WO2006038608A1 - オリゴ二本鎖ｒｎａ及び医薬組成物 - Google Patents

オリゴ二本鎖ｒｎａ及び医薬組成物 Download PDF

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WO2006038608A1
WO2006038608A1 PCT/JP2005/018331 JP2005018331W WO2006038608A1 WO 2006038608 A1 WO2006038608 A1 WO 2006038608A1 JP 2005018331 W JP2005018331 W JP 2005018331W WO 2006038608 A1 WO2006038608 A1 WO 2006038608A1
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rna
oligo
stranded rna
seq
base sequence
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PCT/JP2005/018331
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Kazuko Hirabayashi
Haruna Naito
Original Assignee
Nippon Shinyaku Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • Oligoni-stranded RNA and pharmaceutical composition Oligoni-stranded RNA and pharmaceutical composition
  • the present invention relates to an oligo-stranded RNA and a pharmaceutical composition containing the oligo-stranded RNA.
  • HCV Hepatitis C virus
  • genotype la lb, 2a, 2b, 3a, 3b according to its genotype.
  • the total number of HCV infections, including all genotypes, is estimated to be about 170 million worldwide, and about 1.5 to 2 million in Japan.
  • About 80% of HCV infections become chronic and progress to cirrhosis and hepatocellular carcinoma in about 20-30 years after chronic hepatitis.
  • genotype lb is infected with HCV, and about 80% of all HCV-infected patients have large amounts of the virus in the serum.
  • death toll from hepatocellular carcinoma is 34,000 per year, of which about 75% are derived from HCV.
  • RNA interference [RNAi] introduces double-stranded RNA (hereinafter referred to as “dsRNA”) into cells, and the RNA complementary to the introduced dsRNA is specific. This is a phenomenon in which synthesis of the gene product encoded by the RNA is suppressed.
  • dsRNA double-stranded RNA having proteini inhibitory activity by RNAi
  • siRNA short interfering RNA
  • a method for introducing siRNA into a cell a method using a carrier such as a cationic ribosome or other cationic carrier as a vector, a calcium phosphate method, an electrovolution method, a microinjection method, or the like directly.
  • the method of introduction is used.
  • a method for introducing an expression vector into which a siRNA-encoding base sequence is incorporated into a cell so that the siRNA is expressed in the cell has been studied (see, for example, Non-Patent Documents 4 to 5).
  • Patent Document 1 Pamphlet of International Publication No. 03Z070750
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No.02Z081494
  • Non-Patent Document 1 Hiroshi Yasuhashi, Akito Tsubota, Namiki Izumi, Naoya Kato, “PROGRESS IN MEDICINE”, 2003, 4 ⁇ , p. 1109— 1131
  • Non-Patent Document 2 Takashi Morita and Yoshiyo Yoshida, “Protein Nucleic Acid Enzyme”, 2002, 47 ⁇ , p. 1939-1945
  • Non-Patent Document 3 Martinez et al., “Cell”, September 6, 2002, 110 ⁇ , No. 5, p. 563-57 4
  • Non-Patent Document 4 M. Miyagishi et al., “Nature Biotechnology”, May 2002, 20 ⁇ , 5, p. 497-500
  • Non-Patent Document 5 T. R. Brummelkamp et al., “Science”, April 19, 2002, 296 ⁇ , p. 550-553
  • Non-Patent Document 6 G. Randall et al., Proceedings of the National Academy of Sciences ", 2003, 100 ⁇ , No. 1, p. 235-240
  • Patent Document 7 J. A. Wilson et al., “Proceedings of the National Academy of Sciences”, 2003, 100 ⁇ , p. 2783-2788
  • the present invention mainly relates to an oligo-stranded RNA capable of suppressing HCV replication and a pharmaceutical comprising the oligo-stranded RNA for treating and Z or preventing a disease caused by infection with HCV.
  • the purpose is to provide a composition.
  • d TJ t deoxythymidine monophosphate having 2 bases from the 3 ′ end of each base sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 (hereinafter referred to as “ d TJ t)) or a pair of RNAs consisting of a base sequence excluding 2 bases dT from the 3 ′ end of each base sequence of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5.
  • the inventors have found that an oligo-stranded RNA characterized by having a formed double-stranded forming part can solve the above-mentioned object, and completed the present invention.
  • Examples of the present invention include the following (1) to (6).
  • RNA pair consisting of a base sequence excluding 2 base dT or 3' end of each base sequence of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5
  • An oligo-stranded RNA (hereinafter referred to as “the inventive oligo-stranded RNA”) characterized by having a double-stranded forming portion formed by a pair of RNAs having a base sequence ability except dT of 2 bases. ).
  • RNA of the present invention t ⁇ ⁇
  • composition of the present invention A pharmaceutical composition comprising the oligo-stranded RNA of (1) above and a carrier (hereinafter referred to as “the composition of the present invention”).
  • RNA of the present invention a pair of RNAs having a base sequence ability obtained by removing dT of 2 bases from the 3 ′ end of each base sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 or each of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5
  • An oligo-stranded RNA having a double-stranded forming part formed from a pair of RNAs having a base sequence ability by removing dT of 2 bases from the 3 ′ end of the base sequence can be mentioned.
  • Both RNAs consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 excluding the 3 'end force of 2 bases dT have the nucleotide sequence registered as GenBank accession number AB080299 (SEQ ID NO: This is an RNA (sense strand RNA) with a base sequence homology to a part of the internal ribosome entry site (IRES) in the HCV RNA consisting of 6).
  • Both RNAs consisting of the base sequences excluding the 3 ′ end force of 2 bases dT of each base sequence of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 are respectively from the 3 ′ end of each base sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • RNA antisense strand RNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence excluding 2 bases of dT.
  • RNA consisting of a base sequence obtained by removing 2 base dTs from the 3 'end of the base sequence of SEQ ID NO: 3 is obtained by removing 2 bases dT from the 3' end of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • RNA consisting of a base sequence in which the C base located at the end is replaced with the A base.
  • the "duplex forming part” is a part in which a pair of nucleic acids constituting the oligo-stranded RNA of the present invention forms a duplex, and contains a base sequence homologous to HCV RNA. Say. When there is a single strand that does not form a pair on the 3 ′ side and the Z or 5 ′ side following the double strand forming part of each RNA, this is called a protrusion.
  • HCV replication-inhibiting activity means that, when the oligo-stranded RNA of the present invention is transfected into cells, the HCV replication is compared to the case where the oligo-stranded RNA of the present invention is not present.
  • the activity to suppress specifically refers to the inhibition rate (%) when the amount of HCV RNA in the cells supplemented with the present oligonucleotides is equal to the amount of HCV RNA in the negative control. ) Is evaluated as 0%, the suppression rate (%) force is 0% or more, preferably 75% or more, more preferably 90% or more.
  • the oligo-stranded RNA of the present invention has 1 to a plurality of (for example, 4 or less) nucleobases in the base sequence of the RNA of the double-stranded forming part as long as it retains the HCV replication inhibitory activity. Is deleted, placed It may be replaced, inserted or added.
  • the oligo-stranded RNA of the present invention has a partial force of ribonucleotides constituting one or both RNAs of the duplex forming part as long as it retains HCV replication inhibitory activity. It may be substituted with a ribonucleotide.
  • the modified deoxyribonucleotide is, for example, at least partly modified such as deoxyribose or phosphate backbone constituting the deoxyribonucleotide in order to enhance in vivo stability such as nuclease resistance. Means what is being. Examples of such modifications include modification of the 2-position of deoxyribose, modification of other parts of deoxyribose, and modification of the phosphate backbone.
  • Examples of modifications at the 2 ′ position of deoxyribose include hydrogen at the 2 position of deoxyribose, OR, R, R, OR, SH, SR, NH, NHR, NR, N, CN, F, Cl, Br, I Can be mentioned. here
  • R represents alkyl or aryl.
