CN110218701B - 一种筛选miRNA调控剂的细胞模型及应用 - Google Patents

一种筛选miRNA调控剂的细胞模型及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种筛选miRNA调控剂的细胞模型，该细胞模型以HEK293细胞为宿主，转染入含有anti‑miR‑138‑5p序列与报告基因的重组质粒。另外，本发明还公开了该细胞模型的建立方法以及在筛选miRNA调控剂中的应用。本发明首次建立了基于pEGFP‑C2质粒的miR‑138‑5p调控剂的活细胞筛选体系，使得调控剂对细胞内miR‑138‑5p的调控情况可方便地通过细胞荧光信号的变化观察到；为筛选预防、治疗或改善miR‑138‑5p表达异常相关疾病的经典调控剂提供了有力的筛选工具。

Description

一种筛选miRNA调控剂的细胞模型及应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种筛选miRNA调控剂的细胞模型及应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是真核生物体内一类长度为18～25个核苷酸序列的内源性非编码小RNA，通过结合靶基因的3’UTR区，抑制靶基因翻译或降解靶mRNA，在转录和转录后水平调控靶基因的表达。研究表明，miRNAs在细胞生长、分化、增殖、生物发育过程中发挥巨大作用，能够调控大量的靶基因，从而具有重要的生物学效应。异常表达的miRNAs与包括癌症在内的多种疾病的发生发展相关，miRNAs表达特征可作为某些疾病的分子标签，现已成为治疗各种疾病的潜在靶点。
近些年来，随着对miRNA调控作用研究的不断深入，寻找靶向miRNA的药物，如对miRNA具有调控作用的化学小分子和化学合成的核酸引起了很多科学家的重视。利用在转录/转录后水平调控miRNA的调控剂，可直接或间接改变细胞内的miRNA水平或功能。miRNAs模拟物、抑制物或调控剂作为新型治疗剂为疾病的分子水平靶向治疗提供了思路，因此具有广阔的研究前景。
MiR-138-5p作为miR-138家族成员之一，可通过精密调控其靶基因表达，参与到细胞增殖、分化及凋亡等生物学过程中。研究表明，miR-138-5p异常表达与肿瘤等多种疾病相关，如骨肉瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌及胆囊癌等，在癌症网络调控中被广泛研究。寻找对细胞内miR-138-5p有特定活性的调控剂并阐明调控机制，将为其以后的临床应用提供重要的分子基础。目前用于miRNA调控剂筛选的细胞模型主要通过与荧光素酶报告基因系统联用建立，通过检测荧光素酶与底物的反应活性，继而判断筛查调控剂的活性，然而该方法成本高且检测结果单一。本发明基于EGFP首次建立了miR-138-5p调控剂的细胞筛选模型，通过观察细胞的荧光强度变化，即可直观地反应出调控剂对细胞内miR-138-5p的影响，并可对相关的调控机制展开化学生物学研究工作，以期寻找到miR-138-5p的经典调控剂，为以miR-138-5p为靶点治疗相关疾病提供了新策略。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种筛选miRNA调控剂的细胞模型，以寻找到细胞内miR-138-5p的经典调控剂。采用该细胞模型进行miR-138-5p调控剂的筛选，方法灵敏、操作简单、成本低廉。为筛选预防、治疗或改善miR-138-5p表达异常相关疾病的经典调控剂提供了有力的筛选工具。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种筛选miRNA调控剂的细胞模型，其特征在于，该细胞模型以HEK293细胞为宿主，转染入含有anti-miR-138-5p序列与报告基因的重组质粒。
上述的一种筛选miRNA调控剂的细胞模型，其特征在于，所述anti-miR-138-5p的序列为：
5’-CGGCCTGATTCACAACACCAGCT-3’。
上述的一种筛选miRNA调控剂的细胞模型，其特征在于，所述报告基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP。
另外，本发明还提供了一种建立上述细胞模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、用AATT的连接序列连接两个重复的anti-miR-138-5p序列，选择pEGFP-C2质粒多克隆位点中Xho I(CTCGAG)和Pst I(CTGCAG)作为双酶切位点，设计靶序列引物，序列为：
正义引物：5’-AGTCCGGACTCAGATCTCGAGCGGCCTGATTCAC
AACACCAGCTAATTCGGCCTGATTCACAACACCAGCTCTGCAGTCGACGGTACCGCGG-3’；
反义引物：5’-CCGCGGTACCGTCGACTGCAGAGCTGGTGTTGTG
AATCAGGCCGAATTAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACT-3’；
步骤二、将步骤一中设计的靶序列引物合成并退火后形成双链DNA，选用pEGFP-C2质粒，通过无缝克隆的方式将所述双链DNA插入到报告基因EGFP的终止密码子前，获得重组质粒；
步骤三、将步骤二中所述重组质粒通过脂质体转染入HEK293细胞中，经筛选后得到细胞模型。
上述的方法，其特征在于，步骤三中所述筛选的方法包括：先用G418进行预筛选，然后用有限稀释法对筛选后的细胞进行单克隆化，再通过倒置荧光显微镜对单克隆细胞群落进行荧光筛选。
