WO2022119295A1 - 티민-사이토신 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위 및 이의 용도 - Google Patents

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정유경
이석훈
우재성
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고려대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a thymine-cytosine sequence-specific cytosine sequence-specific cytosine editing activity, adenine nucleotide correction gene scissors, a thymine-cytosine sequence-specific cytosine sequence-specific cytosine nucleotide correction composition comprising the gene scissors and guide RNA, cytosine nucleotide correction It relates to a method and a kit for cytosine base correction.
  • Adenine base editors are effective gene editing tools that can convert A/T pairs to G/C pairs without generating DNA double-strand breaks (DSBs) or requiring donor DNA templates. . These technologies are being used to correct bases not only at the cellular level but also in plants or animals, and verification and development are being actively carried out so that they can be used for gene therapy.
  • the early practical version of the ABE (ABE7.10) consisted of three fused elements.
  • RNA RNA-specific adenosine deaminase
  • wtTadA Escherichia coli
  • eTadA engineered TadA
  • sgRNA genome-wide guide RNA
  • sgRNA genome-wide guide RNA
  • transcript-wide sgRNA-independent off-target RNA editing transcript-wide sgRNA-independent off-target RNA editing
  • ABE-mediated cytosine deamination effect at off-target sites etc. This has been reported The first off-target effect is caused by the imperfect target specificity of Cas nuclease, and the other two off-target effects are due to the DNA/RNA-binding properties of adenosine deaminase.
  • cytosine base editors are effective gene editing tools known to be capable of replacing cytosine with thymine without generating DNA double-strand breaks (DSBs) or using a donor DNA template.
  • DSBs DNA double-strand breaks
  • the cytosine base editing gene has a wide operating range (position 3 to 9), there is a problem that correction occurs even at unwanted bases, and there is a problem that is not suitable for substituting cytosine with a base other than thymine.
  • a key mutation capable of improving cytosine catalysis in adenosine deamination enzyme was discovered and a gene scissors capable of efficient and sophisticated cytosine correction was developed.
  • the present inventors rationally design and test dozens of TadA variants in order to develop gene scissors for more efficient and sophisticated cytosine base correction, and have identified mutations that improve cytosine correction activity. Based on this, the present invention was completed. did
  • an object of the present invention is to provide an adenine base editor with enhanced thymine-cytosine (T-C) sequence-specific cytosine editing activity.
  • the present invention is the adenine base correction gene scissors; and guide RNA (single guide RNA; sgRNA), including, thymine-cytosine (T-C) sequence-specific cytosine base correction composition for another object.
  • guide RNA single guide RNA; sgRNA
  • T-C thymine-cytosine
  • Another object of the present invention is to provide a thymine-cytosine (TC) sequence-specific cytosine base correction method comprising the step of contacting the composition with a target sequence in vitro .
  • TC thymine-cytosine
  • T-C thymine-cytosine
  • the present invention is adenosine deaminase (Adenosine deaminase) variant comprising a P48R mutation; and Cas9 (CRISPR associated protein 9) protein fused, thymine-cytosine (T-C) provides an adenine base editor with enhanced sequence-specific cytosine editing activity (Adenine Base Editor).
  • Adenosine deaminase adenosine deaminase
  • Cas9 CRISPR associated protein 9 protein fused, thymine-cytosine
  • the adenosine deamination enzyme may be TadA7.10.
  • the gene scissors may be a mutation introduced into ABEmax.
  • the gene scissors may be one in which one or more uracil DNA glycosylase (UGI) is additionally linked.
  • UMI uracil DNA glycosylase
  • the present invention is the adenine base correction gene scissors.
  • composition for thymine-cytosine (T-C) sequence-specific cytosine base correction including a guide RNA (single guide RNA; sgRNA).
  • the cytosine may be a cytosine (C) located at the 5th to 7th positions from the 5' end of the target sequence.
  • the composition may be to substitute thymine (T) or guanine (G) for cytosine (C) positioned immediately after thymine (T) on the target sequence depending on the presence or absence of UGI.
  • the present invention provides a thymine-cytosine (TC) sequence-specific cytosine base correction method comprising the step of contacting the composition with a target sequence in vitro .
  • TC thymine-cytosine
  • thymine-cytosine provides a kit for sequence-specific cytosine base correction.
  • the T-C sequence-specific cytosine correction activity is enhanced, and the adenine base editing gene is produced by introducing the P48R mutation to an adenosine deaminase, and a more sophisticated operating range than the conventional cytosine base editing gene scissors. Since cytosine correction occurs only when thymine is located immediately before cytosine, sophisticated correction is possible even when there are several cytosines within the range. By adding UGI, cytosine can be substituted with thymine, In some cases, cytosine may be substituted with guanine.
  • composition for cytosine base editing comprising cytosine base editing gene scissors and sgRNA according to the present invention is a gene therapy field or a new crop that needs to accurately correct only cytosine in all living things including humans, plants, and bacteria It will be useful in the field of development, etc.
  • Figure 1 graphically depicts a schematic of targeted adenine and cytosine calibration mediated by the catalytic activity of ABE.
  • Figure 2 is a graph showing the nucleotide correction efficiency of each of A4 and C6 of ABE at FANCF and RNF2 positions and adenosine deaminase (left) included in various adenine base correction gene scissors (right).
  • FIG. 3 is a result of analyzing the amino acid sequence of adenosine deamination enzyme (TadA) and its structure.
  • Fig. 3b shows the results of superimposing the apo structure derived from E. coli (green; PDB code 1Z3A) on the RNA-bound saTadA single structure (pink and gray; PDB code 2B3J).
  • FIG. 4 is a heat map result analyzing the adenine and cytosine correction efficiency induced by 33 ABE variants at the FANCF and RNF2 positions (left) and the accuracy value obtained by dividing the adenine correction efficiency by the cytosine correction efficiency as a graph. (right).
  • Figure 5 shows the conventionally known cytosine base correction gene scissors (CBE and CBE ( ⁇ UGI)), adenine base correction gene scissors (ABEmax and ABEmax-UGI) and adenine base correction gene scissors (ABE-P48R and P48R mutations) This is a diagram showing the components of ABE-P48R-UGI).
  • FIG. 6 is a heat map showing the substitution of bases for the target site of the CSRNP3 gene by performing high-throughput sequencing after transfecting cells with each of the nucleotide-correcting gene scissors of FIG. 5 .
  • Figure 7 is a high-throughput sequencing analysis after transfecting each of the base-correcting gene scissors of Figure 5 into cells, and the cytosine of each TC motif of the four endogenous genes ( FANCF , RNF2 , ABLIM3 and CSRNP3 ) is substituted with a certain tendency. This is the result of analyzing and showing whether or not
  • Figure 8 is adenine base editing scissors (ABEmax and ABEmax-UGI) and P48R mutation introduced adenine base editing scissors (ABE-P48R and ABE-P48R-UGI) cytosine correction of TC motif after transfection into cells It is the result of confirming the effect according to the position of cytosine.
  • ABEmax and ABEmax-UGI adenine base editing scissors
  • ABE-P48R and ABE-P48R-UGI adenine base editing scissors
  • 10 is a diagram showing the number of diseases caused by substitution of thymine with cytosine and diseases caused by substitution of guanine with cytosine using the ClinVar database.
  • Figure 11 shows the cytosine correction efficiency after transfecting ABE-P48R-UGI and CBE (AncBE4max) of the present invention into a cell line that mimics the genetic mutation of a missense mutation-related disease of the TUBB6 gene in which the TT sequence is mutated to TC. It is the result of comparing the possibility of treatment by measuring.
  • the present inventors have identified a major mutation that significantly reduced adenine base editing activity and enhanced cytosine editing activity in adenine base editing gene scissors, and introduced the mutation into adenosine deaminase to specifically cytosine-cytosine sequence.
  • Adenine base-correcting gene scissors with improved renal-correcting activity were prepared.
  • the present invention provides an adenosine deaminase variant comprising a P48R mutation
  • adenine base editor (Adenine Base Editor) in which Cas9 (CRISPR associated protein 9) protein is fused, thymine-cytosine (T-C) sequence-specific cytosine editing activity is enhanced.
  • Cas9 CRISPR associated protein 9
  • T-C thymine-cytosine
  • Base Editors is a single base editing means, more specifically, adenosine deaminase or cytosine deamination enzyme Cas9 nickase (nickase) It is constructed by fusion to the N-terminus, and is named Adenine Base Editors (ABEs) and Cytosine Base Editors (CBEs), respectively.
  • ABEs Adenine Base Editors
  • CBEs Cytosine Base Editors
  • ABEs Adenine Base Editors
  • ecTadA any naturally occurring deamination enzyme
  • adenosine deamination enzyme variant It is constructed by fusing ecTadA*) to the N-terminus of Cas9 nickase
  • the types of ABEs include ABE6.3, ABE7.8, ABE7.9, ABE 7.10 depending on the type or mutation of the adenosine deaminase. , ABEmax, ABEmax-m, SECURE-ABE, ABE8e, ABE8e-V106W, ABE8.17-m, etc., but are not limited thereto, and may be referred to as “ABEs”.
