WO2023176863A1 - ＲＮＡｉ活性を有する化学修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents

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誠 小泉
貴生 小路
大地 福永
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第一三共株式会社
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • siRNA is useful for identifying gene functions, screening cell lines suitable for producing useful substances, regulating genes involved in diseases, etc.
  • it is difficult to maintain its activity in the body because it is easily degraded by RNA degrading enzymes. , has the disadvantage of high synthesis cost. Therefore, various chemical modifications have been attempted to develop oligonucleotides that retain RNAi activity and are highly stable against RNA degrading enzymes and can be produced at low cost.
  • Double-stranded oligonucleotides combining DNA, 2'-O-methyl RNA, and 2'-F have been reported, and siRNA in which the 14th position from the 5' end of the antisense strand is 2'-F has been reported. It has been reported (for example, see Patent Documents 1 and 2).
  • double-stranded oligonucleotides that combine DNA, 2'-O-methyl RNA, 2'-F RNA, and LNA (2'-O,4'-C-methylene-bridged nuclear acids) have been reported.
  • the RNAi activity of siRNA in which the second or 14th position from the 5' end of the antisense strand is 2'-F, DNA, or LNA has been reported (for example, Patent Document 1, Patent Document 3). reference.).
  • a 11 -A 12 -A 13 -A 14 -A 15 is any of the following; A11 (2'-OMe RNA) -A12 (2'-OMe RNA) -A13 (ENA) -A14 (RNA) -A15 (2'-OMe RNA), A11 (2'-F RNA) -A12 (2'-OMe RNA) -A13 (ENA) -A14 (RNA) -A15 (2'-OMe RNA), A11 (2'-OMe RNA) -A12 (2'-F RNA) -A13 (ENA) -A14 (RNA) -A15 (2'-OMe RNA), A11 (2'-OMe RNA) -A12 (2'-OMe RNA) -A13 (LNA) -A14 (RNA) -A15 (2'-OMe RNA), A11 (2'-F RNA) -A12 (2'-OMe RNA) -A13 (LNA) -A14 (RNA)
  • a 12 is DNA and A 14 is a 2'-O,4'-C-bridged modified nucleoside, or the oligonucleotide according to [6] or a pharmaceutically acceptable oligonucleotide thereof. salt.
  • each internucleoside bond in 2 to 5 nucleotides from the 5' end and 3' end of the oligonucleotide is a phosphorothioate bond.
  • oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof [18] The oligonucleotide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of [1] to [17], wherein the number of nucleosides of S O3 , S O5 , A O5 and A O3 is 0 to 2.
  • the present invention provides an oligonucleotide with a novel modification pattern that has a sustained RNA interference effect and/or gene expression suppressing effect in an animal body. Similar effects were confirmed when this modification pattern was applied to oligonucleotides for multiple target sequences, making it possible to analyze the functions of various genes using this oligonucleotide. Medicines for diseases are provided.
  • FIG. 7 is a diagram showing the hepatic hTfR2 mRNA expression level in hTfR2 Tg mice 7 days after treatment with GalNAc-conjugated TfR2 siRNA.
  • FIG. 2 is a diagram showing the base sequence of mRNA of the gene encoding human transferrin receptor 2 (hTfR2) (SEQ ID NO: 1). The underlined sequence (sequences 2847th to 2865th) indicates the target sequence of TfR2-019, and the double underlined sequence (sequence 1536th to 1554th) indicates the target sequence of TfR2-039.
  • 14-1 is a diagram showing a continuation of FIG. 14-1.
  • the transfectant may be introduced, or it may be exogenous, introduced by a technique such as gene transfer.
  • the gene may be a gene existing on a chromosome or an extrachromosomal gene. Exogenous genes include, but are not limited to, those derived from viruses, bacteria, fungi, or protozoa that can infect the recipient. The function of the gene may be known or unknown.
  • TTR proprotein convertase subtilisn/kexin type 9
  • PCSK9 proprotein convertase subtilisn/kexin type 9
  • PKA polo-like kinase
  • RRM2 ribonucleotide reductase M2 subunit
  • Hsp27 heat shock pro tein 27
  • survivin eukaryotic initiation factor-4E (eIF-4E), intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), alpha subunit of the interleukin 4 receptor (IL-4R-alpha), Factor XI, Factor VII, N-ras, H-ras, K-ras, bcl-2, bcl-xL, Her -1, Her-2, Her-3, Her-4, MDR-1, human ⁇ -catenin gene, DDX3 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), Myeloid Cell Le ukemia Sequence 1 (MCL1)
  • 2'-deoxyadenosine is A(D) or a
  • 2'-deoxyguanosine is G(D) or g
  • 2'-deoxycytidine is C(D) or c
  • thymidine is T(D) or t
  • 2'-deoxy-5-methylcytidine may be written as 5C(D) or 5c
  • 2'-deoxyuridine may be written as U(D) or u.
  • 2'-deoxynucleoside whose base is not specified may be expressed as N(D).
  • a phosphodiester bond that may be chemically modified means a phosphodiester bond employed as a natural internucleoside bond or a chemically modified phosphodiester bond.
  • a natural internucleoside bond is a phosphodiester bond represented by the following formula (P), and when displaying a base sequence, it is displayed without any letters or symbols between nucleosides.
  • chemically modified phosphodiester bond means a bonding mode in which the phosphorus atom contained in the phosphodiester bond is chemically modified.
  • Examples of chemically modified phosphodiester bonds include phosphorothioate bonds represented by the following formula (PS), phosphoroamidate bonds that are modified bonds in which a nitrogen atom is added to a phosphorus atom, and alkyl that can be substituted for a phosphorus atom.
  • An alkylphosphonate bond is a modified bond with a group added (for example, in the case of a methyl group, it becomes a methylphosphonate bond), and a modified bond is a modified bond with a substitutable alkyl group added to the non-covalently bonded oxygen atom of a phosphate group.
  • Examples include phosphotriester bonds. When a phosphorothioate bond is employed, " ⁇ " is displayed between nucleosides in the base sequence display.
  • sugar-modified nucleoside refers to a nucleoside in which the sugar moiety of the nucleoside is modified.
  • Sugar-modified nucleosides include all modes of sugar modification known in the art to which the present invention pertains. Examples of sugar-modified nucleosides include 2'-modified nucleosides, 3'-modified nucleosides, 4'-thio-modified nucleosides, 4'-thio-2'-modified nucleosides and 2'-O,4'-C-crosslinked nucleosides. Examples include modified nucleosides.
  • 2'-O-alkoxyalkylation modifications include 2'-O-methoxyethyl nucleoside ("2'-MOE RNA", “2'-O-methoxyethyl RNA” or "2'-O-methoxyethyl RNA”). It may also be expressed as ⁇ methoxyethoxy RNA.'' The symbol representing the sugar moiety is (m).).
  • the 2'-O-methoxyethyl nucleoside corresponding to each base has a structure represented by the following formula, where 2'-O-methoxyethyladenosine is A(m) and 2'-O-methoxyethylguanosine is A(m).
  • the 2'-deoxy-2'-fluoronucleoside corresponding to each base has a structure represented by the following formula, and 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine is converted into A(F), 2'-deoxy- 2'-fluoroguanosine is G(F), 2'-deoxy-2'-fluorocytidine is C(F), 2'-deoxy-2'-fluoro-5-methylcytidine is 5mC(F), 2'- Deoxy-2'-fluorouridine is sometimes written as U(F), and 2'-deoxy-2'-fluoro-5-methyluridine is sometimes written as T(F). Furthermore, 2'-deoxy-2'-fluoronucleoside whose base is not specified may be expressed as N(F).
  • 3'-O-methoxyethylcytidine 3'-O- Methoxyethyl uridine is sometimes written as U (3m), and 3'-O-methoxyethyl-5-methyl uridine is sometimes written as T (3m).
  • 3'-O-methoxyethyl nucleoside which does not specify the base, may be expressed as N(3m).
  • the manner of linking the sense strand region and the antisense strand region is particularly limited as long as the oligonucleotide of the present invention has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect.
  • the desired chemical linker or Examples include linking by oligonucleotide linkers.
  • Such bases include, for example, chemically modified bases that have base pairing ability equal to or higher than the original base (for example, C and 5C, U and T (5U)), which are the same bases. regarded as.
  • sequence identity preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, Refers to sequences having 97%, 98% or 99% identity, or a mismatch of 3 bases, 2 bases or 1 base.
  • Nucleotide sequence identity can be calculated using known genetic analysis software such as BLAST (registered trademark).
  • S 1 to S 19 each represent one nucleoside, and S a is 0 to 5, preferably 0 to 4, more preferably 0 to 3, 0 to 2, or 0 to 1. Represents a nucleoside. Furthermore, regarding the overhang structure of the sense strand region, the one added to the 5' end is indicated as SO5 , and the one added to the 3' end is indicated as S O3 , and each has 0 to 5, preferably 0 to 4, or more. Preferably, it represents 0 to 3, 0 to 2, or 0 to 1 nucleosides.
  • the S3M-oligonucleotide is characterized in that the nucleoside located at the 3' end of the complementary region in the sense strand region (ie, S 1 in formula (I) above) is a 3'-modified nucleoside.
  • Such 3'-modified nucleosides are not particularly limited as long as the S3M-oligonucleotide has an RNA interference effect and/or a gene expression suppressing effect, but preferably 3'-deoxy-3'-fluoroRNA (3' -F RNA), 3'-OMe RNA, or 3'-MOE RNA, more preferably 3'-OMe RNA.
  • One embodiment of the complementary region in the sense strand region of the S3M-oligonucleotide is the 11th, 12th, 13th, and 15th nucleoside from the 3' end (i.e., S 11 , S 12 , S 13 and S in formula (I) above). At least one of 15 ) is 2'-F RNA, and the other nucleosides are 2'-OMe RNA, 2'-F RNA, DNA, or a combination thereof.
  • S 11 , S 12 , S 13 and S 15 are all 2'-F RNA.
  • the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide refers to the region represented by the above formula (II), ie, A O5 to A O3 .
  • the complementary regions in the antisense strand region of the S3M-oligonucleotide are indicated as A 1 to A 19 numbered from the 5'-terminal nucleoside, and A a located on the 3' side of the complementary region. That is, the complementary region of the antisense strand is the region A 1 to A a in the above formula (II).
  • a 12 is DNA.
  • the modification pattern of A 11 -A 12 -A 13 -A 14 -A 15 in the antisense strand complementary region is preferably one of the following formulas (IIIi) to (IIIl). .
  • 2'-O-methoxyethylguanosine, 2'-O-methoxyethyladenosine, 2'-O-methoxyethyl-5-methylcytidine, 2'-O-methoxyethyl-5-methyluridine can synthesize the corresponding phosphoramidite reagent according to the patent (US6261840) or the literature (Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.), using commercially available phosphoramidite reagents. You can also do that.
  • thioating oligonucleotide analogs in addition to sulfur, tetraethylthiuram disulfide (TETD, Applied Biosystems), Beaucage reagent, phenylacetyl disulfide/pyridine-acetonitrile (1:1 v/v) solution (Ravikumar, Using reagents such as V.T. et al. Bioorg. Med. Chem. . Chem. The thioate derivative can be obtained according to the method described in Soc., 112, 1253 (1990).
  • the oligonucleotide of the present invention includes an oligonucleotide bound to a transport unit for transporting the oligonucleotide to a target tissue or target cell.
  • a transport unit for transporting the oligonucleotide to a target tissue or target cell.
  • a unit having an aminoalkyl phosphate group for example, the alkyl has 3 to 9 carbon atoms
  • an oligonucleotide to which such a transport unit is bound for example, a unit having an aminoalkyl phosphate group (for example, the alkyl has 3 to 9 carbon atoms) introduced into the desired chemical structure can be used as an oligonucleotide.
  • oligonucleotides in which an aptamer, which is a nucleic acid molecule that binds to a protein, is attached to the end of the oligonucleotide.
  • metal salts such as iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts, cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts , ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt , amine salts such as organic salts such as piperazine salts, tetramethylammonium salts, tris(hydroxymethyl)aminomethane salts; such as hydrofluoride, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide.
  • colloidal dispersion systems are expected to have the effect of increasing the stability of compounds in vivo, and the effect of efficiently transporting compounds to specific organs, tissues, or cells.
  • Colloidal dispersions include, but are not limited to, commonly used lipid-based polymer complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and oil-in-water emulsifiers, micelles, mixed micelles, and liposomes.
  • Representative phospholipids include phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, and distearoylphosphatidylcholine.
  • active targeting includes, for example, viral protein coat (Morishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1993, 90, p. 8474-), monoclonal antibodies, (or suitable binding moieties thereof), sugars, glycolipids or proteins (or suitable oligopeptide fragments thereof) to liposomes, or organs and cells other than their naturally occurring localized sites.
  • viral protein coat Menishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1993, 90, p. 8474-
  • monoclonal antibodies or suitable binding moieties thereof
  • sugars or glycolipids or proteins (or suitable oligopeptide fragments thereof)
  • liposomes or organs and cells other than their naturally occurring localized sites.
  • examples include techniques for modifying liposomes by changing their composition in order to achieve distribution in different types.
  • compositions and formulations for topical administration include transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, lozenges, suppositories, sprays, liquids, and powders.
  • Examples 1 to 52 and Reference Examples 1 to 3 This compound was synthesized using the phosphoramidite method (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984), Nature Communications 6, Article number: 6317 (2015)). Specific sequences and structures are listed in Tables 1-1 to 1-10.
  • the compounds of Examples 1 to 17, Examples 48 to 52, Reference Example 2, and Reference Example 3 are siRNAs that target mRNA for the gene encoding human transferrin receptor 2 (TfR2). It is. Furthermore, the compounds of Examples 1 to 4 and Reference Example 2 are located at positions 1536 to 1554 in the base sequence of human TfR2 (hTfR2) mRNA shown in SEQ ID NO: 1, and the compounds of Examples 5 to 17 and Reference Example 3 are located at positions 2847 to 2865.
  • Example 48 TfR2-019.94DUG.s1 and Example 49 (TfR2-019.94DUG.s2) have the 3' end of the antisense strand region in the compound of Example 16 (TfR2-019.94DUG). siRNA in which each overhang structure is one nucleotide or is absent.
  • the compounds of Example 50 TfR2-019.94DUG.e1) and Example 51 (TfR2-019.94DUG.e2) have the target sequence of the compound of Example 16 (TfR2-019.94DUG) on the 5' end side.
  • Sequences each having a length of 1 or 2 nucleotides were used as target sequences, and the lengths of the complementary regions were 20 bp and 21 bp, respectively. It is a certain siRNA.
  • the compound of Example 52 (TfR2-019.94DUG.e3) has the overhang structure of the 3' end of the antisense strand region in the compound of Example 16 (TfR2-019.94DUG) as G(M)U(M). This is siRNA.
  • the "2'-O-methyl nucleoside” portion was synthesized using the phosphoramidite described in Nucleic Acids Research 17, 3373 (1989).
  • the "DNA” portion was synthesized using the phosphoramidite described in Nucleic Acids Research 11, 4539 (1984).
  • the 5'-position of the 5'-terminal nucleotide and the 3'-position of the 3'-terminal nucleotide of each oligonucleotide are hydrogen atoms, as shown in the structural diagram of each nucleoside described above. It is a hydroxyl group bonded to the oxygen atom inside. However, if "GN" is the terminal, no hydrogen atom bond is required.
  • Test Example 1 Screening of TfR2 siRNA on HepG2 cells by reverse transfection method siRNA was screened as follows by reverse transfection method. On the day of transfection, 2 wells of siRNA samples per type, 2 wells of negative control (NT) using distilled water instead of siRNA, and siRNA against hTfR2, which is the compound of Reference Example 2 or 3, as a positive control. A chemically modified compound (TfR2-039.23DUG or TfR2-019.22DUG) was prepared in two wells.
  • HepG2 cells (2 x 10 ⁇ 4 cells/mL) prepared using DMEM containing 10% FBS pre-warmed to 37°C were seeded at 80 ⁇ L per well.
  • the final concentration of siRNA was adjusted to a 10-fold or 50-fold common ratio from 10 nM.
  • cDNA was synthesized by performing RNA extraction and reverse transcription reaction according to the protocol of the kit. Using the obtained cDNA, the amount of endogenous hTfR2 mRNA expression was measured by quantitative PCR. As a housekeeping gene, the mRNA expression level of h18S was measured.
  • Quantitative PCR was performed as follows using IDT Prime Time Gene Expression Master Mix (manufactured by Integrated DNA Technologies). The obtained cDNA was used as a stock solution. Per well of a 384-well PCR plate (manufactured by Applied Biosystems), 5 ⁇ L of IDT Prime Time Gene Expression Master Mix, 0.25 ⁇ L of hTfR2 primer (Hs.PT.58.20599 434, Integrated DNA Technologies) or 0. Mix 25 ⁇ L of h18S primer (Hs.PT.39a.22214856.g, Integrated DNA Technologies), 2.75 ⁇ L of distilled water, and 2 ⁇ L of cDNA (10 ⁇ L in total), and add 2 wells for each cDNA.