进一步的，本发明还提供了一种上述细胞模型在筛选miRNA-138-5p调控剂中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明设计合成用连接序列AATT连接的两个重复的anti-miR-138-5p序列，通过无缝克隆的方式将其插入到pEGFP-C2质粒中EGFP基因的终止密码子前，以构建pEGFP-C2-anti-miR-138-5p重组质粒，并转染HEK293细胞，首次建立了基于EGFP的miR-138-5p调控剂的活细胞筛选体系，以EGFP作为报告基因，使得调控剂对细胞内miR-138-5p的调控情况可方便地通过细胞荧光信号的变化观察到。
2、采用本发明的细胞模型进行miR-138-5p调控剂的筛选，方法灵敏、操作简单、成本低廉，为筛选预防、治疗或改善miR-138-5p表达异常相关疾病的经典调控剂提供了有力的筛选工具。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例2的pEGFP-C2-anti-miR-138-5p重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明实施例2的pEGFP-C2-anti-miR-138-5p重组质粒的测序结果图。
图3为本发明实施例3中转染了pEGFP-C2-anti-miR-138-5p重组质粒的HEK293细胞单克隆化结果图。
图4为本发明实施例4中qPCR检测HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞及其对照HEK293-EGFP细胞在转染miR-138-5p的模拟物angomir-138及抑制物antagomir-138 48h后miR-138-5p表达量的结果图。
图5为本发明实施例4中HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞及其对照HEK293-EGFP细胞在转染miR-138-5p的模拟物angomir-138及抑制物antagomir-138 48h后荧光变化结果图。
图6为本发明实施例4中Western-Blot检测HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞及其对照HEK293-EGFP细胞在转染miR-138-5p的模拟物angomir-138及抑制物antagomir-138 48h后EGFP表达量的结果图。
图7为本发明实施例4中Western-Blot检测HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞及其对照HEK293-EGFP细胞在转染miR-138-5p的模拟物angomir-138及抑制物antagomir-138 48h后EGFP表达量的灰度扫描结果图。
图8为本发明实施例5中qPCR检测HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞及其对照HEK293-EGFP细胞加入杨梅素48h后miR-138-5p表达量的结果图。
图9为本发明实施例5中qPCR检测HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞及其对照HEK293-EGFP细胞加入白术内酯48h后miR-138-5p表达量的结果图。
具体实施方式
实施例1：靶序列引物的设计和合成
通过miRBase数据库获得miR-138-5p的成熟序列(SEQ ID NO.1)为：5’-AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCG-3’。设计anti-miR-138-5p序列(SEQ ID NO.2)为：5’-CGGCCTGATTCACAACACCAGCT-3’。
用AATT的连接序列连接两个重复的anti-miR-138-5p序列，选择pEGFP-C2质粒多克隆位点中Xho I(CTCGAG)和Pst I(CTGCAG)作为双酶切位点，设计靶序列引物，序列为：
正义引物(SEQ ID NO.3)：5’-AGTCCGGACTCAGATCTCGAGCGGCCTGATTCACAACACCAGCTAATTCGGCCTGATTCACAACACCAGCTCTGCAGTCGACGGTACCGCGG-3’；
反义引物(SEQ ID NO.4)：5’-CCGCGGTACCGTCGACTGCAGAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGAATTAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACT-3’；
将设计的靶序列引物合成并退火后形成双链DNA，即为靶序列。
实施例2：重组质粒的构建
复苏购买的含pEGFP-C2质粒的Escherichia coli DH5α菌株，提取质粒。将提取的质粒用Xho I和Pst I限制性内切酶于37℃酶切3h，双酶切反应体系如下表1所示：
表1双酶切反应体系
Figure GDA0003080086400000051
酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，进行目的条带胶回收。利用无缝克隆试剂盒将实施例1中的靶序列插入到EGFP报告基因的终止密码子前，得到连接产物。连接反应体系如下表2所示：
表2连接反应体系
Figure GDA0003080086400000061
