CN108371665B - Rad54b的反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了RAD54B的反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭的药物中的应用。本发明针对RAD54B高表达的含有双微体的肿瘤细胞,利用RAD54B反义核苷酸序列,通过RNA干扰的方法降低RAD54B的表达,减少双微体数目,从而有效抑制肿瘤细胞的生长,增殖和侵袭,降低其恶性程度。本发明将RAD54B的反义核苷酸序列应用于RAD54B高表达的含有双微体的肿瘤细胞生长抑制药物的制备中,能够为含有双微体的肿瘤的生物治疗提供新的药物制备和靶向性治疗方案,提高治疗的特异性。
Description
技术领域
本发明涉及RAD54B的反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭的药物中的应用,本发明属于医药技术领域。
背景技术
DNA修复和重组蛋白RAD54同源物B(recombination and DNA repair proteinRAD54B,RAD54B)是RAD52家族的一员,主要参与DNA损伤的同源重组修复过程。RAD54B是一个DNA损伤应答蛋白,能通过与MDM2-MDMX泛素化连接酶复合体的直接作用,降解p53蛋白。研究发现,RAD54B在肿瘤中经常成高表达且组成型激活状态,促进基因组的不稳定。早在1999年就有发现RAD54B在结直肠癌与原发淋巴瘤中存在体细胞突变。随着DNA测序的研究的发展,发现RAD54B至少在包括肺癌,乳腺癌,结直肠癌等在内的12种肿瘤中存在体细胞突变,证明该基因与肿瘤的发生发展密切相关。此外,RAD54B在多种肿瘤中存在高表达现象,且与预后明显相关。高表达RAD54B能作为结直肠癌患者远端复发和肺腺癌预后的独立预测指标。
双微体(double minutes或double minute chromosomes,DMs)是Spriggs等1962年在一些恶性肿瘤细胞和渗出液及肺癌胸水的转移细胞中首次鉴定的成对存在的颗粒状结构,是基因扩增的另一种主要形式。DMs经常成对出现,是无着丝粒、无端粒、能自我复制的染色体外环状DNA分子,其上经常携带癌基因和耐药基因。大量研究表明,DMs与肿瘤的发生发展,细胞的增殖、抗凋亡以及耐药密切相关。我们的前期工作发现并确认人卵巢癌细胞UACC-1598中有存在大量双微体,因此利用该细胞验证RAD54B基因对双微体的影响,以及对含有双微体的肿瘤细胞功能的改变。
1983年SNAPKA M.R.等首次发现低浓度的羟基脲(HU)可以诱导双微体丢失,减少携带的DHFR基因的扩增拷贝数,降低肿瘤的恶性表型。从肿瘤细胞中消除双微体上扩增的癌基因和耐药基因,降低其致癌性或恢复细胞对药物的敏感性,去除双微体是治疗以基因扩增为标志的疾病的可行途径。不足之处是在临床实际中也会将羟基脲应用于肿瘤治疗,但对肿瘤并没有较强的特异性,羟基脲半衰期短,高剂量,易产生快速耐受性。
针对肿瘤细胞的特点进行特异性治疗可以提高肿瘤治疗的敏感性和特异性,有的放矢,由于某些肿瘤细胞可检测到双微体的形成和RAD54B的异常激活相关,针对这一特点对肿瘤细胞双微体形成密切相关的重要靶点进行干预。通过抑制RAD54B的表达减少肿瘤细胞中双微体数目,从而控制肿瘤细胞的演进,从而可应用于肿瘤细胞生长抑制药物的制备中。
发明内容
针对目前肿瘤治疗效果欠佳的情况,本发明的目的在于提供一种针对含有双微体的肿瘤的靶向生物治疗策略。通过RAD54B反义核苷酸序列干扰RAD54B表达,从而抑制肿瘤细胞生长,降低双微体数目,用于制备针对含有双微体肿瘤细胞生长的抑制药物。
为了达到上述目的,本发明采用了以下技术手段:
本发明特异性的针对RAD54B高表达且含有双微体的肿瘤类型,选择含有双微体的人卵巢癌细胞系UACC-1598为研究对象,以RAD54B的反义核苷酸序列进行RNA干扰抑制,结果表明利用RAD54B反义核苷酸序列通过RNAi技术降低RAD54B其蛋白的表达,能明显降低双微体数目,从而降低肿瘤细胞的恶性程度。
因此,在上述研究的基础上,本发明提出了RAD54B的反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭的药物中的应用。
其中,所述的RAD54B的反义核苷酸序列通过降低双微体数目,从而达到抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭的目的。
