CN106554967A - 干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，涉及靶向激活HIV-1潜伏感染细胞的CRISPR/Cas9转录系统及其制备方法和在用于艾滋病基因治疗中应用。本发明中通过基于靶向HIV调控区sgRNA的dCas9-SunTag-VP64系统，提供新的、精确的放大开启基因表达的方法，使HIV潜伏感染细胞中的HIV-1前病毒得以高效、特异性激活，为后续的病毒清除奠定了基础。本发明涉及的靶向激活HIV-1潜伏感染细胞的CRISPR/Cas9转录系统可用于激活潜伏感染细胞的HIV-1前病毒，进一步用于制订艾滋病基因治疗干预措施。

Description

干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统的制备及应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及CRISPR/Cas9转录系统及其制备方法和应用，具体涉及靶向激活HIV-1潜伏感染细胞的CRISPR/Cas9转录系统及其制备方法和在用于艾滋病基因治疗中应用。

背景技术

现有技术公开了艾滋病即获得性免疫缺陷综合症，是一种由人体免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的严重传染性疾病。所述病毒主要感染并破坏人体免疫系统中最重要的CD4+T淋巴细胞，导致免疫机能缺陷，抵抗力降低，最终患者由于各种机会性感染而死亡。研究实践显示，HIV于1981在临床诊断中被发现，随着人类对病毒及其感染过程的分子生物学研究以及药物研发的不断创新，艾滋病的治疗已经有了突飞猛进的发展。高效抗逆转录病毒疗法(High Active Antiretroviral Therapy，HAART)已经可以成功的将患者外周血病毒量控制在临床检测水平以下(小于50拷贝/mL)，显著提高了患者的生存率和生存质量(Yeni，P.G.et al.Treatment for adult HIV infection：2004recommendations of the International AIDS Society-USA Panel.JAMA.2004，292：251-65；Blankson，J.N.et al.The challenge of viral reservoirs in HIV-1 infection.Annu Rev Med.2002，53：557-93)；人们曾寄希望于凭借HAART完全清除体内的HIV，从而达到彻底治愈AIDS的目的，但遗憾的是随后的实践证明，一旦停止药物治疗，所述病毒载量又会反弹到治疗前水平(Ho，D.D.Toward HIVeradication or remission：the tasks ahead.Science，1998.280：1866-1867.)。研究显示，HIV难以在体内被完全清除的一个重要原因是患者体内存在潜伏病毒储存库，该潜伏病毒储存库主要是由长期潜伏感染的休眠记忆CD4+T细胞和在感染初期活化的CD4+T细胞被HIV-1感染后转化为记忆T细胞构成，通常潜伏细胞在未受刺激时不表达病毒基因，因而可以逃避机体免疫系统或抗逆转录病毒药物作用(Chun，T.W.and Fauci，A.S.Latent reservoirs of HIV：obstacles to theeradication of virus.Proc Natl Acad Sci U S A，1999.96：10958-61.)，尽管感染个体携带潜伏感染细胞数量较少，但衰减率是如此之慢，以至于欲在个体生存期内仅靠HAART治疗将其彻底清除至少目前而言是不可能的.因此，HIV潜伏感染的静息CD4+T细胞是构成机体内病毒储藏库(reservoir)的主要部分，同时也是目前临床治疗不能彻底清除HIV的巨大障碍[Finzi，D.et al.Latent infection of CD4+T cells provides a mechanism for life long persistence of HIV-1，even in patients oneffective combination therapy.Nature Med.1999，5，512-517]；为了清除潜伏感染细胞，研究者提出了“激活后再清除”策略，即试图通过诱导剂来激活潜伏感染细胞中前病毒表达，另一方面，加强机体免疫系统使其识别并杀灭激活的潜伏感染细胞，同时结合HAART疗法保护细胞免受HIV感染(Richman et al.TheChallenge ofFinding a Cure for HIV Infection，Science，2009，1304，323)。目前用于激活HIV-1潜伏库的药物大致可分为以下几种：(1)细胞因子和趋化因子：如肿瘤坏死因子a(TNF-a)；(2)组蛋白去乙酰化酶抑制剂：如SAHA和VPA；(3)组蛋白甲基化转移酶抑制剂：如BIX01294；(4)DNA甲基化转移酶抑制剂：主要是5-Aza以及它的衍生物；(5)蛋白激酶C激活剂：如prostratin和bryostatin-1；(6)正向转录延长因子激活剂：如HMBA和JQ1(S)；(7)其它尚未命名的物质：如disulfiram(Xing，S.and Siliciano，R.F.Targeting HIV latency：pharmacologic strategies toward eradication，Drug Discov Today，2013.18，541-51)等等；上述诱导剂分别与高效抗逆传录病毒疗法结合在临床上已取得了初步疗效，但仍存在着譬如激活效率不高或缺少靶向性及毒副作用等问题，所以本领域研究人员致力于开发更加安全有效的激活药物或找到可以协同使用的药物。

