CN112111490A - 一种可视化活细胞中内源性低丰度单分子rna的方法及应用 - Google Patents

一种可视化活细胞中内源性低丰度单分子rna的方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种可视化活细胞中内源性低丰度单分子RNA的方法及应用，建立了一种CRISPR‑Sunspot成像系统，可以显著提高活细胞中内源性低丰度单分子RNA成像效率和信噪比，并可以在活细胞内进行RNA动态追踪和分析。本发明包含稳定表达CRISPR荧光蛋白成像组件的载体、细胞系和技术方法，本发明可用于在活细胞中放大单分子RNA的信号，实现对活细胞内低丰度RNA的单分子成像和动态观测；可以实现对沉默基因的转录激活和产生的RNA的可视化；可以实现对神经元中内源性RNA靶标的动态观测。

Description

一种可视化活细胞中内源性低丰度单分子RNA的方法及应用
技术领域
本发明属于基因编辑和基因成像领域，涉及CRISPR/Cas9体系在RNA成像中的应用，尤其涉及一种可视化活细胞中内源性低丰度单分子RNA的基因编辑方法及应用。
背景技术
RNA的定位和本地化翻译一直以来是众多研究关注的重点。在维持细胞正常生理功能以及细胞适应应激的过程中，RNA的精准定位发挥着十分关键的作用。真核细胞已进化出复杂的生化过程来定位这些生物大分子到特定的亚细胞区域中，细胞正常的生理活动和功能发挥也依赖于这些定位过程的正确性。不同的RNA分子在合成后，细胞会将其定位于不同的亚细胞区域，进而，RNA分子能够发挥自己特殊的生化功能。这是因为通过将RNA定位到不同的亚细胞区域可以造成细胞内RNA的局部累积，从而实现蛋白质以及蛋白质复合体在细胞中的不对称分布。通过这种RNA分布的不对称性机制，进一步促进了细胞内功能区室的专门化，这个过程在细胞分化、细胞极化以及迁移、细胞之间的信号通讯之间都发挥了重要的功能。
RNA定位异常相关疾病主要是由RNA的转运与定位发生错误导致。在这类疾病中，与疾病相关的RNA分子无法定位到特定的亚细胞区域，致使其编码的蛋白质局部浓度降低，进一步影响了蛋白质发挥正常的生理功能。特别是在许多神经精神疾病中，神经元中RNA定位障碍是导致发病的主要原因。此类疾病需要进行针对病因的精准的在体基因编辑或基因治疗。此外，此类疾病的发病机制非常复杂，具体明确的机制尚未完全阐明，诊断和治疗方法也非常缺乏。更重要的是，在以往的病理机制研究过程中缺乏特异性靶向和标记RNA分子的研究工具。因此，当前亟需从新的角度探索此类疾病的发病机制和诊断策略，以及开发新的分子操控工具，从而为发展新的诊断和治疗方法，提供新的理论基础。
神经元属于极化细胞的一种类型，在极化细胞中，合成充足的RNA并不意味着在细胞内该基因能够正确地表达。大多数成熟的转录本需要与RNA结合蛋白(RNA-bindingproteins,RBPs)结合，形成RNA颗粒，这种RNA颗粒沿着细胞骨架在细胞质内转运，当RNA颗粒被传递至适当的亚细胞位置时，才能够进行本地翻译。因此，RNA颗粒的形成，运输和翻译对于神经元细胞来说非常重要。因此，这就可以解释为什么在人类的许多神经功能障碍疾病中，经常伴随着RNA定位缺陷。因此，RNA定位也因此作为疾病治疗的靶点显得尤为重要。为了探究RNA定位异常相关疾病的分子机制，特别是针对遗传性神经精神疾病进行药理学调控，特异性RNA分子靶向是研究RNA定位异常的基础。为了进一步通过可视化手段，探究细胞内源性的RNA分子与其定向转运蛋白之间的相互作用关系，就需要进行RNA分子的成像和定位。
目前国际上缺乏高性能的RNA活细胞标记和成像方法。如能实现，可以为研究者在研究复杂的生物学过程中，提供丰富的可视化信息，并能为疾病的诊断和治疗奠定基础。传统上，在固定细胞中RNA分子可以通过荧光原位杂交(Fluorescence in situhybridization,FISH)进行检测，在原位杂交实验过程中，荧光探针平铺在单个RNA分子上。FISH已被证明是一种在不同条件下确定固定细胞和组织中RNA的表达和空间定位的强大而可靠的工具。但是，原位杂交需要对样品进行固定处理，因此，无法实现活细胞中的RNA分子成像。为了在活细胞中对RNA进行成像，研究者利用天然存在的噬菌体衣壳蛋白与特定的RNA颈环结构相互结合的原理，开发了MS2分子适配体技术，用于追踪细胞中的RNA分子。MS2-MCP系统依赖于将源自MS2噬菌体的一系列外源RNA茎环整合到目标RNA的序列中,茎环被具有高特异性和亲和力的MS2外壳蛋白(MCP)识别，可以用荧光蛋白标记MCP，从而将荧光蛋白束缚到携带MS2茎环的靶RNA上。由于MS2茎环的多个重复序列已整合到目标RNA中，多个荧光蛋白被束缚在其上，从而导致荧光强度的局部放大。但是，将外源性串联的MS2编码序列插入到内源性RNA分子时，可能会干扰与RNA功能有关的RNA分子结构，造成RNA定位和功能的破坏，并且，由于需要通过载体进行RNA分子的过表达，也会造成成像结果与真实情况的偏差。
在基础生命科学的研究过程中，开发可视化生物大分子的工具越来越得到研究者重视。活细胞中内源性低丰度单分子RNA成像效率差和信噪比低是本研究领域的瓶颈问题。规律的成簇间隔回文重复基序(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,CRISPR)相关的核酸酶Cas9，已被开发为DNA成像的分子工具和平台。最近，有研究小组提出了使用核酸酶失活的Cas9进行RNA成像的技术，该技术可以在单个向导RNA(Single guide RNA,sgRNA)的指导下识别RNA靶标分子，从而对目标转录本进行成像。但是，该成像方法存在很大的局限性，该方法的使用仅限于细胞内高丰度的RNA转录本的成像，无法实现低丰度转录本的单分子成像。由于缺乏可以成像内源性低丰度RNA单分子的研究方法，限制了研究者对RNA定位异常相关疾病的分子机制的研究，特别是针对神经精神疾病相关疾病机制探索。因此，在研究RNA分子的定位以及疾病发生的分子机制的过程中，开发新型的在活细胞或在体的针对低丰度RNA的成像策略，建立一种快速的单分子RNA成像方法显得尤为重要。
发明内容
解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种可视化活细胞中内源性低丰度单分子RNA的方法及应用，可以显著提高活细胞中内源性低丰度单分子RNA成像效率和信噪比，并可以在活细胞内进行RNA动态追踪和分析。