其中,优选的,所述的RAD54B的反义核苷酸序列的靶点序列为位于RAD54B上的SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。
其中,优选的,所述的RAD54B的反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQ IDNO.5以及SEQ ID NO.6所示。
其中,优选的,所述的RAD54B的反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQ IDNO.7以及SEQ ID NO.8所示。
其中,优选的,所述的肿瘤细胞为RAD54B高表达且含有双微体的肿瘤细胞。更优选的,所述的肿瘤细胞为人卵巢癌细胞系UACC-1598。
其中,优选的,将所述的RAD54B的反义核苷酸序列克隆入沉默表达载体中,用于制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭的药物。
其中,优选的,所述的沉默表达载体为TRC2表达载体。
相较于现有技术,本发明的有益效果是:
本发明针对RAD54B高表达的含有双微体的肿瘤细胞,利用RAD54B反义核苷酸序列,通过RNA干扰的方法削弱RAD54B的表达,减少双微体数目,从而有效抑制肿瘤细胞的生长,增殖和侵袭,降低其恶性程度。将RAD54B的反义核苷酸序列应用于RAD54B高表达的含有双微体的肿瘤细胞生长抑制药物的制备中,能够为含有双微体的肿瘤的生物治疗提供新的药物制备和靶向性治疗方案,提高治疗的特异性。
附图说明
图1是qRT-PCR结果图,表示RAD54B基因在UACC-1598肿瘤细胞中表达明显高于正常人卵巢组织。
图2是质粒测序结果图,表示TRC2-shRAD54B基因真核表达载体构建成功。
图3是Western blot结果图,表示转染TRC2-shRAD54B后UACC-1598中RAD54B表达水平下降。
图4是中期核型分析检测双微体数目图,表示转染后的UACC-1598细胞中双微体数目下降。
图5是中期核型统计散点图,表示转染后的UACC-1598细胞双微体数目的减少情况。
图6是实时定量PCR柱状图,表示转染后的UACC-1598细胞双微体携带基因扩增减少。
图7是细胞生长曲线图,表示抑制RAD54B表达后UACC-1598细胞增殖能力降低。
图8是平板克隆实验图,表示抑制RAD54B表达后UACC-1598细胞克隆形成能力降低。
图9是平板克隆数统计图,表示抑制RAD54B表达后UACC-1598细胞克隆形成能力降低。
图10是细胞基底膜侵袭实验图,表示抑制RAD54B表达后UACC-1598细胞侵袭能力下降。(***:p<0.001转染后细胞与未转染细胞相比,细胞克隆数存在差异)
图11是细胞基底膜侵袭统计图,表示抑制RAD54B表达后UACC-1598细胞侵袭能力下降。(***:p<0.001转染后细胞与未转染细胞相比,侵袭细胞数存在差异)
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将随着描述而更为清楚,但该实施例仅用于说明本发明,并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、检测肿瘤细胞中RAD54B扩增情况
(1)常规细胞培养
选择含有双微体的人卵巢癌细胞系UACC-1598为研究对象,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,置于CO2孵箱中于37℃条件下进行培养。
(2)mRNA水平检测UACC-1598细胞中RAD54B表达情况
mRNA水平,以正常人卵巢组织cDNA为对照,检测RAD54B在UACC-1598中表达情况。如图1所示,RAD54B基因在三种不同肿瘤细胞系及正常人卵巢组织表达情况,结果显示肿瘤细胞中RAD54B基因表达量明显高于正常对照组织。
检索NCBI Gene数据库,获得RAD54B基因序列,应用DNAstar软件设计并合成基因特异性引物,所用引物由Invitrogen公司合成,序列如下表1所示:
表1cDNA引物