  • the alkyl of R is preferably a linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms. Specifically, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, n-hexyl, and iso Hexyl is mentioned.
  • substituents that may be substituted with alkyl include halogen, alkyl, alkoxy, and nitro-containing nitro, and 1 to 3 of these may be substituted.
  • Examples of strong halogens include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • Examples of the alkyl include those similar to the above alkyl.
  • Alkoxy includes linear or branched alkoxy having 1 to 6 carbon atoms such as methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, n- Examples include pentyloxy, isopentyloxy, n-hexyloxy, isohexyloxy and the like.
  • an alkoxy having 1 to 3 carbon atoms is preferable.
  • aryl of R aryl having 6 to 10 carbon atoms is preferable.
  • R represents alkylene.
  • alkylene of R linear or branched alkylene having 1 to 6 carbon atoms is preferable.
  • methylene, ethylene, trimethylene, tetramethylene, pentamethylene, hexamethylene, 2- (Ethyl) trimethylene, 1- (methyl) tetramethylene can be mentioned.
  • modification of the other part of deoxyribose include a modification in which the 4 ′ position is a chi-isomer.
  • modifications of the phosphate backbone include modifications such as phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphonate, and phosphoramidate.
  • the oligo-stranded RNA of the present invention has 1 to 3 as protruding portions at the 3 'end or 5' end of at least one RNA of the duplex forming portion as long as it retains the HCV replication inhibitory activity. It may have 4 base nucleotides. When it has an overhang, it does not matter whether the nucleotide constituting the overhang is a ribonucleotide or a deoxyribonucleotide.
  • oligo-stranded RNAs of the present invention having 2 nucleotides as the overhang, 3 of the sense strand RNA and Z or antisense strand RNA according to the present invention oligo-stranded RNA, A base having dT or uridine monophosphate (hereinafter referred to as “U”), 3 ′ side of the base sequence on the HCV RNA that matches the base sequence of the sense strand RNA related to the oligo-stranded RNA of the present invention
  • U uridine monophosphate
  • the oligonucleotide of the present invention having a base sequence complementary to the 2 'base sequence following the 5' side at the 3 'end side of the antisense strand RNA is more preferred.
  • the oligo-stranded RNA of the present invention if it retains the HCV replication inhibitory activity, for example, ribose constituting the ribonucleotide in order to enhance stability in vivo such as nuclease resistance.
  • ribose constituting the ribonucleotide in order to enhance stability in vivo such as nuclease resistance.
  • at least a part of the phosphate backbone or the like may be modified. Examples of significant modifications include modification of the ribose 2 position, modification of other parts of ribose, and modification of the phosphate backbone.
  • the modification at the 2′-position of ribose include, for example, the hydroxyl group at the 2-position of ribose is OR, R, R, OR, SH, SR, NH, NH
  • the alkyl of R is preferably a linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms. Specifically, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, And isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, n-hexyl, and isohexyl.
  • substituent that may be substituted with the alkyl include halogen, alkyl, alkoxy, and nitro-containing nitro, and 1 to 3 of these may be substituted.
  • Examples of strong halogens include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • Examples of the alkyl include the above-mentioned alkyl.
  • Examples of the alkoxy include linear or branched alkoxy having 1 to 6 carbon atoms such as methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, n— Examples include pentyloxy, isopentyloxy, n-hexyloxy, isohexyloxy and the like. In particular, alkoxy having 1 to 3 carbon atoms is preferable.
  • the scale reel is preferably an aryl having 6 to 10 carbon atoms.
  • R ′ represents alkylene.
  • the alkylene for R ′ is preferably a linear or branched alkylene having 1 to 6 carbon atoms.
  • Specific examples include methylene, ethylene, trimethylene, tetramethylene, pentamethylene, hexamethylene, 2- (ethyl) trimethylene, and 1- (methyl) tetramethylene.
  • Examples of the modification of the other part of ribose include a modification in which the 4′-position is a thio form.
  • Examples of the modification of the phosphate backbone include modifications such as phosphorothioate, phosphorodithioate, alkyl phosphonate, and phosphoramidate.
  • the oligo-stranded RNA of the present invention comprises one molar equivalent of one RNA and the other within a range of 0.5 to 2 molar equivalents, preferably within a range of 0.9 to 1.1 molar equivalents. More preferably, it can be prepared by annealing after mixing at an equimolar equivalent. Annealing can be performed by methods obvious to those skilled in the art. For example, the selected two RNAs can be mixed, heated at about 94 ° C for about 5 minutes, and then slowly cooled to room temperature. In addition, the present oligonucleotide oligo-stranded RNA can be prepared by omitting the annealing step after mixing the two selected RNAs.
  • RNA of the present invention may be transfected into cells using a carrier described later. It can also be directly introduced into cells by the calcium phosphate method, the electopore position method or the microinjection method. [0021] II. RNA of the present invention and DNA of the present invention
  • the RNA of the present invention is an RNA having a base sequence obtained by removing dT of 2 bases from the 3 ′ end of any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, and its complementary
  • An RNA having an inhibitory activity on HCV replication when an RNA having a simple base sequence and an oligo-stranded RNA are constructed can be mentioned.
  • RNA of the present invention one or more (for example, 4 or less) nucleobases may be deleted, substituted, inserted or added in the base sequence.
  • the RNA of the present invention is substituted with a partial force of a ribonucleotide constituting the RNA of the present invention, a deoxyribonucleotide or a modified deoxyribonucleotide. Moyo! /.
  • the RNA of the present invention may further have 1 to 4 nucleotides at the 3 'end or 5' end.
  • the nucleotides may be ribonucleotides or deoxyribonucleotides.
  • the nucleotides having dT or U of two bases as the nucleotides are identical to the RNA of the present invention when the RNA of the present invention is a sense strand RNA.
  • RNA of the present invention has a base sequence of 2 bases on the 3 'end side of the RNA of the present invention following the 3' side of the base sequence on HCV RNA, or is complementary to the RNA of the present invention when the RNA of the present invention is an antisense strand RNA. More preferably, the RNA of the present invention has a base sequence complementary to the base sequence of 2 bases following the 5 ′ side of the base sequence on HCV RNA that matches the specific base sequence on the 3 ′ end side of the RNA of the present invention.
  • the RNA of the present invention has a ribose constituting its ribonucleotide in order to enhance in vivo stability such as nuclease resistance, or the like. At least a part of the phosphate backbone or the like may be modified.
  • the DNA of the present invention is characterized in that the ribonucleotide sugar constituting the RNA of the present invention is D-2-deoxyribose, and uracil (U) is thymine (T) among the bases. You can list DNA.
  • the DNA of the present invention is a template for obtaining the oligo-stranded RNA of the present invention by in vitro transcription reaction, which may be incorporated into a plasmid for expressing the oligo-stranded RNA of the present invention. It can be used as DNA. It can also be used as an antisense probe
  • the RNA and DNA of the present invention can be obtained by a solid phase synthesis method by a phosphoramidite method or triester method known to those skilled in the art, or by a liquid phase synthesis method.
  • the most common embodiment is a solid phase synthesis method by the phosphoramidite method, which can be synthesized by an automatic nucleic acid synthesizer or manually. After the synthesis on the solid phase is completed, elimination from the solid phase, deprotection of the protecting group, purification of the target compound, etc. are performed.
  • the purity of the finally obtained RNA and DNA of the present invention is suitably 90% or more, preferably 95% or more.
  • composition of the present invention examples include a pharmaceutical composition comprising the present oligo-stranded RNA and a carrier.
  • the carrier refers to a carrier effective for transferring the oligo-stranded RNA of the present invention into cells.
  • the composition of the present invention can be used for the treatment and Z or prevention of diseases caused by infection with HCV. Examples of diseases caused by infection with HCV include chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma.