  • the adenine base correction gene scissors may have improved specificity or accuracy for adenine base correction, and have the characteristics of significantly increasing the cytosine editing activity specifically for the thymine-cytosine sequence.
  • the mutation may be induced in the ABEmax version, but is not limited thereto.
  • adenosine deaminase is an enzyme that removes an amino group from adenine and is involved in the production of hypoxanthine. It is reported that the enzyme is rarely found in higher animals, but is present in small amounts in the muscles of cows, milk, and blood of mice, and exists in large amounts in the intestines of crayfish and insects.
  • the adenosine deaminase may include a naturally occurring adenosine deaminase such as ecTadA or a variant of an adenosine deaminase such as a mutant (ecTadA*) of ecTadA, preferably the variant is TadA7.10, TadA8e, TadA8s, TadA8.20 or TadA8.17 may be included, and in the present invention, TadA7.10 is used, but is not limited thereto.
  • Cas9 CRISPR associated protein 9 protein
  • CRISPR-Cas9 recognizes, cuts, and edits a specific nucleotide sequence to be used as a third-generation gene scissors, and inserts a specific gene into the target site of the genome or stops the activity of a specific gene simply, quickly and efficiently It is useful to carry out Cas9 protein or gene information may be obtained from a known database such as GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), but is not limited thereto.
  • the Cas9 protein may include all variants of Cas9 as long as it has the function of a nuclease for gene editing as well as wild-type Cas9.
  • the Cas9 protein in the present invention is not limited in its origin, as a non-limiting example Streptococcus pyogenes , Francisella novicida ( Francisella novicida ), Streptococcus thermophilus ( Streptococcus thermophilus ), Legionella It may be derived from Pneumophila ( Legionella pneumophila ), Listeria innocua , or Streptococcus mutans , but preferably from Streptococcus pyogenes ).
  • the gene scissors may be one in which one or more uracil DNA glycosylase (UGI) is additionally linked, and preferably, two UGIs are additionally linked.
  • UGI also referred to as UNG or UDG, serves to hydrolyze the N-glycosylic bond between the deoxyribose sugar of DNA including uracil and the uracil base to create a depilimidine site. It is known that the enzyme hydrolyzes single-stranded DNA and double-stranded DNA including uracil, but does not act on RNA.
  • the present inventors confirmed that the T-C sequence-specific cytosine editing activity was improved in the improved adenine base editing gene scissors according to the present invention through specific examples.
  • the sequence and tertiary structural analysis of the homologous protein of TadA to investigate mutations that may affect the removal of cytosine-correcting activity through the distinction between adenine and cytosine in adenosine deaminase Based on this, variants in which various candidate mutations were introduced into TadA7.10 of ABEmax or ABEmax-m, respectively, were prepared and the adenine and cytosine correction efficiency at the target site in HEK293T cells was analyzed.
  • the conventionally known cytosine base correction gene scissors CBE and CBE( ⁇ UGI)
  • adenine base correction gene scissors ABEmax, ABEmax-UGI
  • P48R mutations of the present invention produced by introducing
  • ABE-P48R, ABE-P48R-UGI modified adenine base editing scissors
  • ABE-P48R, ABE-P48R-UGI modified adenine base editing scissors
  • the improved version according to the present invention In the case of adenine base correction gene scissors (ABE-P48R, ABE-P48R-UGI), it was confirmed that the cytosine located at the 6th position from the 5' end was replaced with high efficiency, mainly immediately after thymine, not adenine (Example 4) Reference).
  • a cell line mimicking a missense mutation of the TUBB6 gene in which the TT sequence is mutated to TC respectively, and Cytosine correction efficiency after transfection of ABE-P48R-UGI and CBE (AncBE4max), or ABE-P48R and CBE (AncBE4max) of the present invention into a cell line mimicking the missense mutation of the TPO gene in which the TG sequence is mutated to TC was measured.
  • the sophisticated cytosine correction function of ABE-P48R-UGI and ABE-P48R was confirmed compared to CBE, respectively, and the therapeutic potential for genetic diseases was confirmed through this (see Example 5).
  • the present invention provides the adenine base correction gene scissors.
  • composition for thymine-cytosine (T-C) sequence-specific cytosine base correction including a guide RNA (single guide RNA; sgRNA).
  • composition for cytosine base correction of the present invention may be to substitute thymine (T) or guanine (G) for cytosine (C) positioned immediately after thymine (T) on the target sequence depending on the presence or absence of UGI, more specifically As such, when UGI is present, the cytosine at the above position may be substituted with thymine, and when UGI is not present, the cytosine at the above position may be substituted with guanine.
  • the cytosine may be cytosine (C) located at the 5th to 7th positions from the 5' end of the target sequence, preferably the cytosines located at the 5th and 6th positions, more preferably It may be a cytosine located in the 6th position, but is not limited thereto.
  • the “guide RNA (gRNA)” is a single-stranded RNA that guides the Cas protein to the target DNA by finding the location of a specific DNA to be edited, and the guide RNA is a protospacer adjacent motif (PAM). ) adjacent to the site, and may include a sequence complementary to the nucleotide sequence of 10 to 25 bp of the DNA to be edited.
  • PAM protospacer adjacent motif
  • the present invention provides a thymine-cytosine (TC) sequence-specific cytosine base correction method comprising the step of contacting the composition with a target sequence in vitro .
  • TC thymine-cytosine
  • the target sequence may include a target base to be corrected, and the target base to be corrected is a base other than cytosine associated with a disease or disease, preferably thymine or guanine. It may be a cytosine-point mutated base, but is not limited thereto.
  • thymine-cytosine provides a kit for sequence-specific cytosine base correction.
  • the kit may include all materials (reagents) necessary for performing base correction such as a buffer and deoxyribonucleotide-5-triphosphate (dNTP) together with the base correction composition.
  • dNTP deoxyribonucleotide-5-triphosphate
  • the optimal amount of reagents to be used in a particular reaction of the kit can be readily determined by a person skilled in the art having the teachings herein.
  • pCMV_ABEmax_P2A_GFP (Addgene # 112101), pCMV-ABEmax (TadA E59A) (Addgene #125648), pCMV-ABEmax (TadA, eTadAE59A) (Addgene #125662), pCMV-ABEmax (TadA E59A, eTadAR 47Q) (Addgene #125657 E59A, eTadAR 47Q) ), pCMV-ABEmax (TadA E59A, eTadAD108Q) (Addgene #125655), pCMV-ABEmaxAW (Addgene #125647), ABE8e (Addgene #138489), ABE8e (TadA-8e V106W) (Addgene #138495), or ABE8.17 ABE variant expression plasmid was constructed based on -m (Addgene #136298).
  • the product was then transformed into 100 ⁇ l of DH5 ⁇ competent cells. Transformed single colonies were inoculated into LB medium containing antibiotics, and plasmids were isolated from the cells using a DNA prep kit (Enzynomics, EP101-200N).
  • CRISPR-Cas9 Restriction enzyme-free DNA cloning using CRISPR-Cas9 was performed with some modifications of previously known methods. More specifically, the sgRNA was designed to cleave the sequence encoding the C-terminus of Cas9 (D10A) in pCMV_ABEmax_P2A_GFP, and 0.7 ⁇ g of in vitro transcribed sgRNA and 1 ⁇ g of recombinant NG for in vitro DNA cleavage.
  • -SpCas9 was pre-incubated at room temperature for 5 minutes, then 1 ⁇ g of pCMV_ABEmax_P2A_GFP and DEPC-treated water were added to the SpCas9-sgRNA, and the final volume was adjusted to 50 ⁇ l. Thereafter, the mixture was incubated at 37° C. for 30 minutes to induce cleavage, and the product was purified through electrophoresis, and the inserted PCR product was amplified from pCMV_AncBE4max (Addgene plasmid # 112094). The two fragments were linked via Gibson assembly.
  • HEK293T (ATCC®CRL-3216 TM ) cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% ampicillin at 37° C. and 5% CO 2 conditions. Cell density was estimated through a hemocytometer and microscopic observation. Before transfection, HEK293T cells were seeded in 24-well plates at a density of 1 ⁇ 10 5 cells per well and incubated for 24 hours. and 250 ng of sgRNA expression plasmid) and a mixture of serum-free medium were treated with the cells. Next, genomic DNA was isolated 72 hours after transfection.
  • the ABEmax expression plasmid (500 ng) and sgRNA expression plasmid (170 ng) were introduced into 2 ⁇ 10 5 cells using the Neon TM Transfection System 10 ⁇ L kit (Thermo Fisher Scientific, MPK1025) by electroporation. Appropriate electroporation parameters (1,500V-20ms-2pulses for HEK293T cells) were performed according to the manufacturer's protocol. In addition, genomic DNA was isolated 72 hours after transfection.