  • Test Example 1-1 hTfR2 knockdown activity using HepG2 cells Evaluation of hTfR2 mRNA expression level 2 days after introducing siRNA into HepG2 cells using the reverse transfection method in the same manner as Test Example 1 I did it.
  • TfR2-019 and TfR2-019.94DUG were used as siRNA.
  • TfR2-019 is a double-stranded oligonucleotide consisting of a sense strand region and an antisense strand region, each of which is an independent oligonucleotide, and the complementary regions of the sense strand region and antisense strand region are all naturally occurring oligonucleotides.
  • the relative hTfR2 mRNA expression level of the specimen treated with each siRNA was calculated and expressed as a relative value when the hTfR2 mRNA expression level in the negative control (NT) was set as 1.0. The results are shown in FIG.
  • the mRNA expression levels of mTfR2 and h18S were measured as the average value between 2 wells.
  • the mRNA expression level of mTfR2 was normalized with the mRNA expression level of h18S, a housekeeping gene.
  • the relative mTfR2 mRNA expression levels of the samples treated with each siRNA were calculated as relative values when the mTfR2 mRNA expression level in the negative control was set to 1.0, and are shown in Tables 5 to 8, respectively.
  • Test Example 3 Pharmaceutical efficacy evaluation test of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA in normal mice TfR2 siRNA conjugated with GalNAc is known to increase plasma iron concentration in normal mice (WO2012/177921), and therefore, this document The compound of Reference Example 1 (AD47882.23DUG) and the compounds of Examples 18 to 25 (AD47882 The following tests were conducted using .41DUG to 48DUG).
  • mouse ⁇ -actin (mActb) primer (Mm.PT.39a.22214843.g, manufactured by Integrated DNA Technologies) was used, mixed in the proportions described above, and Two wells were prepared and quantitative PCR was performed.
  • the mRNA amounts of mTfR2 and mActb were measured as the average value between two wells.
  • the mRNA expression level of mTfR2 was normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene.
  • the relative mRNA amount in the siRNA treatment group was calculated and expressed as a relative value when the mRNA amount in the vehicle group was set to 1.0 (mean value ⁇ standard error).
  • the results of the mTfR2 mRNA expression level are shown in FIG. 9F.
  • Test Example 9 Drug efficacy evaluation test of GalNAc conjugate TfR2 siRNA in human TfR2-expressing mice Using male or female TfR2 humanized mice having the human TfR2 gene locus, which were created at Special Immunology Research Institute Co., Ltd., In order to verify the effect of GalNAc-conjugated TfR2 siRNA, the following experiment was performed. As TfR2 siRNA conjugated with GalNAc, TfR2-019.88DUG (Example 9), TfR2-019.92DUG (Example 14), TfR2-019.93DUG (Example 15), TfR2-019.94DUG (Example 16) was used.
  • mice Seven days after the start of drug treatment, the mice were euthanized by exsanguination under isoflurane anesthesia, the livers were collected, and the amount of hTfR2 mRNA expression was measured. RNA extraction and quantitative PCR were performed as described in Test Example 5. The mRNA expression level of hTfR2 was normalized with the mRNA expression level of mActb, a housekeeping gene. The primers for hTfR2 described in Test Examples 1 and 2 were used. The results of hTfR2 mRNA expression level are shown in FIG. 13. Relative mRNA amounts in other groups were calculated and expressed as relative values when the mRNA amount in the vehicle group was set to 1.0 (mean value ⁇ standard error).

Abstract

ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する新規な化学修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドを提供すること。 センス鎖領域が３'－修飾ヌクレオシドを配した所定の修飾パターンを有し、アンチセンス鎖領域が所定の領域においてＤＮＡ、ＲＮＡ、２'－Ｏ，４'－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２'－ＭＯＥ　ＲＮＡなどを適宜組み合わせた修飾パターンを有するオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩を提供する。

Description

ＲＮＡｉ活性を有する化学修飾オリゴヌクレオチド
　本発明はＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する化学修飾されたヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドの使用、該オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現抑制方法、該オリゴヌクレオチドを含有する医薬等に関する。
　細胞、組織、あるいは個体内の標的遺伝子の発現を阻害する方法として、当該細胞、組織、あるいは個体内に２本鎖ＲＮＡを導入する手法がある。２本鎖ＲＮＡの導入によって、その配列に相同性を持つｍＲＮＡが分解され、標的遺伝子の発現が阻害される。この効果は「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」と呼ばれている。３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれ２１ヌクレオチドからなる２本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）は、脊椎動物の培養細胞において、ＲＮＡ干渉作用を有することが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
　ｓｉＲＮＡは遺伝子機能の同定、有用物質生産に適した細胞株のスクリーニング、疾患に関与する遺伝子の制御等に有用であるが、ＲＮＡ分解酵素によって容易に分解されるため、体内での活性持続が難しい、合成コストが高額になるという欠点を有する。そのため、ＲＮＡ分解酵素に対する安定性が高く、安価に製造できる、ＲＮＡｉ活性を保持したオリゴヌクレオチドの開発のために、様々な化学修飾が試みられてきた。
　オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のリン酸基の非架橋酸素原子を硫黄原子に置き換えたホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、ヌクレアーゼに耐性になることが知られている。しかしながら、オリゴヌクレオチド中のＰＳ結合の数を増やすと２本鎖ＲＮＡの熱力学的不安定化及び非特異的なタンパク質との結合が起きるので好ましくないと報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。
　天然型のＲＮＡを修飾ＲＮＡに置換することによって安定なｓｉＲＮＡを取得する試みもなされている。例えば、ＲＮＡの２’－ＯＨ基をアルキル化しＲＮａｓｅの基質にならないようにした２’－Ｏ－アルキルヌクレオシドとした数多くの誘導体が報告されている。２’－Ｏ－メチルヌクレオチドはｔＲＮＡの中にも見られる天然に存在する修飾ヌクレオチドで、アンチセンス研究の初期の頃から研究されている（例えば、非特許文献３参照。）。
　ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方、または両方を２’－Ｏ－メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が減弱又は完全に失われるとの報告がある（例えば、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７など参照。）。また、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを３つ連続して導入するとセンス鎖への導入では活性低下が見られないが、アンチセンス鎖への導入では活性低下が認められ、特にセンス鎖の５’末端に導入した場合に著しく活性が低下することが報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。
　人工的に合成された修飾ＲＮＡである、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド（２’－Ｆ、または、２’－Ｆ　ＲＮＡ）を有するオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドと同じＮ型配座を優先して形成し、ＲＮＡとの親和性が高くなるが、リン酸ジエステル結合からなるものはヌクレアーゼ抵抗性がないので、ホスホロチオエート結合とし、ヌクレアーゼ抵抗性を持たせる必要がある（例えば、非特許文献９参照。）。
　ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）は、ヌクレアーゼに対する安定性を有している修飾核酸であるが、ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖の一方または両方の３’末端のオーバーハング部位の２個のヌクレオチドにＥＮＡを導入した場合、ＲＮＡｉ活性が低下することが報告されている（例えば、非特許文献１０参照）。
　複数の修飾核酸を組み合わせたｓｉＲＮＡについては多くの報告がある。例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドと２’－Ｆを１つおきにｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖に導入し、未修飾ｓｉＲＮＡと比較して同程度以上のＲＮＡｉ活性が得られ、血清中で比較的安定に保たれることが報告されている（例えば、非特許文献１１参照。）。
　ＤＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、及び、２’－Ｆを組み合わせた２本鎖オリゴヌクレオチドが報告されており、特にアンチセンス鎖の５’末端から１４番目が２’－ＦであるｓｉＲＮＡが報告されている（例えば、特許文献１、２参照。）。また、ＤＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、及び、ＬＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）を組み合わせた２本鎖オリゴヌクレオチドが報告されており、特にアンチセンス鎖の５’末端から２番目、あるいは、１４番目が２’－Ｆ、ＤＮＡ、あるいは、ＬＮＡであるｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性が報告されている（例えば、特許文献１、特許文献３参照。）。
国際公開第２０１２／０５８２１０号パンフレット 国際公開第２０１３／０７４９７４号パンフレット及び米国特許第ＵＳ９，３９９，７７５号公報、米国特許第ＵＳ９，７９６，９７４号公報 国際公開第２０１６／０２８６４９号パンフレット、米国特許第ＵＳ１０，６１２，０２４号公報
Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４－４９８ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、　２０００年、第１０巻、ｐ．１１７－１２１ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８７年、第１５巻、ｐ．６１３１－６１４８ ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ、２００１年、第２０巻、ｐ．６８７７－６８８８ ＲＮＡ、第９巻、２００３年、ｐ．１０３４－１０４８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第４２巻、ｐ．７９６７－７９７５ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第３１巻、ｐ．２７０５－２７１６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年、第４８巻、ｐ．４２４７－４２５３ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３年、第３６巻、　ｐ．８３１－８４１ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００２年、　第１２巻、ｐ．３０１－３０９ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、２００５年、第４８巻、ｐ．９０１－９０４
　本発明の一つの課題は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用（これらの作用をノックダウン作用ということもある。）を有する新規な化学修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドを提供することである。先行技術において、修飾核酸を採用したｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉作用が減弱又は消失する場合があることが数多く報告されている。そのため、医薬品に適用するために体内での安定性と薬理活性を併せ持つ、新規な修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドが求められていた。
　本発明者らは、ＲＮＡ分解酵素に安定なＲＮＡ干渉作用を有するオリゴヌクレオチドを取得すべく、鋭意研究を行ったところ、ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、３’－Ｏ－メチルＲＮＡを適宜組み合わせたオリゴヌクレオチドユニットを有する、オリゴヌクレオチドが上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下を提供する。
［１］　センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域を含むオリゴヌクレオチドであって、
前記センス鎖領域が以下の式（Ｉ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、前記アンチセンス鎖領域が以下の式（ＩＩ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、さらに以下の（ａ）乃至（ｇ）に示される特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩：
センス鎖領域：５’　ＳＯ５－Ｓａ－Ｓ１９－Ｓ１８－Ｓ１７－Ｓ１６－Ｓ１５－Ｓ１４
－Ｓ１３－Ｓ１２－Ｓ１１－Ｓ１０－Ｓ９－Ｓ８－Ｓ７－Ｓ６－Ｓ５－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ２
－Ｓ１－ＳＯ３　３’（Ｉ）
アンチセンス鎖領域：５’　ＡＯ５－Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９－Ａ１０－Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５－Ａ１６－Ａ１７－Ａ１８－
Ａ１９－Ａａ－ＡＯ３　３’（ＩＩ）
（ａ）Ｓ１は３’－修飾ヌクレオシドであり、Ｓ２～Ｓ１９は１個のヌクレオシドを示し、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡであり、Ｓａは０～５個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、ＳＯ３及びＳＯ５はそれぞれ独立して、０～５個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドを示す。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
（ｂ）Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５は１個のヌクレオシドを示し、そのうち少なくとも１つはＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＭＯＥ　ＲＮＡであり、それ以外は２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ又は２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１～Ａ１０及びＡ１６～Ａ１９は１個のヌクレオシドを示し、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、Ａａは０～５個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、ＡＯ３及びＡＯ５はそれぞれ独立して、０～５個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドを示す。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
（ｃ）Ａ２～Ａａの間のヌクレオチド配列は、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列からなり、Ａ１は標的配列の対応するヌクレオシドと相補的な塩基を有するヌクレオシド、アデニンを有するヌクレオシド、チミンを有するヌクレオシド、又はウラシルを有するヌクレオシドであり、ＡＯ３とＡＯ５が存在する場合、そのヌクレオチド配列は、それぞれ独立して、標的配列の対応するヌクレオシドとは独立に選択されるヌクレオチド配列である；
（ｄ）Ｓ１～Ｓａの間のヌクレオチド配列と、Ａ１～Ａａの間のヌクレオチド配列とは、互いに実質的に相補的なヌクレオチド配列であり、かつ、２本鎖構造を形成している；
（ｅ）ＳＯ５とＡＯ３の両方が存在する場合、ＳＯ５及びＡＯ３は、互いに相補的ではないヌクレオチド配列である；
（ｆ）ＳＯ３とＡＯ５の両方が存在する場合、ＳＯ３及びＡＯ５は、互いに相補的ではないヌクレオチド配列である；並びに、
（ｇ）センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の、５’末端のヌクレオシドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオシドの３’位もしくは３’末端のヌクレオシドが３’－修飾ヌクレオシドである場合はその２’位、が化学修飾されていてもよい。
［２］　式（ＩＩ）において、Ｓ１が３’－ＯＭｅ　ＲＮＡである［１］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［３］　センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域が、それぞれ独立したオリゴヌクレオチドとして２本鎖オリゴヌクレオチドを形成している、［１］又は［２］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［４］　２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡ又はＥＮＡである、［１］～［３］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［５］　式（ＩＩ）において、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５の２つ以上同一又はそれぞれ異なっていてもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＭＯＥ　ＲＮＡである［１］～［４］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［６］　式（ＩＩ）において、Ａ１４がＲＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドである、［５］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［７］　式（ＩＩ）において、Ａ１３が２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＯＭｅ　ＲＮＡであり、Ａ１４がＲＮＡである、［６］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［８］　式（ＩＩ）において、Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５が以下のいずれか；
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、又は、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
である、［７］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［９］　式（ＩＩ）において、Ａ１２がＤＮＡであり、Ａ１４が２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドである、［６］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１０］　式（ＩＩ）において、Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５が以下のいずれか；
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、又は、
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