  • the carrier according to the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • a cationic carrier such as a cationic ribosome or a cationic polymer, or a carrier utilizing a virus envelope is used.
  • cationic ribosomes include ribosomes formed as essential components of 2-0- (2-jetylaminoethyl) force rubamoyl-1,3-0-dioleoylglycerol and phospholipids (hereinafter referred to as the following components).
  • oligofectamine registered trademark
  • ribofetin registered trademark
  • ribofectamine registered trademark
  • ribofectamine Min 2000 registered trademark
  • DMRIE-C registered trademark
  • GeneSilencer registered trademark
  • TransMessenger registered trademark
  • TransIT Mention may be made of TKO (registered trademark) (manufactured by Mirus).
  • ribosome A is preferred.
  • the cationic polymer include JetSI (registered trademark) (manufactured by Qbiogene) and Jet-PEI (registered trademark) (polyethyleneimine, manufactured by Qbiogene).
  • JetSI registered trademark
  • Jet-PEI registered trademark
  • polyethyleneimine manufactured by Qbiogene
  • As a carrier using a virus envelope for example, GenomeOne (registered trademark) (HVJ-E ribosome) , Manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.).
  • the concentration of the present oligo-stranded RNA contained in the composition of the present invention varies depending on the type of carrier, etc., but is suitably in the range of 0.1 ⁇ to 100 / ⁇ , and 1 ⁇ to 10 / The range of ⁇ ⁇ is preferred. The range of 10 ⁇ to 1 ⁇ is more preferred.
  • the weight ratio of the present oligo-stranded RNA and the carrier contained in the composition of the present invention depends on the nature of the present oligo-stranded RNA, the type of the carrier, etc. Different forces are within the range of 0.1 to 100, with 1 to 50 being preferred, and 10 to 20 being more preferred.
  • the composition of the present invention may optionally contain a pharmaceutically acceptable additive.
  • emulsification aids for example, fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and pharmaceutically acceptable salts thereof, albumin, dextran), stabilizers (for example, cholesterol, phosphatidic acid), etc.
  • Tonicity agents eg, sodium chloride, glucose, maltose, ratatose, sucrose, trehalose
  • rhodium modifiers eg, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethanol Min.
  • the content of the additive in the composition of the present invention is suitably 90% by weight or less, preferably 70% by weight or less, more preferably 50% by weight or less.
  • the composition of the present invention can be prepared by adding the oligo-stranded RNA of the present invention to a carrier dispersion and stirring appropriately.
  • the additive can be added in an appropriate step either before or after the addition of the oligo-stranded RNA of the present invention.
  • the aqueous solvent that can be used when adding the oligo-stranded RNA of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include electrolyte solutions such as water for injection, distilled water for injection, and physiological saline, Examples thereof include sugar solutions such as glucose solution and maltose solution.
  • conditions such as ⁇ ⁇ and temperature when applying force can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention can be, for example, a liquid or a lyophilized preparation thereof.
  • the lyophilized preparation can be prepared by lyophilizing the composition of the present invention having a liquid form according to a conventional method. For example, after appropriately sterilizing the composition of the present invention in the form of a liquid agent, a predetermined amount is dispensed into a vial, and the condition is about ⁇ 40 to ⁇ 20 ° C. Pre-freezing is performed for about 2 hours, primary drying is performed at about 0 to 10 ° C under reduced pressure, and then secondary drying is performed at about 15 to 25 ° C under reduced pressure, followed by freeze drying. In general, the inside of the nozzle is replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain a freeze-dried preparation of the composition of the present invention.
  • the lyophilized preparation of the composition of the present invention can be used by re-dissolving generally by adding any appropriate solution (re-dissolving solution).
  • re-dissolving solution examples include water for injection, physiological saline, and other general infusion solutions.
  • the amount of this redissolved solution varies depending on the application and is not particularly limited, but it is suitably 0.5 to 2 times the amount before lyophilization or 50 OmL or less.
  • composition of the present invention can be administered intravenously, intraarterially, orally, intratissueally, transdermally, transmucosally or to animals including humans who are desired to be administered in dosage unit form.
  • intravenous administration, transdermal administration, and transmucosal administration are desirable.
  • these dosage forms are suitable for administration, for example, various injections, oral preparations, drops, inhalants, eye drops, ointments, lotions, and suppositories.
  • the dose when administering the composition of the present invention takes into account the type, dosage form, age, weight, etc. of the patient, the route of administration, and the nature and extent of the disease.
  • the amount of the oligo-stranded RNA of the present invention for adults is generally within the range of 0.1 mg to 10 gZ human per day, preferably within the range of 1 mg to 500 mg. This number may vary depending on the type of disease targeted, the mode of administration, and the target molecule. Therefore, in some cases, a lower dose may be sufficient, and conversely, a higher dose may be required.
  • several doses or daily force can be administered at intervals of several days.
  • composition of the present invention includes a pharmaceutical composition comprising the RNA expression vector into which the DNA of the present invention is inserted and the carrier described above.
  • an expression vector may have a plurality of DNAs of the present invention inserted therein or may contain a known DNA.
  • an expression vector into which DNA capable of expressing both the sense strand RNA and the antisense strand RNA constituting the oligo-stranded RNA of the present invention is inserted can be mentioned.
  • the composition includes the present invention containing the present oligo-stranded RNA.
  • pharmaceutically acceptable additives can be added.
  • concentration of the expression vector contained in the composition varies depending on the type of carrier, etc. The appropriate force is in the range of 0.
  • InM to LOO ⁇ and preferably in the range of 1 ⁇ to 10 ⁇ . More preferably within the range of 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the weight ratio of the expression vector to the carrier contained in the composition varies depending on the nature of the expression vector, the type of carrier, etc., but is suitably in the range of 0.1 to 100, A range of 1 to 50 is preferable. A range of 10 to 20 is more preferable.
  • the content of the carrier contained in the composition is the same as in the case of the composition of the present invention containing the oligonucleotide RN of the present invention, and the preparation method thereof is also the case of the present invention composition. It is the same.
  • the dosage form and route of administration are the same as in the case of the composition of the present invention, and the dose to be administered by an appropriate method according to the patient's symptoms is also the same as the drug, dosage form, age, body weight, etc. It is desirable to determine the patient's condition, route of administration, and the nature and extent of the disease.
  • RNA that constitutes the oligo-stranded RNA was requested from Japan Bioservice (Saitama Prefecture).
  • RNA of the present invention having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 synthesized in (1) above is dissolved in water for injection so that each concentration becomes 120 ⁇ . Then each 16.61 was mixed in a test tube. This was prepared by adding 9 66. 8 1 water for injection.
  • aqueous solution of the oligo-stranded RNA according to No. 130A was prepared in the same manner as in (2) above using the RNA of the present invention having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 synthesized in (1) above.
  • oligo-stranded RNA related to No.258 An aqueous solution of oligo-stranded RNA No. 258 was prepared in the same manner as (2) above using the RNA of the present invention having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 synthesized in (1) above. (5) Preparation of pharmaceutical composition
  • 16mgZml ribosome A which is composed of 6 parts by weight of 2-0- (2-jetylaminoethyl) strength rubamoyl 1, 3-0-diol oil glycerol and 10 parts of purified egg yolk lecithin as essential components
  • a dispersion was prepared according to the method described in the literature (see publication No. W094Z19314). 97 ml of water for injection was added to 26.61 of this ribosome A dispersion to prepare 1 ml of ribosome A dispersion.
  • HuH-7 # 50-1 cells a cell line derived from human liver cancer, were used.
  • a medium for the cells at the time of screening a medium containing 10% FBS (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.) in DMEM medium (manufactured by Nissi) was used.
  • DMEM medium manufactured by Nissi
  • a medium containing 400 ⁇ gZml of G418 was used in the above medium.
