到T编辑的脱氨百分比。图4E显示了每个碱基编辑器对RNF2(“ACK121”)、Emx1 v1(“ACK 115”)、Emx1 v2(“B415”)和Hek2 site3(“ACK 119”)中的每一个的插入缺失百分比。
每个碱基编辑器在具有UGI结构域的情况下使用Hek2位点2靶序列的A到G和C到T编辑的脱氨百分比显示在图5中。具有和没有UGI结构域的碱基编辑器构建体对Hek位点2的编辑百分比显示在图6A和6B中。具有和没有UGI结构域的碱基编辑器构建体对EMX1(ack115)靶序列的编辑百分比显示在图7A和7B中。具有和没有UGI结构域的碱基编辑器构建体对Hek位点3(ack115)的编辑百分比显示在图8A和8B中。具有和没有UGI结构域的碱基编辑器构建体对RNF2(ack121)靶序列的编辑百分比显示在图9A和9B中。具有和没有UGI结构域的碱基编辑器构建体对EMX1位点2(B415)的编辑百分比显示在图10A和10B中。具有和没有UGI结构域的碱基编辑器构建体对spA12(YY-A12)靶序列的编辑百分比显示在图11A和11B中。
使用YY-A1、YY-A2、YY-A6、YY-A7、YY-A15、YY-A16、YY-A17、YY-A27和YY-A28靶序列的腺苷碱基编辑器变体的最大效率和插入缺失率显示在图12至22中。最大编辑效率测量为对于在所有窗口位置的位点观察到的最大观察的A→G和C→T编辑活性。因此，最大编辑效率并不表示观察到最大编辑百分比的位置。将具有和没有UGI结构域的腺苷碱基编辑器ABE8.19、ABE8.20用作C到非C编辑的阴性对照和A到G编辑的阳性对照。将胞苷碱基编辑器BE4构建体用作C到非C编辑的阳性对照和A到G编辑的阴性对照。将仅指导物用作阴性对照。也将ABE/CBE融合蛋白碱基编辑器用于比较碱基编辑效率。特别地，相对于A→G的活性，编辑器构建体1.1和1.2显示了增加的C→T活性。
评估每个编辑器构建体在9个选定位点(YY-A1、YY-A2、YY-A6、YY-A7、YY-A15、YY-A16、YY-A17、YY-A27和YY-A28)的最大编辑效率以比较每个编辑器构建体在多个位点的活性(图23A至23S)。“最大编辑”测量为对于在所有窗口位置的位点观察到的最大观察的A→G和C→T编辑活性。因此，图23A至23S的数据没有指定最大编辑百分比出现的位置。特别地，相对于A→G的活性，编辑器构建体1.1和1.2显示了增加的C→T活性。
检查了位点组的每个窗口位置处的20个编辑器构建体的平均编辑效率(图24A至24T和36A至36S)。这允许用编辑框内的位置编号特异性来辨别每个编辑器的编辑效率。图24A至24T和36A至36S将每个编辑器的最大编辑效率显示为最高“峰值”。平均而言，在大多数窗口位置观察到高C→T编辑和低A→G。特别地，相对于A→G的活性，编辑器构建体1.1和1.2显示了增加的C→T活性。编辑器构建体1.3-1.20显示了不同程度的A→G和C→T活性，其中每个编辑窗口位置处的活性似乎是位点依赖性的。这种多样性可能可用于未来的治疗工作，也许在特定窗口位置需要特异性活性水平的情况下。对照显示在图25A至25I和37A至37E中。将ABE8.19m和ABE8.20m(编辑器构建体进化来源的编辑器)用作对照。还包括ABE8.19m/8.20m的“+UGI”版本。一般来说，具有C→T活性的碱基编辑器受益于包含UGI。包括BE4、BE4-max、BE3b(无UGI)、ABE/CBE融合蛋白(ABE-longrAPOBEC-1融合物)和nCas9对照以比较相对C→T活性。
实施例3：具有双重编辑活性(A→G和C→T两者)的腺苷脱氨酶变体(TADAC-2e多肽)的第二轮定向进化
进行进化实验以将突变引入到与靶多核苷酸(例如，DNA)中的胞嘧啶和腺苷两者的双重编辑相关的腺苷脱氨酶中。定向进化实验包括使用基于1.2的序列(表1A)的化学合成突变体TadA*文库作为起始模板，使得文库内的每个变体含有1-3个突变。包含这些突变体TadA*文库的编辑器构建体具有以下架构：突变体TadA*文库-nCas9(D10A)-UGI加上其他质粒组分中的原型间隔区/gRNA支架(由AraC启动子系统驱动)。使用氯霉素抗生素抗性基因选择感兴趣的腺苷变体。验证实验后，将突变体TadA*文库编辑器构建体转化为含有选择构建体的电感受态大肠杆菌，并用维持抗生素和0.1M阿拉伯糖培养过夜(以诱导AraC驱动的编辑器架构的表达)。然后将小体积的培养物铺种在含有浓度不断增加的选择抗生素氯霉素的琼脂平板上，并使其生长24-48小时。然后，对存活的克隆进行挑选、编目和测序，以确定文库成员的突变特征。筛选中鉴定的腺苷脱氨酶变体列于上表1C中。
在HEK293T中评估表1C中列出的候选碱基编辑器的碱基编辑活性。根据上述方法，用编码每种构建体的多核苷酸转染HEK293T细胞。许多碱基编辑器表现出双重编辑活性(即，A到G和C到T碱基编辑活性)。在以下靶位点处评估每个候选碱基编辑器的C到T、A到G和C到G编辑活性(参见图32A至32F、34A和34B)：YY-A2、YY-A6、YY-A7、YY-A12、YY-A17和ACK119(HEK位点3)。还在每个候选碱基编辑器的每个位点处测量了插入缺失活性(参见图33A至33F、35A和35B)。
实施例4：鉴定具有双重编辑活性(A→G和C→T两者)和C→T特异性活性的腺苷脱氨酶变体(TADAC-2s多肽)的候选碱基编辑器的第一轮结构指导设计
为了筛选腺苷脱氨酶变体以鉴定具有改进的双重编辑活性或具有C→T碱基编辑特异性的变体，将199个合理设计的候选编辑器(参见表1D)转染到HEK293T细胞中，并在六个靶位点评估编辑活性。六个靶位点是pYY-TSP-A2(YY-A2)、pYY-TSP-A6(YY-A6)、pYY-TSP-A7(YY-A7)、pYY-TSP-A12(YY-A12)、pYY-TSP-A17(YY-A17)、ACK119(Hek位点3)。对每个候选编辑器测量的A→G和C→T活性呈现在图30中。
候选编辑器的设计由腺苷脱氨酶变体的结构表征提供信息，所述腺苷脱氨酶变体包括以上实施例1中鉴定的和表1A中列出的那些(参见图42、43A至43C、44至50和51A)。特别地，结构分析表明，在第一轮进化中观察到的序列改变(参见实施例2和表1A)和影响单链DNA结合的序列改变往往落在蛋白质结构的三个区域(A-C)内。来自任何一个区域的突变都足以增加胞嘧啶脱氨的特异性。在定向进化中没有鉴定出在所有三个区域都含有突变的变体，并且几乎没有在超过一个区域中包含突变的变体。因此，制备了199个变体的组合文库，其中每个变体在三个区域中的每个区域中含有至少一个突变：A区中1-2个位点改变；B区中1-2个位点改变；以及C区中1-4个位点改变(图51A和57)。A区对应于氨基酸位置29、30、82、84和142，B区对应于氨基酸位置27和49，并且C区对应于氨基酸位置107、112和115(参见图57)。A区对应于变体的活性位点，B区对应于变体的DNA结合区，并且C区对应于变体的DNA环5。
更一般地，A区涵盖残基82-84，B区涵盖残基27-30和47-49，并且C区涵盖残基107-115，其对应于含有残基105-115的环区。B区由晶体学结构中彼此相邻的三个离散二级结构组成：环1(L1；残基25-30)、环3(L3；残基46-47)和螺旋2(残基48-51)。C区在环8(L8)中含有突变。在图57中，未圈出的灰色球体对应于C端螺旋(或者，“α螺旋5”)中的改变，其涵盖野生型ecTadA晶体学结构中的残基139-167。此α螺旋5中的突变在TadA变体的开发中非常重要。不受理论约束，α螺旋5中的改变导致TadA变体中残基150处的解旋，并且断裂的螺旋由图51A中所示的未断裂圆圈标记。
不受理论约束，通过腺苷脱氨酶变体的结构表征获得了关于氨基酸取代对ssDNA结合的影响的一些进一步见解。例如，已确定S82T和A142E取代可能与表1A的TadA变体1.17的C→T编辑值较小有关(图44)。而且，引入环5的结构紊乱和/或构象变化的位置112处的改变(例如，G112H)与增加的胞苷脱氨酶活性相关(图45)。部分结构环5之后的取代影响ssDNA结合(图46)。不受理论约束，对应于表1A的变体1.19的氨基酸取代诱导C端α-螺旋的结构构象变化(环-1和α-1)和展开。
组合文库中的编辑器共同表示广泛的编辑活性，包括C→T/低A→G、相等C→T/A→G、高A→G/低C→T以及介于其之间的所有活性。
在筛选的199个候选编辑器(参见表1D和图30)中，选择了32个候选编辑器用于在大约24个另外的位点进行进一步表征(图31)。在这32个候选编辑器中，24个候选编辑器是C→T特异性“TadC”编辑器，并且8个候选编辑器是双重C→T和A→G“TadAC”候选编辑器。展示双重C→T和A→G碱基编辑活性的代表性候选编辑器包括S1.1、S1.12、S1.13、S1.56、S1.133、S1.134、S1.144和S1.155。具有C→T特异性活性的代表性候选编辑器包括S1.4、S1.5、S1.7、S1.11、S1.14、S1.45、S1.46、S1.47、S1.48、S1.49、S1.51、S1.52、S1.53、S1.55、S1.141、S1.142、S1.143、S1.146、S1.147、S1.148、S1.150、S1.152、S1.153和S1.154。
将腺苷脱氨酶变体S1.1、S1.4、S1.12、S1.41、S1.42、S1.43、S1.46、S1.47、S1.48、S1.50、S1.51、S1.52、S1.53、S1.54、S1.55、S1.56、S1.67、S1.70、S1.71、S1.78、S1.133和S1.140与以下腺苷脱氨酶变体1.17(参见表1A)一起制备和评估：1.17+E27H；1.17+E27K；1.17+E27S；1.17+E27S+I49K；1.17+E27G；1.17+I49N；1.17+E27G+I49N；和1.17+E27Q。如上所述确定变体的编辑效率并呈现在图26A至26F、27A至27F、28A至28F和29A至29F中。
实施例5：具有C→T特异性活性的腺苷脱氨酶变体(TADC-1多肽)的第二轮结构指导设计
为了筛选腺苷脱氨酶变体以鉴定具有改进的C→T碱基编辑特异性的变体，将56个合理设计的候选编辑器(参见表1D)转染到HEK293T细胞中，并在靶位点YY-A2处评估编辑活性。候选编辑器是基于通过以上实施例获得的见解设计的。特别地，从第二轮进化(参见表1C和实施例3)中选择8个位点(参见表1D中列出的“来自表1C的改变”)，并且将来自表1C中的变体S1.154(参见表1D)用作文库设计的模板(参见图51B)。每个变体在8个选定位点的至多8个中含有改变。
对每个候选编辑器测量的C→T、A→G和C→G活性呈现在图40中。选择腺苷脱氨酶变体S2.14、S2.46和S2.52用于进一步表征(参见图52、53、54A至54E、55和56A至56B)。通过测量靶位点YY-A2处的脱氨活性，确定变体S2.14、S2.46和S2.52对C→T编辑具有高特异性(参见图52)。在位点YY-A2、YY-A17和HEK位点3处测量的变体的插入缺失活性显示在图53中。靶位点YY-A2、YY-A6、YY-A7、YY-A12、YY-A17和Hek位点3的平均编辑窗口被确定为约4个碱基对至约8个碱基对，相对于BE4和ABE8对照，碱基编辑窗口变窄(参见图54A至54E)。位点YY-A2处等位基因分布的测量表明，变体的碱基编辑限于约位置4至约位置8，并且变体主要以高特异性编辑位置7处的C(参见图55)。BE4具有更宽的编辑窗口，并且显著更高比例的对应于BE4的等位基因在位置12处具有编辑的C。
使用R环测定评估S2.14、S2.46和S2.52腺苷脱氨酶变体的反式和顺式碱基编辑活性(参见Yu,Y.等人,“Cytosine base editors with minimized unguided DNA and RNAoff-target events and high on-target activity,”Nature Comm.第11卷,文章编号2052(2020)；Doman,J.L.等人,“Evaluation and minimization of Cas9-independentoff-target DNA editing by cytosine base editors,”Nature Biotechnol.38:620-628(2020)，出于所有目的，其内容以引用方式整体并入本文)。如图56A所示，变体仅显示低水平的指导物非依赖性A→G活性，这与变体具有高胞嘧啶脱氨酶特异性一致。ABE8对照在一些靶位点具有低水平的反式活性。如图56B中所示，变体具有中靶顺式C→T碱基编辑活性，BE4也是如此，但ABE8和阴性对照没有。变体在评估位点处具有低反式C→T碱基编辑活性。变体具有指导物非依赖性脱靶，前提是优于BE4的指导物非依赖性脱靶。