技术方案：一种可视化活细胞中内源性低丰度单分子RNA的方法，主要包括：(1)表达CRISPR-Sunspot荧光蛋白成像组件的质粒载体；(2)利用质粒载体和细胞培养技术对细胞中内源性低丰度RNA进行单分子的可视化；具体步骤为：S1.以pLVX克隆载体为骨架载体，扩增TRE3G启动子基因和dCas9-24×GCN_v4基因，胶回收后，得到基因片段，用分子克隆的方法，插入线性化的pLVX克隆载体，构建成重组载体，并命名为“TRE3G-dCas9-24×GCN_v4”；S2.以pLVX克隆载体为骨架载体，用分子克隆的方法，插入TRE3G启动子和scFv-sfGFP基因，并在此载体中插入CMV启动子启动表达的rtTA基因，rtTA用于与TRE3G结合，从而可以利用TET-On诱导表达策略，对荧光蛋白进行表达控制，命名构建的重组载体为“TRE3G-scFv-sfGFP”；S3.分别利用上述两个载体与慢病毒包装的载体psPAX2，pMD2.G共转染到293T细胞中，包装成两个慢病毒，分别命名为“TRE3G-dCas9-24×GCN_v4”慢病毒和“TRE3G-scFv-sfGFP”慢病毒；S4.利用上述两个慢病毒共同感染U2OS细胞，构建可以在强力霉素诱导下稳定表达“dCas9-24×GCN_v4”和“scFv-sfGFP”蛋白的细胞，称之为“CRISPR-Sunspot稳定表达细胞”，并用于后续成像实验；S5.针对一个mRNA转录本序列，设计靶向此条mRNA 3个不同位置的sgRNA靶标序列，并根据其序列合成互补引物序列，退火后连接入pUC57-U6-sgRNA载体，得到3个可以转录表达不同sgRNA的质粒，分别命名为“U6-sgRNA-1，U6-sgRNA-2，U6-sgRNA-3”；S6.根据sgRNA的靶向序列，设计PAMmer序列；S7.将上述“U6-sgRNA-2，U6-sgRNA-3”载体的U6启动子序列和sgRNA序列通过PCR扩增，胶回收后得到DNA片段，并且利用分子克隆技术连接入U6-sgRNA-1载体上，并命名构建后的重组载体为“U6-3×sgRNA”，用以在一个载体上，同时表达3个不同的sgRNA；S8.在CRISPR-Sunspot稳定表达细胞的培养液中添加强力霉素以诱导dCas9-24×GCN_v4和scFv-sfGFP蛋白的表达，随后，进行sgRNA质粒的转染，使用Lipofectamine 3000将“U6-3×sgRNA”质粒载体和PAMmer转染到CRISPR-Sunspot稳定表达细胞中；S9.在转染后的第24小时，利用配备有活细胞工作站的成像显微镜实现活细胞成像观察和单分子RNA动态追踪。
上述方法在对沉默基因的转录激活和可视化中的应用，利用CRISPR/Cas9介导的基因激活(CRISPRa)对细胞中的沉默基因进行激活，促进其转录产生mRNA分子，并同时对产生的mRNA分子进行可视化；具体步骤为：S1.选取“TRE3G-scFv-sfGFP”载体，在sfGFP基因的C末端插入人工转录激活因子VP64的基因序列，用于融合表达“scFv-sfGFP-VP64”蛋白，并将此载体命名为“TRE3G-scFv-sfGFP-VP64”；S2.在“TRE3G-scFv-sfGFP-VP64”载体TRE3G启动子的上游选取酶切位点，插入“U6-sgRNA(启动子靶向)”基因序列,用以启动可以靶向目的基因启动子的sgRNA的转录，并命名为“U6-sgRNA(启动子靶向)-TRE3G-scFv-sfGFP-VP64”载体；S3.利用上述S2载体结合慢病毒包装的载体psPAX2,pMD2.G，包装成慢病毒，命名为“U6-sgRNA(启动子靶向)-TRE3G-scFv-sfGFP-VP64”慢病毒；S4.利用S3慢病毒以及“TRE3G-dCas9-24×GCN_v4”慢病毒共同感染U2OS细胞，构建稳定表达“dCas9-24×GCN_v4”和“scFv-sfGFP-VP64”蛋白以及靶向目的基因的启动子的“sgRNA(启动子靶向)”的细胞，以实现对基因的转录激活，通过荧光定量PCR，定量分析产生的mRNA分子，分析细胞内目的基因的激活水平，选取激活倍数最高的细胞，即产生mRNA最多的细胞进行后续成像实验，称之为“基因激活的CRISPR-Sunspot细胞”；S5.参照“U6-3×sgRNA”的构建方法，构建靶向被激活的mRNA的sgRNA，并命名为“U6-3×sgRNA(mRNA靶向)”；S6.根据sgRNA靶向序列，设计PAMmer序列；S7.在细胞培养液中添加强力霉素以诱导dCas9-24×GCN_v4和scFv-sfGFP-VP64蛋白的表达；随后，进行质粒的转染，使用Lipofectamine 3000将“U6-3×sgRNA(mRNA靶向)”质粒载体和PAMmer转染到“基因激活的CRISPR-Sunspot细胞”中；S8.在转染后的第24小时，利用配备有活细胞工作站的成像显微镜实现活细胞成像，观察基因激活产生的单分子mRNA并进行动态追踪，以及分析RNA在细胞质中扩散的生物学过程。
上述方法在实现对神经元中内源性RNA靶标的动态观测中的应用，其特征在于对原代培养的神经元中的内源性RNA分子进行活细胞可视化，并检测RNA分子与其定向转运蛋白之间的相互作用关系，为实现神经精神疾病的基因治疗提供靶标分子，具体步骤为：S1.参照“U6-3×sgRNA”的构建方法，构建靶向神经元中表达的mRNA的sgRNA，并命名为“U6-3×sgRNA(神经元mRNA靶向)”；S2.根据sgRNA靶向序列，设计PAMmer序列；S3.以pUC57为克隆载体，构建在CMV启动子启动下可以表达Xlr3b-mCherry蛋白的“Xlr3b-mCherry”载体；S4.分离怀孕第18天的孕大鼠的胚胎，取胚胎的大脑，体式镜下分离海马组织，0.25％的胰酶对海马组织进行酶解消化，酶解消化15min后，马血清终止；用移液器吹打消化后的组织液，离心获得含有海马神经元单细胞的细胞上清液；S5.神经元的电转染：将上清液中的细胞进行计数，取含有2×106个神经元的上清液，进行离心，得到细胞沉淀；用Lonza电转染试剂盒的电转液重悬神经元细胞，并在重悬液中加入载体“TRE3G-dCas9-24×GCN_v4”，“TRE3G-scFv-sfGFP”，以及“U6-3×sgRNA(神经元mRNA靶向)”载体,通过电转染仪，将上述质粒载体通过电穿孔的方式递送到神经元细胞内；若同时观察RNA分子与其定向转运蛋白，则在电转染时添加Xlr3b-mCherry质粒载体；S6.转染后神经元的培养：电转完成后，将神经元细胞种在成像用玻璃底细胞培养皿上，用含有B27的神经元培养基进行培养，每隔3天换一次培养液；S7.神经元中的内源性RNA分子进行活细胞可视化观察：在神经元细胞培养的第2天，在细胞培养液中加入强力霉素，诱导成像荧光蛋白的表达，在第7天，通过Qiagen神经元转染试剂将PAMmer转染到神经元中，转染24小时后，利用配备有活细胞工作站的成像显微镜实现活细胞成像，观察神经元内单分子mRNA并进行动态追踪。
