WO2010131695A1 - 二本鎖修飾ｒｎａ - Google Patents

二本鎖修飾ｒｎａ Download PDF

Info

Publication number
WO2010131695A1
WO2010131695A1 PCT/JP2010/058082 JP2010058082W WO2010131695A1 WO 2010131695 A1 WO2010131695 A1 WO 2010131695A1 JP 2010058082 W JP2010058082 W JP 2010058082W WO 2010131695 A1 WO2010131695 A1 WO 2010131695A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
double
ribose
modified rna
pharmaceutical composition
sense strand
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/058082
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直樹 渡辺
Original Assignee
日本新薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日本新薬株式会社 filed Critical 日本新薬株式会社
Publication of WO2010131695A1 publication Critical patent/WO2010131695A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the present invention relates to a novel double-stranded modified RNA.
  • RNA interference refers to a phenomenon in which gene expression is specifically suppressed by degradation or translation inhibition of mRNA having a base sequence complementary to 19 to 23 base double-stranded RNA (short interfering RNA: siRNA).
  • siRNA short interfering RNA
  • the siRNA is generated by cleaving long double-stranded RNA present in the cell with Dicer having RNAase III-like activity.
  • 25-base double-stranded modified RNA in which the hydroxyl group at the 2′-position of ribose of 4 nucleotides continuous from the 5′-end and 3′-end of the sense strand is replaced with methoxy or a fluorine atom has been produced by Dicer. It has been reported to cause RNA interference without being cleaved.
  • no double-stranded RNA longer than 25 bases has been reported so far that causes RNA interference without being cleaved by Dicer.
  • the main object of the present invention is to provide a novel double-stranded modified RNA having an activity to suppress the expression of the protein encoded by the target gene, and a pharmaceutical comprising the complex of the double-stranded modified RNA and a carrier It is to provide a composition.
  • Double-stranded modified RNA having the following characteristics (1) to (5) (hereinafter referred to as “the present RNA”): (1) having a sense strand containing a target base sequence having a length of 30 to 100 bases homologous to the base sequence of the mRNA of the target gene; (2) having an antisense strand containing a base sequence complementary to the target base sequence; (3) The 2 ′ position of ribose in at least two consecutive nucleotides 22-24 from the 5 ′ end of the sense strand and / or in at least two consecutive nucleotides 22-24 from the 3 ′ end of the antisense strand A hydroxyl group of which is substituted, (4) The 2 ′ position of ribose in at least two consecutive nucleotides 22-24 from the 3 ′ end of the sense strand and / or in at least two consecutive nucleotides 22-24 from the 5 ′ end of the antisense strand
  • FIG. 1 shows the cleavage activity by Dicer.
  • “ ⁇ ” represents a Dicer non-added group, and “+” represents a Dicer added group.
  • FIG. 2 shows the cleavage activity by Dicer.
  • “ ⁇ ” represents a Dicer non-added group, and “+” represents a Dicer added group.
  • FIG. 3 shows the cleavage activity by Dicer.
  • “ ⁇ ” represents a Dicer non-added group
  • “+” represents a Dicer added group.
  • FIG. 4 shows the cleavage activity by Dicer.
  • “ ⁇ ” represents a Dicer non-added group, and “+” represents a Dicer added group.
  • FIG. 5 shows the expression-suppressing activity of Bcl-2 protein.
  • the upper row shows Bcl-2 protein, and the lower row shows ⁇ -actin protein.
  • FIG. 6 shows Bcl-2 protein expression inhibitory activity.
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of Bcl-2 protein to the expression level of ⁇ -actin protein.
  • FIG. 7 shows the expression suppression activity of SOD1 protein.
  • the upper row shows the SOD1 protein, and the lower row shows the ⁇ -actin protein.
  • FIG. 8 shows the expression suppression activity of SOD1 protein.
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of SOD1 protein to the expression level of ⁇ -actin protein.
  • FIG. 9 shows hnRNPH protein expression inhibitory activity.
  • FIG. 10 shows the expression suppression activity of hnRNPH protein.
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of hnRNPH protein to the expression level of ⁇ -actin protein.
  • FIG. 11 shows the expression suppression activity of luciferase protein.
  • FIG. 12 shows the expression suppression activity of luciferase protein.
  • RNA of the present invention is a double-stranded modified RNA having the following characteristics (1) to (5).
  • (1) having a sense strand containing a target base sequence having a length of 30 to 100 bases homologous to the base sequence of the mRNA of the target gene; (2) having an antisense strand containing a base sequence complementary to the target base sequence; (3) The 2 ′ position of ribose in at least two consecutive nucleotides 22-24 from the 5 ′ end of the sense strand and / or in at least two consecutive nucleotides 22-24 from the 3 ′ end of the antisense strand A hydroxyl group of which is substituted, (4) The 2 ′ position of ribose in at least two consecutive nucleotides 22-24 from the 3 ′ end of the sense strand and / or in at least two consecutive nucleotides 22-24 from the 5 ′ end of the antisense strand A hydroxyl group of which is substituted, (5) It has the expression suppression activity
  • the 2nd hydroxyl group of ribose of the 22nd and 23rd nucleotides from the 5 ′ end of the sense strand and / or the 23rd and 24th nucleotides from the 3 ′ end of the antisense strand is substituted, and It is preferred that the 23 ′ and 24th nucleotides from the 3 ′ end of the sense strand and / or the 2′-position hydroxyl group of ribose of the 22nd and 23rd nucleotides from the 5 ′ end of the antisense strand are substituted.
  • target gene is not particularly limited and can be arbitrarily selected.
  • a gene that is considered to be the cause of a disease caused by abnormal expression of the protein encoded by the target gene, or a gene for which a part of the base sequence of the gene is known but the function of which is to be clarified it can.
  • target genes include genes that act in a suppressive manner or genes that act in a stimulating manner against various diseases and the like.
  • cancer-related genes apoptosis-related genes, hematological malignant disease-related genes, metabolic disease-related genes, cardiovascular disease-related genes, neurological disease-related genes, urological disease-related genes, autoimmune disease-related genes , Cytokine genes, development-related genes, proliferation-related genes, aging-related genes, immune-related genes, viral genes, viroid genes, prion genes, microorganism-derived genes, and protozoan-derived genes.
  • Cancer-related genes include, for example, oncogenes (eg, bcr / abl gene, c-fms gene, c-fos gene, c-myb gene, c-myc gene, K-ras gene, c-erbB-2 Gene) and tumor suppressor genes (for example, p53 gene, RB gene, BRCA1 / BRCA2 gene, WT1 gene, VHL gene, PTEN gene, bcl-2 gene, bcl-XI gene).
  • tumor suppressor genes for example, p53 gene, RB gene, BRCA1 / BRCA2 gene, WT1 gene, VHL gene, PTEN gene, bcl-2 gene, bcl-XI gene.
  • the “viral gene” include human papilloma virus gene, hepatitis B and C virus gene, and cytomegalovirus (CMV) gene.
  • CMV cytomegalovirus
  • “Viroid genes” include, for example, potato and potato viroid (PSTV) genes.
  • Examples of the “autoimmune disease-related gene” include tumor necrosis factor (TNF) - ⁇ gene.
  • Examples of the “cytokine gene” include an interferon gene and an interleukin gene.
  • Examples of “development-related genes” include homeogenes.
  • Examples of the “growth factor-related gene” include vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, hepatocyte growth factor (HGF) gene, and fibroblast growth factor (FGF) gene.
  • Examples of the “prion gene” include a human prion gene and a bovine prion gene.
  • Examples of the “microbe-derived gene” include pathogenic E. coli such as O157.
  • Examples of the “protozoan-derived gene” include a malaria parasite-derived gene.
  • target base sequence having a length of 30 to 100 bases homologous to the target gene mRNA base sequence a base sequence having 80% or more homology with a part of the target gene mRNA base sequence is appropriate. A base sequence having 90% or more homology is preferable, and a base sequence having 100% homology is more preferable.
  • the target base sequence is suitably within the range of 30 to 100 bases, preferably within the range of 30 to 70 bases, and more preferably within the range of 40 to 70 bases.
  • base sequence complementary to the target base sequence a base sequence having 80% or more complementarity with the target base sequence is suitable, and a base sequence having 90% or more complementarity is preferable, and 100% complementation is preferable.
  • a base sequence having the property is more preferable.
  • complementarity is calculated by excluding nucleotides in which the hydroxyl group at the 2 ′ position of ribose is substituted from the 22nd to 24th nucleotides from the 5 ′ end and 3 ′ end of the antisense strand.
  • Examples of the substituent at the 2 ′ position in the “nucleotide substituted with the hydroxyl group at the 2 ′ position of ribose” include a hydrogen atom, alkyl, aryl, arylalkyl, alkoxyalkyl, aryloxyalkyl, alkoxy, aryloxy, aryl Any selected from alkyloxy, alkoxyalkyloxy, aryloxyalkyloxy, thiol, alkylthio, amino, alkylamino, dialkylamino, aminoalkyloxy, alkylaminoalkyloxy, dialkylaminoalkyloxy, azide, cyano, nitro and halogen These groups can be mentioned.
  • Preferable examples include a hydrogen atom, a fluorine atom, methoxy, methoxyethoxy, aminopropyloxy, dimethylaminoethoxy, and dimethylaminoethoxyethoxy.
  • a hydrogen atom, a fluorine atom, and methoxy are more preferable, and a hydrogen atom is particularly preferable.
  • “With the expression suppression activity of the protein encoded by the target gene” means that the suppression rate is 0% when the expression level of the protein encoded by the target gene is equal to that of the negative control in the cell into which the RNA of the present invention has been introduced.
  • the expression rate of the protein is 50% or more, preferably 75% or more, and more preferably 90% or more.
  • the total length of the sense strand and the antisense strand is the same or different and is suitably within the range of 30 to 104 bases, preferably within the range of 30 to 74 bases, and preferably 40 to 74 bases. Within the range is more preferable.
  • RNA of the present invention includes those in which a part of the ribonucleotide constituting the sense strand and / or the antisense strand is replaced with a modified ribonucleotide, deoxyribonucleotide or modified deoxyribonucleotide.
  • Modified ribonucleotide and “modified deoxyribonucleotide” refer to nucleotides in which at least one of “sugar moiety”, “nucleobase moiety” and “phosphate binding moiety” constituting the nucleotide is modified.
  • modification of the “sugar moiety” include, for example, modification of the hydroxyl group and hydrogen atom at the 2 ′ position of ribose, modification of the hydrogen atom at the 2 ′ position of deoxyribose, and bonding to the carbon atom at the 4 ′ position of the sugar moiety.
  • Modification with oxygen atom as sulfur atom modification with ribose 2′-position hydrogen atom and hydroxyl group as carbonyl group, modification of ribose with 2′-position hydroxyl group and 4′-position carbon atom crosslinked with methylene [so-called , Bridged Nucleic Acid (BNA) or Locked Nucleic Acid (LNA)].
  • BNA Bridged Nucleic Acid
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • Modification of the hydroxyl group at the 2 ′ position of ribose includes substituting the hydroxyl group with another group, for example, alkyl, aryl, arylalkyl, alkoxyalkyl, aryloxyalkyl, alkoxy, aryloxy, arylalkyloxy, Any group selected from alkoxyalkyloxy, aryloxyalkyloxy, thiol, alkylthio, amino, alkylamino, dialkylamino, aminoalkyloxy, alkylaminoalkyloxy, dialkylaminoalkyloxy, azide, cyano, nitro and halogen Modifications substituted with can be mentioned.
  • Modification of the hydrogen atom at the 2 ′ position of ribose or deoxyribose includes substitution of the hydrogen atom with another group, for example, alkyl, aryl, arylalkyl, alkoxyalkyl, aryloxyalkyl, alkoxy, aryloxy , Arylalkyloxy, alkoxyalkyloxy, aryloxyalkyloxy, thiol, alkylthio, amino, alkylamino, dialkylamino, aminoalkyloxy, alkylaminoalkyloxy, dialkylaminoalkyloxy, azide, cyano, nitro and halogen
  • the modification which substitutes by any group which is mentioned can be mentioned.
  • nucleobase moiety refers to a nucleobase moiety that is modified with an appropriate substituent at any modifiable position in a purine base or pyrimidine base, for example.
  • substituents include 1 to 3 substituents selected from the group consisting of halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, hydroxy, carboxy, cyano and nitro.
  • Examples of the modification of the phosphate binding moiety include modifications in which the phosphate binding moiety is phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphonate, boranophosphate, or phosphoramidate.
  • alkyl include linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms. Examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, n-hexyl and isohexyl. Examples of “halogen” include fluorine, chlorine, bromine and iodine. Examples of “alkoxy” include linear or branched alkoxy having 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples thereof include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, n-pentyloxy, isopentyloxy, n-hexyloxy and isohexyloxy. Of these, alkoxy having 1 to 3 carbon atoms is preferable.
  • Examples of “aryl” include aryl having 6 to 10 carbon atoms. Examples thereof include phenyl, ⁇ -naphthyl, and ⁇ -naphthyl. Of these, phenyl is preferred.
  • acyl examples include linear or branched alkanoyl having 1 to 6 carbon atoms and aroyl having 7 to 13 carbon atoms. Examples thereof include formyl, acetyl, n-propionyl, isopropionyl, n-butyryl, isobutyryl, tert-butyryl, valeryl, hexanoyl, benzoyl, naphthoyl and levulinyl.
  • Arylalkyl “arylalkyloxy”, “alkoxyalkyl”, “alkoxyalkyloxy”, “alkylthio”, “alkylamino”, “dialkylamino”, “aminoalkyloxy”, “alkylaminoalkyloxy”, “alkylaminoalkyloxy”, “ Examples of the “alkyl” part of “dialkylaminoalkyloxy”, “aryloxyalkyl” and “aryloxyalkyloxy” include the same as the above “alkyl”. Examples of the “alkoxy” part of “alkoxyalkyl” and “alkoxyalkyloxy” include the same as the above “alkoxy”.
  • the RNA of the present invention may have an overhang at the 3 'end and / or the 5' end of the sense strand and / or antisense strand.
  • nucleotide may be ribonucleotide or deoxyribonucleotide. Further, it may be a modified ribonucleotide or a modified deoxyribonucleotide. Among these embodiments, deoxyribonucleotides are suitable, and deoxythymidine monophosphate is preferred. Modified ribonucleotides and modified deoxyribonucleotides are the same as described above.
  • RNA of the present invention can be obtained by, for example, phosphoramidite method [for example, the 2′-position hydroxyl group is converted to 2 ′-(2-cyanoethoxy) methyl (CEM), 2′-tert-butyldimethylsilyloxymethyl (TOM), Solid-phase synthesis method using 2′-bis (acetoxymethoxy) methylethyl (ACE) or 2′-tert-butyldimethylsilyl (TBDMS) ribonucleotide phosphoramidite compound] or H-phosphonate method Or by a liquid phase synthesis method by a triester method.
  • CEM 2-cyanoethoxy) methyl
  • TOM 2′-tert-butyldimethylsilyloxymethyl
  • the phosphorothioate can be produced, for example, by using a sulfurizing agent such as sulfur or tetraethylthiodisulfide (TETD) in place of the oxidizing agent by iodine-water, for example, in the oxidation step of solid phase synthesis by the phosphoramidite method. it can.
  • TETD tetraethylthiodisulfide
  • the phosphorodithioate can be produced, for example, by using phosphorothioamidite instead of phosphoramidite and using a sulfurizing agent such as sulfur in the oxidation step.
  • the alkyl phosphonate body can be produced, for example, by using an alkyl phosphonamidite such as methylphosphonamidite instead of the phosphoramidite.
  • the phosphoramidate is produced by, for example, synthesizing an H-phosphonate in a solid phase synthesis by the H-phosphonate method, and then using a desired primary or secondary amine and an oxidizing agent such as iodine. Can do.
