RU2660715C2 - Способ репликации человеческого митохондриального генома в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica - Google Patents
Способ репликации человеческого митохондриального генома в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica Download PDFInfo
- Publication number
- RU2660715C2 RU2660715C2 RU2016122717A RU2016122717A RU2660715C2 RU 2660715 C2 RU2660715 C2 RU 2660715C2 RU 2016122717 A RU2016122717 A RU 2016122717A RU 2016122717 A RU2016122717 A RU 2016122717A RU 2660715 C2 RU2660715 C2 RU 2660715C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mitochondrial
- human
- genome
- dna
- gene
- Prior art date
Links
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 title claims abstract description 88
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 50
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 10
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 37
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 24
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 abstract description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 abstract description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 29
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 23
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 18
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 18
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 12
- 208000012268 mitochondrial disease Diseases 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 208000035177 MELAS Diseases 0.000 description 6
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 6
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 208000009564 MELAS Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 230000022886 mitochondrial translation Effects 0.000 description 3
- 101150015830 nd1 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 3
- CFJZQNZZGQDONE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;butanedioic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CCC(O)=O CFJZQNZZGQDONE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 2
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102100040896 Growth/differentiation factor 15 Human genes 0.000 description 1
- 206010060766 Heteroplasia Diseases 0.000 description 1
- 101000893549 Homo sapiens Growth/differentiation factor 15 Proteins 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 201000009035 MERRF syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010058799 Mitochondrial encephalomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010069825 Myoclonic epilepsy and ragged-red fibres Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000798866 Yarrowia lipolytica CLIB122 Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid group Chemical class C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000027721 electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 208000006443 lactic acidosis Diseases 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002807 slow-twitch muscle fiber Anatomy 0.000 description 1
- 101150005399 sod2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 235000011044 succinic acid Nutrition 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid group Chemical group C(CCC(=O)O)(=O)O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ репликации человеческого митохондриального генома в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica. Используя метод химической трансформации, осуществляют трансформацию препарата суммарной ДНК человека в штамм Yarrowia lipolytica, содержащий ранее интегрированные конструкции pQ-SRUS и Lys39H (SEQ ID NO 1) на основе маркера устойчивости к гигромицину HygR (SEQ ID NO 3), либо штамм Yarrowia lipolytica, содержащий ранее интегрированные конструкции pQ-SRUS и Leu36H (SEQ ID NO 2). Проводят отбор трансформантов на минимальной синтетической среде, содержащей сукцинат в качестве единственного источника энергии. Определяют наличие реплицирующейся ДНК митохондриального генома человека с помощью ПЦР в реальном времени с парами праймеров, специфичных к ДНК митохондриального генома человека: MTTL1 (gggtttgttAagatggcagagcccggt)/MTTL2 (ggttggccatgggtatgttgttaagaa) для выявления последовательности гена тРНК - Leu генома человека и TRNK1 (agaaccaacacctctttacagtgaaat)/ TRNK2 (ttagttgggtgatgaggaatagtgtaa) для выявления последовательности гена тPHK-Lys генома человека. Изобретение может быть использовано для коррекции вредных мутаций митохондриального генома человека и препаративной наработки, скорректированной по последовательности интактной митохондриальной ДНК в клетках дрожжей с целью ее последующего введения в мезенхимальные стромальные клетки пациента в интересах лечения распространенных митохондриальных болезней человека, нарушающих функциональность генов митохондриальных Lys-Leu-специфичных рРНК. 6 ил., 1 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биоинженерии, в частности к способу направленной коррекции мутаций митохондриального генома человека с применением генетически модифицированных штаммов Yarrowia lipolytica с искусственно приданной способностью к гомологичной рекомбинации митоходриальной ДНК и введенными маркерами для фенотипической селекции наличия/отсутствия дефектов в генах тРНК-Lys и тРНК-Leu митохондриального генома. Изобретение используется для коррекции вредных мутаций митохондриального генома человека и препаративной наработки скорректированной по последовательности интактной митохондриальной ДНК в клетках дрожжей с целью ее последующего введения в мезенхимальные стромальные клетки пациента, что позволяет обеспечить лечение наиболее тяжелых распространенных митохондриальных болезней человека (например, MELAS и MERFF), нарушающих функциональность генов митохондриальных Lys- Leu-специфичных рРНК.
Уровень техники
Активное изучение митохондриального генома позволило выделить целый класс болезней, в основе которых лежат мутации генов митохондриального генома. Эти мутации способны вовлекать тРНК, рРНК или структурные гены и могут выражаться биохимически как дефекты всей электронно-транспортной цепи или как дефекты отдельных ферментов. Мутационные изменения в мтДНК могут приводить к возникновению митохондриальных наследственных болезней человека, связанных с нарушением процессов окислительного фосфорилирования и энергетического обмена в клетках. Примерно две трети (166 мутаций) патогенных точечных мутаций мтДНК локализованы в генах тРНК, они проявляются в виде разнообразных клинических синдромов. Наиболее распространены мутации в генах тРНКLeu и тРНКLys. Так, в основе синдрома MELAS (митохондриальная энцефалопатия с инсультоподобными эпизодами и лактатацидозом) лежат точечные мутации мтДНК. Примерно 80% из них - в гене мтДНК, кодирующем лейциновую тРНК митохондрий - в гене тРНК лейцина (UUR), (tRNA-Leu), где происходит однонуклеотидная замена А ~> G в 3243-м положении (А3243G tRNA leu). Эта мутация приводит к инактивации транскрипционного терминатора, заключенного внутри гена тРНК Leu. Последствием этой мутации является изменение транскрипционного соотношения рРНК и мРНК и снижение эффективности трансляции. Мутации могут возникать впервые у конкретного пациента либо наследоваться по материнской линии. Всего обнаружено 23 точечных мутаций и 4 делеции мтДНК, приводящих к MELAS [Рассел Д. Синдром MELAS. Изд.: "VSD". 2013. ISBN: 978-5-5097-2091-8]. Другая наиболее распространенная мутация – транзиция A8344G в гене тРНКLys, в 80% случаев ассоциирована с MERRF (миоклональная эпилепсия с “разорванными красными мышечными волокнами) [Мазунин И.О. и др. Мол. биол. 2010. Т. 44. № 5. C. 755–772.3]. В результате этой мутации изменяется высококонсервативный нуклеотид в псевдоуридиновой петле тРНК, что приводит к блокированию митохондриального синтеза белка.
