CN106191066A - 一种抑制肿瘤生长和转移的miRNA序列及其应用 - Google Patents

一种抑制肿瘤生长和转移的miRNA序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制肿瘤生长的miRNA序列及其应用。本发明所提供的核酸序列为如下(A)或(B)：(A)双链RNA：所述双链RNA由正义链(序列1)和反义链(序列2)组成；(B)由一条单链RNA(序列1)和一条单链DNA(将序列2中的U替换为T后所示序列)互补配对形成的嵌合双链。本发明所提供的核酸序列在动物水平能在体内有效抑制肿瘤的生长；在细胞水平能够抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞侵袭、抑制肿瘤细胞迁移和促进肿瘤细胞凋亡。因此，本发明所提供的核酸序列作为一种新型小核酸类的抗肿瘤药物，既能抑制体内肿瘤的生长，降低肿瘤扩散风险，也有望用于预防肿瘤切除或放疗、化疗后的残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发。

Description

一种抑制肿瘤生长和转移的miRNA序列及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种抑制肿瘤生长和转移的miRNA序列及其应用。
背景技术
microRNA是一类由内源基因编码的长度约为19-25个核苷酸的非编码单链RNA分子。其在不同的物种间具有很高的同源性，可能调控着人类基因的1/3。microRNAs参与调控个体发育，细胞的增殖分化、周期等活动主要有三种方式：成熟的microRNA互补结合mRNA，RISC特异降解靶mRNA抑制mRNA的翻译；成熟microRNA在不影响mRNA稳定的前提下，与靶mRNA的3′UTR，抑制靶mRNA的表达；microRNA与剪切目标mRNA聚腺苷酸末端配对结合后，靶mRNA被3′核酸外切酶水解，在转录后水平对靶mRNA进行负性调控。通过靶向不同的基因，microRNA实现其肿瘤细胞的功能调控。研究表明，越来越多的原癌或抑癌基因在肿瘤细胞与正常组织间的表达存在显著差异，且与肿瘤的发生、发展存在关联性。运用microRNA的原癌或抑癌基因的功能，利用相关技术，或可实现肿瘤精准治疗的可能。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种核酸序列。
本发明所提供的核酸序列，为如下(A)或(B)：
(A)双链RNA：所述双链RNA由正义链和反义链组成，所述正义链具有序列表中序列1所示序列，所述反义链具有序列表中序列2所示序列；
(B)由一条单链RNA和一条单链DNA互补配对形成的嵌合双链：所述嵌合双链中的所述单链RNA具有序列表中序列1所示序列，所述单链DNA具有将序列表中序列2中的U替换为T后所示序列。
在本发明中，所述(A)中，所述正义链的序列具体为序列表中序列1，所述反义链具体为序列表中序列2。所述(B)中，所述单链RNA的序列具体为序列表中序列1，所述单链DNA的序列具体为将序列表中序列2中的U替换为T后所示序列。
根据需要所述核酸序列可经过如下修饰中的至少一种：
(1)对所述核酸序列的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰(如磷酸二酯键中的氧被硫取代)；
(2)对所述核酸序列的核苷酸序列中的核糖的2′-OH的修饰(如2′-OH经过甲氧基取代、氟取代或者脱氧修饰)；
(3)对所述核酸序列的核苷酸序列中的碱基的修饰(如LNA等修饰；胆固醇、甲氧基、硫代、氨基等修饰；3′或5′的特殊修饰，包括生物素、荧光基团及其它特殊标记)。
进一步，所述核酸序列为化学合成，可以进行2′氟代(2′-F)、2′甲氧基(2′-OMe)、硫代(PS)和2′脱氧(2′-deoxy)化学修饰。修饰的核酸序列分子可分别表示如下：所述核酸序列-2′-F、所述核酸序列-PS、所述核酸序列-2′-OMe和所述核酸序列-2′-deoxy。或是核苷酸序列的5'p、5'巯基、5'NH2、5'Chol、5-Me-dC修饰、5'TET、5'Biotin3'NH2、3'Chol、3'BHQ-1、3'Dabcyl，或是C6S-S修饰等修饰。所述核酸序列分子有作用的重要肿瘤调控基因例如转录因子Jun等，但不仅限于该靶基因。
进一步，含有所述DNA分子的重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种应用。
本发明所提供的应用，具体为：所述核酸序列或所述DNA分子或所述重组载体或重组菌在如下任一中的应用：
(a1)制备用于抑制肿瘤生长的药物，和/或抑制肿瘤生长；