  • the boranophosphate body can be produced, for example, by using boron and a tertiary amine after synthesizing the H-phosphonate body in solid phase synthesis by the H-phosphonate method.
  • RNA of the present invention can be transfected into cells using a carrier described later. It can also be directly introduced into cells by the calcium phosphate method, electroporation method or microinjection method.
  • composition of the present invention comprises a complex of the RNA of the present invention and a carrier.
  • the carrier is not particularly limited as long as it is effective for transferring the RNA of the present invention into cells.
  • examples thereof include cationic carriers such as cationic liposomes, cationic polymers, and cationic dendrimers, and carriers using virus envelopes or nanoparticles.
  • liposome A Cationic liposome carrier (hereinafter referred to as “liposome A”) formed with 2-O- (2-diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol and phospholipid as essential components.
  • liposome B containing lipid as an essential component
  • liposome C containing phospholipid as an essential constituent component
  • Oligofectamine manufactured by Invitrogen
  • 2-O- (2-diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol can be produced by the method described in the literature (Example 20 of WO 94/19314).
  • 1,3-distearoylglycero-2-phosphatidyl-N- (methoxypolyethyleneglycol succinyl) ethanolamine is produced by the method described in the literature (Cancer Research vol. 68, no. 21 (2008) pp. 8843-8851). can do.
  • the compound is preferably distributed within a molecular weight range of 2000 to 3800.
  • the molecular weight can be measured by a mass spectrum using an electrospray ionization method.
  • Phospholipids that can be used in liposomes A, B and C include, for example, phosphatidylcholine [eg, dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), palmitoyloleoylphosphatidylcholine], phosphatidyl List ethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, sphingomyelin, dipalmitoylphosphatidylglycerol, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, egg yolk lecithin, soybean lecithin, or hydrogenated phospholipids thereof be able to.
  • DOPC dioleoylphosphatidylcholine
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • DPPC
  • Lipofectin consists of N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) as neutral lipid 1: It is a cationic liposome containing 1 (mol / mol).
  • DOTMA N-[1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • Lipofectamine is composed of 2,3-diolexioxyoxy-N- [2- (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneammonium trifluoroacetate (DOSPA) and dioleoylphosphatidylethanolamine It is a cationic liposome containing 3: 1 (w / w) of (DOPE).
  • Cellfectin is a cation containing N, N 1 , N 2 , N 3 -tetramethyl-tetrapalmitylspermine (TM-TPS) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) at a ratio of 1: 1.5 (mol / mol). Liposomes.
  • DMRIE-C is a cationic liposome containing 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide (DMRIE) and cholesterol (Cholesterol) at 1: 1 (mol / mol).
  • cationic polymer examples include jetSI (manufactured by Qbiogene), jetPEI (polyethyleneimine; manufactured by Qbiogene), and atelocollagen.
  • viruses envelope examples include GenomeONE (HVJ-E liposome; manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.).
  • cationic dendrimer examples include a cationic amino acid dendrimer (for example, dendritic poly (L-lysine) (for example, “Organic Biomolecular Chemistry”, 2003, Vol. 1, pages 1270-1273) or a polyamidoamine dendrimer. Can be mentioned.
  • a cationic amino acid dendrimer for example, dendritic poly (L-lysine) (for example, “Organic Biomolecular Chemistry”, 2003, Vol. 1, pages 1270-1273) or a polyamidoamine dendrimer.
  • nanoparticles examples include gold nanoparticles and silica nanoparticles, and the average particle diameter is suitably in the range of 1 nm to 5000 nm, for example.
  • gold nanoparticles examples include cationic gold nanoparticles (“Bioconjugate Chemistry”, 2002, 13, 3-6), cationic gold nanoparticles modified with polyethylene glycol (for example, “Journal of” Controlled Release ", 2006, 111, 382-389).
  • the type of the RNA of the present invention contained in the composition of the present invention may be one type, or may be 2 to 10 types.
  • the concentration of the RNA of the present invention contained in the composition of the present invention varies depending on the type of carrier and the like, but when used in vitro, for example, the range of 0.1 nM to 10 ⁇ M is appropriate, and 10 nM to 1 ⁇ M. Within the range of is preferable. When used in vivo, for example, the range of 0.1 to 10 mg / mL is appropriate, and the range of 0.5 to 2 mg / mL is preferable.
  • the weight ratio of the RNA of the present invention to the carrier contained in the composition of the present invention (carrier / RNA of the present invention) varies depending on the nature of the RNA of the present invention, the type of carrier, etc., but is preferably within the range of 0.01-100. In the range of 1-50, more preferably in the range of 5-30.
  • a pharmaceutically acceptable additive can be optionally blended.
  • additives include emulsification aids (for example, fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and pharmaceutically acceptable salts thereof, albumin, dextran), stabilizers (for example, cholesterol, phosphatidic acid), and isotonic agents.
  • emulsification aids for example, fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and pharmaceutically acceptable salts thereof, albumin, dextran
  • stabilizers for example, cholesterol, phosphatidic acid
  • isotonic agents for example, sodium chloride, glucose, maltose, lactose, sucrose, trehalose
  • pH adjusters for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethanolamine
  • the content of the additive in the composition of the present invention is suitably 90% by weight or less, preferably 70% by weight or less, and more preferably 50% by weight or less.
  • the composition of the present invention can be prepared by adding the RNA of the present invention to a carrier dispersion and stirring appropriately. Further, the additive can be added in an appropriate step before or after the RNA of the present invention is added.
  • the solvent that can be used for adding the RNA of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include electrolyte solutions such as water for injection, distilled water for injection, and physiological saline, glucose solution, and maltose. Examples thereof include sugar liquids such as liquid. Further, conditions such as pH and temperature in such a case can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention can be, for example, a liquid or a lyophilized preparation thereof.
  • the lyophilized preparation can be prepared by lyophilizing the composition of the present invention having a liquid form according to a conventional method. For example, after properly sterilizing the composition of the present invention in the form of a liquid agent, a predetermined amount is dispensed into a vial, and pre-freezing is performed at about ⁇ 40 to ⁇ 20 ° C. for about 2 hours. Primary drying can be performed at about 0 to 10 ° C. under reduced pressure, followed by secondary drying at about 15 to 25 ° C. under reduced pressure and freeze-drying. In general, the inside of the vial is replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain a lyophilized preparation of the composition of the present invention.
  • the above lyophilized preparation can be used by re-dissolving generally by adding any appropriate solution (re-dissolving solution).
  • re-dissolving solution examples include water for injection, physiological saline, and other general infusion solutions.
  • the amount of this redissolved solution varies depending on the application and the like and is not particularly limited, but it is suitably 0.5 to 2 times the amount of the solution before lyophilization or 500 mL or less.
  • RNA of the present invention or the composition of the present invention is used, for example, for the treatment and / or prevention of diseases caused by abnormal expression of the protein encoded by the target gene. be able to.
  • diseases caused by abnormal expression of the protein encoded by the target gene be able to.
  • used for the treatment and / or prevention of cancer viral diseases, metabolic diseases, cardiovascular diseases, neurological diseases, urological diseases, hematological malignancies, or diseases where the promotion or suppression of apoptosis is desired Can do.
  • RNA or the composition of the present invention is administered to animals including humans by intravenous administration, intraarterial administration, oral administration, tissue administration (for example, intravesical administration, intrathoracic administration, intraperitoneal administration, intraocular administration, Administration into the brain), transdermal administration, transmucosal administration, pulmonary administration, or rectal administration.
  • intravenous administration, transdermal administration, and transmucosal administration are desirable.
  • these dosage forms are suitable for administration, for example, various injections, oral preparations, drops, inhalants, eye drops, ointments, lotions and suppositories.
  • the dosage of the RNA of the present invention or the composition of the present invention is determined, for example, for adults in consideration of the type of RNA of the present invention, dosage form, patient condition such as age and weight, administration route, nature and degree of disease. In general, it is generally within the range of 0.1 mg to 5 g / human per day, preferably within the range of 1 mg to 2 g. This value may vary depending on the type of target disease, dosage form, and target molecule. Therefore, in some cases, a lower dose may be sufficient, and conversely, a higher dose may be required. It can also be administered once to several times a day or at intervals of 1 day to several days.
  • Double-stranded RNA Sequence The double-stranded RNA used in Test Examples 1 to 3 is as follows.
  • “dA”, “dT”, “dG”, and “dC” represent nucleotides (DNA) in which the hydroxyl group at the 2′-position of ribose is replaced with a hydrogen atom.
  • “A”, “u”, “g”, and “c” represent nucleotides in which the hydroxyl group at the 2 ′ position of ribose is substituted with methoxy.
  • Bcl2-1 Sense strand (SEQ ID NO: 1) 5'-GUG AUG AAG UAC AUC CAU UdTdT-3 ' Antisense strand (SEQ ID NO: 2) 5'-AAU GGA UGU ACU UCA UCA CdTdT-3 ' Bcl2-2: Sense strand (SEQ ID NO: 3) 5'-CGA UAA CCG GGA GAU AGU GAU GAA GUA CAU CCA UUDT dT-3 ' Antisense strand (SEQ ID NO: 4) 5'-AAU GGA UGU ACU UCA UCA CUA UCU CCC GGU UAU CGdT dT-3 ' Bcl2-3: Sense strand (SEQ ID NO: 5) 5'-CGA UAA CCG GGA G dAdT AGU GAU dGdA A GUA CAU CCA UUdT dT-3 ' Antisense strand (SEQ ID NO: 4) 5'-AAU GGA U
  • GL3-1 is a sequence described in the literature (Journal of Controlled Release, 131, 2008, p.64-69), each of which suppresses the expression of the protein encoded by the target gene.
  • (2) Synthesis of RNA strands constituting double-stranded RNA The synthesis of RNA strands constituting double-stranded RNA was commissioned to Japan Bioservice. Each RNA strand was dissolved in water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd., the same shall apply hereinafter) so as to have a concentration of 100 ⁇ M.
  • Test Example 1 In Vitro Cleaving Activity by Dicer
  • the sense strand and the antisense strand synthesized in Production Example 1 (2) were each 20 ⁇ M in annealing buffer (30 mM HEPES-KOH pH 7.4, 100 mM KCl, 2 mM MgCl 2 ). It prepared so that it might become.
  • a PROGRAM TEMP CONTROL SYSTEM PC-800 (manufactured by ASTEC) was heated to 95 ° C., held for 2 minutes, and then annealed by cooling to 30 ° C. over 60 minutes to prepare double-stranded RNA.
  • the prepared double-stranded RNA was subjected to an in vitro cleavage reaction using Recombinant Dicer Enzyme Kit (manufactured by Genlantis). After the reaction, electrophoresis was carried out with TBE ( ⁇ 0.5) on a 15% polyacrylamide gel so that the double-stranded RNA was 20 pmol / lane, stained with ethidium bromide, and ChemiDoc (manufactured by Bio-Rad Laboratories). Detected. The results are shown in FIGS. As shown in FIGS. 1 to 4, it was found that the RNA of the present invention is difficult to be cleaved by Dicer. On the other hand, natural double-stranded RNA was cleaved by Dicer.
  • Test Example 2 Bcl-2 protein, SOD1 protein or hnRNPH protein expression-inhibiting activity
  • A431 cells (human epithelial cancer cell line) were seeded at a density of 1 ⁇ 10 5 in a 6 cm-sized petri dish. The cells were cultured overnight in 3 mL of DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (manufactured by Sigma, the same shall apply hereinafter) under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . The medium was replaced with 2.7 mL of fresh medium, 0.3 mL of 30 nM pharmaceutical composition prepared in Production Example 2 was added, and the mixture was cultured for 3 days.
  • the cells were washed twice with PBS (manufactured by Nissui, the same applies hereinafter), and then transferred to a 1.5 mL tube using a cell scraper. Centrifuge at 1000 ⁇ g for 2 minutes, remove the supernatant, suspend in 50-100 ⁇ L of buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP-40], and then on ice for 30 minutes Left to stand. Centrifugation was performed at 15000 ⁇ g and 4 ° C. for 20 minutes, and the supernatant (cell extract) was recovered. The protein concentration in the cell extract was measured using a BCA protein assay system (Pierce Biotechnology).
  • a mouse anti-human bcl-2 antibody (M0887, manufactured by DAKO CYTOMATION) was diluted 500 times as a primary antibody, and a peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse IgG antibody was used as a secondary antibody. (P0260, DAKO CYTOMATION) diluted 2000 times was used.
  • HRP peroxidase
  • SOD1 protein a primary antibody obtained by diluting a goat anti-human SOD1 antibody (# SOD-101, manufactured by Stressgen) 1000 times was used as a secondary antibody, and an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (# 7074, CellSignaling). ) Were diluted 2000 times, respectively.
  • hnRNPH protein For detection of hnRNPH protein, a 200-fold diluted goat anti-human hnRNPH antibody (sc-10042, manufactured by Santa Cruz) was used as a primary antibody, and an HRP-labeled anti-goat IgG antibody (P-0449, P-0449, DAKO CYTOMATION Co., Ltd.) diluted 2000 times were used.
  • HRP-labeled anti-goat IgG antibody P-0449, P-0449, DAKO CYTOMATION Co., Ltd.
  • ⁇ -actin protein a goat anti-human ⁇ -actin antibody (sc-1615, manufactured by Santa Cruz) was diluted 2000 times as the primary antibody, and an HRP-labeled anti-goat IgG antibody (P0449) was used as the secondary antibody.
  • the RNA of the present invention is a protein (Bcl-2 protein, SOD1 protein or hnRNPH protein) encoded by the target gene at the same level or stronger than the corresponding natural double-stranded RNA. Expression was suppressed.
  • Test Example 3 Luciferase Protein Expression Inhibitory Activity
  • A549 cells human lung cancer-derived cells that stably express luciferase were seeded at 1000 cells / well in a 96-well plate, 37 in 100 ⁇ L of DMEM medium containing 10% fetal calf serum ° C., and cultured overnight in 5% CO 2. The next day, 11.11 ⁇ L of 100 nM pharmaceutical composition prepared in Production Example 2 was added.
  • the medium was replaced with 75 ⁇ L of the fresh medium, and 75 ⁇ L of a commercially available luciferase activity measurement kit (Steady-Glo Luciferase Assay System; manufactured by Promega) was added to cause luminescence dependent on luciferase.
  • the amount of luminescence was measured with a microplate chemiluminescence detector (Top Count; manufactured by Packard).
  • the cell which added maltose instead of the pharmaceutical composition was made into the negative control.
  • FIGS. 11 and 12 the RNA of the present invention suppressed the expression of the luciferase protein to the same extent or more strongly than the corresponding natural double-stranded RNA even when the luciferase gene was targeted.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