有益效果：本发明基于CRISPR/Cas9技术，构建了dCas9介导的RNA分子成像方法，系统优化了影响RNA成像效率的主要因素。以RNA可视化成像为出发点，构建了可以在细胞中进行内源性单分子RNA检测的技术方法，利用我们构建的新的成像系统可以进一步解析RNA与其调控蛋白在病理过程中的相互关系。在此发明中，我们通过分子克隆、药理学调控、分子成像等技术方法确定dCas9蛋白、sgRNA的表达量与CRISPR介导的RNA成像效率的关系，为后续单分子成像系统的开发奠定了基础。进一步，通过病毒表达、基因操控、细胞培养等策略，开发了针对内源性RNA单分子成像的CRISPR-Sunspot系统。最后，综合采用神经生化技术、神经元培养技术，建立了成像神经元中神经精神疾病相关RNA的系统。
附图说明
图1用于建立CRISPR-Sunspot成像系统的表达荧光蛋白的慢病毒载体。(A)dCas9蛋白与24×GCN_v4抗原肽形成融合蛋白进行表达，在两者之间通过HA标签和两个核定位信号肽NLS进行连接；整个融合蛋白的表达由TRE3G启动子控制。(B)scFv抗体肽与sfGFP绿色荧光蛋白融合表达，在C端各有一个核定位信号肽NLS和Myc标签，此融合蛋白的表达由TRE3G启动子控制。在TRE3G启动子上游，有CMV-rtTA基因序列，用以在CMV启动子的控制下表达反义Tet转录活化因子rtTA。(C)“U6-3×sgRNA”载体,其中每一个U6启动子控制一个sgRNA的表达，每个sgRNA分别靶向同一条mRNA的不同位置。
图2 CRISPR-Sunspot系统用于在活细胞中对RNA进行单分子成像的示意图。CRISPR-Sunspot系统应用于RNA单分子成像的原理。此处SunTag生物信号放大系统用于荧光信号放大，dCas9-24×GCN_v4融合蛋白在sgRNA和PAMmer的引导下靶向RNA分子，24×GCN_v4的抗原肽可以招募24个scFv-sfGFP绿色荧光蛋白分子；一个RNA分子上设计有三个sgRNA可以靶向的位点。
图3 CRISPR-Sunspot系统用于在活细胞中对RNA进行单分子成像。(A)使用CRISPR-Sunspot系统对HBS1L mRNA标记的代表性图像。CRISPR-Sunspot的成像蛋白dCas9-24×GCN_v4和sc-Fv-sfGFP靶向HBS1L mRNA，与对照组相比，实验组细胞在细胞质中产生了分散分布的荧光信号点，每个荧光信号点代表一个mRNA分子。标尺为20μm和5μm(右图)。(B)通过单分子荧光原位杂交(smFISH)验证CRISPR-Sunspot靶向的是单分子mRNA分子，如图显示，CRISPR-Sunspot与smFISH存在明显的共定位。标尺为20μm和5μm(下图)。
图4 CRISPR-Sunspot系统在神经元树突中对Camk2a mRNA进行成像。(A)在神经元树突中Camk2a mRNA和Xlr3b蛋白的定位图。(B)在神经元中使用CRISPR-Sunspot系统对Camk2a mRNA进行标记的代表性图像。dCas9-24×GCN_v4，scFv-sfGFP和sgCamk2a以及PAMmer共表达于神经元中对Camk2a mRNA进行可视化，共聚焦图像显示树突中的Camk2amRNA(由sfGFP指示)，与对照组相比，在实验组神经元的树突中，观察到指示Camk2a mRNA颗粒的绿色荧光斑点。标尺为20μm和5μm(下图)。
图5 CRISPR-Sunspot系统在神经元树突中对Camk2a mRNA以及相互作用蛋白成像。(A)示意图显示了在神经元中对Camk2a mRNA和Xlr3b蛋白成像所需的组件。(B)使用CRISPR-Sunspot系统标记Camk2a mRNA与Xlr3b蛋白的定位关系；图中存在Camk2a mRNA(由sfGFP指示)、Xlr3b蛋白(由mCherry指示)和MAP2(神经元标志物)，成像结果表明Xlr3b蛋白参与到Camk2a mRNA在树突中的转运过程。标尺为20μm和5μm(下图)。
图6 CRISPR-Sunspot用于HBG1基因转录激活，以及产生的HBG1 mRNA的单分子成像的慢病毒载体。(A)dCas9蛋白与24×GCN_v4抗原肽形成融合蛋白进行表达，在两者之间通过HA标签和两个核定位信号肽NLS进行连接；整个融合蛋白的表达由TRE3G启动子控制。(B)scFv抗体肽与sfGFP绿色荧光蛋白融合表达，在sfGFP的C端融合有一个人工转录激活因子VP64，整个蛋白的表达由TRE3G启动子控制。在TRE3G启动子上游，有“U6-sgHBG1(启动子靶向)”基因序列，用以在U6启动子的控制下，表达“sgHBG1(启动子靶向)”；在U6启动子上游，有CMV-rtTA基因序列，用以在CMV启动子的控制下表达rtTA。(C)“U6-3×sgRNA(mRNA靶向)”载体,其中每一个U6启动子控制一个sgRNA的表达，每个sgRNA分别靶向同一条mRNA的不同位置。
图7 CRISPR-Sunspot用于HBG1基因转录激活后产生的HBG1 mRNA的单分子成像。(A)示意图显示了SunTag介导的CRISPRa基因激活和CRISPR-Sunspot系统介导的RNA成像方法。(B)使用CRISPR-Sunspot系统在HBG1未激活(对照)、VP64介导的HBG1基因激活以及HBG1过表达细胞中标记HBG1 mRNA分子的代表性图像。在VP64介导的基因转录激活以及HBG1过表达细胞中，可以在细胞质中观察到分散分布的指示mRNA的荧光信号点，每个荧光信号点代表一个单个的mRNA分子。标尺为20μm和5μm(右图)。
图8 CRISPR-Sunspot用于在活细胞中对HBG1基因转录激活后产生的HBG1 mRNA的动态追踪。(A)CRISPR-Sunspot系统对HBG1基因转录激活后产生的HBG1 mRNA进行动态追踪，图中显示了对照组与实验组的时间序列拍摄的代表图。(B)对(A)中时间序列成像的结果进行分析，图中展示了4种代表性的运动模式，分别为1-快速，定向运动；2-快速，双向运动；3-慢速，定向运动；4-慢速，双向运动。
具体实施方式