(a2)制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物，和/或抑制肿瘤细胞增殖；
(a3)制备用于抑制肿瘤细胞侵袭的药物，和/或抑制肿瘤细胞侵袭；
(a4)制备用于抑制肿瘤细胞迁移的药物，和/或抑制肿瘤细胞迁移；
(a5)制备用于促进肿瘤细胞凋亡的药物，和/或促进肿瘤细胞凋亡；
(a6)制备用于预防肿瘤复发的药物，和/或预防肿瘤复发。
其中，所述预防肿瘤复发具体为预防肿瘤摘除术或放化疗后残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发。
本发明的第三个目的是提供一种药物。
本发明所提供的药物具有如下(a1)-(a6)功能中至少一种，其活性成分为所述核酸序列或所述DNA分子或所述表达盒、重组载体或重组菌；
(a1)抑制肿瘤生长；
(a2)抑制肿瘤细胞增殖；
(a3)抑制肿瘤细胞侵袭；
(a4)抑制肿瘤细胞迁移；
(a5)促进肿瘤细胞凋亡；
(a6)预防肿瘤复发。
根据需要，所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体应当与本发明药物中的双链RNA分子相容。
进一步，所述药学上可接受的载体可为体内转染试剂，如脂质体，聚乙烯亚胺(PEI)、阳离子纳米聚合物等。或是传统的药物载体，糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、植物油等渗缓冲液等。或者是新型药物载体制剂：大分子物质，如免疫球蛋白、白蛋白、纤维原、葡萄糖等；经过或未经过改造的细胞，如白细胞、红细胞等；合成得到的生物可降解性大分子脂质体，如静脉乳、磁性球剂、玉脂聚糖球等；合成的非生物降解性大分子，如半渗透微囊、聚丙烯凝胶等。本发明的药物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者种类、发病情况、给药方式等因素中和考虑对病人进行有益的剂量施用。具体剂型可包括口服液、注射剂、舌下含服剂等多种液体剂型，或通过加以适当的赋形剂制备成粉剂、片剂、胶囊剂等多种其他剂型。较佳的制剂为保持核酸序列的效能、毒副作用低、给药途径适宜。
在本发明的实施例中，所述药学上可接受的载体具体为脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen)。相应的，所述药物中，所述核酸序列和所述Lipofectamine2000的配比具体为(5-50)pmol：1μL，如(20-32)pmol：1μL，具体如20pmol：1μL，或者30pmol：1μL，或者50pmol：1μL。更加具体的，所述药物中，所述核酸序列溶液的浓度为20μmol/L，所述核酸序列溶液和所述Lipofectamine2000的体积配比具体为(1-1.6)：1，如1：1，或者1.5：1，或者1.6：1。
所述药物中还可以包括葡萄糖、生理盐水或者缓冲液等。
在本发明中，所述肿瘤具体为肝癌；所述肿瘤细胞具体为肝癌细胞。更加具体的，所述肝癌细胞为HepG2细胞或SK-HEP-1细胞。
实验证明，本发明所提供的核酸序列通过抑制肝癌肿瘤细胞内核转录因子Jun的表达，实现抑制肿瘤生长的作用。在动物水平，将肿瘤细胞接种裸鼠，随后用所述核酸序列治疗的实验证明所述核酸序列能在体内有效抑制肿瘤的生长。另外，在细胞水平，还证实了本发明所提供的核酸序列具有抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞侵袭、抑制肿瘤细胞迁移和促进肿瘤细胞凋亡的作用。因此，本发明所提供的核酸序列作为一种新型小核酸类的抗肿瘤药物，既能抑制体内肿瘤的生长，降低肿瘤扩散风险，也有望用于预防肿瘤切除或放疗、化疗后的残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发。
附图说明
图1为CCK-8方法检测实施例1制备的2′-OH核酸序列抑制肿瘤细胞增殖的折线图；
图2为实施例1制备的2′-OH核酸序列抑制肿瘤细胞侵袭的柱形图；
图3为实施例1制备的2′-OH核酸序列抑制肿瘤细胞迁移的柱形图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的定量实验，均设置至少3个重复，结果取均值。
5周龄的雄性裸鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司(BALB/cNude401)。
Hep G2细胞：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(TCHu 72)。