将连接产物转化大肠杆菌DH5α，活化后将其涂布到含卡那霉素的平板上，过夜培养，挑取单克隆菌落并提取质粒，双酶切鉴定连接产物(即提取的质粒)，参照图1，2号重组后的pEGFP-C2-anti-miR-138-5p质粒与1号pEGFP-C2空质粒大小一致。将提取的质粒进行DNA测序，测序结果参照图2，经比对，测序结果正确，说明pEGFP-C2-anti-miR-138-5p重组质粒构建成功。
实施例3：细胞模型的构建
3.1HEK293细胞的培养
将购买的HEK293细胞从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴锅中，待其融化后，放于离心机中以1000rpm离心5min，吸去上清，加入适量含10％FBS胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞并接种入培养瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中静置培养，隔日更换培养基并继续传代培养。
3.2pEGFP-C2-anti-miR-138-5p重组质粒转染HEK293细胞
将细胞接种于6孔板中，待其长至60％～90％时用于转染，用无血清且无双抗的DMEM培养基分别稀释构建成功的pEGFP-C2-anti-miR-138-5p重组质粒以及LipofectamineTM2000脂质体，室温下混合孵育20min，向细胞中滴加混合孵育后的DNA-脂质体复合物，转染24h，将转染后的细胞按1:10的比例传代，继续转染48h，再加入100mg/mLG418，使G418的终浓度为1500μg/mL，进行预筛选，平行3孔，筛选14天后，观察细胞的生存情况。
3.3有限稀释法挑选含pEGFP-C2-anti-miR-138-5p重组质粒的单克隆细胞
转染后的细胞预筛选14天后，用0.25％～0.02％EDTA的胰蛋白酶消化液消化，待细胞收缩变圆后，终止消化轻轻吹打为单个细胞悬液。取少量细胞悬液至细胞计数板上，计算细胞密度，利用有限稀释法的原理将细胞悬液稀释，分别接种于96孔板，每孔终体积为0.1mL。稀释24h后再将细胞放置于倒置显微镜下观察，挑选只含单个阳性细胞的小孔，标记好并放于培养箱中继续培养。参照图3所示为转染了pEGFP-C2-anti-miR-138-5p质粒的HEK293细胞单克隆化情况，观察可见单克隆细胞为小群落或仅有单个细胞，生长速度缓慢，根据其生长情况更换含G418的培养液并将所挑取的单克隆细胞HEK293-EGFP/miR-138-5p转接种于24孔板中扩大培养，冻存。
实施例4：基于EGFP报告基因的miR-138-5p调控剂的活细胞筛选体系的活性检测
培养HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞及对照HEK293-EGFP细胞，将两种细胞分别接种于12孔板，应用脂质体转染法分别转染angomir-138、antagomir-138和NC，于转染后48h镜下观察细胞的荧光强弱变化，并收集细胞，分别提取RNA和蛋白质进行qPCR及western-blot检测。
参照图4，qPCR检测HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞及HEK293-EGFP细胞中转染angomir-138及antagomir-138 48h后miR-138-5p的表达水平，相比NC组，两株细胞在转染angomir-138后miR-138-5p的表达均显著升高，而在转染antagomir-138后，miR-138-5p的表达均显著降低，这说明miR-138-5p的模拟物及抑制物成功改变了两株细胞内的内源性miR-138-5p水平。
参照图5，荧光显微镜下观察两株细胞的荧光变化情况。与NC组相比，转染miR-138-5p的模拟物angomir-138后，HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞的荧光强度显著降低，说明angomir-138与pEGFP-C2质粒上anti-miR-138-5p序列结合，抑制了EGFP的表达，从而使荧光强度降低；而转染miR-138-5p抑制物antagomir-138后，HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞荧光强度显著升高，说明细胞内miR-138-5p的表达被抑制而不与anti-miR-138-5p序列结合，从而使EGFP表达上调，荧光强度升高；而在该细胞的对照HEK293-EGFP细胞中，转染angomir-138、antagomir-138和NC后，细胞荧光强度均无明显变化。
结合上述图4，说明细胞荧光的改变是miR-138-5p与细胞中插入序列anti-miR-138-5p相互作用的结果。进一步说明miR-138-5p调控剂对细胞荧光的改变是特异性的，通过观察细胞荧光的变化情况即可筛选出miR-138-5p的调控剂。基于EGFP报告基因的miR-138-5p调控剂的HEK293活细胞筛选体系构建成功。
参照图6和图7，western-blot检测两种细胞在转染angomir-138及antagomir-13848h后EGFP的表达情况。在HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞中，转染angomir-138后，EGFP的表达相比NC组显著降低，说明angomir-138与pEGFP-C2质粒上anti-miR-138序列相结合，抑制了EGFP的表达；转染antagomir-138后，EGFP的表达相比NC组显著升高，说明antagomir-138抑制了细胞中miR-138-5p的表达，不与质粒上anti-miR-138-5p序列相结合，从而上调了EGFP的表达。而对照细胞中EGFP在各组中的表达均无明显差异。该结果与图5的细胞荧光结果相符。综上所述，基于EGFP报告基因的miR-138-5p调控剂的HEK293活细胞筛选体系构建成功且活性良好，可作为细胞中miR-138-5p调控剂的筛选工具。
实施例5：基于EGFP报告基因的miR-138-5p调控剂的活细胞筛选体系的应用
利用HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞筛选miR-138-5p的调控剂。培养HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞及对照HEK293-EGFP细胞，加入终浓度为20μM的中药活性成分杨梅素和白术内酯，48h后荧光显微镜下观察两株细胞的荧光变化情况并提取细胞RNA，qPCR检测miR-138-5p的表达情况，结果如图8和图9所示。图8左侧为细胞荧光变化结果图，右侧为杨梅素对miR-138-5p表达调控的结果图，从图中可以看出，在加入杨梅素48h后，两株细胞中miR-138-5p的表达均显著降低；细胞荧光结果显示，与blank组相比，加入杨梅素后，HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞的荧光强度显著升高，而HEK293-EGFP细胞的荧光强度无变化，说明应用基于EGFP报告基因的HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞筛选的杨梅素可作为miR-138-5p的抑制剂。
图9左侧为细胞荧光变化结果图，右侧为白术内酯对miR-138-5p表达调控的结果图，从图中可以看出，在加入白术内酯48h后，两株细胞中miR-138-5p的表达均显著升高；细胞荧光结果显示，与blank组相比，加入白术内酯后，HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞的荧光强度显著降低，而HEK293-EGFP细胞的荧光强度无变化，说明应用基于EGFP报告基因的HEK293-EGFP/miR-138-5p细胞筛选的白术内酯可作为miR-138-5p的激动剂。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 西北工业大学
西安九清生物科技有限公司
<120> 一种筛选miRNA调控剂的细胞模型及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 1
agcugguguu gugaaucagg ccg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcctgatt cacaacacca gct 23
<210> 3
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtccggact cagatctcga gcggcctgat tcacaacacc agctaattcg gcctgattca 60
caacaccagc tctgcagtcg acggtaccgc gg 92
<210> 4
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgcggtacc gtcgactgca gagctggtgt tgtgaatcag gccgaattag ctggtgttgt 60
gaatcaggcc gctcgagatc tgagtccgga ct 92

Claims (3)

1.一种筛选miRNA调控剂的细胞模型，其特征在于，该细胞模型以HEK293细胞为宿主，转染入含有anti-miR-138-5p序列与报告基因的重组质粒，所述anti-miR-138-5p的序列为：
5’-CGGCCTGATTCACAACACCAGCT-3’；
所述报告基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP；
所述细胞模型的构建方法包括以下步骤：
步骤一、用AATT的连接序列连接两个重复的anti-miR-138-5p序列，选择pEGFP-C2质粒多克隆位点中XhoI和PstI作为双酶切位点，设计靶序列引物，序列为：
正义引物：5’-AGTCCGGACTCAGATCTCGAGCGGCCTGATTCACAACACCAGCTAATTCGGCCTGATTCACAACACCAGCTCTGCAGTCGACGGTACCGCGG-3’；
反义引物：5’-CCGCGGTACCGTCGACTGCAGAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGAATTAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACT-3’；
步骤二、将步骤一中设计的靶序列引物合成并退火后形成双链DNA，选用pEGFP-C2质粒，通过无缝克隆的方式将所述双链DNA插入到报告基因EGFP的终止密码子前，获得重组质粒；
步骤三、将步骤二中所述重组质粒通过脂质体转染入HEK293细胞中，经筛选后得到细胞模型。
2.根据权利要求1所述的一种筛选miRNA调控剂的细胞模型，其特征在于，步骤三中所述筛选的方法包括：先用G418进行预筛选，然后用有限稀释法对筛选后的细胞进行单克隆化，再通过倒置荧光显微镜对单克隆细胞群落进行荧光筛选。
3.一种如权利要求1所述细胞模型在筛选miRNA-138-5p调控剂中的应用。
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