CN108707635B

CN108707635B - 用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用

Info

Publication number: CN108707635B
Application number: CN201810535575.1A
Authority: CN
Inventors: 李大力; 张晓辉; 朱碧云; 刘明耀; 席在喜
Original assignee: East China Normal University; Bioray Laboratories Inc
Current assignee: East China Normal University; Bioray Laboratories Inc
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2018-05-29
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2038-05-29
Also published as: CN108707635A

Abstract

本发明公开了用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用，涉及基因编辑技术领域。该组合物包括第一载体和第二载体,第一载体包括5’‑3’的式(I)结构:P_II‑X1‑L1‑X2‑PolyA；第二载体包括5’‑3’的式(II)结构：P_III‑Y1‑P_II‑Y2‑L2‑Y3或Y4或Y5‑L3‑Y4‑PolyA；该组合物可对靶序列上的更宽的位置上的碱基进行修饰，具有较广阔的核苷酸修饰空间。

Description

用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体而言，涉及一种用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用。

背景技术

自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物学领域的各个实验，正改变着传统的基因操作手段。

利用CRISPR/Cas9技术与胞嘧啶脱氨酶或者腺苷脱氨酶融合而成的单碱基基因编辑技术，分别可实现基因组上定点的C/G到T/A(简称CBE)，A/T到G/C(简称ABE)单碱基的突变。单碱基基因编辑技术，是基于Cas9n(D10A)与胞嘧啶脱氨酶或者腺苷脱氨酶融合而成，因此，其除了依赖Cas9识别PAM(例如NGG)外，存在一个“工作窗口”。若spCas9n融合，则它的工作窗口则是距离PAM远端数起4-9位，且在5-7位比较高效地实现基因编辑；若saCas9n融合，则它的工作窗口则是距离PAM远端数起4-12位，且在10-12位比较高效地实现基因编辑。因此，其工作窗口也影响了在基因组上的可编辑的空间，极大的限制了单碱基基因编辑系统应用范围。

因此，本领域迫切需要一种具备较广的工作窗口的单碱基基因组编辑系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于核苷酸序列修饰的组合物，采用该组合物可以对核苷酸序列进行修饰，且具有较广的修饰区域，可以对PAM序列上游的第3-16位区域更广范围内的核苷酸进行修饰，具有较广的应用前景。

本发明的另一目的在于提供上述组合物在在基因突变、基因修复、构建有基因突变导致的疾病动物模型、基因治疗、基因功能筛选、药物筛选或疾病诊断等领域中的应用。采用本发明的组合物，可以针对感兴趣的基因组的目标区域进行修饰。

本发明的另一目的在于提供一种修饰核苷酸序列的方法，采用该用该方法可以对PAM序列上游的第3-16位区域范围的核苷酸核进行修饰，具有较广的核苷酸修饰区域和更广泛的的应用前景。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于核苷酸序列修饰的组合物，其其包括：第一载体和第二载体；

其中，所述第一载体包括5’-3’的式(I)结构：

P_II-X1-L1-X2-PolyA 式(I)；

式(I)中，P_II为II型启动子；X1为突变型Cas9(D10A)核酸酶的编码序列；X2为多肽表位的编码序列，L1为无或连接序列；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

其中，所述第二载体包括5’-3’的式(II)结构：

P_III-Y1-P_II-Y2-L2-Y3或Y4或Y5-L3-Y6-PolyA 式(II)；

式(II)中，P_III为III型启动子；Y1为sgRNA的骨架序列；P_II为II型启动子；Y2为多肽表位的单链抗体结合域的编码序列；L2为无或连接序列；Y3为胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶糖苷酶抑制剂融合编码序列；Y4为野生型腺苷脱氨酶与突变型腺苷脱氨酶融合编码序列；Y5为Y3与Y4融合编码序列；L3为自剪接多肽2A；Y6为筛选标记蛋白表达序列；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，Y5的连接顺序如下：胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶糖苷酶抑制剂-野生型腺苷脱氨酶-突变型腺苷脱氨酶。