В настоящее время ни в одной из опубликованных печатных работ, включая патентные заявки, не предложено способов направленного воздействия на митохондриальный геном человека [Di Donato, S. et al . J. Neurol. 2009. V. 256. P. 693–710; Harbauer, A.B. et al. Cell Metab. 2014. V. 4. P. 357–372; Мазунин И.О. и др. Мол. биол. 2010. Т. 44. № 5. C. 755–772; Spelbrink, J.N. et al. IUBMB Life. 2010. V. 62. P. 19–32; Тодоров, И.Н. и др. Биохимия. 2009. Т. 74. C. 1184–1194].
Этиотропные средства лечения митохондриальных болезней человека отсутствуют [Harbauer, A.B. et al. Cell Metab. 2014. V. 4. P. 357–372; Мазунин И.О. и др. Мол. биол. 2010. Т. 44. № 5. C. 755–772; Патрушев М.В. и др. Биохимия. 2014, Т. 79 (11). C. 1417 – 1428.; de Laat, P. et al. JIMD Rep. 2013. V. 8. P. 47–50.; Swalwell, H. et al. Eur J Hum Genet. 2011. V. 19(7). P. 769-75.].
Все существующие и перспективные средства лечения этих болезней основаны на купировании последствий митохондриальной недостаточности [Мазунин И.О. и др. Мол. биол. 2010. Т. 44. № 5. C. 755–772.; Carelli, V. et al. Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1787. P. 518–528.; Yu-Wai-Man, P. et al. J. Med. Genet. 2009. V. 46. P. 145–158.; Rotig, A. Diabetes Metab. 2010. V. 36. P. 97–107.; A Human Mitochondrial Genome Database. 2009. www. mitomap.org.].
При этом разработка средств направленной коррекции генома митохондрий создает принципиально новые возможности для практической медицины [Никитина Л.П. и др. Забайкальский медицинский вестник. 2011. № 2. C. 184-190.; Егорова Л.А. и др. Клиницист. 2013. № 2. C. 6-13.; Рассел Д Изд.: "VSD". 2013. ISBN: 978-5-5097-2091-8.; Прохорова Н.С. и др. Таврический медико-биологический вестник 2010. Т. 13. № 4 (52). C. 146-149.].
В основном, в имеющихся патентах освещены способы медикаментозной коррекции митохондриальных дисфункций, в частности синдрома MELAS и болезни Паркинсона. В этих заявках не упоминаются ни способы воздействия на геном митохондрии, ни методы репликации генома митохондрий человека в гетерологичных системах (в том числе дрожжах). Данные изобретения направлены на медикаментозное лечение заболеваний, связанных с дисфункцией митохондрий [WO/2015/144964; US2015196500; IN515DEN2015], а также на разработку методов тестирования и поиск маркеров митохондриальных нейродегенеративных заболеваний [WO/2015/144964; CN101818193], с возможным прогнозированием заболеваний у детей [RU 2366959]. В этой части выявлена активно развивающаяся новая тенденция к использованию в качестве маркера развития митохондриальных заболеваний эпигенетических маркеров: сайтов метилирования митохондриального генома.
Известны патенты, описывающие продуценты белков и низкомолекулярных метаболитов на основе дрожжей Yarrowia lipolytica [RU 2422526; RU 2451075; RU 2451749], в том числе сверхпродуценты янтарной и лимонной кислот, обладающие измененными в функциональном отношении митохондриями. Однако, в этих патентах не описаны методы непосредственного воздействия на геном митохондрий, в частности, с использованием систем гомологичной рекомбинации. Имеются патенты [RU 2376376], в которых показаны генетические конструкции, которые способны влиять на работу митохондрий, но в этих патентах не упоминается о белке RecA или иных системах гомологичной или иной рекомбинации ДНК.
В публикации [Yoon, Y.G. и Koob, M.D. «Efficient cloning and engineering of entire mitochondrial genomes in Escherichia coli and transfer into transcriptionally active mitochondria» Nucleic Acids Res. 2003; 31(5): 1407–1415] описан эксперимент по репликации полноразмерного генома митохондрий мыши и дрожжей в E. coli. Однако по соображениям биоэтики и биобезопасности этот подход не пригоден для накопления митохондрий человека в интересах генотерапии, так как при его использовании в состав митохондриального генома пациента были бы введены дополнительные физиологически активные элементы: бактериальный репликон и маркер лекарственной устойчивости.
В патенте [FR2857977, опубл. 23.07.2003] описан способ препаративной наработки РНК для генотерапии болезней человека, основанный на использовании векторов, поддерживающихся в митохондриях дрожжей, лишенных собственного митохондриального генома.
Известен патент КНР [CN 104450768 A «Shuttle vector of targeted yeast mitochondria and application of shuttle vector» (опубл. 25.03.2015)], описывающий структуру репликативного вектора, размножающегося в митохондриях пекарских дрожжей S. cerevisiae.
Известен патент авторов И. Тарасова и Н. Энтелис из университета Старсбурга (Франция) «Vector for therapy of mitochondrial disease» (US2015361450, C12N15/85, опубл. 17.12.2015), в котором описана молекула РНК, позволяющая частично компенсировать митохондриальные болезни, снижая уровень гетероплазмии митохондриального генома в организме. Операции по введению в митохондрии ДНК в патенте не затрагивались.
Известен патент «Mitochondrial expression vector and process for the transformation of mitochondria» US2015315608, C12N15/85, опубл. 05.11.2015, в котором описывается независимый от эндогенного митохондриального генома плазмидный вектор, обеспечивающий репликацию и транскрипцию трансгенов в гигантских митохондриях клеток млекопитающих.
Известен патент I. Malcuit и A. Sorokin «Plant mitochondrial transformation method» (PCT/GB2009/002755, опубл. 28.09.2011)], описывающий способ введения РНК в митохондрии растений в сочетании с обратной транскриптазой, что позволяет нарабатывать трансгены in vivo и интегрировать их в митохондриальный геном и более ранний патент «Plant Mitochondria Transformation Method» WO_2010_061187_A2, опубл. 3.06.2010, описывающий структуру векторов, поддерживающихся в митохондриях растений, включая репликоны и эффективные промоторы. В этом же ряду находится более ранний патент CA2272788 патентообладателя Garching Innovation Gmbh (Германия) (опубл. 11.12.2000).
Таким образом, можно резюмировать, что работы по направленной коррекции дефектов генома митохондрий человека и животных нигде в мире не проводились или не привели к патентоспособным результатам. Единственным примером изобретения, направленного на коррекцию истинных причин митохондриальных заболеваний MELAS и MERFF, является патент [US 2015361450], описывающий метод доставки недостающих тРНК из цитоплазмы в митохондрии, в частности с целью подавления фенотипических проявлений мутаций в митохондриальных ДНК, воздействуя на уровень гетероплазии. Однако этот метод даже теоретически не позволяет восстановить генетическую неполноценность митохондриального генома таких пациентов и на практике не используется.