本发明附图和实施例对应，下面结合作进一步的说明。但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。本发明(1)为了建立CRISPR-Sunspot成像系统以及稳定表达CRISPR荧光蛋白成像组件的载体和细胞系，我们首先构建了“CRISPR-Sunspot稳定表达细胞”作为荧光成像的工具细胞。在此细胞中，我们选用诱导型四环素(tetracycline,Tet)操纵子Tet-On策略的TRE3G启动子对dCas9-24×GCN_v4和scFv-sfGFP的表达进行诱导表达控制。在强力霉素处理下，表达产生dCas9-24×GCN_v4以及scFv-sfGFP蛋白，并且此两个蛋白中均含有核定位信号序列肽(NLS)，此信号序列肽可以使蛋白定位到细胞核中。因此，由于核定位信号序列肽作用，dCas9-24×GCN_v4和scFv-sfGFP蛋白都集中在细胞核，而在细胞质中并没有显著的绿色荧光信号。此诱导型CRISPR-Sunspot成像系统由于初始的细胞质信号几乎为零，将更加灵敏，更加适合于RNA的成像研究。(2)在对RNA进行靶向成像时，dCas9-24×GCN_v4蛋白在与RNA互补配对的sgRNA和PAMmer的引导下，可以结合到靶标RNA上；随后，由于GCN_v4与scFv之间存在抗原与抗体相互结合的特性，1个dCas9-24×GCN_v4蛋白上的GCN_v4肽段可以招募24个scFv-sfGFP。为了进一步放大靶向的单分子RNA的荧光信号，我们在一条RNA序列上设计3个sgRNA可以靶向的位点，通过转染含有串联sgRNA表达盒的载体“U6-3×sgRNA”以及PAMmer到“CRISPR-Sunspot稳定表达细胞”中，对靶向的RNA分子进行成像观察或动态追踪。结果显示，可以在细胞的细胞质中检测到较强的绿色荧光点状信号，此信号指示了单个RNA在细胞质中的定位。因此，可以实现在活细胞中对低丰度存在的RNA进行单分子成像，我们构建了可以实现低丰度RNA单分子检测的工具。在实施例中，我们选择HBS1L基因的mRNA作为目标靶向的RNA，当使用CRISPR-Sunspot成像系统时，与对照组相比，将sgHBS1L与PAMmer共转入细胞时，细胞核的荧光信号显著减少，同时，可以在细胞质中检测到指示RNA分子的分散分布的绿色荧光点状信号。进一步，通过与单分子原位杂交同时进行标记，定量数据证实，CRISPR-Sunspot系统检测到的就是单分子的RNA分子，因此，我们建立的系统可以实现对低丰度RNA进行有效的标记，CRISPR-Sunspot系统可以实现以高信噪比，达到放大单分子RNA信号的目的。(3)通过募集人工转录激活因子，可以实现程序化的CRISPR介导的基因转录激活(CRISPRa)。为了扩大CRISPR-Sunspot的用途，实现对CRISPR介导的基因转录激活可视化的检测，我们建立了选择性激活基因转录并可以同时成像产生的目标mRNA分子的方法。并且构建了“基因激活的CRISPR-Sunspot细胞”用于成像检测。此细胞可以表达dCas9-24×GCN_v4和scFv-sfGFP-VP64蛋白，在scFv-sfGFP-VP64蛋白的基因序列中，VP64是一种人工转录激活因子，在“sgRNA(启动子靶向)”的引导下，dCas9-24×GCN_v4蛋白可以将scFv-sfGFP-VP64融合蛋白募集到目的基因启动子的转录起始位点(Transcription start site,TSS)上游，从而实现对基因的转录激活调控。在实现了基因的激活后，我们接下来评估CRISPR-Sunspot系统是否可以同时成像这些激活后产生的mRNA分子。在“sgRNA(mRNA靶向)”的引导下，dCas9-24×GCN_v4蛋白可以绑定到目标mRNA分子上，进一步招募scFv-sfGFP-VP64融合蛋白，此RNA靶向过程与技术方案(2)中的类似，从而实现在细胞质中对转录激活后产生的mRNA产物进行可视化。在实施例中，我们选择在U2OS细胞中几乎不表达的HBG1基因作为靶标，与没有进行基因激活的对照组细胞相比，在“HBG1激活的CRISPR-Sunspot细胞”的细胞质中出现了大量的可被检测到的荧光信号点。这些结果证实了CRISPR-Sunspot不仅可以实现基因的转录激活，并且能够同步实现对激活后产生的RNA的单分子信号放大检测。因此，CRISPR-Sunspot系统可以程序化地用以实现细胞中的基因转录激活的同时，可以同步实现基因转录产物的可视化，不仅如此，我们结合活细胞延时摄影技术，可以对RNA运动的动力学进行分析。(4)细胞中存在一些特异性的结合蛋白控制着与神经精神疾病密切相关的RNA的分布。为了能够实现在神经元细胞中对低丰度的RNA进行成像，我们将包含CRISPR-Sunspot系统的成像组件的质粒载体，电转染导入到神经元细胞内，用以靶向神经元的内源性RNA分子，使用CRISPR-Sunspot成像系统进行RNA的可视化。通过上述策略，在实施例中，我们选择对神经精神疾病密切相关的Camk2a mRNA分子进行靶向，结果是：可以在树突中观察到代表Camk2a mRNA分子的绿色荧光信号点。这些结果说明CRISPR-Sunspot也能够用于有效地检测神经元中的低丰度存在的Camk2a RNA分子。进一步，在电转染成像组件质粒的同时，也添加“Xlr3b-mCherry”载体用于在神经元中过表达Xlr3b-mCherry蛋白，在实施例中，可以在树突中观察到指示Camk2a mRNA的绿色荧光信号点，并且此信号点与红色荧光标记的Xlr3b蛋白有很好的共定位，因此，通过可视化手段，在神经元细胞的树突中，检测到了Camk2a mRNA分子与Xlr3b蛋白存在相互作用，进一步证明了Xlr3b蛋白与Camk2a mRNA分子的树突转运密切相关。综上，我们的CRISPR-Sunspot成像系统也可以用于在神经元中可视化内源性靶标RNA及与其相互作用的调节蛋白。
实施例1用于建立CRISPR-Sunspot成像系统的慢病毒质粒载体的构建
(1)基因序列：从数据库网站获得TRE3G(Addgene#52343)、dCas9-24×GCN_v4(Addgene#60910)、scFv-sfGFP(Addgene#60904)、VP64(Addgene#60904)、CMV-rtTA(Addgene#19780)、U6-sgRNA(F+E)(Addgene#59986)、Xlr3b(NCBI,NM_001081643.1)、mCherry(Addgene#36084)等基因或蛋白的基因序列和质粒载体，通过利用分子克隆技术将各个片段，构建至慢病毒克隆载体pLVX或pUC57载体(pLVX或pUC57载体购自生工生物公司)中。
(2)PCR扩增与酶切：利用表1.1中设计的基因序列特异的引物，利用载体作为模板，对目的基因序列进行PCR扩增，得到TRE3G、dCas9-24×GCN_v4、scFv-sfGFP、scFv-sfGFP-VP64、CMV-rtTA、U6-sgRNA(F+E)、Xlr3b、mCherry基因片段。扩增(Gflex PCR酶，takara公司)程序为：95℃，10min；95℃，10s；60℃，30s；68℃，2min；共进行35个循环；72℃，4min。对pLVX载体用限制性内切酶EcoR I、Pac I(takara公司)进行酶切，在37℃水浴锅中反应2小时进行酶切。