  • TadA homologous proteins were searched using Protein BLAST of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • E. coli wtTadA sequence (GenBank ID: WP_001297409.1) was used as the input sequence and 10 homologous proteins exhibiting ⁇ 40% sequence identity were selected.
  • the accession numbers and species for the selected sequences are as follows: vsTadA, WP_127165941.1, Veillonella sp. CHU732; ssTadA, WP_105128341.1, Streptococcus suis ; asTadA, WP_067866801.1, Acinetobacter sp.
  • HEK293T cells were centrifuged, and the cell pellet was resuspended in 100 ⁇ l of Proteinase K extraction buffer [40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1% Tween-20, 0.2 ⁇ M EDTA, 10 mg Proteinase K, 0.2% Nonidet P-40]. Next, incubated at 60° C. for 15 minutes and then incubated at 98° C. for 5 minutes. Genomic DNA isolated from HEK293T cells was amplified using KOD-Multi & Epi (TOYOBO, KME-101), and the resulting PCR product was analyzed using Illumina Mini-Seq. Mini-seq results were analyzed using BE-Analyzer (http://www.rgenome.net/be-analyzer/).
  • HEK293T cells were transfected with 500 ng of ABE expression plasmid and 170 ng of sgRNA by electroporation, and cells were washed with DPBS after 24 hours.
  • RNA was isolated using the NucleoSpin® RNA Plus kit (MACHEREY-NAGEL, 740984. 250) according to the manufacturer's instructions, and reverse transcription was performed using ReverTra Ace- ⁇ - TM (TOYOBO, FSK-101) according to the manufacturer's instructions.
  • cDNA synthesis was performed.
  • PCR was performed with KOD-Multi & Epi (TOYOBO, KME-101), and the PCR product was analyzed using an Illumina Mini-Seq instrument. To obtain the ratio of adenosine to inosine edited, the number of adenosine to guanosine conversions in the product was divided by the total number of adenosine.
  • ABE7.10 which is adenine base editors (ABE)
  • TC * N the preferred motif
  • cytosine base substitution by this cytosine deamination catalyst appeared not only in ABE7.10, but also in its previous versions (ABE6.3, ABE7.8 and ABE7.9) and more optimized versions (ABEmax).
  • ABE mutants developed by variously improving TadA an adenosine deamination enzyme, for various purposes.
  • the types of ABE variants used in this experiment are as follows, and detailed TadA information contained in each variant is shown in FIG.
  • a version developed for the purpose of reducing the ABE-mediated RNA off-target effect i.e., ABEmax -F148A, ABEmax-AW, and SECURE-ABEs
  • ABEmax -F148A ABEmax-AW
  • SECURE-ABEs 2) a version comprising a TadA8e variant exhibiting increased deamination activity (i.e., ABE8e and ABE8e-V106W), and 3) TadA8s exhibiting enhanced editing activity version (i.e., ABE8.17-m).
  • the present inventors tried to identify a major mutation that promotes the distinction between adenine and cytosine in TadA, an adenosine deamination enzyme, and thought that some of the TadA homologous proteins may have already evolved to avoid cytosine correction. Therefore, for this purpose, the amino acid sequences of TadA homologous proteins derived from various species were investigated.
  • FIG. 3A based on the aligned amino acid sequence of each TadA homologous protein and the tertiary structure of Staphylococcus aureus TadA (saTadA) bound to the tRNA fragment of FIG. 3B, it is substantially active between homologous proteins. It was found that several residues inside and outside the site were variously mutated. For example, in E. coli wtTadA, P48 is substituted with arginine in most of the TadA homologous proteins, and D108 is substituted with asparagine, glutamate or serine in other homologous proteins. could know. In addition, the saTadA structure in Fig.
  • 3b provided insight into the structural change of the RNA substrate required for deamination of cytosine smaller than adenine.
  • the hexagonal ring of adenine must be located deep inside the adenine binding pocket, similar to that seen in the saTadA structure with a purine base attached to the pocket.
  • the pyrimidine ring must be in the same position as the hexagonal ring of the purine base in the structure, resulting in a shift of the sugar-phosphate backbone to the pocket edge.
  • V30 and F84 located in the adenine binding pocket were substituted with isoleucine and leucine found at corresponding positions in many TadA homologous proteins.
  • mutations previously tested and shown to incompletely reduce RNA editing activity such as the R47Q mutation, which retains DNA on-target editing activity, and the D53E mutation, which reduces RNA editing activity in vitro, were co-introduced.
  • each of the above candidate mutations likely to affect the cytosine-correcting effect of ABE was introduced into TadA7.10 of ABEmax or ABEmax-m, and then transfected into HEK293T cells, and each ABE variant at the target site in the FANCF and RNF2 genes. was tested for the nucleotide conversion activity of
  • TadA7.10-P48R a mutant TadA7.10 showing improved selectivity for cytosine correction, was found.
  • the present inventors based on the results of Example 3, using a TadA7.10-P48R mutant introduced with a P48R mutation significantly reduced adenine-correcting activity while increasing cytosine-correcting activity TC sequence-specific base correction tool wanted to develop.
  • two copies of uracil DNA glycosylase (UGI) were ligated to the C-terminus of ABEmax-P48R, such as AncBE4max, which is an optimized cytosine base gene scissors (CBE).
  • UGI uracil DNA glycosylase
  • the addition of UGI may increase the efficiency of cytosine (C) to thymine (T) calibration rather than cytosine (C) to guanine (G) calibration, and vice versa.
  • CBEs AncBE4max and AncBE4max ( ⁇ UGI)
  • ABEs types ABEmax and ABEmax-UGI and ABEs into which P48R was introduced, ABEmax-P48R and ABEmax-P48R-UGI.
  • CBE and CBE substituted all cytosines (C) (eg, C3, C6 and C7) at the highest ratio within the corrective operating range, It was shown that ABEmax and ABEmax-UGI replaced all As (eg A4 and A8) and C6. On the other hand, it was confirmed that ABE-P48R and ABE-P48R-UGI mainly substituted C6.
  • the present inventors performed a test by adding target sites of three endogenous genes (FANCF, RNF2 and ABLIM3) to the CSRNP3 gene, and performed a high-throughput sequencing analysis.
  • FANCF target sites of three endogenous genes
  • RNF2 target sites of three endogenous genes
  • ABLIM3 endogenous genes
  • the trend of corrective activity coincided with the results at the target site of the CSRNP3 gene, and in the case of ABE-P48R, mainly C was substituted with G, whereas in the case of ABE-P48R-UGI, C to T as expected. It was found that substituted with, and the same cytosine substitution effect as shown in FIG.
  • ABE-P48R and ABE-P48R-UGI could serve as correction tools for substitution of guanine and thymine for cytosine directly adjacent to thymine (TC-to-TG and TC-to-TT), respectively. suggesting that there is
  • Example 5 Validation of the possibility of treating genetic diseases using adenine base editing gene scissors with enhanced TC-specific cytosine base editing activity
  • a missense mutation in the TUBB6 gene (causing a F394S change in the protein) is associated with congenital facial paralysis, bilateral ptosis, and palatopharyngeal dysfunction.
  • the TC sequence must be corrected with TT. Accordingly, the present inventors first established a cell line containing an appropriate mutation in the genome to mimic the genetic variation of the disease, and then transfected the cell line with CBE (AncBE4max) or ABE-P48R-UGI, respectively, and then, high-throughput A nucleotide sequence analysis was performed.
  • the present inventors established a cell line containing an appropriate mutation in the genome to mimic the genetic variation of the disease as described above, and then transfected the cell line with CBE (AncBE4max) or ABE-P48R, respectively, and then Throughput sequencing was performed.

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Abstract

본 발명은 티민-사이토신 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위, 및 상기 유전자가위 및 가이드 RNA를 포함하는 티민-사이토신 서열 특이적 사이토신 염기교정용 조성물, 사이토신 염기교정 방법 및 사이토신 염기교정용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 T-C 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위는 아데노신 탈아미노화 효소에 P48R 돌연변이를 도입하여 제작된 것으로, 종래 사이토신 염기교정 유전자가위에 비해 더욱 정교한 작동범위를 가지며 사이토신 바로 앞에 티민이 위치하는 경우에만 사이토신의 교정이 일어나므로 사이토신이 범위 내에 여러 개 있는 경우에도 정교한 교정이 가능하며, UGI를 추가함으로써 사이토신을 티민으로 치환할 수 있고 UGI를 추가하지 않을 경우 사이토신을 구아닌으로 치환할 수도 있다. 이에, 본 발명에 따른 사이토신 염기교정 유전자가위 및 sgRNA를 포함하는 사이토신 염기교정용 조성물은 인간, 식물, 박테리아를 포함한 모든 생명체에서 사이토신만을 정확하게 교정해야 할 필요가 있는 유전자 치료 분야 또는 새로운 작물 개발 분야 등에서 유용하게 활용 가능할 것이다.