本发明利用多肽表位与单链抗体(scFv)的特异性结合特点，通过在Cas9(D10A)核酸酶上融合多个多肽表位，进而可以募集更多的Y3或Y4或Y5，进而使得具有更多的核苷酸序列修饰酶例如胞嘧啶脱氨酶、腺苷脱氨酶可以靶序列进行修饰，使得修饰的范围更广，效率更高。本发明实施例的实验已证明了如此效果，利用该组合物可以对sgRNA所识别的PAM序列上游的第3-16位区域范围的核苷酸进行修饰,即所谓的“工作窗口”得到扩增，大于现有的基因编辑系统，进而具有更高效的基因编辑效率。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，

所述多肽表位为GCN4，所述单链抗体结合域为GCN4抗体的单链抗体结合域；

优选的，所述多肽表位的数量为5-10个；

优选的，所述多肽表位的数量为10个；

进一步地，在本发明的一些实施方案中，

当多肽表位的数量为多个是，相邻两个多肽表位间隔22个氨基酸。

多肽表位的类型可以根据实际情况选自，其并不限于GCN4-Scfv。也可以是其他类型的多肽表位。相应的，单链抗体为相应的多肽表位的单链抗体即可。

多肽表位的数量是影响所募集的修饰酶活性的一个因素，适宜数量的多肽表位，可以通过相应的单链抗体募集合适数量的修饰酶聚集，确保所募集的修饰酶聚集能够发挥正常功能的活性或者具有活性提高的效果。

Cas9(D10A)核酸酶融合5-10个数量的多肽表位，可以使得所募集的修饰酶聚集能够发挥正常功能的活性或者具有活性提高的效果。

当式(II)结构选用Y3时，胞嘧啶脱氨酶可以对靶序列上所有的胞嘧啶(C)脱氨，形成尿嘧啶(U)，在尿嘧啶糖苷酶抑制剂存在的条件下，随着基因组的复制，原位于靶序列上的胞嘧啶(C)的位点突变为胸腺嘧啶(T)，进而实现在该位点的C/G到T/A的突变修饰，实现基因编辑的效果。

当式(II)结构选用Y4时，腺苷脱氨酶可以靶序列上所有的腺嘌呤(A)脱氨，变成肌苷(I)，在基因组复制的过程中，该位点为被当作鸟嘌呤(G)，进而导致在原位于靶序列上的腺嘌呤(A)位点突变为鸟嘌呤(G)，进而实现在该位点的A/T到G/C的突变修饰，实现基因编辑的效果。

当式(II)结构选用Y5时所用修饰酶是胞嘧啶脱氨酶和腺苷脱氨酶的融合体，则可以实现对靶序列上C/G到T/A的突变和A/T到G/C的突变双重修饰效果。

Cas9(D10A)核酸酶可对单链形成切口的活性且不具有对双链切割形成DSB的活性，利用其特性，可以使得胞嘧啶脱氨酶和腺苷脱氨酶发挥核苷酸修饰作用。

容易理解，类似于CRISPR/Cas9的结合原理，本发明利用gRNA的指导序列引导CRISPR复合物结合靶序列的互补序列上，进而发挥其相应的修饰效果或作用。sgRNA的指导序列也可以理解为核心序列，其可以根据感兴趣的基因位点或区域进行设计。

采用本发明提供的核苷酸序列修饰的组合物，可以直接将其或将其与其他辅料混合后注射到生物体内或转染细胞对感兴趣的基因位点或区域进行修饰具有使用方便、修饰空间广等特点。

当多肽表位的数量的10个时，式(II)结构含有Y3时，第一载体和第二载体各自部分的表达元件的模式图如图1所示；图1上方代表第一载体，spCas9n代表突变型Cas9(D10A)核酸酶的编码序列(X1)，10×GCN4代表多肽表位的编码序列(X2)，PA代表PolyA，II型启动子即P_II在图中未示出；图1下方代表第二载体，SCFV代表多肽表位的单链抗体结合域的编码序列(Y2)，Apobec1代表大鼠来源的胞嘧啶脱氨酶编码序列，UGI代表枯草芽孢杆菌噬菌体来源尿嘧啶糖苷酶抑制剂的编码序列，P_III、Y1在图中未示出，2A为自剪接多肽编码序列(L3)；GFP为筛选标记蛋白表达序列(Y6)；将该载体系统(命名为CBE-10×GCN4-scFv)转入生物体或细胞可实现对靶序列上的更广位置上的C/G到T/A的突变修饰。

