CN117987473A - 一种监测miRNA动态变化的报告基因载体及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体及构建方法，属于基因工程技术领域，将构建的报告基因与载体质粒连接、转化获得，具体的，通过将FTH1的3’UTR替换为GRIA2的3’UTR而构建的报告基因与慢病毒载体质粒GV367载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒GV367‑FTH1‑GRIA23’UTR。利用GRIA23’UTR对FTH1报告基因进行改造，构建miR‑124反应性的FTH1基因报告系统(FTH1‑GRIA23’UTR)，并进行验证；通过成神经分化前后细胞内报告基因表达的变化实现MRI对细胞内miR‑124动态变化的可视化，从而有效监测干细胞分化事件，同时也为感兴趣miRNA与目的基因的靶向关系研究提供一种无创的新型MRI分子影像学手段。

Description

一种监测miRNA动态变化的报告基因载体及构建方法

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，尤其涉及一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体及构建方法。

背景技术

干细胞具有多向分化潜能，在再生医学研究领域备受关注。通过诱导干细胞向神经方向分化，使其修复或替代病损细胞及组织，为神经系统疾病的治疗提供了一种新的策略。然而，要实现这一治疗策略的临床应用，需要利用无创的影像学手段对干细胞分化过程进行有效的监测和评估。

目前用于干细胞监测的成像手段大致可分为三种，即光学成像、核医学成像和磁共振成像(MRI)，其中MRI因具有无辐射、组织穿透力强以及软组织对比度好等优点而被广泛应用。分子水平的MR成像研究常需借助于报告基因。目前MRI报告基因可分为编码酶的报告基因、编码细胞膜受体的报告基因和内源性报告基因等几种。铁蛋白基因(Ferritin)属内源性报告基因，是目前应用最为成熟和广泛的MRI报告基因之一。

之前的研究中，我们已经利用FTH1报告基因对干细胞神经分化过程进行了MRI示踪研究，结果显示FTH1能够在细胞内持续过表达并引起明确的聚铁效应，后者可产生明显的MRI信号对比。这一MRI示踪策略虽然实现了对干细胞分化前后的纵向监测，但显然不能有效区分分化后的神经细胞和分化前的干细胞，即无法明确干细胞神经分化这一事件发生的时间和空间信息。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体及构建方法，利用GRIA23’UTR对FTH1报告基因进行改造，构建miR-124反应性的FTH1基因报告系统(FTH1-GRIA23’UTR)，并进行验证；通过成神经分化前后细胞内报告基因表达的变化实现MRI对细胞内miR-124动态变化的可视化，从而有效监测干细胞分化事件，同时也为感兴趣miRNA与目的基因的靶向关系研究提供一种无创的新型MRI分子影像学手段。

本发明采用的技术方案如下：一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体，将构建的报告基因与载体质粒连接、转化获得，具体的，通过将FTH1的3’UTR替换为GRIA2的3’UTR而构建的报告基因与慢病毒载体质粒GV367载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒GV367-FTH1-GRIA23’UTR。

进一步地，所述将FTH1的3’UTR替换为GRIA2的3’UTR构建的报告基因为FTH1-GRIA23’UTR，所述的FTH1-GRIA23’UTR核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述FTH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述GRIA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体的应用，包括所述的磁共振报告基因载体在检测神经分化miR-124动态变化中的应用；

进一步地，当细胞内miR-124表达增高时，特异性靶向结合于所述报告基因的GRIA23’UTR，抑制所述报告基因的表达。

一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)双荧光素酶实验：验证miRNA-124与所述报告基因3’UTR结合情况。

(2)慢病毒载体构建：将人工合成的FTH1序列和GRIA23’UTR序列与载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒FTH1-A3’UTR，并对长出的单克隆进行测序；鉴定构建成功后感染293T细胞；48h后收集病毒液；离心得到病毒并标记为CMV-FTH1-A3’UTR；采用逐孔稀释滴度测定法测定病毒滴度，同时构建CMV-FTH1作为阳性对照，CMV-NC空载病毒作为阴性对照；

