CN107709561A - 修饰的siRNA及含有该修饰的siRNA的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于抑制RecQL1解旋酶基因表达的修饰的siRNA、含有该修饰的siRNA的RecQL1基因表达抑制剂和细胞死亡诱导剂，以及含有该修饰的siRNA的用于治疗癌症的药物组合物。具体而言，本发明提供一种如下所示的修饰的siRNA、含有该修饰的siRNA的RecQL1基因表达抑制剂和细胞死亡诱导剂，以及含有该修饰的siRNA的用于治疗癌症的药物组合物：所述修饰的siRNA为包括含有SEQ ID NO:1所示碱基序列的有义链和含有SEQ ID NO:2所示碱基序列的反义链，且以RecQL1解旋酶基因为靶标的双链修饰的siRNA，其中，该有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第2、3、4、13位上含有2’‑取代核苷酸，该有义链还在选自于由SEQ ID NO:1所示碱基序列的第12、14、17、18、19位组成的组中一个以上的位置上含有2’‑取代核苷酸，该2’‑取代核苷酸的第2’位为‑R1、‑OR1、‑R2OR1、‑OR2OR1或‑R3OR2OR1，其中，R1为C1‑4烃基，R2和R3独立地为C1‑3亚烃基。

Description

修饰的siRNA及含有该修饰的siRNA的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种用于抑制RecQL1解旋酶基因表达的修饰的siRNA、含有该修饰的siRNA的RecQL1基因表达抑制剂和细胞死亡诱导剂，以及含有该修饰的siRNA的用于治疗癌症的药物组合物。
背景技术
DNA解旋酶是将双链DNA解开成单链的酶，在DNA复制、修复、转录、翻译、重组等与遗传信息相关的各种过程中起着重要作用。DNA解旋酶有很多种类，与大肠杆菌的RecQ解旋酶显示同源性的DNA解旋酶称为RecQ型解旋酶。
人类基因组中有5种RecQ型解旋酶(RecQL1、WRN、RTS、BLM和RecQ5)。其中，WRN、RTS和BLM基因中的变异分别是沃纳综合征、Rothmund-Thomson综合征和布卢姆综合征的基因组不稳定性疾病的原因。另一方面，尚没有RecQL1和RecQ5与疾病相关的报告。
RecQL1解旋酶(也称作RecQ1或RecQL)被认为能将多见于DNA复制时的DNA高级结构即Holiday结构解开，促进DNA复制。另外，也认为RecQL1会与参与错配修复的MSH2/6蛋白形成复合物，在基因组复制时进行错配修复。此外，还已知RecQL1虽然在癌细胞和增殖活跃的细胞中高表达，但在处于休眠期的细胞中其表达水平低。关于概述参照非专利文献1。
本发明人报告了siRNA引起RecQL1解旋酶表达量降低，使得在各种癌细胞中诱导有丝分裂死亡(mitotic catastrophe)和分裂期细胞死亡(mitotic cell death)(专利文献1～3和非专利文献2～4)。这会导致RecQL1解旋酶减少以致不能对伴随着DNA复制而产生的DNA损伤进行修复，使得在细胞保持损伤的状况下进入分裂周期。本发明人还报告了在荷瘤动物模型中针对RecQL1的siRNA表现出抗肿瘤活性(专利文献1和非专利文献3、4)。
利用siRNA的基因表达抑制法是被广泛应用的研究方法。由于siRNA可以设计为以特定的序列为靶标，因此其效果特异性高，可期待应用于药物。但是，由于RNA容易被核酸酶分解，因此在作为药物对生物体给药时，会存在被分解、难以发挥期望的功能的问题。因此，正在尝试通过利用甲基化和氟化等对构成siRNA的多聚核苷酸链进行人工化学修饰，来增强siRNA的稳定性。但是，已知修饰一般会导致siRNA的RNAi活性降低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO 2004/100990号
专利文献2：国际公开WO 2006/054625号
专利文献3：日本特开2012-219085号公报
非专利文献
非专利文献1：二见和伸等(2010年)《药物医疗器械管理科学》(PMDRS)，41(1):19-26
非专利文献2：二见和伸等(2008年)《癌症科学》(Cancer Sci.)，99(1):71-80
非专利文献3：二见和伸等(2008年)《癌症科学》(2008年)，99(6):1227-1236
非专利文献4：二见和伸等(2010年)《国际分子医学杂志》(Int.J.Mol.Med.)，25:537-545
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供一种用于抑制RecQL1解旋酶基因表达的修饰的siRNA、含有该修饰的siRNA的RecQL1基因表达抑制剂和细胞死亡诱导剂，以及含有该修饰的siRNA的用于治疗癌症的药物组合物。
解决课题的技术手段
本发明人为解决上述课题而进行了潜心研究，结果意外地发现，如果向以RecQL1解旋酶基因为靶标的siRNA中构成该siRNA的有义链或者有义链与反义链两者的特定位置的核苷酸导入2'-甲氧基化(2'-O-甲基化)等2'-取代，则RNAi活性会增强。考虑到修饰的siRNA的RNAi活性一般低于未修饰的siRNA，则本发明人的这个发现非常令人意想不到。基于上述发现，本发明人完成了本发明。
即，本发明包含如下内容。
[1]一种修饰的siRNA，所述修饰的siRNA为包括含有SEQ ID NO:1所示碱基序列的有义链和含有SEQ ID NO:2所示碱基序列的反义链，且以RecQL1解旋酶基因为靶标的双链修饰的siRNA，
其中，所述有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第2、3、4和13位上含有2’-取代核苷酸，
所述有义链还在选自于由SEQ ID NO:1所示碱基序列的第12、14、17、18和19位组成的组中一个以上的位置上含有2’-取代核苷酸，
所述2’-取代核苷酸的第2’位为-R1、-OR1、-R2OR1、-OR2OR1或-R3OR2OR1，其中，R1为C1-4烃基(アルキル基)，R2和R3独立地为C1-3亚烃基(アルキレン基)。
[2]根据[1]所述的修饰的siRNA，其与具有相同碱基序列的未修饰的siRNA相比，具有更高的细胞死亡诱导活性。
[3]根据[1]或[2]所述的修饰的siRNA，其中，所述有义链还在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第11位上含有2’-取代核苷酸。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的下列位置上含有所述2’-取代核苷酸：
(a)第2、3、4、11、12、13、14、17、18和19位；
(b)第2、3、4、11、12、13和14位；
(c)第2、3、4、12、13、14、17、18和19位；
(d)第2、3、4、13、17、18和19位；
(e)第2、3、4、11、12、13、14和17位；
(f)第2、3、4、11、12、13、14和18位；
(g)第2、3、4、11、12、13、14和19位；
(h)第2、3、4、11、12、13、14、17和18位；
(i)第2、3、4、11、12、13、14、17和19位；
(j)第2、3、4、11、12、13、14、18和19位；
(k)第2、3、4、12、13、17、18和19位；或
(l)第2、3、4、13、14、17、18和19位。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述反义链未经修饰。
[6]根据[1]～[4]中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述反义链在选自于由SEQID NO:2所示碱基序列的第5、13、15和19位组成的组中一个以上的位置上含有所述2’-取代核苷酸。
[7]根据[6]所述的修饰的siRNA，其中，所述反义链在SEQ ID NO:2所示碱基序列的下列位置上含有所述2’-取代核苷酸：
(i)第13、15和19位；
(ii)第5、13、15和19位；或
(iii)第5、13和15位。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述2’-取代核苷酸为2’-甲氧基核苷酸或2’-氨基甲氧基核苷酸。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的修饰的siRNA，其具有由TT或UU组成的3’端突出。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述有义链和所述反义链为19～25个碱基长度。
[11]根据[9]或[10]所述的修饰的siRNA，其中，所述有义链的碱基序列由SEQ IDNO:3所示的碱基序列组成，所述反义链的碱基序列由SEQ ID NO:4所示的碱基序列组成。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述有义链在5’末端与胆固醇结合。
[13]一种RecQL1基因表达抑制剂，其含有[1]～[12]中任一项所述的修饰的siRNA。
[14]一种细胞死亡诱导剂，其含有[1]～[12]中任一项所述的修饰的siRNA。
[15]一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有[1]～[12]中任一项所述的修饰的siRNA。
[16]根据[15]所述的药物组合物，其中，所述癌症为卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、大肠癌、肺癌或宫颈癌。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2015-151974号的公开内容。
发明效果
通过本发明，提供一种用于抑制RecQL1解旋酶基因表达的修饰的siRNA、含有该修饰的siRNA的RecQL1基因表达抑制剂和细胞死亡诱导剂，以及含有该修饰的siRNA的用于治疗癌症的药物组合物。
附图说明
图1是表示用于实验的siRNA的序列及其2'-甲氧基核苷酸的位置图；(a)表示未修饰的RecQL1-siRNA，(b)～(j)表示修饰的RecQL1-siRNA(分别为(b)QL-9、(c)QL-15、(d)QL-16、(e)QL-17、(f)QL-18、(g)QL-19、(h)QL-20、(i)QL-21和(j)QL-24)；各siRNA上侧的链为有义链，下侧的链为反义链；2'-甲氧基核苷酸的位置用黑色圆圈、下划线、小写字母和粗体字表示；(a)中用编号表示C和U的位置；
图2是表示修饰的RecQL1-siRNA(QL-15、QL-16和QL-17)对ES-2(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞的细胞死亡诱导活性的图表；
图3是表示修饰的RecQL1-siRNA(QL-18)的细胞死亡诱导活性的图表；(A)表示对TOV-112D(卵巢癌子宫内膜样腺癌)细胞的活性，(B)表示对ES-2(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞的活性；
图4是表示修饰的RecQL1-siRNA(QL-19)的细胞死亡诱导活性的图表；(A)表示对TOV-112D(卵巢癌子宫内膜样腺癌)细胞的活性，(B)表示对ES-2(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞的活性；
图5是表示修饰的RecQL1-siRNA(QL-20)的细胞死亡诱导活性的图表；(A)表示对TOV-112D(卵巢癌子宫内膜样腺癌)细胞的活性，(B)表示对ES-2(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞的活性；
图6是表示修饰的RecQL1-siRNA(QL-21)的细胞死亡诱导活性的图表；(A)表示对TOV-112D(卵巢癌子宫内膜样腺癌)细胞的活性，(B)表示对ES-2(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞的活性；
图7是表示修饰的RecQL1-siRNA(QL-15和QL-19)对TOV-21G(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞的细胞死亡诱导活性的图表；
图8是表示修饰的RecQL1-siRNA(QL-15和QL-19)对HCT-15(大肠癌)细胞的细胞死亡诱导活性的图表；
图9是表示修饰的RecQL1-siRNA(QL-15和QL-19)对A549(肺癌)细胞的细胞死亡诱导活性的图表；
图10是表示修饰的RecQL1-siRNA(QL-15)对HeLa(宫颈癌)细胞的RecQL1基因表达抑制活性的图表；
图11是表示修饰的RecQL1-siRNA(QL-19)与胆固醇结合而成的siRNA(QL-19-Chol)对(A)A549(肺癌)细胞、(B)HeLa(宫颈癌)细胞或(C)ES-2(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞的RecQL1基因表达抑制活性的图表；
图12是表示从移植后第3天起开始给予修饰的RecQL1-siRNA(QL-19)的肿瘤细胞增殖抑制活性的图表；(A)表示腹膜重量(g)，(B)表示腹膜重量相对于体重的比例(％)；
图13是表示从移植后第7天起开始给予修饰的RecQL1-siRNA(QL-19)的肿瘤细胞增殖抑制活性的图表；(A)表示腹膜重量(g)，(B)表示腹膜重量相对于体重的比例(％)；
图14是表示比较例所使用的siRNA的序列及其2'-甲氧基核苷酸的位置图；(a)表示未修饰的RecQL1-siRNA，(b)～(d)表示修饰的RecQL1-siRNA(分别为(b)QL-2S、(c)QL-3S和(d)QL-5)；各siRNA上侧的链为有义链，下侧的链为反义链；2'-甲氧基核苷酸的位置用黑色圆圈、下划线、小写字母和粗体字表示；(a)中用编号表示C和U的位置。
具体实施方式
下面详细地说明本发明。
<修饰的siRNA>
本发明涉及以RecQL1解旋酶基因为靶标的双链修饰的siRNA。
本说明书中，“siRNA”(short-interfering RNA，短干扰RNA)是指能够通过RNAi来诱导靶基因的表达抑制、具有大约19～25个碱基对的双链RNA。siRNA由后述的有义链和反义链这两条多聚核苷酸链构成。siRNA也可以含有单链部分(突出)。
本说明书中，“RNAi”(RNA interference，RNA干扰)是指在导入具有与靶基因序列互补的序列的双链RNA(例如siRNA)的细胞内，靶基因的表达被特异性地抑制的现象。利用siRNA的RNAi的典型机制如下。首先，导入到细胞内的siRNA一条链进入到被称为RISC(RNA-induced Silencing Complex，RNA诱导的沉默复合物)的复合物中，识别具有互补性高的序列的靶基因的mRNA。通过RISC在siRNA的中心部分切割靶基因的mRNA。然后，切割的mRNA被分解。通过这种机制，siRNA能够通过RNAi来诱导靶基因的表达抑制。
本发明的siRNA以包含人RecQL1基因编码区(SEQ ID NO:19)的第273～291位的19个碱基长度的碱基序列5'-GTTCAGACCACTTCAGCTT-3’(SEQ ID NO:20)的序列为靶标。人RecQL1mRNA的碱基序列可在Genbank Accession:NM_002907.3GI:209977006下获得。
本发明的siRNA含有：
含有SEQ ID NO:1所示碱基序列的有义链；以及
含有SEQ ID NO:2所示碱基序列的反义链。
本说明书中，“碱基”是指可与其他核酸的碱基配对的杂环部分。SEQ ID NO:2所示的碱基序列是与人RecQL1基因编码区的第273～291位的上述碱基序列(SEQ ID NO:20)互补的序列。SEQ ID NO:1所示的碱基序列是与SEQ ID NO:2所示的碱基序列互补的序列。
本说明书中，“反义链”是指具有与靶基因的mRNA互补的序列的多聚核苷酸链。本说明书中，“有义链”是指具有与反义链互补的序列(即具有与靶基因的mRNA相同的序列)的多聚核苷酸链。反义链与有义链退火而生成siRNA。反义链能与靶基因的mRNA结合并诱导RNAi。本发明中，构成siRNA的反义链能与RecQL1mRNA编码区的第273～291位结合并诱导RNAi。因此，本发明的siRNA能够诱导RecQL1基因的表达抑制。
本发明的siRNA是经修饰的siRNA。优选地，本发明的siRNA在有义链或者有义链与反义链两条链的特定位置上含有2’-取代核苷酸，更具体为含有2’-取代嘧啶核苷酸(即2’-取代尿苷酸(U)或2’-取代胞苷酸(C))。尤其是，构成本发明siRNA的有义链，在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第2、3、4和13位上含有2’-取代核苷酸(2’-取代嘧啶核苷酸)。本说明书中所示的核苷酸的位置是自多聚核苷酸链的5’侧起计数的位置。有义链的嘌呤核苷酸(即第1、5～7、10、15和16位的腺苷酸(A)和鸟苷酸(G))也可以是未修饰(天然型)的嘌呤核苷酸。
构成本发明siRNA的有义链，在SEQ ID NO:1所示碱基序列中除了第2、3、4和13位以外，还在其他位置上含有2’-取代核苷酸。具体地，有义链还在选自于由SEQ ID NO:1所示碱基序列的第12、14、17、18和19位组成的组中一个以上、两个以上、三个以上、四个以上或全部五个位置上含有2’-取代核苷酸(2’-取代嘧啶核苷酸)。有义链也可以在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第11位上含有2’-取代核苷酸。有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第8和9位上含有未修饰(天然型)的嘧啶核苷酸。
在具体实施方式中，构成本发明siRNA的有义链可以在SEQ ID NO:1所示碱基序列的下列位置上含有2’-取代核苷酸(2’-取代嘧啶核苷酸)：
(a)第2、3、4、11、12、13、14、17、18和19位；
(b)第2、3、4、11、12、13和14位；
(c)第2、3、4、12、13、14、17、18和19位；或
(d)第2、3、4、13、17、18和19位。
这种情况下，有义链可以在SEQ ID NO:1所示碱基序列中除了上述(a)～(d)中任一项所示的位置以外的位置上具有未修饰(天然型)的核苷酸。
有义链还可以在SEQ ID NO:1所示碱基序列的下列位置上含有2’-取代核苷酸(2’-取代嘧啶核苷酸)：
(e)第2、3、4、11、12、13、14和17位；
(f)第2、3、4、11、12、13、14和18位；
(g)第2、3、4、11、12、13、14和19位；
(h)第2、3、4、11、12、13、14、17和18位；
(i)第2、3、4、11、12、13、14、17和19位；
(j)第2、3、4、11、12、13、14、18和19位；
(k)第2、3、4、12、13、17、18和19位；或
(l)第2、3、4、13、14、17、18和19位。
这种情况下，有义链可以在SEQ ID NO:1所示碱基序列中除了上述(e)～(l)中任一项所示的位置以外的位置上具有未修饰(天然型)的核苷酸。
另一方面，构成本发明siRNA的反义链可以经修饰，也可以未经修饰。
在反义链经修饰的实施方式中，反义链可以在选自于由SEQ ID NO:2所示碱基序列的第4、5、10、13、14、15和19位组成的组中一个以上、两个以上、三个以上或四个以上的位置上含有2’-取代核苷酸(2’-取代嘧啶核苷酸)。反义链的嘌呤核苷酸(即第1～3、6～9、11、12和16～18位的腺苷酸(A)和鸟苷酸(G))也可以是未修饰(天然型)的嘌呤核苷酸。
在优选实施方式中，反义链也可以在选自于由SEQ ID NO:2所示碱基序列的第5、13、15和19位组成的组中一个以上、两个以上或三个以上的位置上含有2’-取代核苷酸(2’-取代嘧啶核苷酸)。这种情况下，反义链可以在SEQ ID NO:2所示碱基序列中除了上述位置(第5、13、15和19位)以外的位置上具有未修饰(天然型)的核苷酸。
在具体实施方式中，反义链可以在SEQ ID NO:2所示碱基序列的下列位置上含有2’-取代核苷酸(2’-取代嘧啶核苷酸)：
(i)第13、15和19位；
(ii)第5、13、15和19位；或
(iii)第5、13和15位。
这种情况下，反义链可以在SEQ ID NO:2所示碱基序列中除了上述(i)～(iii)中任一项所示的位置以外的位置上具有未修饰(天然型)的核苷酸。
在优选实施方式中，有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第2、3、4、11、12、13、14、17、18和19位上含有2’-取代核苷酸，并且反义链也可以未经修饰。在另一优选实施方式中，有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第2、3、4、11、12、13和14位上含有2’-取代核苷酸，并且反义链也可以未经修饰。在又一优选实施方式中，有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第2、3、4、12、13、14、17、18和19位上含有2’-取代核苷酸，并且反义链也可以在SEQID NO:2所示碱基序列的第5、13、15和19位上含有2’-取代核苷酸。在又一优选实施方式中，有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第2、3、4、12、13、14、17、18和19位上含有2’-取代核苷酸，并且反义链也可以在SEQ ID NO:2所示碱基序列的第13、15和19位上含有2’-取代核苷酸。在又一优选实施方式中，有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第2、3、4、12、13、14、17、18和19位上含有2’-取代核苷酸，并且反义链也可以在SEQ ID NO:2所示碱基序列的第5、13和15位上含有2’-取代核苷酸。在又一优选实施方式中，有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第2、3、4、13、17、18和19位上含有2’-取代核苷酸，并且反义链也可以在SEQ IDNO:2所示碱基序列的第13、15和19位上含有2’-取代核苷酸。在这些实施方式中，有义链可以在SEQ ID NO:1所示碱基序列中除了上述位置以外的位置上具有未修饰(天然型)的核苷酸。反义链可以在SEQ ID NO:2所示碱基序列中除了上述位置以外的位置上具有未修饰(天然型)的核苷酸。
本说明书中，“2’-取代核苷酸”是指构成核苷酸的糖(核糖)的第2’位的氢氧基被其他基团取代的核苷酸。本发明的siRNA由于含有这种2’-取代核苷酸，因此不是未修饰的siRNA，而是修饰的siRNA。本说明书中，“2’-取代核苷酸”的第2’位为-R1、-OR1、-R2OR1、-OR2OR1或-R3OR2OR1，其中，R1为C1-4烃基，R2和R3独立地为C1-3亚烃基。本说明书中，“烃基(アルキル基)”是指可被取代的直链或支链、饱和或不饱和的碳原子数为1～4个的一价烃基。作为“烃基”的示例，例如列举有：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。本说明书中，“亚烃基(アルキレン基)”是指可被取代的直链或支链、饱和或不饱和的碳原子数为1～3个的二价烃基。作为“亚烃基”的示例，例如列举有：亚甲基、亚乙基、三亚甲基等。作为烃基或亚烃基可具有的取代基，列举有：卤原子(例如氟、氯、溴、碘)、氨基、硝基和羟基等。R1也可以为C1-3烃基，C1-2烃基或C1烃基。R2和R3也可以为C1-2亚烃基或C1亚烃基。具体地，作为2’-取代核苷酸的第2’位的取代基，例如列举但不限于：-OCH3(甲氧基)、-OCH2CH3(乙氧基)、-OCH2NH2(氨基甲氧基)、-OCH2CH2NH2(氨基乙氧基)、-OCH2CH2F(氟化甲基甲氧基)、-OCH2CH2CH2F(氟化甲基乙氧基)、-CH3(甲基)、-CH2CH3(乙基)、-CH2CH2CH3(丙基)、-CH2OCH3(甲氧基甲基，MOM)、-CH2CH2OCH3(甲氧基乙基，MOE)、-OCH2OCH3、-OCH2CH2OCH3、-CH2OCH2OCH3、-CH2OCH2CH2OCH3(甲氧基乙氧基甲基，MEM)。2’-取代核苷酸优选为2’-甲氧基核苷酸(2'-O-甲基核苷酸)或2’-氨基甲氧基核苷酸(2'-O-氨基甲基核苷酸)。含有2'-甲氧基核苷酸的siRNA与未修饰的siRNA相比，在生物体内对自然免疫系统的刺激低(参照Judge,AD.等(2006年)《分子治疗》(Mol.Ther.)，13(3):494-505；Robbins,M.等(2007年)《分子治疗》，15(9):1663-1669；Sioud,M.,(2006年)《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)，36:1222-1230)。构成本发明的修饰的siRNA的有义链和/或反义链可以含有多个上述2’-取代核苷酸，而这些第2’位的取代基可以彼此相同也可以彼此不同，但优选相同。
一般已知，siRNA在末端具有数个(例如2～5个)核苷酸的单链部分(突出)时RNAi活性高。因此，本发明的siRNA优选在末端具有数个修饰或未修饰的脱氧核苷酸或核糖核苷酸的突出。在一实施方式中，本发明的siRNA也可以具有2个核苷酸的3’端突出。优选地，本发明的siRNA也可以具有由两个胸苷酸(TT)或两个尿苷酸(UU)组成的3’端突出。
构成本发明siRNA的有义链和反义链可以分别为19～25个碱基长度，长度可彼此相同也可彼此不同。即，有义链可以由SEQ ID No:1所示的碱基序列(19个碱基长度)构成，除了该序列以外，还可以在5’或3’末端，优选在3’末端，具有1～6个、例如1～4个或1～2个脱氧核苷酸或核糖核苷酸(例如与RecQL1 mRNA同源的核糖核苷酸或UU或者TT)。另外，反义链可以由SEQ ID No:2所示的碱基序列(19个碱基长度)构成，除了该序列以外，还可以在5’或3’末端，优选在3’末端，具有1～6个、例如1～4个或1～2个脱氧核苷酸或核糖核苷酸(例如与RecQL1 mRNA互补的核糖核苷酸或UU或者TT)。有义链和反义链优选为21～23个碱基长度，更优选为21个碱基长度。
有义链的碱基序列最优选由SEQ ID No:1所示的碱基序列(19个碱基长度)和3’末端的TT(2个碱基长度)(即SEQ ID No:3所示的碱基序列(21个碱基长度))组成。另外，反义链的碱基序列最优选由SEQ ID No:2所示的碱基序列(19个碱基长度)和3’末端的TT(2个碱基长度)(即SEQ ID No:4所示的碱基序列(21个碱基长度))组成。在这些情况下，2’-取代核苷酸的位置可以作为自SEQ ID No:3或SEQ ID No:4的5’侧起计数的位置来表示。例如，SEQID No:1所示碱基序列的第2、3、4和13位可分别表示为SEQ ID No:3所示碱基序列的第2、3、4和13位。
本发明的siRNA不一定全部的核苷酸均为核糖核苷酸(RNA)。即在本发明中，构成siRNA的1～数个、例如1～4个核糖核苷酸也可以为相应的脱氧核苷酸。优选地，siRNA的突出为脱氧核苷酸，除此以外的所有核苷酸可以为核糖核苷酸。
本发明的siRNA在5’和/或3'末端也可以和胆固醇、α-生育酚、生物素、DIG、荧光素、青色素3(Cy3)、青色素5(Cy5)等配体分子或荧光分子结合。可以在反义链和/或有义链中进行这种结合。在优选实施方式中，有义链可以在5’末端与配体分子或荧光分子结合，更优选地，有义链可以在5’末端与胆固醇结合。
本发明人曾经报告过利用siRNA的RNAi机制来抑制RecQL1基因的表达，由此在癌细胞中诱导有丝分裂死亡和分裂期细胞死亡(国际公开WO 2004/100990号、国际公开WO2006/054625号，日本特开2012-219085号公报、二见和伸等(2008年)《癌症科学》(2008年)，99(1):71-80、二见和伸等(2008年)《癌症科学》(2008年)，99(6):1227-1236、二见和伸等(2010年)《国际分子医学杂志》，25:537-545)。本发明的修饰的siRNA以RecQL1基因为靶标，利用RNAi机制来抑制RecQL1基因表达，由此能够在癌细胞中诱导细胞死亡。本发明的修饰的siRNA与具有相同碱基序列的未修饰的siRNA相比，能够具有更高的细胞死亡诱导活性。本说明书中，“未修饰的siRNA”是指由在糖、碱基和磷酸中没有任何修饰的脱氧核苷酸和/或核糖核苷酸组成的siRNA(天然型siRNA)。siRNA的“细胞死亡诱导活性”可由本领域技术人员通过公知的任何方法容易地判定，例如，如后述实施例中所述，可将siRNA导入到任意癌细胞(例如TOV-112D(卵巢癌子宫内膜样腺癌)细胞、ES-2或TOV-21G(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞、HCT-15(大肠癌)细胞、A549(肺癌)细胞或HeLa(宫颈癌)细胞)中，确定一定时间后(例如约72小时后～120小时后)的存活细胞数(存活率)，由此进行判定。例如可通过WST检测或显微镜下的细胞的计数等来确定存活细胞数。
构成本发明的修饰的siRNA的有义链和反义链可通过本技术领域公知的常用方法制造，例如，可通过手动或自动的反应，利用酶或化学合成来制造。当化学合成RNA或DNA分子时，也可利用厂商(例如Gene Design、Dharmacon、QIAGEN、西格玛奥德里奇等)的受托制造服务。这种情况下，可以指定2’-取代核苷酸的种类、位置和根据需要而结合的配体分子或荧光分子的种类和位置(5’和/或3’末端)。合成的反义链和有义链例如可通过使用溶剂或树脂的提取、沉降、电泳或色谱法等从混合物中纯化。本发明的修饰的siRNA可将如上得到的有义链和反义链混合并退火而制造。也可从厂商那里获取退火的双链siRNA。
本发明的siRNA可在体外(in vitro)(离体(ex vivo))或体内(in vivo)导入到细胞或组织，或者在体内导入到个体中，用于通过RNAi来诱导靶基因RecQL1的表达抑制。另外，当将本发明的siRNA导入到癌细胞时，通过靶基因RecQL1的表达抑制，可以诱导细胞死亡。可由本领域技术人员通过本领域公知的方法适当进行siRNA的导入。siRNA例如也可通过物理方法例如直接注入含有该siRNA的溶液、使用由该siRNA覆盖的颗粒的轰击或该siRNA的存在下的电穿孔法等导入。或者，siRNA也可通过脂质介导载体运送、化学介导运送(例如磷酸钙法)等用于将核酸导入到细胞的本技术领域公知的其他方法来导入，另外，也可使用脂质体或高分子胶束等公知的给药系统(DDS)技术来导入。
体外的给药量可由本领域技术人员适当确定，例如，可以以本发明的修饰的siRNA在培养基的浓度为0.01～100000nM、0.1～10000nM或1～1000nM的方式给药。关于体内的给药量，在后述的“药物组合物”项中有记载。
要导入本发明siRNA的细胞、组织或个体可来源于灵长类(例如猕猴、食蟹猴、黑猩猩等)，优选来源于人。
<剂>
本发明还提供一种含有本发明的修饰的siRNA的RecQL1基因表达抑制剂。本说明书中，“基因表达抑制”是指通过siRNA抑制靶基因的mRNA表达和/或蛋白质表达。在以基因的mRNA或蛋白质的表达量为指标判定基因的表达时，“基因表达抑制”不仅指相对于未导入siRNA的情况为100％地抑制，还指75％以上、50％以上、20％以上或10％以上抑制。基因表达抑制的程度可以将靶基因的mRNA或蛋白质的表达量作为指标来判定。mRNA的表达量可通过Northern杂交或定量RT-PCR等确定，蛋白质的表达量可通过蛋白质印迹法、ELISA、蛋白质活性测定或来源于荧光蛋白的荧光强度等确定。另外，在本说明书中，siRNA的“RNAi活性”可根据RecQL1基因表达量(mRNA表达量或蛋白质表达量)来判定，还可通过对癌细胞的细胞死亡诱导活性来判定。上述RecQL1基因表达抑制剂含有本发明的修饰的siRNA作为有效成分，并且也可以含有制药上可以允许的载体或添加剂等其他成分。RecQL1基因表达抑制剂可用作研究用试剂(RNAi试剂)，也可作为药物用于疾病的治疗。
本发明还提供一种含有本发明的修饰的siRNA的细胞死亡诱导剂。本发明的细胞死亡诱导剂能够在癌细胞中特异性地诱导细胞死亡，而不会在正常细胞中诱导细胞死亡。上述细胞死亡诱导剂含有本发明的修饰的siRNA作为有效成分，并且也可以含有制药上可以允许的载体或添加剂等其他成分。细胞死亡诱导剂可用作研究用试剂，也可作为药物用于疾病的治疗。
<药物组合物>
本发明还提供一种含有本发明的修饰的siRNA作为有效成分的用于治疗癌症的药物组合物。
作为治疗对象的癌症，列举但不限于：肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌、宫颈癌、前列腺癌、脑瘤、骨肿瘤、胆管癌、头颈癌。另外，卵巢癌一般分为子宫内膜样腺癌、浆液性腺癌、透明细胞性腺癌和粘液性腺癌。
本说明书中，“治疗”是指在受试对象中使癌细胞或组织减少或消失，或者抑制癌扩散或发展。
受试对象可以是灵长类(例如猕猴、食蟹猴、黑猩猩等)，但优选人。
本发明的药物组合物可根据需要另外含有制药上可以允许的载体。制药上可以允许的载体包括稀释剂或赋形剂，例如列举有：麦芽糖、甘露醇、乳糖、木糖、海藻糖、山梨糖醇、明胶、阿拉伯树胶、瓜尔胶、黄蓍胶、乙醇、生理盐水、林格氏液等。
本发明的药物组合物除了上述载体外，还可根据需要含有稳定剂、缓冲剂、乳化剂、张度剂、防腐剂等添加剂。这些添加剂优选在制药时使用。
作为稳定剂，例如列举有：白蛋白、明胶、甘露醇、EDTA钠等。作为缓冲剂，例如列举有：柠檬酸钠、柠檬酸、磷酸钠等。作为乳化剂，例如列举有：山梨聚糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯等。作为张度剂，例如列举有：氯化钠、氯化钾、糖类等。作为防腐剂，例如列举有：苯扎氯铵、对羟苯甲酸、三氯叔丁醇等。
本发明的药物组合物在不丧失有效成分即本发明的修饰的siRNA所具有的RNAi活性的范围内，也可以含有其他药剂。例如，在注射剂的情况下，也可含有规定量的抗生素。
作为药物组合物的剂型，例如列举但不限于：注射剂、点眼剂、霜剂、点鼻剂、软膏剂、粘膜剂、硬膏剂和栓剂等非经口剂型或液剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、舌下剂、锭剂等经口剂型。
本发明的药物组合物可以按照在治疗上的有效剂量向生物体给药，以治疗目标疾病(癌)。本说明书中，“在治疗上的有效剂量”是指本发明的药物组合物所含有的siRNA在治疗作为对象的癌症或减轻症状上所需要的用量，且对于给药的生物体几乎没有或完全没有有害副作用的用量。具体的给药量按照各个受试对象，例如由医生根据病情的发展程度或重症程度、全身的健康状态、年龄、体重、性别和对治疗的耐受性等进行判断来确定。例如，本发明的药物组合物也可以按照修饰的siRNA为0.0001mg/体重kg/天～10000mg/体重kg/天或0.001mg/体重kg/天～1000mg/体重kg/天或0.01mg/体重kg/天～100mg/体重kg/天的量来给药。
本发明的药物组合物的给药可以采用全身给药或局部给药(例如对患部直接给药)中的任一种。给药途径可以为非经口或经口中的任一种，例如列举有：腹腔内、静脉内、动脉内、肝脏内、阴道内、肌肉内、骨髓内、髓腔内、经皮、皮下、皮内、鼻腔内、肠内、支气管内、肺内或舌下等。
另外，本发明的药物组合物例如可以根据医生确定的治疗计划，以一定的时间间隔，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、6个月或1年等间隔，分1～数次或数十次向患者给药。
<方法>
本发明还提供一种使用含有本发明的修饰的siRNA的上述制剂或组合物来抑制RecQL1基因表达的方法、诱导细胞死亡的方法或治疗癌症的方法。这些方法可以是体外法、离体法或体内法。
实施例
下面利用实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明的技术范围并不限于这些实施例。
[实施例1]
<修饰的RecQL1-siRNA在体外的RNAi活性>
本发明人使用各种细胞株，在体外对在各种位置上含有2’-取代核苷酸的修饰的RecQL1-siRNA的RNAi活性进行研究。
<材料和方法>
<细胞的制备>
实验中使用以下人类细胞株的细胞：TOV-112D(卵巢癌子宫内膜样腺癌)、ES-2与TOV-21G(卵巢癌透明细胞性腺癌)、HCT-15(大肠癌)、A549(肺癌)和HeLa(宫颈癌)细胞。细胞株从ATCC(American Type Culture Collection，美国典型培养物保藏中心)获得。这些细胞株的细胞在siRNA转染的前一天以每个孔2.0×104个的量接种在24孔板中，或者以每个孔2.0×103个的量接种在96孔板中，使用以下培养液进行培养：对于TOV-112D、TOV-21G和HeLa，使用DMEM(nacalai tesque)+10％FBS(fetalbovine serum，胎牛血清，西格玛奥德里奇)+1％青霉素/链霉素(GIBCO)；对于ES-2，使用McCoy5A(GibcoBRL)+10％FBS+1％青霉素/链霉素；对于HCT-15，使用RPMI(nacalai tesque)+10％FBS+青霉素/链霉素；对于A549，使用EMEM(和光纯药)+10％FBS+NEAA(non-essential amino acids，非必需氨基酸，和光纯药)+青霉素/链霉素。
<siRNA转染>
在Gene Design公司进行siRNA合成。使用的siRNA的碱基序列和修饰位置示于图1。使用的siRNA以人RecQL1基因编码区(SEQ ID NO:19)的第273～291位为靶标。各修饰的RecQL1-siRNA(图1b～1j)具有与未修饰的RecQL1-siRNA(图1a)相同的碱基序列，在图1所示的位置上含有2’-甲氧基核苷酸(2'-O-甲基核苷酸)。另外，使用作为修饰的siRNA的QL-19(图1g)有义链的5’末端结合有胆固醇的修饰的siRNA(QL-19-Chol)。作为不表现RNAi活性的阴性对照，使用GL3-siRNA或mGL3-siRNA。GL3-siRNA是具有以下碱基序列的未修饰的多聚核苷酸链：5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'(SEQ ID NO:17)和5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'(SEQ ID NO:18)。mGL3-siRNA具有与GL3-siRNA相同的碱基序列，但含有数个2’-甲氧基核苷酸，其序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示。
使用LipofectamineTM RNAiMAX试剂(Invitrogen)，基本上按照制造商的操作说明步骤，将目标浓度(对于图2所示的实验，为1、2.5、5、10、25或50nM；对于图3～7所示的实验，为1、2.5、5、10或25nM；对于图8、9所示的实验，为1、2.5、5或25nM；对于图10所示的实验，为1.3nM)的各siRNA导入到细胞中。对于图11A、11B所示的实验，将siRNA直接添加到培养液中浓度达到500nM，由此导入到细胞中。对于图11C所示的实验，将siRNA直接添加到培养液中浓度达到250nM，由此导入到细胞中。根据需要，自siRNA转染起约48小时后，为使细胞不汇合而进行适当稀释并重新接种细胞。
<细胞死亡诱导活性>
自siRNA转染起96小时后(图2、8、9)或120小时后(图3～7)，使用活细胞数测定试剂SF(nacalai tesque)，通过WST检测来测定活细胞数。按照制造商的操作说明步骤进行检测。计算出测定的活细胞数相对于未转染细胞测定的活细胞数的比例(存活率(％))。以存活率作为指标评价细胞死亡诱导活性。
<基因表达抑制活性>
自siRNA转染起30小时后(图10)或24小时后(图11)，回收细胞，使用NucleoZOL(MACHERY-NAGEL)提取总RNA。通过定量RT-PCR确定提取的RNA中的RecQL1 mRNA量(RecQL1基因表达量)。使用Rotor-Gene Q 2plex System(QIAGEN)进行定量RT-PCR。RecQL1和β肌动蛋白基因的RT-PCR用引物以及TaqMan探针从Applied Biosystems(美国应用生物系统公司)购买。使用QuantiFast Probe RT-PCR Kit(QIAGEN)，按照其使用手册进行RT-PCR反应。将RecQL1基因表达量相对于β肌动蛋白基因表达量进行标准化。在结果如图10所示的实验中，以未转染细胞中的表达量作为基准(100％)，在结果如图11所示的实验中，以用修饰的RecQL1-siRNAQL-19转染的细胞中的表达量作为基准(100％)，计算出相对表达(％)。以相对表达作为指标，评价基因表达抑制活性。
<结果>
研究有义链的C和U的一部分被2’-甲氧基化的修饰的siRNA(QL-15、QL-16和QL-17，图1c～1e)的RNAi活性。QL-15有义链的C和U，其第8和9位未修饰，在第2、3、4、11、12、13、14、17、18和19位被2’-甲氧基化。QL-16有义链的C和U，其第17、18和19位未修饰，在第2、3、4、8、9、11、12、13和14位被2’-甲氧基化。QL-17有义链的C和U，其第8、9、17、18和19位未修饰，在第2、3、4、11、12、13和14位被2’-甲氧基化。本发明人曾经报告过通过利用siRNA的RNAi机制来抑制RecQL1基因的表达，由此在癌细胞中诱导有丝分裂死亡和分裂期细胞死亡(国际公开WO 2004/100990号、国际公开WO 2006/054625号，日本特开2012-219085号公报、二见和伸等(2008年)《癌症科学》(2008年)，99(1):71-80、二见和伸等(2008年)《癌症科学》(2008年)，99(6):1227-1236、二见和伸等(2010年)《国际分子医学杂志》，25:537-545)。因此，通过细胞死亡诱导活性评价上述修饰的siRNA的RNAi活性。
令人惊讶的是，结果QL-15、QL-16和QL-17在ES-2(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞中表现出的RNAi活性均高于未修饰的siRNA(图2)。尤其是QL-15和QL-17表现出高RNAi活性。QL-15表现出最高的RNAi活性。另外，该结果显示，有义链在第8和9位未修饰的情况下(QL-15和QL-17)活性更高。
接着，研究在有义链和反义链两条链中含有2’-甲氧基核苷酸的修饰的siRNA(QL-18、QL-19、QL-20和QL-21，图1f～1i)的RNAi活性。QL-18～QL-20的有义链在第2、3、4、12、13、14、17、18和19位上含有2’-甲氧基核苷酸。QL-21的有义链在第2、3、4、13、17、18和19位上含有2’-甲氧基核苷酸。另一方面，对于反义链，QL-18的反义链在第5、13、15和19位上含有2’-甲氧基核苷酸。QL-19和QL-21的反义链在第13、15和19位上含有2’-甲氧基核苷酸。QL-20的反义链在第5、13和15位上含有2’-甲氧基核苷酸。
结果可以看到以下趋势：QL-18～QL-21在卵巢癌细胞的TOV-112D(卵巢癌子宫内膜样腺癌)和ES-2(卵巢癌透明细胞性腺癌)中具有的RNAi活性均高于未修饰的siRNA(图3～6)。尤其是QL-19和QL-21在这两种细胞中的RNAi活性高，QL-19的RNAi活性最高(图4、6)。
对于在以上实验中表现出很高的RNAi活性的QL-15和QL-19，在TOV-21G(卵巢癌透明细胞性腺癌)、HCT-15(大肠癌)和A549(肺癌)中进一步研究活性。结果显示，QL-15和QL-19在这些细胞中具有的RNAi活性均高于未修饰的siRNA(图7～9)。
接着，使用HeLa(宫颈癌)细胞，研究在有义链的各种位置上具有2’-甲氧基核苷酸、反义链未修饰的修饰的siRNA(QL-9、QL-15和QL-24，图1b、1c、1j)的基因表达抑制活性。QL-9有义链的C和U全部(在第2、3、4、8、9、11、12、13、14、17、18和19位)被2’-甲氧基化。如上所述，QL-15有义链的C和U，在第2、3、4、11、12、13、14、17、18和19位被2’-甲氧基化。QL-24有义链的C和U，在第2、3、4和13位被2’-甲氧基化。结果示于图10。结果显示，QL-9和QL-24的基因表达抑制活性均低于未修饰的siRNA，而QL-15具有的基因表达抑制活性与未修饰的siRNA相比大幅增加。一般已知核苷酸的2’-甲氧基化会提高核酸酶耐受性。而另一方面，已知核苷酸的2’-甲氧基化一般会使siRNA的RNAi活性降低。从这些一般思维角度出发，特定位置的核苷酸被2’-甲氧基化的本发明一实施方式的siRNA所具有的RNAi活性高于未修饰的siRNA是完全预料不到的。这提示非2’-甲氧基化引起的核酸酶耐受性提高的未知机制有可能会使本发明一实施方式的siRNA的RNAi活性增强。
接着，使用A549(肺癌)细胞、HeLa(宫颈癌)细胞或ES-2(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞，对比上述2’-甲氧基化修饰的siRNA(QL-19)和在有义链的5’末端结合有胆固醇的QL-19(QL-19-Chol)的基因表达抑制活性。图11A～11C分别表示使用A549(肺癌)细胞、HeLa(宫颈癌)细胞或ES-2(卵巢癌透明细胞性腺癌)细胞的结果。结果显示，QL-19-Chol在任何细胞中的基因表达抑制活性均高于QL-19，通过在siRNA有义链的5’末端结合胆固醇，可以不使用其他给药系统(DDS)就能将siRNA有效地导入到细胞内，从而能够利用siRNA保持一定的基因表达抑制活性(图11)。
综上所述，发现修饰的RecQL1-siRNA具有的RNAi活性高于未修饰的RecQL1-siRNA，且只在有义链(QL-15、QL-16和QL-17)或者在有义链和反义链两条链(QL-18、QL-19、QL-20和QL-21)中含有2’-取代核苷酸(2'-甲氧基核苷酸)。另外，这些修饰的RecQL1-siRNA有义链的共同点是，在第2、3、4和13位的嘧啶核苷酸(C或U)被2’-甲氧基化，进一步在其他位置的嘧啶核苷酸被2’-甲氧基化。此外还显示出，通过使在含有2’-取代核苷酸的修饰的RecQL1-siRNA有义链的5’末端结合胆固醇，siRNA无需使用其他DDS就能表现出RNAi活性。
需要说明的是，将两条RNA链(反义链和有义链)的所有U和C用2’-甲氧基化物取代，表现出RNAi的效果有下降的趋势。
[实施例2]
<荷瘤动物模型中修饰的RecQL1-siRNA对肿瘤细胞增殖的抑制>
本发明人使用荷瘤动物模型，研究在实施例1中在体外表现出具有高RNAi活性的修饰的RecQL1-siRNA(QL-19)是否在体内也具有效果。
<材料和方法>
<荷瘤小鼠的制作>
将TOV-112D细胞(人类卵巢癌子宫内膜样腺癌、3级、IIIc期，从ATCC获得)，在含有10％FBS(西格玛奥德里奇)和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基(nacalai tesque)中，在37℃的培养箱中以不超过80％的汇合度进行继代培养。用PBS洗涤细胞，用0.05％胰蛋白酶-EDTA(nacalai tesque)剥离并回收细胞。将回收的细胞以300×g、3分钟、4℃离心。在冷PBS中悬浮沉淀的细胞，密度为2×107个/ml，得到TOV-112D细胞悬浮液。
从日本Charles River公司购买4周龄的雌性Balb/c裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj)。驯化1周后，向5周龄的小鼠腹腔内给予上述TOV-112D细胞悬浮液500μl，移植细胞，制作荷瘤小鼠。
<siRNA的给药>
作为siRNA，使用GL3-siRNA和mGL3-siRNA实施例1所述)、未修饰的RecQL1-siRNA(图1a)以及修饰的RecQL1-siRNA(QL-19，图1g)。将各siRNA与LIC-101(日本新药株式会社)按1:16(w/w)的比混合，得到siRNA的脂质体溶液(1mg/ml)。使用10％麦芽糖溶液(大冢制药)稀释该脂质体溶液。在TOV-112D(卵巢癌子宫内膜样腺癌)细胞移植后第3天或第7天，开始以每2天10次的频率向荷瘤小鼠的腹腔内给予siRNA(3.75mg/kg的用量)或仅给予赋形剂(10％麦芽糖)(每组10只小鼠)。
<肿瘤重量的测定>
在TOV-112D(卵巢癌子宫内膜样腺癌)细胞移植后第23天或第24天，解剖小鼠。摘除包括从小鼠的食道到直肠消化道的腹膜。然后，切除消化道，测定腹膜重量。进一步计算出腹膜重量相对于小鼠体重的比例(％)。
<结果>
无论是在对小鼠移植癌细胞后第3天(图12)开始给予siRNA，还是在第7天(图13)开始给予siRNA，未修饰的RecQL1-siRNA或修饰的RecQL1-siRNA均能明显抑制腹膜重量随着肿瘤结节形成和肿瘤生长而增加。
以上结果显示，修饰的RecQL1-siRNA(QL-19)在体内明显具有抑制肿瘤细胞增殖的效果。
[比较例]
QL-2S、QL-3S和QL-5的有义链和反义链，其特定位置的核苷酸被2’-甲氧基化，而这些有义链的第2、3和13位未被修饰(图14)。QL-2S、QL-3S和QL-5表现出的RNAi活性均低于具有相同序列的未修饰的siRNA。
工业实用性
本发明的修饰的RecQL1-siRNA预测为没有对除了RecQL1基因以外的基因的脱靶效应，而且不会对正常细胞诱导细胞死亡，能够特异性地对癌细胞诱导细胞死亡。因此，本发明的修饰的RecQL1-siRNA可期待用作副作用少实用的药物。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2：合成寡核苷酸
SEQ ID NO:3～18和SEQ ID NO:21～24：DNA/RNA复合分子(結合DNA/RNA分子)：合成寡核苷酸
本说明书所引用的全部刊物、专利以及专利申请通过直接引用而编入本说明书。
序列表
<110> 佳康尔研究所股份有限公司
<120> 修饰的siRNA及含有该修饰的siRNA的药物组合物
<130> PH-6623-PCT
<150> JP 2015-151974
<151> 2015-07-31
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
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aacgtaacaa tggctggaaa ggaggtattt cttgttatgc ctacaggagg tggaaagagc 360
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Claims (16)

1.一种修饰的siRNA，所述修饰的siRNA为包括含有SEQ ID NO:1所示碱基序列的有义链和含有SEQ ID NO:2所示碱基序列的反义链，且以RecQL1解旋酶基因为靶标的双链修饰的siRNA，
其中，所述有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第2、3、4和13位上含有2’-取代核苷酸，
所述有义链还在选自于由SEQ ID NO:1所示碱基序列的第12、14、17、18和19位组成的组中一个以上的位置上含有2’-取代核苷酸，
所述2’-取代核苷酸的第2’位为-R1、-OR1、-R2OR1、-OR2OR1或-R3OR2OR1，其中，R1为C1-4烃基，R2和R3独立地为C1-3亚烃基。
2.根据权利要求1所述的修饰的siRNA，其与具有相同碱基序列的未修饰的siRNA相比，具有更高的细胞死亡诱导活性。
3.根据权利要求1或2所述的修饰的siRNA，其中，所述有义链还在SEQ ID NO:1所示碱基序列的第11位上含有2’-取代核苷酸。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述有义链在SEQ ID NO:1所示碱基序列的下列位置上含有所述2’-取代核苷酸：
(a)第2、3、4、11、12、13、14、17、18和19位；
(b)第2、3、4、11、12、13和14位；
(c)第2、3、4、12、13、14、17、18和19位；
(d)第2、3、4、13、17、18和19位；
(e)第2、3、4、11、12、13、14和17位；
(f)第2、3、4、11、12、13、14和18位；
(g)第2、3、4、11、12、13、14和19位；
(h)第2、3、4、11、12、13、14、17和18位；
(i)第2、3、4、11、12、13、14、17和19位；
(j)第2、3、4、11、12、13、14、18和19位；
(k)第2、3、4、12、13、17、18和19位；或
(l)第2、3、4、13、14、17、18和19位。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述反义链未经修饰。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述反义链在选自于由SEQID NO:2所示碱基序列的第5、13、15和19位组成的组中一个以上的位置上含有所述2’-取代核苷酸。
7.根据权利要求6所述的修饰的siRNA，其中，所述反义链在SEQ ID NO:2所示碱基序列的下列位置上含有所述2’-取代核苷酸：
(i)第13、15和19位；
(ii)第5、13、15和19位；或
(iii)第5、13和15位。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述2’-取代核苷酸为2’-甲氧基核苷酸或2’-氨基甲氧基核苷酸。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的修饰的siRNA，其具有由TT或UU组成的3’端突出。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述有义链和所述反义链为19～25个碱基长度。
11.根据权利要求9或10所述的修饰的siRNA，其中，所述有义链的碱基序列由SEQ IDNO:3所示的碱基序列组成，所述反义链的碱基序列由SEQ ID NO:4所示的碱基序列组成。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的修饰的siRNA，其中，所述有义链在5’末端与胆固醇结合。
13.一种RecQL1基因表达抑制剂，其含有权利要求1～12中任一项所述的修饰的siRNA。
14.一种细胞死亡诱导剂，其含有权利要求1～12中任一项所述的修饰的siRNA。
15.一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有权利要求1～12中任一项所述的修饰的siRNA。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中，所述癌症为卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、大肠癌、肺癌或宫颈癌。
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