当多肽表位的数量的10个时，式(II)结构含有Y4时，第一载体和第二载体各自部分的表达元件的模式图如图2所示，图2中TadA为腺苷脱氨酶编码序列，TadA*为腺苷脱氨酶突变体编码序列。将该载体系统(命名为ABE-10×GCN4-scFv)转入生物体或细胞可实现对靶序列上的更广位置的A/T到G/C的突变。将该载体系统转入生物体或细胞可实现对靶序列上的更广位置上的A/T到G/C的突变。

当多肽表位的数量的10个时，式(II)结构含有Y5时，第一载体和第二载体表达各自部分的表达元件的模式图如图3所示。将该载体系统(命名为ACBE-10×GCN4-scFv)转入生物体或细胞可实现对靶序列上的更广位置的C/G到T/A和A/T到G/C的同时突变。

进一步地，在在本发明的一些实施方案中，多肽表位10×GCN4的核酸编码序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在在本发明的一些实施方案中，多肽表位的单链抗体结合域scFv的核酸编码序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，在在本发明的一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶Apobec1的核酸编码序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，在在本发明的一些实施方案中，尿嘧啶糖苷酶抑制剂的编码序列UGI的核酸编码序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，在在本发明的一些实施方案中，腺苷脱氨酶TadA的核酸编码序列如SEQID NO.5所示。

进一步地，在在本发明的一些实施方案中，腺苷脱氨酶突变体TadA*的核酸编码序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，在在本发明的一些实施方案中，自剪接多肽2A的核酸编码序列如SEQID NO.7所示。

第三方面，本发明还提供了一种修饰核苷酸序列的方法，其包括：

给予对象施加如上第一方面所述的组合物或如上第一方面所述的载体系统。

其中，对象可以是细胞、病毒、细菌、动物体或植物体等生物体。

本发明实施例的实验已验证，通过将第一方面所述的组合物或如上第一方面所述的载体系统注射生物体或转染细胞可以实现对靶序列的核苷酸突变，且突变的范围从PAM基序的上游的第3位延伸至第16位，具有更广的修饰空间。

第四方面，本发明还提供了如上所述的用于核苷酸序列修饰的组合物在基因突变、基因修复、构建有基因突变导致的疾病动物模型、基因治疗、基因功能筛选、药物筛选或疾病诊断中应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中的CBE-10×GCN4-scFv载体系统的第一载体和第二载体的部分表达元件的模式图；

图2为本发明实施例ABE-10×GCN4-scFv载体系统的第一载体和第二载体的部分表达元件的模式图；

图3为本发明实施例ACBE-10×GCN4-scFv载体系统的第一载体和第二载体的部分表达元件的模式图；

图4为本发明实施例中的PX330载体的结构示意图；

图5为本发明实施例中的中间载体U6-sgRNA-EF1α-SCFV-MCS-T2A-GFP的结构示意图；

图6为本发明实施例中的采用CBE-10×GCN4-scFv载体系统针对不同靶点的基因编辑效率的检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一、载体构建

1、构建spCas9n-10×GCN4载体系统

1)以来源于pX330(Addgene Plasmid #42230)为骨架，将其Cas9改为Cas9n(D10A)，即为pX330(D10A)。具体实施步骤为：在铂尚生物技术有限公司合成引物(详见表1)，构建不同的质粒用对应不同的引物(以后略)，以pX330为模板，用KOD-Plus-Neo酶(TOYOBO公司，产品编号为：Code:KOD-401)和用表-1中的引物PCR扩增后分别得到PCR-pX330(D10A)-1(205bp)和PCR-pX330(D10A)-2(263bp)，PCR反应体系如下：

模板(质粒DNA)	10-100ng
		10×Kod plus buffer	10μl
dNTP(2μM)	10μl
		MgSO<sub>4</sub>(25mM)	6μl
引物-F	3μl
		引物-R	2μl
Kod plus酶	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	补齐至100μl