有研究公开了人工设计的转录效应因子系统在靶向调控基因表达和生物功能方面显示出一定的优势，该系统包含特异性结合基因组序列的DNA结合结构域和转录效应结构域两部分：锌指蛋白(zinc finger proteins，ZFPs)和转录激活子样效应因子(transcription activator-like effectors，TALEs)介导细胞中基因转录调控为最先代表。复旦大学朱焕章教授课题组首次利用锌指蛋白(Wang P et al.Specific reactivation of latent HIV-1 with designer zinc-finger transcription factorstargeting the HIV-1 5′-LTR promoter.Gene therapy.2014，21：490-495)和转录激活子样效应因子(Wang X et al.Designed TALE proteins efficiently induced theexpression of latent HIV-1 in latently infected cells.Aids Res Hum Retrov.2015，31：98-106)介导的转录激活系统实现对HIV-1潜伏感染细胞模型的有效和特异激活研究，激活效率为30％左右；但是ZFPs和TALEs使用的同时存在有很多的限制：例如基因组特定序列的限制、需要大规模筛选、模块的步步组装等繁琐过程，因此，在调控基因表达方面尚不能被广泛应用。

最近基于成簇的规律间隔的短回文重复序列CRISPR(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat)新一代基因编辑工具CRISPR/Cas9的出现带来了很多的优越性，由于该系统中简便设计的sgRNA，因此在基因治疗领域中备受关注；在后续的研究报道中显示将内切酶失活的dCas9(dead Cas9)与转录激活结构域结合，可以实现对靶标基因的表达上调；最初的研究中显示dCas9与一个拷贝的激活结构域(VP64)结合(dCas9-VP64)介导对目的基因的激活效率不是很理想，在一定程度上限制了应用；为了解决效率低这一问题，后续的研究中显示利用多个非重叠(non-overlapping)的sgRNAs结合使用介导dCas9-VP64对特定基因表达进行调控，虽然，提高了激活效率，可是需要同时转入多个sgRNAs到靶细胞中；Tanenbaum等人另辟蹊径，将dCas9与24个拷贝的生物活性小分子(24-GCN4_-V4)融合并作为诱饵(dCas9-24-GCN4_-V4)，招募融合有多个VP64的特异性针对GCN4_-V4的单链抗体[single chain fragmentvariable，(scFv)-GCN4-VP64]于启动子区域，实现对目的基因精确和放大性调控(Tanenbaum，ME et al.A protein-tagging system for signal amplification in geneexpression and fluorescence imaging.Cell.2014，159：635-646)；该dCas9-SunTag-VP64系统不仅可以改善和提高基因调控的技术，同时为探究基因组中所有基因的生物学功能提供了可能。

目前，利用ZFPs和TALEs介导对HIV-1病毒潜伏感染的细胞模型特异性激活研究已有报道；但是利用最新的CRISPR/Cas9技术并借助SunTag系统靶向HIV-1 LTR(long terminal repeat)启动子区域并特异性激活潜伏感染细胞的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的研究基础上，提供干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统及其制备方法。