である、［９］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１１］　式（ＩＩ）において、Ａ２、Ａ６及びＡ１６が２’－Ｆ　ＲＮＡである、［１］～［１０］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１２］　式（ＩＩ）において、更に、Ａ８、Ａ９及びＡ１０からなる群から選択される１又は２個のヌクレオシドが２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１、Ａ３～Ａ５、Ａ７、Ａ１７～Ａ１９及びＡａのヌクレオシドが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである、［１１］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１３］　式（ＩＩ）において、Ａ２、Ａ６、Ａ８、Ａ１０及びＡ１６が２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１、Ａ３～Ａ５、Ａ７、Ａ９、Ａ１７～Ａ１９及びＡａのヌクレオシドが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである、［１２］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１４］　式（Ｉ）において、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３及びＳ１５が２’－Ｆ　ＲＮＡである［１］～［１３］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１５］　式（Ｉ）において、Ｓ２～Ｓ１０、Ｓ１４、Ｓ１６～Ｓ１９及びＳａが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである［１４］のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１６］　式（ＩＩ）においてＲＮＡが採用される場合、当該ＲＮＡとその３’側に隣接するヌクレオシドとの間の結合がホスホロチオエート結合であることを特徴とする、［１］～［１５］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１７］　前記オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端から２～５ヌクレオチドにおいて、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であることを特徴とする、［１］～［１６］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１８］　ＳＯ３、ＳＯ５、ＡＯ５及びＡＯ３のヌクレオシド数が０～２である、［１］～［１７］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［１９］　ＳＯ３のヌクレオシド数が０である、［１８］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２０］　ＳＯ３、ＳＯ５及びＡＯ５のヌクレオシド数が０であり、ＡＯ３のヌクレオシド数が２である、［１９］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２１］　オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオシドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオシドの３’位もしくは３’末端のヌクレオシドが３’－修飾ヌクレオシドである場合はその２’位、の化学修飾が、目的組織への輸送用ユニットである、［１］～［２０］のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２２］　目的組織への輸送用ユニットが、ＧａｌＮＡｃユニット又は脂肪酸ユニットである、［２１］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
［２３］　ＧａｌＮＡｃユニットが、
（式中、破線は隣接するヌクレオチドの５’末端のリン酸基及び／又は３’末端のリン酸基（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位のリン酸基）とリン酸ジエステル結合することを表す。）
で表されるユニットであることを特徴とする、［２２］に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
　本発明により、動物体内で持続的にＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する、新規な修飾パターンのオリゴヌクレオチドが提供される。当該修飾パターンは、複数の標的配列に対するオリゴヌクレオチドに適用して、同様の効果が確認されたため、該オリゴヌクレオチドを用いて各種遺伝子の機能解析が可能になり、また、該オリゴヌクレオチドを含む多様な疾患に対する医薬品が提供される。
[規則91に基づく訂正 03.04.2023]
２本鎖ｓｉＲＮＡの修飾パターンを示す図である。図中、黒丸は２’－Ｏ－メチルＲＮＡを表し、白丸は２’－デオキシ－２’－フルオロＲＮＡを表し、黒三角形はＤＮＡを表し、白三角形は３’－Ｏ－メチルＲＮＡを表し、白ひし形はＥＮＡを表し、黒ひし形はＲＮＡを表し、縦の棒が入った白丸はＬＮＡを表し、横の棒が入った白丸は２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡを表し、マークとマークを繋ぐ線はリン酸ジエステル結合を表し、マークとマークを繋ぐ線に「ｓ」が記載されている場合はホスホロチオエート結合を表す。図中、上部の鎖はセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）を表し、センス鎖の左側の末端が５’末端、右側の末端が３’末端を表す。下部の鎖はアンチセンス鎖（またはガイド鎖）を表し、アンチセンス鎖の右側の末端が５’末端、左側の末端が３’末端を表す。各ｓｉＲＮＡは、ＮＮＮ－ｘｘｘで表し、ＮＮＮ－ｘｘｘの後に記載されている数字とアルファベットは、図１乃至６に記載の修飾パターンの略号を示す。 ２本鎖ｓｉＲＮＡにおけるアンチセンス鎖のＡ１４がＤＮＡ又はＲＮＡの場合の修飾パターンを示す図である。各記号、配置、修飾などは、図1と同じ様式で表示される。 ２本鎖ｓｉＲＮＡにおける、アンチセンス鎖のＡ８及びＡ９が２’－デオキシ－２’－フルオロＲＮＡの場合の修飾パターンを示す図である。各記号、配置、修飾などは、図1と同じ様式で表示される。 ２本鎖ｓｉＲＮＡにおける、アンチセンス鎖のＡ１４がＥＮＡの場合の修飾パターンを示す図である。各記号、配置、修飾などは、図1と同じ様式で表示される。 ２本鎖ｓｉＲＮＡにおける、アンチセンス鎖のＡ８及びＡ９が２’－デオキシ－２’－フルオロＲＮＡ、かつ、アンチセンス鎖のＡ１３がＥＮＡの場合の修飾パターンを示す図である。各記号、配置、修飾などは、図1と同じ様式で表示される。 ２本鎖ｓｉＲＮＡにおける、アンチセンス鎖のＡ８が２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、及びＡ９が２’－デオキシ－２’－フルオロＲＮＡの場合の修飾パターンを示す図である。各記号、配置、修飾などは、図1と同じ様式で表示される。 正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による血漿中鉄濃度の推移を示す図である。 図８Ａは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置前（Ｄａｙ０）の血漿中鉄濃度を示す図である。図８Ｂは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置７日後（Ｄａｙ７）の血漿中鉄濃度を示す図である。図８Ｃは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置１２日後（Ｄａｙ１２）の血漿中鉄濃度を示す図である。図８Ｄは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置２１日後（Ｄａｙ２１）の血漿中鉄濃度を示す図である。図８Ｅは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置２８日後（Ｄａｙ２８）の血漿中鉄濃度を示す図である。 図９Ａは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置前（Ｄａｙ０）の血漿中鉄濃度を示す図である。図９Ｂは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置７日後（Ｄａｙ７）の血漿中鉄濃度を示す図である。図９Ｃは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置１４日後（Ｄａｙ１４）の血漿中鉄濃度を示す図である。図９Ｄは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置２１日後（Ｄａｙ２１）の血漿中鉄濃度を示す図である。図９Ｅは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置２８日後（Ｄａｙ２８）の血漿中鉄濃度を示す図である。図９Ｆは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置２８日後における肝臓ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 図１０Ａは、炎症に伴う貧血モデルにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による血漿中鉄濃度を示す図である。図１０Ｂは、炎症に伴う貧血モデルにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＨＧＢ値を示す図である。図１０Ｃは、炎症に伴う貧血モデルにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＭＣＨ値を示す図である。図１０Ｄは、炎症に伴う貧血モデルにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によるＲＢＣ数を示す図である。図１０Ｅは、炎症に伴う貧血モデルにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置による肝臓ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 ＨｅｐＧ２細胞におけるｓｉＲＮＡのｈＴｆＲ２ノックダウン活性を示す図である。 図１２Ａは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置前（Ｄａｙ０）の血漿中鉄濃度を示す図である。図１２Ｂは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置９日後（Ｄａｙ９）の血漿中鉄濃度を示す図である。図１２Ｃは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置１４日後（Ｄａｙ１４）の血漿中鉄濃度を示す図である。図１２Ｄは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置２１日後（Ｄａｙ２１）の血漿中鉄濃度を示す図である。図１２Ｅは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置２８日後（Ｄａｙ２８）の血漿中鉄濃度を示す図である。図１２Ｆは、正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置２８日後における肝臓ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 ｈＴｆＲ２　Ｔｇマウスにおける、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを処置して７日後における肝臓ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を示す図である。 ヒトトランスフェリン受容体２（ｈＴｆＲ２）をコードする遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１）を示す図である。下線の配列（２８４７～２８６５番目の配列）はＴｆＲ２－０１９の標的配列を示し、二重下線の配列（１５３６～１５５４番目の配列）はＴｆＲ２－０３９の標的配列を示す。 図１４－１の続きを示す図である。
　＜１．用語の説明＞
　本明細書において、「標的遺伝子」とは、これを導入する細胞、組織、あるいは固体（以下これを「被導入体」と称することがある。）においてＲＮＡであれば特に制限されず、タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡであってもタンパク質に翻訳されないノンコーディングＲＮＡであってもよい。ノンコーディングＲＮＡとしては、機能性ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの非翻訳領域、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ型ｎｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ－ｌｉｋｅｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、長鎖ｎｃＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）等が挙げられる。具体的には、導入する被導入体に内在性のものでも、遺伝子導入等の手法によって導入される外来性のものでもよい。また、染色体上に存在する遺伝子でも、染色体外のものでもよい。外来性の遺伝子としては、例えば、被導入体に感染可能なウイルス、バクテリア、真菌又は原生動物由来のものが挙げられるがこれらに制限されない。遺伝子の機能については既知のものでも未知のものでもよい。
　そのような標的遺伝子の例としては、特定の疾患を有する患者において特異的に発現が上昇している及び／又は特異的に変異している遺伝子を挙げることができ、疾患としては、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症、高コレステロール血症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患など）、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、貧血（例えば、慢性疾患に伴う貧血、鉄不応性鉄欠乏性貧血等）、加齢性黄斑変性症、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、線維症（肺線維症、肝線維症、腎線維症、骨髄線維症等）を挙げることができ、これらの疾患の原因遺伝子としては、例えば、ｋｉｎｅｓｉｎ　ｓｐｉｎｄｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＫＳＰ）、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，　（ＶＥＧＦ）、ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ　（ＴＴＲ）、ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｎ／ｋｅｘｉｎ　ｔｙｐｅ　９（ＰＣＳＫ９）、ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅ（ＰＬＫ）、ＡｐｏＢ－１００、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｍ２　ｓｕｂｕｎｉｔ　（ＲＲＭ２）、ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２７（Ｈｓｐ２７）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ－４Ｅ　（ｅＩＦ－４Ｅ）、ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１（ＩＣＡＭ－１）、ａｌｐｈａ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　４　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　（ＩＬ－４Ｒ－ａｌｐｈａ）、Ｆａｃｔｏｒ　ＸＩ、　Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ、Ｎ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、Ｋ－ｒａｓ、ｂｃｌ－２、ｂｃｌ－ｘＬ、Ｈｅｒ－１、Ｈｅｒ－２、Ｈｅｒ－３、Ｈｅｒ－４、ＭＤＲ－１、ヒトβ－カテニン遺伝子、ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ　（Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｓｐ）　ｂｏｘ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　３，　Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ）、Ｍｙｅｌｏｉｄ　Ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　１（ＭＣＬ１）遺伝子、ＰＫＲ（Ｅｉｆ２ａｋ２）、Ｈｓｐ４７（Ｓｅｒｐｉｎｈ１）、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｄｕｃｅｒ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ(ＳＴＡＴ３)を挙げることが出来るがこれらに限定されない。
　本明細書において、核酸又は核酸分子とは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドの総称である。
　「ヌクレオシド」とは、遺伝情報に重要な塩基部分と分子の物理化学的性質に重要な糖部分が結合した化学構造部分を意味する。
　「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分の３’位（３’位が修飾されている場合は２’位）の水酸基がリン酸基とエステルを形成している化合物である。
　「オリゴヌクレオチド」とは、２以上のヌクレオチドがその中の１つのヌクレオチドのリン酸基部分と別のヌクレオチドの糖部分の５’位の水酸基が結合した構造（リン酸ジエステル結合）から構成されるオリゴマーのことをいう。但し、３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）、及び/又は、５’末端のヌクレオチドの５’位は、水酸基であってもリン酸基であってもよく、それらが化学修飾された構造であってもよい。また、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合は化学修飾されていてもよい。本明細書においては、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドとは同一の意味で用いている。
　核酸の塩基部分は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、チミン（Ｔ）であり、ＡとＵ又はＴ、ＧとＣは、それぞれ水素結合によりワトソン－クリック塩基対を形成し、塩基対を形成する関係にある塩基同士の関係を「相補的」という。それぞれの塩基部分は化学修飾される場合があるが、修飾された塩基であっても、通常は元の塩基と同じ塩基対形成能を示す場合もある。代表的な修飾塩基としては、５－メチルシトシン（５Ｃ）、５－メチルウラシル（５Ｕ）等が知られており、５ＵはＴと同一の構造である。本明細書に添付する配列表において、５ＣはＣとして、５ＵはＴ又はＵとして表示される。
　本明細書において、核酸の標記方法は、「塩基の記号（糖部分の記号）」として表示される場合がある。糖部分の記号については、以下の各種ヌクレオシドの記載箇所で説明される。
　本明細書において、オリゴヌクレオチドの「修飾パターン」とは、特に言及がない限り、塩基の配列とは無関係に、オリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオシドの糖部分の修飾様式の配置を意味する。また、特に言及された場合、更に各ヌクレオシド間の結合様式と組み合わせた修飾パターンを意味する。糖部分の構造やヌクレオシド間結合は、標的配列に依存せず、分子としての安定性や、その安定性に起因する結合性能に影響を与える要素であることから、ある標的配列に対して確認された修飾パターンによる作用効果が、別の標的配列に対して同じ修飾パターンを適用した場合にも同様の作用効果が示される蓋然性が高いとされている（例えば、Mol Ther. (2018) 26:708-717を参照）。
　本明細書において、「天然型のヌクレオシド」とは、２’－デオキシヌクレオシド又はリボヌクレオシドである。各塩基に対応する２’－デオキシヌクレオシド（「ＤＮＡ」ともいう。糖部分を表す記号は（Ｄ）であり、塩基部分の小文字標記で表す場合もある。）は以下の式で表される構造を有し、２’－デオキシアデノシンはＡ（Ｄ）またはａ、２’－デオキシグアノシンはＧ（Ｄ）またはｇ、２’－デオキシシチジンはＣ（Ｄ）またはｃ、チミジンはＴ（Ｄ）またはｔ、２’－デオキシ－５－メチルシチジンは５Ｃ（Ｄ）または５ｃ、２’－デオキシウリジンはＵ（Ｄ）またはｕ、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない２’－デオキシヌクレオシドはＮ（Ｄ）と表記する場合がある。
　（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　各塩基に対応するリボヌクレオシド（「ＲＮＡ」ともいう。糖部分を表す記号は（Ｒ）であり、塩基部分の大文字標記で表す場合もある。）は以下の式で表される構造を有し、アデノシンはＡ（Ｒ）またはＡ、グアノシンはＧ（Ｒ）またはＧ、シチジンはＣ（Ｒ）またはＣ、ウリジンはＵ（Ｒ）またはＵ、と表記する場合もある。また、塩基を特定しないリボヌクレオシドはＮ（Ｒ）と表記する場合がある。
　（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　本明細書において、「修飾ヌクレオシド」及び「修飾ヌクレオチド」とは、天然のヌクレオシドの塩基部分、糖部分又はリン酸ジエステル部分に少なくとも一つの化学修飾された構造を含むヌクレオシド又はヌクレオチドを意味する。
　本明細書において、「化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合」とは、天然のヌクレオシド間結合に採用されるリン酸ジエステル結合、又は化学修飾されたリン酸ジエステル結合を意味する。天然のヌクレオシド間結合は、下記式（P）で表されるリン酸ジエステル結合であり、塩基配列の表示においてはヌクレオシドの間に文字および記号を挟まずに表示される。また、本明細書において、「化学修飾されたリン酸ジエステル結合」とは、リン酸ジエステル結合に含まれるリン原子が化学修飾された結合様式を意味する。化学修飾されたリン酸ジエステル結合の例としては、下記式（ＰＳ）で表されるホスホロチオエート結合、リン原子に窒素原子が付加した修飾結合であるホスホロアミデート結合、リン原子に置換可能なアルキル基が付加した修飾結合であるアルキルホスホネート結合（例えば、メチル基の場合は、メチルホスホネート結合となる）、リン酸基の非共有結合の酸素原子に置換可能なアルキル基が付加した修飾結合であるリン酸トリエステル結合が挙げられる。ホスホロチオエート結合が採用される場合、塩基配列の表示においてはヌクレオシドの間に「＾」が表示される。
（上記各式中、破線は結合手を示し、一方の結合手は５’側に隣接するヌクレオシドの３’-水酸基の酸素原子（３’位が修飾されたヌクレオシドでは２’位の酸素原子）または隣接する構造ユニットとエステル結合することを表し、他方の結合手は３’側に隣接するヌクレオシドの５’-水酸基の酸素原子または構造ユニットとエステル結合することを表す。）
　本明細書において、「糖修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドの糖部分が修飾されているヌクレオシドをいう。糖修飾ヌクレオシドには、本発明の属する技術分野で知られている糖修飾の全ての様式を含む。糖修飾ヌクレオシドの例としては、２’－修飾ヌクレオシド、３’－修飾ヌクレオシド、４’－チオ修飾ヌクレオシド、４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシド及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドなどが挙げられる。好ましい糖修飾としては、２’－Ｏ－アルキル化（メチル化、エチル化、プロピル化、イソプロピル化、ブチル化など）、２’－Ｏ－アルコキシアルキル化（メトキシエチル化、メトキシプロピル化、メトキシブチル化など）、２’－ハロゲン化（クロロ化、フルオロ化など）、３’－Ｏ－アルキル化（メチル化、エチル化、プロピル化、イソプロピル化、ブチル化など）、３’－Ｏ－アルコキシアルキル化（メトキシエチル化、メトキシプロピル化、メトキシブチル化など）、３’－ハロゲン化（クロロ化、フルオロ化など）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化（アルキレン化架橋等）などが例示される。
　本明細書において、「２’－修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドに含まれるリボフラノースの２’位が化学修飾されたヌクレオシドをいう。そのような修飾の例としては、例えば、２’－Ｏ－アルキル化（メチル化、エチル化、プロピル化、イソプロピル化、ブチル化など）ヌクレオシド、２’－Ｏ－アルコキシアルキル化（メトキシエチル化、メトキシプロピル化、メトキシブチルなど）ヌクレオシド、２’－ハロゲン化（クロロ化、フルオロ化など）ヌクレオシド、２’－アリル化ヌクレオシド、２’－アミノ化ヌクレオシド、２’－アジド化ヌクレオシド、２’－Ｏ－アリル化ヌクレオシド、２’－ＯＣＦ３ヌクレオシド、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３ヌクレオシド、２’－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）ヌクレオシド、又は２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）ヌクレオシド（各ＲｍとＲｎは個別にＨ、アミノ保護基、又は置換あるいは非置換Ｃ１－Ｃ１０アルキルである）等を例示することができる。好ましい２’－修飾ヌクレオシドは、２’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシド、２’－Ｏ－アルコキシアルキル化ヌクレオシド、又は２’－ハロゲン化ヌクレオシドである。
　糖修飾ヌクレオシドのうち、２’－Ｏ－アルキル化修飾の例としては、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオシド（「２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ」又は「２’－ Ｏ－メチルＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（Ｍ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した２’－Ｏ－メチルヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、２’－Ｏ－メチルアデノシンをＡ（Ｍ）、２’－Ｏ－メチルグアノシンをＧ（Ｍ）、２’－Ｏ－メチルシチジンをＣ（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル－５－メチルシチジンを５Ｃ（Ｍ）、２’－Ｏ－メチルウリジンをＵ（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジンをＴ（Ｍ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない２’－Ｏ－メチルヌクレオシドは、Ｎ（Ｍ）と表記する場合がある。
　（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　また、２’－Ｏ－アルコキシアルキル化修飾の例としては、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシド（「２’－ＭＯＥ　ＲＮＡ」、「２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ」又は「２’－メトキシエトキシＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（ｍ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシンをＡ（ｍ） 、２’－Ｏ－メトキシエチルグアノシンをＧ（ｍ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジンをＣ（ｍ）（塩基の構造は５Ｃだが、便宜上Ｃ（ｍ）と表示する。２’－Ｏ－メトキシエチルシチジンに置き換えて用いることもできる。）、２’－Ｏ－メトキシエチルウリジンをＵ（ｍ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジンをＴ（ｍ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドはＮ（ｍ）と表記する場合がある。