表1.1扩增目的基因的引物序列
Figure BDA0002637129350000091
Figure BDA0002637129350000101
(3)PCR产物与酶切产物的纯化：将PCR产物和酶切产物，通过2％的琼脂糖凝胶电泳将条带进行分离，根据序列的碱基长度，割胶回收相应的DNA片段，后续使用Axygen凝胶回收试剂盒进行凝胶回收。
(4)重组质粒的连接：纯化后的PCR片段和线性化的质粒载体通过NanoDrop核酸测定仪测定浓度。根据克隆试剂盒(生工生物公司)推荐的载体:插入的基因片段的摩尔比例进行连接。连接体系为20微升：2×连接酶Mix试剂10微升，载体20ng，目的基因片段各50ng，其中载体、目的基因片段根据浓度计算出体积，加水使反应终体积为20微升，40℃水浴15分钟。
(5)感受态的转化：将感受态DH5α(生工生物公司)置于冰上融化；完全融化之后，用移液器将连接产物转移到感受态中，在冰上放置25分钟。然后在42℃水浴中热击90秒，继续置于冰上5分钟。随后加入不含抗生素的LB培养液1毫升，37℃摇床上培养60分钟后，4000转/分钟离心4分钟，弃上清。将沉淀的菌体用100微升LB培养液重悬，然后转移到含有特定抗性的LB培养皿上，用涂布棒涂匀菌液，倒扣于37℃孵箱中培养。
(6)单克隆菌落扩增：培养皿在37℃孵箱中培养12小时后，可以在LB培养板上观察到单克隆菌落。挑取单一菌落，加入含有特定抗性的LB培养液中，继续于37℃摇床中培养过夜。
(7)质粒提取：收集菌液，用通用的质粒提取试剂盒(生工生物公司)进行质粒提取。测定提取的质粒浓度，利用限制酶对质粒进行酶切确定阳性质粒，将质粒送金维智公司测序，比对测序结果，确保插入片段正确，选取最终插入结果正确的质粒进行保存以及后续慢病毒包装实验。
实施例2用于建立CRISPR-Sunspot成像系统的慢病毒的包装
(1)HEK293T细胞的复苏：1)37℃水浴预热培养基，准备15mL无菌的离心管，加入8mL预热好的培养基。2)从液氮罐中取出冻存的细胞(购自美国ATCC)，快速放入37℃水浴锅中复温，轻晃冻存管，使细胞在1至2分钟内完全解冻。3)75％酒精的棉球擦拭冻存管表面，置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的8mL培养基的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散。4)1,200rpm离心5分钟，弃上清，加入1mL新的培养基，轻轻吹打成细胞悬液。5)将细胞悬液吸至T25细胞瓶内，补加培养基至5mL，轻晃动细胞瓶，使细胞分布均匀，放入细胞培养箱内培养。6)观察细胞贴壁生长情况，6小时后更换新的培养基，待细胞长至80％至90％汇合时进行传代。
(2)细胞传代：1)从细胞瓶中吸出旧培养基。使用2mL D-Hank’s平衡盐溶液洗涤细胞。2)从细胞瓶中吸出洗涤液，将1mL预热的胰蛋白酶添加到细胞瓶侧壁，轻轻摇动细胞瓶以完全覆盖细胞。3)在室温下孵育1至2分钟。4)当大部分细胞脱落时，加入2倍体积的预热完全培养基终止消化。5)将细胞转移至15mL离心管中，1,200rpm离心5分钟。6)倾倒弃去上清，加入预热完全培养基重悬细胞，将细胞悬液稀释至合适的细胞接种密度，转移至新的细胞瓶中，放入细胞培养箱内继续培养。HEK293T细胞培养在高糖DMEM培养基(Gibco)中，培养基中含有10％的胎牛血清(Gibco)以及50U/mL青霉素和链霉素(Life Technologies)。细胞在37℃含有5％CO2的培养箱中进行培养。
(3)慢病毒质粒的转染:1)将HEK293T细胞接种在15cm培养皿(Corning)中，细胞达到80％汇合度后，用10mL完全培养基代替旧培养基。2)接下来，将携带目标基因的20μg转移质粒，15μg psPAX2、10μg pMD2.G和130μL脂质体转染试剂与434μL DMEM涡旋混合，并在室温下孵育10分钟。3)然后将质粒和脂质体混合物轻轻加入细胞中。待转染12小时后，将上清液替换为新鲜培养基。
(4)慢病毒的纯化:在48h和72h后分别收集含有病毒颗粒的上清液，并通过离心纯化慢病毒，分装后在-80℃下保存。
实施例3 CRISPR-Sunspot稳定表达细胞系的构建与筛选
(1)U2OS细胞的复苏与传代：复苏与传代过程同实施例2，U2OS细胞(购自美国ATCC)培养在RPMI-1640培养基中(Gibco)，培养基中含有10％的胎牛血清(Gibco)以及50U/mL青霉素和链霉素(Life Technologies)。细胞在37℃含有5％CO2的培养箱中进行培养。将细胞种于合适的培养板中。以第2天50％细胞汇合度的细胞数为宜。
(2)病毒感染U2OS细胞：从-80℃冰箱取出慢病毒后，置于冰浴融化，根据预实验的MOI值，用新鲜完全培养基将慢病毒稀释成所需浓度，轻轻混匀。吸去培养板中旧的培养基，按顺序加入完全培养基，稀释好的病毒液，加入Polybrene至终浓度为5μg/mL，轻轻摇匀，将混合液加入细胞中，37℃培养过夜。感染48小时后，更换为新鲜培养基。
(3)CRISPR-Sunspot稳定表达细胞系的建立：具体步骤为：1)感染48小时后，将细胞消化并进行梯度稀释，确保每个24孔板中仅有一个单细胞，将每个单细胞在培养基中继续培养2周，扩大细胞数量。2)2周后，利用荧光显微镜确定每孔细胞的sfGFP绿色荧光的强度。3)选择荧光强度合适的单克隆细胞株，用胰酶进行消化，并接种在六孔板中扩增细胞数量后留存。
实施例4 RT-qPCR进行转录激活效率的评价
此部分适用于：对沉默基因的转录激活和可视化。下述为“HBG1基因激活”实施例中转录激活后产生的mRNA检测。
(1)细胞内总RNA提取：具体步骤如下：将12孔板中的细胞培养上清吸弃，并用预冷PBS清洗2-3遍；每孔加入500μL Trizol进行裂解，裂解时间5分钟；将裂解液转移至RNaseFree的EP管中，并在每个EP管中加入1/5体积的氯仿，在涡旋仪中剧烈震荡15秒，使管内液体形成乳液状态。室温静置15分钟后转移至低温预冷离心机中，12,000g离心15分钟；离心后EP管内液体分层，将上层水相转移至新的EP管中，并在管中加入等体积的异丙醇。上下倒置EP管对液体进行混匀，并室温放置10分钟。静置结束后12,000g离心10分钟；离心结束后，将上清弃置。每管加入500μL 75％乙醇，上下颠倒混匀，12,000g离心5分钟，弃上清。将EP管倒扣，自然干燥；待EP管内干燥后，每管加入10μL RNase Free水，用移液器进行混匀。通过NanoDrop One仪器对RNA的浓度进行测定。对RNA浓度进行定量，逆转录剩余后的RNA置于-80摄氏度冰箱保存。