本发明涉及的靶向激活HIV-1潜伏感染细胞的CRISPR/Cas9转录系统可用于激活潜伏感染细胞的HIV-1前病毒，进一步用于制订艾滋病基因治疗干预措施。

本发明中通过基于靶向HIV调控区sgRNA的dCas9-SunTag-VP64系统，提供一种新的、精确的放大开启基因表达的方法，使HIV潜伏感染细胞中的HIV-1前病毒得以高效、特异性激活，为后续的病毒清除奠定了基础。

本发明的用于激活潜伏感染细胞中的HIV-1前病毒的dCas9-SunTag-VP64转录系统由如下成分构成：

(1)pHR重组载体：dCas9-24×GCN4_-V4；

(2)pHR重组载体：scFv-GCN-sfGFP-VP64；

(3)pZDonor重组载体：sgRNA。

本发明中，sgRNA重组载体来源于pZDonor。

本发明中，sgRNAs特异靶向HIV-1 LTR不同区域；所述的用于特异靶向HIV-1 LTR不同区域的sgRNAs核苷酸序列为：

本发明的靶向激活HIV-1潜伏感染细胞的CRISPR/Cas9转录系统通过下述方法制备：利用dCas9-24×GCN4_-V4(#60910)和scFv-GCN4-GFP-VP64(#60904)表达质粒与sgRNA表达质粒(#47108)(购自addgene)共同转入到细胞中，借助sgRNA与基因组中的靶序列特异性结合实现dCas9-SunTag-VP64系统对HIV-1病毒潜伏感染细胞的激活；其包括：

识别位点的确定：HIV-1 LTR启动子在不同病毒株亚型中保守性最高，所以成为本发明中理想的靶点，为了能够获得与LTR结合效率最理想且介导dCas9-SunTag-VP64激活效率最明显的sgRNA，本发明中，在转录起始位点上、下游设计并合成多个sgRNAs寡核苷酸，通过http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站与人基因组中可能出现相似或者相同的序列进行比对检查，最终确定了如下表1所示的候选的sgRNAs作为实验中的筛选位点：

表1

质粒构建：表达sgRNA的质粒来源于addgene(#47108)，以HIV-1 LTR为靶标，将设计的多个sgRNAs依次克隆到sgRNA表达载体中，获得特异性靶向病毒LTR的sgRNA表达质粒；

sgRNAs体外筛选：将dCas9-VP64或dCas9-SunTag-VP64(包含dCas9-24×GCN4_-V4和scFv-GCN4-GFP-VP64)表达质粒、识别HIV-1 LTR不同区域的sgRNA表达质粒、由LTR驱动的萤火虫荧光素报告基因表达系统(LTR-luc)和作为内参对照的海参荧光素酶报告基因检测系统(pRL-SV40)共同转入人胚胎肾源细胞(Human Embryonic Kidney 293T，HEK293T)细胞内，三天后收取细胞并裂解，将上清用于检测萤火虫荧光素酶报告基因表达活性；将连有靶点的sgRNA可以介导dCas9-SunTag-VP64特异性结合在LTR启动子上并有效上调萤火虫荧光素酶报告基因表达量，而在dCas9-VP64系统却未见有明显的报告基因表达水平，作为本发明在筛选结合活性理想的sgRNA的同时也可以间接说明dCas9-SunTag-VP64系统的高效性；结果显示，在转录起始位点上游-164到-146bp之间的sgRNA(sgRNA6)可以介导dCas9-SunTag-VP64高效激活报告基因表达水平，相对sgRNA空载体而言，报告基因激活水平可达5倍，而在dCas9-VP64系统中却没有检测到报告基因表达水平的上升，以上sgRNA结合活性筛选实验间接说明dCas9-SunTag-VP64系统相对dCas9-VP64系统介导的基因激活效果明显；