实施例6：将ABE8e突变引入到腺苷脱氨酶变体中
ABE8e的指导物非依赖性脱靶编辑率高于ABE8。因此，制备表1E中列出的腺苷脱氨酶变体以确定ABE8的碱基编辑活性是否可以通过改变以包含ABE8e的改变而得到改善。
将表1E的碱基编辑器变体转染至HEK293T细胞中，并评估七个靶位点(即A1、A4、A5、A14、A16、A17和A25)的编辑活性(参见表24)。测量每个碱基编辑器变体的最大百分比中靶和脱靶AT→GC碱基编辑活性(参见图38)。变体879(“8e(879)”)和882(“8e(882)”)表现出增加的中靶活性，而指导物非依赖性脱靶活性的增加相对较低。
鉴于上述8e879和8e882变体的良好性能，进行了实验以确定将这些变体的改变并入到变体1.1、1.2、1.12、1.17、1.18和1.19中是否可以改善这些变体的碱基编辑活性。8e(879)改变是F149Y，并且8e(882)改变是Y147D、F149Y、T166I和D167N。使用Lipofectamine-2000(ThermoFisher)将表1F的碱基编辑器变体转染至HEK293T细胞中，并评估6个靶位点(即B415、YY-A2、YY-A6、YY-A7、YY-A15和YY-A16)的编辑活性。孵育4天后，收获细胞，并提取基因组DNA用于高通量测序(HTS)分析(图39A至39R)。图39A至39R显示了在6个靶位点的组的每个指定窗口位置处每种腺苷脱氨酶变体的平均编辑效率。图39A至39R提供了按位置编号的编辑效率以及最大编辑效率(即，每个图中的最高峰)。有趣的是，对C→T活性具有高特异性的变体1.1和1.2在经过改变以包含8e(879)或8e(882)改变时显示出降低的A→G活性且C→T活性没有显著增加(图39M至39R)。
在以上实施例中使用以下材料和方法。
定向进化
进行进化实验以将突变引入到腺苷脱氨酶中，以使靶多核苷酸(例如，DNA)中的胞嘧啶能够脱氨。定向进化实验包括使用两(2)个突变体TadA*文库。这些突变文库基于作为起始模板的ABE8.19m和ABE8.20m TadA*，其中一种是化学文库(化学合成)，并且一种是随机化文库(经由易错PCR合成)。包含这些突变体TadA*文库的编辑器构建体具有以下架构：突变体TadA*文库-nCas9(D10A)-UGI加上其他质粒组分中的原型间隔区/gRNA支架(由AraC启动子系统驱动)。
下面提供了编码具有UGI的ABE8.19m的质粒的序列，其中编码TadA的序列部分由粗体文本表示，编码接头的序列由纯斜体文本表示，编码SpCas9的序列部分由带下划线文 本表示，编码UGI的序列部分由粗体斜体文本表示，并且编码核定位信号(NLS)的序列部分由粗体带下划线文本表示。
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下面提供了编码具有UGI的ABE8.20m的质粒的序列，其中编码TadA的序列部分由粗体文本表示，编码接头的序列由纯斜体文本表示，编码SpCas9的序列部分由带下划线文 本表示，编码UGI的序列部分由粗体斜体文本表示，并且编码核定位信号(NLS)的序列部分由粗体带下划线文本表示。
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选择策略在氯霉素抗生素抗性基因中使用了两(2)个功能丧失突变，所述两个突变都需要C到T突变以恢复功能。具体地，这些功能丧失突变之一是活性位点突变，而另一个突变是脯氨酸突变。具有这种选择机制的选择质粒构建体具有以下结构：具有2个C到T可校正突变的选择基因：氯霉素抗性基因加上其他质粒组分中的维持抗生素基因(奇霉素(Spectinomycin))。
验证实验后，将突变体TadA*文库编辑器构建体转化为含有选择构建体的电感受态大肠杆菌，并用维持抗生素和0.1M阿拉伯糖培养过夜(以诱导AraC驱动的编辑器架构的表达)。然后将小体积的培养物铺种在含有浓度不断增加的选择抗生素氯霉素的琼脂平板上，并使其生长24-48小时。然后，对存活的克隆进行挑选、编目和测序，以确定文库成员的突变特征。
哺乳动物转染实验
将候选效应子克隆到哺乳动物构建体中进行转染。将构建体设计为具有或没有UGI结构域。HEK293T细胞是选择用于哺乳动物转染实验的哺乳动物细胞系。
HEK293T细胞的铺种
将HEK293T细胞以35,000个细胞/孔的接种密度、250uL的总体积铺种到48孔聚-D-赖氨酸涂布的板上。通过Nucleocounter NC-200仪器确定细胞计数。
方案如下：
1)从含有HEK293T细胞的T150烧瓶中吸出培养基。
2)添加5mL TrypLE Express。
3)在37℃下孵育3-5分钟，直至细胞脱落。
4)向每个烧瓶中添加25mL培养基进行淬灭(DMEM+10％FBS)，充分混合。
5)合并至50mL锥形管中。
6)经由NC-200仪器对细胞进行计数。取300μL等份细胞混合物以在机器上计数(重复测量)。
7)根据细胞计数调整细胞浓度至140,000个细胞/mL，使得每250μL含有35,000个细胞。
8)将250μL(35,000个细胞)等分到48孔板的每个孔中。
转染HEK293T细胞
HEK293T细胞中的转染方案如下：
1)将6.25uL的250ng/μL标准化编辑器(总共750ng)和6.25μL的100ng/μL指导混合物(250ng指导构建体、10ng的Amaxa pmax GFP质粒)合并到96孔PCR板中的每个指导物/编辑器组合中用于转染。
2)通过每1.5μL L2K试剂混合11.0μL OptiMEM来制备Lipofectamine 2000(L2K)。
3)将L2K混合物等分到槽中。
4)将12.5μL lipo混合物添加到编辑器+指导物的每个孔中(总体积＝25μL)。
5)在室温下孵育15min。
6)将所有25μL的编辑器/指导物+lipo混合物转移到细胞中。
用于MiSeq测序的转染的HEK293T细胞的收获和处理
裂解细胞以收集基因组DNA：
哺乳动物裂解缓冲液：0.05％ SDS、10mM Tris-HCl、25ng/mL蛋白酶K。
对于40mL：39.35mL无核酸酶H2O、400μL 1.0M Tris-HCl、200μL10％ SDS和50μL20μg/mL蛋白酶K。
裂解
经由以下方法裂解转染的细胞：
1)使用8通道吸出器吸出培养基，并用约250μL PBS清洗每个孔。
2)使用8通道吸出器吸出PBS。
3)一次处理一个板，每孔添加约100μL哺乳动物裂解缓冲液(参见上文)。
4)将含有消化细胞的板在37℃下孵育1小时。
5)将裂解物转移到96孔PCR板中，注意以与下游预制MiSeq条形码板匹配的方向转移(用于简化下游处理)。
6)经由以下条件在热循环仪中孵育以灭活蛋白酶K：
1：80℃持续30分钟
2：保持12℃
7)继续进行接头PCR步骤。
MiSeq文库制备、接头PCR
使用以下引物和条件进行接头PCR：
每26μL反应物：
0.125μL正向接头引物(100μM)
0.125μL反向接头引物(100μM)
12.25μL无核酸酶H2O
12.50μL Phusion U 2x MM
1μL gDNA裂解混合物
热循环条件：
1：95℃-2min
2：95℃-15s
3：62℃20s
4：72℃20s
5：重复2-4次x30个循环
6：72℃2min
7：保持12℃
用2％琼脂糖检查凝胶(任选)检查PCR，然后继续编条形码。
MiSeq文库制备、编条形码：
使用以下引物和条件进行条形码PCR：
每份反应物：
1.25μL正向条形码(10uM)
1.25μL反向条形码(10uM)
10μL无核酸酶dH2O
12.5μL Q5 2x MM
来自先前接头PCR反应的2μL PCR产品
制备Q5 MM和水的预混液，然后为方便起见，对引物和水进行多通道移液。
热循环条件：
1：95℃-2min
2：95℃-15s
3：62℃20s
4：72℃20s
5：重复2-4次x10个循环
6：72℃2min
7：保持12℃
为文库制备制备了样品。
MiSeq文库制备
通过将3.5μL每个样品收取到储液器中，合并以上步骤中的扩增子(仅一个位点，因此合并到一个容器中)。在2％琼脂糖凝胶上对样品进行电泳。经由Qiagen凝胶纯化试剂盒进行凝胶提取和纯化。将提取的凝胶片段溶解于9mL的缓冲液QG中，然后将其冷却至室温。
将约9mL的此凝胶溶液加载到3MinElut柱上(每柱加载3mL)。使用Qiagen真空歧管实现流通。用3mL另外的缓冲液QG洗涤柱。用2mL缓冲液PB洗涤柱。用2mL缓冲液PE洗涤柱两次。将柱放置到2mL Qiagen收集管中并以最大速率(20,000g)旋转1分10秒以除去过量的含乙醇缓冲液。将柱放置到最终的1.5mL EPPENDORFTM收集管中，并用每柱用20μL进行洗脱。将所有洗脱液合并到一个管中。获得文库浓度，并基于浓度和碱基数量(本例中经由475bp计算)制备4nM文库溶液。新鲜制备200mM NaOH。通过首先将5uL 200mN NaOH添加到新EPPENDORFTM管中的5μL 4nM文库溶液中，短暂颠倒/离心混合并孵育5分钟来制备20pM文库溶液。孵育5分钟后，立即将990缓冲液HBT1(来自解冻的MiSeq试剂盒)添加到管中。经由Illumina MiSeq方案制备20pM PhiX溶液。最终文库含有13.5pM文库和10％ PhiX(10％的文库浓度)。根据benchling ELN系统将文库加载到MiSeq上。
MiSeq数据分析
经由Miseq分析工作流程系统自动进行数据分析。
其他实施方案
根据上文描述，将显而易知的是可对本文所述的本发明作出变化和修改以使其适于各种用途和条件。所述实施方案也在以下权利要求书的范围内。
在对本文变量的任何定义中叙述一列要素包括将那个变量定义为任何单一要素或所列要素的组合(或亚组合)。在本文中叙述实施方案包括那个实施方案呈任何单一实施方案形式或与任何其它实施方案或其部分组合。
本说明书中提及的所有专利和公布以引用方式并入本文，程度就仿佛具体地且个别地指示各独立专利和公布以引用方式并入一般。

Claims (106)

1.一种腺苷脱氨酶变体，所述腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有增加的胞苷脱氨酶活性和/或增加的胞苷脱氨酶特异性，其中所述腺苷脱氨酶变体相对于所述参考腺苷脱氨酶包含两个或更多个氨基酸改变。
2.如权利要求1所述的腺苷脱氨酶变体，其中包含所述改变的所述腺苷脱氨酶变体与以下氨基酸序列具有至少约70％或更高氨基酸序列同一性：
3.如权利要求1或2所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述两个或更多个改变位于选自由以下组成的组的氨基酸位置处：与SEQ ID NO:1具有至少约70％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列的2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167，或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置处。
4.如权利要求2或3所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述两个或更多个改变选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:1具有至少约70％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列的S2X、V4X、F6X、H8X、R13X、T17X、R23X、E27X、P29X、V30X、R47X、A48X、I49X、G67X、Y76X、D77X、S82X、F84X、H96X、G100X、R107X、G112X、A114X、G115X、M118X、D119X、H122X、N127X、A142X、A143X、R147X、Y147X、F149X、A158X、Q159X、A162X、S165X、T166X和D167X，或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置的所述改变。
5.如权利要求1-3中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述两个或更多个改变位于与SEQ ID NO:1具有至少约70％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列的氨基酸位置处，所述改变选自由以下组成的组：