(2)利用Takara逆转录试剂盒进行逆转录操作：1)去除基因组DNA，反应体系及步骤如下：
20μL体系：提取总RNA 2μg，试剂盒成分中5×gDNA Eraser Buffer 4μL，gDNAEraser 1μL，加RNase Free ddH2O补足20μL。将配好的体系室温放置5分钟或是42℃反应2分钟。反应结束后置于冰上，进行后续操作。2)逆转录操作，反应体系及步骤如下：20μL体系：1)中的反应产物10μL，5×PrimeScript Buffer 2(for real time)4μL，PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1μL，RT Primer Mix 1μL，RNase Free ddH2O补足20μL。将配好的反应体系放入PCR仪中，运行一下程序：37℃15min，85℃5s，4℃hold。反应结束后取出，放置于-40℃保存。
(3)RT-qPCR方法进行基因表达差异分析。反应体系及步骤如下：1)将上一步中得到的cDNA稀释10倍进行后续反应。20μL反应体系组分：2×SYBR Green Mix 10μL，稀释后的cDNA 2μL，荧光定量PCR引物Forward+Reverse各0.6μL，RNase Free ddH2O补足至总体积20μL。将配好的反应体系转移至体积100μL的八排管中，并放置于荧光定量PCR仪中进行后续检测。2)荧光定量PCR仪运行程序为：95.0℃5min；95℃10s；60℃30s；重复40个循环，并在反应结束后进行熔解曲线检测，用以检测引物特异性(实施例用的引物序列见表1.2)。3)RT-qPCR反应结果通过Bio-Rad CFX Manager软件进行分析，ΔΔCt方法进行定量分析。
表1.2荧光定量PCR的引物序列
引物名称 引物序列(5’-3’)
HBG1定量-正向引物 AACCCCAAAGTCAAGGCACA
HBG1定量-反向引物 CATCTTCTGCCAGGAAGCCT
实施例5用于靶向mRNA序列的“U6-3×sgRNA”载体的构建
(1)单个sgRNA载体构建：1)设计靶向mRNA的序列(实施例用的序列见表1.3)，订购序列寡核苷酸(金唯智生物公司)。2)sgRNA寡核苷酸的磷酸化处理。磷酸化体系如下：sgRNA(100μM)各1μL，T4 PNK 0.5μL，T4 PNK Buffer 1μL，加ddH2O补足至10μL。将该体系放置于37℃水浴中反应30分钟，通过PCR仪95℃进行梯度退火处理。3)pUC57-U6-sgRNA(购自生工生物公司)质粒载体通过BbsI限制性内切酶进行酶切反应。反应体系如下：BbsI(NEB公司)1μL，BbsI Buffer 1μL，载体300ng，ddH2O补足至10μL。将该体系放置于37℃水浴中反应60分钟，并进行琼脂糖凝胶电泳方法进行纯化。4)将2)中的反应产物稀释100倍，取1μL进行后续连接；将3)中的纯化产物取2μL进行后续连接。连接体系为10微升：10×T4 DNA连接酶(NEB公司)缓冲液1微升，T4 DNA连接酶1微升，2μL载体、1μL寡核苷酸片段，加无菌水使反应终体积为10微升。16℃水浴连接过夜。后续进行常规的转化及质粒提取步骤。提取后的质粒进行测序，验证序列正确插入，选取最终插入结果正确的“U6-sgRNA-1，U6-sgRNA-2，U6-sgRNA-3”质粒进行保存。
(2)“U6-3×sgRNA”质粒载体的构建：通过PCR(引物见表1.4)得到“U6-sgRNA-2,U6-sgRNA-3”载体的U6启动子序列和sgRNA序列，胶回收后得到DNA片段，克隆到U6-sgRNA-1载体上，并命名为“U6-3×sgRNA”。
表1.3靶向mRNA的序列
Figure BDA0002637129350000131
Figure BDA0002637129350000141
表1.4扩增U6-sgRNA-2，U6-sgRNA-3的引物序列
引物名称 序列
U6-sgRNA(F+E)-正向引物 GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC
U6-sgRNA(F+E)-反向引物 AAAAAGCACCGACTCGGTGCC
实施例6 CRISPR-Sunspot稳定表达细胞系的转染
(1)细胞准备：对“CRISPR-Sunspot稳定表达细胞”进行消化传代和接种，待24孔板细胞长至70％至90％汇合时可以进行转染操作。
(2)质粒转染：按照脂质体试剂制造商的说明书进行，使用Lipofectamine 3000将“U6-3×sgRNA”载体和PAMmer转染到细胞中，具体操作步骤如下：1)在50μL Opti-MEM培养基中加入2μL Lipofectamine 3000(Invitrogen)，混合均匀。2)在50μL Opti-MEM培养基中加入1μg“U6-3×sgRNA”质粒和1μL的PAMmer，混合均匀后加入2μL p3000试剂，混合均匀。3)将50μL稀释后的“U6-3×sgRNA”质粒和PAMmer加至50μL稀释后的Lipofectamine 3000(Invitrogen)中，孵育10分钟。4)均匀加入24孔板细胞，轻轻摇动细胞瓶以完全覆盖细胞。
实施例7原代神经元细胞的分离培养及电转染
(1)原代神经元的分离：从胚胎第18天大鼠脑中分离得到海马神经元。具体操作为：1)从异氟烷麻醉的大鼠中取出胚胎，分离胚胎鼠的大脑，在体式显微镜下分离得到海马。2)将海马在不含Ca2+和Mg2+的Hank平衡盐溶液中进行解剖，用精细镊剪碎海马。3)加入含0.025％DNase I的胰蛋白酶-EDTA(0.25％，Gibco)消化液，在37℃消化15分钟。4)然后用马血清中和胰蛋白酶的消化作用。所有涉及动物的实验程序均已获得南京医科大学实验动物使用委员会的批准。
(2)原代神经元培养：1)收集海马消化物并离心，1,000×g，离心5分钟。2)然后用吸管在含有10％马血清和50U/mL青霉素和链霉素(Gibco)的DMEM培养基中反复抽吸。3)离心后，对上清液中解离的细胞进行计数。4)将细胞按照比例，接种在预孵育有多聚D-赖氨酸(Sigma-Aldrich)的6孔板中，此6孔板已经预先添加了含2％B27，2mM GlutaMAX和50U/mL青霉素和链霉素的Neurobasal Plus培养基。5)将神经元在37℃的5％浓度的CO2培养箱中进行培养，每隔3天更换一次新鲜培养基。