  • Cells are seeded in 3 x 10 5 cells Zdish in a 6 cm diameter dish, at 37 ° C and 5% CO
  • the culture dish was also aspirated and the medium was changed by adding 2.7 ml of the medium. Thereto was added 0.3 ml of the pharmaceutical composition prepared in the example so that the final concentration of the present oligo-stranded RNA was 100 nM, to a final volume of 3 ml. After adding the pharmaceutical composition, the cells were cultured for 96 hours in a CO incubator. Cells in PBS 2
  • RNA2.5; zg was used as a cage and reverse transcription was performed using Thermoscript RT-PCR System (Invitrogen) to prepare cDNA.
  • the cDNA contained in this reverse transcription reaction solution is used as a PCR reaction kit, and HCV RNA and the constitutively expressed gene GAPDH (D-glyceraldehyde— are detected using a real-time PCR detection quantification system (ABI Prism7000).
  • 3 phosphate dehydrogenase
  • cDNA derived from lOOng total RNA was used, and for PCR amplification of GAPDH, 0.5 ng cDNA derived from total RNA was used in a vertical form.
  • a negative control cDNA derived from total RNA isolated from cells supplemented with distilled water was used.
  • the amount of HCV RNA was calculated as a relative ratio when the amount of GAPDH mRNA was 1. The obtained results were evaluated with a suppression rate of 0% when the amount of HCV RNA in cells supplemented with the pharmaceutical composition was equal to the amount of HCV RNA in the negative control.

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Abstract

　本発明の目的は、ＨＣＶの複製を抑制するオリゴ二本鎖ＲＮＡ及びＨＣＶに感染することにより引き起こされる疾患を治療及び／又は予防するための当該オリゴ二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物を提供することにある。 　本発明は、ＨＣＶの複製を抑制する、配列番号３及び配列番号４の各塩基配列の３’末端から２塩基のデオキシチミジン一リン酸（以下、「ｄＴ」という）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対又は配列番号２及び配列番号５の各塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡの対で形成されている二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴ二本鎖ＲＮＡ及び当該オリゴ二本鎖ＲＮＡと適当な担体とを含む医薬組成物に関するものである。

Description

明 細 書
オリゴニ本鎖 RNA及び医薬組成物
技術分野
[0001] 本発明は、オリゴニ本鎖 RNA及び当該オリゴニ本鎖 RNAを含む医薬組成物に関 するものである。
背景技術
[0002] C型肝炎ウィルス（以下、「HCV」という）は、その genotypeにより、 genotype la、 lb、 2a、 2b、 3a、 3bに分類される。 HCVの感染者数は、全 genotypeを合わせて、 全世界で約 1. 7億人であり、日本では約 150〜200万人であると言われている。 HC V感染の約 80%が慢性化し、慢性肝炎を経て、約 20〜30年で肝硬変や肝細胞癌 へと進行する。 日本においては、 genotype lbの HCVに感染しており、かっ血清 中に大量の当該ウィルスが存在する患者力 全 HCV感染者の約 80%を占めている 。また、肝細胞癌での死者は年間 3. 4万人であり、そのうち約 75%が HCV由来であ る。
[0003] HCV感染の治療としては、インターフェロンを中心とした抗ウィルス療法が行われ ており、当該療法による肝細胞癌の発生予防効果や延命効果等が証明されている。 しかしながら、インターフェロン療法では、日本人患者の大多数を占める高ウィルス、 genotype lbの HCV感染者に対しての完全著効率 (治療終了後 24週間以上、血 清中の HCV RNAが陰性である患者の割合を表す）が、全症例の内、 16%程度に しか過ぎず、その効果は限定されたものである。そのため、インターフェロンに次ぐ次 世代の抗 HCV治療薬が期待されて ヽる。 HCV感染及びその治療方法に関する総 説については、以下の文献を参照されたい (例えば、非特許文献 1を参照)。
[0004] RNA干渉 [RNA interference (以下、「RNAi」という）]は、二本鎖 RNA (以下、 「dsRNA」という）を細胞内に導入することにより、導入した dsRNAと相補的な RNA が特異的に分解され、したがって当該 RNAのコードする遺伝子産物の合成が抑制さ れる現象である。また、 RNAiによるタンパク質発現抑制活性を有する短い二本鎖の RNAを、 short interfering RNA (以下、「siRNA」という）という。 siRNAを用い た RNAiに関する総説については、以下の文献を参照されたい（例えば、非特許文 献 2ないし 3を参照)。
[0005] siRNAの細胞内への導入方法としては、カチオン性リボソーム又はその他のカチ オン性担体等の担体をベクターとして用いる方法、リン酸カルシウム法、エレクトロボ レーシヨン法又はマイクロインジェクション法等により細胞内に直接導入する方法等が 用いられている。また、 siRNAを細胞内で発現するよう siRNAをコードする塩基配列 を組み込んだ発現ベクターを細胞内に導入する方法も研究されている（例えば、非 特許文献 4ないし 5を参照)。
[0006] 近年、 HCV RNAに対する siRNAに関してもいくつかの報告がされているが、い ずれも充分満足できる効果は得られて!/ヽな 、 (例えば、特許文献 1な!ヽし特許文献 2 、ならびに非特許文献 6ないし 7を参照)。
[0007] 特許文献 1：国際公開第 03Z070750号パンフレット
特許文献 2 :国際公開第 02Z081494号パンフレット
非特許文献 1 :八橋 弘、坪田 昭人、泉 並木、加藤 直也、「PROGRESS IN MEDICINE」、 2003年、 4卷、 p. 1109— 1131
非特許文献 2 :森田 隆及び吉田 佳世、「タンパク質 核酸 酵素」、 2002年、 47卷 、 p. 1939 - 1945
非特許文献 3 : Martinezら、 "Cell", 2002年 9月 6日、 110卷、 5号、 p. 563 - 57 4
非特許文献 4 : M. Miyagishiら、 "Nature Biotechnology", 2002年 5月、 20卷、 5号、 p. 497- 500
非特許文献 5 :T. R. Brummelkampら、 "Science", 2002年 4月 19日、 296卷、 p . 550- 553
非特許文献 6 : G. Randallら、 Proceedings of the National Academy of Sciences", 2003年、 100卷、 1号、 p. 235 - 240
特許文献 7 :J. A. Wilsonら、 "Proceedings of the National Academy of Sciences", 2003年、 100卷、 5号、 p. 2783 - 2788