dCas9-SunTag-VP64介导HIV-1前病毒在潜伏感染细胞中的激活研究：

HIV-1病毒潜伏感染Jurkat细胞模型来源于本实验室构建(C11)和NIHAIDS馈赠(J-LatA10.6)，均简称IN细胞；转入IN细胞内的假病毒带有EGFP报告基因，如果HIV-1前病毒被激活，细胞带有绿色荧光，证明潜伏感染的HIV-1病毒被激活；值得一提的是，因其从addgene购买的scFV-GCN4-GFP-VP64表达载体中带有绿色荧光基因，与潜伏感染细胞模型中带有的绿色荧光蛋白会混淆，所以在本实验中预先将scFV-GCN4-GFP-VP64表达载体中的GFP通过BstBI和BamH I酶切位点进行酶切、回收，然后补平并重新连接形成scFV-GCN4-VP64表达载体，本发明中，将dCas9-24×GCN4_-V4和scFv-GCN4-VP64表达载体命名为dCas9-SunTag-VP64(δGFP)；细胞培养于添加了10％的胎牛血清，1％的青链霉素和RPMI1640培养基中；本发明中将体外筛选获得的高效靶向HIV-1 5’-LTR的sgRNA6表达载体(sgRNA6-LTR)或者sgRNA空载体(sgRNA empty)和dCas9-VP64或是dCas9-SunTag-VP64(δGFP)通过电转途径导入IN细胞内，电转后的72h，观察各个组内的GFP阳性细胞百分比，间接提示HIV-1前病毒激活的效率；结果显示，转有sgRNA6-LTR和dCas9-SunTag-VP64(δGFP)组内的绿色荧光细胞经流式进一步验证为30％；未做任何处理的IN细胞或是sgRNA空载体组未观察到明显的激活效果，约为2％-8％左右，相同条件下在dCas9-VP64系统中未见任何明显的绿色荧光细胞数目增多，各个组内的GFP阳性细胞数目在流式仪器检测之后均保持在10％左右；实验结果说明dCas9-SunTag-VP64可以有效激活HIV-1病毒潜伏感染的细胞模型。

本发明的制备方法中，克隆序列可以采用PCR，人工合成，酶切等方法实现，拼接序列则可能采用酶切、退火、连接粘性末端等方法实现。

本发明中，所适用宿主包括各种真核生物。

本发明中，携带dCas9-SunTag-VP64的表达质粒系统应用的宿主细胞可以是静止细胞或者分裂细胞。

本发明中，携带dCas9-SunTag-VP64的表达质粒系统被证实在两种HIV-1潜伏感染细胞模型中激活，效率达到30％左右。

本发明提供干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统及其制备方法，所述转录系统能高效、特异性激活HIV-1潜伏感染细胞的HIV-1前病毒，为后续的病毒清除奠定了基础，进一步可用于制订艾滋病基因治疗干预措施。

附图说明

图1.dCas9-24×GCN4_-V4重组载体结构示意图。

图2.scFv-GCN4-sfGFP-VP64重组载体结构示意图。

图3.sgRNA表达载体示意图。

图4.sgRNA表达载体克隆方法示意图。

图5.针对HIV-1 LTR的sgRNA靶点序列。

图6.体外筛选用于介导dCas9-SunTag-VP64激活HIV LTR的sgRNAs。

图7.dCas9-SunTag-VP64介导HIV-1病毒在潜伏感染细胞中的激活。

具体实施方式

实施例1

体外筛选用于介导dCas9-SunTag-VP64激活HIV-1 LTR的sgRNAs

将dCas9-SunTag-VP64(包含dCas9-24×GCN4_-V4和scFv-GCN4-GFP-VP64)表达质粒、识别HIV-1 LTR不同区域的sgRNA表达质粒、由LTR驱动的萤火虫荧光素酶报告基因表达系统(LTR-luc)和作为内参对照的海参荧光素酶报告基因检测系统(pRL-SV40)共同转入人胚胎肾源细胞HEK293T细胞内；按照相同转染条件，将dCas9-VP64转录激活系统做转染测试，三天后收取、裂解细胞并将上清用于检测萤火虫荧光素酶报告基因表达活性；将连有靶点的sgRNA可以介导dCas9-SunTag-VP64特异性结合在LTR启动子上并有效上调萤火虫荧光素酶报告基因表达量，而在dCas9-VP64系统却未见有明显的报告基因表达水平，作为在筛选结合活性理想的sgRNA的同时也可以间接说明dCas9-SunTag-VP64系统的高效性的评定标准；结果显示，在转录起始位点上游-164到-146bp之间的sgRNA(sgRNA6)可以介导dCas9-SunTag-VP64高效激活报告基因表达水平，相对sgRNA空载体而言，报告基因激活水平可达5倍，而在dCas9-VP64系统中却没有检测到报告基因表达水平的上升，实验结果说明dCas9-SunTag-VP64系统相对dCas9-VP64系统介导的基因激活效果明显。