氨基酸位置2处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；
氨基酸位置4处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；
氨基酸位置6处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；
氨基酸位置13处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；
氨基酸位置27处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；
氨基酸位置29处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；
氨基酸位置100处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；
氨基酸位置112处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；
氨基酸位置114处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；
氨基酸位置115处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、165、166和167；
氨基酸位置162处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、165、166和167；或
氨基酸位置165处的第一改变和选自由以下组成的组的氨基酸位置处的一个或多个另外的改变：2、4、6、8、13、17、23、27、29、30、47、48、49、67、76、77、82、84、96、100、107、112、114、115、118、119、122、127、142、143、147、149、158、159、162、166和167。
6.如权利要求1-5中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述两个或更多个改变选自由以下组成的组：与SEQ ID NO:1具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列的S2H、V4K、V4S、V4T、V4Y、F6G、F6H、F6Y、H8Q、R13G、T17A、T17W、R23Q、E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q、E27S、E27G、P29A、P29G、P29K、V30F、V30I、V30L、R47G、R47S、A48G、I49K、I49M、I49N、I49Q、I49T、G67W、I76H、I76R、I76W、I76Y、Y76H、Y76I、Y76R、Y76W、D77G、S82T、F84A、F84L、F84M、H96N、G100A、G100K、R107C、T111H、G112H、A114C、G115M、M118L、D119N、H122G、H122N、H122R、H122T、N127I、N127K、N127P、A142E、A143E、R147H、Y147D、F149Y、A158V、Q159S、A162C、A162N、A162Q、S165P、T166I和D167N，或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置的所述改变。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个改变选自表1A至1F中任一个所列的那些。
8.如权利要求1-7中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述两个或更多个改变包括选自由以下组成的组的改变组合：
E27H、Y76I和F84M；
E27H、I49K和Y76I；
E27S、I49K和Y76I；
E27S、I49K、Y76I和A162N；
E27K和D119N；
E27H和Y76I；
E27S、I49K和G67W；
I49T、G67W和H96N；
E27C、Y76I和D119N；
R13G、E27Q和N127K；
T17A、E27H、I49M、Y76I和M118L；
I49Q、Y76I和G115M；
S2H、I49K、Y76I和G112H；
R47S和R107C；
H8Q、I49Q和Y76I；
T17A、A48G、S82T和A142E；
E27G和I49N；
E27G、D77G和S165P；
E27S、I49K和S82T；
E27S、I49K、S82T和G115M；
E27S、V30I、I49K和S82T；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和A142E；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G112H和A142E；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L和R107C；
E27S、I49K、S82T、F84L和G112H；
E27S、I49K、S82T、F84L和G115M；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；
E27S、P29G、I49K和S82T；
E27S、P29G、I49K、S82T和G115M；
E27S、P29G、I49K、S82T和A142E；
P29G、I49K和S82T；
E27G、I49K和S82T；
E27G、I49K、S82T、R107C和A142E；
V4K、E27H、I49K、Y76I和A114C；
V4K、E27H、I49K、Y76I和D77G；
F6Y、E27H、I49K、Y76I、G100A和H122R；
V4T、E27H、I49K、Y76R和H122G；
F6Y、E27H、I49K和Y76W；
F6Y、E27H、I49K、Y76I和D119N；
F6Y、E27H、I49K、Y76I和A114C；
F6Y、E27H、I49K和Y76I；
V4K、E27H、I49K、Y76W和H122T；
F6G、E27H、I49K、Y76R和G100K；
F6H、E27H、I49K、Y76I和H122N；
E27H、I49K、Y76I和A114C；
F6Y、E27H、I49K、Y76H、H122R和T166I；
E27H、I49K、Y76I和N127P；
R23Q、E27H、I49K和Y76R；
E27H、I49K、Y76H、H122R和A158V；
F6Y、E27H、I49K、Y76I和T111H；
E27H、I49K、Y76I和R147H；
E27H、I49K、Y76I和A143E；
F6Y、E27H、I49K和Y76R；
T17W、E27H、I49K、Y76H、H122G和A158V；
V4S、E27H、I49K、A143E和Q159S；
E27H、I49K、Y76I、N127I和A162Q；
T17A、E27H和A48G；
T17A、E27K和A48G；
T17A、E27S和A48G；
T17A、E27S、A48G和I49K；
T17A、E27G和A48G；
T17A、A48G和I49N；
T17A、E27G、A48G和I49N；
T17A、E27Q和A48G；
E27S、I49K、S82T和R107C；
E27S、I49K、S82T和G112H；
E27S、I49K、S82T和A142E；
E27S、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T和R107C；
E27S、V30I、I49K、S82T和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K和S82T；
E27S、V30L、I49K、S82T和R107C；
E27S、V30L、I49K、S82T和G112H；
E27S、V30L、I49K、S82T和G115M；
E27S、V30L、I49K、S82T和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、V30F、I49K、S82T和F84A；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和R107C；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G112H；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G115M；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和A142E；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G112H；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G115M；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T和F84L；
E27S、I49K、S82T、F84L和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T和R107C；
E27S、P29G、I49K、S82T和G112H；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29G、I49K、S82T和R107C；
P29G、I49K、S82T和G112H；
P29G、I49K、S82T和G115M；
P29G、I49K、S82T和A142E；
P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；
P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；
P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；
P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；
P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；
P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29K、I49K和S82T；
P29K、I49K、S82T和R107C；
P29K、I49K、S82T和G112H；
P29K、I49K、S82T和G115M；
P29K、I49K、S82T和A142E；
P29K、I49K、S82T、R107C和G112H；
P29K、I49K、S82T、R107C和G115M；
P29K、I49K、S82T、R107C和A142E；
P29K、I49K、S82T、G112H和A142E；
P29K、I49K、S82T、G115M和A142E；
P29K、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K和S82T；
P29K、V30I、I49K、S82T和R107C；
P29K、V30I、I49K、S82T和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T和F84L；
P29K、I49K、S82T、F84L和R107C；
P29K、I49K、S82T、F84L和G112H；
P29K、I49K、S82T、F84L和G115M；
P29K、I49K、S82T、F84L和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T和F84L；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27G、I49K、S82T和R107C；
E27G、I49K、S82T和G112H；
E27G、I49K、S82T和G115M；
E27G、I49K、S82T和A142E；
E27G、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27G、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27G、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27G、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27H、I49K和S82T；