SK-HEP-1细胞：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(TCHu 109)。
实施例1、核酸序列的制备
本发明中所述核酸序列为双链RNA；所述双链RNA由正义链和反义链组成，所述正义链的序列为序列表中序列1所示序列(5′-UGGGGGAGGAAGGACAGGCCAU-3′)，所述反义链的序列为序列表中序列2所示序列(5′-AUGGCCUGUCCUUCCUCCCCCA-3′)。选用一条随机序列作为阴性对照(NC)，NC的正义链的序列为：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(序列3)，反义链的序列为：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(序列4)。所述核酸序列和所述阴性对照序列中的A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
所述核酸序列及所述阴性对照由上海生工(Sangon)生物工程股份有限公司合成。将本发明合成的由序列1和序列2组成的核酸序列命名为2′-OH-核酸序列。当然，也可以将所述双链RNA替换为由一条单链RNA和一条单链DNA互补配对形成的嵌合双链；所述嵌合双链中的所述单链RNA的序列为序列表中序列1所示序列(5′-
UGGGGGAGGAAGGACAGGCCAU-3′)，所述单链DNA的序列为将序列表中序列2中的U替换为T后所示序列(5′-AUGGCCUGUCCUUCCUCCCCCA-3′)；
实施例2、2′-OH-核酸序列对肿瘤细胞增殖的影响
将实施例1制备的2′-OH核酸序列和阴性对照粉末分别溶解于DEPC水中，配成终浓度为20μmol/L的溶液。取对数期的肝癌细胞(HepG2细胞和SK-HEP-1细胞)，分别调整细胞悬液浓度至5×105细胞/mL，按每孔100μL接种于96孔板；置于37℃，含5％CO2的孵箱中使细胞贴壁，培养过夜。转染时，分别将0.3μL的2′-OH核酸序列溶液(浓度为20μmol/L)和0.3μL的lipofectamine2000(Invitrogen)稀释于25μL无血清培养液(Opti-MEM)中混匀，室温孵育5分钟，然后将上述核酸序列溶液与lipofectamine2000溶液混匀，于室温静置20分钟，将约50μL的核酸序列-脂质体复合物加到细胞培养板中(细胞生长融合率为65％)，分别培养0、24、48、72和96小时；小心吸去上清，加入90μL新鲜培养基，再加入10μL CCK-8，继续培养2.5小时，在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光值；同时设置调零孔(培养基，CCK-8)，每组设置5个复孔。OD450的值越大，说明活细胞数越多，即细胞增殖能力越强；反之，OD450的值越小，说明活细胞数越少，即细胞增殖能力越弱。
结果如图1所示，图1表明转染实施例1制备的2′-OH核酸序列的肿瘤细胞的增殖受到明显抑制，与阴性对照组(NC)相比较，增殖速率明显降低。
实施例3、2′-OH-核酸序列抑制肿瘤细胞侵袭能力
将实施例1制备的2′-OH核酸序列按实施例2的分组及实验体系进行转染实验，转染完成后，于37℃，含5％CO2的孵箱中培养过夜，更换为含5％(体积分数)FBS的培养基饥饿培养24h。实验前，用含0.5％(体积分数)FBS的DMEM培养液按1：6稀释50mg/L Matrigel(BD公司Matrigel TM货号354234)，取60μL包被transwell小室底部膜的上室面，放37℃5％CO2培养箱孵育4小时，吸弃上清。转染后的肝癌细胞PC-3及DU145以胰酶消化，血球计数板计数，按5×103细胞/孔的浓度接种于transwell小室，下室加入血清浓度为20％的培养基700μL，37℃5％CO2培养48h。取出小室，PBS洗一次。加入预冷的甲醇-20℃固定10min。弃净甲醇后PBS清洗三遍。用棉签轻轻刮去小室上表面的Matrigel胶，用PBS洗上表面3次。拿出小室倒置，风干。将小室放入新的24-well中，加入200μL 0.1％结晶紫(配制方法：称取0.1g结晶紫加100mL冰乙酸溶解完全，摇匀即得)，使膜浸没，37℃染色30min。用ddH2O洗3次。小室风干后，放入孔中，倒置显微镜下取若干视野，拍照计数，统计穿过膜的细胞数。穿过膜的肿瘤细胞数越多，说明肿瘤细胞的侵袭能力越强；反之，穿过膜的肿瘤细胞数越少，说明肿瘤细胞的侵袭能力越弱。
结果如图2所示，图2表明，与阴性对照组(NC)相比，转染了实施例1制备的2′-OH核酸序列的肿瘤细胞的侵袭能力受到明显抑制。