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、主として、 HCVの複製を抑制することができるオリゴニ本鎖 RNA及び H CVに感染することにより引き起こされる疾患を治療及び Z又は予防するための当該 オリゴニ本鎖 RNAを含む医薬組成物を提供することを目的として ヽる。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、 HCVの複製を抑制する、配列番号 3及び 配列番号 4の各塩基配列の 3'末端から 2塩基のデォキシチミジン一リン酸 (以下、「d TJ t 、う）を除 、た塩基配列力 なる RNAの対又は配列番号 2及び配列番号 5の各 塩基配列の 3 '末端から 2塩基の dTを除 ヽた塩基配列からなる RNAの対で形成され ている二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴニ本鎖 RNAが上記目的を解決 しうることを見出し、本発明を完成した。
[0010] 本発明としては、例えば、下記（1)〜（6)を挙げることができる。
(1)配列番号 3及び配列番号 4の各塩基配列の 3'末端力 2塩基の dTを除いた塩 基配列からなる RNAの対又は配列番号 2及び配列番号 5の各塩基配列の 3 '末端か ら 2塩基の dTを除 、た塩基配列力 なる RNAの対で形成されて 、る二重鎖形成部 を有することを特徴とするオリゴニ本鎖 RNA (以下、「本発明オリゴニ本鎖 RNA」とい う)。
(2)配列番号 2、配列番号 3又は配列番号 5のいずれ力 1つの塩基配列の 3'末端か ら 2塩基の dTを除 、た塩基配列力 なる RNAであって、かつその相補的な塩基配 列からなる RNAとオリゴニ本鎖 RNAを構成したときに HCVの複製抑制活性を有す ることを特徴とする RNA (以下、「本発明 RNA」 t ヽぅ）。
(3)上記（2)の RNAを構成するリボヌクレオチドの糖が D— 2—デォキシリボースであ り、かつ塩基の内、ゥラシル (U)がチミン (T)であることを特徴とする DNA (以下、「本 発明 DNA」という）。
(4)上記（3)の本発明 DNAが挿入された、 RNAの発現ベクター。
(5)上記（1)のオリゴニ本鎖 RNAと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物（以下 、「本発明組成物」という）。
(6)上記 (4)の発現ベクターと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。 発明を実施するための最良の形態
[0011] I.本発明オリゴニ本鎖 RNA
本発明オリゴニ本鎖 RNAとして、配列番号 3及び配列番号 4の各塩基配列の 3'末 端から 2塩基の dTを除いた塩基配列力 なる RNAの対又は配列番号 2及び配列番 号 5の各塩基配列の 3 '末端から 2塩基の dTを除 、た塩基配列力 なる RNAの対で 形成されている二重鎖形成部を有するオリゴニ本鎖 RNAを挙げることができる。
[0012] 配列番号 1及び配列番号 2の塩基配列の 3'末端力 2塩基の dTを除いた塩基配 列からなる両 RNAは、 GenBankァクセッション番号 AB080299として登録されてい る塩基配列（配列番号 6)からなる HCV RNA中の internal ribosome entry sit e (IRES)の一部分と相同な塩基配列力 なる RNA (センス鎖 RNA)である。配列番 号 4及び配列番号 5の各塩基配列の 3 '末端力 2塩基の dTを除 、た塩基配列から なる両 RNAは、それぞれ配列番号 1及び配列番号 2の各塩基配列の 3'末端から 2 塩基の dTを除 、た塩基配列と相補的な塩基配列カゝらなる RNA (アンチセンス鎖 RN A)である。配列番号 3の塩基配列の 3 '末端から 2塩基の dTを除 、た塩基配列から なる RNAは、配列番号 1の塩基配列の 3 '末端から 2塩基の dTを除 、た塩基配列の 3，末端に位置する C塩基を A塩基に置換した塩基配列からなる RNAである。
[0013] 上記「二重鎖形成部」とは、本発明オリゴニ本鎖 RNAを構成する核酸の対が二重 鎖を形成している部分であって、 HCV RNAに相同な塩基配列を含む部分をいう。 そして、それぞれの RNAの二重鎖形成部につづく 3 '側及び Z又は 5 '側に対を形 成しない一本鎖がある場合には、これを突出部と呼ぶ。
[0014] 上記「HCVの複製抑制活性」とは、本発明オリゴニ本鎖 RNAを細胞にトランスフエ クシヨンした場合に、本発明オリゴニ本鎖 RNAが存在しな 、場合に比べて HCVの複 製を抑制する活性をいう。 「HCVの複製抑制活性を有する」とは、具体的には、本発 明オリゴニ本鎖 RNAを添カ卩した細胞の HCV RNA量が、陰性対照の HCV RNA 量と等しい場合を抑制率 (％)が 0%であるとして評価した場合に、その抑制率 (％) 力 0%以上、好ましくは 75%以上、さらに好ましくは 90%以上である場合をいう。
[0015] 本発明オリゴニ本鎖 RNAは、 HCVの複製抑制活性を保持して ヽれば、二重鎖形 成部の RNAの塩基配列中に、 1ないし複数 (例えば、 4以下）の核酸塩基が欠失、置 換、挿入又は付加されていてもよい。
また、本発明オリゴニ本鎖 RNAは、 HCVの複製抑制活性を保持していれば、二重 鎖形成部の一方又は両方の RNAを構成するリボヌクレオチドの一部力 デォキシリ ボヌクレオチド又は修飾デォキシリボヌクレオチドに置換されていてもよい。ここで、修 飾デォキシリボヌクレオチドとは、例えば、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定 性を高めるために、デォキシリボヌクレオチドを構成するデォキシリボース又はリン酸 バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されているものを意味する。かかる修飾とし ては、例えば、デォキシリボースの 2，位の修飾、デォキシリボースのその他の部分の 修飾、リン酸バックボーンの修飾を挙げることができる。デォキシリボースの 2'位の修 飾としては、例えば、デォキシリボースの 2，位の水素を OR、 R、 R，OR、 SH、 SR、 N H、 NHR、 NR、 N、 CN、 F、 Cl、 Br、 Iに置換する修飾を挙げることができる。ここ
2 2 3
で、 Rはアルキル又はァリールを表す。 Rのアルキルとしては、直鎖状または分枝鎖 状の炭素数 1〜6のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、ェチル、 n— プロピル、イソプロピル、 n—ブチル、イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、 n— ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、 tert—ペンチル、 n—へキシル、およびイソ へキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよぐかかる置換基として は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これ らが 1〜3個置換されていてもよい。力かるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ 素を挙げることができる。アルキルとしては上記のアルキルと同様のものを挙げること ができる。アルコキシとしては直鎖状または分枝鎖状の炭素数 1〜6のアルコキシ、例 えばメトキシ、エトキシ、 n—プロポキシ、イソプロポキシ、 n—ブトキシ、イソブトキシ、 s ec—ブトキシ、 tert—ブトキシ、 n—ペンチルォキシ、イソペンチルォキシ、 n—へキシ ルォキシ、イソへキシルォキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数 1〜3のアル コキシが好ましい。 Rのァリールとしては、炭素数 6〜10のァリールが好ましい。具体 的には、例えば、フエニル、 α—ナフチル、 j8—ナフチルを挙げることができる。とり わけフエ-ルが好ましい。また、 R，はアルキレンを表す。 R，のアルキレンとしては、直 鎖状または分枝鎖状の炭素数 1〜6のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、 メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、へキサメチレン、 2— (ェチル）トリメチレン、 1— (メチル)テトラメチレンを挙げることができる。デォキシリボ ースのその他の部分の修飾としては、例えば、 4'位をチォ体とする修飾を挙げること ができる。リン酸バックボーンの修飾としては、例えば、ホスホロチォエート体、ホスホ 口ジチォエート体、アルキルホスホネート体、ホスホロアミデート体とする修飾を挙げる ことができる。
[0017] また、本発明オリゴニ本鎖 RNAは、 HCVの複製抑制活性を保持して ヽれば、二重 鎖形成部の少なくとも一方の RNAの 3'末端又は 5'末端に突出部として 1ないし 4塩 基のヌクレオチドを有していてもよい。突出部を有する場合には、突出部を構成する ヌクレオチドはリボヌクレオチドかデォキシリボヌクレオチドかを問わな 、。突出部とし てヌクレオチドを 2塩基有する本発明オリゴニ本鎖 RNAが好ましぐその中でも、本 発明オリゴニ本鎖 RNAに係るセンス鎖 RNA及び Z又はアンチセンス鎖 RNAの 3， 末端に突出部として、 2塩基の dT若しくはゥリジン一リン酸 (以下、「U」という）を有す るカゝ、本発明オリゴニ本鎖 RNAに係るセンス鎖 RNAの塩基配列と一致する HCV RNA上の塩基配列の 3'側に続く 2塩基の塩基配列を当該センス鎖 RNAの 3'末端 側に有するカゝ、又は本発明オリゴニ本鎖 RNAに係るアンチセンス鎖 RNAと相補的 な塩基配列と一致する HCV RNA上の塩基配列の 5 '側に続く 2塩基の塩基配列と 相補的な塩基配列を当該アンチセンス鎖 RNAの 3'末端側に有する本発明オリゴニ 本鎖 RNAがより好ましい。