采用TRIzol Reagent总RNA提取试剂,按说明书提供的方法提取人卵巢癌细胞UACC-1598的总RNA。依测定浓度调整各组样品总RNA量,采用Roche公司的TranscriptorFirst Stand cDNA System Kit逆转录试剂盒,按照说明书提供的方法逆转录合成cDNA第一链。反应条件50℃60min;85℃5min;16℃+∞。-20℃保存cDNA第一链。qRT-PCR检测UACC-1598中RAD54B的cDNA水平。
2、构建TRC2-shRAD54B基因真核表达载体抑制RAD54B表达
(1)构建并鉴定TRC2-shRAD54B表达载体
①设计TRC2-shRNA序列
选择4个hRAD54B位点设计siRNA寡核苷酸序列,经实验证明TRC2-shRAD54B-2,TRC2-shRAD54B-3效果较好。hRAD54B对应位点序列如下:
siRAD54B-2:AAGTTCATACAGGTGATTCGT(SEQ ID NO.1)
siRAD54B-3:AACCTCATTGGAGGATCTCAC(SEQ ID NO.2)
构建TRC2-shRAD54B质粒,合成序列如下表2所示的序列:
表2
②寡核苷酸退火
溶解oligos的浓度至100nmol/mL,反应体系:
反应条件:95℃水浴5min,自然降温到室温(30℃以下);
吸取退火后产物1μL,溶于200μL水中。
③TRC2载体线性化
环状TRC2shRNA表达载体含有BamHI、EcoRI限制性酶切位点,用这两种内切酶对TRC2进行双酶切,获得线性质粒载体,且两端为所需酶切位点粘性末端。
酶切体系如下:
37℃水浴2h;1%琼脂糖凝胶电泳;按照PCR产物回收步骤进行回收。
④寡核苷酸片段与线性化的shRAD54B表达质粒TRC2连接重组
反应体系:
16℃反应过夜。
⑤TRC2-RAD54B重组质粒转化至感受态细胞stbl3
从-80℃冰箱中取出感受态细胞stbl 350μL,立即插入冰内,待其自然融化。加入5μL连接产物,轻轻混匀后冰上放置30min。42℃水浴75s。在放入冰上2min。加入500μL LB培养液(不含氨苄),置于37℃振荡培养箱中培养,150rpm,45min。离心,3500rpm,2min。弃400μL上清液,剩余100μL液体轻轻混匀,均匀涂布于AMP(+)LB培养皿上,37℃培养过夜。
⑥挑选阳性克隆
在含Amp的平皿培养基上接种后培养16~20小时后,可见散在分布的菌落,从中挑选数个单克隆菌落,分别接种于5mL LB培养液中,37℃振荡培养16~20小时,180rpm。
⑦检测质粒构建效果
根据QIAGEN公司提供的说明书进行操作快速提取TRC2-shRAD54B重组质粒DNA,双酶切法鉴定shRAD54B与TRC2载体是否连接成功。所获得的质粒经上述方法初步验证后送Invitrogen公司测序。测序结果如图2所示。将测序所得到的序列使用NCBI数据库进行BLAST同源性分析比对。
(2)细胞转染
将上述质粒转染入UACC-1598细胞,转染过程按照LipofectinTM 2000转染试剂说明书操作。在转染24h之后,加入嘌呤霉素(Puromycin)进行稳定筛选,2~3天更换含相同嘌呤霉素浓度的培养基。7天后,空白对照组细胞基本都已经死亡,而转染组的细胞有散在的细胞克隆,待6孔板内细胞生长至70%~80%时转移至培养瓶中继续培养。得到稳定转染的细胞组和对照组,培养至铺满培养瓶。收取细胞沉淀,加入适量裂解液,提取总蛋白。利用Western blot检测RAD54B敲减效果,发现TRC2-shRAD54B-2,TRC2-shRAD54B-3效果较好,用于后期实验,结果如图3所示。包括实验组细胞株TRC2-shRAD54B-2和TRC2-shRAD54B-3;和对照组细胞株TRC2-shcontrol。
3、抑制RAD54B表达对UACC-1598细胞内双微体的影响
(1)中期核型分析检测抑制RAD54B表达后的双微体数目的变化
取对数生长期对照组细胞TRC2-shcontrol和实验组细胞TRC2-shRAD54B-2,TRC2-shRAD54B-3三种细胞中加入终浓度为0.02μg/mL的秋水仙素,37℃继续培养1h,将细胞用吸管吹打下来,将悬液装入离心管中1000r/min离心5min,并用PBS冲洗两次,加入37℃预热的0.075mol/L的KCL,在37℃水浴中低渗作用13min,逐滴加入1mL新鲜固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)混匀,1500r/min离心7min,弃上清加入10mL固定液,轻轻混匀,室温固定30min,1500r/min离心7min,重复一次,弃上清,加入适当固定液混匀,将细胞悬液以一定高度滴于预冷的载玻片上,室温晾干。Giemsa染液染色7min,流水冲洗,晾干。置于显微镜下观察。