Description

티민-사이토신 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위 및 이의 용도
본 발명은 티민-사이토신 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위, 상기 유전자가위 및 가이드 RNA를 포함하는 티민-사이토신 서열 특이적 사이토신 염기교정용 조성물, 사이토신 염기교정 방법 및 사이토신 염기교정용 키트에 관한 것이다.
아데닌 염기교정 유전자가위 (Adenine base editors; ABEs)는 DNA 이중가닥 절단 (DSB)을 생성하거나 공여체 DNA 주형을 필요로 하지 않고 A/T 쌍을 G/C 쌍으로 변환할 수 있는 효과적인 유전자 교정 도구이다. 이러한 기술은 세포 단계에서뿐만 아니라 식물이나 동물 개체에서도 염기를 교정할 때 사용되고 있으며, 유전자 치료에 이용될 수 있도록 검증과 개발이 활발히 이루어지고 있다. ABE의 초기 실용적 버전 (ABE7.10)은 3개의 융합된 요소로 구성된다. 구체적으로, 부분적으로 불활성의 Cas 핵산분해효소 (Cas nickase 또는 nCas) 및 아데노신 탈아미노화 효소 (adenosine deaminases) 쌍으로 구성된다 (Escherichia coli (wtTadA) 유래의 TadA인 야생형 tRNA-특이적 아데노신 탈아미노화 효소, 및 RNA 대신 DNA에 작동하도록 진화된 TadA7.10인 조작된 TadA (eTadA)). 그러나 최근 아데닌 염기교정 유전자가위에서, 게놈 차원의 가이드 RNA (sgRNA) 의존적 오프-타겟 DNA 교정, 전사체 차원의 sgRNA 독립적 오프-타겟 RNA 편집 및 오프-타겟 위치에서 ABE 매개 사이토신 탈아미노화 효과 등이 보고되었다. 상기 첫 번째 오프-타겟 효과는 Cas 핵산분해효소의 불완전한 표적 특이성에 의해 야기되는 것이고, 나머지 두 가지 오프-타겟 효과는 아데노신 탈아미노화 효소의 DNA/RNA-결합 특성에 의한 것이다.
현재까지 몇몇 연구 그룹에서 RNA에 대한 오프-타겟 효과를 감소시키기 위해 추가 돌연변이를 도입한 새로운 버전의 ABE를 개발하였다. 예컨대, wtTadA와 TadA7.10 모두에서 F148A 돌연변이를 추가하면 무작위적인 RNA 탈아미노화 활성이 감소한다고 보고하였다. 다른 그룹에서는 독립적으로 ABE7.10의 wtTadA가 RNA 탈아미노화 활성에 주로 영향을 미친다는 결과를 발표하였으며, 반면에 wtTadA가 존재하지 않을 경우 DNA 교정 활성에 영향을 미치지 않음을 발견하였다. 따라서 E59A 돌연변이를 도입함으로써 wtTadA를 비활성화 시켰고, TadA7.10에서의 추가 돌연변이 (V106W)는 DNA 표적 활성을 감소시키지 않고 RNA에 대한 오프-타겟 효과를 감소시킨다는 것을 발견하였다. 또 다른 그룹은 wtTadA를 완전히 제거하고 TadA7.10 (K20A/R21A 또는 V82G)에 몇 가지 돌연변이를 추가하여 RNA 오프-타겟 효과를 감소시켰다 (Nat Biotechnol 37, 1041-1048 (2019)). 그러나 상기와 같이 많은 연구 그룹들에서 ABE 매개 RNA 탈아미노화 활성을 감소시키는데에 주로 초점을 맞추어 연구들이 진행되어 왔다.
한편, 사이토신 염기교정 유전자가위 (cytosine base editors; CBEs)는 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 생성하거나 공여 DNA 주형을 이용하지 않고 사이토신을 티민으로 치환할 수 있다고 알려진 효과적인 유전자 교정 도구이다. 그러나 사이토신 염기교정 유전자가위는 작동범위가 (position 3 to 9) 넓은 편이어서 원하지 않는 염기에서도 교정이 일어나는 문제가 있으며, 또한 사이토신을 티민이 아닌 다른 염기로 치환하기에는 적합하지 않은 문제가 있었다.
이에, 본 발명에서는 아데노신 탈아미노화 효소 (TadA)에서 사이토신 촉매 작용을 향상시킬 수 있는 주요 돌연변이를 발굴하여 효율적이고 정교한 사이토신 교정이 가능한 유전자가위를 개발하였다.
본 발명자들은 보다 효율적이고 정교한 사이토신 염기교정을 위한 유전자가위를 개발하기 위하여 수십 개의 TadA 변이체를 합리적으로 설계하고 테스트하여 사이토신 교정 활성을 향상시키는 돌연변이를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위 (Adenine Base Editor)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 아데닌 염기교정 유전자가위; 및 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)를 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 in vitro에서 표적 서열과 접촉시키는 단계를 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 P48R 돌연변이를 포함하는 아데노신 탈아미노화 효소 (Adenosine deaminase) 변이체; 및 Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질이 융합된, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위 (Adenine Base Editor)를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 아데노신 탈아미노화 효소는 TadA7.10인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 유전자가위는 ABEmax에 돌연변이가 도입된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유전자가위는 하나 이상의 우라실 DNA 글리코실라제 (uracil DNA glycosylase; UGI)가 추가로 연결된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아데닌 염기교정 유전자가위; 및
가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)를 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 사이토신은 표적 서열의 5'말단으로부터 5번째 내지 7번째에 위치한 사이토신 (C)인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 UGI의 유무에 따라 표적 서열 상에서 티민 (T) 바로 뒤에 위치하는 사이토신 (C)을 티민 (T) 또는 구아닌 (G)으로 치환하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 in vitro에서 표적 서열과 접촉시키는 단계를 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 T-C 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된, 아데닌 염기교정 유전자가위는 아데노신 탈아미노화 효소에 P48R 돌연변이를 도입하여 제작된 것으로, 종래 사이토신 염기교정 유전자가위에 비해 더욱 정교한 작동범위를 가지며 사이토신 바로 앞에 티민이 위치하는 경우에만 사이토신의 교정이 일어나므로 사이토신이 범위 내에 여러 개 있는 경우에도 정교한 교정이 가능하며, UGI를 추가함으로써 사이토신을 티민으로 치환할 수 있고 UGI를 추가하지 않을 경우 사이토신을 구아닌으로 치환할 수도 있다. 이에, 본 발명에 따른 사이토신 염기교정 유전자가위 및 sgRNA를 포함하는 사이토신 염기교정용 조성물은 인간, 식물, 박테리아를 포함한 모든 생명체에서 사이토신만을 정확하게 교정해야 할 필요가 있는 유전자 치료 분야 또는 새로운 작물 개발 분야 등에서 유용하게 활용 가능할 것이다.
도 1은 ABE의 촉매 활성에 의해 매개되는 표적 아데닌 교정 및 사이토신 교정의 개략도를 그림으로 도시한 것이다.
도 2는 다양한 아데닌 염기교정용 유전자가위에 포함된 아데노신 탈아미노화 효소 (좌측) 및 FANCF 및 RNF2 위치에서 ABE의 각 A4 및 C6의 염기 교정 효율을 보여주는 그래프이다 (우측).
도 3은 아데노신 탈아미노화 효소 (TadA)의 아미노산 서열 및 이의 구조를 분석한 결과로서, 도 3a는 다양한 종 유래 wtTadA, TadA7.10 TadA8e, saTadA 및 10 TadA 상동단백질의 서열을 정렬하여 나타낸 결과이고, 도 3b는 E. coli (녹색; PDB 코드 1Z3A) 유래 apo 구조를 RNA에 결합된 saTadA의 홀로 구조 (분홍색과 회색; PDB 코드 2B3J) 위에 겹쳐 놓은 구조를 나타낸 결과이다.
도 4는 FANCF 및 RNF2 위치에서 33개의 ABE 변이체에 의해 유도된 아데닌 및 사이토신 교정 효율을 분석한 히트맵 결과 (좌측) 및 아데닌 교정 효율을 사이토신 교정 효율로 나눈 정확도 값을 그래프로 나타낸 결과이다(우측).
도 5는 종래 공지된 사이토신 염기교정 유전자가위 (CBE 및 CBE(△UGI)), 아데닌 염기교정 유전자가위 (ABEmax 및 ABEmax-UGI) 및 P48R 돌연변이가 도입된 아데닌 염기교정 유전자가위 (ABE-P48R 및 ABE-P48R-UGI)의 구성요소를 도식화하여 나타낸 그림이다.
도 6은 도 5의 각 염기교정 유전자가위를 세포에 형질감염시킨 후 고 처리량 염기서열 분석을 실시하여 CSRNP3 유전자의 표적 부위에 대한 염기의 치환 여부를 히트 맵으로 나타낸 결과이다.