E27H、I49K、S82T和R107C；
E27H、I49K、S82T和G112H；
E27H、I49K、S82T和G115M；
E27H、I49K、S82T和A142E；
E27H、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27H、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27H、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27H、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27H、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S和S82T；
E27S、S82T和R107C；
E27S、S82T和G112H；
E27S、S82T和G115M；
E27S、S82T和A142E；
E27S、S82T、R107C和G112H；
E27S、S82T、R107C和G115M；
E27S、S82T、R107C和A142E；
E27S、S82T、G112H和A142E；
E27S、S82T、G115M和A142E；
E27S、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A和S82T；
P29A、S82T和R107C；
P29A、S82T和G112H；
P29A、S82T和G115M；
P29A、S82T和A142E；
P29A、S82T、R107C和G112H；
P29A、S82T、R107C和G115M；
P29A、S82T、R107C和A142E；
P29A、S82T、G112H和A142E；
P29A、S82T、G115M和A142E；
P29A、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、V30I和S82T；
E27S、V30I、S82T和R107C；
E27S、V30I、S82T和G112H；
E27S、V30I、S82T和G115M；
E27S、V30I、S82T和A142E；
E27S、V30I、S82T、R107C和G112H；
E27S、V30I、S82T、R107C和G115M；
E27S、V30I、S82T、R107C和A142E；
E27S、V30I、S82T、G112H和A142E；
E27S、V30I、S82T、G115M和A142E；
E27S、V30I、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29A、V30I、S82T和F84L；
P29A、V30I、S82T、F84L和R107C；
P29A、V30I、S82T、F84L和G112H；
P29A、V30I、S82T、F84L和G115M；
P29A、V30I、S82T、F84L和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G112H；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G115M；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、G112H和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、G115M和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、P29A、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
V4K和A114C；
V4K和D77G；
F6Y、G100A和H122R；
V4T、I76R和H122G；
F6Y和I76W；
F6Y和D119N；
F6Y和A114C；
V4K、I76W和H122T；
F6G、I76R和G100K；
F6H和H122N；
F6Y、I76H、H122R和T166I；
R23Q和I76R；
I76H、H122R和A158V；
F6Y和T111H；
T111H、H122G和A162C；
F6Y和I76R；
T17W、I76H、H122G和A158V；
V4S、I76Y、A143E和Q159S；
N127I和A162Q；
E27H、Y76I、F84M和F149Y；
E27H、I49K、Y76I和F149Y；
T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L和F149Y；
T17A、A48G、S82T、A142E和F149Y；
E27G和F149Y；
E27G、I49N和F149Y；
E27H、Y76I、F84M、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
E27H、I49K、Y76I、Y147D、F149Y、T166I、D167N；
T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
T17A、A48G、S82T、A142E、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
E27G、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
E27G、I49N、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；以及
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；
以上改变属于与SEQ ID NO:1具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置。
9.如权利要求1-8中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述两个或更多个改变包括选自由以下组成的组的改变组合：
E27S、I49K和S82T；
E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；以及
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E。
10.如权利要求1-9中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述两个或更多个改变包括选自表1A至1F中任一个所列的那些的改变组合。
11.一种腺苷脱氨酶变体，所述腺苷脱氨酶变体包含与以下序列具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列中的一个或多个改变：
其中所述腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有增加的胞苷脱氨酶活性和/或增加的胞苷脱氨酶特异性，并且其中所述一个或多个改变不包括SEQ ID NO:1的位置48处的R氨基酸或另一腺苷脱氨酶中的相应改变。/>
12.一种腺苷脱氨酶变体，所述腺苷脱氨酶变体包含选自由与以下序列具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列的2、4、6、13、27、29、100、112、114、115、162和165组成的组的氨基酸位置处或另一腺苷脱氨酶中的相应位置处的一个或多个改变：
13.一种腺苷脱氨酶变体，所述腺苷脱氨酶变体包含选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸改变：与以下序列具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列的S2H、V4K、V4S、V4T、V4Y、F6G、F6H、F6Y、H8Q、R13G、T17A、T17W、R23Q、E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q、E27S、E27G、P29A、P29G、P29K、V30F、V30I、R47G、R47S、A48G、I49K、I49M、I49N、I49Q、I49T、G67W、I76H、I76R、I76W、Y76H、Y76R、Y76W、F84A、F84M、H96N、G100A、G100K、T111H、G112H、A114C、G115M、M118L、H122G、H122R、H122T、N127I、N127K、N127P、A142E、R147H、A158V、Q159S、A162C、A162N、A162Q和S165P：
或另一脱氨酶中的相应改变。
14.一种腺苷脱氨酶变体，所述腺苷脱氨酶变体包含选自由以下组成的组的氨基酸改变组合：
E27H、Y76I和F84M；
E27H、I49K和Y76I；
E27S、I49K、Y76I和A162N；
E27K和D119N；
E27H和Y76I；
E27S、I49K和G67W；
E27S、I49K和Y76I；
I49T、G67W和H96N；
E27C、Y76I和D119N；
R13G、E27Q和N127K；
T17A、E27H、I49M、Y76I和M118L；I49Q、Y76I和G115M；
S2H、I49K、Y76I和G112H；
R47S和R107C；
H8Q、I49Q和Y76I；
T17A、A48G、S82T和A142E；
E27G和I49N；
E27G、D77G和S165P；
E27S、I49K和S82T；
E27S、I49K、S82T和G115M；
E27S、V30I、I49K和S82T；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和A142E；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G112H和A142E；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L和R107C；
E27S、I49K、S82T、F84L和G112H；
E27S、I49K、S82T、F84L和G115M；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；
E27S、P29G、I49K和S82T；
E27S、P29G、I49K、S82T和G115M；
E27S、P29G、I49K、S82T和A142E；
P29G、I49K和S82T；
E27G、I49K和S82T；
E27G、I49K、S82T、R107C和A142E；
V4K、E27H、I49K、Y76I和A114C；
V4K、E27H、I49K、Y76I和D77G；
F6Y、E27H、I49K、Y76I、G100A和H122R；V4T、E27H、I49K、Y76R和H122G；
F6Y、E27H、I49K和Y76W；
F6Y、E27H、I49K、Y76I和D119N；
F6Y、E27H、I49K、Y76I和A114C；
F6Y、E27H、I49K和Y76I；
V4K、E27H、I49K、Y76W和H122T；
F6G、E27H、I49K、Y76R和G100K；
F6H、E27H、I49K、Y76I和H122N；
E27H、I49K、Y76I和A114C；
F6Y、E27H、I49K、Y76H、H122R和T166I；E27H、I49K、Y76I和N127P；
R23Q、E27H、I49K和Y76R；
E27H、I49K、Y76H、H122R和A158V；
F6Y、E27H、I49K、Y76I和T111H；
E27H、I49K、Y76I和R147H；
E27H、I49K、Y76I和A143E；
F6Y、E27H、I49K和Y76R；
T17W、E27H、I49K、Y76H、H122G和A158V；
V4S、E27H、I49K、A143E和Q159S；
E27H、I49K、Y76I、N127I和A162Q；
T17A、E27H和A48G；
T17A、E27K和A48G；
T17A、E27S和A48G；
T17A、E27S、A48G和I49K；
T17A、E27G和A48G；
T17A、A48G和I49N；
T17A、E27G、A48G和I49N；
T17A、E27Q和A48G；