实施例2

dCas9-SunTag-VP64介导HIV-1病毒在潜伏感染细胞中的激活

HIV-1病毒潜伏感染Jurkat细胞模型来源于本实验室构建(C11)和NIHAIDS馈赠(J-Lat A10.6)，均简称IN细胞；

转入IN细胞内的假病毒带有EGFP报告基因，如果HIV-1前病毒被激活，细胞带有绿色荧光，证明潜伏感染的HIV-1病毒被激活；本实验中，因从addgene购买的scFV-GCN4-GFP-VP64表达载体中带有绿色荧光基因，与潜伏感染细胞模型中带有的绿色荧光蛋白会产生混淆，所以在本实验中预先将scFV-GCN4-GFP-VP64表达载体中的GFP通过BstB I和BamH I酶切位点进行酶切、回收，然后补平并重新连接形成scFV-GCN4-VP64表达载体，将dCas9-24×GCN4_-V4和scFv-GCN4-VP64表达载体命名为dCas9-SunTag-VP64(δGFP)；细胞培养于添加了10％的胎牛血清，1％的青链霉素和RPMI1640培养基中，将体外筛选获得的高效靶向HIV-1 5’-LTR的sgRNA6表达载体(sgRNA6-LTR)或者sgRNA空载体(sgRNA empty)和dCas9-VP64或是dCas9-SunTag-VP64(δGFP)通过电转途径导入IN细胞内，电转后72h，观察各个组内的GFP阳性细胞百分比，间接提示HIV-1前病毒激活的效率；

结果显示，转有sgRNA6-LTR和dCas9-SunTag-VP64(δGFP)组内的绿色荧光细胞经流式进一步验证为30％；未做任何处理的IN细胞或是sgRNA空载体组未观察到明显的激活效果，约为2％-8％左右，相同条件下在dCas9-VP64系统中未见任何明显的绿色荧光细胞数目增多，各个组内的GFP阳性细胞数目在流式仪器检测之后均保持在10％左右；实验结果说明dCas9-SunTag-VP64可以有效激活HIV-1病毒潜伏感染的细胞模型。

Claims (6)

1.干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统，其特征在于，通过基于靶向HIV调控区sgRNA的dCas9-SunTag-VP64转录系统，放大开启基因表达，高效、特异性激活HIV潜伏感染细胞中的HIV-1前病毒。

2.按权利要求1所述的干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统，其特征在于，所述的dCas9-SunTag-VP64转录系统由如下成分构成：

(1)pHR重组载体：dCas9-24×GCN4_-V4；

(2)pHR重组载体：scFv-GCN-sfGFP-VP64；

(3)pZDonor重组载体：sgRNA。

3.按权利要求1所述的干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统，其特征在于，所述的sgRNA重组载体来源于pZDonor。

4.按权利要求1所述的干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统，其特征在于，用于特异靶向HIV-1LTR不同区域的sgRNAs核苷酸序列为：

5.按权利要求1所述的干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统，其特征在于，通过下述方法制备：利用dCas9-24×GCN4_-v4(#60910)和scFv-GCN4-GFP-VP64(#60904)表达质粒与sgRNA表达质粒(#47108)共同转入到细胞中，借助sgRNA与基因组中的靶序列特异性结合实现dCas9-SunTag-VP64系统对HIV-1病毒潜伏感染细胞的激活；其包括：

识别位点的确定；质粒构建：sgRNAs体外筛选以及dCas9-SunTag-VP64介导HIV-1前病毒在潜伏感染细胞中的激活实验。

6.权利要求1所述的干预HIV-1潜伏的CRISPR/Cas9转录系统在用于制订艾滋病基因治疗干预措施中的用途。