　（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　また、２’－ハロゲン化修飾の例としては、例えば、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド（「２’－Ｆ　ＲＮＡ」又は「２’－デオキシ－２’－フルオロＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（Ｆ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、２’－デオキシ－２’－フルオロアデノシンをＡ（Ｆ）、２’－デオキシ－２’－フルオログアノシンをＧ（Ｆ）、２’－デオキシ－２’－フルオロシチジンをＣ（Ｆ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－メチルシチジンを５ｍＣ（Ｆ）、２’－デオキシ－２’－フルオロウリジンをＵ（Ｆ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－メチルウリジンをＴ（Ｆ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシドはＮ（Ｆ）と表記する場合がある。
　（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　本明細書において、「３’－修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドに含まれるリボフラノースの３’位が化学修飾されたヌクレオシドをいう。３’－修飾ヌクレオシドにおける２’位の水酸基は修飾されていてもよい。そのような修飾の例としては、例えば、３’－Ｏ－アルキル化（メチル化、エチル化、プロピル化、イソプロピル化、ブチル化など）ヌクレオシド、３’－Ｏ－アルコキシアルキル化（メトキシエチル化、メトキシプロピル化、メトキシブチルなど）ヌクレオシド、３’－ハロゲン化（クロロ化、フルオロ化など）ヌクレオシド、３’－アリル化ヌクレオシド、３’－アミノ化ヌクレオシド、３’－アジド化ヌクレオシド、３’－Ｏ－アリル化ヌクレオシド、３’－ＯＣＦ３ヌクレオシド、３’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３ヌクレオシド、３’－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）ヌクレオシド、又は３’－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）ヌクレオシド（各ＲｍとＲｎは個別にＨ、アミノ保護基、又は置換あるいは非置換Ｃ１－Ｃ１０アルキルである）等を例示することができる。好ましい３’－修飾ヌクレオシドは、３’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシド、３’－Ｏ－アルコキシアルキル化ヌクレオシド、又は３’－ハロゲン化ヌクレオシドである。
　３’－修飾ヌクレオシドのうち、３’－Ｏ－アルキル化修飾の例としては、例えば、３’－Ｏ－メチルヌクレオシド（「３’－ＯＭｅ　ＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（３Ｍ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した３’－Ｏ－メチルヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、３’－Ｏ－メチルアデノシンをＡ（３Ｍ） 、３’－Ｏ－メチルグアノシンをＧ（３Ｍ）、３’－Ｏ－メチルシチジンをＣ（３Ｍ）、３’－Ｏ－メチル－５－メチルシチジンを５ｍＣ（３Ｍ）、３’－Ｏ－メチルウリジンをＵ（３Ｍ）、３’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジンをＴ（３Ｍ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない３’－Ｏ－メチルヌクレオシドはＮ（３Ｍ）と表記する場合がある。
　（上記各式中、破線は結合手を示す。）
また、３’－Ｏ－アルコキシアルキル化修飾の例としては、例えば、３’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシド（「３’－ＭＯＥ　ＲＮＡ」、「３’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ」又は「３’－メトキシエトキシＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（３ｍ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した３’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドは、各塩基に対応した３’－Ｏ－メチルヌクレオシドの上記構造図において、３’位の酸素原子に結合したメチル基に代わってメトキシエチル基が結合した構造を有する。各塩基に対応した３’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドは、３’－Ｏ－メトキシエチルアデノシンをＡ（３ｍ） 、３’－Ｏ－メトキシエチルグアノシンをＧ（３ｍ）、３’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジンをＣ（３ｍ）（塩基の構造は５Ｃだが、便宜上Ｃ（３ｍ）と表示する。３’－Ｏ－メトキシエチルシチジンに置き換えて用いることもできる。）、３’－Ｏ－メトキシエチルウリジンをＵ（３ｍ）、３’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジンをＴ（３ｍ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない３’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドはＮ（３ｍ）と表記する場合がある。
また、３’－ハロゲン化修飾の例としては、例えば、３’－デオキシ－３’－フルオロヌクレオシド（「３’－Ｆ　ＲＮＡ」又は「３’－デオキシ－３’－フルオロＲＮＡ」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（３Ｆ）である。）が挙げられる。各塩基に対応した３’－デオキシ－３’－フルオロヌクレオシドは、各塩基に対応した３’－Ｏ－メチルヌクレオシドの上記構造図において、３’位の炭素原子に結合したメトキシ基に代わってフッ素原子が結合した構造を有する。各塩基に対応した３’－デオキシ－３’－フルオロヌクレオシドは、３’－デオキシ－３’－フルオロアデノシンをＡ（３Ｆ）、３’－デオキシ－３’－フルオログアノシンをＧ（３Ｆ）、３’－デオキシ－３’－フルオロシチジンをＣ（３Ｆ）、３’－デオキシ－３’－フルオロ－５－メチルシチジンを５ｍＣ（３Ｆ）、３’－デオキシ－３’－フルオロウリジンをＵ（３Ｆ）、３’－デオキシ－３’－フルオロ－５－メチルウリジンをＴ（３Ｆ）と表すこともある。また、塩基を特定しない３’－デオキシ－３’－フルオロヌクレオシドはＮ（３Ｆ）と表記する場合がある。
　本明細書において、「４’－チオ修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドに含まれるリボフラノースの４’位の酸素原子が硫黄原子で置換されたヌクレオシドをいう。４’－チオ修飾ヌクレオシドの例としては、４’－酸素原子が硫黄原子で置換されたβ－Ｄ－リボヌクレオシドを挙げることができる（Ｈｏｓｈｉｋａ，Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．５７９，ｐ．３１１５－３１１８，（２００５）；　Ｄａｎｄｅ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９，　ｐ．１６２４－１６３４（２００６）；Ｈｏｓｈｉｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．　８，　ｐ．２１３３－２１３８，（２００７））。
　本明細書において、「４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドに含まれるリボフラノースの２’位が化学修飾され、かつ、リボフラノースの４’位の酸素原子が硫黄原子で置換されたヌクレオシドをいう。４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシドの例としては、２’－Ｈ、又は、２’－Ｏ－メチルを保持する４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシドを挙げることができる（Ｍａｔｓｕｇａｍｉ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　３６，　１８０５　（２００８））。
　糖修飾ヌクレオシドのうち、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾の例としては、例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋ヌクレオシド（「ＥＮＡ」、「ＥＮＡユニット」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（Ｅ）である。）（Ｍｏｒｉｔａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ．，　１２，　ｐ．７３（２００２）．；　Ｍｏｒｉｔａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　１１，ｐ．２２１１（２００３）．）が挙げられる。各塩基に対応した２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋ヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋アデノシンをＡ（Ｅ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋グアノシンをＧ（Ｅ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋－５－メチルシチジンをＣ（Ｅ）（塩基の構造は５Ｃだが、便宜上Ｃ（Ｅ）と表示する。２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋シチジンに置き換えて用いることもできる。）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋ウリジンをＵ（Ｅ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋－５－メチルウリジンをＴ（Ｅ）、と表記する場合もある。また、塩基を特定しない２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋ヌクレオシドはＮ（Ｅ）と表記する場合がある。
　（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　また、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾の別の例としては、例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋ヌクレオシド（「ＬＮＡ」、「ＬＮＡユニット」と表示する場合もある。糖部分を表す記号は（Ｌ）である。）（Ｏｂｉｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　３８，　ｐ．８７３５－　（１９９７）．；　Ｏｂｉｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　３９，　ｐ．５４０１－　（１９９８）．；　Ａ．　Ａ．　Ｋｏｓｈｋｉｎ，　Ａ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，　５４，　ｐ．３６０７（１９９８）．；　Ｏｂｉｋａ，　Ｓ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　９，ｐ．１００１（２００１）．）が挙げられる。各塩基に対応した２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋ヌクレオシドは、以下の式で表される構造を有し、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋アデノシンをＡ（Ｌ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋グアノシンをＧ（Ｌ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋－５－メチルシチジンをＣ（Ｌ）（塩基の構造は５Ｃだが、便宜上Ｃ（Ｌ）と表示する。２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋シチジンに置き換えて用いることもできる。）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋ウリジンをＵ（Ｌ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋－５－メチルウリジンをＴ（Ｌ）と表すこともある。また、塩基を特定しない２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋ヌクレオシドはＮ（Ｌ）と表記する場合がある。
　（上記各式中、破線は結合手を示す。）
　本発明のオリゴヌクレオチド又はその塩は、標的配列のヌクレオチド配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖領域（単にアンチセンス鎖ということもある）、及び該アンチセンス鎖領域の相補領域におけるヌクレオチド配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖領域（単にセンス鎖ということもある）を有する。センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域は、相補領域のヌクレオチド配列において２本鎖構造を形成するが、それぞれが独立したオリゴヌクレオチドとして２本鎖オリゴヌクレオチドを形成していてもよく、一方の５’末端のヌクレオチドの５’位と他方の３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）とが連結されて１本鎖オリゴヌクレオチドを形成していてもよい。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドは２分子のオリゴヌクレオチドでもよく、１分子のオリゴヌクレオチドでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドが１分子のオリゴヌクレオチドである場合、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の連結様式としては、本発明のオリゴヌクレオチドがＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り特に限定されないが、例えば、一方の５’末端のヌクレオチドの５’位と他方の３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）との、所望の化学リンカー又はオリゴヌクレオチドリンカーによる連結が挙げられる。
　本明細書における、「実質的に同一のヌクレオチド配列」とは、対象となるヌクレオチド配列に対して、全て同一の塩基からなるヌクレオチド配列に加え、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列、１又は数個の同一ではない塩基を含むが、オリゴヌクレオチドとして所望の機能を発揮することができるヌクレオチド配列も含む。ここで、「同一の塩基」とは、元の塩基と完全に同一の塩基に加えて、元の塩基と同等以上の塩基対形成能を有する塩基が含まれる。そのような塩基としては、例えば、化学修飾塩基であって、元の塩基と同等以上の塩基対形成能を有する塩基（例えば、Cと5C、UとT（5U））は、それぞれ同一の塩基とみなす。配列の同一性について、対象となるヌクレオチド配列に対して、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性、或いは、３塩基、２塩基又は１塩基のミスマッチを有する配列のことをいう。ヌクレオチド配列の同一性はＢＬＡＳＴ（登録商標）等の公知の遺伝子解析ソフトウエアを用いて計算することが出来る。
　本明細書における、「実質的に相補的なヌクレオチド配列」とは、対象となるヌクレオチド配列に対して、全てが相補的なヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に加え、１又は数個（例えば、５個、４個、３個、又は２個）のヌクレオチドが相補的なヌクレオチドではないが、オリゴヌクレオチド同士が塩基対を形成するヌクレオチド配列も含む。また、本明細書において、「相補的な塩基」とは、対象となる塩基に対してワトソン－クリック塩基対を形成できる塩基をいい、未修飾の塩基であってもよく、化学修飾された塩基であってもよい。例えば、５－メチルウラシルはアデニンと、５－メチルシトシンはグアニンと、それぞれ互いに相補的な塩基である。
　本明細書におけるオリゴヌクレオチドの「２本鎖構造」とは、互いに実質的に相補的なヌクレオチド配列同士がワトソン－クリック塩基対を形成して２本鎖の構造を有しているものをいう。２本鎖構造を形成するヌクレオチド配列は、２分子の異なるオリゴヌクレオチド間における実質的に相補的なヌクレオチド配列同士であってもよく、１本鎖オリゴヌクレオチドの内部における実質的に相補的な配列同士であってもよい。
　本明細書において、「構造ユニット」とは、オリゴヌクレオチドに所望の機能を付与する化学構造単位をいう。オリゴヌクレオチドに付与する所望の機能としては、例えば、オリゴヌクレオチドを標的組織もしくは標的細胞（標的組織等ともいう）に輸送する機能、オリゴヌクレオチドの体内動態を改善する機能、等が挙げられる。構造ユニットは、公知の方法でオリゴヌクレオチドに結合させることができるが、例えば、構造ユニット中にアミダイト構造を有することで、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）又は５’末端のヌクレオチドの５’位に結合させることができる。また、構造ユニット中に、リガンドなどの標的組織等への輸送を促進する構造を有することで、標的組織等に対する輸送能をオリゴヌクレオチドに付与することができるが、そのような構造としては、肝細胞に輸送するためのＧａｌＮＡｃユニット、筋組織に輸送するための脂肪酸ユニット等が挙げられる。本明細書において、このような標的組織等に対する輸送能を付与するための構造ユニットを、特に「輸送用ユニット」ということがある。
＜２．ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチド＞
　本明細書において、「ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチド」とは、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域に含まれる実質的に相補的なヌクレオチド同士がワトソン－クリック塩基対を形成し、２本鎖構造を形成する相補領域を含み、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するオリゴヌクレオチドである。標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドに含まれる相補領域の全ての塩基がワトソン－クリック塩基対を形成していなくてもよい。本明細書において、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、「ｓｉＲＮＡ」と記載される場合もある。
　本明細書において、「標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列」とは、標的配列と同一のヌクレオチド配列をいうが、完全に同一の配列に加えて、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドが標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、実質的に同一のヌクレオチド配列も含む。
　本明細書において、「標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列」とは、標的配列と相補的なヌクレオチド配列をいうが、完全に相補的な配列に加え、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドが標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、実質的に相補的なヌクレオチド配列も含む。
　本明細書において、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するオリゴヌクレオチドを標的遺伝子に対するＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドという。
　標的遺伝子に対するＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて特に制限されないが、例えば、コンピュータソフトウエア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）：ＧＥＮＥＴＹＸ　ＣＯＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等。）を用いて標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有すると予想された配列に基づいて決定することができる。さらに選択された配列に基づいて作製したＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドのＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を確認することによって決定することもできる。
　本明細書中において遺伝子発現抑制作用とは、遺伝子の発現を完全に抑制する作用の他に、コントロールに比して遺伝子の発現を減少させる作用も含まれ、遺伝子抑制（gene silencing）も遺伝子発現抑制作用に含まれる。また、本明細書においては、遺伝子発現抑制作用と遺伝子発現抑制活性を同じ意味に用いている。
　ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用は、当業者が通常行う方法で確認することができるが、例えば、標的遺伝子が発現している細胞に標的遺伝子に対するＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを投与して一定時間経過後の標的遺伝子の翻訳産物であるタンパク質をウエスタンブロット解析によって定量しタンパク質の発現量をコントロールと比較することによって確認することが出来る。また、リアルタイムＰＣＲの手法により標的遺伝子に対するＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチド投与後の標的遺伝子の発現量をリアルタイムで測定することによっても確認することができる。
　本明細書において、「標的配列」とは、標的遺伝子のヌクレオチド配列のうち、いずれの部分でもよい１８ヌクレオチド以上の配列であって、本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドが標的とする配列を意味する。また、標的配列にＳＮＰｓ等が知られている場合、それらの変異を有する配列も標的配列に含まれる。本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドにおいては、アンチセンス鎖領域の少なくとも一部に標的配列と実質的に相補的な配列（以下、「標的対応配列」）を含む。
　本明細書において、「相補領域」とは、ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドに含まれるセンス鎖領域とアンチセンス鎖領域のヌクレオチド配列が、互いに実質的に相補的である領域を意味する。センス鎖領域とアンチセンス鎖領域は、その相補領域において、必ずしも完全に相補的である必要はないが、少なくとも相補領域における末端の塩基同士は相補的である。本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス鎖領域の相補領域は、標的対応配列を包含するが、相補領域の５’末端及び／又は３’末端がさらに延長された領域においてセンス鎖領域との相補性を維持していてもよい。
　本発明におけるＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを構成するアンチセンス鎖領域における標的対応配列の鎖長は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り特に限定されないが、１８ヌクレオチドから、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までのいかなる長さでもよい。例えば、標的対応配列の鎖長は１８～２９ヌクレオチドとすることができ、好ましくは１８～２４ヌクレオチド、１８～２３ヌクレオチド、又は１８～２２ヌクレオチドであり、より好ましくは１８～２１ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１８又は１９ヌクレオチドである。
　本発明におけるＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを構成するセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域における各相補領域の鎖長は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り特に限定されず、いかなる長さでもよい。例えば、相補領域の鎖長は１９～２９ヌクレオチドとすることができ、好ましくは１９～２４ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、又は１９～２２ヌクレオチドであり、より好ましくは１９～２１ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１９ヌクレオチドである。
　本発明におけるＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを構成するセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の鎖長は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り特に限定されず、いかなる長さでもよい。センス鎖領域の鎖長としては、例えば、１９～３９ヌクレオチドとすることができ、好ましくは１９～２９ヌクレオチドであり、より好ましくは１９～２４ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、又は１９～２２ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１９～２１ヌクレオチドであり、最も好ましくは１９ヌクレオチドである。アンチセンス鎖領域の鎖長としては、例えば、１９～３９ヌクレオチドとすることができ、好ましくは１９～２９ヌクレオチドであり、より好ましくは１９～２４ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、又は１９～２２ヌクレオチドであり、さらに好ましくは２１～２３ヌクレオチドであり、最も好ましくは２１ヌクレオチドである。