　本発明は、下記（１）～（５）の特徴を有する二本鎖修飾ＲＮＡに関するものである。 （１）標的遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相同的な３０～１００塩基長の標的塩基配列を含むセンス鎖を有すること、 （２）標的塩基配列と相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有すること、 （３）センス鎖の５'末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３'末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドにおいて、リボースの２'位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、 （４）センス鎖の３'末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５'末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドにおいて、リボースの２'位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、 （５）標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有すること。

Description

二本鎖修飾ＲＮＡ
　本発明は、新規な二本鎖修飾ＲＮＡに関するものである。
　ＲＮＡ干渉は、１９塩基～２３塩基程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）と相補的な塩基配列を持つｍＲＮＡの分解又は翻訳阻害により塩基配列特異的に遺伝子発現を抑制する現象をいう（例えば、非特許文献１及び２を参照）。そのｓｉＲＮＡは、細胞内に存在する長鎖二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡａｓｅＩＩＩ様の活性を有するＤｉｃｅｒにより切断を受け、生成される。
　最近、センス鎖の５’末端及び３’末端から連続した４塩基のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基がメトキシ若しくはフッ素原子で置換されている、２５塩基の二本鎖修飾ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒで切断されずにＲＮＡ干渉を引き起こすことが報告されている。しかしながら、２５塩基より長鎖の二本鎖ＲＮＡにおいて、Ｄｉｃｅｒで切断されずにＲＮＡ干渉を引き起こすものはこれまでに報告されていない。
Ｎａｔｕｒｅ、３９１、１９９８、ｐ．８０６－８１１ Ｎａｔｕｒｅ、４１１、２００１、ｐ．４９４－４９８
　本発明の主な目的は、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有する新規な二本鎖修飾ＲＮＡ、及び当該二本鎖修飾ＲＮＡと担体との複合体を含有することを特徴とする医薬組成物を提供することにある。
　本発明者は、例えば、下記１、２に掲げる発明を見出し、本発明を完成した。
１．下記（１）～（５）の特徴を有する二本鎖修飾ＲＮＡ（以下、「本発明ＲＮＡ」という。）：
（１）標的遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相同的な３０～１００塩基長の標的塩基配列を含むセンス鎖を有すること、
（２）標的塩基配列と相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有すること、
（３）センス鎖の５’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドにおいて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（４）センス鎖の３’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドにおいて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（５）標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有すること。
２．本発明ＲＮＡと担体との複合体を含有することを特徴とする医薬組成物（以下、「本発明組成物」という。）。
 