Анализируя известные в патентной и иной литературе сведения о методах терапии митохондриальных болезней человека, в том числе, прямо или косвенно использующих методы генотерапии митохондриального генома, приходится констатировать, что предметы изобретения известных патентов ограничиваются способами конструирования векторных молекул ДНК для репликации в митохондриях различных организмов (млекопитающих, растений и дрожжей), содержащих неприродные элементы. Ни один из описанных методов не позволяет реплицировать полностью нативную молекулу митохондриальной ДНК человека и вносить в неё направленные изменения типа точечных замен.
Известны также способы диагностики митохондриальных болезней человека, не касаясь возможностей их лечения. Так в патенте [CN101177702] представлен генный чип, способный распознавать участки с мутациями, связанными с синдромами MELAS и MERRF митохондриальных заболеваний. Действующие патенты [WO/2015/144964, WO/2015/108077] направлены на диагностику митохондриальных болезней человека, в том числе на разработку метода диагностики или оценки риска нейродегенератиных заболеваний [WO/2015/144964] и определение содержания белка GDF15 в качестве биомаркера для оценки тяжести митохондриальных заболеваний и эффективности их лечения [WO/2015/108077]. Все эти изобретения не затрагивают тему таких синдромов, как MELAS и MERFF, а также не используют Y. lipolytica либо иные организмы для лечения таких болезней.
Таким образом, можно утверждать, что заявляемое изобретение не затрагивает каких-либо принципов, описываемых в цитируемых патентах.
Раскрытие изобретения
Разработка методов генной инженерии для работы с геномом митохондрий является полностью новым направлением биотехнологии, не имеющим аналогов. Задачей изобретения является создание метода направленной коррекции митохондриального генома человека (в частности, устранения вредных мутаций, ассоциированных с синдромами MELAS и MERFF) в гетерологичной дрожжевой системе с целью препаративной наработки скорректированного генома и введения его в мезенхимальные стромальные клетки (МСК) человека, культивируемые in vitro. МСК с восстановленной таким образом функцией митохондрий могут быть использованы для введения пациентам, что может обеспечить частичное или полное купирование симптомов MELAS и MERFF. К преимуществам описываемого способа генотерапии человека относится возможность направленной (точечной) корректировки единственного нуклеотида из состава генома, ответственного за появление митохондриальной болезни, тогда как весь остальной геном человека остается неизменным. Существует возможность предварительного полного секвенирования митохондриального генома человека, реплицирующегося в Y. lipolytica перед введением в митохондрии МСК человека. Это позволяет добиться существенного снижения риска возникновения случайных мутаций по сравнению с альтернативным подходом: ферментативным восстановлением всей последовательности митохондриального генома человека из химически синтезированных олигонуклеотидов.
Анализируя причины практически полного отсутствия описанных в патентной и иной литературе методов направленного воздействия на геном митохондрий (включая задачу генотерапии митохондриальных болезней человека), необходимо отметить, что ни один из исследованных видов эукариот не обладает собственной системой гомологичной рекомбинации митохондриального генома. Известный из уровня техники штамм дрожжей Y. lipolytica W29, несущий конструкцию pQ-SRUS, предназначенную для введения в клетки дрожжей гена RecA из Bacillus subtilis, обладает уникальной для живых объектов способностью к интеграции ДНК-конструкций в митохондриальный геном [RU 2562869]. В рамках настоящего изобретения на базе Y. lipolytica W29 разработана генетическая система, позволяющая с помощью химической трансформации вводить в митохондрии дрожжей геном митохондрий, используя фенотипическую селекцию трансформантов по восстановлению искусственно нарушенной способности штамма расти на минимальных средах с сукцинатом в качестве единственного источника энергии. В момент трансформации митохнодриальный геном человека проникает в митохондрии дрожжей и начинает реплицироваться в них наряду с собственным митохондриальным геномом Y. lipolytica, используя имеющийся там собственный ферментативный аппарат репликации. При этом ядерный геном человека, попадая в клетки дрожжей, не реплицируется и не оказывает влияния на генотип отбираемых штаммов-трансформантов. Поэтому для получения трансформантов Y. lipolytica, поддерживающих репликацию митохондриального генома человека, не требуется предварительное физическое разделение митохондриального и ядерного генома человека.
Для создания системы фенотипической селекции трансформантов Y. lipolytica, поддерживающих репликацию митохондриального генома человека, в рамках изобретения создаются штаммы с дефектами тРНК митохондриального кодирования. Удаление гена Yalif-MT39, кодирующего тРНК-Lys, или гена Yalif-MT36, кодирующего тРНК-Leu, из митохондриального генома Y. lipolytica достигается путем замещения на ген устойчивости к гигромицину с применением искусственно введенной в митохондрии системы гомологичной рекомбинации бактериального происхождения приводит к возникновению условно летального фенотипа: утрате способности использовать метаболиты цикла Кребса (в частности, сукцинат) в качестве единственного источника энергии. Для создания таких конструкций необходимо использование специальным образом модифицированного гена гигромициновой устойчивости (аминогликозидфосфотрансферазы), по кодоновому составу элемент и типу элемента инициации трансляции в адаптированному для распознавания митохондриальной системой трансляции Y. lipolytica. В виду своеобразия системы митохондриальной системы трансляции использование для этой цели генов устойчивости, адаптированных для работы в бактериях или в ядерном геноме эукариот, невозможно.
С целью адаптации 5’-некодирующей области искусственного гена устойчивости к гигромицину для экспрессии в митохондриях Y. lipolytica была использована последовательность гена ND1 из митохондриального генома этого организма, кодирующая главную субъединицу протонной NADH-оксидазы внутренней мембраны митохондрий – один из наиболее активно экспрессирующихся компонентов митохондриального генома [Edmondson et al., Mol Genet Genomics. 2005. V. 273 P. 115-22]. Она содержит рибосом-связывающую последовательность – аналог последовательности Шайна-Дельгарно у бактерий [Paul et al., Mutat. Res. 2001. V. 5. P. 486]. При конструировании кодирующей области гена особое внимание было уделено кодонам, соответствующим Leu: во всех случаях использовался кодон TTG. В качестве Arg-специфичного кодона использовался AGG. 50% кодонов, соответствующих Trp, были заменены с TGG на TGA (терминаторный кодон стандартного генетического кода). Вследствие этого искусственный ген полностью лишен способности экспрессироваться в ядерном геноме Y. lipolytica или в бактериях: возникновение устойчивости к гигромицину достигается только при встраивании гена в геном митохондрий Y. lipolytica. Для кодирования Met в двух из четырёх позиций был использован кодон ATA (соответствует Ile в стандартном коде). В качестве терминаторного был использован кодон TAA, наиболее часто использующийся в генах митохондриального кодирования Y. lipolytica [Kolesnikova et al., RNA. 2010. V. 16. P. 926–941]. Для кодирования Thr в двух позициях использован кодон CTC, соответствующий Leu в стандартном генетическом коде.