　本発明のＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドにおいて、センス鎖領域とアンチセンス鎖領域が異なるオリゴヌクレオチド分子に存在する場合、その全体が２本鎖構造である必要はなく、５’及び／又は３’末端のヌクレオシドが一部突出した、又は、２本鎖構造を形成しないオーバーハング構造を有していてもよい。そのようなオーバーハング構造は、例えば、１～５個のヌクレオシド、好ましくは１～３個のヌクレオシド、さらに好ましくは２個のヌクレオシドからなる構造が挙げられる。また、オーバーハング構造は、２本鎖オリゴヌクレオチドの全ての末端に存在していてもよく、その一部のみであってもよい。本明細書において、オーバーハング構造の表示として、センス鎖領域の５’末端をＳＯ５、３’末端をＳＯ３、アンチセンス鎖領域の５’末端をＡＯ５、３’末端をＡＯ３、とそれぞれ表示する場合がある。オーバーハング構造の塩基配列は特に限定されないが、オリゴＴ又はオリゴＵを採用することができる。
　ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドは、下記の（i）～（iv）から選択される少なくともいずれか一つの性質を有する。
（i）標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ii）ＲＮＡ分解酵素に安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（iii）エキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（iv）ＲＮＡ分解酵素、エキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
　ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドの一例としては、標的遺伝子に対するアンチセンス鎖領域、及び該アンチセンス鎖領域に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖領域を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖領域の５’末端のヌクレオチドの５’位及びセンス鎖領域の３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）が、各々において化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されていてもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド３’－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－［リンカー］－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－５’－オリゴヌクレオチド、の構造を形成している［ここで、『オリゴヌクレオチド３’』は、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）に水酸基上の水素原子を持たない構造を表し、『５’－オリゴヌクレオチド』は、オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドの５’位に水酸基上の水素原子を持たない構造を示す。］オリゴヌクレオチドを挙げることができる。このようなリンカーは、例えばＷＯ２０１２／０７４０３８等に記載されており、これら文献の記載を参考にして合成することができる。
　ＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオシドは、天然型ヌクレオシドであってもよく、糖修飾ヌクレオシドを採用してもよい。また、ヌクレオシド間結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合であり、例えば、リン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合を適宜選択することができる。
＜３．Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチド＞
　本発明は、センス鎖領域が以下の式（Ｉ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖領域が以下の式（ＩＩ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、さらに以下の（ａ）乃至（ｇ）に示される特徴を有するＲＮＡｉ－オリゴヌクレオチド（以下、「Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチド」という）又はその薬学上許容される塩を提供する：
センス鎖領域：５’　ＳＯ５－Ｓａ－Ｓ１９－Ｓ１８－Ｓ１７－Ｓ１６－Ｓ１５－Ｓ１４
－Ｓ１３－Ｓ１２－Ｓ１１－Ｓ１０－Ｓ９－Ｓ８－Ｓ７－Ｓ６－Ｓ５－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ２
－Ｓ１－ＳＯ３　３’　（Ｉ）
アンチセンス鎖領域：５’　ＡＯ５－Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９－Ａ１０－Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５－Ａ１６－Ａ１７－Ａ１８－
Ａ１９－Ａａ－ＡＯ３　３’　（ＩＩ）
（ａ）Ｓ１～Ｓ１９は、それぞれ１個のヌクレオシドを示し、Ｓ１は３’－修飾ヌクレオシドである。Ｓａは０～１０個のヌクレオシド、好ましくは０～５個又は０～４個、より好ましくは０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドである。ＳＯ３及びＳＯ５は、それぞれ独立して、０～５個、好ましくは０～４個、より好ましくは、０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドである。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
（ｂ）Ａ１～Ａ１９は、それぞれ１個のヌクレオシドを示し、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５のうち少なくとも１つはＤＮＡ、ＲＮＡ、2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＭＯＥ　ＲＮＡである。Ａａは０～１０個のヌクレオシド、好ましくは０～５個又は０～４個、より好ましくは０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドである。ＡＯ３及びＡＯ５は、それぞれ独立して、０～５個、好ましくは０～４個、より好ましくは、０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドである。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
（ｃ）Ａ２～Ａａの間のヌクレオチド配列は、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列（標的対応配列）からなり、Ａ１は標的配列の対応するヌクレオシドと相補的な塩基を有するヌクレオシド、アデニンを有するヌクレオシド、チミンを有するヌクレオシド、又はウラシルを有するヌクレオシドであり、ＡＯ３とＡＯ５が存在する場合、そのヌクレオチド配列は、それぞれ独立して、標的配列の対応するヌクレオシドとは独立に選択されるヌクレオチド配列である；
（ｄ）Ｓ１～Ｓａの間のヌクレオチド配列とＡ１～Ａａの間のヌクレオチド配列とは、互いに実質的に相補的なヌクレオチド配列からなる相補領域であり、かつ、２本鎖構造を形成している；
（ｅ）ＳＯ５とＡＯ３の両方が存在する場合、ＳＯ５及びＡＯ３は、互いに相補的ではないヌクレオシドである；
（ｆ）ＳＯ３とＡＯ５の両方が存在する場合、ＳＯ３及びＡＯ５は、互いに相補的ではないヌクレオシドである；、並びに、
（ｇ）センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の、５’末端のヌクレオシドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオシドの３’位もしくは３’末端のヌクレオシドが３’－修飾ヌクレオシドである場合はその２’位、が化学修飾されていてもよい。
＜３－１．センス鎖領域＞
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域は、上記式（Ｉ）で表される領域、すなわち、ＳＯ５～ＳＯ３をいう。Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域における相補領域は、３’末端のヌクレオシドから附番したＳ１～Ｓ１９、及び相補領域の５’側に位置するＳａとして表示する。すなわち、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖における相補領域は、上記式（Ｉ）におけるＳ１～Ｓａの領域である。Ｓ１～Ｓ１９は、それぞれ一つのヌクレオシドを表し、Ｓａは０～５個、好ましくは０～４個、より好ましくは、０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドを表す。また、センス鎖領域のオーバーハング構造は、５’末端に付加するものをＳＯ５、３’末端に付加するものをＳＯ３と表示し、それぞれ０～５個、好ましくは０～４個、より好ましくは、０～３個、０～２個、又は０～１個、のヌクレオシドを表す。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドは、センス鎖領域における相補領域の３’末端に位置するヌクレオシド（すなわち、上記式（Ｉ）におけるＳ１）が、３’－修飾ヌクレオシドであることを特徴とする。そのような３’－修飾ヌクレオシドとしては、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドがＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り特に限定されないが、好ましくは、３’－デオキシ－３’－フルオロＲＮＡ（３’－Ｆ　ＲＮＡ）、３’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、又は３’－ＭＯＥ　ＲＮＡであり、より好ましくは３’－ＯＭｅ　ＲＮＡである。さらに、この３’－修飾ヌクレオシドの２’位は、水酸基、修飾されていてもよいアルコキシ基（好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、メトキシエトキシ基）、又は修飾されていてもよいリン酸基（好ましくは、チオリン酸基、ジチオリン酸基、メチルリン酸基、エチルリン酸基）であってもよく、オーバーハング構造（すなわち、上記式（Ｉ）におけるＳＯ３）のヌクレオシドの５’位と結合していてもよく、又は、リンカー構造と結合していてもよい。好ましくは、２’位は水酸基である。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域における相補領域のＳ１以外のヌクレオシドは、特に限定されず、様々な天然ヌクレオシド又は糖修飾ヌクレオシドを採用することができるが、好ましくは、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡである。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域における相補領域の一つの態様は、３’末端から１１、１２、１３及び１５番目のヌクレオシド（すなわち、上記式（Ｉ）におけるＳ１１、Ｓ１２、Ｓ１３及びＳ１５）のうち、少なくとも一つが、２’－Ｆ　ＲＮＡであり、それ以外のヌクレオシドは、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらの組み合わせである。好ましくは、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３及びＳ１５はすべて２’－Ｆ　ＲＮＡである。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域における相補領域の一つの好ましい態様は、センス鎖領域における相補領域のＳ２～Ｓ１０、Ｓ１４、Ｓ１６～Ｓ１９及びＳａのヌクレオシドが、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡ或いはそれらから選択される2種類が交互に配置された修飾パターンであり、より好ましくは、それぞれ独立して２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ又はＤＮＡ或いはそれらが交互に配置された修飾パターン、さらにより好ましくはそれらすべてが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである。Ｓａのヌクレオシド数は０～１０個の間で適宜選択することができ、必要に応じて、その３’側から、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２３、Ｓ２４、Ｓ２５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ２８、及びＳ２９として表示する場合がある。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域における相補領域のヌクレオチド配列（すなわち、上記式（Ｉ）におけるＳ１～Ｓａ）は、アンチセンス領域における相補領域（すなわち、上記式（ＩＩ）におけるＡ１～Ａａ）と実質的に相補的なヌクレオチド配列である。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域は、その相補領域の３’末端及び／又は５’末端にオーバーハング構造（すなわち、上記式（Ｉ）におけるＳＯ３及びＳＯ５）を有していてもよい。ＳＯ３及びＳＯ５はそれぞれ独立して、０～５個（好ましくは、４、３、２、１又は０個）のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドである。好ましくは、ＳＯ３、及び、ＳＯ５は存在せず、である。
　ＳＯ３及びＳＯ５が存在する場合、その塩基は、オーバーハングとしての機能を発揮する限り特に限定されないが、好ましくは、オリゴU、又は、オリゴTである。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域の修飾パターンを以下式（Ｉａ）～（Ｉｃ）に例示する。
　５’ＳＯ５（N(M)）－Ｓａ（N(M)）－Ｓ１９（N(M)）－Ｓ１８（N(M)）－Ｓ１７（N(M)）－Ｓ１６（N(M)）－Ｓ１５（N(F)）－Ｓ１４（N(M)）－Ｓ１３（N(F)）－Ｓ１２（N(F)）－Ｓ１１（N(F)）－Ｓ１０（N(M)）－Ｓ９（N(M)）－Ｓ８（N(M)）－Ｓ７（N(M)）－Ｓ６（N(M)）－Ｓ５（N(M)）－Ｓ４（N(M)）－Ｓ３（N(M)）－Ｓ２（N(M)）－Ｓ１（N(3M)）－２’Ｈ　３’（Ｉａ）
　５’Ｓａ（N(M)）－Ｓ１９（N(M)）－Ｓ１８（N(M)）－Ｓ１７（N(M)）－Ｓ１６（N(M)）－Ｓ１５（N(F)）－Ｓ１４（N(M)）－Ｓ１３（N(F)）－Ｓ１２（N(F)）－Ｓ１１（N(F)）－Ｓ１０（N(M)）－Ｓ９（N(M)）－Ｓ８（N(M)）－Ｓ７（N(M)）－Ｓ６（N(M)）－Ｓ５（N(M)）－Ｓ４（N(M)）－Ｓ３（N(M)）－Ｓ２（N(M)）－Ｓ１（N(3M)）－２’Ｈ　３’（Ｉｂ）
　５’Ｓ１９（N(M)）－Ｓ１８（N(M)）－Ｓ１７（N(M)）－Ｓ１６（N(M)）－Ｓ１５（N(F)）－Ｓ１４（N(M)）－Ｓ１３（N(F)）－Ｓ１２（N(F)）－Ｓ１１（N(F)）－Ｓ１０（N(M)）－Ｓ９（N(M)）－Ｓ８（N(M)）－Ｓ７（N(M)）－Ｓ６（N(M)）－Ｓ５（N(M)）－Ｓ４（N(M)）－Ｓ３（N(M)）－Ｓ２（N(M)）－Ｓ１（N(3M)）－２’Ｈ　３’（Ｉｃ）
　［上記式において、（N(M)）は2'-OMe RNAを表し、（N(F)）は2'-F RNAを表し、（N(3M)）は3'-OMe RNAを表す。ＳＯ５（N(M)）及びＳａ（N(M)）は０～３個の2'-OMe RNAからなるヌクレオシドを表す。各オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端から3個のヌクレオシドの2か所のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、それ以外のヌクレオシド間結合はリン酸ジエステル結合である。すなわち、各オリゴヌクレオチドは、３’末端と５’末端に、それぞれ２か所ずつ、合計４か所のホスホロチオエート結合を有している。］
＜３－２．アンチセンス鎖領域＞
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域は、上記式（ＩＩ）で表される領域、すなわち、ＡＯ５～ＡＯ３をいう。Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域は、５’末端のヌクレオシドから附番したＡ１～Ａ１９、及び相補領域の３’側に位置するＡａとして表示する。すなわち、アンチセンス鎖の相補領域は、上記式（ＩＩ）におけるＡ１～Ａａの領域である。Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域のヌクレオチド配列は、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列であればよく、例えば、標的配列と５、４、３、２又は1塩基のミスマッチが含まれていてもよく、好ましくは完全に相補的である。Ａ１～Ａ１９は、それぞれ一つのヌクレオシドを表し、Ａａは０～５個のヌクレオシドを表す。また、アンチセンス鎖領域のオーバーハング構造は、５’末端に付加するものをＡＯ５、３’末端に付加するものをＡＯ３と表示する。
　Ａ１は、標的配列の対応する塩基と実質的に相補的な塩基であってもよく、標的配列とは独立してアデニン、ウラシル、又はチミンであってもよい。ｓｉＲＮＡのセンス鎖の相補領域における3’末端の塩基が、標的配列とは無関係にアデニン又はウラシルである場合に、良好なＲＮＡ干渉活性を示すことは、特許US10093923等に記載されている。また、文献（Nature 465, 818-822 (2010)）には、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオシドはＲＮＡ干渉活性に関与するＡｇｏ２タンパク質に結合し、標的ｍＲＮＡに結合しないことが示されている。アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオシドがアデニン又はウラシルヌクレオシドである場合の方が、グアニン又はシトシンである場合よりも、Ａｇｏ２タンパク質に強く結合することも示されていることから、アンチセンス鎖の５’末端はアデニン又はウラシルヌクレオシドであることが好ましい。
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域のＡ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５のうち、少なくとも一つ（好ましくは、２つ以上）が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシド及び２’－ＭＯＥ　ＲＮＡからなる群から選択されるいずれかである。ここで用いられる2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドとしては、特に限定されないが、好ましくは、ＬＮＡ又はＥＮＡである。アンチセンス鎖相補領域において、前記で同定されるヌクレオシド以外のヌクレオシドは、特に限定されず、様々な天然ヌクレオシド又は糖修飾ヌクレオシドを採用することができるが、好ましくは、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡである。
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域のＡ１４が、ＲＮＡであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図２の５６型、５７型、図３の６１型、６２型、６６型及び６７型、図５の７５型～８３型、図６の９１型～９５型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　Ａ１４がＲＮＡであるオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域の好ましい態様としては、Ａ１３が2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシド、2'-OMe RNA又は2'-F RNAであり、より好ましくは2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドであり、更に好ましくはENA又はLNAである（図５の７６型～８３型、及び、図６の９１型～９３型）。このようなＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドにおいて、Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５の修飾パターンとして好ましくは、以下式（ＩＩＩａ）～（ＩＩＩｈ）のいずれかである。
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩａ）
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｂ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｃ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｄ）
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｅ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｆ）
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｇ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｈ）
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域のＡ１４が2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドが提供される。ここで、2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドとして、好ましくはENA又はLNAである。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図４の７０型～７４型、及び図６の８８型～９０型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　Ａ１４が2'-O, 4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドの好ましい態様としては、Ａ１２がDNAである。このようなＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス鎖相補領域のＡ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５の修飾パターンとして好ましくは、以下式（ＩＩＩｉ）～（ＩＩＩｌ）のいずれかである。
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｉ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｊ）
Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｋ）
Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)　（ＩＩＩｌ）
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域のＡ１４がDNAであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図２の５８型及び５９型、図３の６３型、６４型、６８型及び６９型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域の式（ＩＩ）のＡ１５が２’－ＭＯＥ　ＲＮＡであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図５の７９型及び８３型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域の５’末端から１１～１３番目のヌクレオシド（式（ＩＩ）のＡ１１、Ａ１２、Ａ１３）のいずれかが2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、ENAは図１の４３型、４５型、図４の７５型～８４型、図６の８５型、８６型、及び、９１型～９３型、LNAは図１の４４型、４６型、及び図３の６７型、６９型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域の５’末端から１１～１３番目のヌクレオシド（式（ＩＩ）のＡ１１、Ａ１２、Ａ１３）のいずれかがDNAであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図１の４１型、４２型、図４の７１型、及び図６の８７型～９０型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　本発明の一例として、Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域の５’末端から１１～１３番目のヌクレオシド（式（ＩＩ）のＡ１１、Ａ１２、Ａ１３）のいずれかが２’－ ＭＯＥ　ＲＮＡであるオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの修飾パターンとしては、例えば、図１の４７型及び４８型、図４の７４型に示されるものが例示されるが、これらに限定されない。
　本発明のＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域において、上記で特定されたヌクレオシド以外のヌクレオシドは様々な種類を適宜選択することができるが、好ましくは、Ａ２、Ａ６及びＡ１６の少なくとも一つ（好ましくは全て）のヌクレオシドが、２’－Ｆ　ＲＮＡである。さらに好ましいアンチセンス鎖領域は、Ａ２、Ａ６及びＡ１６に加えて更に、Ａ８、Ａ９及びＡ１０からなる群から選択される１又は２個のヌクレオシドが２’－Ｆ　ＲＮＡであり、前記で特定された以外のヌクレオシド（たとえば、Ａ１、Ａ３～Ａ５、Ａ７、Ａ１７～Ａ１９及びＡａ）は、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ又はＤＮＡである。
　本発明のＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域における相補領域において、Ａ１１～Ａ１５以外の領域の好ましい修飾パターンは、例えば以下の表A-1および表A-2に例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
［上記表において、（M）は2'-OMe RNAであり、（F）は2'-F RNAである。Ａａは、０～５個のヌクレオシドであり、０以外の場合全て同一のヌクレオシドである。ＡＯ３は、０～５個のヌクレオシドであり、０以外の場合全て同一のヌクレオシドである。ヌクレオシド間結合は、リン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合が適宜選択される。］