[0018] さらに、本発明オリゴニ本鎖 RNAは、 HCVの複製抑制活性を保持して ヽれば、例 えば、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのリボヌクレオ チドを構成するリボース又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されてい てもよい。力かる修飾としては、例えば、リボースの 2，位の修飾、リボースのその他の 部分の修飾、リン酸バックボーンの修飾を挙げることができる。リボースの 2'位の修飾 としては、例えば、リボースの 2，位の水酸基を OR、 R、 R，OR、 SH、 SR、 NH、 NH
2
R、 NR、 N、 CN、 F、 Cl、 Br、 Iに置換する修飾を挙げることができる。ここで、 Rは
2 3
アルキル又はァリールを表す。 Rのアルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素 数 1〜6のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n—ブチル、イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、 n—ペンチル、 イソペンチル、ネオペンチル、 tert—ペンチル、 n—へキシル、およびイソへキシルが 挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよぐ力かる置換基としては、例えば、 ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが 1〜3個 置換されていてもよい。力かるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げる ことができる。アルキルとしては上記のアルキルを挙げることができる。アルコキシとし ては直鎖状または分枝鎖状の炭素数 1〜6のアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、 n—プロポキシ、イソプロポキシ、 n—ブトキシ、イソブトキシ、 sec—ブトキシ、 tert—ブ トキシ、 n—ペンチルォキシ、イソペンチルォキシ、 n—へキシルォキシ、イソへキシル ォキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数 1〜3のアルコキシが好ましい。尺の ァリールとしては、炭素数 6〜10のァリールが好ましい。具体的には、例えば、フエ二 ル、 α—ナフチル、 j8—ナフチルを挙げることができる。とりわけフエ-ルが好ましい 。また、 R'はアルキレンを表す。 R'のアルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の 炭素数 1〜6のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリ メチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、へキサメチレン、 2— (ェチル）トリメチレン、 1—(メチル)テトラメチレンを挙げることができる。リボースのその他の部分の修飾とし ては、例えば、 4'位をチォ体とする修飾を挙げることができる。リン酸バックボーンの 修飾としては、例えば、ホスホロチォエート体、ホスホロジチォエート体、アルキルホス ホネート体、ホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。
[0019] 本発明オリゴニ本鎖 RNAは、一方の RNA1モル当量に対して、他方を 0. 5〜2モ ル当量の範囲内で、好ましくは 0. 9〜1. 1モル当量の範囲内で、更に好ましくは等 モル当量で混合した後に、アニーリングすることにより調製することができる。ァニーリ ングは、当業者に自明な方法により行うことができる。例えば、選択した 2つの RNAを 混合し、 94°C程度で 5分程度加熱した後、室温まで徐冷することにより行うことができ る。また、選択した 2つの RNAを混合した後、アニーリングする工程を省いても本発 明オリゴニ本鎖 RNAを調製することができる。
[0020] 本発明オリゴニ本鎖 RNAは、後述する担体を用いて細胞内にトランスフエクシヨン してもよい。また、リン酸カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法又はマイクロインジェ クシヨン法等により、直接細胞内に導入することもできる。 [0021] II.本発明 RNA及び本発明 DNA
本発明 RNAとして、配列番号 2、配列番号 3又は配列番号 5のいずれか 1つの塩 基配列の 3'末端から 2塩基の dTを除いた塩基配列からなる RNAであって、かつそ の相補的な塩基配列カゝらなる RNAとオリゴニ本鎖 RNAを構成したときに HCVの複 製抑制活性を有する RNAを挙げることができる。
[0022] 本発明 RNAは、当該塩基配列中に、 1ないし複数 (例えば、 4以下）の核酸塩基が 欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。
[0023] 本発明 RNAは、上述した本発明オリゴニ本鎖 RNAの場合と同様に、本発明 RNA を構成するリボヌクレオチドの一部力 デォキシリボヌクレオチド又は修飾デォキシリ ボヌクレオチドに置換されて 、てもよ！/、。
[0024] 本発明 RNAは、 3'末端又は 5'末端に更にヌクレオチドを 1ないし 4塩基有してい てもよ 、。当該ヌクレオチドはリボヌクレオチドかデォキシリボヌクレオチドかを問わな い。当該ヌクレオチドを 2塩基有する本発明 RNAが好ましぐその中でも、当該ヌクレ ォチドとして、 2塩基の dT若しくは Uを有するカゝ、本発明 RNAがセンス鎖 RNAの場 合は、本発明 RNAと一致する HCV RNA上の塩基配列の 3'側に続く 2塩基の塩 基配列を本発明 RNAの 3'末端側に有するか、又は、本発明 RNAがアンチセンス鎖 RNAの場合は、本発明 RNAと相補的な塩基配列と一致する HCV RNA上の塩基 配列の 5 '側に続く 2塩基の塩基配列と相補的な塩基配列を本発明 RNAの 3 '末端 側に有する本発明 RNAがより好ま 、。
[0025] 本発明 RNAは、上述した本発明オリゴニ本鎖 RNAの場合と同様に、例えば、ヌク レアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのリボヌクレオチドを構 成しているリボース又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていても よい。
[0026] 本発明 DNAとしては、本発明 RNAを構成するリボヌクレオチドの糖が D— 2—デォ キシリボースであり、かつ塩基の内、ゥラシル (U)がチミン (T)であることを特徴とする DNAを挙げることができる。
[0027] 本発明 DNAは、本発明オリゴニ本鎖 RNAを発現するためのプラスミドに組み込ま れてもよぐ本発明オリゴニ本鎖 RNAをインビトロ転写反応で得るためのテンプレート DNAとして用いることができる。また、アンチセンスプローブとして用いることができる
[0028] 本発明 RNA及び本発明 DNAは、当業者に既知のホスホアミダイト法又はトリエス テル法による固相合成法で、または液相合成法で得ることがきる。最も一般的な態様 は、ホスホアミダイト法による固相合成法であり、核酸自動合成機又は手動にて合成 することができる。固相での合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護 及び目的物の精製等を行う。最終的に得られた本発明 RNA及び本発明 DNAの純 度は、 90%以上が適当であり、 95%以上が好ましい。
[0029] III.本発明組成物
本発明組成物として、本発明オリゴニ本鎖 RNAと担体とを含む医薬組成物を挙げ ることができる。当該担体とは、本発明オリゴニ本鎖 RNAを細胞内へ移行させるのに 有効な担体をいう。本発明組成物は HCVに感染することにより引き起こされる疾患の 治療及び Z又は予防のために用いることができる。 HCVに感染することにより引き起 こされる疾患としては、例えば、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌を挙げることができる。
[0030] 本発明組成物に係る担体としては、医薬上許容されるものであれば特に制限され ず、例えば、カチオン性リボソーム、カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、または ウィルスエンベロープを利用した担体を挙げることができる。カチオン性リボソームとし ては、例えば、 2-0- (2—ジェチルアミノエチル）力ルバモイルー 1, 3— 0—ジォ レオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるリボソーム（以下、 「リボソーム A」という）、オリゴフエクトァミン (登録商標）（Invitrogen社製）、リボフエタ チン (登録商標）（Invitrogen社製）、リボフヱクトァミン (登録商標）（Invitrogen社製 )、リボフヱクトァミン 2000 (登録商標）（Invitrogen社製）、 DMRIE— C (登録商標） (Invitrogen社製）、 GeneSilencer (登録商標）（Gene Therapy Systems社製） 、 TransMessenger (登録商標）（QIAGEN社製）、 TransIT TKO (登録商標）（M irus社製）を挙げることができる。それらの中で、リボソーム Aが好ましい。カチオン性 ポリマーとしては、例えば、 JetSI (登録商標）（Qbiogene社製）、 Jet-PEI (登録商 標）（ポリエチレンィミン、 Qbiogene社製）を挙げることができる。ウィルスェンベロー プを利用した担体としては、例えば、 GenomeOne (登録商標）（HVJ—Eリボソーム 、石原産業社製)を挙げることができる。
[0031] 本発明組成物中に含まれる本発明オリゴニ本鎖 RNAの濃度は、担体の種類等に よって異なるが、 0. 1ηΜ〜100 /ζ Μの範囲内が適当であり、 1ηΜ〜10 /ζ Μの範囲 内が好ましぐ 10ηΜ〜1 μ Μの範囲内がより好ましい。また、本発明組成物中に含 まれる本発明オリゴニ本鎖 RNAと担体との重量比（担体 Ζ本発明オリゴニ本鎖 RN Α)は、本発明オリゴニ本鎖 RNAの性質、担体の種類等によって異なる力 0. 1〜1 00の範囲内が適当であり、 1〜50の範囲内が好ましぐ 10〜20の範囲内がより好ま しい。
[0032] 本発明組成物には、本発明オリゴニ本鎖 RNAと上述した担体以外に、任意に医 薬上許容される添加剤を配合することができる。カゝかる添加剤として、例えば、乳化 補助剤 (例えば、炭素数 6〜22の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デ キストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例え ば、塩ィ匕ナトリウム、グルコース、マルトース、ラタトース、スクロース、トレハロース）、 ρ Η調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリ エタノールァミン)を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することがで きる。本発明組成物中の当該添加剤の含有量は、 90重量％以下が適当であり、 70 重量％以下が好ましぐ 50重量％以下がより好ましい。
[0033] 本発明組成物は、担体の分散液に本発明オリゴニ本鎖 RNAを加え、適当に攪拌 すること〖こより調製することができる。また、添加剤は、本発明オリゴニ本鎖 RNAの添 加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明オリゴニ本鎖 RNA を添加させる際に用い得る水性溶媒としては、医薬上許容されるものであれば特に 制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ 糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、力かる場合の ρΗ及び温度 等の条件は、当業者が適宜選択することができる。
[0034] 本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結 乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理す ること〖こより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を 適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約— 40〜― 20°Cの条件で 予備凍結を 2時間程度行い、約 0〜10°Cで減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約 1 5〜25°Cで減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的には ノ ィアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得るこ とがでさる。
[0035] 本発明組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液 (再溶解液)の添 加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、 生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途 等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の 0. 5〜2倍量、又は 50 OmL以下が適当である。
[0036] 本発明組成物は、投与単位形態で投与することが望ましぐヒトを含む動物に対し、 静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与又は経 直腸投与することができる。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が望ましい。こ れらの投与に適した剤型、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼 剤、軟膏剤、ローション剤、座剤で投与されるのはもちろんである。
[0037] 本発明組成物を投与する際の用量としては、含有される本発明オリゴニ本鎖 RNA の種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮し た上で調製することが望ましいが、成人に対して本発明オリゴニ本鎖 RNA量として、 1日当たり 0. lmg〜10gZヒトの範囲内力 好ましくは lmg〜500mgの範囲内が一 般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異な る場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上 の用量を必要とするときもある。また 1日 1回力も数回の投与又は 1日力も数日間の間 隔で投与することができる。
[0038] 本発明組成物の別の態様として、本発明 DNAが挿入された、 RNAの発現べクタ 一と上述した担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。かかる発現ベクターは 、複数の本発明 DNAが挿入されていてもよいし、また、公知の DNAを含んでいても よい。具体的には、例えば、本発明オリゴニ本鎖 RNAを構成するセンス鎖 RNAとァ ンチセンス鎖 RNAの両方を発現することができる DNAが挿入された発現ベクターを 挙げることができる。当該組成物には、本発明オリゴニ本鎖 RNAを含有する本発明 組成物と同様に、医薬上許容される添加剤を添加することができる。当該組成物中 に含まれる発現ベクターの濃度は、担体の種類等によって異なる力 0. InM〜： LOO μ Μの範囲内が適当であり、 1ηΜ〜10 μ Μの範囲内が好ましぐ 10ηΜ〜1 μ Μの 範囲内がより好ましい。当該組成物中に含まれる発現ベクターと担体との重量比（担 体 Ζ発現ベクター）は、発現ベクターの性質、担体の種類等によって異なるが、 0. 1 〜100の範囲内が適当であり、 1〜50の範囲内が好ましぐ 10〜20の範囲内がより 好ましい。また、当該組成物中に含まれる担体の含有量は、本発明オリゴニ本鎖 RN Αを含有する本発明組成物の場合と同様であり、その調製方法等に関しても、本発 明組成物の場合と同様である。更に、投与形態及び投与経路は、本発明組成物の 場合と同様に、患者の症状に合わせた適切な方法により投与してよぐ用量もまた同 様に、薬物、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度等を 考慮した上で決定することが望ま 、。
実施例
[0039] 以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は 実施例に示される範囲に限定されるものではない。
[0040] 実施例 医蓉組成物の調製
(1)オリゴニ本鎖 RNAを構成する RNAの合成
オリゴニ本鎖 RNAを構成する RNAの合成は、 日本バイオサービス (埼玉県）に依 頼した。
(2) 130番に係るオリゴニ本鎖 RNAの調製
130番に係るオリゴニ本鎖 RNAの水溶液は、上記（1)で合成した配列番号 1及び 配列番号 4の塩基配列を有する本発明 RNAをそれぞれの濃度が 120 μ Μになるよ うに注射用水に溶解し、その後、それぞれ 16. 6 1を試験管中で混合した。これ〖こ 9 66. 8 1の注射用水を添加することにより、調製した。
(3) 130A番に係るオリゴニ本鎖 RNAの調製
130A番に係るオリゴニ本鎖 RNAの水溶液は、上記（1)で合成した配列番号 3及 び配列番号 4の塩基配列を有する本発明 RNAを用い、上記 (2)と同様に調製した。
(4) 258番に係るオリゴニ本鎖 RNAの調製 258番に係るオリゴニ本鎖 RNAの水溶液は、上記（1)で合成した配列番号 2及び 配列番号 5の塩基配列を有する本発明 RNAを用い、上記 (2)と同様に調製した。 (5)医薬組成物の調製