运行程序如下：

用AgeI和BglII(购自Thermo)双酶切pX330，酶切条件：37℃、30min。体系体积为20μl，载体2μg，其余均参照Thermo Scientisfic FastDigest Restriction Enzymes的条件进行，酶切反应体系如下：

载体	2μg
		10×Green Buffer	2μl
Enzyme1	1μl
		Enzyme2	1μl
ddH<sub>2</sub>O	补齐至20μl

PCR产物和酶切产物1％-1.5％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物得以纯化，酶切产物割胶回收(Generay公司的薄型琼脂凝胶DNA回收试剂盒)长片段(8127bp)。将胶回收的酶切产物与PCR产物(PCR-pX330(D10A)-1(205bp)和PCR产物(PCR-pX330(D10A)-2(263bp))做Gibson组装(诺唯赞多片段组装试剂盒，体系均参照C113使用说明书)，得pX330(D10A)。

以下载体构建中所使用方法与上述描述方法类似。

2)参照CBh-dCas9-10×GCN4_v4(NCBI GenBank:LC169508.1)合成氨基酸序列为10个串联的GCN4(苏州金唯智公司)到PUC57上，其中GCN4为19个氨基酸(EELLSKNYHLENEVARLKK)的多肽，其中GCN4之间的22个氨基酸(GSGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGGSGSGGSGSGGSGSGGSGSG)长度的连接序列。从pX330上PCR扩增得到片段PCR-spCas9n-10×GCN4-1(1515bp)；从puc57上PCR扩增得片段PCR-puc57(1293bp)；pX330(D10A)用(PmlI和EcoRI)酶切，酶切产物(7140bp)，将该PCR产物和酶切产物均用1％-1.5％琼脂糖凝胶电泳，之后对应片段切胶。将胶回收的酶切产物(7140bp)与PCR产物(PCR-spCas9n-10×GCN4-1(1515bp))、(PCR-puc57(1293bp))做Gibson组装，即得到spCas9n-10×GCN4。

2、构建不同的载体系统CBE/ABE/ACBE-SCFV

以本实验室现有中间载体U6-sgRNA-EF1α-SCFV-MCS-T2A-GFP(其序列如下)为基础，在些基础上构建不同的SCFV-CBE/ABE/ACBE，所用引物如表1所示。

中间载体U6-sgRNA-EF1α-SCFV-MCS-T2A-GFP的序列如下：

AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGCTATGCATCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCAGGCCTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACG ATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTA GAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACT TGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTT AGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT TAGGCCTGAATTCTGCAGATATCGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAG TTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTA CTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCA ACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCT TGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAG AGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCG CGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGAC CTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTT GGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACC GAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGC CCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGG AGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTC CTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGA GTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTT AGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCC TCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACGTACGGCCACCCATGGGCCCCGACATCGTG ATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCCGCAGCAGCACCGGCGC CGTGACCACCAGCAACTACGCCAGCTGGGTGCAGGAGAAGCCCGGCAAGCTGTTCAAGGGCCTGATCGGCGGCACCA ACAACCGCGCCCCCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCCTGATCGGCGACAAGGCCACCCTGACCATCAGCAGC CTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTTCTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGCCAGGGCACCAA GGTGGAGCTGAAGCGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAGCGGCGGCGGCAGCG AGGTGAAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAAGCTGAGCTGCGCCGTGAGCGGC TTCAGCCTGACCGACTACGGCGTGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCGCGGCCTGGAGTGGATCGGCGTGATCTG GGGCGACGGCATCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGGACCGCTTCATCATCAGCAAGGACAACGGCAAGAACACCG TGTACCTGCAGATGAGCAAGGTGCGCAGCGACGACACCGCCCTGTACTACTGCGTGACCGGCCTGTTCGACTACTGG GGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGGTGGAGGCGGAGGTTCTGG GGGAGGAGGTAGTGGCGGTGGTGGTTCAGGAGGCGGCGGAAGCCCTAAGAAAAAGAGGAAGGTGCACAGTACTACGCGTGTCGACGCTAGCTCGCGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAGTG AGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTT CAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGC TGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATG AAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG CAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACT TCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGAC AAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCA CTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCC TGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGC ATGGACGAGCTGTACAAGTAAGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATT GCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAG TTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA

上述序列中：第1处下划线为U6启动子序列，第2处下划线为SgRNA scaffold序列，第3处下划线为EF1α启动子序列，第4处下划线为scFV序列，第5处下划线为GFP序列，第6处下划线为PolyA序列。

表1本发明实施例中所用的引物序列

2.1SCFV-CBE工作系统

以BE3(Addgene Plasmid #89508)为模板，用引物(详见表1)扩增得到PCR片段CBE-SCFV-1(763bp)，片段CBE-SCFV-2(337bp)，Sca1和Nru1酶切U6-sgRNA-EF-1α-SCFV-MCS-T2A-GFP回收PCR产物及对应酶切产物，之后Gibson组装，即可得到CBE-10×GCN4-SCFV的第二工作系统。

2.2SCFV-ABE工作系统

以pCMV-ABE7.10(Addgene Plasmid #102919)为模板，PCR扩增得到ABE的片段(1147bp)，Sca1和Nru1酶切U6-sgRNA-EF-1α-SCFV-MCS-T2A-GFP，回收PCR产物及对应酶切产物，之后Gibson组装即可得到ABE-10×GCN4-SCFV的第二工作系统。

2.3SCFV-ACBE工作系统

以CBE-SCFV为模板，扩增得片段ACBE-SCFV-1(1027bp)，以ABE-SCFV为模板，扩增得片段ACBE-SCFV-2(1149bp)，Sca1和Nru1酶切U6-sgRNA-EF-1α-SCFV-MCS-T2A-GFP，回收PCR产物及对应酶切产物，之后Gibson组装即可得到ACBE-10×GCN4-SCFV的第二工作系统。

3、靶点质粒的设计与构建

3.1靶点序列的设计

靶点设计基本原则：

在NCBI找取人基因相应的靶点序列如表-2。若测试CBE-10×GCN4-SCFV使其靶点范围内尽可能含C；若测试ABE-10×GCN4-SCFV使其靶点范围内尽可能含A；若测试ACBE-10×GCN4-SCFV使其靶点范围内尽可能含AC。类似于CRISPR/Cas9靶点oligo设计策略如表-3，sgRNA以U6为启动子，需要G作为转录起始位点，如正向oligo是在靶点5`端添加CACCG，反向oligo是靶点的互补链5`端添加AAAC。

表2测试不同工作系统的靶点序列

CBE-10×GCN4-SCFV

ABE-10×GCN4-SCFV

靶点名称	序列(5`-3`)
		CCR5-sgRNA1-P	TGACATCAATTATTATACATCGG
CCR5-sgRNA1	TAATAATTGATGTCATAGATTGG
		CCR5-sgRNA2	GTGAGTAGAGCGGAGGCAGGAGG