　Ｓ３Ｍ－オリゴヌクレオチドに含まれるアンチセンス鎖領域は、その相補領域の３’末端及び／又は５’末端にオーバーハング構造（すなわち、上記式（ＩＩ）におけるＡＯ３及びＡＯ５）を有していてもよい。ＡＯ３及びＡＯ５はそれぞれ独立して、０～５個（好ましくは、３、２、１又は０個）のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドである。好ましくは、ＡＯ３は、２又は３個の２’－ＯＭｅ　ＲＮＡからなるオーバーハングであるか、あるいは、１又は２個の２’－ＯＭｅ　ＲＮＡと１又は２個の2'-O,4'-C-架橋化修飾ヌクレオシドとからなるオーバーハングであり、ＡＯ５は存在しない。
　ＡＯ３及びＡＯ５が存在する場合、その塩基は、オーバーハングとしての機能を発揮する限り特に限定されないが、好ましくは、オリゴU、又は、オリゴTである。
＜３－３．ヌクレオシド間結合＞
　本発明のＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間の結合様式は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を適宜選択することができ、好ましくは、リン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合であり、それらをそれぞれ単独で、又は、組み合わせて採用することができる。好ましくは、リン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合の組み合わせであり、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域それぞれに含まれるヌクレオシド間結合において、ホスホロチオエート結合の含有率が、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２９％以下、２８％以下、２７％以下、２６％以下または２５％以下である。
　RNA及び／又は２’－Ｆ　ＲＮＡが採用される場合、当該ヌクレオシドとその３’側に隣接するヌクレオシドとの間の結合がホスホロチオエート結合であってもよい。好ましくは、ＲＮＡが採用される場合、当該ヌクレオシドとその３’側に隣接するヌクレオシドとの間の結合はホスホロチオエート結合である。
　本発明のＳ３Ｍ－オリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端から１、２、３、４又は５番目のヌクレオシド間結合（ヌクレオシド間の結合数として、１、２、３、又は４か所）は、ホスホロチオエート結合を採用することが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、センス鎖領域とアンチセンス鎖領域が異なるオリゴヌクレオチドに含まれる場合、センス鎖領域の５’末端及び３’末端から１、２、３、４又は５番目のそれぞれのヌクレオシド間、並びに　アンチセンス鎖領域の５’末端及び３’末端から１、２、３、４又は５番目のそれぞれのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合であってもよく、好ましくは、センス鎖領域の５’末端及び３’末端から１、２、３番目のそれぞれのヌクレオシド間結合（ヌクレオシド間の結合数として、２か所）、並びに　アンチセンス鎖領域の５’末端から１、２、３番目のそれぞれのヌクレオシド間結合（ヌクレオシド間の結合数として、２か所）、及び３’末端から１、２、３又は４番目のそれぞれのヌクレオシド間結合（ヌクレオシド間の結合数として、３か所）、がホスホロチオエート結合である。
＜４．オリゴヌクレオチドの合成方法＞
　本発明のオリゴヌクレオチドの調製方法としては所望のオリゴヌクレオチドが合成できる限り特に制限はないが、既知の化学合成法（リン酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、又は、Ｈ－ホスホネート法等）を用いることができる。例えば、市販の核酸合成機を用いて、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成に使われる試薬を用いて合成することができる。
　通常のホスホロアミダイト法により、所望のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１２，　４５３９（１９８４））記載の方法に準じて合成することができる。
　各種ヌクレオシドに対応したアミダイト試薬は市販されているものを購入して使用してもよく、公知の方法に従って合成することもできる。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、市販の合成機（例えば、パーキンエルマー社のホスホロアミダイド法によるモデル３９２）などを用いて、文献（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))に記載の方法に準じて合成することができる。その際に用いられるホスホロアミダイト試薬は、天然型のヌクレオシド及び2'-O-メチルヌクレオシド（すなわち、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルウリジン）については、市販のホスホロアミダイト試薬を用いることができる。2'-O-アルキル基の炭素数が２～６個の2'-O-アルキルグアノシン、2'-O-アルキルアデノシン、2'-O-アルキルシチジンおよび2'-O-アルキルウリジンについては、以下の通りである。
　2'-O-アミノエチルグアノシン、2'-O-アミノエチルアデノシン、2'-O-アミノエチルシチジン、2'-O-アミノエチルウリジンは、文献（Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　2'-O-プロピルグアノシン、2'-O-プロピルアデノシン、2'-O-プロピルシチジン、2'-O-プロピルウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　2'-O-アリルグアノシン、2'-O-アリルアデノシン、2'-O-アリルシチジン、2'-O-アリルウリジンは、市販のホスホロアミダイト試薬を用いることができる。
　２’－ＭＯＥ　ＲＮＡについて、2'-O-メトキシエチルグアノシン、2'-O-メトキシエチルアデノシン、2'-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン、2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジンは、特許（US6261840）または、文献（Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成でき、市販のホスホロアミダイト試薬を用いることもできる。
　2'-O-ブチルグアノシン、2'-O-ブチルアデノシン、2'-O-ブチルシチジン、2'-O-ブチルウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　2'-O-ペンチルグアノシン、2'-O-ペンチルアデノシン、2'-O-ペンチルシチジン、2'-O-ペンチルウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　2'-O-プロパルギルグアノシン、2'-O-プロパルギルアデノシン2'-O-プロパルギルシチジン、2'-O-プロパルギルウリジンは、市販のホスホロアミダイト試薬を用いることができる。
　２’－Ｆ　ＲＮＡについて、2'-デオキシ-2'-フルオログアノシン、2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシン、2'-デオキシ-2'-フルオロシチジン、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンは、文献（J. Med. Chem. 36, 831 (1993)）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成でき、市販のホスホロアミダイト試薬を用いることもできる。
　３’－修飾ヌクレオシドである３’－Ｆ　ＲＮＡについて、3'-デオキシ-3'-フルオログアノシンはWO2017027645に従って、3'-デオキシ-3'-フルオロアデノシンはWO2018198076に従って、3'-デオキシ-3'-フルオロウリジンはUS2011/0196141に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。また、3'-デオキシ-3'-フルオロシチジンは前記文献など、公知の方法を参考にして合成することができる。
　３’－修飾ヌクレオシドである3'-OMe RNAについて、3'-O-メチルグアノシン、3'-O-メチルアデノシン、3'-O-メチルシチジン、3'-O-メチルウリジンは、市販のホスホロアミダイト試薬を用いて合成することができる。
　３’－修飾ヌクレオシドである3'-MOE RNAについて、3'-O-メトキシエチルグアノシン、3'-O-メトキシエチルアデノシン、3'-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン、3'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジンは、US2003/0096979に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　ＬＮＡについて、2'-O,4'-C-メチレングアノシン、2'-O,4'-C-メチレンアデノシン、2'-O,4'-C-メチレンシチジン、2'-O,4'-C-メチレン-5-メチルシチジンおよび2'-O,4'-C-メチレン-5-メチルウリジンについては、WO99/14226に記載の方法に従って対応するホスホロアミダイト試薬を製造することができる。
　2'-O,4'-C-架橋部分のアルキレン基の炭素数が２～５個の2'-O,4'-C-アルキレングアノシン、2'-O,4'-C-アルキレンアデノシン、2'-O,4'-C-アルキレンシチジン、2'-O,4'-C-アルキレン-5-メチルシチジンおよび2'-O,4'-C-アルキレン-5-メチルウリジンについては、WO00/47599に記載の方法に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を製造することができる。
　D-リボフラノースの2'-デオキシ-2'-C,4'-C-メチレンオキシメチレン化されたヌクレオシドは、文献（Wang,G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　S-cEt（constrained ethyl）は、文献（Seth,P.P. et al. J.Org.Chem (2010), 75, 1569-1581.）に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　AmNAは、文献（Yahara,A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.）または、WO2014/109384に従って、対応するホスホロアミダイト試薬を合成できる。
　ホスホロアミダイト試薬をカップリング後、硫黄、テトラエチルチウラムジスルフィド（TETD、アプライドバイオシステム社）、Beaucage試薬（Glen Research社）、または、キサンタンヒドリドなどの試薬を反応させることにより、ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる（Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198）。
　合成機で用いるコントロールド　ポア　グラス（CPG）、及び、ポリスチレンを固相担体として、2'-O-メチルヌクレオシド及び3'-O-メチルヌクレオシドが結合した固相担体は、市販のものを利用することができる。また、2'-O,4'-C-メチレングアノシン、2'-O,4'-C-メチレンアデノシン、2'-O,4'-C-メチレン-5-メチルシチジンおよび2'-O,4'-C-メチレン-5-メチルウリジンについては、WO99/14226に記載の方法に従って、アルキレン基の炭素数が２～５個の2'-O,4'-C-アルキレングアノシン、2'-O,4'-C-アルキレンアデノシン、2'-O,4'-C-アルキレン-5-メチルシチジンおよび2'-O,4'-C-アルキレン-5-メチルウリジンについては、WO00/47599に記載の方法に従って製造したヌクレオシドを文献（Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J.Gait, Oxford University Press, 1984）に従って、CPGに結合することができる。また、ユニバーサルレジンを用いて、上述のホスホロアミダイト試薬を結合させることにより合成できる。また、修飾されたCPG（特開平７－８７９８２の実施例１２ｂに記載）を用いることにより、3'末端に2-ヒドロキシエチルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、3'-amino-Modifier C3 CPG, 3'-amino-Modifier C7 CPG, Glyceryl CPG, (Glen Research), 3'-specer C3 SynBase CPG 1000, 3'-specer C9 SynBase CPG 1000（link technologies）を使えば、3'末端にヒドロキシアルキルリン酸基、または、アミノアルキルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。
　また、オリゴヌクレオチド類縁体をチオエート化する場合は、硫黄のほかテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステムズ社）、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、フェニルアセチルジスルフィド／ピリジン－アセトニトリル（１：１　ｖ／ｖ）溶液（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，　Ｖ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００６）　１６，ｐ．２５１３－２５１７）等の試薬を用い、文献（Ｔｅｔａｒｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　３２，　３００５（１９９１）、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１１２，　１２５３（１９９０））記載の方法に準じてチオエート誘導体を得ることができる。
　ＲＮＡの2’-水酸基の保護基として、ｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基などのシリル系の保護基を用いている場合、フッ化 テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）、ＨＦ－ピリジン、又は、ＨＦ－トリエチルアミンなどを用いて脱保護することができる。
　濃アンモニア水、メタノール性アンモニア、エタノール性アンモニア、濃アンモニア水－エタノール（３：１Ｖ／Ｖ）混液、濃アンモニア水－４０％メチルアミン水溶液（１：１Ｖ／Ｖ）混液、メチルアミン、０．５Ｍ　ＬｉＯＨ水溶液、３．５Ｍ　トリエチルアミン/メタノール溶液の（１：１０Ｖ／Ｖ）混液、0.05M 炭酸カリウム含メタノールなどを用いて、塩基部のアシル基、及び、リン酸基部のシアノエチル基を脱保護することができ、好適には濃アンモニア水、濃アンモニア水―エタノール混液（３：１Ｖ／Ｖ）である。
　逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィーを含む。）等の各種クロマトグラフィーなど、通常の核酸の精製に用いられる精製操作で精製することにより、本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドを標的組織又は標的細胞に輸送するための輸送用ユニットが結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような輸送用ユニットが結合したオリゴヌクレオチドとしては、例えば、所望の化学構造にアミノアルキルリン酸基（例えば、アルキルとしては、３乃至９の炭素数を持つ。）を導入したユニットを、オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）に結合させたオリゴヌクレオチドを挙げることができる。そのような輸送用ユニットとしては、例えば肝臓実質細胞のアシアロ糖受容体（ＡＳＧＲＰ）に結合するＧａｌＮＡｃユニット、肝臓や筋組織へ輸送するための脂肪酸（例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸など）ユニット（例えば、Nucleic Acids Res. (2020) 47, 6029-6044、WO2017/19267号公報など参照）等を、適宜採用することができる。
　ＧａｌＮＡｃユニットとは、ＡＳＧＲＰに結合可能なＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む構造単位で、本発明のオリゴヌクレオチドを肝臓に送達するために用いることができる。ＧａｌＮＡｃユニットは、直鎖または分岐したリンカー構造を有していてもよく、例えば、直鎖、２分岐以上、３分岐以上、又は４分岐以上、あるいは、４分岐以下、３分岐以下、又は２分岐以下の分岐したリンカー構造を有し得る。また、ＧａｌＮＡｃユニットは、オリゴヌクレオチドとの結合のためのリン酸基またはチオリン酸基を含んでいてもよい。ＡＳＧＲＰへの結合能が維持される限り、一つのＧａｌＮＡｃユニットに含まれるＧａｌＮＡｃの数に制限は無く、またＧａｌＮＡｃの構造が修飾されていてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドに用いることができるＧａｌＮＡｃユニットとしては、例えば、ＷＯ２０２１／０４９５０４号公報、ＷＯ２００９／０７３８０９号公報、ＷＯ２０１４／０７６１９６号公報、ＷＯ２０１４／１７９６２０号公報、ＷＯ２０１５／００６７４０号公報、ＷＯ２０１５／１０５０８３号公報、ＷＯ２０１６／０５５６０１２０１７／０２３８１７号公報、ＷＯ２０１７／０８４９８７号公報、ＷＯ２０１７／１３１２３６号公報、Methods in Enzymology、1999年、313巻、２９７～３２１頁、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 26 (2016) 3690-3693、等の公知のＧａｌＮＡｃユニットを適宜採用することができる。
　例えば、採用できるＧａｌＮＡｃユニットとしては、下記式のものが挙げられ、ＷＯ２０２１／０４９５０４に記載の方法にしたがって適宜調整できる。
（上記式中、破線は結合手を示し、結合手の酸素原子は、隣接するヌクレオチドと結合することを表し、５’末端のヌクレオチドと結合する場合は５’－リン酸基と、３’末端のヌクレオチドと結合する場合は３’－リン酸基（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位のリン酸基）と、リン酸ジエステル結合を形成することを表し、形成されるリン酸ジエステル結合は、ホスホロチオエート結合などの化学修飾されたリン酸ジエステル結合であってもよい。）
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドにコレステロールユニット、脂質ユニット又は、ビタミンＥユニットを導入したもの（例えば、Ｌｏｒｅｎｚ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ．，１４，ｐ．４９７５－４９７７（２００４）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ，４３２，ｐ．１７３－１７８，　（２００４）；　Ｗｏｌｆｒｕｍ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　２５，ｐ．１１４９－１１５７，（２００７））Ｋｕｂｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，　１７，　ｐ．１－２０，（２００７）；　Ｋｕｂｏ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　３６５，ｐ．５４－６１，（２００８）；　Ｎｉｓｈｉｎａ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｔｈｅｒ．　１６，ｐ．７３４－７４０，（２００８）参照。）、及びオリゴヌクレオチドの末端に、タンパク質に結合する核酸分子であるアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を結合したものも含む。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドとモノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）や、タンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）が結合したものも含む（例えば、Ｓｏｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　２３，ｐ．７０９－７１７（２００５）；　Ｘｉａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｒｅｓ．　２４，ｐ．２３０９－２３１６（２００７）、Ｋｕｍａｒ，　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐ．３９－４３（２００７）参照。）。
　また、本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドにカチオニックポリマーを加えることで、正電荷を帯びた複合体としたものも含む（臓器及び細胞への分布を達成することができた例として、Ｌｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｅｄ．　７，ｐ．９７７－９８６（２００５），Ｂａｉｇｕｄｅ　ｅｔ　ａｌ．２，ｐ．２３７－２４１，　ＡＣＳ　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．（２００７），Ｙａｄａｖａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　１７，ｐ．２１３－２２２（２００７）参照）。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、上記のオリゴヌクレオチドのあらゆる薬学的に許容可能な塩類、エステル、又はそのようなエステルの塩類を含む。本発明のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩類としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリ－ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ－ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドを含有する組成物は、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所的又は取り込み、分配及び／又は吸収を補助するための他の処方として、他の分子、分子構造又は化合物の混合物と混合される、封入される、共役される。
　本発明のオリゴヌクレオチドを、疾患の予防薬又は治療薬として使用する場合には、前記オリゴヌクレオチド、又は、その薬理学上許容される塩を、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。
　これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
　上記のように調製されたオリゴヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写され得るものであれば、特に制限されない。被導入体としては細胞、組織、あるいは個体を意味する。
　本発明のオリゴヌクレオチドが導入される細胞としては、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能性細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不滅化細胞、形質転換細胞、神経細胞又は免疫細胞のいずれのものであってもよい。
　組織としては単一細胞胚又は構成性細胞、又は多重細胞胚、胎児組織等を含む。また、上記分化細胞としては、例えば、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌線又は外分泌腺の細胞等が挙げられる。このような細胞の例としては、ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　ｂａｎｋ）、ショウジョウバエＳ２細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，　ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｅｍｂｒｙｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｍｏｒｐｈ．，　２７，ｐ．３５３－３６５（１９７２）、ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－２）、あるいは、ヒトＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１５７３）等が好ましく用いられる。
　さらに本発明のオリゴヌクレオチドの被導入体として用いられる個体として、具体的には、植物、動物、原生動物、ウイルス、バクテリア、又は真菌類に属するもの等が挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物又は裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物又は無脊椎動物であってもよい。脊椎動物としてはマウス、ラット、サル、イヌ及びヒトを含む哺乳類が好ましい。
　被導入体への本発明のオリゴヌクレオチドの導入方法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルス感染、３Ｌ５－オリゴヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウイルス感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には植物体の体腔又は間質細胞等への注入又は灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、皮下、筋肉内及び静脈内投与、非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、経膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウイルス感染等が用いられる。経口導入の方法としては、本発明のオリゴヌクレオチドを生物の食物と直接混合する方法を使うこともできる。
　本発明のオリゴヌクレオチドを患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。　コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，ｐ．６８２－；Ｂｌｕｍｅ　ａｎｄ　Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，ｐ．９１－；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ．，１９９４，２３，ｐ．１１９－；Ｃｈｏｎｎ　ａｎｄ　Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，ｐ．６９８－）。サイズ範囲が０．２－０．４μｍである単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，ｐ．７７－）。
　リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。
　特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４－１８の炭素原子、特に１６－１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４－１８の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。
　代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
　リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。
　受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。
　一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスのタンパク質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，ｐ．８４７４－）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又はタンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げることができる。
　標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。
　本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ’）２）、であり得る。２種又はそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。
　内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
　本発明のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩の使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、静脈内投与または皮下投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を、気管内投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を、眼球内投与の場合には、１回当り下限０．０５ｍｇ（好適には、０．５ｍｇ）、上限１０ｍｇ（好適には、５ｍｇ）を、成人に対して、１日当り１乃至３回症状に応じて投与することが望ましい。また、安定性が高められた薬剤の場合は、１週間に１乃至３回、さらに安定性が高められた薬剤の場合は、１ヶ月に１乃至３回症状に応じて投与することが望ましい。
　局所的投与に対する薬学的組成物及び処方は、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、飴、坐薬、スプレー、液体及び粉末を含む。
（実施例１～５２、及び参考例１～３）
　本化合物は、ホスホロアミダイト法（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)、Nature Communications 6, Article number: 6317 (2015)）を用いて合成を行った。具体的な配列、構造については、表１－１～表１－１０に記載した。なお、実施例１～１７、実施例４８～５２、参考例２及び参考例３の化合物は、ヒトのトランスフェリン受容体２（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２、ＴｆＲ２）をコードする遺伝子に対するｍＲＮＡを標的遺伝子とするｓｉＲＮＡである。また、実施例１～４及び参考例２の化合物は配列番号１に示すヒトＴｆＲ２（ｈＴｆＲ２）　ｍＲＮＡの塩基配列における１５３６～１５５４番目、実施例５～１７及び参考例３の化合物は２８４７～２８６５番目の１９ヌクレオチドからなる塩基配列をそれぞれ標的配列とし、さらに各アンチセンス鎖領域の３’末端にオーバーハング構造としてＵ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）が結合したものである。また、実施例１８～４７及び参考例１の化合物は、ＷＯ２０１２／１７７９２１に記載されているマウスＴｆＲ２（ｍＴｆＲ２）に対するｓｉＲＮＡであるＡＤ－４７８８２における１９塩基対（すなわち、相補領域）に対して様々な化学修飾を施し、さらに各アンチセンス鎖領域の３’末端にオーバーハング構造としてＵ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）が結合したものである。
　実施例４８（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｓ１）及び実施例４９（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｓ２）の化合物は、実施例１６の化合物（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ）におけるアンチセンス鎖領域の３’末端のオーバーハング構造がそれぞれ１ヌクレオチドであるか、又は存在しない、ｓｉＲＮＡである。実施例５０（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ１）及び実施例５１（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ２）の化合物は、実施例１６の化合物（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ）における標的配列を５’末端側にそれぞれ１又は２個のヌクレオチド鎖長延ばした配列（すなわち、それぞれ配列番号１の２８４６～２８６５番目の配列及び２８４５～２８６５番目の配列）を標的配列とし、相補領域の鎖長がそれぞれ２０ｂｐ、２１ｂｐであるｓｉＲＮＡである。実施例５２（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ３）の化合物は、実施例１６の化合物（ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ）におけるアンチセンス鎖領域の３’末端のオーバーハング構造をＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）としたｓｉＲＮＡである。
「2'-O-メチルヌクレオシド」の部分は、Nucleic Acids Research 17, 3373 (1989)に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「DNA」の部分は、Nucleic Acids Research 11, 4539 (1984)に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「3'-O-メチルヌクレオシド」の部分は、3'-O-Methyl Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite（ChemGene、カタログ番号：ANP-2901）、3'-O-Methyl Cytidine (n-bz) CED phosphoramidite（ChemGene、カタログ番号：ANP-2902）、3'-O-Methyl Guanosine (n-ibu) CED phosphoramidite（ChemGene、カタログ番号：ANP-2903）、または、3'-O-Methyl Uridine CED phosphoramidite（ChemGene、カタログ番号：ANP-2904）を用いて合成した。「2'-O,4'-C-メチレンヌクレオシド」の部分は、WO99/14226に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオシド」の部分は、J. Med. Chem. 36, 831 (1993) に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「2'-O-メトキシエチルヌクレオシド」の部分は、Helv. Chim. Acta 78, 486-504 (1995)に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。「GN」の部分は、WO2019/172286参考例41に記載に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定し、その結果を表１に記載した。
　各実施例化合物及び参考例化合物は、それぞれ個別に合成した表１－１及び表１－７に記載の塩基配列からなるセンス鎖領域と、表１－２～表１－６及び表１－８に記載の塩基配列からなるアンチセンス鎖領域とを、等モルずつ１つのチューブに入れてアニーリング処理後、未変性ゲル、または、ＨＰＬＣを使って２本鎖を形成していることを確認した。
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　表中の「分子量」は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。表中の「塩基配列」において、N(R)はRNA、N(D)はDNA、N(M)は2'-OMe RNA、N(m)は2'-MOE RNA、N(3M)は3'-OMe RNA、N(F)は2'-F RNA、N(L)はLNA、N(E)はENAを示す。それぞれのヌクレオシドの構造は、前述した各構造式で表される。
　「GN」は、上述した式（ＧＮ）で表されるGalNAcユニットを表す。ヌクレオシド間の結合、ヌクレオシドとGalNAcユニットとの結合、または、ヌクレオシドとリンカーとの結合について、「^」は、ホスホロチオエート結合（-P(=S)(OH)-、上述したヌクレオシド間結合の構造図中の（PS）で示す）を示し、特に記載のない場合は、リン酸ジエステル結合（-P(=O)(OH)-、上述したヌクレオシド間結合の同図中の（Ｐ）で示す）で結合したものを示す。
　各オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドの５’位及び３’末端のヌクレオチドの３’位（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位）は、水素原子が、上述した各ヌクレオシドの構造図中の酸素原子と結合した水酸基となっている。但し、「GN」が末端になっている場合は、水素原子の結合を必要としない。
＜試験例＞
試験例１：ＨｅｐＧ２細胞に対するＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡのリバーストランスフェクション法によるスクリーニング
　リバーストランスフェクション法によって以下のようにｓｉＲＮＡのスクリーニングを行った。トランスフェクション当日、ｓｉＲＮＡ検体を１種類あたり２ウェル分、ｓｉＲＮＡの代わりに蒸留水としたネガティブコントロール（ＮＴ）を２ウェル分、ポジティブコントロールとして参考例２または３の化合物である、ｈＴｆＲ２に対するｓｉＲＮＡに対して化学修飾を施した化合物（TfR2-039.23DUGまたはTfR2-019.22DUG）を２ウェル分作製した。
　１ウェルあたり１４．８μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．２μＬのＲＮＡｉＭＡＸの混合液に５μＬのｓｉＲＮＡ（実施例の化合物）を添加し、室温で２０分間インキュベートした。ネガティブコントロール用の試薬調製としては、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとＲＮＡｉＭＡＸの混合液に対して、ｓｉＲＮＡの代わりに５μＬの蒸留水を添加した。ポジティブコントロール用の試薬調製としては、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとＲＮＡｉＭＡＸの混合液に対して、５μＬの参考例２または３の化合物を添加した。次に、ｓｉＲＮＡまたはネガティブコントロールまたはポジティブコントロールを含む混合液を２０μＬずつ９６ウェルの細胞培養用プレート（ＳＵＭＩＲＯＮ社製）に添加した。混合液を添加した９６ウェルプレートに、予め３７℃に温めておいた１０％　ＦＢＳを含んだＤＭＥＭを用いて調製した２ｘ１０＾４　ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＨｅｐＧ２細胞を、１ウェルあたり８０μＬずつ播種した。ｓｉＲＮＡの最終濃度としては、１０ｎＭから１０倍または５０倍公比になるように調製した。
　トランスフェクションして１日後または２日後に、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｐｒｅｐ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｓ　ＲＴ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　ｑＰＣＲ（タカラバイオ社製）を用いて、キットのプロトコルに従ってＲＮＡ抽出および逆転写反応を実施しｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲによって内因性のｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ハウスキーピング遺伝子としては、ｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量を測定した。
　定量的ＰＣＲは、ＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、以下のように行った。得られたｃＤＮＡは原液として使用した。３８４ウェルのＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の１ウェルあたり、５μＬのＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、０．２５μＬのｈＴｆＲ２プライマー（Ｈｓ．ＰＴ．５８．２０５９９４３４、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）または、０．２５μＬのｈ１８Ｓプライマー（Ｈｓ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８５６．ｇ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２．７５μＬの蒸留水、２μＬのｃＤＮＡの割合で混合（計１０μＬ）し、各ｃＤＮＡに対して２ウェル分調製し、定量的ＰＣＲを行った。ｈＴｆＲ２とｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量を２ウェル間の平均値として測定した。ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ネガティブコントロールにおけるｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置した検体の相対ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を算出して表記した。結果は、以下の表２から表４に示した。
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試験例１－１：ＨｅｐＧ２細胞を用いたｈＴｆＲ２ノックダウン活性
　試験例１と同様の方法で、リバーストランスフェクション法を用いてｓｉＲＮＡをＨｅｐＧ２細胞に導入して２日後における、ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の評価を行った。ｓｉＲＮＡとして、ＴｆＲ２－０１９、及びＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ（実施例１６）を用いた。ＴｆＲ２－０１９は、それぞれ独立したオリゴヌクレオチドであるセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域から構成される２本鎖オリゴヌクレオチドであり、該センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の相補領域はすべてが天然型のＲＮＡ（すなわち、Ａ（Ｒ）、Ｇ（Ｒ）、Ｃ（Ｒ）、及びＵ（Ｒ））で構成されている。また、ＴｆＲ２－０１９におけるアンチセンス鎖領域は、配列番号１に示されるｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡの２８４７～２８６５番目の塩基配列を標的配列とし、該標的配列と完全に相補的な配列からなる相補領域を有し、該相補領域の各３’末端にオーバーハング構造として２個の連続したＴ（Ｄ）が結合したオリゴヌクレオチドである。また、ＴｆＲ２－０１９におけるセンス鎖領域は、対応するアンチセンス鎖領域の相補領域におけるヌクレオチド配列と完全に相補的な配列からなる相補領域を有し、該相補領域の３’末端にオーバーハング構造として２個の連続したＴ（Ｄ）が結合したオリゴヌクレオチドである。また、各ヌクレオシド間結合は化学修飾されていないリン酸ジエステル結合である。
　ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量の評価について、ネガティブコントロール（ＮＴ）におけるｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置した検体の相対ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を算出して表記した。結果は、図１１に示した。
　この結果は、特にＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧが、ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡに対する高いノックダウン活性を有することを示すものである。
試験例２：ｍＴｆＲ２を安定発現したＨＥＫ２９３Ａ細胞（２９３Ａ－ｍＴｆＲ２細胞）に対するＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡのリバーストランスフェクション法によるＲＮＡｉ活性測定
　ＨＥＫ２９３Ａ細胞にマウスＴｆＲ２（ｍＴｆＲ２）をコードするプラスミドをトランスフェクションによって過剰発現した後に、ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇｉｂｃｏ社製）による薬剤セレクションによって、ｍＴｆＲ２を安定発現したＨＥＫ２９３Ａ細胞（２９３Ａ－ｍＴｆＲ２細胞）をクローニングした。
　リバーストランスフェクション法によって以下のようにｓｉＲＮＡのスクリーニングを行った。トランスフェクション当日、ｓｉＲＮＡ検体を１種類あたり２ウェル分、ｓｉＲＮＡの代わりに蒸留水としたネガティブコントロール（ＮＴ）を２ウェル分、ポジティブコントロールとしてＷＯ２０１２／１７７９２１に記載されているｍＴｆＲ２に対するｓｉＲＮＡの配列に化学修飾を施した参考例１の化合物（AD47882.23DUG）を２ウェル分作製した。
　１ウェルあたり１４．８μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．２μＬのＲＮＡｉＭＡＸの混合液に５μＬのｓｉＲＮＡ（各実施例の化合物）を添加し、室温で２０分間インキュベートした。ネガティブコントロール用の試薬調製としては、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとＲＮＡｉＭＡＸの混合液に対して、ｓｉＲＮＡの代わりに５μＬの蒸留水を添加した。ポジティブコントロール用の試薬調製としては、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとＲＮＡｉＭＡＸの混合液に対して、５μＬの参考例１の化合物を添加した。次に、ｓｉＲＮＡ、ネガティブコントロールまたはポジティブコントロールを含む混合液を２０μＬずつ９６ウェルの細胞培養用プレート（ＳＵＭＩＲＯＮ社製）に添加した。混合液を添加した９６ウェルプレートに、予め３７℃に温めておいた１０％　ＦＢＳを含んだＤＭＥＭを用いて調製した２ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｍＬの２９３Ａ－ｍＴｆＲ２細胞を、１ウェルあたり８０μＬずつ播種した。ｓｉＲＮＡの最終濃度としては、１０ｎＭから１０倍公比になるように調製した。
　トランスフェクションして１日後または２日後に、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｐｒｅｐ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｓ　ＲＴ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　ｑＰＣＲ（タカラバイオ社製）を用いて、キットのプロトコルに従ってＲＮＡ抽出および逆転写反応を実施しｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲによってｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ハウスキーピング遺伝子としては、ヒト１８Ｓ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ（ｈ１８Ｓ）のｍＲＮＡ発現量を測定した。
　定量的ＰＣＲは、ＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、以下のように行った。得られたｃＤＮＡは原液として使用した。３８４ウェルのＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の１ウェルあたり、５μＬのＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、０．２５μＬのｍＴｆＲ２プライマー（Ｍｍ．ＰＴ．５８．７８６０１８５、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）または、０．２５μＬのｈ１８Ｓプライマー（Ｈｓ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８５６．ｇ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２．７５μＬの蒸留水、２μＬのｃＤＮＡの割合で混合（計１０μＬ）し、各ｃＤＮＡに対して２ウェル分調製し、定量的ＰＣＲを行った。ｍＴｆＲ２とｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量を２ウェル間の平均値として測定した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｈ１８ＳのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ネガティブコントロールにおけるｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置した検体の相対ｍＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を算出し、それぞれ表５から表８に示した。
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試験例３：正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡは、正常マウスにおける血漿中鉄濃度を上昇させることがされている（ＷＯ２０１２／１７７９２１）ことから、当該文献に記載されているＡＤ４７８８２の塩基配列に対して、様々な化学修飾を施し、かつ、ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡとして、参考例１の化合物(ＡＤ４７８８２.２３ＤＵＧ)、実施例１８乃至２５の化合物（ＡＤ４７８８２.４１ＤＵＧ～４８ＤＵＧ）を用いて以下の試験を行った。
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを１　ｍｇ／ｋｇ　（１ｍｐｋ）の用量で、雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に皮下投与（ｓ．ｃ．）した（ｎ＝５／群）。ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）群としては、ＰＢＳを皮下投与した（ｎ＝５／群）。ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳの処置前（Ｄａｙ０）、処置して２日後（Ｄａｙ２）、６日後（Ｄａｙ６）、１３日後（Ｄａｙ１３）に尾静脈採血を行い、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて、血漿中鉄濃度を測定した。血漿中鉄濃度の結果を図７に示した（平均値±標準誤差）。
試験例４：正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡのマウス体内での持続的な活性を評価するため、ＡＤ４７８８２の塩基配列に対して、様々な化学修飾を施し、かつ、ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡとして、参考例１の化合物(ＡＤ４７８８２.２３ＤＵＧ)、実施例２２の化合物（ＡＤ４７８８２.４５ＤＵＧ）、実施例２６乃至４０の化合物（ＡＤ４７８８２.７０～８４ＤＵＧ）を用いて、以下の実験を行った。
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを１　ｍｇ／ｋｇ　（１ｍｐｋ）の用量で、雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に皮下投与（ｓ．ｃ．）した（ｎ＝５／群）。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを皮下投与した（ｎ＝５／群）。ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳの処置前（Ｄａｙ０）、処置して７日後（Ｄａｙ７）、１２日後（Ｄａｙ１２）、２１日後（Ｄａｙ２１）、２８日後（Ｄａｙ２８）に尾静脈採血を行い、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて、血漿中鉄濃度を測定した。血漿中鉄濃度の結果を図８に示した（平均値±標準誤差）。
試験例５：正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　試験例４と同様に、ＡＤ４７８８２の塩基配列に対して、様々な化学修飾を施し、かつ、ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡとして、参考例１の化合物(ＡＤ４７８８２.２３ＤＵＧ)、実施例２７の化合物（ＡＤ４７８８２.７１ＤＵＧ）、実施例３６の化合物（ＡＤ４７８８２.８０ＤＵＧ）、実施例４１乃至４６の化合物（ＡＤ４７８８２.８８～９３ＤＵＧ）を用いて以下の試験を行った。
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを１　ｍｇ／ｋｇ　（１ｍｐｋ）の用量で、雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に皮下投与（ｓ．ｃ．）した（ｎ＝５／群）。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを皮下投与した（ｎ＝５／群）。ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳの処置前（Ｄａｙ０）、処置して７日後（Ｄａｙ７）、１４日後（Ｄａｙ１４）、２１日後（Ｄａｙ２１）、２８日後（Ｄａｙ２８）に尾静脈採血を行い、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて、血漿中鉄濃度を測定した。血漿中鉄濃度の結果を図９に示した（平均値±標準誤差）。
　また、ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳの処置後２８日後（Ｄａｙ２８）において、イソフルランによる麻酔下でマウスを放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＵＡＧＥＮ社製）を用いてキットのプロトコルに従って実施した。得られた５０００　ｎｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ　ｔｏ　ｃＤＮＡ　ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応することによって得られたｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲによって内因性のマウスＴｆＲ２のｍＲＮＡ量を測定した。
　定量的ＰＣＲは、ＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、以下のように行った。得られたｃＤＮＡは、蒸留水を用いて１０倍に希釈した（ｃＤＮＡ　１５μＬおよび蒸留水１３５μＬを混合した）。３８４ウェルのＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の１ウェルあたり、５μＬのＩＤＴ　ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、０．２５μＬのｍＴｆＲ２プライマー（Ｍｍ．ＰＴ．５８．７８６０１８５、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、または、２．７５μＬの蒸留水、２μＬのｃＤＮＡの割合で混合（計１０μＬ）し、各ｃＤＮＡに対して２ウェル分調製し、定量的ＰＣＲを行った。ハウスキーピング遺伝子としては、マウスβ―ａｃｔｉｎ（ｍＡｃｔｂ）プライマー（Ｍｍ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８４３．ｇ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用し、上記に記したような割合で混合し、各ｃＤＮＡに対して２ウェル分調製し、定量的ＰＣＲを行った。ｍＴｆＲ２およびｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ量を２ウェル間の平均値として測定した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｖｅｈｉｃｌｅ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、ｓｉＲＮＡ処置群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図９Ｆに示した。
試験例６：炎症に伴う貧血モデルにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡは、炎症に伴う貧血モデルにおけるＨＧＢ値を上昇させる。ＡＤ４７８８２の塩基配列に対して、様々な化学修飾を施し、かつ、ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．４１ＤＵＧ（実施例１８の化合物）、ＡＤ４７８８２．８８ＤＵＧ（実施例４１の化合物）、ＡＤ４７８８２．８９ＤＵＧ（実施例４２の化合物）、ＡＤ４７８８２．９１ＤＵＧ（実施例４４の化合物）、ＡＤ４７８８２．９２ＤＵＧ（実施例４５の化合物）、ＡＤ４７８８２．９３ＤＵＧ（実施例４６の化合物）を用いて以下の試験を行った。
　ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡを１　ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）の用量で雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に１回投与した（Ｄａｙ０）。Ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを皮下投与した。ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳを処置して、４日後（Ｄａｙ４）にｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを１５０μＬ／マウスで皮下投与して炎症を誘導した。炎症を誘導しない対象群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅの代わりにＰＢＳをｓ．ｃ．投与した。本試験ではｎ＝５／群とした。１回目のｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを投与して２日後（Ｄａｙ６）に血漿中鉄濃度を測定した。血漿中鉄濃度は、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて測定した。結果は、図１０Ａに示した。
　１回目のｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを投与して７日後（Ｄａｙ１１）に再度ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを１５０μＬ／マウスで皮下投与した。２回目のｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅを投与して３日後（Ｄａｙ１４）において、イソフルラン麻酔下で腹大静脈内採血を行い、多項目自動血球分析装置ＸＴ２０００（シスメックス株式会社製）を用いて、ＨＧＢ値、ＭＣＨ値、ＲＢＣ数を測定した。結果はそれぞれ、図１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄに示した。
　また、マウスをイソフルラン麻酔下で放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図１０Ｅに示した。炎症を誘導していないｃｏｎｔｒｏｌ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
試験例７：ＨｅｐＧ２細胞に対するＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡのリバーストランスフェクション法によるスクリーニング
　試験例１と同様の方法で、ｓｉＲＮＡとしてＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ（実施例１６）、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｓ１（実施例４８）、ＴｆＲ２－０１９．９４．ｓ２ＤＵＧ（実施例４９）、ＴｆＲ２－０１９．９４．ｅ１ＤＵＧ（実施例５０）、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ２（実施例５１）、及びＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ．ｅ３（実施例５２）を用いて、ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量について試験した。ネガティブコントロール（ＮＴ）におけるｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を１．０としたときの相対値として、各ｓｉＲＮＡを処置した検体の相対ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡ発現量を算出して表記した。結果は、以下の表９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
試験例８：正常マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　試験例５と同様に、ＡＤ４７８８２の塩基配列に対して、様々な化学修飾を施し、かつ、ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡとして、参考例１の化合物（ＡＤ４７８８２．２３ＤＵＧ）、実施例４５の化合物（ＡＤ４７８８２．９２ＤＵＧ）、実施例４７の化合物（ＡＤ４７８８２．９４ＤＵＧ）を用いて以下の実験を行った。
　ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＡＤ４７８８２．２３ＤＵＧ（２３ＤＵＧ）を１　ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）の用量で、ＡＤ４７８８２．９２ＤＵＧ（９２ＤＵＧ）を０．３　ｍｇ／ｋｇ（０．３ｍｐｋ）または１　ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）の用量で、ＡＤ４７８８２．９４ＤＵＧを０．３　ｍｇ／ｋｇ（０．３ｍｐｋ）または１　ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）の用量で、雄性のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウス（日本クレア社製）に皮下投与（ｓ．ｃ．）した（ｎ＝４または５／群）。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを皮下投与した（ｎ＝４／群）。ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳの処置前（Ｄａｙ０）、処置して９日後（Ｄａｙ９）、１４日後（Ｄａｙ１４）、２１日後（Ｄａｙ２１）、２８日後（Ｄａｙ２８）に尾静脈採血を行い、メタロアッセイ鉄測定キット（メタロジェニクス社製）を用いて、血漿中鉄濃度を測定した。血漿中鉄濃度の結果をそれぞれ図１２Ａから図１２Ｅに示した（平均値±標準誤差）。
　また、ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳの処置後２８日後（Ｄａｙ２８）において、イソフルランによる麻酔下でマウスを放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｍＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図１２Ｆに示した。ｖｅｈｉｃｌｅ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
試験例９：ヒトＴｆＲ２発現マウスにおけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの薬効評価試験
　株式会社特殊免疫研究所において作出した、ヒトＴｆＲ２遺伝子座を有する雄性または雌性のＴｆＲ２ヒト化マウスを用いて、ヒトＴｆＲ２　ｍＲＮＡに対するＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの効果を検証するために、以下の実験を行った。ＧａｌＮＡｃをコンジュゲートしたＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡとして、ＴｆＲ２－０１９．８８ＤＵＧ（実施例９）、ＴｆＲ２－０１９．９２ＤＵＧ（実施例１４）、ＴｆＲ２－０１９．９３ＤＵＧ（実施例１５）、ＴｆＲ２－０１９．９４ＤＵＧ（実施例１６）の化合物を用いた。
　ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡ処置群は、３　ｍｇ／ｋｇ（３ｍｐｋ）または０．３　ｍｇ／ｋｇ（０．３ｍｐｋ）の用量で１回皮下投与（ｓ．ｃ．）した（ｎ＝３／群）。ｖｅｈｉｃｌｅ群としては、ＰＢＳを１回皮下投与した（ｎ＝４／群）。
　薬剤処置を開始して７日後において、イソフルラン麻酔下でマウスを放血処置により安楽殺後、肝臓を採材し、ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＲＮＡの抽出および定量的ＰＣＲは、試験例５に記載の通りに実施した。ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるｍＡｃｔｂのｍＲＮＡ発現量で正規化した。ｈＴｆＲ２に対するプライマーは、試験例１及び試験例２に記載のものを使用した。ｈＴｆＲ２のｍＲＮＡ発現量の結果は、図１３に示した。ｖｅｈｉｃｌｅ群におけるｍＲＮＡ量を１．０としたときの相対値として、その他の群における相対ｍＲＮＡ量を算出して表記（平均値±標準誤差）した。
　これらの結果は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴｆＲ２　ｓｉＲＮＡの処置によって、ヒトＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現量を抑制できることを示している。また、ヒトＴｆＲ２　ｍＲＮＡの発現量を抑制することでＨＧＢ値を上昇させ、骨髄機能不全に伴う貧血、例えば、骨髄線維症に伴う貧血などの貧血疾患や、炎症に伴う貧血、例えば、慢性腎臓病に伴う貧血などの貧血疾患に対して、治療効果を提供できる可能性を示すものである。
配列番号１：ｈＴｆＲ２　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２：ＴｆＲ２－０３９のセンス鎖ヌクレオチド配列
配列番号３～８：ＴｆＲ２－０３９のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列
配列番号９：ＴｆＲ２－０１９のセンス鎖ヌクレオチド配列
配列番号１０、１１：ＴｆＲ２－０１９のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列
配列番号１２：ＡＤ４７８８２のセンス鎖ヌクレオチド配列
配列番号１３、１４：ＡＤ４７８８２のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列
配列番号１５、１６：２本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖領域のヌクレオチド配列
配列番号１７～２１：２本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖領域のヌクレオチド配列

Claims (23)

  1. 　センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域を含むオリゴヌクレオチドであって、前記センス鎖領域が以下の式（Ｉ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、前記アンチセンス鎖領域が以下の式（ＩＩ）に示すオリゴヌクレオチドからなり、さらに以下の（ａ）乃至（ｇ）に示される特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩：
    センス鎖領域：５’　ＳＯ５－Ｓａ－Ｓ１９－Ｓ１８－Ｓ１７－Ｓ１６－Ｓ１５－Ｓ１４－Ｓ１３－Ｓ１２－Ｓ１１－Ｓ１０－Ｓ９－Ｓ８－Ｓ７－Ｓ６－Ｓ５－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１－ＳＯ３　３’（Ｉ）
    アンチセンス鎖領域：５’　ＡＯ５－Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９－Ａ１０－Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５－Ａ１６－Ａ１７－Ａ１８－Ａ１９－Ａａ－ＡＯ３　３’（ＩＩ）
    （ａ）Ｓ１は３’－修飾ヌクレオシドであり、Ｓ２～Ｓ１９は１個のヌクレオシドを示し、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡであり、Ｓａは０～５個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、ＳＯ３及びＳＯ５はそれぞれ独立して、０～５個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドを示す。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
    （ｂ）Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５は１個のヌクレオシドを示し、そのうち少なくとも１つはＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＭＯＥ　ＲＮＡであり、それ以外は２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ又は２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１～Ａ１０及びＡ１６～Ａ１９は１個のヌクレオシドを示し、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、Ａａは０～５個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、ＡＯ３及びＡＯ５はそれぞれ独立して、０～５個のヌクレオシドを示し、それぞれのヌクレオシドは独立して、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、ＤＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドを示す。各ヌクレオシド間の結合は、化学修飾されていてもよいリン酸ジエステル結合を示す；
    （ｃ）Ａ２～Ａａの間のヌクレオチド配列は、標的配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列からなり、Ａ１は標的配列の対応するヌクレオシドと相補的な塩基を有するヌクレオシド、アデニンを有するヌクレオシド、チミンを有するヌクレオシド、又はウラシルを有するヌクレオシドであり、ＡＯ３とＡＯ５が存在する場合、そのヌクレオチド配列は、それぞれ独立して、標的配列の対応するヌクレオシドとは独立に選択されるヌクレオチド配列である；
    （ｄ）Ｓ１～Ｓａの間のヌクレオチド配列と、Ａ１～Ａａの間のヌクレオチド配列とは、互いに実質的に相補的なヌクレオチド配列であり、かつ、２本鎖構造を形成している；
    （ｅ）ＳＯ５とＡＯ３の両方が存在する場合、ＳＯ５及びＡＯ３は、互いに相補的ではないヌクレオチド配列である；
    （ｆ）ＳＯ３とＡＯ５の両方が存在する場合、ＳＯ３及びＡＯ５は、互いに相補的ではないヌクレオチド配列である；並びに、
    （ｇ）センス鎖領域及び／又はアンチセンス鎖領域の、５’末端のヌクレオシドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオシドの３’位もしくは３’末端のヌクレオシドが３’－修飾ヌクレオシドである場合はその２’位、が化学修飾されていてもよい。
  2. 　式（ＩＩ）において、Ｓ１が３’－ＯＭｅ　ＲＮＡである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  3. 　センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域が、それぞれ独立したオリゴヌクレオチドとして２本鎖オリゴヌクレオチドを形成している、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  4. 　２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡ又はＥＮＡである、請求項１～３に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  5. 　式（ＩＩ）において、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４及びＡ１５の２つ以上が同一又はそれぞれ異なっていてもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＭＯＥ　ＲＮＡである請求項１～４のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  6. 　式（ＩＩ）において、Ａ１４がＲＮＡ又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドである、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  7. 　式（ＩＩ）において、Ａ１３が２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシド又は２’－ＯＭｅ　ＲＮＡであり、Ａ１４がＲＮＡである、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  8. 　式（ＩＩ）において、Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５が以下のいずれか；
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(ENA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(LNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(2'-OMe RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、又は、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(2'-F RNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(RNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    である、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  9. 　式（ＩＩ）において、Ａ１２がＤＮＡであり、Ａ１４が２’－Ｏ，４’－Ｃ－架橋化修飾ヌクレオシドである、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  10. 　式（ＩＩ）において、Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５が以下のいずれか；
    Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(ENA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、Ａ１１(2'-F RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、又は、
    Ａ１１(2'-OMe RNA)－Ａ１２(DNA)－Ａ１３(2'-OMe RNA)－Ａ１４(LNA)－Ａ１５(2'-OMe RNA)、
    である、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  11. 　式（ＩＩ）において、Ａ２、Ａ６及びＡ１６が２’－Ｆ　ＲＮＡである、請求項１～１０のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  12. 　式（ＩＩ）において、更に、Ａ８、Ａ９及びＡ１０からなる群から選択される１又は２個のヌクレオシドが２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１、Ａ３～Ａ５、Ａ７、Ａ１７～Ａ１９及びＡａのヌクレオシドが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  13. 　式（ＩＩ）において、Ａ２、Ａ６、Ａ８、Ａ１０及びＡ１６が２’－Ｆ　ＲＮＡであり、Ａ１、Ａ３～Ａ５、Ａ７、Ａ９、Ａ１７～Ａ１９及びＡａのヌクレオシドが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  14. 　式（Ｉ）において、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３及びＳ１５が２’－Ｆ　ＲＮＡである請求項１～１３のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  15. 　式（Ｉ）において、Ｓ２～Ｓ１０、Ｓ１４、Ｓ１６～Ｓ１９及びＳａが２’－ＯＭｅ　ＲＮＡである請求項１４のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  16. 　式（ＩＩ）においてＲＮＡが採用される場合、当該ＲＮＡとその３’側に隣接するヌクレオシドとの間の結合がホスホロチオエート結合であることを特徴とする、請求項１～１５のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  17. 　前記オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端から２～５ヌクレオチドにおいて、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であることを特徴とする、請求項１～１６のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  18. 　ＳＯ３、ＳＯ５、ＡＯ５及びＡＯ３のヌクレオシド数が０～２である、請求項１～１７のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  19. 　ＳＯ３のヌクレオシド数が０である、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  20. 　ＳＯ３、ＳＯ５及びＡＯ５のヌクレオシド数が０であり、ＡＯ３のヌクレオシド数が２である、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  21. 　オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオシドの５’位及び／又は３’末端のヌクレオシドの３’位もしくは３’末端のヌクレオシドが３’－修飾ヌクレオシドである場合はその２’位、の化学修飾が、目的組織への輸送用ユニットである、請求項１～２０のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  22. 　目的組織への輸送用ユニットが、ＧａｌＮＡｃユニット又は脂肪酸ユニットである、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。
  23. 　ＧａｌＮＡｃユニットが、
    （式中、破線は隣接するヌクレオチドの５’末端のリン酸基及び／又は３’末端のリン酸基（３’位が修飾されたヌクレオチドでは２’位のリン酸基）とリン酸ジエステル結合することを表す。）
    で表されるユニットであることを特徴とする、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド又はその薬学上許容される塩。 
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