図１は、Ｄｉｃｅｒによる切断活性を示す。図中、「－」はＤｉｃｅｒ非添加群を、「＋」はＤｉｃｅｒ添加群をそれぞれ表す。 図２は、Ｄｉｃｅｒによる切断活性を示す。図中、「－」はＤｉｃｅｒ非添加群を、「＋」はＤｉｃｅｒ添加群をそれぞれ表す。 図３は、Ｄｉｃｅｒによる切断活性を示す。図中、「－」はＤｉｃｅｒ非添加群を、「＋」はＤｉｃｅｒ添加群をそれぞれ表す。 図４は、Ｄｉｃｅｒによる切断活性を示す。図中、「－」はＤｉｃｅｒ非添加群を、「＋」はＤｉｃｅｒ添加群をそれぞれ表す。 図５は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。上段はＢｃｌ－２タンパク質を、下段はβ－ａｃｔｉｎタンパク質をそれぞれ示す。 図６は、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、Ｂｃｌ－２タンパク質の発現量の比を示す。 図７は、ＳＯＤ１タンパク質の発現抑制活性を示す。上段はＳＯＤ１タンパク質を、下段はβ－ａｃｔｉｎタンパク質をそれぞれ示す。 図８は、ＳＯＤ１タンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、ＳＯＤ１タンパク質の発現量の比を示す。 図９は、ｈｎＲＮＰＨタンパク質の発現抑制活性を示す。上段はｈｎＲＮＰＨタンパク質を、下段はβ－ａｃｔｉｎタンパク質をそれぞれ示す。 図１０は、ｈｎＲＮＰＨタンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β－ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、ｈｎＲＮＰＨタンパク質の発現量の比を示す。 図１１は、ルシフェラーゼタンパク質の発現抑制活性を示す。 図１２は、ルシフェラーゼタンパク質の発現抑制活性を示す。
　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
Ｉ．本発明ＲＮＡ
　本発明ＲＮＡは、下記（１）～（５）の特徴を有する二本鎖修飾ＲＮＡである。
（１）標的遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相同的な３０～１００塩基長の標的塩基配列を含むセンス鎖を有すること、
（２）標的塩基配列と相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有すること、
（３）センス鎖の５’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドにおいて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（４）センス鎖の３’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドにおいて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（５）標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有すること。
　本発明ＲＮＡにおいて、センス鎖の５’末端から２２及び２３番目のヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２３及び２４番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基が置換されており、かつセンス鎖の３’末端から２３及び２４番目のヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２２及び２３番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基が置換されているものが好ましい。
　センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２４番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基、及びセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２２番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基が更に置換されているものがより好ましい。
　「標的遺伝子」とは、特に制限されず、任意に選択することができる。例えば、標的遺伝子がコードするタンパク質の異常な発現が疾患の原因と考えられる遺伝子や、遺伝子の塩基配列の一部が判明しているがどのような機能を有するのかを解明したい遺伝子を挙げることができる。また、標的遺伝子には、各種疾患等に対して、抑制的に作用する遺伝子又は促進的に作用する遺伝子も含まれる。
具体的には、例えば、癌関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、血液学的悪性疾患関連遺伝子、代謝性疾患関連遺伝子、循環器疾患関連遺伝子、神経疾患関連遺伝子、泌尿器疾患関連遺伝子、自己免疫疾患関連遺伝子、サイトカイン遺伝子、発生関連遺伝子、増殖関連遺伝子、老化関連遺伝子、免疫関連遺伝子、ウイルス遺伝子、ウイロイド遺伝子、プリオン遺伝子、微生物由来遺伝子、原虫由来遺伝子を挙げることができる。
　「癌関連遺伝子」としては、例えば、癌遺伝子（例えば、ｂｃｒ／ａｂｌ遺伝子、ｃ－ｆｍｓ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、ｃ－ｍｙｂ遺伝子、ｃ－ｍｙｃ遺伝子、Ｋ－ｒａｓ遺伝子、ｃ－ｅｒｂＢ－２遺伝子）や癌抑制遺伝子（例えば、ｐ５３遺伝子、ＲＢ遺伝子、ＢＲＣＡ１・ＢＲＣＡ２遺伝子、ＷＴ１遺伝子、ＶＨＬ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ｂｃｌ－２遺伝子、ｂｃｌ－ＸＩ遺伝子）を挙げることができる。
　「ウイルス遺伝子」としては、例えば、ヒト乳頭腫ウィルス遺伝子、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）遺伝子を挙げることができる。
　「ウイロイド遺伝子」としては、例えば、ジャガイモやせいも病ウイロイド（ＰＳＴＶ）遺伝子を挙げることができる。
　「自己免疫疾患関連遺伝子」としては、例えば、腫傷壊死因子（ＴＮＦ）－α遺伝子を挙げることができる。
「サイトカイン遺伝子」としては、例えば、インターフェロン遺伝子、インターロイキン遺伝子を挙げることができる。
　「発生関連遺伝子」としては、例えば、ホメオ遺伝子を挙げることができる。
　「増殖因子関連遺伝子」としては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）遺伝子を挙げることができる。
　「プリオン遺伝子」としては、例えば、ヒトプリオン遺伝子、ウシプリオン遺伝子を挙げることができる。
　「微生物由来遺伝子」としては、例えば、Ｏ１５７等の病原性大腸菌を挙げることができる。
「原虫由来遺伝子」としては、例えば、マラリア原虫由来遺伝子を挙げることができる。
　「標的遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相同的な３０～１００塩基長の標的塩基配列」としては、標的遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列の一部と８０％以上の相同性を有する塩基配列が適当であり、９０％以上の相同性を有する塩基配列が好ましく、１００％の相同性を有する塩基配列がより好ましい。但し、相同性は、センス鎖の５’末端及び３’末端から２２～２４番目のヌクレオチドの中、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドを除いて算出される。
　なお、相同性の計算は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０（１９９０）及び　Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載のアルゴリズム［当該アルゴリズムは、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。デフォルトパラメーター（期待値１０以下；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３）を使用する。］を用いることにより行う。
　標的塩基配列は、３０～１００塩基長の範囲内が適当であり、３０～７０塩基長の範囲内が好ましく、４０～７０塩基長の範囲内がより好ましい。
　「標的塩基配列と相補的な塩基配列」としては、標的塩基配列と８０％以上の相補性を有する塩基配列が適当であり、９０％以上の相補性を有する塩基配列が好ましく、１００％の相補性を有する塩基配列がより好ましい。但し、相補性は、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端から２２～２４番目のヌクレオチドの中、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドを除いて算出される。
　なお、相補性の計算は、標的塩基配列とワトソン・クリック型塩基対又はＷｏｂｂｌｅ塩基対を形成するように変換して得られる塩基配列とアンチセンス鎖の塩基配列との相同性を、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０（１９９０）及び　Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載のアルゴリズム［当該アルゴリズムは、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。デフォルトパラメーター（期待値１０以下；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３）を使用する。］を用いることにより行う。
　「リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチド」における２’位の置換基としては、例えば、水素原子、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ及びハロゲンから選択されるいずれかの基を挙げることができる。好ましくは、例えば、水素原子、フッ素原子、メトキシ、メトキシエトキシ、アミノプロピルオキシ、ジメチルアミノエトキシ、ジメチルアミノエトキシエトキシを挙げることができる。
　それらの中で、水素原子、フッ素原子、メトキシがより好ましく、水素原子が特に好ましい。
　「標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有する」としては、本発明ＲＮＡを導入した細胞において、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量が陰性対照のそれと等しい場合を抑制率が０％であるとみなし、当該タンパク質の発現量の抑制率が５０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上である場合をいう。
　本発明ＲＮＡにおいて、センス鎖及びアンチセンス鎖の全長は、同一又は異なって、３０～１０４塩基長の範囲内が適当であり、３０～７４塩基長の範囲内が好ましく、４０～７４塩基長の範囲内がより好ましい。
　本発明ＲＮＡには、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖を構成するリボヌクレオチドの一部が、修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドに置換されたものも含まれる。
　「修飾リボヌクレオチド」及び「修飾デオキシリボヌクレオチド」とは、ヌクレオチドを構成する「糖部分」、「核酸塩基部分」、「リン酸結合部分」の少なくとも１つが修飾されているヌクレオチドをいう。
　「糖部分」の修飾としては、例えば、リボースの２’位の水酸基や水素原子の修飾、デオキシリボースの２’位の水素原子の修飾、糖部分の４’位の炭素原子に結合している酸素原子を硫黄原子とする修飾、リボースの２’位の水素原子と水酸基をカルボニル基とする修飾、リボースの２’位の水酸基と４’位の炭素原子とをメチレンにて架橋する修飾［いわゆる、Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）又はＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）］を挙げることができる。
　リボースの２’位の水酸基の修飾には、当該水酸基を他の基で置換することを含み、例えば、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ及びハロゲンから選択されるいずれかの基で置換する修飾を挙げることができる。
　リボース、デオキシリボースの２’位の水素原子の修飾には、当該水素原子を他の基で置換することを含み、例えば、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ及びハロゲンから選択されるいずれかの基で置換する修飾を挙げることができる。
　「核酸塩基部分」の修飾体とは、例えば、プリン塩基又はピリミジン塩基中、修飾可能な任意の位置において、適当な置換基で修飾されている核酸塩基部分をいう。かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、シアノ及びニトロからなる群から選択される１～３個の置換基を挙げることができる。
　具体的には、例えば、２－アミノプリン、２－アミノ－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン（グアニン）、６－アミノ－９Ｈ－プリン（アデニン）、８－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、２，６，８－トリアミノプリン、６，８－ジアミノプリン、６－アミノ－２－ヒドロキシプリン、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン、８－アミノ－６－ヒドロキシプリン、６－アミノ－８－ヒドロキシプリン、６－ヒドロキシプリン、２，６－ジヒドロキシプリン又はそれらの互変異性体等のプリン塩基：５－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－２，４－ジオン（チミン）、４－アミノピリミジン－２（１Ｈ）－オン（シトシン）、ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン（ウラシル）、４，５－ジアミノピリミジン－２－オン、４，６－ジアミノピリミジン－２－オン、５－アミノピリミジン－２，４－ジオン、６－アミノピリミジン－２，４－ジオン、５－アミノピリミジン－２－オン、６－アミノピリミジン－２－オン、２，４－ジヒドロキシピリミジン又はそれらの互変異性体等のピリミジン塩基を挙げることができる。
　リン酸結合部分の修飾としては、例えば、リン酸結合部分をホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、ボラノホスフェート体又はホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。
　ここで、本明細書で用いている各用語について詳述する。
　「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１～６のアルキルを挙げることができる。例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ｎ－ヘキシル及びイソヘキシルを挙げることができる。
　「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
　「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１～６のアルコキシを挙げることができる。例えばメトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシを挙げることができる。それらの中で、炭素数１～３のアルコキシが好ましい。
　「アリール」としては、例えば、炭素数６～１０のアリールを挙げることができる。例えば、フェニル、α―ナフチル、β―ナフチルを挙げることができる。それらの中で、フェニルが好ましい。
　「アシル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１～６のアルカノイル、炭素数７～１３のアロイルを挙げることができる。例えば、ホルミル、アセチル、ｎ－プロピオニル、イソプロピオニル、ｎ－ブチリル、イソブチリル、ｔｅｒｔ－ブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニルを挙げることができる。
　「アリールアルキル」、「アリールアルキルオキシ」、「アルコキシアルキル」、「アルコキシアルキルオキシ」、「アルキルチオ」、「アルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」、「アミノアルキルオキシ」、「アルキルアミノアルキルオキシ」、「ジアルキルアミノアルキルオキシ」、「アリールオキシアルキル」及び「アリールオキシアルキルオキシ」の「アルキル」部分としては、上記の「アルキル」と同じものを挙げることができる。
　「アルコキシアルキル」及び「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分としては、上記の「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
　「アリールアルキル」、「アリールオキシアルキル」、「アリールアルキルオキシ」、「アリールオキシアルキルオキシ」及び「アリールオキシ」の「アリール」部分としては、上記の「アリール」と同じものを挙げることができる。
　「アルキル」、「アリール」の置換基である「ハロゲン」、「アルキル」及び「アルコキシ」としては、各々上記と同じものを挙げることができる。
　本発明ＲＮＡは、そのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端及び／又は５’末端に突出部を有していてもよい。
　当該突出部としては、１～４塩基のヌクレオチドが適当であり、２塩基のヌクレオチドが好ましい。当該ヌクレオチドは、リボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドかを問わない。また、修飾リボヌクレオチドや修飾デオキシリボヌクレオチドであってもよい。それらの態様の中で、デオキシリボヌクレオチドが適当であり、デオキシチミジン一リン酸が好ましい。なお、修飾リボヌクレオチドや修飾デオキシリボヌクレオチドは、前記と同様である。
　本発明ＲＮＡは、例えば、ホスホロアミダイト法［例えば、２’位水酸基が、２’－（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）化、２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）化、２’－ビス（アセトキシメトキシ）メチルエチル（ＡＣＥ）化又は２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）化されたリボヌクレオチドホスホロアミダイト化合物を使用する方法］若しくはＨ－ホスホネート法による固相合成法によって、又はトリエステル法による液相合成法によって製造することができる。
　リン酸結合部分の修飾は、当業者に公知の方法（例えば、“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、２０巻、１９９３年、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．）により行うことができる。
ホスホロチオエート体は、例えば、ホスホロアミダイト法による固相合成の酸化の工程において、例えば、ヨウ素－水による酸化剤の代わりに硫黄やｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｔｈｉｕｒａｍｄｉｓｕｌｆｉｄｅ（ＴＥＴＤ）等の硫黄化剤を用いることにより製造することができる。
　ホスホロジチオエート体は、例えば、ホスホロアミダイトの代わりにホスホロチオアミダイトを用い、酸化の工程において硫黄などの硫黄化剤を用いることにより製造することができる。
　アルキルホスホネート体は、例えば、ホスホロアミダイトの代わりに、メチルホスホンアミダイト等のアルキルホスホンアミダイトを用いることにより製造することができる。
ホスホロアミデート体は、例えば、Ｈ－ホスホネート法による固相合成において、Ｈ－ホスホネート体を合成した後、所望の１級又は２級のアミンとヨウ素等の酸化剤を用いることにより製造することができる。
　ボラノホスフェート体は、例えば、Ｈ－ホスホネート法による固相合成において、Ｈ－ホスホネート体を合成した後、ボロンと３級アミンとを用いることにより製造することができる。
　本発明ＲＮＡは、後述する担体を用いて細胞内にトランスフェクションすることができる。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法等により、直接細胞内に導入することもできる。
ＩＩ．本発明組成物
　本発明組成物は、本発明ＲＮＡと担体との複合体を含有することを特徴とするものである。
　上記担体としては、本発明ＲＮＡを細胞内に移行させるのに有効なものであれば特に制限されない。例えば、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー、カチオン性デンドリマー等のカチオン性担体、ウイルスエンベロープ又はナノ粒子を利用した担体を挙げることができる。
　「カチオン性リポソーム」としては、例えば、
（１）２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるカチオン性リポソーム担体（以下、「リポソームＡ」という。）、
（２）２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール、１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミン及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソーム（以下、「リポソームＢ」という。）、
（３）２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール、Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミン［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＤＳＰＥ－０２０Ｃ；日本油脂社製］及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソーム（以下、「リポソームＣ」という。）、
（４）オリゴフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（５）リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（６）リポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（７）セルフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（８）リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（９）ＤＭＲＩＥ－Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（１０）ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
（１１）ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、
（１２）ＴｒａｎｓＩＴ－ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ社製）を挙げることができる。
それらの中で、リポソームＡ、リポソームＢ、リポソームＣが好ましい。
　２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールは、文献（ＷＯ９４／１９３１４の実施例２０）に記載の方法により製造することができる。
　１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミンは、文献（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｖｏｌ．６８，ｎｏ．２１（２００８）ｐｐ．８８４３－８８５１）に記載の方法により製造することができる。当該化合物は、分子量２０００～３８００の範囲内で分布するものが好ましい。なお、分子量は、エレクトロスプレーイオン化法を用いたマススペクトルで測定することができる。
　リポソームＡ、Ｂ及びＣにおいて用い得る、リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン［例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン］、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン又はこれらの水素添加リン脂質を挙げることができる。
　リポフェクチンは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）と中性脂質としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で含むカチオン性リポソームである。
　リポフェクトアミンは、２，３－ジオレキシオロキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウム　トリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を３：１（ｗ／ｗ）で含むカチオン性リポソームである。
　セルフェクチンは、Ｎ，Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３－テトラメチル－テトラパルミチルスペルミン（ＴＭ－ＴＰＳ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を１：１．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で含むカチオン性リポソームである。
　ＤＭＲＩＥ－Ｃは、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）とコレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）を１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で含むカチオン性リポソームである。
　「カチオン性ポリマー」としては、例えば、ｊｅｔＳＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）、ｊｅｔＰＥＩ（ポリエチレンイミン；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）、アテロコラーゲンを挙げることができる。
　「ウイルスエンベロープ」としては、例えば、ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ（ＨＶＪ－Ｅリポソーム；石原産業社製）を挙げることができる。
　「カチオン性デンドリマー」としては、例えば、カチオン性アミノ酸デンドリマー（例えば、デンドリックポリ（Ｌ－リジン）（例えば、“Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、２００３年、１巻、１２７０－１２７３頁）又はポリアミドアミンデンドリマーを挙げることができる。
　「ナノ粒子」としては、例えば、金ナノ粒子、シリカナノ粒子を挙げることができ、その平均粒子径としては、例えば、１ｎｍ～５０００ｎｍの範囲内が適当である。
　「金ナノ粒子」としては、例えば、カチオン性金ナノ粒子（“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、２００２年、１３巻、３－６頁）、ポリエチレングリコールで修飾されたカチオン性金ナノ粒子（例えば、“Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｒｅａｓｅ”、２００６年、１１１巻、３８２－３８９頁）を挙げることができる。
　本発明組成物中に含まれる本発明ＲＮＡの種類は、一種類であってもよいが、２～１０の複数種であってもよい。
　本発明組成物中に含まれる本発明ＲＮＡの濃度は、担体の種類等によって異なるが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合には、例えば、０．１ｎＭ～１０μＭの範囲内が適当であり、１０ｎＭ～１μＭの範囲内が好ましい。また、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合には、例えば、０．１～１０ｍｇ／ｍＬの範囲内が適当であり、０．５～２ｍｇ／ｍＬの範囲内か好ましい。
　本発明組成物中に含まれる本発明ＲＮＡと担体との重量比（担体／本発明ＲＮＡ）は、本発明ＲＮＡの性質、担体の種類等によって異なるが、０．０１～１００の範囲内が適当であり、１～５０の範囲内が好ましく、５～３０の範囲内がより好ましい。
　本発明組成物には、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６～２２の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。
　本発明組成物は、担体の分散液に本発明ＲＮＡを加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、添加剤は、本発明ＲＮＡの添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明ＲＮＡを添加する際に用い得る溶媒としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、かかる場合のｐＨおよび温度等の条件は、当業者が適宜選択することができる。
　本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約－４０～－２０℃の条件で予備凍結を２時間程度行い、約０～１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５～２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
　上記凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５～２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
ＩＩＩ．本発明ＲＮＡ、本発明組成物の医薬用途
　本発明ＲＮＡないし本発明組成物は、例えば、標的遺伝子がコードするタンパク質の異常な発現が原因となっている疾患の治療及び／又は予防のために用いることができる。
例えば、癌、ウイルス性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、神経疾患、泌尿器疾患、血液学的悪性疾患、又はアポトーシスの促進又は抑制が所望される疾患の治療及び／又は予防のために用いることができる。
　本発明ＲＮＡないし本発明組成物は、ヒトを含む動物に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与（例えば、膀胱内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、眼内投与、脳内投与）、経皮投与、経粘膜投与、経肺投与又は経直腸投与することができる。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が望ましい。これらの投与に適した剤型、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤で投与されるのはもちろんである。
　本発明ＲＮＡないし本発明組成物の投与量は、本発明ＲＮＡの種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質や程度を考慮した上で、例えば、成人に対して、１日当たり０．１ｍｇ～５ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ～２ｇの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また１日１回から数回の投与または１日から数日間の間隔で投与することもできる。
 