ACBE-10×GCN4-SCFV

表3测试不同工作系统所设计的靶点oligo设计

CBE-10×GCN4-SCFV

ABE-10×GCN4-SCFV

ACBE-10×GCN4-SCFV

3.2靶点质粒构建

合成表-3中的sgRNA oligo

3.2.1将oligo用纯水溶解，终浓度为100μM。

3.2.2退火。两条互补oligo各取10μL混合，并放入沸水浴煮5min后，自然降温至室温，约2小时。

3.2.3连接。将不同工作系统的第二载体用BbsI酶切后的载体分别与退火后的sgRNA(退火sgRNA用无菌水稀释100倍)按以下反应体系进行连接反应。

退火后的sgRNA，1μL；BbsI酶切的载体1μL(10-50ng)；T4连接酶1μL；10x T4buffer 1μL，H₂O补足至10μL。

室温连接60min后，取5μL转化至50μL感受态细菌中，涂卡那霉素抗性板，37℃培养过夜。

3.2.4从过夜培养的培养板中，挑取2个克隆，接种于4-5mL培养液，摇床37℃，220r/min培养过夜。

3.2.5摇菌培养过夜后，提取质粒，并用M13R测序验证，测序正确质粒。

二、CBE/ABE/ACBE-10×GCN4-SCFV对内源基因工作窗口及工作效率的检测

1.质粒转染

第1天用293T细胞铺种24孔板。

1.1消化HEK293T细胞，按照2.0×10⁵cell/孔接种24孔板。

注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验。

第2天转染

1.2观察各孔细胞状态。

注：要求转染前细胞密度应为80％-95％，且状态正常。

1.3为保证数据的准确性和实验的可重复性，用无菌水稀释质粒，将各组质粒浓度

稀释至一致，或保证各组之间的质粒样品体积相同。

组别设置如下：

Blank:空白对照，仅包括培养的细胞和培养基；

处理组，每孔分别为不同的工作系统，分别为:

spCas9n-10×GCN4：CBE/ABE/ACBE-SCFV＝250ng:250ng

设置n＝3孔/组。

1.4向1.5mLEP管中加入DMEM(无血清，无抗生素)。

1.5将DNA质粒加入到第(1.4)步的EP管中，混匀。

1.6将转染试剂PEI加入到上一步的EP管中，混匀，室温静置20分钟。

1.7将转染混合液加到24孔板中。轻轻敲击24孔板以混匀。

1.8 37℃，5％CO2，培养120h后，通过FACS分选GFP阳性细胞。

2.分选GFP阳性细胞及突变效率检测

第5天

2.1.120h后，流式分选GFP阳性细胞。

2.2.用天根细胞基因组提取试剂盒提取分选的GFP阳性细胞基因组DNA。

2.3.对提取的细胞基因组PCR包括有目的靶点约200bp,PCR各靶点，之后利用Hi-TOM基因编辑位点检测试剂盒(诺禾致源)准备测序样品进行高通量测序，并通过网站-http://www.hi-tom.net/hi-tom/进行分析深度测序结果，统计分析CBE/ABE/ACBE-10×GCN4-SCFV对内源性基因工作窗口及工作效率。结果图6所示。

实验结果表明：使用CBE-10×GCN4-scFv载体系统，可使靶点EMX1-sgRNA2-P,AAVS1-sgRNA2-P可以实现3-16位的C/G到T/A的高效突变。对比现有的C/G到T/A转换工具CBE(BE3,SaKKH-BE3)，其工作窗口为3-7(BE3)或4-12(SaKKH-BE3)位C,因此，CBE-10×GCN4-scFv有效地拓展了现有CBE的工作窗口。同理类推，ABE-10×GCN4-SCFV载体系统，可使靶序列上的更宽位置的A/T到G/C的突变；转染ACBE-10×GCN4-SCFV载体系统，可使靶序列上的更宽位置的C/G到T/A和A/T到G/C的同时突变。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海邦耀生物科技有限公司

<120> 用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaggagcttc tgagcaaaaa ctatcacctc gaaaacgagg ttgcgcgact gaagaaagga 60