实施例4、2′-OH-核酸序列抑制肿瘤细胞迁移能力。
将实施例1制备的2′-OH核酸序列和阴性对照粉末分别溶解于DEPC水中，配成终浓度为20μmol/L的溶液。取对数期肝癌细胞(HepG2细胞和SK-HEP-1细胞)，分别调整细胞悬液浓度至1.5×106细胞/mL。按1.5×106细胞/孔的浓度接种6孔板，混匀后于37℃5％CO2培养过夜。转染时，分别将8μL的2′-OH核酸序列溶液(浓度为20μmol/L)和5μL的lipofectamine2000(Invitrogen)稀释于250μL无血清培养液(Opti-MEM)中混匀，室温孵育5分钟，然后将上述核酸序列溶液与lipofectamine2000溶液混匀，于室温静置20分钟，将约500μL的核酸序列-脂质体复合物加到细胞培养板中(细胞生长融合率为85％)。转染后将6孔板于37℃5％CO2培养过夜，用20μL枪头比着直尺，在6孔板中均匀画直线横穿过孔，每孔三条。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入3％(体积分数)FBS培养基。放入37℃5％CO2培养箱继续培养，分别于0h、8、24、48h拍照。利用Image-ProPlus量出各照片划痕的面积及长度，按划痕宽度值＝划痕面积面积/划痕长度值，算出各划痕宽度；进而计算第48小时划痕愈合率，第48小时划痕愈合率＝(0h划痕宽度-48h划痕宽度)/0h划痕宽度。划痕愈合率越大，说明肿瘤细胞的迁移能力越强；反之，划痕愈合率越小，说明肿瘤细胞的迁移能力越弱。
结果如图3所示，图3表明，与阴性对照组(NC)相比，转染了实施例1制备的2′-OH核酸序列的肿瘤细胞的迁移能力受到明显抑制。

Claims (10)

1.一种核酸序列，为如下(A)或(B)：
(A)双链RNA：所述双链RNA由正义链和反义链组成，所述正义链具有序列表中序列1所示序列，所述反义链具有序列表中序列2所示序列；
(B)由一条单链RNA和一条单链DNA互补配对形成的嵌合双链：所述嵌合双链中的所述单链RNA具有序列表中序列1所示序列，所述单链DNA具有将序列表中序列2中的U替换为T后所示序列。
2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于：所述(A)中，所述正义链的序列为序列表中序列1，所述反义链为序列表中序列2；
所述(B)中，所述单链RNA的序列为序列表中序列1，所述单链DNA的序列为将序列表中序列2中的U替换为T后所形成的序列。
3.根据权利要求1或2所述的核酸序列，其特征在于：所述核酸序列经过如下修饰中的至少一种：
(1)对所述核酸序列的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2)对所述核酸序列的核苷酸序列中的核糖的2′-OH的修饰；
(3)对所述核酸序列的核苷酸序列中的碱基的修饰。
4.编码权利要求1或2所述核酸序列的DNA分子。
5.含有权利要求4所述DNA分子的重组载体或重组菌。
6.权利要求1-3中任一所述的核酸序列或权利要求4所述的DNA分子或权利要求5所述的重组载体或重组菌在如下任一中的应用：
(a1)制备用于抑制肿瘤生长的药物，和/或抑制肿瘤生长；
(a2)制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物，和/或抑制肿瘤细胞增殖；
(a3)制备用于抑制肿瘤细胞侵袭的药物，和/或抑制肿瘤细胞侵袭；
(a4)制备用于抑制肿瘤细胞迁移的药物，和/或抑制肿瘤细胞迁移；
(a5)制备用于促进肿瘤细胞凋亡的药物，和/或促进肿瘤细胞凋亡；
(a6)制备用于预防肿瘤复发的药物，和/或预防肿瘤复发。
7.具有如下(a1)-(a6)功能中至少一种的药物，其活性成分为权利要求1-3中任一所述的核酸序列或权利要求4所述的DNA分子或权利要求5所述的重组载体或重组菌；
(a1)抑制肿瘤生长；
(a2)抑制肿瘤细胞增殖；
(a3)抑制肿瘤细胞侵袭；
(a4)抑制肿瘤细胞迁移；
(a5)促进肿瘤细胞凋亡；
(a6)预防肿瘤复发。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药学上可接受的载体为Lipofectamine2000；所述药物中，所述核酸序列和所述Lipofectamine2000的配比为(5-50)pmol：1μL。
10.根据权利要求6所述的应用或权利要求7-9中任一所述的药物，其特征在于：所述肿瘤为肝癌；所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
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