(3)原代神经元的电转染：对用于RNA成像的神经元转染，具体方法为：1)从海马消化物上清液中收集解离的神经元细胞，进行细胞计数。2)按适当的细胞密度重悬在NeuronNucleofector Solution(Lonza)中，并使用电转仪用成像质粒混合物进行转染。3)电转染结束后，将神经元用Neurobasal Plus培养基重悬，并且接种在预铺有多聚D-赖氨酸的6孔板中。4)转染2h后，将培养基替换为新鲜的Neurobasal完全培养基。
实施例8成像系统用于单分子RNA可视化的共聚焦显微镜图像采集
(1)细胞准备：为了进行RNA成像，稳定表达成像组件的U2OS细胞或原代神经元要先转染sgRNA载体和PAMmer(实施例6或7)。
(2)固定细胞的成像：1)转染24小时后，将细胞在室温下用4％多聚甲醛(PFA)固定20分钟。2)PBS清洗细胞3次，每次5min。3)然后固定在滴有Vectashield封片剂(VectorLaboratories，含DAPI)的载玻片上。4)使用激光共聚焦显微镜拍摄荧光成像结果。
(3)活细胞动态的成像：1)转染前，细胞接种在适用于活细胞成像的玻璃底细胞培养皿中。2)转染24小时后，将细胞培养上清换成无酚红的培养基。3)使用配置有活细胞工作站的转盘共聚焦显微镜进行时间序列拍摄。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种可视化活细胞中内源性低丰度单分子RNA的方法及应用
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttactccct atcagtgata gagaacgtat gaa 33
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttacgaggg taggaagtgg tacggaaa 28
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcccaaga agaagcgcaa ggtg 24
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaattaagc ttgtgcccca gtttgcta 28
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgggccccg acatcgtgat ga 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttgtagagc tcatccatgc catg 24
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatgctttag acgattttga cttagatat 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tagcatatct agatcaaagt catctagggc 30
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacattgatt attgactagt tattaatagt aat 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttacccgggg agcatgtcaa gg 22
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagggcctat ttcccatgat tccttc 26
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaaagcacc gactcggtgc c 21
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgtcaagca gaaaaaggaa ggcca 25
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgagaataac acatccagga gagact 26
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atggtgagca agggcgagga ggataac 27
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cttgtacagc tcgtccatgc cgc 23
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catcttctgc caggaagcct 20
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<212> RNA
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cuaaaaacua guaaauaaau 20
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<212> RNA
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auaacugauc cguugggugu 20
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacaagaaaa uuaaaugaag 20
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcuuuauucu gcaagcaaua 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccugaggug caggcuuccu 20
<210> 24
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<212> RNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (3)