　以下、製造例、試験例により、本発明を詳細に説明する。但し、本発明は、実施例の記載に限定されないことは言うまでもない。
製造例１　二本鎖ＲＮＡの調製
（１）二本鎖ＲＮＡの配列
　試験例１～３で用いた二本鎖ＲＮＡは、以下の通りである。下記配列中、「ｄＡ」、「ｄＴ」、「ｄＧ」及び「ｄＣ」は、リボースの２’位の水酸基が水素原子で置換されたヌクレオチド（ＤＮＡ）を表す。また、「ａ」、「ｕ」、「ｇ」及び「ｃ」は、リボースの２’位の水酸基がメトキシで置換されたヌクレオチドを表す。
Ｂｃｌ２－１：
センス鎖（配列番号１）
５’－ＧＵＧ　ＡＵＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＡＵＣ　ＣＡＵ　ＵｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号２）
５’－ＡＡＵ　ＧＧＡ　ＵＧＵ　ＡＣＵ　ＵＣＡ　ＵＣＡ　ＣｄＴｄＴ－３’　
Ｂｃｌ２－２：
センス鎖（配列番号３）
　　５’－ＣＧＡ　ＵＡＡ　ＣＣＧ　ＧＧＡ　ＧＡＵ　ＡＧＵ　ＧＡＵ
ＧＡＡ　ＧＵＡ　ＣＡＵ　ＣＣＡ　ＵＵｄＴ　ｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号４）
　　５’－ＡＡＵ　ＧＧＡ　ＵＧＵ　ＡＣＵ　ＵＣＡ　ＵＣＡ　ＣＵＡ
ＵＣＵ　ＣＣＣ　ＧＧＵ　ＵＡＵ　ＣＧｄＴ　ｄＴ－３’
Ｂｃｌ２－３：
センス鎖（配列番号５）
　　５’－ＣＧＡ　ＵＡＡ　ＣＣＧ　ＧＧＡ　ＧｄＡｄＴ　ＡＧＵ　ＧＡＵ
　ｄＧｄＡＡ　ＧＵＡ　ＣＡＵ　ＣＣＡ　ＵＵｄＴ　ｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号４）
　　５’－ＡＡＵ　ＧＧＡ　ＵＧＵ　ＡＣＵ　ＵＣＡ　ＵＣＡ　ＣＵＡ
ＵＣＵ　ＣＣＣ　ＧＧＵ　ＵＡＵ　ＣＧｄＴ　ｄＴ－３’
Ｂｃｌ２－４：
センス鎖（配列番号６）
　　５’－ＣＧＡ　ＵＡＡ　ＣＣＧ　ＧＧＡ　Ｇａｕ　ＡＧＵ　ＧＡＵ
ｇａＡ　ＧＵＡ　ＣＡＵ　ＣＣＡ　ＵＵｄＴ　ｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号４）
　　５’－ＡＡＵ　ＧＧＡ　ＵＧＵ　ＡＣＵ　ＵＣＡ　ＵＣＡ　ＣＵＡ
ＵＣＵ　ＣＣＣ　ＧＧＵ　ＵＡＵ　ＣＧｄＴ　ｄＴ－３’
Ｂｃｌ２－５：
センス鎖（配列番号７）
　　５’－ＧＧＧ　ＵＡＣ　ＧＡＵ　ＡＡＣ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ＡＵＡ
ＧＵＧ　ＡＵＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＡＵＣ　ＣＡＵ　ＵｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号８）
　　５’－ＡＡＵ　ＧＧＡ　ＵＧＵ　ＡＣＵ　ＵＣＡ　ＵＣＡ　ＣＵＡ
　ＵＣＵ　ＣＣＣ　ＧＧＵ　ＵＡＵ　ＣＧＵ　ＡＣＣ　ＣｄＴｄＴ－３’
Ｂｃｌ２－６：
センス鎖（配列番号９）
　　５’－ＧＧＧ　ＵＡＣ　ＧＡＵ　ＡＡＣ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ｄＡｄＴＡ
　ｄＧｄＴＧ　ＡＵＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＡＵＣ　ＣＡＵ　ＵｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号８）
　　５’－ＡＡＵ　ＧＧＡ　ＵＧＵ　ＡＣＵ　ＵＣＡ　ＵＣＡ　ＣＵＡ
　ＵＣＵ　ＣＣＣ　ＧＧＵ　ＵＡＵ　ＣＧＵ　ＡＣＣ　ＣｄＴｄＴ－３’
Ｂｃｌ２－７：
センス鎖（配列番号１０）
　　５’－ＧＧＧ　ＵＡＣ　ＧＡＵ　ＡＡＣ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ａｕＡ
　ｇｕＧ　ＡＵＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＡＵＣ　ＣＡＵ　ＵｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号８）
　　５’－ＡＡＵ　ＧＧＡ　ＵＧＵ　ＡＣＵ　ＵＣＡ　ＵＣＡ　ＣＵＡ
　ＵＣＵ　ＣＣＣ　ＧＧＵ　ＵＡＵ　ＣＧＵ　ＡＣＣ　ＣｄＴｄＴ－３’
 