agcgggtccg gtggaagtgg ctccggatct ggaggttctg gcagcggagg tagcggcagt 120

ggcgaagagc tccttagtaa gaactatcat ctggaaaatg aggtagcgcg cttaaagaaa 180

gggtcgggaa gtggcggcag cggaagtggg agtggaggga gcggttctgg cggttccggc 240

agtggagagg agttgctgtc taagaactac cacttagaaa acgaagtcgc acggctaaaa 300

aaaggttccg gctccggcgg ctccggttct ggaagcgggg gctcgggatc aggtggatct 360

ggatcaggag aggaattgct ttccaaaaac taccaccttg agaatgaggt ggccaggtta 420

aagaagggga gcggctcggg gggtagtgga tcggggtcgg gcgggtcagg aagcggtggt 480

agcggatctg gggaggagct gctctcgaag aattaccatt tggagaacga agtggcgaga 540

ctaaagaagg gaagcggtag tggtggttca gggtctggtt caggtggcag tgggtctggg 600

ggctcagggt ccggtgaaga gttattatct aagaactatc atttagagaa tgaggtggcc 660

cgtctgaaga agggctctgg ttccggcggt tctggctccg gttccggagg ttccggctct 720

ggcggtagcg gatctggtga ggaactgctg tccaaaaact atcatctgga gaatgaggtt 780

gcccgtctga aaaaaggtag cggcagcggt ggatccggtt ccggtagcgg aggctccgga 840

tccggtggct ctggaagcgg cgaggagtta ttgtctaaga attaccacct cgagaacgag 900

gtcgctaggc tgaaaaaggg cagcggttcc ggcggttctg gatctggctc cggtggttct 960

ggttccggcg gttccggttc cggcgaggag ctgctgtcta aaaattatca cttagaaaac 1020

gaggttgcta ggttaaaaaa gggctccggc tccggaggtt ccggttccgg ttctggcggc 1080

agcggctctg gtggaagcgg ttctggagag gagctgttat ccaagaacta ccacttagaa 1140

aatgaggtcg ctcgtttaaa gaaaggctcc ggttctggag gttccggctc tggtagcggc 1200

ggcagcggct ctggtggcag cggtagcggt 1230

<210> 2

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggccccgaca tcgtgatgac ccagagcccc agcagcctga gcgccagcgt gggcgaccgc 60

gtgaccatca cctgccgcag cagcaccggc gccgtgacca ccagcaacta cgccagctgg 120

gtgcaggaga agcccggcaa gctgttcaag ggcctgatcg gcggcaccaa caaccgcgcc 180

cccggcgtgc ccagccgctt cagcggcagc ctgatcggcg acaaggccac cctgaccatc 240

agcagcctgc agcccgagga cttcgccacc tacttctgcg ccctgtggta cagcaaccac 300

tgggtgttcg gccagggcac caaggtggag ctgaagcgcg gcggcggcgg cagcggcggc 360

ggcggcagcg gcggcggcgg cagcagcggc ggcggcagcg aggtgaagct gctggagagc 420

ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggcagc ctgaagctga gctgcgccgt gagcggcttc 480

agcctgaccg actacggcgt gaactgggtg cgccaggccc ccggccgcgg cctggagtgg 540

atcggcgtga tctggggcga cggcatcacc gactacaaca gcgccctgaa ggaccgcttc 600

atcatcagca aggacaacgg caagaacacc gtgtacctgc agatgagcaa ggtgcgcagc 660

gacgacaccg ccctgtacta ctgcgtgacc ggcctgttcg actactgggg ccagggcacc 720

ctggtgaccg tgagcagcta cccatacgat gttccagatt acgctggtgg aggcggaggt 780

tctgggggag gaggtagtgg cggtggtggt tcaggaggcg gcggaagc 828

<210> 3

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agctcagaga ctggcccagt ggctgtggac cccacattga gacggcggat cgagccccat 60

gagtttgagg tattcttcga tccgagagag ctccgcaagg agacctgcct gctttacgaa 120

attaattggg ggggccggca ctccatttgg cgacatacat cacagaacac taacaagcac 180

gtcgaagtca acttcatcga gaagttcacg acagaaagat atttctgtcc gaacacaagg 240

tgcagcatta cctggtttct cagctggagc ccatgcggcg aatgtagtag ggccatcact 300

gaattcctgt caaggtatcc ccacgtcact ctgtttattt acatcgcaag gctgtaccac 360

cacgctgacc cccgcaatcg acaaggcctg cgggatttga tctcttcagg tgtgactatc 420

caaattatga ctgagcagga gtcaggatac tgctggagaa actttgtgaa ttatagcccg 480

agtaatgaag cccactggcc taggtatccc catctgtggg tacgactgta cgttcttgaa 540

ctgtactgca tcatactggg cctgcctcct tgtctcaaca ttctgagaag gaagcagcca 600

cagctgacat tctttaccat cgctcttcag tcttgtcatt accagcgact gcccccacac 660

attctctggg ccaccgggtt gaaa 684

<210> 4

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actaatctgt cagatattat tgaaaaggag accggtaagc aactggttat ccaggaatcc 60