担体として、 2— 0—（2—ジェチルアミノエチル）力ルバモイルー 1, 3— 0—ジォレ オイルグリセロール 6重量部と精製卵黄レシチン 10重量部とを必須構成成分として形 成される 16mgZmlのリボソーム A分散液を文献記載の方法 (W094Z19314号公 報参照）に従い調製した。このリボソーム A分散液 26. 6 1に注射用水 973. 4 1を 添加してリボソーム A分散液 lmlを調製した。このリボソーム分散液 lmlに上記（2)〜 (4)で調製したオリゴニ本鎖 RNA水溶液 lmlを、撹拌しながら徐々に添加し、その 後、 600Wのバス型超音波装置を用いて 2分間分散処理することにより、混合した本 発明 RNAが完全に二本鎖を形成した場合のオリゴニ本鎖 RNAの終濃度が 1 μ Μ である医薬組成物を調製した。
試験例 オリゴニ本鎖 RNAのスクリーニング
(1)使用細胞株
下記（2)のスクリーニングでは、ヒト肝癌由来の細胞株である HuH— 7 # 50— 1細 胞を用いた。 HuH— 7 # 50—1細胞の詳細については、文献（Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000年、 293卷、 p. 993— 999)を 参照されたい。スクリーニング時の当該細胞の培地としては、 DMEM培地（二ッスィ 社製）に 10%の FBS (三光純薬社製)を含有する培地を用いた。なお、スクリーニン グ時以外は、上記培地に、更に 400 μ gZmlの G418 (Gibco BRL社製）を含有す る培地を用いた。
(2)スクリーニング方法及びその評価方法
6cm径のシャーレに細胞を 3 X 105cellsZdishで播種し、 37°C、 5%CO条件下
2 でー晚培養した。翌日、培養ディッシュ力も培地を吸引し、 2. 7mlの培地を加えて培 地交換を行った。そこに、本発明オリゴニ本鎖 RNAの最終濃度として 100nMとなる ように、実施例にて調製した医薬組成物を 0. 3ml添加し、終量を 3mlとした。当該医 薬組成物を添加後、 COインキュベーター内にて 96時間培養した。細胞を PBSで 2
2
回洗浄した後、セルスクレーパーにて細胞を回収し、常法に従いトータル RN Aを単 離した。
得られたトータル RNA2.5;zgを铸型に、 Thermoscript RT—PCR System (I nvitrogen社製)を用いて逆転写反応を行い、 cDNAを作成した。この逆転写反応 液中に含まれる cDNAを PCR反応の铸型に用い、リアルタイム PCR法による検出定 量システム（ABI Prism7000)を用いて HCV RNA及び構成的発現遺伝子であ る GAPDH(D— glyceraldehyde— 3— phosphate dehydrogenase) mRNA特 異的な PCR増幅を行い、それぞれの RNA量の準定量を行った。 HCV RNAの PC R増幅には、 lOOngのトータル RNA由来の cDNAを、 GAPDHの PCR増幅には 0. 5ngのトータル RNA由来の cDNAをそれぞれ铸型に用 、た。陰性対照としては蒸留 水を添カ卩した細胞より単離したトータル RNA由来の cDNAを用いた。 HCV RNA 量は、 GAPDH mRNAの量を 1としたときの相対的な割合として算出した。得られ た結果は、医薬組成物を添カ卩した細胞の HCV RNA量が、陰性対照の HCV RN A量と等 ヽ場合を抑制率 0%として評価した。
(3)試験結果
上記スクリーニングの結果を表 1に示す。その結果、 130A番 (配列番号 3及び配列 番号 4)及び 258番（配列番号 2及び配列番号 5)の 2つのオリゴニ本鎖 RNAに顕著 な HCV複製抑制活性が認められた。また、 130A番 (配列番号 3及び配列番号 4)の オリゴニ本鎖 RNAは、 130番 (配列番号 1及び配列番号 4)のオリゴニ本鎖 RNAと比 ベて、非常に高い HCV複製抑制活性を有していた。
[表 1] オリゴ .本鎖 抑制率
配列 （ 5 ' → 3 ' )
R N Λ {%)
CGGGAGAGCCAUAGUGGUC- d T d T (配列番号 1 ) i 30 6 3
GACCACUAUGG CUCUCCCG- d T d ^r (配列番^ 4 )
CGGG AG AGCCAUAGUG GUA- d T d T (配列番号 3 )
1 3 O A 9 3
GAC CACUAUGGCUCUCC C G- d T d T (配列番 )
G U A G U G U U G G G U C G C G A A A - d T d T (配列番^ 2 )
2 53 1
U UUCGCGACC CAACACUAC- d T d T (配列番号 5 )

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 3及び配列番号 4の各塩基配列の 3 '末端から 2塩基のデォキシチミジン 一リン酸 (dT)を除 、た塩基配列からなる RNAの対又は配列番号 2及び配列番号 5 の各塩基配列の 3 '末端から 2塩基のデォキシチミジン一リン酸 (dT)を除いた塩基配 列からなる RNAの対で形成されている二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴ 二本鎖 RNA。
[2] 二重鎖形成部の塩基配列中に、 1ないし複数の核酸塩基が欠失、置換、挿入又は 付加されており、かつ C型肝炎ウィルスの複製抑制活性を有する、請求項 1に記載の オリゴニ本鎖 RNA。
[3] 二重鎖形成部を構成するリボヌクレオチドの一部力 デォキシリボヌクレオチドない し修飾デォキシリボヌクレオチドに置換されており、かつ C型肝炎ウィルスの複製抑制 活性を有する、請求項 1に記載のオリゴニ本鎖 RNA。
[4] 二重鎖形成部の少なくとも一方の RNAの 3'末端又は 5'末端に突出部としてヌクレ ォチドが 1ないし 4塩基付加されており、かつ C型肝炎ウィルスの複製抑制活性を有 する、請求項 1に記載のオリゴニ本鎖 RNA。
[5] 突出部としてのヌクレオチドがデォキシリボヌクレオチドである、請求項 4に記載のォ リゴニ本鎖 RNA。
[6] 突出部としてのヌクレオチドがデォキシチミジン一リン酸 (dT)であって、これが二重 鎖形成部を構成する少なくとも一方の RNAの 3'末端に 2塩基付加されている、請求 項 4に記載のオリゴニ本鎖 RNA。
[7] 二重鎖形成部を構成する一部のヌクレオチドのリボース又はリン酸バックボーンが 修飾されており、かつ C型肝炎ウィルスの複製抑制活性を有する、請求項 1に記載の オリゴニ本鎖 RNA。
[8] リボース又はリン酸バックボーンの修飾力 リボースの 2，位の水酸基を OR、 R、 R， OR、 SH、 SR、 NH、 NHR、 NR、 N、 CN、 F、 Cl、 Br及び Iから選択される置換基
2 2 3
に置換する修飾 (Rはアルキル又はァリールを表し、 R'はアルキレンを表す）、リボー スの 4，位をチォ体とする修飾、及び、リン酸バックボーンをホスホロチォエート体、ホ スホロジチォエート体、アルキルホスホネート体又はホスホロアミデート体とする修飾 力も選択される 1又は複数の修飾である、請求項 7に記載のオリゴニ本鎖 RNA。
[9] 配列番号 2、配列番号 3又は配列番号 5の塩基配列の 3 '末端から 2塩基のデォキ シチミジン一リン酸（dT)を除 、た塩基配列力もなる RNAであって、かつその相補的 な塩基配列カゝらなる RNAとオリゴニ本鎖 RNAを構成したときに C型肝炎ウィルスの 複製抑制活性を有することを特徴とする RNA。
[10] 塩基配列中に、 1ないし複数の核酸塩基が欠失、置換、挿入又は付加されている、 請求項 9に記載の RNA。
[11] RNAを構成するリボヌクレオチドの一部がデォキシリボヌクレオチドないし修飾ヌク レオチドに置換されて 、る、請求項 9に記載の RNA。
[12] RNAの 3 '末端又は 5'末端にヌクレオチドが 1ないし 4塩基付加されている、請求 項 9に記載の RNA。
[13] 付加されているヌクレオチド力 デォキシリボヌクレオチドである、請求項 12に記載 の RNA。
[14] 3 '末端に 2塩基のヌクレオチドが付加されており、かかるヌクレオチドがデォキシチ ミジン一リン酸 (dT)である、請求項 12に記載の RNA。
[15] ヌクレオチドを構成するリボース又はリン酸バックボーンの少なくとも一部が修飾さ れている、請求項 9に記載の RNA。
[16] 請求項 9〜 15のいずれかに記載の RNAを構成するリボヌクレオチドの糖が D— 2
—デォキシリボースであり、かつ塩基の内、ゥラシル (U)がチミン (T)であることを特 徴とする DNA。
[17] 請求項 16に記載の DNAが挿入された、 RNAの発現ベクター。
[18] 請求項 1〜8のいずれかに記載のオリゴニ本鎖 RNAと担体とを含むことを特徴とす る医薬組成物。
[19] 請求項 17に記載の発現ベクターと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
[20] 担体がカチオン性担体である、請求項 18又は 19に記載の医薬組成物。
[21] カチオン性担体が、 2— 0—（2—ジェチルアミノエチル）力ルバモイルー 1, 3-0 ジォレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成されるリボソーム である、請求項 20に記載の医薬組成物。
[22] リン脂質がレシチンである請求項 21に記載の医薬組成物。
[23] C型肝炎ウィルスの複製抑制が所望される疾患の治療及び Z又は予防のための請 求項 18又は 19のいずれかに記載の医薬組成物。
[24] C型肝炎ウィルスの複製抑制が所望される疾患が、慢性肝炎、肝硬変又は肝細胞 癌である、請求項 21に記載の医薬組成物。
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