(3)慢病毒转染细胞并筛选稳定株；

(4)诱导细胞分化，预期使得细胞分化后FTH1表达较分化前下降；

(5)通过多种方法验证细胞分化前后FTH1表达变化，并利用磁共振对分化前后的细胞进行扫描检测；

(6)预期实现该细胞分化前后，利用磁共振观察到信号改变，说明FTH1表达，反应miRNA-X在细胞分化过程中表达发生变化。

本发明有益效果如下：

(1)利用GRIA2的3’UTR序列(GRIA23’UTR)对FTH1报告基因进行改造，构建miR-124反应性的FTH1基因报告系统(FTH1-GRIA23’UTR)，利用慢病毒载体将该基因报告系统转导至小鼠P19干细胞，采用全反式维甲酸(All-trans-retinoicacid,atRA)诱导法对转基因P19干细胞进行成神经诱导分化，并在分化前后行铁检测和MR成像，观察验证神经分化对报告基因表达的影响。

(2)将FTH1的3’UTR替换为GRIA2的3’UTR，使miR-124通过与改造后的FTH1的3’UTR特异性结合，来控制FTH1报告基因的表达；通过成神经分化前后细胞内报告基因表达的变化以及相应的聚铁效应改变(报告基因表达的变化反映了细胞内miR-124的含量)，从而通过miR-124的动态变化水平来间接判断干细胞分化事件的发生，实现MRI对细胞内miR-124动态变化的可视化，从而有效监测干细胞分化事件，同时也为感兴趣miRNA与待测目的基因的靶向关系研究提供一种无创的新型MRI分子影像学手段。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1为本申请中FTH1-GRIA23’UTR结构及作用；

图2为实施例1中慢病毒载体图谱；

图3为实施例1中慢病毒酶切电泳对照图；

图4为实施例1中实验组FTH1-GRIA2 3’UTR PCR产物电泳图；

图5为实施例1中阳性对照组FTH1 PCR产物电泳图；

图6为实施例1中FTH1-GRIA2 3’UTR实验组阳性转化子PCR产物电泳图；

图7为实施例1中FTH1阳性实验组阳性转化子PCR产物电泳图；

图8为实验组FTH1-GRIA2 3’UTR序列；

图9为阳性对照组FTH1序列。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体，将构建的报告基因与载体质粒连接、转化获得，其特征在于，通过将FTH1的3’UTR替换为GRIA2的3’UTR而构建的报告基因与慢病毒载体质粒GV367载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒GV367-FTH1-GRIA23’UTR。

所述的磁共振报告基因载体在检测神经分化miR-124动态变化中的应用：当细胞内miR-124表达增高时，特异性靶向结合于所述报告基因的GRIA23’UTR，抑制所述报告基因的表达。

一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)双荧光素酶报告基因实验

使用TargetScan在线靶基因预测miR-124与GRIA23’UTR是否存在结合位点。将预测序列构建入双荧光素酶报告基因系统，实验组共分为4组：GRIA23’UTR载体质粒+miR-124载体质粒；GRIA23’UTR空载质粒(GRIA23’UTR-NC)+miR-124载体质粒；GRIA23’UTR载体质粒+miR空载质粒(miR-NC)；GRIA23’UTR空载质粒(GRIA23’UTR-NC)+miR空载质粒(miR-NC)，用于验证miR-124靶向抑制GRIA2基因。同时把阳性对照组分为2组：TRAF63’UTR载体质粒+miR-146b载体质粒；TRAF63’UTR载体质粒+miR空载质粒(miR-NC)，用于验证整个转染检测体系是否可用有效。

(2)Westernblot检测FTH1表达

构建质粒并转染293T细胞，使用Westernblot重复三次检测FTH1-GRIA23’UTR结合miR-124后，FTH1是否受抑制。实验共分2组：FTH1-GRIA23’UTR载体质粒+miR-124载体质粒；FTH1-GRIA23’UTR载体质粒+miR空载质粒(miR-NC)。检测FTH1-GRIA23’UTR+miR-124组FTH1表达量是否低于FTH1-GRIA23’UTR+miR-NC组。