通过双微体计数,发现敲减RAD54B后,UACC-1598中双微体数目明显降低,结果如图4和图5所示。通过ANOVA统计,Dunnett’s Multiple Comparison Test方法分析得到,***P<0.001,有统计学意义。
(2)双微体携带基因水平检测
已知UACC-1598细胞中双微体上携带MCL1、MYCN和EIF5A2基因扩增,接下来,通过实时定量PCR技术检测RAD54B基因沉默后UACC-1598细胞中MCL1、MYCN和EIF5A2基因的扩增水平。
对TRC2-shcontrol,TRC2-shRAD54B-2,TRC2-shRAD54B-3按QIAamp DNA ExtractKit说明书操作提取细胞总DNA。检测已知的UACC-1598细胞中双微体上携带的基因MCL1、MYCN和EIF5A2的DNA扩增水平。检索NCBI Gene数据库,获得MCL1、MYCN和EIF5A2基因序列,应用DNAstar软件设计并合成基因特异性引物。所用引物由Invitrogen公司合成,序列如下表3所示:
表3用于扩增MCL1、MYCN和EIF5A2的引物序列
基因 | 引物序列 | SEQ ID NO. |
hMCL1-F | 5'-CTGGAGATTATCTCTCGGTAC-3' | 9 |
hMCL1-R | 5'-CTGACTCGTTTCGGTTTC-3' | 10 |
hMYCN-F | 5'-ACCACAAGGCCCTCAGTAC-3' | 11 |
hMYCN-R | 5'-GCAACGGCATTCTCTCAG-3' | 12 |
hEIF5A2-F | 5'-ATTGGGTTTCAGCATGTTG-3' | 13 |
hEIF5A2-R | 5'-AACATTCCACTAGCATCATTTC-3' | 14 |
hACTB-F | 5'-ACCGCGAGAAGATGACCCAG-3' | 15 |
hACTB-R | 5'-ACCGCGAGAAGATGACCCAG-3' | 16 |
在Roche LightCycler480型荧光定量PCR仪SYBR Green I/HRM Dye(465-510)系统下运行qPCR反应。每一样本测量3次,按照说明书提供的最佳反应条件,94℃4min;94℃30s,60℃30s,72℃30s,共45个循环;MCL1、MYCN和EIF5A2的DNA扩增水平以ACTB为内参进行比较,计算不同实验的数据平均值±标准差。计算不同实验的数据平均值±标准差。
图6是实时定量PCR柱状图,从该结果可以看出转染后的UACC-1598细胞双微体携带基因扩增减少。通过ANOVA统计,Dunnett’s Multiple Comparison Test方法分析得到,***P<0.001,有统计学意义。
4、抑制RAD54B表达对UACC-1598细胞生物学行为的影响
(1)检测抑制RAD54B表达后细胞增殖能力的变化
MTT法绘制细胞生长曲线:接种细胞,取对数生长期对照组细胞TRC2-shcontrol和实验组细胞TRC2-shRAD54B-2,TRC2-shRAD54B-3细胞浓度为1×104个/mL,接种于96孔板,每孔接种100μL,每种细胞每个观察时间点均设计为3个复孔。培养24h后,每孔加入100μL1640培养基和20μL MTS溶液混合物,37℃继续培养4h。选择492nm波长,酶联免疫检测仪测定各孔的吸光值,并记录结果。以时间为横轴,取5个相同生长天数及携带相同载体的光吸收值均值作为该类细胞的某天吸光值,并作为纵轴绘制细胞生长曲线。
图7是细胞生长曲线图,从该结果可以看出抑制RAD54B表达后UACC-1598细胞增殖能力降低。通过ANOVA统计,Dunnett’s Multiple Comparison Test方法分析得到,**P<0.01,***P<0.001,有统计学意义。
(2)检测抑制RAD54B表达后细胞克隆形成能力的变化
平板克隆实验:接种细胞,取对数生长期对照组细胞TRC2-shcontrol和实验组细胞TRC2-shRAD54B-2,TRC2-shRAD54B-3,细胞消化成单细胞悬液,细胞计数后每孔1500个细胞接种与6孔板中,每种细胞设置3个复孔,37℃孵箱培养两周左右。弃掉原培养基,PBS冲洗两遍,之后加入2ml甲醇室温固定15分钟。弃掉固定液,PBS洗两遍,之后用现配制的Giemsa染液(Giemsa染料原液:PBS=1:9)染色9分钟,缓慢冲洗掉染液,室温干燥,待6孔板完全干燥后用数码相机拍照,计数后进行统计。