1.一种可视化活细胞中内源性低丰度单分子RNA的方法，其特征在于：主要包括：（1）表达CRISPR-Sunspot荧光蛋白成像组件的质粒载体；(2) 利用质粒载体和细胞培养技术对细胞中内源性低丰度RNA进行单分子的可视化；具体步骤为：S1.以pLVX克隆载体为骨架载体，扩增TRE3G启动子基因和dCas9-24×GCN_v4基因，胶回收后，得到基因片段，用分子克隆的方法，插入线性化的pLVX克隆载体，构建成重组载体，并命名为“TRE3G-dCas9-24×GCN_v4”；S2. 以pLVX克隆载体为骨架载体，用分子克隆的方法，插入TRE3G启动子和scFv-sfGFP基因，并在此载体中插入CMV启动子启动表达的rtTA基因，rtTA用于与TRE3G结合，从而可以利用TET-On诱导表达策略，对荧光蛋白进行表达控制，命名构建的重组载体为“TRE3G-scFv-sfGFP”；S3. 分别利用上述两个载体与慢病毒包装的载体psPAX2，pMD2.G共转染到293T细胞中，包装成两个慢病毒，分别命名为“TRE3G-dCas9-24×GCN_v4” 慢病毒和“TRE3G-scFv-sfGFP”慢病毒；S4.利用上述两个慢病毒共同感染U2OS细胞，构建可以在强力霉素诱导下稳定表达“dCas9-24×GCN_v4” 和“scFv-sfGFP”蛋白的细胞，称之为“CRISPR-Sunspot稳定表达细胞”，并用于后续成像实验；S5. 针对一个mRNA转录本序列，设计靶向此条mRNA 3个不同位置的sgRNA靶标序列，并根据其序列合成互补引物序列，退火后连接入pUC57-U6-sgRNA载体，得到3个可以转录表达不同sgRNA的质粒，分别命名为“U6-sgRNA-1，U6-sgRNA-2，U6-sgRNA-3”；S6. 根据sgRNA的靶向序列，设计PAMmer序列；S7. 将上述“U6-sgRNA-2，U6-sgRNA-3”载体的U6启动子序列和sgRNA序列通过PCR扩增，胶回收后得到DNA片段，并且利用分子克隆技术连接入U6-sgRNA-1载体上，并命名构建后的重组载体为“U6-3×sgRNA”，用以在一个载体上，同时表达3个不同的sgRNA；S8. 在CRISPR-Sunspot稳定表达细胞的培养液中添加强力霉素以诱导dCas9-24×GCN_v4和scFv-sfGFP蛋白的表达，随后，进行sgRNA质粒的转染，使用Lipofectamine 3000将 “U6-3×sgRNA”质粒载体和PAMmer转染到CRISPR-Sunspot稳定表达细胞中；S9. 在转染后的第24小时，利用配备有活细胞工作站的成像显微镜实现活细胞成像观察和单分子RNA动态追踪。
2.权利要求1所述的方法在对沉默基因的转录激活和可视化中的应用，其特征在于利用CRISPR/Cas9介导的基因激活（CRISPRa）对细胞中的沉默基因进行激活，促进其转录产生mRNA分子，并同时对产生的mRNA分子进行可视化；具体步骤为：S1.选取 “TRE3G-scFv-sfGFP”载体，在sfGFP基因的C末端插入人工转录激活因子VP64的基因序列，用于融合表达“scFv-sfGFP-VP64”蛋白，并将此载体命名为“TRE3G-scFv-sfGFP-VP64”；S2.在“TRE3G-scFv-sfGFP-VP64”载体TRE3G启动子的上游选取酶切位点，插入“U6-sgRNA（启动子靶向）”基因序列, 用以启动可以靶向目的基因启动子的sgRNA的转录，并命名为“U6-sgRNA (启动子靶向)-TRE3G-scFv-sfGFP-VP64”载体；S3.利用上述S2载体结合慢病毒包装的载体psPAX2, pMD2.G，包装成慢病毒，命名为“U6-sgRNA (启动子靶向)-TRE3G-scFv-sfGFP-VP64”慢病毒；S4. 利用S3的慢病毒以及 “TRE3G-dCas9-24×GCN_v4”慢病毒共同感染U2OS细胞，构建稳定表达“dCas9-24×GCN_v4” 和“scFv-sfGFP-VP64”蛋白以及靶向目的基因的启动子的“sgRNA (启动子靶向)”的细胞，以实现对基因的转录激活，通过荧光定量PCR，定量分析产生的mRNA分子，分析细胞内目的基因的激活水平，选取激活倍数最高的细胞，即产生mRNA最多的细胞进行后续成像实验，称之为“基因激活的CRISPR-Sunspot细胞”；S5.参照“U6-3×sgRNA”的构建方法，构建靶向被激活的mRNA的sgRNA，并命名为“U6-3×sgRNA(mRNA靶向)”； S6. 根据sgRNA靶向序列，设计PAMmer序列；S7.在细胞培养液中添加强力霉素以诱导dCas9-24×GCN_v4和scFv-sfGFP-VP64蛋白的表达；随后，进行质粒的转染，使用Lipofectamine 3000将“U6-3×sgRNA(mRNA靶向)”质粒载体和PAMmer转染到“基因激活的CRISPR-Sunspot细胞”中；S8.在转染后的第24小时，利用配备有活细胞工作站的成像显微镜实现活细胞成像，观察基因激活产生的单分子mRNA并进行动态追踪，以及分析mRNA在细胞质中扩散的生物学过程。
3.权利要求1所述的方法在实现对神经元中内源性RNA靶标的动态观测中的应用，其特征在于对原代培养的神经元中的内源性RNA分子进行活细胞可视化，并检测RNA分子与其定向转运蛋白之间的相互作用关系，为实现神经精神疾病的基因治疗提供靶标分子，具体步骤为：S1. 参照“U6-3×sgRNA”的构建方法，构建靶向神经元中表达的mRNA的sgRNA，并命名为“U6-3×sgRNA（神经元mRNA靶向）”；S2. 根据sgRNA靶向序列，设计PAMmer序列；S3.以pUC57为克隆载体，构建在CMV启动子启动下可以表达Xlr3b-mCherry蛋白的“Xlr3b-mCherry”载体；S4. 分离怀孕第18天的孕大鼠的胚胎，取胚胎的大脑，体式镜下分离海马组织，0.25%的胰酶对海马组织进行酶解消化，酶解消化15min后，马血清终止；用移液器吹打消化后的组织液，离心获得含有海马神经元单细胞的细胞上清液；S5. 神经元的电转染：将上清液中的细胞进行计数，取含有2×106个神经元的上清液，进行离心，得到细胞沉淀；用Lonza电转染试剂盒的电转液重悬神经元细胞，并在重悬液中加入载体“TRE3G-dCas9-24×GCN_v4” ，“TRE3G-scFv-sfGFP”，以及 “U6-3×sgRNA(神经元mRNA靶向)”载体, 通过电转染仪，将上述质粒载体通过电穿孔的方式递送到神经元细胞内；若同时观察RNA分子与其定向转运蛋白，则在电转染时添加Xlr3b-mCherry质粒载体；S6. 转染后神经元的培养：电转完成后，将神经元细胞种在成像用玻璃底细胞培养皿上，用含有B27的神经元培养基进行培养，每隔3天换一次培养液；S7. 神经元中的内源性RNA分子进行活细胞可视化观察：在神经元细胞培养的第2天，在细胞培养液中加入强力霉素，诱导成像荧光蛋白的表达，在第7天，通过Qiagen神经元转染试剂将PAMmer转染到神经元中，转染24小时后，利用配备有活细胞工作站的成像显微镜实现活细胞成像，观察神经元内单分子mRNA并进行动态追踪。
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