(3)慢病毒载体构建

使用上海吉凯基因化学技术有限公司设计的AgeI/NheI酶对载体质粒GV367(Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin)进行双酶切，将人工合成的FTH1序列和GRIA23’UTR序列与载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒GV367-FTH1-GRIA23’UTR，并对长出的单克隆进行测序，鉴定构建成功后感染293T细胞，48h后收集病毒液，离心得到病毒并标记为CMV-FTH1-GRIA23’UTR，病毒分装后－80℃保存。采用逐孔稀释滴度测定法测定病毒滴度，同时构建CMV-FTH1作为阳性对照，CMV-NC空载病毒作为阴性对照。

(4)慢病毒转染P19细胞并筛选稳定株

待P19细胞在孔板中汇合度达30％左右时，根据病毒转染适宜MOI值。添加含实验组CMV-FTH1-GRIA23’UTR、阳性对照组CMV-FTH1和空载组病毒的培养基，48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。嘌呤霉素筛选稳定表达株，并分别命名为P19-FTH1-GRIA23’UTR、P19-FTH1、P19-NC。

(5)P19细胞成神经诱导分化及鉴定

以8d为一个分化周期，将P19-FTH1-GRIA23’UTR、P19-FTH1细胞加入含终浓度为10μM的atRA培养基悬浮培养4d，将诱导分化第4d的细胞重悬，离心后在多聚赖氨酸包被的培养皿中以无atRA的完全培养基维持分化4d。通过镜下观察第0、4、8d细胞形态变化，取第8d的细胞进行免疫荧光染色，PCR检测第0、2、4、6、8d细胞内miR-124表达量变化，通过以上三种方法来验证是否成功分化出Neurons-FTH1-GRIA23’UTR、Neurons-FTH1细胞。

(6)细胞分化前后聚铁能力和FTH1表达检测

通过普鲁士蓝染色、铁含量试剂检测盒检测细胞内铁含量。通过Westernblot、MR体外成像检测细胞神经分化前后FTH1的表达和T2WI信号变化、R2值变化。

实施例1：

在本实施例中，需要说明的是，在载体构建过程中的实验材料包括：

一、主要试剂

二、主要仪器及器材

监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体得到具体构建过程：

基因信息

(1)基因名称：FTH1-GRIA23’UTR(NM_010239+3utr(miR-124-3p))物种：Mouse

(2)基因名称：FTH1(NM_010239)物种：Mouse

1、慢病毒载体酶切

载体名称：GV367

元件顺序：Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin

克隆位点：AgeI/NheI

对照编号：CON238

载体图谱参考图2；

酶切步骤：

根据如下列表，配制50μl酶切体系；

按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

酶切载体体系(50μL)：

参考图3，酶切结果电泳图：

1#:10kbMarker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)

2#:载体酶切产物

3#:未酶切载体(从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋，开环，线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，故此时质粒的电泳条带只能作为质粒分子量大小判断的参考，不可作为准确判断依据。质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小)。

2、目的基因片段的获取

2.1引物

实验组FTH1-GRIA2 3’UTR序列、阳性对照组FTH1序列获取；

引物设计如下：

FTH1-GRIA2 3’UTR-R:5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACCACCGCGTCTCCCTC-3'

FTH1-GRIA2 3’UTR-F：5'-CACACATTCCACAGGCTAGCTTAAACTCCACATAGTTAAGAATTCTTGGCTG-3'

FTH1-R:5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACCACCGCGTCTCCCTC-3'

FTH1-F:5'-CACACATTCCACAGGCTAGCTTAGCTCTCATCACCGTGTCCCAG-3'

2.2PCR扩增目的基因片段

配制如下反应体系，轻轻吹打混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反应。

PCR扩增序列体系如下(50μL)：

反应条件(PCR程序如下)：

2.3PCR扩增结果

实验组FTH1-GRIA2 3’UTR PCR产物大小：818；参考图4，实验组FTH1-GRIA2 3’UTRPCR产物电泳图：Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。

阳性对照组FTH1 PCR产物大小：596；参考图5，阳性对照组FTH1 PCR产物电泳图：

Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。

3、PCR产物与载体进行交换(连接)

3.1实验步骤：

于冰水浴中配制如下反应体系。用秱液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避克产生气泡。于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。

反应体系如下：

说明：

a)加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的最适摩尔比为1：2

b)阳性对照加入的纯化的PCR产物为GAPDH基因(带有同样的交换臂)

4、转化

4.1转化步骤

将10μL交换反应产物加入到100μL感叐态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。叏适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。

5、菌落PCR鉴定

5.1引物

FTH1-GRIA2 3’UTR鉴定引物-R：5'-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3'

FTH1-GRIA2 3’UTR鉴定引物-F:5'-CTTACGTGAGTCCTGGCATG-3'

FTH1鉴定引物-R:5'-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3'

FTH1鉴定引物-F:5'-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3'

鉴定引物说明：本对引物一个位于目的基因中，一个位于载体上，用于菌落PCR鉴定转化子。

5.2PCR鉴定

配制如下反应体系，震荡混匀，短暂离心。在超净工作台中，用无菌的枪头挑取个菌落至20μL鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应。

鉴定体系如下(20μL)：

反应条件(PCR程序如下)：

5.3鉴定结果

FTH1-GRIA2 3’UTR实验组

阳性转化子PCR产物大小：641，电泳图参考图6，

1#：阴性对照(ddH2O)

2#：阴性对照(空载自连对照组)

3#：阳性对照(GAPDH)

4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp5-12#：1-8号转化子

FTH1阳性实验组

阳性转化子PCR产物大小：1210，电泳图参考图7，

1#：阴性对照(ddH2O)

2#：阴性对照(空载自连对照组)

3#：阳性对照(GAPDH)

4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp5-12#：1-8号转化子

6、重组质粒酶切产物测序

将鉴定出的阳性兊隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序。对测序结果不目的基因序列进行比对分析。比对结果如下：

实验组FTH1-GRIA2 3’UTR序列：参考图8；

阳性对照组FTH1序列：参考图9；

比对结果说明：测序结果与目标序列一致。

7、质粒抽提

将测序正确的菌液转接于10mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。详细操作步骤如下：

1.收集过夜培养的菌液于标记好的5mL离心管，12000rpm，离心2min收菌；

2.弃上清，加入250μL细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；

3.加入250μL细胞裂解液，再加入10μL蛋白酶K，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，致使菌体裂解澄清；

4.加入350μL中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；

5.10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5mLEP管；

6.12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清转秱至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；

7.加入600μL预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；

8.在超净台中将回收柱转秱至新的1.5mLEP管中，静置10-20min，自然晾干；

9.往回收柱中加入95μLNuclease-FreeWater，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体，将构建的报告基因与载体质粒连接、转化获得，其特征在于，通过将FTH1的3’UTR替换为GRIA2的3’UTR而构建的报告基因与慢病毒载体质粒GV367载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒GV367-FTH1-GRIA23’UTR。

2.一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体，其特征在于：所述将FTH1的3’UTR替换为GRIA2的3’UTR构建的报告基因为FTH1-GRIA23’UTR，所述的FTH1-GRIA23’UTR核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体，其特征在于：所述FTH1的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体，其特征在于：所述GRIA2的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的磁共振报告基因载体在检测神经分化miR-124动态变化中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：当细胞内miR-124表达增高时，特异性靶向结合于所述报告基因的GRIA23’UTR，抑制所述报告基因的表达。

7.根据权利要求1-4任一项所述的一种监测miRNA动态变化的磁共振报告基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)双荧光素酶实验：验证miRNA-124与所述报告基因3’UTR结合情况；

(2)慢病毒载体构建：将人工合成的FTH1序列和GRIA2 3’UTR序列与载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒FTH1-A3’UTR，并对长出的单克隆进行测序；鉴定构建成功后感染293T细胞；48h后收集病毒液；离心得到病毒并标记为CMV-FTH1-A 3’UTR；采用逐孔稀释滴度测定法测定病毒滴度，同时构建CMV-FTH1作为阳性对照，CMV-NC空载病毒作为阴性对照；

(3)慢病毒转染细胞并筛选稳定株；

(4)诱导细胞分化，预期使得细胞分化后FTH1表达较分化前下降；

(5)通过多种方法验证细胞分化前后FTH1表达变化，并利用磁共振对分化前后的细胞进行扫描检测；

(6)预期实现该细胞分化前后，利用磁共振观察到信号改变，说明FTH1表达，反应miRNA-X在细胞分化过程中表达发生变化。