atcctcatgc tcccagagga ggtggaagaa gtcattggga acaagccgga aagcgatata 120

ctcgtgcaca ccgcctacga cgagagcacc gacgagaatg tcatgcttct gactagcgac 180

gcccctgaat acaagccttg ggctctggtc atacaggata gcaacggtga gaacaagatt 240

aagatgctct ct 252

<210> 5

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcgaggtgg agttcagcca cgagtactgg atgagacacg ccctgaccct ggctaagaga 60

gcttgggatg agagagaggt gcccgtggga gctgttctgg ttcataacaa cagggtgatc 120

ggcgagggat ggaacagacc tatcgggaga cacgacccaa ccgctcatgc tgaaatcatg 180

gccctgagac aaggagggct ggtgatgcaa aattacagac tgatcgacgc aaccctgtac 240

gtgaccctgg agccttgtgt gatgtgcgca ggagcaatga tccactccag aatcggcaga 300

gtggtgttcg gagctagaga tgccaaaacc ggagccgctg gaagcctgat ggacgttctg 360

catcaccccg gaatgaatca cagagtggag ataaccgagg gcattctggc cgacgagtgt 420

gctgctctgc tgtctgattt cttcagaatg agaaggcagg aaatcaaggc ccagaaaaag 480

gcccaaagca gcaccgac 498

<210> 6

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcagaagtcg agttcagcca tgagtattgg atgagacatg ctctgaccct ggcaaagaga 60

gcaagagacg agagagaggt cccagtggga gcagttctgg tgctgaacaa cagagtgatc 120

ggggaggggt ggaacagagc aatcggactg cacgacccta cagcacacgc agaaataatg 180

gcactgagac aaggggggct cgtgatgcaa aactacaggc tgatcgacgc caccctgtac 240

gtcacatttg agccctgtgt gatgtgtgcc ggagccatga ttcacagtag aatcggccgg 300

gtggtgttcg gtgtgagaaa cgctaaaaca ggcgccgccg gaagcctgat ggatgttctg 360

cattaccccg gcatgaatca ccgggtggag atcacagagg gcatcctggc tgacgaatgt 420

gccgctctgc tgtgttactt cttcagaatg ccccgacaag tgttcaacgc ccagaagaaa 480

gcccagtcaa gcaccgac 498

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg ccca 54

Claims

1.一种用于核苷酸序列修饰的组合物，其特征在于，

其包括：第一载体和第二载体；

其中，所述第一载体包括5’-3’的式（I）结构：

P_II-X1-L1-X2-PolyA 式（I）；

式（I）中，P_II为II型启动子；X1为突变型Cas9（D10A）核酸酶的编码序列；X2为多肽表位的编码序列，L1为无或连接序列；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

其中，所述第二载体包括5’-3’的式（II）结构：

P_III-Y1-P_II-Y2-L2-Y3 式（II）；

式（II）中，P_III为III型启动子；Y1为sgRNA的骨架序列；P_II为II型启动子；Y2为多肽表位的单链抗体结合域的编码序列；L2为无或连接序列；Y3为胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶糖苷酶抑制剂融合编码序列；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Y3的连接顺序如下：胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶糖苷酶抑制剂-野生型腺苷脱氨酶-突变型腺苷脱氨酶；

所述多肽表位为GCN4，所述单链抗体结合域为GCN4单链抗体结合域；

所述多肽表位的数量为5-10个；

X2的序列如SEQ ID NO.1所示，Y2的序列如SEQ ID NO.2所示， Y3中胞嘧啶脱氨酶的核酸编码序列如SEQ ID NO.3所示，Y3中尿嘧啶糖苷酶抑制剂的编码序列如SEQ ID NO.4所示，Y3中腺苷脱氨酶的核酸编码序列如SEQ ID NO.5所示，Y3中突变型腺苷脱氨酶的核酸编码序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种修饰核苷酸序列的方法，其特征在于，其包括：

给予对象施加权利要求1所述的组合物，所述方法以非疾病的治疗为目的。

3.权利要求1所述的用于核苷酸序列修饰的组合物在构建有基因突变导致的疾病动物模型、基因功能筛选或药物筛选中应用。