图8是平板克隆实验图,图9是平板克隆数统计图,从该结果可以看出抑制RAD54B表达后UACC-1598细胞克隆形成能力降低。通过ANOVA统计,Dunnett’s MultipleComparison Test方法分析得到,***P<0.001,有统计学意义。
(3)检测抑制RAD54B表达后细胞侵袭能力的变化
侵袭实验:应用BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber取对数生长期的对照组细胞TRC2-shcontrol和实验组细胞TRC2-shRAD54B-2,TRC2-shRAD54B-3三种细胞进行基底膜侵袭实验。从-20℃取出侵袭小室放入24孔板中,室温放置。在24孔板和小室内各加入500μL预热的(37℃)无血清1640培养基,37℃孵箱中水化2h。水化后,小心地将液体移出,不要碰到matrigel基底膜。将取TRC2-shcontrol和TRC2-shRAD54B-2,TRC2-shRAD54B-3三种细胞用胰酶消化,全培养基终止消化,细胞计数,将细胞稀释到1×105个/mL。24孔板内加入750μL全培养基,之后,将小室放入24孔板中,注意小室膜下不要产生气泡。迅速加入500μL细胞悬液(5×104个细胞/孔),每组细胞设3个复孔。镜下观察,吹打均匀。37℃孵箱中,培养24h。取出24孔板,棉签蘸无血清培养基擦干净膜的内表面,去掉未发生侵袭的细胞。膜在无水甲醇中固定1min,蒸馏水洗2遍;苏木素染色5min,水洗干净(至无色);伊红染色20s,水洗干净。将膜完全晾干。刀切膜,中性树胶将膜粘到载玻片上,盖上盖玻片。光镜下观察,计数,拍照。
图10是细胞基底膜侵袭实验图,图11是细胞基底膜侵袭统计图,从该结果可以看出抑制RAD54B表达后UACC-1598细胞侵袭能力下降。通过ANOVA统计,Dunnett’s MultipleComparison Test方法分析得到,***P<0.001,有统计学意义。
序列表
<110> 哈尔滨医科大学
<120> RAD54B的反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭的药物中的应用
<160>20
<170>Patent-In 3.5
<210>1
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catgatctgg gtcatcttc 19
Claims (4)
1.RAD54B的反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭的药物中的应用,所述的肿瘤细胞为RAD54B高表达且含有双微体的人卵巢癌细胞系UACC-1598,所述的RAD54B的反义核苷酸序列的靶点序列为位于RAD54B上的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列,且所述的RAD54B的反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQ ID NO.5以及SEQID NO.6所示或SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的RAD54B的反义核苷酸序列通过降低双微体数目,从而达到抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭的目的。
3.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于,将所述的RAD54B的反义核苷酸序列克隆入沉默表达载体中,用于制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭的药物。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的沉默表达载体为TRC2表达载体。
Priority Applications (1)
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