ＳＯＤ１－１：
センス鎖（配列番号１１）
　　５’－ＧＧＵ  ＧＧＡ  ＡＡＵ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＵ  ＡｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号１２）
　　５’－ＵＡＣ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＵ  ＵＵＣ  ＣＡＣ  ＣｄＴｄＴ－３’
ＳＯＤ１－２：
センス鎖（配列番号１３）
　　５’－ＡＧＡ  ＵＧＡ  ＣＵＵ  ＧＧＧ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＵＧＧ  ＡＡＡ
ＵＧＡ ＡＧＡ ＡＡＧ ＵＡｄＴ ｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号１４）
　　５’－ＵＡＣ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＵ  ＵＵＣ  ＣＡＣ  ＣＵＵ  ＵＧＣ  
ＣＣＡ  ＡＧＵ  ＣＡＵ  ＣＵｄＴ  ｄＴ－３’
ＳＯＤ１－３：
センス鎖（配列番号１５）
　　５’－ＡＧＡ  ＵＧＡ  ＣＵＵ  ＧＧＧ  ＣｄＡｄＡ  ｄＡＧＧ  ＵＧＧ  
ｄＡｄＡｄＡ  ＵＧＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＵＡｄＴ  ｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号１４）
　　５’－ＵＡＣ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＵ  ＵＵＣ  ＣＡＣ  ＣＵＵ  ＵＧＣ  
ＣＣＡ  ＡＧＵ  ＣＡＵ  ＣＵｄＴ  ｄＴ－３’
ＳＯＤ１－４：
センス鎖（配列番号１６）
　　５’－ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＵ  ＧＡＣ  ＵＵＧ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＧＧＵ  
ＧＧＡ  ＡＡＵ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＵ  ＡｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号１７）
　　５’－ＵＡＣ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＵ  ＵＵＣ  ＣＡＣ  ＣＵＵ  ＵＧＣ  
ＣＣＡ  ＡＧＵ  ＣＡＵ  ＣＵＧ  ＣＵＵ  ＵｄＴｄＴ－３’
ＳＯＤ１－５：
センス鎖（配列番号１８）
　　５’－ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＵ  ＧＡＣ  ＵＵＧ  ＧＧＣ  ｄＡｄＡｄＡ  
ｄＧｄＧｄＴ  ＧＧＡ  ＡＡＵ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＵ  ＡｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号１７）
　　５’－ＵＡＣ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＵ  ＵＵＣ  ＣＡＣ  ＣＵＵ  ＵＧＣ  
ＣＣＡ  ＡＧＵ  ＣＡＵ  ＣＵＧ  ＣＵＵ  ＵｄＴｄＴ－３’
 
ｈｎＲＮＰＨ－１
センス鎖（配列番号１９）
　　５’－ＡＡＣ  ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＵＧ  ＡｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号２０）
　　５’－ＵＣＡ  ＵＣＵ  ＵＣＵ  ＧＡＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＵｄＴｄＴ－３’
ｈｎＲＮＰＨ－２
センス鎖（配列番号２１）
　　５’－ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＣＵ  ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＧＡＡ  ＣＵＵ  ＧＡＡ
ＵＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＵ  ＧＡｄＴ  ｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号２２）
　　５’－ＵＣＡ  ＵＣＵ  ＵＣＵ  ＧＡＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＵＣＡ  ＡＣＡ  
ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＵＣＧ  ＣＣｄＴ  ｄＴ－３’
ｈｎＲＮＰＨ－３
センス鎖（配列番号２３）
　　５’－ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＣＵ  ＵＵＵ  ＧｄＴｄＴ  ｄＧＡＡ  ＣＵＵ
ｄＧｄＡｄＡ  ＵＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＵ  ＧＡｄＴ  ｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号２２）
　　５’－ＵＣＡ  ＵＣＵ  ＵＣＵ  ＧＡＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＵＣＡ  ＡＣＡ  
ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＵＣＧ  ＣＣｄＴ  ｄＴ－３’
ｈｎＲＮＰＨ－４
センス鎖（配列番号２４）
　　５’－ＣＡＡ  ＧＵＧ  ＧＣＧ  ＡＧＧ  ＣＵＵ  ＵＵＧ  ＵＵＧ  ＡＡＣ  
ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＵＧ  ＡｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号２５）
　　５’－ＵＣＡ  ＵＣＵ  ＵＣＵ  ＧＡＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＵＣＡ  ＡＣＡ  
ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＵＣＧ  ＣＣＡ  ＣＵＵ  ＧｄＴｄＴ－３’
ｈｎＲＮＰＨ－５
センス鎖（配列番号２６）
　　５’－ＣＡＡ  ＧＵＧ  ＧＣＧ  ＡＧＧ  ＣＵＵ  ＵＵＧ  ｄＴｄＴｄＧ
ｄＡｄＡｄＣ  ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＵＧ  ＡｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号２５）
　　５’－ＵＣＡ  ＵＣＵ  ＵＣＵ  ＧＡＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＵＣＡ  ＡＣＡ  
ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＵＣＧ  ＣＣＡ  ＣＵＵ  ＧｄＴｄＴ－３’
 