E27S、I49K、S82T和R107C；
E27S、I49K、S82T和G112H；
E27S、I49K、S82T和A142E；
E27S、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T和R107C；
E27S、V30I、I49K、S82T和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、V30L、I49K和S82T；
E27S、V30L、I49K、S82T和R107C；
E27S、V30L、I49K、S82T和G112H；
E27S、V30L、I49K、S82T和G115M；
E27S、V30L、I49K、S82T和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、V30F、I49K、S82T和F84A；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和R107C；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G112H；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G115M；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和A142E；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G112H；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G115M；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T和F84L；
E27S、I49K、S82T、F84L和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T和R107C；
E27S、P29G、I49K、S82T和G112H；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29G、I49K、S82T和R107C；
P29G、I49K、S82T和G112H；
P29G、I49K、S82T和G115M；
P29G、I49K、S82T和A142E；
P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；
P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；
P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；
P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；
P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；
P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K和S82T；
P29K、I49K、S82T和R107C；
P29K、I49K、S82T和G112H；
P29K、I49K、S82T和G115M；
P29K、I49K、S82T和A142E；
P29K、I49K、S82T、R107C和G112H；
P29K、I49K、S82T、R107C和G115M；
P29K、I49K、S82T、R107C和A142E；
P29K、I49K、S82T、G112H和A142E；
P29K、I49K、S82T、G115M和A142E；
P29K、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、V30I、I49K和S82T；
P29K、V30I、I49K、S82T和R107C；
P29K、V30I、I49K、S82T和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29K、I49K、S82T和F84L；
P29K、I49K、S82T、F84L和R107C；
P29K、I49K、S82T、F84L和G112H；
P29K、I49K、S82T、F84L和G115M；
P29K、I49K、S82T、F84L和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T和F84L；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27G、I49K、S82T和R107C；
E27G、I49K、S82T和G112H；
E27G、I49K、S82T和G115M；
E27G、I49K、S82T和A142E；
E27G、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27G、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27G、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27G、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27H、I49K和S82T；
E27H、I49K、S82T和R107C；
E27H、I49K、S82T和G112H；
E27H、I49K、S82T和G115M；
E27H、I49K、S82T和A142E；
E27H、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27H、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27H、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27H、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27H、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S和S82T；
E27S、S82T和R107C；
E27S、S82T和G112H；
E27S、S82T和G115M；
E27S、S82T和A142E；
E27S、S82T、R107C和G112H；
E27S、S82T、R107C和G115M；
E27S、S82T、R107C和A142E；
E27S、S82T、G112H和A142E；
E27S、S82T、G115M和A142E；
E27S、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A和S82T；
P29A、S82T和R107C；
P29A、S82T和G112H；
P29A、S82T和G115M；
P29A、S82T和A142E；
P29A、S82T、R107C和G112H；
P29A、S82T、R107C和G115M；
P29A、S82T、R107C和A142E；
P29A、S82T、G112H和A142E；
P29A、S82T、G115M和A142E；
P29A、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I和S82T；
E27S、V30I、S82T和R107C；
E27S、V30I、S82T和G112H；
E27S、V30I、S82T和G115M；
E27S、V30I、S82T和A142E；
E27S、V30I、S82T、R107C和G112H；
E27S、V30I、S82T、R107C和G115M；
E27S、V30I、S82T、R107C和A142E；
E27S、V30I、S82T、G112H和A142E；
E27S、V30I、S82T、G115M和A142E；
E27S、V30I、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；P29A、V30I、S82T和F84L；
P29A、V30I、S82T、F84L和R107C；
P29A、V30I、S82T、F84L和G112H；
P29A、V30I、S82T、F84L和G115M；
P29A、V30I、S82T、F84L和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G112H；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G115M；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、G112H和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、G115M和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、P29A、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
V4K和A114C；
V4K和D77G；
F6Y、G100A和H122R；
V4T、I76R和H122G；
F6Y和I76W；
F6Y和D119N；
F6Y和A114C；
V4K、I76W和H122T；
F6G、I76R和G100K；
F6H和H122N；
F6Y、I76H、H122R和T166I；
R23Q和I76R；
I76H、H122R和A158V；
F6Y和T111H；
T111H、H122G和A162C；
F6Y和I76R；
T17W、I76H、H122G和A158V；
V4S、I76Y、A143E和Q159S；
N127I和A162Q；
E27H、Y76I、F84M和F149Y；
E27H、I49K、Y76I和F149Y；
T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L和F149Y；
T17A、A48G、S82T、A142E和F149Y；
E27G和F149Y；
E27G、I49N和F149Y；
E27H、Y76I、F84M、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
E27H、I49K、Y76I、Y147D、F149Y、T166I、D167N；
T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
T17A、A48G、S82T、A142E、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
E27G、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
E27G、I49N、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；以及
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；以上改变属于与以下序列具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列：
或另一腺苷脱氨酶中的相应改变组合。
15.一种腺苷脱氨酶变体，所述腺苷脱氨酶变体相对于参考腺苷脱氨酶具有增加的胞苷脱氨酶活性和/或增加的胞苷脱氨酶特异性，其中所述腺苷脱氨酶变体相对于所述参考腺苷脱氨酶包含有包含氨基酸残基82-84的A区、包含氨基酸残基27-30和47-49的B区、包含残基107-115的C区中的一个或多个或包含残基139-167的C端螺旋中的改变：
16.如权利要求15所述的腺苷脱氨酶变体，其中包含所述改变的所述腺苷脱氨酶变体与SEQ ID NO.1具有至少约70％或更高氨基酸序列同一性。
17.如权利要求15或权利要求16所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述A区中的改变改变了所述脱氨酶的活性位点。
18.如权利要求15-17中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述B区中的改变是在包含残基25-30的环1、包含残基46-47的环3或包含残基48-51的螺旋2中的一个或多个中。
19.如权利要求15-18中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述改变是在环1中。
20.如权利要求15-18中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述改变是在环3中。
21.如权利要求15-18中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述改变是在包含残基139-167的C端螺旋中。
22.如权利要求21所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述改变与所述螺旋的解旋相关。
23.如权利要求22所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述螺旋的解旋是在残基145-155之间。
24.如权利要求22或权利要求23所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述螺旋的解旋是在约残基150处。
25.如权利要求1-24中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体缺乏显著的腺苷脱氨酶活性。
26.如权利要求1-24中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体缺乏可检测的腺苷脱氨酶活性。
27.如权利要求11-14中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述一个或多个改变包括选自由以下组成的组的改变组合：
E27S、I49K和S82T；
E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；以及
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E。
28.如权利要求1-27中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述两个或更多个改变包括选自表1A至1F中任一个所列的那些的改变组合。
29.如权利要求1-27中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中相对于参考腺苷脱氨酶，所述一个或多个改变增加胞苷脱氨酶活性和/或胞苷脱氨酶特异性。
30.如权利要求1-29中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体是TadA脱氨酶变体或其片段。
31.如权利要求30所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述TadA脱氨酶或其片段是细菌TadA脱氨酶。
32.如权利要求1-31中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体包含选自由以下组成的组的改变组合：与SEQ ID NO:1具有至少约70％或更高同一性的氨基酸序列的E27H、Y76I和F84M；以及E27H、I49K和Y76I，或另一腺苷脱氨酶中的相应改变组合。
33.如权利要求1-32中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体还包含SEQ ID NO.1的氨基酸位置166处的R。
34.如权利要求12-33中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体不包含SEQ ID NO:1的位置48处的R氨基酸。
35.如权利要求1-34中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体表现出增加的胞苷脱氨酶活性和/或胞苷脱氨酶特异性，其为参考腺苷脱氨酶的至少约30倍或更多倍。
36.如权利要求1-35中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体表现出增加的胞苷脱氨酶活性和/或胞苷脱氨酶特异性，其为参考腺苷脱氨酶的至少约50倍或更多倍。
37.如权利要求1-36中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体表现出增加的胞苷脱氨酶活性和/或胞苷脱氨酶特异性，其为参考腺苷脱氨酶的至少约70倍或更多倍。
38.如权利要求1-37中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约30％或更多。
39.如权利要求1-38中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约50％或更多。
40.如权利要求1-39中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体保持参考腺苷脱氨酶的腺苷脱氨酶活性的至少约70％或更多。
41.如权利要求1-40中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述参考腺苷脱氨酶为TadA*8.20或TadA*8.19。
42.如权利要求1-40中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体能够使单链或双链靶多核苷酸中的胞苷和腺嘌呤脱氨。
43.如权利要求42所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述靶多核苷酸为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。
44.如权利要求1-43中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述腺苷脱氨酶变体的胞苷脱氨活性与腺嘌呤脱氨活性比率为至少约1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
45.如权利要求1-44中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中相对于参考腺苷脱氨酶，所述改变增加了使胞苷脱氨的选择性。
46.如权利要求1-45中任一项所述的腺苷脱氨酶变体，其中所述改变不在选自由以下组成的组的氨基酸位置处：30、47-49、82-84、107-111、139、142、143、146-149、151-161、166和167；或不是选自由以下组成的组的改变：V30I、V30L、V30、R47F、R47M、R47Q、R47W、P48A、P48D、P48E、P48H、P48K、P48L、P48R、P48S、P48T、I49V、V82G、V82S、V82T、L84F、L84I、R107A、R107C、R107H、R107K、R107N、R107P、D108A、D108E、D108F、D108G、D108I、D108K、D108L、D108M、D108N、D108Q、D108S、D108V、D108W、D108Y、A109S、K110I、T111R、D139L、D139M、A142N、A143D、A143E、A143G、A143L、S146C、S146R、S146T、D147A、D147R、D147T、D147Y、F148A、F149A、F149N、F149Y、M151V、R152H、R152P、R153C、Q154H、Q154L、Q154R、Q154S、E155D、E155G、E155V、I156D、I156F、I156Y、K157N、A158K、Q159L、K160E、K161T、T166I、T166R和D167N。
47.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含多核苷酸可编程DNA结合结构域和如权利要求1-46中任一项所述的腺苷脱氨酶变体。
48.如权利要求47所述的融合蛋白，其中所述多核苷酸可编程DNA结合结构域为Cas9、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i或Cas12j/CasΦ结构域。
49.如权利要求47或48所述的融合蛋白，其中所述多核苷酸可编程DNA结合结构域为金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、嗜热链球菌1Cas9(St1Cas9)、化脓性链球菌Cas9(SpCas9)或其变体。
50.如权利要求49所述的融合蛋白，其中所述多核苷酸可编程DNA结合结构域包含具有改变的原型间隔区相邻基序(PAM)特异性的修饰的SaCas9。
51.如权利要求50所述的融合蛋白，其中所述多核苷酸可编程DNA结合结构域包含具有改变的原型间隔区相邻基序(PAM)特异性的SpCas9变体。
52.如权利要求47-51中任一项所述的融合蛋白，其中所述多核苷酸可编程DNA结合结构域为无核酸酶活性变体或切口酶变体。
53.如权利要求47-51中任一项所述的融合蛋白，其包含所述多核苷酸可编程DNA结合结构域和所述脱氨酶结构域之间的接头。
54.如权利要求47-51中任一项所述的融合蛋白，其包含一个或多个核定位信号。
55.如权利要求47-54中任一项所述的融合蛋白，其包含一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)结构域。
56.一种多分子复合物，所述多分子复合物包含多核苷酸可编程DNA结合蛋白、如权利要求1-55中任一项所述的腺苷脱氨酶变体和指导RNA。
57.一种碱基编辑器系统，所述碱基编辑器系统包含如权利要求1-46中任一项所述的腺苷脱氨酶变体、多核苷酸可编程DNA结合蛋白和一种或多种指导多核苷酸，其中所述碱基编辑器系统实现靶多核苷酸中的A到G和C到T编辑。
58.一种碱基编辑器系统，所述碱基编辑器系统包含如权利要求47-56中任一项所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸，其中所述碱基编辑器系统实现靶多核苷酸中的A到G和C到T编辑。
59.如权利要求57或权利要求58所述的碱基编辑器系统，其中所述碱基编辑器系统具有增加的C到T碱基编辑活性，其相对于参考碱基编辑器系统的C到T碱基编辑活性为至少约30倍。
60.如权利要求57-59中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述碱基编辑器系统具有增加的C到T碱基编辑活性，其相对于参考碱基编辑器系统的C到T碱基编辑活性为至少约50倍。
61.如权利要求57-59中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述碱基编辑器系统具有增加的C到T碱基编辑活性，其相对于参考碱基编辑器系统的C到T碱基编辑活性为至少约70倍。
62.如权利要求57-61中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统活性的至少约30％。
63.如权利要求57-61中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统活性的至少约50％。
64.如权利要求57-63中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述碱基编辑器系统保持A到G碱基编辑活性为参考碱基编辑器系统活性的至少约70％。
65.如权利要求57-64中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述碱基编辑器系统在所述靶多核苷酸中具有至少约30％的C到T编辑活性。
66.如权利要求57-65中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述碱基编辑器系统在所述靶多核苷酸中具有至少约50％的C到T编辑活性。
67.如权利要求57-66中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述碱基编辑器系统在所述靶多核苷酸中具有至少约70％的C到T编辑活性。
68.如权利要求57-66中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述参考碱基编辑器系统为ABE8.20、ABE8.19、B93、B88、变体1.17(表1A)或变体1.2(表1A)。
69.如权利要求57-66中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述靶多核苷酸为双链或单链。
70.如权利要求57-66中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述靶多核苷酸为DNA或RNA。
71.如权利要求57-70中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述靶多核苷酸是在细胞基因组中。
72.如权利要求57-71中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述靶多核苷酸中的所述A到G和/或所述C到T编辑与遗传疾病相关。
73.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1-37中任一项所述的腺苷脱氨酶变体、如权利要求38-55中任一项所述的融合蛋白、如权利要求56所述的多分子复合物或如权利要求57-71中任一项所述的碱基编辑器系统。
74.一种载体，所述载体包含如权利要求73所述的多核苷酸。
75.如权利要求74所述的载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体。
76.如权利要求74或权利要求75所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
77.如权利要求76所述的载体，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体和疱疹病毒载体。
78.如权利要求74-77中任一项所述的载体，其中所述载体包含启动子。
79.一种细胞，所述细胞包含如权利要求74-78中任一项所述的载体。
80.如权利要求79所述的细胞，其中所述细胞为人细胞。
81.如权利要求79或80所述的细胞，其中所述细胞是在体外。
82.如权利要求79或80所述的方法，其中所述细胞是在体内。
83.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-37中任一项所述的腺苷脱氨酶变体、如权利要求38-55中任一项所述的融合蛋白、如权利要求56所述的多分子复合物或如权利要求57-71中任一项所述的碱基编辑器系统或如权利要求79-82中任一项所述的细胞。
84.如权利要求83所述的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
85.一种编辑细胞基因组的方法，所述方法包括：
使细胞中的靶多核苷酸序列与如权利要求38-55中任一项所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸接触，并在所述细胞基因组中生成一个或多个改变，从而编辑所述细胞基因组。
86.一种编辑细胞基因组的方法，所述方法包括：
使生物体的细胞中的靶多核苷酸序列与如权利要求56所述的多分子复合物或如权利要求57-71中任一项所述的碱基编辑器系统接触，并在所述细胞基因组中生成一个或多个改变，从而编辑所述细胞基因组。
87.如权利要求85或权利要求86所述的方法，其中所述细胞是体外或体内细胞。
88.如权利要求85-86中任一项所述的方法，其中所述细胞为细菌、酵母、真菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
89.一种治疗受试者的遗传疾病或病症的方法，所述方法包括：
使所述受试者的细胞中的靶多核苷酸与如权利要求38-55中任一项所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸接触，并在所述细胞基因组中生成一个或多个改变，从而治疗所述受试者的所述遗传疾病或病症。
90.一种治疗受试者的遗传疾病或病症的方法，所述方法包括：
向所述受试者的细胞施用如权利要求56所述的多分子复合物、如权利要求57-71中任一项所述的碱基编辑器系统、如权利要求74-78中任一项所述的载体、如权利要求79-82中任一项所述的细胞或如权利要求83或84所述的组合物，并在所述细胞基因组中生成一个或多个改变，从而治疗所述受试者的所述遗传疾病或病症。
91.如权利要求89或权利要求90所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
93.一种用于在靶多核苷酸中将C编辑为T的方法，所述方法包括使靶多核苷酸与如权利要求38-55中任一项所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸接触，从而编辑所述靶多核苷酸。
94.一种用于在靶多核苷酸中将C编辑为T的方法，所述方法包括使靶多核苷酸序列与如权利要求56所述的多分子复合物或如权利要求57-71中任一项所述的碱基编辑器系统接触，从而编辑所述靶多核苷酸。
95.一种用于将A到G和/或C到T编辑引入到细胞基因组中的方法，所述方法包括将如权利要求38-55中任一项所述的融合蛋白和在所述细胞基因组中实现A到G编辑、C到T编辑或其组合的指导多核苷酸引入到细胞中。
96.一种用于将A到G和/或C到T编辑引入到细胞基因组中的方法，所述方法包括将如权利要求56所述的多分子复合物或如权利要求57-71中任一项所述的碱基编辑器系统引入到细胞中以在所述细胞基因组中实现A到G编辑、C到T编辑或其组合。
97.一种用于在多核苷酸中校正单核苷酸多态性(SNP)的方法，所述方法包括使靶多核苷酸与如权利要求38-55中任一项所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸接触，从而通过使所述SNP或其互补核碱基脱氨来编辑所述SNP。
98.一种用于在多核苷酸中校正单核苷酸多态性(SNP)的方法，所述方法包括使靶多核苷酸序列与如权利要求56所述的多分子复合物或如权利要求57-71中任一项所述的碱基编辑器系统接触，从而通过使所述SNP或其互补核碱基脱氨来编辑所述SNP。
99.一种编辑存在于细胞基因组中的调节序列的方法，所述方法包括使调节序列与如权利要求38-55中任一项所述的融合蛋白和一种或多种指导多核苷酸接触，从而编辑所述调节序列。
100.一种编辑存在于细胞基因组中的调节序列的方法，所述方法包括使调节序列与如权利要求56所述的多分子复合物或如权利要求57-71中任一项所述的碱基编辑器系统接触，从而编辑所述调节序列。
101.一种产生具有增加的胞苷脱氨酶活性和/或胞苷脱氨酶特异性的腺苷脱氨酶变体的方法，所述方法包括在与以下序列具有至少70％氨基酸同一性的氨基酸序列中生成一个或多个改变：
其中所述一个或多个改变选自由以下组成的组：S2H、V4K、V4S、V4T、V4Y、F6G、F6H、F6Y、H8Q、R13G、T17A、T17W、R23Q、E27C、E27G、E27H、E27K、E27Q、E27S、E27G、P29A、P29G、P29K、V30F、V30I、R47G、R47S、A48G、I49K、I49M、I49N、I49Q、I49T、G67W、I76H、I76R、I76W、Y76H、Y76R、Y76W、F84A、F84M、H96N、G100A、G100K、T111H、G112H、A114C、G115M、M118L、H122G、H122R、H122T、N127I、N127K、N127P、A142E、R147H、A158V、Q159S、A162C、A162N、A162Q和S165P，或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置的所述改变。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述一个或多个改变包括选自由以下组成的组的改变组合：
E27H、Y76I和F84M；
E27H、I49K和Y76I；
E27S、I49K和Y76I；
E27S、I49K、Y76I和A162N；
E27K和D119N；
E27H和Y76I；
E27S、I49K和G67W；
I49T、G67W和H96N；
E27C、Y76I和D119N；
R13G、E27Q和N127K；
T17A、E27H、I49M、Y76I和M118L；
I49Q、Y76I和G115M；
S2H、I49K、Y76I和G112H；
R47S和R107C；
H8Q、I49Q和Y76I；
T17A、A48G、S82T和A142E；
E27G和I49N；
E27G、D77G和S165P；
E27S、I49K和S82T；
E27S、I49K、S82T和G115M；
E27S、V30I、I49K和S82T；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G112H和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、G115M和A142E；E27S、I49K、S82T、F84L和R107C；
E27S、I49K、S82T、F84L和G112H；
E27S、I49K、S82T、F84L和G115M；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；
E27S、P29G、I49K和S82T；
E27S、P29G、I49K、S82T和G115M；
E27S、P29G、I49K、S82T和A142E；
P29G、I49K和S82T；
E27G、I49K和S82T；
E27G、I49K、S82T、R107C和A142E；
V4K、E27H、I49K、Y76I和A114C；
V4K、E27H、I49K、Y76I和D77G；
F6Y、E27H、I49K、Y76I、G100A和H122R；
V4T、E27H、I49K、Y76R和H122G；
F6Y、E27H、I49K和Y76W；
F6Y、E27H、I49K、Y76I和D119N；
F6Y、E27H、I49K、Y76I和A114C；
F6Y、E27H、I49K和Y76I；
V4K、E27H、I49K、Y76W和H122T；
F6G、E27H、I49K、Y76R和G100K；
F6H、E27H、I49K、Y76I和H122N；
E27H、I49K、Y76I和A114C；
F6Y、E27H、I49K、Y76H、H122R和T166I；E27H、I49K、Y76I和N127P；
R23Q、E27H、I49K和Y76R；
E27H、I49K、Y76H、H122R和A158V；
F6Y、E27H、I49K、Y76I和T111H；
E27H、I49K、Y76I和R147H；
E27H、I49K、Y76I和A143E；
F6Y、E27H、I49K和Y76R；
T17W、E27H、I49K、Y76H、H122G和A158V；V4S、E27H、I49K、A143E和Q159S；
E27H、I49K、Y76I、N127I和A162Q；
T17A、E27H和A48G；
T17A、E27K和A48G；
T17A、E27S和A48G；
T17A、E27S、A48G和I49K；
T17A、E27G和A48G；
T17A、A48G和I49N；
T17A、E27G、A48G和I49N；
T17A、E27Q和A48G；
E27S、I49K、S82T和R107C；
E27S、I49K、S82T和G112H；
E27S、I49K、S82T和A142E；
E27S、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30I、I49K、S82T和R107C；
E27S、V30I、I49K、S82T和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30L、I49K和S82T；
E27S、V30L、I49K、S82T和R107C；
E27S、V30L、I49K、S82T和G112H；
E27S、V30L、I49K、S82T和G115M；
E27S、V30L、I49K、S82T和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、V30L、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S、V30F、I49K、S82T和F84A；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和R107C；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G112H；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和G115M；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A和A142E；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G112H；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C和G115M；
E27S、V30F、I49K、S82T、F84A、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、I49K、S82T和F84L；
E27S、I49K、S82T、F84L和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
E27S、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T和R107C；
E27S、P29G、I49K、S82T和G112H；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27S、P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29G、I49K、S82T和R107C；
P29G、I49K、S82T和G112H；
P29G、I49K、S82T和G115M；
P29G、I49K、S82T和A142E；
P29G、I49K、S82T、R107C和G112H；
P29G、I49K、S82T、R107C和G115M；
P29G、I49K、S82T、R107C和A142E；
P29G、I49K、S82T、G112H和A142E；
P29G、I49K、S82T、G115M和A142E；
P29G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29K、I49K和S82T；
P29K、I49K、S82T和R107C；
P29K、I49K、S82T和G112H；
P29K、I49K、S82T和G115M；
P29K、I49K、S82T和A142E；
P29K、I49K、S82T、R107C和G112H；
P29K、I49K、S82T、R107C和G115M；
P29K、I49K、S82T、R107C和A142E；
P29K、I49K、S82T、G112H和A142E；
P29K、I49K、S82T、G115M和A142E；
P29K、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K和S82T；
P29K、V30I、I49K、S82T和R107C；
P29K、V30I、I49K、S82T和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、G112H和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29K、I49K、S82T和F84L；
P29K、I49K、S82T、F84L和R107C；
P29K、I49K、S82T、F84L和G112H；
P29K、I49K、S82T、F84L和G115M；
P29K、I49K、S82T、F84L和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
P29K、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T和F84L；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和R107C；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G112H；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和G115M；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G112H和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、G115M和A142E；
P29K、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27G、I49K、S82T和R107C；
E27G、I49K、S82T和G112H；
E27G、I49K、S82T和G115M；
E27G、I49K、S82T和A142E；
E27G、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27G、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27G、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27G、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27G、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27H、I49K和S82T；
E27H、I49K、S82T和R107C；
E27H、I49K、S82T和G112H；
E27H、I49K、S82T和G115M；
E27H、I49K、S82T和A142E；
E27H、I49K、S82T、R107C和G112H；
E27H、I49K、S82T、R107C和G115M；
E27H、I49K、S82T、R107C和A142E；
E27H、I49K、S82T、G112H和A142E；
E27H、I49K、S82T、G115M和A142E；
E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；E27S和S82T；
E27S、S82T和R107C；
E27S、S82T和G112H；
E27S、S82T和G115M；
E27S、S82T和A142E；
E27S、S82T、R107C和G112H；
E27S、S82T、R107C和G115M；
E27S、S82T、R107C和A142E；
E27S、S82T、G112H和A142E；
E27S、S82T、G115M和A142E；
E27S、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29A和S82T；
P29A、S82T和R107C；
P29A、S82T和G112H；
P29A、S82T和G115M；
P29A、S82T和A142E；
P29A、S82T、R107C和G112H；
P29A、S82T、R107C和G115M；
P29A、S82T、R107C和A142E；
P29A、S82T、G112H和A142E；
P29A、S82T、G115M和A142E；
P29A、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、V30I和S82T；
E27S、V30I、S82T和R107C；
E27S、V30I、S82T和G112H；
E27S、V30I、S82T和G115M；
E27S、V30I、S82T和A142E；
E27S、V30I、S82T、R107C和G112H；
E27S、V30I、S82T、R107C和G115M；
E27S、V30I、S82T、R107C和A142E；
E27S、V30I、S82T、G112H和A142E；
E27S、V30I、S82T、G115M和A142E；
E27S、V30I、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
P29A、V30I、S82T和F84L；
P29A、V30I、S82T、F84L和R107C；
P29A、V30I、S82T、F84L和G112H；
P29A、V30I、S82T、F84L和G115M；
P29A、V30I、S82T、F84L和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G112H；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和G115M；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、G112H和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、G115M和A142E；
P29A、V30I、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
E27S、P29A、V30I、I49K、S82T、F84L、R107C、G112H、G115M和A142E；
V4K和A114C；
V4K和D77G；
F6Y、G100A和H122R；
V4T、I76R和H122G；
F6Y和I76W；
F6Y和D119N；
F6Y和A114C；
V4K、I76W和H122T；
F6G、I76R和G100K；
F6H和H122N；
F6Y、I76H、H122R和T166I；
R23Q和I76R；
I76H、H122R和A158V；
F6Y和T111H；
T111H、H122G和A162C；
F6Y和I76R；
T17W、I76H、H122G和A158V；
V4S、I76Y、A143E和Q159S；
N127I和A162Q；
E27H、Y76I、F84M和F149Y；
E27H、I49K、Y76I和F149Y；
T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L和F149Y；
T17A、A48G、S82T、A142E和F149Y；
E27G和F149Y；
E27G、I49N和F149Y；
E27H、Y76I、F84M、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
E27H、I49K、Y76I、Y147D、F149Y、T166I、D167N；
T17A、E27H、I49M、Y76I、M118L、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
T17A、A48G、S82T、A142E、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
E27G、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
E27G、I49N、Y147D、F149Y、T166I和D167N；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P、A142E和A143E；以及
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、D119N、H122G、N127P和A143E；或另一腺苷脱氨酶中的相应氨基酸位置的所述改变组合。
103.如权利要求101或权利要求102所述的方法，其中所述一个或多个改变包括选自由以下组成的组的改变组合：
E27S、I49K和S82T；
E27S、V30I、I49K、S82T和F84L；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、S82T、R107C、G112H、G115M和A142E；
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G和A142E；以及
F6Y、E27H、I49K、Y76W、D77G、S82T、R107C、G112H、A114C、G115M、H122G、N127P和A142E。
104.如权利要求101-103中任一项所述的方法，其中所述一个或多个改变包括选自表1A至1F中任一个所列的那些的改变组合。
105.一种腺苷脱氨酶变体，所述腺苷脱氨酶变体由如权利要求101-104中任一项所述的方法产生。
106.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求38-55中任一项所述的融合蛋白、如权利要求56所述的多分子复合物或如权利要求57-71中任一项所述的碱基编辑器系统、如权利要求73所述的多核苷酸、如权利要求74-78中任一项所述的载体、如权利要求79-82中任一项所述的细胞或如权利要求83或84所述的组合物，以及其在碱基编辑中的使用说明书。
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