도 7은 도 5의 각 염기교정 유전자가위를 세포에 형질감염시킨 후 고 처리량 염기서열 분석을 실시하여 4가지 내인성 유전자 (FANCF, RNF2, ABLIM3 및 CSRNP3)의 각 TC 모티프의 사이토신이 어떠한 경향으로 치환되는지를 분석하여 나타낸 결과이다.
도 8은 아데닌 염기교정 유전자가위 (ABEmax 및 ABEmax-UGI) 및 P48R 돌연변이가 도입된 아데닌 염기교정 유전자가위 (ABE-P48R 및 ABE-P48R-UGI)를 세포에 형질감염시킨 후 TC 모티프의 사이토신 교정효과를 사이토신의 위치에 따라 확인한 결과이다.
도 9는 아데닌 염기교정 유전자가위 (ABEmax 및 ABEmax-UGI) 및 P48R 돌연변이가 도입된 아데닌 염기교정 유전자가위 (ABE-P48R 및 ABE-P48R-UGI)를 세포에 형질감염시킨 후 사이토신 교정효과를 모티프 종류에 따라 확인한 결과이다.
도 10은 ClinVar database를 이용하여 티민이 사이토신으로 치환되어서 발생한 질병 및 구아닌이 사이토신으로 치환되어서 발생한 질병의 수를 파악하여 도식화하여 나타낸 것이다.
도 11은 TT 서열이 TC로 변이된 TUBB6 유전자의 미스센스 돌연변이 관련 질환의 유전적 변이를 모방한 세포주에 본 발명의 ABE-P48R-UGI 및 CBE (AncBE4max)를 형질감염시킨 후 사이토신의 교정 효율을 측정하여 치료 가능성을 비교한 결과이다.
도 12는 TG 서열이 TC로 변이된 TPO 유전자의 미스센스 돌연변이 관련 비독성 및 독성 갑상선종 질환의 유전적 변이를 모방한 세포주에 본 발명의 ABE-P48R 및 CBE (AncBE4max)를 형질감염시킨 후 사이토신의 교정 효율을 측정하여 치료 가능성을 비교한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 아데닌 염기교정 유전자가위에서 아데닌 염기교정 활성을 현저히 감소시키고 사이토신 교정 활성을 증진시킨 주요 돌연변이를 확인하였고, 아데노신 탈아미노화 효소에 상기 돌연변이를 도입시켜 티민-사이토신 서열 특이적으로 사이토신 교정 활성이 향상된 아데닌 염기교정 유전자가위를 제작하였다.
본 발명은 P48R 돌연변이를 포함하는 아데노신 탈아미노화 효소 (Adenosine deaminase) 변이체; 및
Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질이 융합된, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위 (Adenine Base Editor)를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "염기교정 유전자가위 (Base Editors, BEs)"는 단일 염기의 교정 수단으로서, 보다 구체적으로 아데노신 탈아미노화 효소 또는 사이토신 탈아미노화 효소를 Cas9 니카아제 (nickase)의 N-말단에 융합시킴으로써 구축되며, 각각 아데닌 염기교정 유전자가위 (Adenine Base Editors; ABEs) 및 사이토신 염기교정 유전자가위 (Cytosine Base Editors; CBEs)로 명명된다. 상기 BEs는 이중 가닥 절단을 일으키지 않으면서, ABEs는 특정 부위에서 아데닌을 구아닌으로 교정하며 CBEs는 특정 부위에서 사이토신을 티민으로 교정한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아데닌 염기교정 유전자가위 (Adenine Base Editors; ABEs)"는 아데닌을 구아닌으로 교정하기 위해, 임의의 자연유래 탈아미노화 효소 (ecTadA) 및/또는 아데노신 탈아미노화 효소 변이체 (ecTadA*)를 Cas9 니카아제 (nickase)의 N-말단에 융합시킴으로써 구축되며, ABEs의 종류로는 아데노신 탈아미노화 효소의 종류 또는 변이에 따라 ABE6.3, ABE7.8, ABE7.9, ABE 7.10, ABEmax, ABEmax-m, SECURE-ABE, ABE8e, ABE8e-V106W, ABE8.17-m 등의 버전이 있으나 이에 제한되지 않고, "ABEs"로 지칭할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아데닌 염기교정 유전자가위는 아데닌 염기교정에 대한 특이성 또는 정확도가 감소하고, 티민-사이토신 서열 특이적으로 사이토신의 교정 활성이 현저히 증가한 특성을 갖는 개량된 것일 수 있다. 바람직하게는 ABEmax 버전에 돌연변이가 유도된 것일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "아데노신 탈아미노화 효소 (adenosine deaminase)"는 아데닌에서 아미노기를 제거하고 히포크산틴 (hypoxanthine)의 생성에 관여하는 효소이다. 상기 효소는 고등 동물에는 거의 발견되지 않으나 암소의 근육 내, 우유, 쥐의 혈액에 조금 존재하며 가재의 내장 및 곤충 등에서는 많이 존재한다고 보고된다. 아데노신 탈아미노화 효소는 ecTadA와 같은 자연유래 아데노신 탈아미노화 효소 또는 ecTadA의 돌연변이 (ecTadA*)와 같은 아데노신 탈아미노화 효소의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 변이체는 TadA7.10, TadA8e, TadA8s, TadA8.20 또는 TadA8.17 등을 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 TadA7.10을 이용하였으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질”은 DNA 바이러스에 대한 특정 박테리아의 면역학적 방어에서 중요한 역할을 하는 단백질로 유전자 공학 응용에 많이 사용되는데, 상기 단백질의 주요 기능이 DNA를 절단하는 것이기 때문에 세포의 게놈을 변형하는 데에 적용할 수 있다. 구체적으로, CRISPR-Cas9은 3세대 유전자가위로써 이용하고자 하는 특정 염기서열을 인식하여 절단하고 편집하며, 게놈의 목적 장소에 특정 유전자를 삽입하거나 특정 유전자의 활동을 정지시키는 조작을 간단하고 신속하고 효율성 있게 실시하는데 유용하다. Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, Cas9 단백질은 그 목적에 따라 당업자가 추가적인 도메인을 적절하게 연결할 수 있다. 본 발명에 있어서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9 뿐만아니라, 유전자 편집을 위한 핵산분해효소의 기능을 갖는 것이라면 Cas9의 변이체를 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 Cas9 단백질은 그 유래가 제한되지 않으며, 비제한적인 예시로써 스트렙토코커스 피요제네스 (Streptococcus pyogenes), 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua), 또는 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) 유래일 수 있으나, 바람직하게는 스트렙토코커스 피요제네스 (Streptococcus pyogenes) 유래일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자가위는 하나 이상의 우라실 DNA 글리코실라제 (uracil DNA glycosylase; UGI)가 추가로 연결된 것일 수 있으며, 바람직하게는 2개의 UGI가 추가로 연결된 것일 수 있다. 상기 UGI는 UNG, UDG라고도 하며, 우라실을 포함한 DNA의 deoxyribose sugar와 우라실 염기 사이의 N-glycosylic bond를 가수분해하여 탈필리미딘 부위를 만드는 역할을 한다. 상기 효소는 우라실을 포함한 단일가닥 DNA와 이중가닥 DNA는 가수분해 하지만, RNA에는 작용하지 않는다고 알려져 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 개량된 아데닌 염기교정 유전자가위에서 T-C 서열 특이적으로 사이토신 교정 활성이 향상된 것을 확인하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 이전 연구에서 확인된 결과를 바탕으로 ABE7.10 보다 더욱 개량된 버전의 ABE 변이체들에서도 사이토신 탈아미노화 활성이 나타나는지 조사한 결과, 테스트한 모든 ABE 변이체들에서 여전히 아데닌 교정 활성 외에도 사이토신 교정이 유도되는 것을 확인하였다 (실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 아데노신 탈아미노화 효소에서 아데닌과 사이토신 사이의 구별 통해 사이토신 교정 활성을 제거하는데 영향을 미칠 수 있는 돌연변이를 조사하기 위해 TadA의 상동단백질의 서열 및 3차 구조분석 결과를 기반으로 다양한 후보 돌연변이가 각각 ABEmax 또는 ABEmax-m의 TadA7.10에 도입된 변이체들을 제작하여 HEK293T 세포 내 표적 부위에서 아데닌 및 사이토신의 교정 효율을 분석하였다. 그 결과 예상과 달리 ABEmax-m의 TadA7.10에서 P48R 돌연변이가 아데닌 교정 효율을 실질적으로 감소시킨 반면 사이토신 교정 효율을 증가시켜 사이토신 교정에 대한 높은 특이성을 초래한다는 것을 발견하였다 (실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 종래 공지된 사이토신 염기교정 유전자가위 (CBE 및 CBE(ΔUGI)), 아데닌 염기교정 유전자가위 (ABEmax, ABEmax-UGI) 및 P48R 돌연변이를 도입하여 제작한 본 발명의 개량된 아데닌 염기교정 유전자가위 (ABE-P48R, ABE-P48R-UGI) 총 6가지를 세포에 형질감염시켜 내인성 CSRNP3 유전자의 표적 염기서열에서 치환되는 염기들을 분석한 결과, 본 발명에 따른 개량된 버전의 아데닌 염기교정 유전자가위 (ABE-P48R, ABE-P48R-UGI)의 경우 아데닌이 아닌 주로 티민 바로 뒤에 있으면서 5'말단으로부터 6번째에 위치하는 사이토신을 높은 효율로 치환하는 것을 확인하였다 (실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 유전 질환의 치료에 대한 ABE-P48R 및 ABE-P48R-UGI의 잠재력을 검증하기 위해, 각각 TT 서열이 TC로 변이된 TUBB6 유전자의 미스센스 돌연변이를 모방한 세포주 및 TG 서열이 TC로 변이된 TPO 유전자의 미스센스 돌연변이를 모방한 세포주에 본 발명의 ABE-P48R-UGI 및 CBE (AncBE4max), 또는 ABE-P48R 및 CBE (AncBE4max)를 형질감염시킨 후 사이토신의 교정 효율을 측정하였다. 그 결과 CBE 대비 각각 ABE-P48R-UGI 및 ABE-P48R의 정교한 사이토신 교정 기능을 확인하였으며, 이를 통해 유전 질환에 대한 치료 잠재성을 알 수 있었다 (실시예 5 참조).
따라서 상기 결과들은 본 발명에 따른 아데닌 염기교정 유전자가위의 매우 정교한 사이토신 염기교정 효과 및 이의 용도를 입증하는 것이다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 아데닌 염기교정 유전자가위; 및
가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)를 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 사이토신 염기교정용 조성물은 UGI의 유무에 따라 표적 서열 상에서 티민 (T) 바로 뒤에 위치하는 사이토신 (C)을 티민 (T) 또는 구아닌 (G)으로 치환하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 UGI가 존재하는 경우 상기 위치의 사이토신이 티민으로 치환될 수 있고, UGI가 존재하지 않는 경우 상기 위치의 사이토신이 구아닌으로 치환될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 사이토신은 표적 서열의 5'말단으로부터 5번째 내지 7번째에 위치한 사이토신 (C)인 것일 수 있으며, 바람직하게는 5번째 및 6번째에 위치한 사이토신일 수 있고, 더욱 바람직하게 6번째에 위치한 사이토신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 “가이드 RNA (guide RNA; gRNA)”란 편집하고자 하는 표적하는 특정 DNA의 위치를 찾아내어 Cas 단백질을 표적 DNA로 인도하는 역할을 하는 단일 가닥의 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 PAM (protospacer adjacent motif) 자리와 인접하며, 편집하려는 DNA의 10~25bp의 염기 서열과 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 in vitro에서 표적 서열과 접촉시키는 단계를 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 염기교정 방법에 있어서, 상기 표적 서열은 교정하고자 하는 표적 염기를 포함하는 것일 수 있고, 상기 교정하고자 하는 표적 염기는 질병 또는 질환과 연관된 사이토신을 제외한 다른 염기, 바람직하게 티민 또는 구아닌이 사이토신으로 점 돌연변이된 염기일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 상기 염기교정용 조성물과 함께 버퍼 (buffer) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트 (dNTP)와 같은 염기교정을 실시하는데 필요한 물질 (시약)을 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험재료 및 실험방법
1-1. ABE 변이체 발현용 플라스미드 구축
본 발명자들은 pCMV_ABEmax_P2A_GFP (Addgene # 112101), pCMV-ABEmax (TadA E59A) (Addgene # 125648), pCMV-ABEmax (TadA, eTadAE59A) (Addgene # 125662), pCMV-ABEmax(TadA E59A, eTadAR47Q) (Addgene #125657), pCMV-ABEmax(TadA E59A, eTadAD108Q) (Addgene #125655), pCMV-ABEmaxAW (Addgene #125647), ABE8e (Addgene #138489), ABE8e(TadA-8e V106W) (Addgene #138495), 또는 ABE8.17-m (Addgene #136298)을 기반으로 ABE 변이체 발현 플라스미드를 구축하였다. ABE 발현용 벡터를 얻기 위해, pCMV_ABEmax_P2A_GFP 1μg, NotI-HF 1 unit (New England Biolabs, catalog number: R3189L) 및 BglII 1 unit (Enzynomics, catalog number: R010S)을 최종 50 μl 부피에서 혼합하였다. 이어서 상기 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하여 절단 반응을 유도한 다음, 전기영동을 수행하여 절단된 산물을 크기에 따라 분리하고 겔 추출 키트인 ExpinTM Gel SV mini (GeneAll, catalog number: 102-102)를 사용하여 정제하였다. 2U T5 엑소뉴클레아제 (exonuclease)(New England Biolabs, catalog number: M0363S), 12.5U Phusion DNA 중합효소 (Polymerase)(Thermo Fisher Scientific, catalog number: F530L), 2kU Taq DNA 리가아제 (ligase)(New England Biolabs, catalog number: M0208S), 0.2M Tris-HCl (pH 7.5), 0.2M MgCl2, 2mM dNTPs, 0.2M dithiothreitol, 25% PEG-8000, 및 1mM NAD를 최종 10μl 부피로 혼합하였고, 이 혼합물에 상기 정제된 산물과 확인하고자 하는 변이체를 포함하는 합성된 PCR 산물을 넣고 혼합하고, 50℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 산물을 100μl의 DH5α competent 세포로 형질전환시켰다. 형질전환된 단일 콜로니를 항생제가 함유된 LB 배지에 접종하였고, DNA prep 키트 (Enzynomics, EP101-200N)를 사용하여 세포로부터 플라스미드를 분리하였다.
1-2. CRISPR-Cas9을 이용한 DNA 클로닝을 통한 ABE-UGI 구축
CRISPR-Cas9를 사용한 제한 효소 없는 DNA 클로닝은 기존에 공지된 방법을 일부 변경하여 실시하였다. 보다 구체적으로, pCMV_ABEmax_P2A_GFP에서 Cas9 (D10A)의 C-말단을 암호화하는 서열을 절단하기 위해 sgRNA를 설계하였고, 시험관 내 (in vitro) DNA 절단을 위해 0.7μg의 시험관 내 전사된 sgRNA 및 1μg의 재조합 NG-SpCas9를 실온에서 5분 동안 사전 배양한 다음, 1μg의 pCMV_ABEmax_P2A_GFP 및 DEPC 처리된 물을 상기 SpCas9-sgRNA에 첨가하고 최종 부피를 50μl가 되도록 맞추었다. 이후 상기 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양하여 절단을 유도한 다음, 산물을 전기영동을 통해 정제하였고, 삽입된 PCR 산물은 pCMV_AncBE4max (Addgene 플라스미드 # 112094)로부터 증폭되었다. 두 단편이 Gibson 어셈블리를 통해 연결되었다.
1-3. 리포좀을 이용한 형질감염
HEK293T (ATCC®CRL-3216TM) 세포는 10% FBS, 1% 암피실린 (ampicillin)이 보충된 DMEM 배지에서 37℃및 5% CO2 조건 하에 배양되었다. 세포 밀도는 혈구계수기 및 현미경 관찰을 통해 추정하였다. 형질감염 전, HEK293T 세포를 24-웰 플레이트에 웰 당 1×105 세포 밀도로 분주하고 24시간 동안 배양하였으며, lipofectamine® 2000 시약 (Thermo Fisher Scientific, 11668019) 2μL, 플라스미드 DNA 1μL (ABE 발현 플라스미드 750ng및 sgRNA 발현 플라스미드 250ng) 및 무혈청 배지의 혼합액을 세포에 처리하였다. 다음으로 형질감염 72시간 후에 genomic DNA를 분리하였다.
1-4. 전기천공법을 통한 형질감염
NeonTM Transfection System 10 μL 키트 (Thermo Fisher Scientific, MPK1025)를 이용하여 2×105 세포 내로 The ABEmax 발현 플라스미드 (500ng) 및 sgRNA 발현 플라스미드 (170ng)를 전기천공법을 이용하여 도입하였다. 적절한 전기천공 매개변수 (HEK293T 세포의 경우 1,500V-20ms-2pulses)는 제조사의 프로토콜을 준수하여 진행하였다. 또한 형질감염 72시간 후에 genomic DNA를 분리하였다.
1-5. TadA 상동단백질의 서열 정렬
미국 국립생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 Protein BLAST를 사용하여 TadA 상동단백질 (orthologs)을 검색하였다. E. coli wtTadA 서열 (GenBank ID : WP_001297409.1)을 입력 서열로 사용하고 ~ 40% 서열 동일성을 나타내는 10개의 상동단백질을 선택하였다. 선택된 서열에 대한 accession number 및 종 (species)은 다음과 같다: vsTadA, WP_127165941.1, Veillonella sp. CHU732; ssTadA, WP_105128341.1, Streptococcus suis; asTadA, WP_067866801.1, Acinetobacter sp. SFB; bfTadA, WP_073388705.1, Butyrivibrio fibrisolvens; sxTadA, WP_107541930.1, Staphylococcus xylosus; cbTadA, WP_111988333.1, Cellvibrionaceae bacterium AOL6; dfTadA, WP_117494436.1, Dorea formicigenerans; ocTadA, WP_047980683.1, Ornithinibacillus contaminans; osTadA, WP_077602817.1, Oceanobacillus sojae; pgTadA, WP_026908502.1, Paucisalibacillus globulus.
1-6. 표적 심층 서열분석 (Targeted deep sequencing)
HEK293T 세포를 원심분리하고, 세포 펠릿을 100μl의 Proteinase K 추출 완충액 [40mM Tris-HCl (pH 8.0), 1% Tween-20, 0.2μM EDTA, 10mg Proteinase K, 0.2% Nonidet P-40]에 재현탁한 다음, 60℃에서 15분 동안 배양한 후 98℃에서 5분 동안 배양하였다. HEK293T 세포에서 분리된 게놈 DNA는 KOD-Multi & Epi (TOYOBO, KME-101)를 사용하여 증폭시켰고, 생성된 PCR 산물은 Illumina Mini-Seq 기기를 사용하여 분석하였다. Mini-seq 결과는 BE-Analyzer (http://www.rgenome.net/be-analyzer/)를 이용하여 분석하였다.
1-7. 표적 RNA 서열분석 (Targeted RNA sequencing)
24-웰 플레이트에서, HEK293T 세포에 500ng의 ABE 발현 플라스미드와 170ng의 sgRNA를 전기천공법을 통해 형질감염시켰고, 24시간 후 세포를 DPBS로 세척하였다. RNA는 제조업체의 지침에 따라 NucleoSpin® RNA Plus 키트 (MACHEREY-NAGEL, 740984. 250)를 사용하여 분리하였고, ReverTra Ace-α-TM (TOYOBO, FSK-101)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사를 통한 cDNA 합성을 수행하였다. cDNA 증폭을 위해 KOD-Multi & Epi (TOYOBO, KME-101)로 PCR을 수행하였고, Illumina Mini-Seq 기기를 사용하여 PCR 산물을 분석하였다. 아데노신에서 이노신으로 편집된 비율을 구하기 위해, 산물에서 아데노신에서 구아노신으로 변환된 수를 총 아데노신 수로 나누었다.
실시예 2. 다양한 ABE 변이체에 대한 사이토신 탈아미노화 활성 측정
본 발명자들은 이전 연구에서 아데닌 염기교정 유전자가위 (Adenine base editors; ABE)인 ABE7.10은 도 1에 도시된 바와 같이 선호하는 모티프 (TC * N)의 좁은 작동범위 (Cas9 표적 범위의 5' 말단으로부터 5~7번째)에서 원래의 표적 염기인 아데닌을 교정하는 것 이외에도 TC 표적 모티프가 있는 경우에 사이토신 탈아미노화 (cytosine deamination)를 촉매하여 사이토신을 치환할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 사이토신 탈아미노화 촉매에 의한 사이토신 염기 치환은 ABE7.10뿐만이 아니라 이의 이전 버전 (ABE6.3, ABE7.8 및 ABE7.9) 및 더욱 최적화된 버전 (ABEmax)에서도 나타나는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 최근 들어 다양한 목적에 따라 아데노신 탈아미노화 효소인 TadA를 다양하게 개량하여 개발된 ABE 변이체들에서도 사이토신 탈아미노화 활성이 나타나는지 여부를 조사하고자 하였다. 본 실험에서 사용한 ABE 변이체 종류는 다음과 같으며, 각 변이체에 포함된 구체적인 TadA 정보는 도 2에 나타내었다: 1) ABE 매개 RNA 오프-타겟 효과를 감소시키기 위한 목적으로 개발된 버전 (i.e., ABEmax-F148A, ABEmax-AW, 및 SECURE-ABEs), 2) 증가된 탈아미노화 활성을 나타내는 TadA8e 변이체를 포함하는 버전 (i.e., ABE8e 및 ABE8e-V106W), 및 3) 향상된 편집 활성을 나타내는 TadA8s를 포함하는 버전 (i.e., ABE8.17-m).
이를 위해, 인간 HEK293T 세포에서 교정 작동범위 내에 아데닌 잔기 및 사이토신 표적 모티프를 모두 포함하는 두 가지 대표적 내인성 표적 (FANCF 및 RNF2)을 대상으로 모든 ABE 변이체를 테스트하였고, 고 처리량 염기서열 분석을 실시하여 하기와 같은 결과를 얻었다.
첫째, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 테스트된 상기 모든 ABE 변이체는 여전히 아데닌 교정 외에도 사이토신 교정을 유도하는 것으로 나타났으나, ABEmax-F148A 및 ABEmax-AW의 경우 사이토신 교정 효율이 약간 감소되어 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 eTadA의 추가 엔지니어링이 사이토신 탈아미노화 활성을 제거하거나 최소화할 수 있다는 본 발명자들의 가설을 뒷받침하는 것이라고 판단하였다.
둘째, 모든 ABE8 변이체가 이전 버전에 비해 크게 증가한 아데닌 교정 효을 보였지만 사이토신 교정 효율 또한 증가한 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고 ABE8e-V106W의 경우에는 ABE8e에 비해 사이토신 교정 효율이 감소된 것을 확인하였다.
셋째, wtTadA의 비활성화 또는 제거가 DNA 교정 활성을 방해하지 않는 것을 알 수 있었으며, 오히려 wtTadA가 없는 ABEmax 버전 (ABEmax-m)은 원래의 ABEmax 보다 더 높은 DNA 교정 활성을 나타내었다.
실시예 3. 사이토신 교정 효율에 중요한 영향을 미치는 TadA 내 돌연변이 확인
본 발명자들은 아데노신 탈아미노화 효소인 TadA에서 아데닌과 사이토신 사이의 구별을 촉진하는 주요 돌연변이를 확인하고자 하였으며, TadA 상동단백질의 일부가 이미 사이토신 교정을 회피하도록 진화하였을 수 있다고 생각하였다. 따라서 이를 위해 다양한 종에서 유래된 TadA 상동단백질의 아미노산 서열을 조사하였다.
그 결과, 도 3a에서 볼 수 있는 바와 같이 각 TadA 상동단백질들의 정렬된 아미노산 서열과 도 3b의 tRNA 단편에 결합된 Staphylococcus aureus TadA (saTadA)의 3차 구조를 기반으로, 실질적으로 상동단백질 사이에서 활성 부위 안팎의 여러 잔기가 다양하게 변이되어 있음을 발견하였다. 예를 들어, E. coli wtTadA의 P48은 TadA 상동단백질의 대부분에서 아르기닌 (arginine)으로 치환되고, D108은 다른 상동단백질에서 아스파라긴 (asparagine), 글루타메이트 (glutamate) 또는 세린 (serine)으로 치환되어 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 3b의 saTadA 구조는 아데닌 보다 작은 사이토신의 탈아미노화에 필요한 RNA 기질의 구조적 변화에 대한 통찰력을 제공하였다. 아데닌 탈아미노화 활성을 위해, 아데닌의 육각형 고리는 포켓에 퓨린 염기가 결합된 saTadA 구조에서 보이는 것과 유사하게 아데닌 결합 포켓 안쪽 깊숙이 위치해야 한다. 그러나 사이토신 탈아미노화를 위해서는 피리미딘 고리가 구조에서 퓨린 염기의 육각형 고리와 동일한 위치에 있어야하므로 결과적으로 당-인산 백본이 포켓 가장자리로 이동해야 한다. 따라서 본 발명자들은 DNA 백본이 포켓 테두리에 접근하는 것을 방지할 수 있는 더 큰 잔기로 P48과 D108을 치환하기로 결정하였다. 또한 아데닌 결합 포켓에 위치한 V30 및 F84를 많은 TadA 상동단백질의 해당 위치에서 발견되는 이소류신 (isoleucine) 및 류신 (leucine)으로 치환시켰다. 더욱이, DNA on-target 편집 활성을 유지하는 R47Q 돌연변이, 및 시험관 내에서 RNA 편집 활성을 감소시키는 D53E 돌연변이와 같이 이전에 테스트되어 RNA 편집 활성을 불완전하게 감소시키는 것으로 나타난 돌연변이를 함께 도입하였다.
다음으로, ABE의 사이토신 교정 효과에 영향을 미칠만한 상기 각 후보 돌연변이를 ABEmax 또는 ABEmax-m의 TadA7.10에 도입한 다음, HEK293T 세포에 형질감염시켜 FANCF 및 RNF2 유전자 내 표적 부위에서 각 ABE 변이체의 뉴클레오티드 전환 활성을 테스트하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 ABE 변이체의 아데닌 및 사이토신 교정 효율을 ABEmax의 효율로 보정 (normalization) 하였을 때, 대부분의 돌연변이에서 아데닌 및 사이토신 교정 효율이 동시에 증가 또는 감소하였다는 것을 확인하였다. 단, 본 발명자들은 예상치 못하게 ABEmax-m의 TadA7.10에서 P48R 돌연변이가 아데닌 교정 효율을 실질적으로 감소시킨 반면 사이토신 교정 효율을 증가시켜 사이토신 교정에 대한 높은 특이성을 초래한다는 것을 발견하였다.
상기 결과를 통해, 사이토신 교정에 대한 향상된 선택성을 나타낸 TadA7.10 변이체인 TadA7.10-P48R을 발견하였다.
실시예 4. P48R 돌연변이가 도입된 아데닌 염기교정 유전자가위의 TC 특이적 사이토신 교정 효과 확인
본 발명자들은 상기 실시예 3의 결과에 기반하여, P48R 돌연변이가 도입된TadA7.10-P48R 변이체를 이용하여 아데닌 교정 활성을 크게 감소시키면서 사이토신 교정 활성을 증가시킨 TC 서열-특이적 염기 교정 도구를 개발하고자 하였다. 이를 위해, 최적화된 사이토신 염기 유전자가위(CBE)인 AncBE4max와 같이, ABEmax-P48R의 C-말단에 우라실 DNA 글리코실라제 (uracil DNA glycosylase; UGI)의 두 카피를 연결하였다. UGI를 추가하면 사이토신 (C)에서 구아닌(G)으로의 교정이 아닌 사이토신 (C)에서 티민 (T)으로의 교정 효율이 증가할 수 있으며, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 이에, 본 발명자들은 궁극적으로 TC-특이적 염기교정 유전자가위로써 다음과 같은 6가지 종류를 준비하였으며, 이의 구성 요소를 도식화하여 도 5에 나타내었다: CBEs 종류인 AncBE4max 및 AncBE4max(△UGI), ABEs 종류인 ABEmax 및 ABEmax-UGI, 및 P48R이 도입된 ABEs인 ABEmax-P48R 및 ABEmax-P48R-UGI.
상기 6종류의 TC-특이적 염기교정 유전자가위를 HEK293T 세포로 형질감염시켜 CSRNP3 유전자의 표적 부위에서 염기 교정에 대한 테스트를 진행한 후 고 처리량 염기서열 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 6의 히트맵 결과에서 볼수 있는 바와 같이 CBE 및 CBE(△UGI)가 교정 작동범위 내에서 모든 사이토신 (C) (예: C3, C6 및 C7)을 가장 높은 비율로 치환시켰고, ABEmax 및 ABEmax-UGI가 모든 As (예: A4 및 A8) 및 C6를 치환시킨 것으로 나타났다. 반면에 ABE-P48R 및 ABE-P48R-UGI는 주로 C6를 치환시킨 것으로 확인되었다.
이에, 본 발명자들은 상기 CSRNP3 유전자에 더하여 3가지 내인성 유전자(FANCF, RNF2 및 ABLIM3)의 표적 부위를 추가하여 테스트를 진행하고 고 처리량 염기서열 분석을 진행하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 교정 활성 경향이 CSRNP3 유전자의 표적 부위에서의 결과와 일치하였고, ABE-P48R의 경우 주로 C에서 G로 치환된 반면 ABE-P48R-UGI의 경우 예상대로 C에서 T로 치환된 것을 알 수 있었고, 또한 상기와 같은 사이토신 치환 효과는 도 8에 나타낸 바와 같이, TC 모티프를 다른 위치에 가지고 있는 타겟에 대해 처리했을 때, 5' 말단으로부터 5번째 내지 7번째에 위치한 사이토신에도 적용될 수 있으며, 도 9에 나타낸 바와 같이, TC 모티프를 가진 타겟 특이적으로 사이토신 교정효과가 일어남을 확인하였다.
이러한 결과는 ABE-P48R 및 ABE-P48R-UGI가 각각 티민과 직접적으로 인접한 사이토신에 대하여 구아닌 및 티민으로의 치환 (TC-to-TG 및 TC-to-TT)을 위한 교정 도구로 기능할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 5. TC 특이적 사이토신 염기교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위를 이용한 유전 질환 치료 가능성 검증
유전 질환의 치료에 대한 ABE-P48R 및 ABE-P48R-UGI의 잠재력을 검증하기 위해, 본 발명자들은 in silico ClinVar 데이터베이스에 등록된 모든 표적화 변이를 조사하였다. 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이 데이터베이스에서 병변적 표현형을 야기한 총 36,153개의 T > C 돌연변이가 표준 사이토신 염기 교정 작동범위 (4~8번째)에 위치하였다. 이 중 3,874개 (11%)의 돌연변이가 ABE-P48R-UGI 교정 작동범위 내 사이토신 표적 모티프와 연관되어 있었다. 또한 데이터베이스에서 23,237개의 G > C 돌연변이 중 3,248개 (14%)가 ABE-P48R에 의해 표적화될 수 있음을 확인하였다.
5-1. ABE-P48R-UGI를 이용한 TC에서 TT로의 교정
일례로, TUBB6 유전자의 미스센스 돌연변이 (단백질에서 F394S 변화 유발)의 경우 선천성 안면 마비, 양측 안검하수증 및 구개범인두 기능장애와 관련이 있으며, 근본적 치료를 위해서는 TC 서열을 TT로 교정해야 한다. 이에, 본 발명자들은 먼저 질병의 유전적 변이를 모방하기 위해 게놈에 적절한 돌연변이를 포함하는 세포주를 확립한 다음, 상기 세포주에 CBE (AncBE4max) 또는 ABE-P48R-UGI를 각각 형질감염시킨 후, 고 처리량 염기서열 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 ABE-P48R-UGI에 비해 CBE가 더 높은 총 사이토신 교정 효율을 보였으나, 정확한 교정 효율은 더 낮게 나타난 것을 확인하였다 (ABE-P48R-UGI는 4.1%, CBE는 1% 미만). 또한 ABE-P48R-UGI는 무시할 수 있는 방관자 효과를 나타낸 반면 CBE는 방관자 효과를 많이 나타냄을 확인하였다. 따라서 상기 결과는 ABE-P48R-UGI가 TC에서 TT로의 교정을 위한 유용한 교정 수단으로 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
5-2. ABE-P48R을 이용한 TC에서 TG로의 교정
비독성 및 독성 갑상선종 환자 모두에서 발견되는 TPO 유전자의 미스센스 돌연변이 (Q660E 변화 유발)의 경우, 치료를 위해서는 TC 서열을 TG로 교정해야 한다. 이에, 본 발명자들은 전술한 바와 마찬가지로 상기 질병의 유전적 변이를 모방하기 위해 게놈에 적절한 돌연변이를 포함하는 세포주를 확립한 다음, CBE (AncBE4max) 또는 ABE-P48R을 각각 상기 세포주에 형질감염시킨 후 고 처리량 염기서열 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이 ABE-P48R에 비해 CBE가 총 사이토신 교정 효율은 더 높게 나타났지만 정확한 교정 비율은 더 낮은 것을 확인하였다(ABE-P48R의 경우 3.1%, CBE는 1% 미만). 또한, ABE-P48R은 ABE-P48R-UGI와 마찬가지로 무시할 수 있는 방관자 효과를 나타낸 반면 CBE는 방관자 효과를 많이 나타내었는바, 상기 결과는 ABE-P48R이 유용한 TC에서 TG로의 염기 교정 도구로 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.

Claims (9)

  1. P48R 돌연변이를 포함하는 아데노신 탈아미노화 효소 (Adenosine deaminase) 변이체; 및
    Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질이 융합된, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위 (Adenine Base Editor).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아데노신 탈아미노화 효소는 TadA7.10인 것을 특징으로 하는, 아데닌 염기교정 유전자가위.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유전자가위는 ABEmax에 돌연변이가 도입된 것을 특징으로 하는, 아데닌 염기교정 유전자가위.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유전자가위는 하나 이상의 우라실 DNA 글리코실라제 (uracil DNA glycosylase; UGI)가 추가로 연결된 것을 특징으로 하는, 아데닌 염기교정 유전자가위.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 아데닌 염기교정 유전자가위; 및
    가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)를 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 사이토신은 표적 서열의 5'말단으로부터 5번째 내지 7번째에 위치한 사이토신 (C)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 UGI의 유무에 따라 표적 서열 상에서 티민 (T) 바로 뒤에 위치하는 사이토신 (C)을 티민 (T) 또는 구아닌 (G)으로 치환하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제5항의 조성물을 in vitro에서 표적 서열과 접촉시키는 단계를 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정 방법.
  9. 제5항의 조성물을 포함하는, 티민-사이토신 (T-C) 서열 특이적 사이토신 염기교정용 키트.
PCT/KR2021/017954 2020-12-01 2021-12-01 티민-사이토신 서열 특이적 사이토신 교정 활성이 증진된 아데닌 염기교정 유전자가위 및 이의 용도 WO2022119295A1 (ko)

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