ＧＬ３－１：
センス鎖（配列番号２７）
　　５’－ＣＵＵ　ＡＣＧ　ＣＵＧ　ＡＧＵ　ＡＣＵ　ＵＣＧ　ＡｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号２８）
　　５’－ＵＣＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＵＣＡ　ＧＣＧ　ＵＡＡ　ＧｄＴｄＴ－３’
ＧＬ３－２：
センス鎖（配列番号２９）
　　５’－ＧＧＵ　ＧＧＡ　ＣＡＵ　ＣＡＣ　ＵＵＡ　ＣＧＣ　ＵＧＡ
　ＧＵＡ　ＣＵＵ　ＣＧＡ　ｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号３０）
　　５’－ＵＣＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＵＣＡ　ＧＣＧ　ＵＡＡ　ＧＵＧ
　ＡＵＧ　ＵＣＣ　ＡＣＣ　ｄＴｄＴ－３’
ＧＬ３－３：
センス鎖（配列番号３１）
　　５’－ＧＧＵ　ＧＧＡ　ＣＡｄＴ　ｄＣｄＡＣ　ＵＵＡ　ＣＧＣ　ＵＧＡ
ｄＧｄＴＡ　ＣＵＵ　ＣＧＡ　ｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号３０）
　　５’－ＵＣＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＵＣＡ　ＧＣＧ　ＵＡＡ　ＧＵＧ
　ＡＵＧ　ＵＣＣ　ＡＣＣ　ｄＴｄＴ－３’
ＧＬ３－４：
センス鎖（配列番号３２）
　　５’－ＡＵＣ　ＧＡＧ　ＧＵＧ　ＧＡＣ　ＡＵＣ　ＡＣＵ　ＵＡＣ
　ＧＣＵ　ＧＡＧ　ＵＡＣ　ＵＵＣ　ＧＡｄＴ　ｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号３３）
　　５’－ＵＣＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＵＣＡ　ＧＣＧ　ＵＡＡ　ＧＵＧ
ＡＵＧ　ＵＣＣ　ＡＣＣ　ＵＣＧ　ＡＵｄＴ　ｄＴ－３’
ＧＬ３－５：
センス鎖（配列番号３４）
　　５’－ＡＵＣ　ＧＡＧ　ＧＵＧ　ＧＡＣ　ＡｄＴｄＣ　ｄＡＣＵ　ＵＡＣ
　ｄＧｄＣＵ　ＧＡＧ　ＵＡＣ　ＵＵＣ　ＧＡｄＴ　ｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号３３）
　　５’－ＵＣＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＵＣＡ　ＧＣＧ　ＵＡＡ　ＧＵＧ
ＡＵＧ　ＵＣＣ　ＡＣＣ　ＵＣＧ　ＡＵｄＴ　ｄＴ－３’
ＧＬ３－６：
センス鎖（配列番号３５）
　　５’－ＣＡＣ　ＡＵＡ　ＵＣＧ　ＡＧＧ　ＵＧＧ　ＡＣＡ　ＵＣＡ
　ＣＵＵ　ＡＣＧ　ＣＵＧ　ＡＧＵ　ＡＣＵ　ＵＣＧ　ＡｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号３６）
　　５’－ＵＣＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＵＣＡ　ＧＣＧ　ＵＡＡ　ＧＵＧ
ＡＵＧ　ＵＣＣ　ＡＣＣ　ＵＣＧ　ＡＵＡ　ＵＧＵ　ＧｄＴｄＴ－３’
ＧＬ３－７：
センス鎖（配列番号３７）
　　５’－ＣＡＣ　ＡＵＡ　ＵＣＧ　ＡＧＧ　ＵＧＧ　ＡＣＡ　ｄＴｄＣｄＡ
ｄＣｄＴＵ　ＡＣＧ　ＣＵＧ　ＡＧＵ　ＡＣＵ　ＵＣＧ　ＡｄＴｄＴ－３’
　アンチセンス鎖（配列番号３６）
　　５’－ＵＣＧ　ＡＡＧ　ＵＡＣ　ＵＣＡ　ＧＣＧ　ＵＡＡ　ＧＵＧ
ＡＵＧ　ＵＣＣ　ＡＣＣ　ＵＣＧ　ＡＵＡ　ＵＧＵ　ＧｄＴｄＴ－３’
 
　なお、Ｂｃｌ２－１はＷＯ２００４／１０５７７４に、ＳＯＤ１－１は文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、３１４、２００４、ｐ．２８３－２９１）に、ｈｎＲＮＰＨ－１は文献（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３、２００４、ｐ．２２２－２２６）に、ＧＬ３－１は文献（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ、１３１、２００８、ｐ．６４－６９）にそれぞれ記載されている配列であり、いずれも標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制し得るものである。
（２）二本鎖ＲＮＡを構成するＲＮＡ鎖の合成
　二本鎖ＲＮＡを構成するＲＮＡ鎖の合成は、日本バイオサービス社に依頼した。
各ＲＮＡ鎖の濃度が１００μＭになるように注射用水（大塚製薬工場社製、以下同じ。）に溶解した。
製造例２　医薬組成物の調製
（１）担体（リポソームＡ）の調製
　文献（ＷＯ９４／１９３１４の実施例２０）に記載の方法により製造した２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール　６０ｍｇと１００ｍｇの卵黄レシチン（キューピー社製）をバイアル中で２ｍＬのクロロホルムに溶解し、これに窒素ガスを吹きつけてクロロホルムを除去し、バイアルの壁面に薄膜を形成させた。これを更に減圧下で一晩放置した後、１０００ｍｇのマルトース（林原社製）、４．０ｍＬの注射用水及び８０μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を分散させた。４℃で３時間放置した後、マイクロプローブ（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ－２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて、１０分間超音波処理を行った。その後、注射用水を用いて１０ｍＬになるように定容し、１６ｍｇ／ｍＬの分散液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　製造例１（２）で合成したセンス鎖及びアンチセンス鎖を等モルで混合し１０％マルトース溶液（大塚製薬工場社製、以下同じ。）で希釈し、二本鎖ＲＮＡを調製した。上記（１）で調製した担体を１０％マルトース溶液にて適宜希釈し、同容量の二本鎖ＲＮＡを攪拌しながら少量ずつ滴下して、二本鎖ＲＮＡと担体との複合体（医薬組成物）を形成させた。
　複合体中の二本鎖ＲＮＡの濃度は０．１～３μＭであり、複合体中の二本鎖ＲＮＡと担体との比率は１：１６（ｗ／ｗ）であった。なお、調製した複合体は１０％マルトースで適宜希釈した。
試験例１　Ｄｉｃｅｒによるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断活性
　製造例１（２）で合成したセンス鎖及びアンチセンス鎖をアニーリングバッファー(３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２)中でそれぞれの濃度が２０μＭになるように調製した。ＰＲＯＧＲＡＭ　ＴＥＭＰ　ＣＯＮＴＲＯＬ　ＳＹＳＴＥＭ　ＰＣ－８００（ＡＳＴＥＣ社製）を用いて、９５℃まで加熱し、２分間保持した後、６０分間かけて３０℃まで冷却することでアニーリングさせ、二本鎖ＲＮＡを調製した。調製した二本鎖ＲＮＡを、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｄｉｃｅｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｔ （Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社製）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断反応を行った。反応後、二本鎖ＲＮＡ　２０ｐｍｏｌ／ｌａｎｅとなるように１５％ポリアクリルアミドゲルにてＴＢＥ（×０．５）で電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）により検出した。
　その結果を図１～４に示す。図１～４に示すように、本発明ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによる切断を受け難いことが分かった。一方で、天然型の二本鎖ＲＮＡはＤｉｃｅｒによる切断を受けていた。
試験例２　Ｂｃｌ－２タンパク質、ＳＯＤ１タンパク質又はｈｎＲＮＰＨタンパク質の発現抑制活性
　Ａ４３１細胞（ヒト上皮癌細胞株）を６ｃｍ径のシャーレに１×１０５個で播種した。１０％ウシ胎児仔血清を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社製、以下同じ。）３ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。新鮮な上記培地２．７ｍＬに交換し、製造例２で調製した３０ｎＭの医薬組成物　０．３ｍＬを添加し、３日間培養した。細胞をＰＢＳ（ニッスイ社製、以下同じ。）で２回洗浄した後、セルスクレーパーを用いて１．５ｍＬチューブに移した。１０００×ｇで２分間遠心し、上清を取り除き、５０～１００μＬの緩衝液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　ＮＰ－４０］に懸濁した後、氷上に３０分間静置した。１５０００×ｇ、４℃で２０分間遠心し、上清（細胞抽出液）を回収した。
　細胞抽出液中のタンパク質濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイシステム（ピアスバイオテクノロジー社製）を使用し、測定した。
　細胞抽出液中のタンパク質１５μｇをｅ－ＰＡＧＥＬ（登録商標）（アトー社製）で電気泳動し、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社製）に転写した。タンパク質を転写した膜を、ブロッキングワン（ナカライテスク社製、以下同じ。）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングを行った。１次抗体を０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で２０倍希釈したブロッキングワン(５％ブロッキングワン)で希釈し、当該希釈溶液中で室温１時間振盪した。ＰＢＳＴで洗浄した後、５％ブロッキングワンで希釈した２次抗体中で室温１時間振盪した。ＰＢＳＴで洗浄した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ (パーキンエルマー社製)を用いて発光させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（バイオ・ラッド ラボラトリー社製）にてＢｃｌ－２タンパク質、ＳＯＤ１タンパク質、ｈｎＲＮＰＨタンパク質又はβ－ａｃｔｉｎタンパク質を検出し、各タンパク質の発現量を定量化した。なお、ＧＬ３－１を添加した細胞と医薬組成物の代わりにマルトースを添加した細胞を陰性対照とした。
　Ｂｃｌ－２タンパク質の検出では、１次抗体としてはマウス抗ヒトｂｃｌ－２抗体（Ｍ０８８７、ＤＡＫＯ　ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を５００倍希釈したものを、２次抗体としてはペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐ０２６０、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
　ＳＯＤ１タンパク質の検出では、１次抗体としてはヤギ抗ヒトＳＯＤ１抗体(＃ＳＯＤ－１０１、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社製)を１０００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（＃７０７４、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
　ｈｎＲＮＰＨタンパク質の検出では、１次抗体としてはヤギ抗ヒトｈｎＲＮＰＨ抗体(ｓｃ－１００４２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製)を２００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ 抗体（Ｐ－０４４９、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
　β-ａｃｔｉｎタンパク質の検出では、１次抗体としてはヤギ抗ヒトβ-ａｃｔｉｎ抗体(ｓｃ－１６１５、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製)を２０００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ 抗体（Ｐ０４４９、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものを、又は、１次抗体としてはマウス抗ヒトβ-ａｃｔｉｎ抗体(ｓｃ－８４３２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製)を２０００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ 抗体（Ｐ－０２６０、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
　その結果を図５～１０に示す。図５～１０に示すように、本発明ＲＮＡは、対応する天然型の二本鎖ＲＮＡと同程度若しくはそれよりも強く標的遺伝子がコードするタンパク質（Ｂｃｌ－２タンパク質、ＳＯＤ１タンパク質又はｈｎＲＮＰＨタンパク質）の発現を抑制した。
試験例３　ルシフェラーゼタンパク質の発現抑制活性
　９６穴プレートにルシフェラーゼを安定に発現するＡ５４９細胞（ヒト肺癌由来細胞）を１０００個／ｗｅｌｌで播種し、１０％ウシ胎児仔血清を含むＤＭＥＭ培地　１００μＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。翌日、製造例２で調製した１００ｎＭの医薬組成物１１.１１μＬを添加した。医薬組成物を添加７２時間後に、新鮮な上記培地７５μＬに交換し、７５μＬの市販のルシフェラーゼ活性測定キット（Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ；プロメガ社製）を添加してルシフェラーゼに依存した発光を生じさせ、マイクロプレート化学発光検出器（Ｔｏｐ　Ｃｏｕｎｔ；パッカード社製）により発光量を計測した。なお、医薬組成物の代わりにマルトースを添加した細胞を陰性対照とした。
　その結果を図１１及び１２に示す。図１１及び１２に示すように、本発明ＲＮＡは、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とした場合においても、対応する天然型の二本鎖ＲＮＡと同程度若しくはそれよりも強くルシフェラーゼタンパク質の発現を抑制した。
 