Штаммы Y. lipolytica с искусственно введенными дефектами генов Yalif-MT39 и Yalif-MT36 (замена гена тРНК на ген гигромициновой устойчивости по принципу двуплечевой гомологичной рекомбинации с использованием белка RecA – продукта конструкции pQ-SRUS) сохраняют способность эффективно расти на полноценной питательной среде, содержащей глюкозу, используя при этом аэробный метаболизм.
Введение митохондриального генома человека в клетки Y. lipolytica, несущие ноль-мутации в генах Yalif-MT39 и Yalif-MT36, приводит к комплементации утраченной функции митохондрий – способности использовать метаболиты цикла Кребса в качестве единственного источника энергии. При этом в присутствии белка RecA одновременное введение в штаммы Y. lipolytica мутантного варианта митохондриального генома человека, несущего вредную мутацию в гене тРНК-Lys, и ПЦР-копии фрагмента этой ДНК с искусственно скорректированной мутацией, приводит к образованию in vivo (в митохондриях клеток дрожжей) варианта митохондриального генома человека со скорректированной мутацией. Такая ДНК может быть выделена из клеток Y. lipolytica и использована для введения в митохондрии МСК пациента, несущего вредную мутацию.
Осуществление изобретения:
1. Конструирование синтетического гена устойчивости к гигромицину (аминогликозидфосфотрансфераза из Tn5370, размер 332 а.о.) (Фиг. 1), по кодоновому составу и организации старта трансляции адаптированного для экспрессии в митохондриях Y. lypolytica (Фиг. 2, SEQ ID NO 3).
2. На основе искусственного гена устойчивости к гигромицину создание генетических конструкций в форме линейной двунитевой ДНК, пригодных для введения в состав митохондриального генома Y. lipolytica путем гомологичной рекомбинации с 3’-UTR оперона 1 (SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2). Одновременно с приданием устойчивости к гигромицину конструкции удаление из митохондриального генома дрожжей гена тРНК-Lys или тРНК-Leu.
3. Получение трансформантов Y. lipolytica, несущих генетические конструкции на основе гена устойчивости к гигромицину (SEQ ID NO 3), в составе митохондриального генома.
4. Введение митохондриального генома человека в клетки трансформантов дрожжей с фенотипическим отбором трансформантов по комплементации дефекта в генах тРНК- Leu и тРНК-Lys. Оценка эффективности введения митохондриального генома человека в штамм дрожжей с применением метода ПЦР в реальном времени (по одной или нескольким маркерным последовательностям).
1. Разработка и получение синтетического гена устойчивости к гигромицину
Последовательность гигромицинфосфотрансферазы В - hygromycine B phosphotransferase из Tn5370 Mycobacterium smegmatis, штамм MC2 155 – детерминаниты устойчивости к гигромицину, доступна из базы данных NCBI GenBank Proteins под номером AII01819 (Фиг. 1). Соответствующая ей нуклеотидная последовательность природного гена доступна из базы данных NCBI GenBank Nucleotides под номером KM232615. При конструировании искусственного гена введение в его состав промотора не предусматривается, поскольку интегрированный в геном митохондрий трангсен эффективно транскрибируется с эффективно действующего эндогенного промотора оперона 1, находящегося выше сайта интеграции по ходу транскрипции. С целью адаптации 5’-некодирующей области искусственного гена устойчивости к гигромицину для экспрессии в митохондриях Y. lipolytica используется последовательность гена ND1 из митохондриального генома этого организма, кодирующая главную субъединицу протонной NADH-оксидазы внутренней мембраны митохондрий. Далее следует кодирующая последовательность гена, соответствующая нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 3 (Фиг. 2). Для обеспечения высокой эффективности трансляции мРНК HygR в митохондриях и исключения экспрессии соответствующего гена вне митохондриального генома (например, при интеграции его в ядерный геном) особое внимание должно быть уделено кодонам, значение которых отличается в митохондриальном и ядерном геноме Y lipolytica. Таким кодоном, в первую очередь, является Leu: при разработке искусственного гена во всех случаях целесообразно использовать кодон TTG. В качестве Arg-специфичного кодона должен использоваться AGG. Около половины всех имеющихся кодонов, соответствующих Trp, должны быть заменены с TGG на TGA (терминаторный кодон стандартного генетического кода). Вследствие этого искусственный ген оказывается полностью лишен способности экспрессироваться в ядерном геноме Y. lipolytica или в бактериях. Для кодирования Met в двух из четырёх позиций используют кодон ATA (соответствует Ile в стандартном коде). В качестве терминаторного выбирают кодон TAA, наиболее часто использующийся в генах митохондриального кодирования Y. lipolytica. Для кодирования Thr в двух позициях используют кодон CTC, соответствующий Leu в стандартном генетическом коде. С 5’-конца искусственный ген ограничивают сайтом рестрикции BamHI, с 3’-конца – сайтом HindIII. Последовательность искусственного гена устойчивости к гигромицину представлена на Фиг. 2 (SEQ ID NO 3).
Синтез искусственного гена осуществляют полуферментативным методом. Во избежание неточностей химического синтеза длина олигонуклеотидов, введенных в реакцию лигирования, не должна превышать 50 нт. Температура гибридизации смеси олигонуклеотидов перед началом реакции лигирования – 60°С, время гибридизации – 20 мин.
Каждый олигонуклеотид предварительно подвергают фосфорилированию 5’-конца с помощью полинуклеотидкиназы и вводят в реакцию в количестве 200 пмоль. В результате лигирования был получают продукт длиной 1030 п.н. После очистки с помощью набора GeneJet (MBI Fermentas) без использования дополнительной ПЦР-амплификации получают ~56 пмоль двуцепочечной ДНК ожидаемого размера 1030 п.н. (Фиг. 3). Её непосредственно используют для создания конструкций для трансформации Y. lipolytica в линейной форме.
2. Разработка генетических конструкций для замещения генов тРНК- Leu и тРНК-Lys на ген гигромициновой устойчивости в составе митохондриального генома Y. lipolytica
Для проведения трансформации используют ранее описанный рекомбинантный штамм Y. lipolytica W29 (pQ-SRUS), обладающий активностью рекомбиназы RecA бактериального происхождения в митохондриях [Патент RU 2562869].
Создают две конструкции, где адресные последовательности длиной 400 п.н. для гомологичной рекомбинации с флангами генов Yalif-Mt36 и Yalif-Mt39 присоединяют к искусственному гену устойчивости к гигромицину (Фиг. 4). Конструкции Lys39H и Leu36H создают в линейной форме и препаративно нарабатывают с помощью препаративной ПЦР.
Для создания конструкции Lys39H синтезируют праймеры:
Lys39-1 | cctttaaaagtagaatatatatata |
Lys39-2 | GGGGATCCttaattaatatatttaatatgaa |
необходимые для ПЦР-клонирования области генома митохондрий 3591-3991 длиной 400 п.н. со следующей последовательностью:
1 cctttaaaag tagaatatat atataacata ataacaaaaa gtagactctg aaccatctct
61 ttgagacggt tcgagtccta tttttgttat agaagggaat aaatatatac acataaaaga
121 ataatatata agaaaaaaaa ataacgaatg tccctaactt catccttttg gattgtaagt
181 tccgataaat atatatatta tatgttcata aattaagata tatatatatc tattatcggt
241 ccttctcttt gataatttat taataatgtg ttaggtagcg ggcagggtat ttaatacttt
301 tagctctact gagttgtaga ttaattggca aatcacttaa atttgagtta agactatgaa
361 agttcgaatc tttccaattc atattaaata tattaattaa g
При этом в состав праймера Lys39-2 вводят сайт BamHI, необходимый для стыковки с последовательностью искусственного гена гигромицина HygR.
Для ПЦР-клонирования области генома митохондрий 4061-4461 длиной 400 п.н. используют праймеры:
Lys39-3 | GGAAGCTTctttctattatttatattaaataatat |
Lys39-4 | AATTATATATGATAGCTCAAATATCA |
с помощью которых прводят ПЦР-клонирование фрагмента ДНК со следующей последовательностью:
1 ctttctatta tttatattaa ataatataat tattatataa aggaccaaat agaatcgaac
61 tatcggcttg ccgaaggttc gattcctata ggaccccttt ctattattta tattaaataa
121 tataattatt tatgaaatat tcaatagata attataaaaa tttaaggtac tttttaacta
181 attgaatcga aacatcttag tttgtaaagc tatatataat tatatatagg taaaagttgt
241 atatgtaaaa aatttaagtt aaaaatagta aaaaccttta atttaacggt aaaatacata
301 attgataatt atgatacgtc aggttcgact cctacaaggt ttaataaagg atatttggct
361 gagcggttga aagcatgata tttgagctat catatataat t
Пары праймеров Lys39-1/Lys39-2 и Lys39-3/Lys39-4 вводят в реакцию ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК типового коллекционного штамма Y. lipolytica CLIB-122.
Для создания конструкции Leu36H используют праймеры:
Leu36-1 | attgttttgtaatcagtagcttttggt |
Leu36-2 | GGGGATCCTTATTATTTAATAAATATAATTTTATAT, |
необходимые для ПЦР-клонирования области генома митохондрий 3088-3488 длиной 400 п.н. со следующей последовательностью:
1 attgttttgt aatcagtagc ttttggttca aatccaaaat ttaacattaa aatttataat
61 attatcctcc cataattaaa agagttgatt tttaagacct tatcgtcaaa cgtaagacgt
121 tagaacttca ctctaaaaat acgggttcaa gtcccgttaa ggttaaaaaa tataatatta
181 ttaaagtaac atagtgtaat ggtatcacat caggctcata atctgataat atttggttcg
241 aatccatttg ttgctatata atttataata ggttaataga aagtttggaa ctatagttta
301 aaggttaaaa ctaaccgctc ataacggttc aatgattgtt cgagtcaatc tggttctata
361 aaaatatata aatatatttt ttatatttat taaataataa g
При этом в состав праймера Leu36-2 вводят сайт BamHI, необходимый для стыковки с последовательностью искусственного гена HygR.
Для ПЦР-клонирования области генома митохондрий 3569-3969 длиной 400 п.н. используют праймеры:
Leu36-3 | GGAAGCTTatagaagggagtaataatacttcctttaaaag |
Lys36-4 | AATTGGAAAGATTCGAACTTTCAT |
с помощью которых проводят ПЦР-клонирование фрагмента ДНК со следующей последовательностью:
1 atagaaggga gtaataatac ttcctttaaa agtagaatat atatataaca taataacaaa
61 aagtagactc tgaaccatct ctttgagacg gttcgagtcc tatttttgtt atagaaggga
121 ataaatatat acacataaaa gaataatata taagaaaaaa aaataacgaa tgtccctaac
181 ttcatccttt tggattgtaa gttccgataa atatatatat tatatgttca taaattaaga
241 tatatatata tctattatcg gtccttctct ttgataattt attaataatg tgttaggtag
301 cgggcagggt atttaatact tttagctcta ctgagttgta gattaattgg caaatcactt
361 aaatttgagt taagactatg aaagttcgaa tctttccaat t
После очистки с применением набора GeneJet (MBI Fermentas) «плечи для рекомбинации» длиной 400 п.н. обрабатывают рестриктазой BamHI (продукты ПЦР, полученные с помощью праймеров Lys39-1/Lys39-2 и Leu39-1/Lys39-2) или HindIII (продукты ПЦР, полученные с праймерами Lys39-3/Lys39-4 и Leu39-3/Leu39-4). Фрагмент, соответствующий искусственному гену HygR, обрабатывают одновременно рестриктазами BamHI и HindIII.
Далее с целью получения конструкции Lys39H смешивают по 3 пмоль фрагментов, полученных с праймерами Lys39-1/Lys39-2, Lys39-3/Lys39-4 и фрагмента гена HygR, проводят обработку Т4 ДНК-лигазой в течение 12 часов. Лигазную смесь используют в качестве матрицы для ПЦР с праймерами Lys39-1 и Lys39-4.
1. Получение трансформантов дрожжей, несущих генетические конструкции для замещения генов тРНК- Leu и тРНК-Lys на ген гигромициновой устойчивости в составе митохондриального генома Y. lipolytica
Для проведения трансформации используют штамм Y. lipolyica W29, несущий ген рекомбиназы RecA под контролем промотора и терминатора транскрипции гена SOD2 в составе интегративной конструкции pQ-SRUS [RU 2562869].
Для получения препарата компетентных клеток штамм культивируют на полноценной жидкой среде YP состава (г/л): протеозный пептон (Difco) – 20, дрожжевой экстракт (Difco) – 10, при интенсивной аэрации при 30°С в течение 16 часов.
ДНК конструкции Lys39H нарабатывают с помощью препаративной ПЦР при помощи праймеров Lys39-1 и Lys39-4, а ДНК конструкции Leu36H - при помощи праймеров Leu36-1 и Leu36-4. Праймеры в количестве 10 пмоль каждого вносят в объем реакционной смеси 30 мкл. При проведении ПЦР используют температуру отжига 58°С. По окончании реакции продукты очищают с помощью набора GeneJet (MBI Fermentas) и определяют концентрацию с помощью спектрфотометра NanoDrop (Eppendorf). Для эксперимента используют препараты, имеющие концентрацию ДНК не менее 0,1 мкг/мкл.
Процедуру трансформации с использованием ацетата Li и полиэтиленгликоля 6000 проводят по методу, описанному ранее в работе [Davidow L.S. et al. Curr. Genet. 1985. V. 10. P. 39-48]. При этом к аликвоте клеток, содержащей 108 к.о.е., добавляют 1,2 мкг очищенной ДНК конструкции Lys39H или Leu36H. По окончании трансформации клетки, тщательно промытые деионизованной водой для удаления остатков полэтиленгликоля, высевают на полноценную агаризованную среду YPD (2% бактопептон, 2% дрожжевой экстракт Difco, 2% глюкоза, 2% бактоагар HyMedia) с добавлением гигромицина (G-418, Promega) в концентарции 23 мкг/мл.
Чашки инкубируют в термостате в течение 48 часов при 30°С. Выросшие колонии (15 колоний, полученных при трансформации ДНК конструкции Lys39H, и 13 колоний, полученных при трансформации ДНК конструкции Leu36H) пересевают на селективную среду того же состава, которая использовалась для трансформации. Полученную чашку используют в качестве исходного материала для проверки фенотипа трансформантов. Для этого каждую колонию пересевают на синтетическую агаризованную среду YNB (с добавлением витаминов и микроэлементов), содержащую в качестве единственного источника углерода и энергии 100 мМ Трис-сукцинат, рН 5,5. Для поддержания рН в среду вносят также 2 M KPi буфер; pH 5,5, приготовленный по прописи: 272 г/л безводного KH2PO4 (Amresco кат. № 0781) растворяют в 1 л воды и доводят рН с помощью рН-метрического титрования с помощью 2 M K2HPO4 (получают путем растворения 342 г/л безводного K2HPO4 (Amresco кат № 0705). Фосфатный буфер вносят в среду в объёмном соотношении 1:40 перед засевом. Из 28 проверенных колоний 12 (в том числе 7 колоний, полученных при трансформации ДНК конструкции Lys39H, и 5 колоний, полученных при трансформации ДНК конструкции Leu36H, сохраняют способность расти на минимальной среде, что свидетельствует об отсутствии перестройки митохондриального генома в результате встройки конструкций. Эти клоны в дальнейшей работе не используют. Оставшиеся 16 колоний, не обладающих способностью к росту на минимальной среде с содержанием сукцината в качестве единственного источника энергии, подвергают генотипированию.
Клетки, не обладающие способностью к росту на минимальной среде с сукцинатом в качестве единственного источника энергии, выращивают в неселективных условиях на жидкой полноценной среде YPD при интенсивной аэрации в объеме 3 мл и выделяют суммарную геномную ДНК с помощью набора Проба-ГС (ДНК-Технология, Москва). Полученные препараты геномной ДНК исследуют с помощью аналитической ПЦР с праймерами Lys39-1/Lys39-2 (8 клонов, полученных при трансформации конструкцией Lys39H), или с Leu36-1/Leu36-2 (8 клонов, полученных при трансформации конструкцией Leu36H). Результаты проверки представлены на Фиг. 5.
Результат генотипирования показывает, что два клона W29 (pQ-SRUS, Lys39H)#3 и W29 (pQ-SRUS, Leu36H)#15, сохраняют интактную структуру 5’-концевого фланга митохондриального генома, примыкающего к конструкции. Эти клоны используют для дальнейших экспериментов по введению митохондриального генома человека и восстановлению структуры и активности генов TRNL1 и TRNK/MTTK в ней.
4. Введение митохондриального генома человека в клетки трансформантов дрожжей с фенотипическим отбором трансформантов по комплементации дефекта в генах тРНК- Leu и тРНК-Lys
Для получения препарата компетентных клеток штаммы W29 (pQ-SRUS, Lys39H)#3 и W29 (pQ-SRUS, Leu36H)#15 культивируют на полноценной жидкой среде YP состава (г/л): протеозный пептон (Difco) – 20, дрожжевой экстракт (Difco) – 10, при интенсивной аэрации при 30°С в течение 16 часов и далее обрабатывают, как описано [Davidow L.S. et al. Curr. Genet. 1985. V. 10. P. 39-48].
Суммарную геномную ДНК человека для использования при трансформации дрожжей выделяют с помощью набора DNA IQ System (Qiagen) на основе магнитных микрочастиц. Используют первичную культуру фибробластов человека в количестве 1010 клеток с диплоидным набором хромосом. Для единичного эксперимента используют 10 мкг препарата геномной ДНК первичных фибробластов человека. При этом к аликвоте клеток, содержащей 108 к.о.е., добавляют ДНК в объеме 10 мкл. Трансформанты высевают на синтетическую агаризованную среду YNB (с добавлением витаминов и микроэлементов), содержащую в качестве единственного источника углерода и энергии 100 мМ Трис-сукцинат, рН 5,5 с добавлением гигромицина (G-418, Promega) в концентрации 23 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля используют аликвоты компетентных клеток W29 (pQ-SRUS, Lys39H)#3 и W29 (pQ-SRUS, Leu36H)#15 без добавления ДНК человека. При трансформации штамма, несущего конструкцию W29 (pQ-SRUS, Lys39H)#3, получают 8 колоний, при трансформации штамма W29 (pQ-SRUS, Leu36H)#15 – 7 колоний. В отрицательных контролях колонии появляться не должны. Выросшие колонии двукратно пассируют на агаризованной синтетической среде с сукцинатом в качестве единственного источника энергии, после чего их выращивают в неселективных условиях на жидкой полноценной среде YPD при интенсивной аэрации в объеме 3 мл и выделяют суммарную геномную ДНК с помощью набора Проба-ГС (ДНК-Технология, Москва). Полученные препараты геномной ДНК исследуют с помощью ПЦР в реальном времени, используя набор производства Евроген (Москва), каталожный номер PK145S, содержащий хот-стартовый комплекс ДНК-полимеразы Taq и интеркалирующий краситель Sybr Green и три пары праймеров: HygU1 (GGGGATCCacaaaccataaaaaaaaatgCTTcaagaatccTTGttaTTGT)/HygL1 (GGAAGCTTAggcgccgggggcggtgtccggcggcccccaCAAgaactgcg) (для оценки содержания собственного митохондриального генома Y. lipolytica, маркированного геном HygR), MTTL1 (gggtttgttAagatggcagagcccggt)/MTTL2 (ggttggccatgggtatgttgttaagaa) (для выявления последовательности гена тРНК – Leu генома человека) и TRNK1 (agaaccaacacctctttacagtgaaat)/ TRNK2 (ttagttgggtgatgaggaatagtgtaa) (для выявления последовательности гена тРНК – Lys генома человека). Реакцию проводят помощью термоциклера с оптической системой детекции «ДТ-322» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Учёт результатов реакции выполняют с помощью программного обеспечения детектирующего термоциклера «ДТ-322» (Фиг. 6). В качестве отрицательных контролей используют препараты геномной ДНК родительских штаммов Y. lipolytica W29 (pQ-SRUS, Lys39H)#3 и W29 (pQ-SRUS, Leu36H)#15.
Измерения параметра Ct показывает наличие следующих средних величин для каждой группы клонов (Таблица 1).
Таблица 1. Средние значения и среднеквадратичные отклонения параметра Ct в среднем для групп трансформантов Y. lipolytica W29 (pQ-SRUS)
Род. штамм | Определяемые маркерные последовательности | ||
Hyg (YL) | MTTL (hum) | TRNK (hum) | |
Lys39H | 22,2±0,3 | 23,5±0,5 | 23,8±0,4 |
Leu36H | 21,8±0,4 | 23,9±0,5 | 23,9±0,5 |
При этом величина Ct во всех контрольных точках составляет 45 циклов (максимально возможное значение с учетом числа выполненных циклов). Таким образом, использованный метод ПЦР в реальном времени обеспечивает возможность точно идентифицировать образцы, в которых отсутствует исследуемая мишень.
Клоны №3 и №6, полученные при трансформации геномной ДНК человека штамма Y. lipolytica W29 (pQ-SRUS, Lys39H)#3 показали отсутствие маркера MTTL человеческого митохондриального генома при наличии маркера TRNK.
Симметричная ситуация наблюдалась при трансформации штамма W29 (pQ-SRUS, Leu36H)#15. В части клонов трансформантов (например, клон №4, Фиг. 6) при трансформации происходит утрата части митохондриального генома человека, приводящая к отсутствию в генотипе маркера TRNK. Утрата селектируемого в процессе трансформации маркеров (например, MTTL в случае штамма W29 (pQ-SRUS, Leu36H)#15) не ожидается. Вероятность утраты случайно взятого локуса митохондриального генома в процессе трансформации составляет от 25% (в случае штамма W29 (pQ-SRUS, Lys39H)#3) до 14% (в случае штамма W29 (pQ-SRUS, Leu36H)#15).
Краткое описание графических изображений:
Фиг. 1. Аминокислотная последовательность маркера устойчивости к гигромицину (гигромицинфосфотрансфераза В - hygromycine B phosphotransferase) из Tn5370 Mycobacterium smegmatis, штамм MC2 155, депонированная в базе данных NCBI GenBank Proteins под номером AII01819.
Фиг. 2. Нуклеотидная последовательность искусственного гена устойчивости к гигромицину (гигромицинфосфотрансфераза В - hygromycine B phosphotransferase) из Tn5370 Mycobacterium smegmatis, адаптированная для экспрессии в митохондриальном геноме Y. lipolytica. Рамкой выделена 5’-нетранслируемая область, взятая из гена ND1 Y. lipolytica, инициаторный и терминаторный кодоны выделены жирным шрифтом и подчёркнуты. Кодоны, используемые в соответствии с уникальными особенностями генетического кода митохондрий дрожжей, показаны прописными буквами. Последовательности фланкирующих рестриктных сайтов BamHI и HindIII выделены серой заливкой.
Фиг. 3. Электрофоретический анализ фрагмента ДНК, полученного в результате лигирования фосфорилированных олигонуклеотидов. Ожидаемый размер искусственного гена устойчивости к гигромицину (гигромицинфосфотрансфераза В - hygromycine B phosphotransferase) из Tn5370 Mycobacterium smegmatis, адаптированного для экспрессии в митохондриальном геноме Y. lipolytica – 1030 п.н. (дорожка 1).
Фиг. 4. Схема интегративных конструкций Lys39H и Leu36H.
Фиг. 5. Результаты генотипирования клонов, полученных в результате трансформации Y. lipolytica W29 (pQ-SRUS) линейными конструкциями Lys39H и Leu36H, предназначенными для интеграции в геном митохондрий.
Дорожки 1-8: геномная ДНК клонов 1-15, полученных при трансформации конструкцией Lys39H и утративших способность к росту на среде с сукцинатом в качестве единственного источника энергии - ПЦР праймерами Lys39-1/Lys39-2.
Дорожки 9-16: геномная ДНК клонов 1-13, полученных при трансформации конструкцией Leu36H и утративших способность к росту на среде с сукцинатом в качестве единственного источника энергии - ПЦР с праймерами Leu36-1/Leu36-2.
Фиг. 6. Результаты определения содержания митохондриального генома человека в биомассе клонов, полученных при трансформации штаммов W29 (pQ-SRUS, Lys39H)#3) и W29 (pQ-SRUS, Leu36H)#15 суммарной ДНК человека с последующим отбором на минимальной среде с сукцинатом в качестве единственного источника углерода.
По оси абсцисс указаны номера клонов, полученных при трансформации родительских штаммов W29 (pQ-SRUS, Lys39H)#3) и W29 (pQ-SRUS, Leu36H)#15 соответственно. Литерой «К» отмечен контроль – ДНК соответствующего исходного родительского штамма. По оси ординат приведены значения порогового цикла (Ct), автоматически определенного встроенным программным обеспечением детектирующего термоциклера «ДТ-322».
Claims (1)
- Способ репликации человеческого митохондриального генома в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica, отличающийся тем, что штамм Yarrowia lipolytica, содержащий ранее интегрированные конструкции pQ-SRUS и Lys39H (SEQ ID NO 1) на основе маркера устойчивости к гигромицину HygR (SEQ ID NO 3), либо штамм Yarrowia lipolytica, содержащий ранее интегрированные конструкции pQ-SRUS и Leu36H (SEQ ID NO 2), трансформируют препаратом суммарной ДНК человека, используя метод химической трансформации, после чего проводят отбор трансформантов на минимальной синтетической среде, содержащей сукцинат в качестве единственного источника энергии, и определяют наличие реплицирующейся ДНК митохондриального генома человека с помощью ПЦР в реальном времени с парами праймеров, специфичных к ДНК митохондриального генома человека: MTTL1 (gggtttgttAagatggcagagcccggt)/MTTL2 (ggttggccatgggtatgttgttaagaa) для выявления последовательности гена тРНК - Leu генома человека и TRNK1 (agaaccaacacctctttacagtgaaat)/ TRNK2 (ttagttgggtgatgaggaatagtgtaa) для выявления последовательности гена тPHK - Lys генома человека.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016122717A RU2660715C2 (ru) | 2016-06-09 | 2016-06-09 | Способ репликации человеческого митохондриального генома в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016122717A RU2660715C2 (ru) | 2016-06-09 | 2016-06-09 | Способ репликации человеческого митохондриального генома в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016122717A RU2016122717A (ru) | 2017-12-14 |
RU2660715C2 true RU2660715C2 (ru) | 2018-07-09 |
Family
ID=60718346
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016122717A RU2660715C2 (ru) | 2016-06-09 | 2016-06-09 | Способ репликации человеческого митохондриального генома в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2660715C2 (ru) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009150441A1 (en) * | 2008-06-13 | 2009-12-17 | University Of Stavanger | Mitochondrial transformation |
EP2367941A2 (en) * | 2008-11-25 | 2011-09-28 | Algentech SAS | Plant mitochondria transformation method |
RU2562869C1 (ru) * | 2014-10-31 | 2015-09-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (ИНБИ РАН) | ИНТЕГРАТИВНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pQ-SRUS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica, ОБЛАДАЮЩИХ СПОСОБНОСТЬЮ К ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ ГЕНОМА МИТОХОНДРИЙ ЗА СЧЁТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА БЕЛКА RecA БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ |
US20150315608A1 (en) * | 2012-09-26 | 2015-11-05 | Universitat Leipzig | Mitochondrial expression vector and method for the transformation of mitochondria |
US20150361450A1 (en) * | 2014-06-13 | 2015-12-17 | Universite De Strasbourg | Vector for therapy of mitochondrial disease |
-
2016
- 2016-06-09 RU RU2016122717A patent/RU2660715C2/ru active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009150441A1 (en) * | 2008-06-13 | 2009-12-17 | University Of Stavanger | Mitochondrial transformation |
EP2367941A2 (en) * | 2008-11-25 | 2011-09-28 | Algentech SAS | Plant mitochondria transformation method |
US20150315608A1 (en) * | 2012-09-26 | 2015-11-05 | Universitat Leipzig | Mitochondrial expression vector and method for the transformation of mitochondria |
US20150361450A1 (en) * | 2014-06-13 | 2015-12-17 | Universite De Strasbourg | Vector for therapy of mitochondrial disease |
RU2562869C1 (ru) * | 2014-10-31 | 2015-09-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (ИНБИ РАН) | ИНТЕГРАТИВНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pQ-SRUS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica, ОБЛАДАЮЩИХ СПОСОБНОСТЬЮ К ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ ГЕНОМА МИТОХОНДРИЙ ЗА СЧЁТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА БЕЛКА RecA БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SHADEL G. S. INSIGHTS FROM MODEL SYSTEMS Yeast as a Model for Human mtDNA Replication // Am. J. Hum. Genet. 65:1230-1237, 1999. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2016122717A (ru) | 2017-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11713471B2 (en) | Class II, type V CRISPR systems | |
Mann et al. | RPC40, a unique gene for a subunit shared between yeast RNA polymerases A and C | |
Mita et al. | Recombination via flanking direct repeats is a major cause of large-scale deletions of human mitochondrial DNA | |
CN110520528A (zh) | 高保真性cas9变体及其应用 | |
CN110527697B (zh) | 基于CRISPR-Cas13a的RNA定点编辑技术 | |
KR20180069898A (ko) | 핵염기 편집제 및 그의 용도 | |
US9567590B2 (en) | Method of introducing a mitochondrial genome into a eukaryotic cell mitochondrion | |
US20230416710A1 (en) | Engineered and chimeric nucleases | |
CN110892074A (zh) | 用于增加香蕉的保质期的组成物及方法 | |
JP2016501549A (ja) | トリコデルマリーセイQM6aおよびその誘導体中の交配障害と関連する遺伝子/遺伝要素ならびにその同定方法 | |
KR20180091099A (ko) | 단백질 제조를 위한 개선된 진핵 세포 및 이들을 제조하는 방법 | |
Kuo et al. | Improvement in the secretory expression of recombinant Candida rugosa lipase in Pichia pastoris | |
RU2660715C2 (ru) | Способ репликации человеческого митохондриального генома в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica | |
CN113549650B (zh) | 一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用 | |
CN110499333A (zh) | 用于修复dmd基因突变的核酸序列及系统 | |
AU2011201470A1 (en) | Reduction of spontaneous mutation rates in cells | |
CN106119137B (zh) | 一种改善丝状真菌蛋白分泌能力的方法 | |
KR20180128864A (ko) | 매칭된 5' 뉴클레오타이드를 포함하는 가이드 rna를 포함하는 유전자 교정용 조성물 및 이를 이용한 유전자 교정 방법 | |
KR102358538B1 (ko) | 유전자 총법을 이용한 미세조류의 교정 방법 | |
CN107604059A (zh) | 一种朗德鹅填饲后鹅肥肝增重的分子标记及应用 | |
Gao et al. | Basic amino acid mutations in the nuclear localization signal of hibiscus chlorotic ringspot virus p23 inhibit virus long distance movement | |
Isakova et al. | Genetic system for maintaining the mitochondrial human genome in yeast Yarrowia lipolytica | |
CN117051043B (zh) | 一种基于环状rna编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素及其应用 | |
CN110218701B (zh) | 一种筛选miRNA调控剂的细胞模型及应用 | |
WO2024173573A1 (en) | Crispr-transposon systems and components |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20201211 Effective date: 20201211 |