Claims (29)

  1. 　下記（１）～（５）の特徴を有する二本鎖修飾ＲＮＡ：
    （１）標的遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相同的な３０～１００塩基長の標的塩基配列を含むセンス鎖を有すること、
    （２）標的塩基配列と相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖を有すること、
    （３）センス鎖の５’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドにおいて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
    （４）センス鎖の３’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２２～２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドにおいて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
    （５）標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有すること。
  2. 　センス鎖の５’末端から２２及び２３番目のヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２３及び２４番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基、及びセンス鎖の３’末端から２３及び２４番目のヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２２及び２３番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基が置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  3. 　センス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖の５’末端から２４番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基、並びに／又はセンス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖の３’末端から２２番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基が更に置換されていることを特徴とする、請求項２に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  4. 　リボースの２’位の水酸基が、水素原子、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ及びハロゲンから選択されるいずれかの基で置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  5. 　リボースの２’位の水酸基が、水素原子、フッ素原子及びメトキシから選択されるいずれかの基で置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  6. 　更に、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖を構成するリボヌクレオチドの一部が、デオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドに置換されていることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  7. 　センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端及び／又は５’末端に突出部として１～４塩基のヌクレオチドが付加されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  8. 　突出部として付加されたヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである、請求項７に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  9. 　突出部として付加したヌクレオチドが２塩基のデオキシチミジン一リン酸である、請求項７に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  10. 　更に、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖のヌクレオチドを構成するリボース又はリン酸バックボーンの一部が修飾されていることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  11. 　リボース又はリン酸バックボーンの修飾が、リボースの２’位の水酸基を水素原子、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ及びハロゲンから選択されるいずれかの基で置換する修飾、リボースの４’位をチオ体とする修飾又はリン酸バックボーンをホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体又はホスホロアミデート体とする修飾である、請求項１０に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  12. 　標的塩基配列の鎖長が４０～７０塩基長であることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡと担体との複合体を含有することを特徴とする医薬組成物。
  14. 　担体がカチオン性担体、ウイルスエンベロープ又はナノ粒子を利用した担体である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 　カチオン性担体がカチオン性リポソームである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　カチオン性リポソームが２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須の構成成分とするカチオン性リポソーム：２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール、１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミン及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソーム：又は２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール、Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミン及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソームである、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　リン脂質がホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、卵黄レシチン、大豆レシチン又はこれらの水素添加リン脂質である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 　カチオン性担体がカチオン性ポリマーである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  19. 　カチオン性担体がカチオン性デンドリマーである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  20. 　カチオン性デンドリマーがポリアミドアミンデンドリマーである、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 　ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項１４に記載の医薬組成物。
  22. 　標的遺伝子がコードするタンパク質の異常な発現が原因となっている疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  23. 　癌、ウイルス性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、神経疾患又は泌尿器疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  24. 　アポトーシスの促進又は抑制が所望される疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  25. 　血液学的悪性疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
  26. 　標的遺伝子がコードするタンパク質の異常な発現が原因となっている疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  27. 　癌、ウイルス性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、神経疾患又は泌尿器疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  28. 　アポトーシスの促進又は抑制が所望される疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  29. 　血液学的悪性疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
     
PCT/JP2010/058082 2009-05-14 2010-05-13 二本鎖修飾ｒｎａ WO2010131695A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-117916 2009-05-14
JP2009117916A JP2012147677A (ja) 2009-05-14 2009-05-14 二本鎖修飾ｒｎａ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010131695A1 true WO2010131695A1 (ja) 2010-11-18

Family

ID=43085068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/058082 WO2010131695A1 (ja) 2009-05-14 2010-05-13 二本鎖修飾ｒｎａ

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2012147677A (ja)
WO (1) WO2010131695A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017002079A (ja) * 2008-07-25 2017-01-05 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． センス鎖中の一般塩基またはミスマッチを使用したｓｉＲＮＡサイレンシング活性の亢進
CN110325540A (zh) * 2016-11-07 2019-10-11 纳诺索尔公司 转录后化学修饰的双链rna

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004106511A1 (ja) * 2003-05-30 2004-12-09 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Ｂｃｌ−２の発現抑制をするオリゴ二本鎖ＲＮＡとそれを含有する医薬組成物
WO2004105774A1 (ja) * 2003-05-30 2004-12-09 Nippon Shinyaku Co., Ltd. オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物
JP2006500014A (ja) * 2002-08-05 2006-01-05 アトゥーゲン・アーゲー より新規形態の干渉ｒｎａ分子
WO2006038608A1 (ja) * 2004-10-05 2006-04-13 Nippon Shinyaku Co., Ltd. オリゴ二本鎖ｒｎａ及び医薬組成物
WO2007052629A1 (ja) * 2005-11-01 2007-05-10 Nippon Shinyaku Co., Ltd. オリゴ二本鎖ｒｎａ及び医薬組成物
WO2007099981A1 (ja) * 2006-03-01 2007-09-07 Nippon Shinyaku Co., Ltd. ガラクトース誘導体、薬物担体及び医薬組成物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006500014A (ja) * 2002-08-05 2006-01-05 アトゥーゲン・アーゲー より新規形態の干渉ｒｎａ分子
WO2004106511A1 (ja) * 2003-05-30 2004-12-09 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Ｂｃｌ−２の発現抑制をするオリゴ二本鎖ＲＮＡとそれを含有する医薬組成物
WO2004105774A1 (ja) * 2003-05-30 2004-12-09 Nippon Shinyaku Co., Ltd. オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物
WO2006038608A1 (ja) * 2004-10-05 2006-04-13 Nippon Shinyaku Co., Ltd. オリゴ二本鎖ｒｎａ及び医薬組成物
WO2007052629A1 (ja) * 2005-11-01 2007-05-10 Nippon Shinyaku Co., Ltd. オリゴ二本鎖ｒｎａ及び医薬組成物
WO2007099981A1 (ja) * 2006-03-01 2007-09-07 Nippon Shinyaku Co., Ltd. ガラクトース誘導体、薬物担体及び医薬組成物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHONO, S. ET AL.: "An efficient and low immunostimulatory nanoparticle formulation for systemic siRNA delivery to the tumor", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 131, 2008, pages 64 - 69, XP025506370, DOI: doi:10.1016/j.jconrel.2008.07.006 *
KIM, D.-H. ET AL.: "Synthetic dsRNA dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 23, no. 2, February 2005 (2005-02-01), pages 222 - 226, XP002610305, DOI: doi:10.1038/nbt1051 *
YOKOTA, T. ET AL.: "siRNA-based inhibition specific for mutant SOD1 with single nucleotide alternation in familial ALS, compared with ribozyme and DNA enzyme", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 314, 2004, pages 283 - 291 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017002079A (ja) * 2008-07-25 2017-01-05 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． センス鎖中の一般塩基またはミスマッチを使用したｓｉＲＮＡサイレンシング活性の亢進
CN110325540A (zh) * 2016-11-07 2019-10-11 纳诺索尔公司 转录后化学修饰的双链rna
US11174480B2 (en) 2016-11-07 2021-11-16 nanoSUR LLC Post-transcriptionally chemically modified double strand RNAs

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012147677A (ja) 2012-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6476155B2 (ja) センス鎖中の一般塩基またはミスマッチを使用したｓｉＲＮＡサイレンシング活性の亢進
JP5502025B2 (ja) ＶＥＧＦを標的とするｉＲＮＡ物質
KR102263352B1 (ko) 트랜스티레틴（ＴＴＲ） 관련 질병을 치료하기 위한 ＲＮＡｉ 제제, 조성 및 그의 사용방법
WO2008022046A2 (en) Dicer substrate rna peptide conjugates and methods for rna therapeutics
JP2011528910A5 (ja)
JP6457704B2 (ja) 高活性及びオフターゲット削減のためのｓｉＲＮＡ構造
JP2021507709A (ja) キラル富化二本鎖ｒｎａ剤
EP2264167A1 (en) Double-stranded lipid-modified rna having high rna interference effect
JPWO2008096690A1 (ja) ポリエチレングリコール誘導体
JPWO2012161196A1 (ja) チミジル酸合成酵素に対するｓｈＲＮＡ分子を含むリポソームおよびその用途
US20170081667A1 (en) Nucleic acid that inhibits expression of irf5
JPWO2006038608A1 (ja) オリゴ二本鎖ｒｎａ及び医薬組成物
US20210238594A1 (en) Compositions and methods for improving strand biased
WO2007099981A1 (ja) ガラクトース誘導体、薬物担体及び医薬組成物
KR20220069103A (ko) 최소 플루오린 함량을 갖는 작은 간섭 rna의 화학적 변형
WO2013056670A1 (zh) 小干扰RNA及其应用和抑制plk1基因表达的方法
WO2010131695A1 (ja) 二本鎖修飾ｒｎａ
WO2011125943A1 (ja) 修飾オリゴヌクレオチド
WO2011109427A2 (en) Improving the biological activity of sirna through modulation of its thermodynamic profile
EP4183879A1 (en) Double-stranded oligonucleotide and composition for treating covid-19 containing same
EP3906930A1 (en) Rnai molecule for treating cancer
WO2010021389A1 (ja) Ｂｃｌ－２蛋白質の発現を抑制する核酸
WO2023176863A1 (ja) ＲＮＡｉ活性を有する化学修飾オリゴヌクレオチド
WO2024004779A1 (ja) ＲｅｃＱＬ１ヘリカーゼ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ
EP3950005A1 (en) Rnai molecule

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10774952

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10774952

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP