TW202400193A - 抑制跨膜絲胺酸蛋白酶６（ｔｍｐｒｓｓ６）表現的組成物及方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供抑制
TMPRSS6表現的寡核苷酸。亦提供包含其之組合物及其用途，尤其是關於治療與鐵調素缺乏或抑制相關之疾病、病症及/或病狀的用途。
Description
本案係關於抑制
TMPRSS6表現的寡核苷酸與包含其之組合物及其用途。
鐵是微量營養素，為每個生物體的生物學上的必需成分。它對於足夠的造血功能、氧化代謝、細胞免疫反應以及眾多其他細胞過程很重要。在其游離形態下，鐵參與氧化還原反應，導致自由基的形成，產生氧化壓力可能導致器官損傷。生物體已經發展出蛋白質系統，用於通過細胞膜和生物液體輸送游離鐵，並以非毒性且容易移動的形式儲存鐵，以避免鐵中毒。在人體中，鐵主要以與蛋白質結合複合形式存在，作為血紅素化合物、血紅素酶或非血紅素化合物。鐵吸收藉由二價金屬轉運蛋白1發生在腸上皮細胞內發生，並出現在十二指腸和上半部空腸。然後，鐵從十二指腸黏膜轉移到血液中，在該處由轉鐵蛋白運輸到細胞或骨髓進行紅血球生成。由於鐵對於許多不同的細胞功能中為所需的，需要持續平衡鐵的吸收、運輸、儲存和利用，以維持鐵的平衡。鐵調素為由
HAMP基因編碼的循環肽荷爾蒙，其由肝臟分泌，對於維持鐵平衡起重要作用。鐵調素的表現直接受鐵攝入變化的調控，抑制其會導致生物可利用血清鐵含量增加。鐵調素通過直接結合鐵泵蛋白阻斷鐵流入血漿，鐵泵蛋白為定位在十二指腸上皮細胞的細胞膜上的主要鐵輸出者從飲食中吸收鐵，也存在於巨噬細胞中回收老化紅細胞中的鐵。鐵調素與鐵泵蛋白結合後誘發其內化，並隨後誘發溶酶體降解，從而阻斷鐵輸出至循環系統。肝臟中的鐵調素表現受三種獨立的途徑調節，其中炎症(炎症因子)及高血清鐵含量導致了鐵調素上調，而當紅細胞生成增加有製造紅血球的高鐵需求時，鐵調素被下調。換句話說，當鐵調素含量高時，血清鐵含量減少，這可導致貧血。當鐵調素含量低時，在諸如血色素沉著症疾病狀態下，可發生鐵含量升高及過載。
在病理情況下，鐵調素的長期抑制經常導致原發性鐵過載，這由於其表現功能故障，而導致血漿鐵感應訊號途徑(例如，遺傳性血色素沉著症)功能喪失。在紅細胞生成增加但功能異常(例如，β地中海貧血)情況下，鐵調素被下調，導致繼發性鐵過載。原發性及繼發性鐵過載的病理生理後果為普遍的，在疾病進展過程中會導致積累游離的血漿鐵，堆積在器官中造成受損。
TMPRSS6 (跨膜蛋白酶絲胺酸6)編碼第II型絲胺酸蛋白酶，且主要在肝臟中表現。TMPRSS6參與由鐵缺乏所誘發的跨膜訊號途徑，且抑制多種編碼鐵調素的基因
HAMP的活化途徑。
研究顯示上調鐵調素改善異常血色素生成，且預防或限制β地中海貧血及遺傳性血色素沉著症小鼠模型中的鐵過載(Gardenghi等人，
J. Clin. Invest., 2010；Guo等人，
J. Clin. Invest., 2013；Schmidt等人，
Blood2013; Casu et al.
Blood2016；Ramos等人，
Blood2012)。 與HFE相關的遺傳性血色素沉著症為最常見的遺傳性鐵過載病症，在北歐人群中p.C282Y突變的患病率較高(Alexander及Kowdley，
Genetics in Medicine, 2009)。肝臟中鐵調素的產生受損被認為導致與HFE相關的血色素沉著症中的鐵過載。鐵過載在這種情況下通常會導致併發症，諸如肝硬化和糖尿病，以及其他受影響器官衰竭。
與其在抑制鐵調素表現一致，在TMPRSS6突變會導致諸如鐵難治性、缺鐵性貧血等病症。在TMPRSS6 −/−小鼠中鐵調素表現顯著增加，且在Hfe −/−小鼠中降低TMPRSS6可改善鐵過載表型(Du等人，
Science2008；Folgueras等人，
Blood2008；Finberg KE等人，
Blood, 2011)。
這個證據表明在與鐵過載相關的疾病的治療中靶向TMPRSS6的作用。目前對於這類疾病的治療選擇有限。因此，目前需要針對與鐵過載相關的病症進行有效治療的方法，而本發明解決了該需求。
本公開係部分基於對寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)降低
TMPRSS6在
活體內及
活體外表現的發現。已顯示
TMPRSS6的異常表現與改變鐵調素表現和血清鐵含量相關。如本文所示，投予
TMPRSS6RNAi寡核苷酸後，在
活體內血清鐵和血清鐵飽和度均會降低。儘管沒有受理論的限制，但抑制
TMPRSS6會增加鐵調素表現，接著降低血清鐵含量，防止鐵過載。因此，不希望受理論限制，寡核苷酸靶向的
TMPRSS6係用於治療與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病或病症。
因此，在一些態樣中，本公開提供一種用於降低跨膜絲胺酸蛋白酶6 (
TMPRSS6)表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中該有義股和該反義股形成一雙螺旋區，其中該反義股包括與
TMPRSS6mRNA標靶序列SEQ ID NOs: 661-852任一者的互補區，且其中該互補區長度為至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，有義股之長度為15至50個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為18至36個核苷酸。
在一些實施例中，反義股之長度為15至30個核苷酸。
在一些實施例中，該反義股之長度為22個核苷酸，且該反義股及該有義股形成長度為至少19個核苷酸之雙螺旋區，視情況長度為至少20個核苷酸。在一些實施例中，互補區之長度為至少19個連續核苷酸。在一些實施例中，互補區之長度為20個連續核苷酸。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現之雙股RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括：
(i)長度為19-30個核苷酸的反義股，其中該反義股包括一核苷酸序列，其包括有與
TMPRSS6mRNA標靶序列互補區，其中該互補區選自於SEQ ID NO: 1-192，以及
(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括該反義股之互補區，其中該反義股及該有義股為單獨股，其形成在該反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現之雙股RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括：
(i)長度為19-30個核苷酸的反義股，其中該反義股包括一核苷酸序列，其包括一與
TMPRSS6mRNA標靶序列互補之區域，其中該互補區選自於SEQ ID NO: 1-192，以及
(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括該反義股之互補區，其中該反義股及該有義股為單獨股，其形成在該反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，該有義股之3'端包括示為S1-Lp-S2之莖-環，其中S1與S2互補，且其中Lp在S1與S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環。在一些實施例中，Lp為三環或四環。在一些實施例中，Lp為四環。在一些實施例中，四環包括序列5’-GAAA-3’。在一些實施例中，S1及S2之長度為1至10個核苷酸，且具有相同長度。在一些實施例中，S1及S2之長度為1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸或10個核苷酸。在一些實施例中，S1及S2之長度為6個核苷酸。在一些實施例中，莖環包括序列5’-GCAGCCGAAAGGCUGC-3’ (SEQ ID NO: 856)。
在一些實施例中，該有義股之接近3'端包括示為S1-Lp-S2之莖-環，其中S1與S2互補，且其中Lp在S1與S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環。在一些實施例中，Lp為三環或四環。在一些實施例中，Lp為四環。在一些實施例中，四環包括序列5’-GAAA-3’。在一些實施例中，S1及S2之長度為1至10個核苷酸，且具有相同長度。在一些實施例中，S1及S2之長度為1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸或10個核苷酸。在一些實施例中，S1及S2之長度為6個核苷酸。在一些實施例中，莖環包括序列5’-GCAGCCGAAAGGCUGC-3’ (SEQ ID NO: 856)。
在一些實施例中，該反義股包括長度為一或多個核苷酸的3'突出序列。在一些實施例中，突出序列包括嘌呤核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端序列之長度為2個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端係選自AA、GG、AG及GA。在一些實施例中，突出端為GG或AA。在一些實施例中，突出端為GG。
在一些實施例中，該寡核苷酸包括至少一個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包括2'-修飾。在一些實施例中，該2'-修飾為選自以下之修飾：2'-胺基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸。在一些實施例中，該修飾為選自以下之2'-修飾：2'-氟以及2'-O-甲基。在一些實施例中，該有義股之約10-15%、10%、11%、12%、13%、14%或15%之核苷酸包括2’-氟修飾。在一些實施例中，該反義股之約25-35%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%或35%之核苷酸包括2’-氟修飾。在一些實施例中，該寡核苷酸之約25-35%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%或35%之核苷酸包括2’-氟修飾。在一些實施例中，該有義股包括36個核苷酸，其中自5’至3’位置為1-36，其中位置8-11包括2’-氟修飾。在一些實施例中，該反義股包括22個核苷酸，其中自5’至3’位置為1-22，且其中位置2、3、4、5、7、10及14包括2’-氟修飾。
在一些實施例中，寡核苷酸包括至少一個經修飾的核苷酸間鍵。在一些實施例中，至少一個經修飾之核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，該反義股包括(i)位置1與2之間，及位置2與3之間；或(ii)位置1與2之間、位置2與3之間，及位置3與4之間的硫代磷酸酯鍵，其中自5'至3'編號位置為1-4。在一些實施例中，該反義股之長度為22個核苷酸，且其中該反義股包括位置20與21之間及位置21與22之間的硫代磷酸酯鍵，其中自5'至3'編號1-22位置。在一些實施例中，該反義股之長度為22個核苷酸，且其中該反義股包括位置1與2之間、位置2與3之間、位置3與4之間、位置20與21之間及位置21與22之間的硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，有義股包括位置1與2之間的硫代磷酸酯鍵，其中位置自5'至3'編號。
在一些實施例中，該反義股之5′-核苷酸之糖之4'-碳包括磷酸酯類似物。在一些實施例中，該磷酸酯類似物為氧甲基磷酸酯、乙烯基磷酸酯或丙二醯基磷酸酯，視情況其中該磷酸酯類似物為包括有4'-氧甲基膦酸酯之4’-磷酸酯類似物。
在一些實施例中，寡核苷酸的至少一個核苷酸與一或多個靶向配體共軛。在一些實施例中，各靶向配體包括碳水化合物、胺糖、膽固醇、或多肽。在一些實施例中，該莖環包括與該莖環之一或多個核苷酸共軛之一或多個靶向配體。在一些實施例中，該一或多個靶向配體與該環之一或多個核苷酸共軛。在一些實施例中，該環包括自5'至3'編號為1-4之4個核苷酸，其中在位置2、3及4處之核苷酸各自包括一或多個靶向配體，其中該靶向配體相同或不同。在一些實施例中，每一靶向配體包括N-乙醯半乳醣胺(GalNAc)部分。在一些實施例中，該GalNAc部分為單價GalNAc部分、二價GalNAc部分、三價GalNAc部分、或四價GalNAc部分。在一些實施例中，該莖-環之Lp之至多4個核苷酸各自與單價GalNAc部分共軛。
在一些實施例中，互補區與mRNA標靶序列完全互補。在一些實施例中，互補區與mRNA標靶序列部分互補。在一些實施例中，互補區包括與mRNA標靶序列不超過四個錯配。
在一些實施例中，該互補區與在該反義股之核苷酸位置2-8處之
TMPRSS6mRNA標靶序列完全互補，其中核苷酸位置係自5’至3’編號。在一些實施例中，該互補區與在該反義股之核苷酸位置2-11處之
TMPRSS6mRNA標靶序列完全互補，其中核苷酸位置係自5’至3’編號。
在一些實施例中，有義股包括SEQ ID NOs: 579-580、585-587、590及595-597中任一者之核苷酸序列。在一些實施例中，反義股包括SEQ ID NOs: 600-601、606-608、611及616-618中任一者之核苷酸序列。
在一些實施例中，有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608。
在一些實施例中，有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607。
在一些實施例中，該有義股包括如SEQ ID NO: 579中所示之核苷酸序列，且該反義股包括如SEQ ID NO: 600中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，該有義股包括如SEQ ID NO: 580中所示之核苷酸序列，且該反義股包括如SEQ ID NO: 601中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，該有義股包括如SEQ ID NO: 590中所示之核苷酸序列，且該反義股包括如SEQ ID NO: 611中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，該有義股包括如SEQ ID NO: 597中所示之核苷酸序列，且該反義股包括如SEQ ID NO: 618中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，該有義股包括如SEQ ID NO: 586中所示之核苷酸序列，且該反義股包括如SEQ ID NO: 607中所示之核苷酸序列。
在一些實施例中，反義股之長度為22個核苷酸。
在一些實施例中，反義股包括選自SEQ ID NO: 600-601、606-608、611及616-618之核苷酸序列。
在一些實施例中，有義股之長度為36個核苷酸。
在一些實施例中，有義股包括選自SEQ ID NO: 579-580、585-587、590及595-597之核苷酸序列。
在一些實施例中，有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 621及642；
(b)分別為SEQ ID NO: 622及643；
(c)分別為SEQ ID NO: 637及658；
(d)分別為SEQ ID NO: 632及653；
(e)分別為SEQ ID NO: 638及659；
(f)分別為SEQ ID NO: 639及660；
(g)分別為SEQ ID NO: 627及648；
(h)分別為SEQ ID NO: 628及649；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 629及650。
在一些實施例中，有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 621及642；
(b)分別為SEQ ID NO: 622及643；
(c)分別為SEQ ID NO: 632及653；
(d)分別為SEQ ID NO: 639及660；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 628及649。
在一些實施例中，該有義股包括如SEQ ID NO: 621中所示之核苷酸序列，且該反義股包括如SEQ ID NO: 642中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，該有義股包括如SEQ ID NO: 622中所示之核苷酸序列，且該反義股包括如SEQ ID NO: 643中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，該有義股包括如SEQ ID NO: 632中所示之核苷酸序列，且該反義股包括如SEQ ID NO: 653中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，該有義股包括如SEQ ID NO: 639中所示之核苷酸序列，且該反義股包括如SEQ ID NO: 660中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，該有義股包括如SEQ ID NO: 628中所示之核苷酸序列，且該反義股包括如SEQ ID NO: 649中所示之核苷酸序列。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括下列序列以及全部修飾：5′ -[mGs][mG][mU][mG][mC][mU][mA][fC][fU][fC][fU][mG][mG][mU][mA][mU][mU][mU][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 621)，且其中該反義股包括下列序列以及全部修飾：5′ [Me磷酸酯-4O-mUs][fGs][fAs][fA][fA][mU][fA][mC][mC][fA][mG][mA][mG][fU][mA][mG][mC][mA][mC][mCs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 642)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，以及其中ademA-GalNAc =
。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括下列序列以及全部修飾：5′ [mGs][mC][mU][mA][mC][mU][mC][fU][fG][fG][fU][mA][mU][mU][mU][mC][mC][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 622)，且其中該反義股包括下列序列以及全部修飾：5′ [Me磷酸酯-4O-mUs][fUs][fAs][fG][fG][mA][fA][mA][mU][fA][mC][mC][mA][fG][mA][mG][mU][mA][mG][mCs][mGs][mG]- 3′ (SEQ ID NO: 643)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，以及其中ademA-GalNAc =
。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括下列序列以及全部修飾：5′ - [mCs][mU][mC][mA][mC][mC][mU][fG][fC][fU][fU][mC][mU][mU][mC][mU][mG][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 632)，且其中該反義股包括下列序列以及全部修飾：5′ -[Me磷酸酯-4O-mUs][fAs][fCs][fC][fA][mG][fA][mA][mG][fA][mA][mG][mC][fA]
[mG][mG][mU][mG][mA][mGs][mGs][mG] -3′ (SEQ ID NO: 653)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，且其中ademA-GalNAc =
。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括下列序列以及全部修飾：5′ -[mAs][mG][mU][mG][mU][mG][mA][fA][fA][fG][fA][mC][mA][mU][mA][mG][mC][mU][mG][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]3’ (SEQ ID NO: 639)，且其中該反義股包括下列序列以及全部修飾：5′- [Me磷酸酯-4O-mUs][fCs][fAs][fG][fC][mU][fA][mU][mG][fU][mC][mU][mU][fU][mC][mA][mC][mA][mC][mUs][mGs][mG] -3′ (SEQ ID NO: 660)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，以及其中ademA-GalNAc =
。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括下列序列以及全部修飾：5′ -[mGs][mG][mG][mU][mG][mC][mA][fC][fU][fA][fU][mG][mG][mC][mU][mU][mG][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]3’ (SEQ ID NO: 628)，且其中該反義股包括下列序列以及全部修飾：5′- [Me磷酸酯-4O-mUs][fUs][fAs][fC][fA][mA][fG][mC][mC][fA][mU][mA][mG][fU][mG][mC][mA][mC][mC][mCs][mGs][mG] -3′ (SEQ ID NO: 649)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，以及其中ademA-GalNAc =
。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括SEQ ID NO: 621：且其中該反義股包括SEQ ID NO: 642，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，其中所述RNAi係以具有如圖14A所示結構的共軛形式存在。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括SEQ ID NO: 632：且其中該反義股包括SEQ ID NO: 653，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，其中所述RNAi係以具有如圖14B所示結構的共軛形式存在。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括SEQ ID NO: 639：且其中該反義股包括SEQ ID NO: 660，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，其中所述RNAi係以具有如圖14C所示結構的共軛形式存在。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括SEQ ID NO: 628：且其中該反義股包括SEQ ID NO: 649，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，其中所述RNAi係以具有如圖14D所示結構的共軛形式存在。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括SEQ ID NO: 621：且其中該反義股包括SEQ ID NO: 642，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，其中所述RNAi係以具有如圖10A-B所示結構的共軛形式存在。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括SEQ ID NO: 632：且其中該反義股包括SEQ ID NO: 653，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，其中所述RNAi係以具有如圖11A-B所示結構的共軛形式存在。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括SEQ ID NO: 639：且其中該反義股包括SEQ ID NO: 660，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，其中所述RNAi係以具有如圖12A-B所示結構的共軛形式存在。
在一些態樣中，本公開提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股及反義股，其中該有義股包括SEQ ID NO: 628：且其中該反義股包括SEQ ID NO: 649，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，其中所述RNAi係以具有如圖13A-B所示結構的共軛形式存在。
在一些實施例中，本公開提供一種醫藥組合物，其包括本文所述之RNAi寡核苷酸及醫藥學上可接受之載劑、遞送劑或賦形劑。
在一些實施例中，本公開提供一種用於治療患有與鐵調素缺乏或抑制相關之疾病、病症、或病狀之個體之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如本文所述之RNAi寡核苷酸或其醫藥組合物，從而治療該個體。 在一些實施例中，投予RNAi寡核苷酸後，鐵調素的表現增加。在一些實施例中，投予RNAi寡核苷酸後，血清中鐵飽和含量減少。在一些實施例中，投予RNAi寡核苷酸後，血清鐵含量減少。
在一些實施例中，本發明提供一種將寡核苷酸遞送至個體之方法，該方法包括向該個體投予如本文所述之醫藥組合物。
在一些實施例中，本發明提供一種用於降低細胞、細胞群或個體中的
TMPRSS6表現的方法，該方法包括以下步驟：
i.將細胞或細胞群體與如本文所述的RNAi寡核苷酸、或如本文所述之醫藥組合物接觸；或
ii.向個體投予如本文所述之RNAi寡核苷酸或本文所述之醫藥組合物。
在一些實施例中，降低
TMPRSS6表現包括降低
TMPRSS6mRNA的量或水平、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(matriptase-2)的量或水平或兩者皆是。在一些實施例中，降低
TMPRSS6表現導致鐵調素生成增加。在一些實施例中，降低
TMPRSS6表現導致血清鐵含量減少。在一些實施例中，降低
TMPRSS6表現導致血清鐵飽和度減少。
在一些實施例中，個體患有與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀。在一些實施例中，該與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀為血色素沉著症或β地中海貧血。在一些實施例中，該與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀為真性紅血球增多症。
在一些實施例中，該RNAi寡核苷酸或該醫藥組合物係與第二組合物或治療劑組合投與。
在一些實施例中，本公開提供一種如本文所述之RNAi寡核苷酸或醫藥組合物，其係用作在製造治療與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀的藥物，視情況為治療血色素沉著症(例如，遺傳性血色素沉著症)、真性紅血球增多症或β地中海貧血。
在一些實施例中，本公開提供一種如本文所述之RNAi寡核苷酸或醫藥組合物，其係用作治療或適用於治療與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀，視情況為治療血色素沉著症(例如，遺傳性血色素沉著症)、真性紅血球增多症或β地中海貧血。
在一些實施例中，本公開提供一種套組，其包括如本文所述之RNAi寡核苷酸、且視情況選用醫藥學上可接受之載劑及藥品仿單，該藥品仿單包括有向患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀的個體投與的說明書。
在一些實施例中，本公開提供一種如本文所述之RNAi寡核苷酸或醫藥組合物或套組用於或適用於治療與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀，其中該與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀為血色素沉著症(例如，遺傳性血色素沉著症)、真性紅血球增多症或β地中海貧血。
跨膜絲胺酸蛋白酶6 (TMPRSS6)編碼位於細胞的表面的第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(matriptase-2)。Matriptase-2蛋白質通過調節鐵調素，在鐵的平衡調控中發揮功能。
根據一些態樣，本發明提供可降低肝臟中
TMPRSS6表現的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸設計成治療與鐵調素缺乏或抑制相關之疾病。在一些態樣中，本發明提供藉由降低特定細胞(例如，肝細胞)或器官(例如，肝)中的
TMPRSS6表現來治療與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病之方法。
TMPRSS6 表現之寡核苷酸抑制劑
TMPRSS6 標靶序列
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(如RNAi寡核苷酸)係靶向至包括
TMPRSS6mRNA之標靶序列。在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸係靶向位於
TMPRSS6mRNA序列內之標靶序列。在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸係對應於位於
TMPRSS6mRNA序列內之標靶序列。在一些實施例中，該寡核苷酸或其部分、片段或股(例如，雙股(ds)RNAi寡核苷酸的反義股或引導股)與包括有
TMPRSS6mRNA的標靶序列結合或黏合，從而抑制
TMPRSS6的表現。
在一些實施例中，該寡核苷酸係靶向至
TMPRSS6標靶序列，用於抑制
TMPRSS6 之體內表現目的。在一些實施例中，藉由靶向
TMPRSS6標靶序列的寡核苷酸來抑制
TMPRSS6表現的量或程度，係與該寡核苷酸的效力相關。在一些實施例中，靶向
TMPRSS6標靶序列之寡核苷酸對
TMPRSS6表現之抑制量或程度，與用寡核苷酸治療患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀之個體或患者中的治療益處量或程度相關。
通過檢驗編碼
TMPRSS6的mRNA (包括多種不同物種的mRNA (例如，人類、食蟹猴、小鼠和大鼠；請參見例如實例2))的核苷酸序列，並作為
體外和
體內測試的結果(請見如實例2-5)，已發現
TMPRSS6mRNA的某些核苷酸序列比其他核苷酸序列更適合寡核苷酸-基礎的抑制，因此可作為本文所述之寡核苷酸的標靶序列。在一些實施例中，
TMPRSS6標靶序列包括或由以下任一序列組成：SEQ ID NO: 661-852。在一些實施例中，
TMPRSS6標靶序列包括或由以下所示之序列組成：SEQ ID NO: 844、841、818、794或762。在一些實施例中，
TMPRSS6標靶序列包括或由以下所示之序列組成：SEQ ID NO: 844。在一些實施例中，
TMPRSS6標靶序列包括或由以下所示之序列組成：SEQ ID NO: 841。在一些實施例中，
TMPRSS6標靶序列包括或由以下所示之序列組成：SEQ ID NO: 818。在一些實施例中，
TMPRSS6標靶序列包括或由以下所示之序列組成：SEQ ID NO: 794。在一些實施例中，
TMPRSS6標靶序列包括或由以下所示之序列組成：SEQ ID NO: 762。
TMPRSS6靶向序列
在一些實施例中，出於靶向細胞中之
TMPRSS6mRNA及抑制及/或降低
TMPRSS6表現之目的，本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)具有
TMPRSS6mRNA (
例如在
TMPRSS6mRNA之標靶序列內)的互補區。在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸包括一
TMPRSS6標靶序列(例如，dsRNAi寡核苷酸之一反義股或引導股)，其具有藉由互補(沃森-克里克)鹼基配對而與
TMPRSS6標靶序列結合或黏合的互補區。該靶向序列或互補區通常具有合適的長度和鹼基含量，以使該寡核苷酸(或其一股)可與
TMPRSS6mRNA結合或黏合，以達到抑制及/或降低
TMPRSS6表現的目的。在一些實施例中，靶向序列或互補區之長度為至少約12、至少約13、至少約14、至少約15、至少約16、至少約17、至少約18、至少約19、至少約20、至少約21、至少約22、至少約23、至少約24、至少約25、至少約26、至少約27、至少約28、至少約29或至少約30個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列或互補區之長度為約12至約30 (
例如12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至27或15至30)個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列或互補區之長度為約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列或互補區之長度為18個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列或互補區之長度為19個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列或互補區之長度為20個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列或互補區之長度為21個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列或互補區之長度為22個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列或互補區之長度為23個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列或互補區之長度為24個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之序列互補的標靶序列或互補區，且靶向序列或互補區之長度為18個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之序列互補的標靶序列或互補區，且靶向序列或互補區之長度為19個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 193-384中之任一者之序列互補的標靶序列或互補區，且靶向序列或互補區之長度為20個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 193-384中之任一者之序列互補的標靶序列或互補區，且靶向序列或互補區之長度為21個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 193-384中之任一者之序列互補的標靶序列或互補區，且靶向序列或互補區之長度為22個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 193-384中之任一者之序列互補的標靶序列或互補區，且靶向序列或互補區之長度為23個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 193-384中之任一者之序列互補的標靶序列或互補區，且靶向序列或互補區之長度為24個核苷酸。
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(如RNAi寡核苷酸)包括靶向序列或互補區(如雙股寡核苷酸之反義股或引導股)，其完全互補於一
TMPRSS6標靶序列。在一些實施例中，該靶向序列或互補區部分互補於一
TMPRSS6標靶序列。在一些實施例中，該寡核苷酸包括一靶向序列或互補區，其完全互補於一
TMPRSS6標靶序列。在一些實施例中，該寡核苷酸包括一靶向序列或互補區，其部分互補於一
TMPRSS6標靶序列。
在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之序列完全互補之靶向序列或互補區。在一些實施例中，該寡核苷酸包括一靶向序列或互補區，其完全互補於下列所示之序列：SEQ ID NO: 844、841、818、794和762。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之序列部分互補之靶向序列或互補區。在一些實施例中，該寡核苷酸包括一靶向序列或互補區，其部分互補於下列所示之序列：SEQ ID NO: 844、841、818、794及762。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括與
TMPRSS6mRNA內之連續核苷酸序列互補之靶向序列或互補區，其中該連續核苷酸序列之長度為約12至約30個核苷酸(
例如長度為12至30、12至28、12至26、12至24、12至20、12至18、12至16、14至22、16至20、18至20或18至19個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸包括與
TMPRSS6mRNA內之連續核苷酸序列互補之靶向序列或互補區，其中該連續核苷酸序列之長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包含與
TMPRSS6mRNA內之連續核苷酸序列互補之靶向序列或互補區，其中該連續核苷酸序列之長度為19個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與
TMPRSS6mRNA內之連續核苷酸序列互補之靶向序列或互補區，其中該連續核苷酸序列之長度為20個核苷酸。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之連續核苷酸序列互補之靶向序列或互補區，視情況其中該連續核苷酸序列之長度為19個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 844、841、818、794及762中之任一者之連續核苷酸序列互補之靶向序列或互補區，其中該連續核苷酸序列之長度為19個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 376、373、350、326及294中之任一者之連續核苷酸序列互補之靶向序列或互補區，其中該連續核苷酸序列之長度為20個核苷酸。
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸(如RNAi寡核苷酸)包括一靶向序列或互補區，其具有一或多個鹼基對(bp)與相對應的
TMPRSS6標靶序列不匹配。在一些實施例中，該靶向序列或互補區可具有與相對應的
TMPRSS6靶向序列至多約1個、至多約2個、至多約3個、至多約4個、至多約5個等錯配，條件為該靶向序列或互補區在合適的雜合條件下與
TMPRSS6mRNA結合或黏合之能力，及/或該寡核苷酸抑制
TMPRSS6表現的能力得以維持。此外，在一些實施例中，該靶向序列或互補區可具有與相對應的
TMPRSS6標靶序列不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、不超過5個錯配，條件為該靶向序列或互補區在合適的雜合條件下與
TMPRSS6mRNA結合或黏合之能力，及/或該寡核苷酸抑制
TMPRSS6表現的能力得以維持。在一些實施例中，寡核苷酸包括與對應標靶序列具有1個錯配之靶向序列或互補區。在一些實施例中，寡核苷酸包含與對應標靶序列具有2個錯配之靶向序列或互補區。在一些實施例中，寡核苷酸包含與對應標靶序列具有3個錯配之靶向序列或互補區。在一些實施例中，寡核苷酸包含與對應標靶序列具有4個錯配之靶向序列或互補區。在一些實施例中，寡核苷酸包含與對應標靶序列具有5個錯配之靶向序列或互補區。在一些實施例中，寡核苷酸包括與對應標靶序列具有超過一個錯配(
例如2、3、4、5或更多個錯配)之靶向序列或互補區，其中至少2個(
例如全部)錯配係連續置放(
例如連續2、3、4、5或更多個錯配)，或其中錯配穿插在整個靶向序列或互補區中。在一些實施例中，寡核苷酸包括與對應標靶序列具有超過一個錯配(
例如2、3、4、5或更多個錯配)之靶向序列或互補區，其中至少2個(
例如全部)錯配係連續置放(
例如連續2、3、4、5或更多個錯配)，或其中至少一或多個非錯配鹼基對位於該等錯配之間、或其組合。在一些實施例中，該寡核苷酸包括一標靶序列或互補區，其互補於SEQ ID NO: 661-852之任一者之核苷酸連續序列，其中該標靶序列或互補區可具有與相對應的
TMPRSS6標靶序列至多約1個、至多約2個、至多約3個、至多約4個、至多約5個等錯配。在一些實施例中，該寡核苷酸包含一標靶序列或互補區，其互補於SEQ ID NO: 661-852之任一者之一核苷酸連續序列，其中該標靶序列或互補區可具有與相對應的
TMPRSS6標靶序列不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、或不超過5個錯配。在一些實施例中，該寡核苷酸包括一標靶序列或互補區，其互補於SEQ ID NO: 661-852之任一者之核苷酸連續序列，其中該標靶序列或互補區可具有與相對應的
TMPRSS6標靶序列至多約1個、至多約2個、至多約3個、至多約4個、至多約5個等錯配。在一些實施例中，該寡核苷酸包含一標靶序列或互補區，其互補於SEQ ID NO: 844、841、818、794及762之任一者之一核苷酸連續序列，其中該靶向序列或互補區可具有與相對應的
TMPRSS6標靶序列不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個、或不超過5個錯配。
寡核苷酸之類型
多種寡核苷酸類型及/或結構可用於在本文的方法中靶向
TMPRSS6，包含但不限於RNAi寡核苷酸、反義寡核苷酸(ASO)、miRNA等。考慮將本文或別處描述的任何寡核苷酸類型使用作為整合本文所述之
TMPRSS6標靶序列的框架，用於抑制
TMPRSS6表現的目的。
在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸藉由參與涉及Dicer之上游或下游的RNA干擾(RNAi)路徑來抑制
TMPRSS6表現。舉例而言，已研發出各股大小為約19-25個核苷酸、具有至少一個1至5個核苷酸之3′突出端的RNAi寡核苷酸(
參見例如美國專利案第8,372,968號)。亦已研發出由Dicer處理以產生活性RNAi產物之較長寡核苷酸(
參見例如美國專利案第8,883,996號)。其他工作製備出延長的dsRNA，其中至少一股之至少一端延長超出雙螺旋靶向區，包括其中一個股包含熱力學穩定性四環結構(
參見例如美國專利第8,513,207號及第8,927,705號；以及國際專利申請公開案第WO 2010/033225號)。此類結構可包含單股(ss)延伸部分(在分子之一或兩側上)以及雙股(ds)延伸部分。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸與Dicer參與(
例如Dicer裂解)之下游之RNAi路徑接合。在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸為Dicer受質。在一些實施例中，當內源性Dicer處理後，製備出能夠降低
TMPRSS6表現之長度為19-23個核苷酸之雙股核酸。在一些實施例中，寡核苷酸在反義股之3'端具有突出端(
例如長度為1、2或3個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸(
例如siRNA)包括與目標RNA反義之21-核苷酸引導股及互補隨從股，其中兩股退火以形成19 bp雙螺旋及在任一個或兩個3′端處之2個核苷酸的突出端。較長寡核苷酸設計亦可用，包含具有23個核苷酸之引導股及21個核苷酸之隨從股的寡核苷酸，其中在分子右側(隨從股之3'端/引導股之5'端)存在平端，且在分子左側(隨從股之5'端/引導股之3'端)存在兩個核苷酸的3′-引導股突出端。在此類分子中，存在21 bp雙螺旋區。
參見例如美國專利第9,012,138號、第9,012,621號及第9,193,753號。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其長度均在約17至36 (
例如17至36、20至25或21-23)個核苷酸範圍內。在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸包括長度為19-30個核苷酸之反義股及長度為19-50個核苷酸之有義股，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含有義股及反義股，其長度均在約19-22個核苷酸範圍內。在一些實施例中，有義股及反義股具有相等長度。在一些實施例中，寡核苷酸包括有義股及反義股，以使得在有義股或反義股二者中之一者或有義股及反義股兩者上存在3′-突出端。在一些實施例中，對於具有長度均在約21-23個核苷酸範圍內之有義股及反義股之寡核苷酸而言，有義股、反義股或有義股及反義股兩者上之3′突出端之長度為1或2個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸具有22個核苷酸之引導股及20個核苷酸之隨從股，其中在分子右側(隨從股之3'端/引導股之5'端)存在平端，且在分子左側(隨從股之5'端/引導股之3'端)存在2個核苷酸的3′-引導股突出端。在此類分子中，存在20 bp雙螺旋區。
用於與本文中之組合物及方法一起使用之其他寡核苷酸設計包含：16聚體siRNA (參見例如Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Blackburn (編), ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, 2006)、shRNA (例如，具有19 bp或較短的莖；參見例如Moore等人(2010) Methods Mol. Biol. 629:141-158)、平siRNA (例如，長度為19個bp；參見例如，Kraynack及Baker (2006) RNA 12:163-176)、不對稱siRNA (aiRNA；參見例如，Sun等人(2008) Nat. Biotechnol. 26:1379-82)、不對稱較短雙螺旋siRNA (參見例如，Chang等人 (2009) Mol. Ther. 17:725-32)、分叉siRNA (參見例如，Hohjoh (2004) FEBS Lett. 557:193-98)、ss siRNA (Elsner (2012) Nat. Biotechnol. 30:1063)、啞鈴狀環狀siRNA (參見例如，Abe等人(2007) J. Am. Chem. Soc. 129:15108-09)及內部多區段小干擾RNA (siRNA；參見例如，Bramsen等人 (2007) Nucleic Acids Res. 35:5886-97)。可用於一些實施例中降低或抑制
TMPRSS6表現的寡核苷酸結構的其他非限制性實例為微型RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)和短siRNA (請參見如Hamilton等人，(2002) EMBO J
.21:4671-79；亦請另見美國專利申請公開號2009/0099115)。
此外，在一些實施例中，本文中用於降低或抑制
TMPRSS6表現的寡核苷酸為單股(ss)。此類結構可包含但不限於單股RNAi分子。近期成果已證實ss RNAi分子之活性(參見例如，Matsui 等人(2016) Mol. Ther. 24:946-55)。然而，在一些實施例中，本文中之寡核苷酸為反義寡核苷酸(ASO)。反義寡核苷酸為具有如下核鹼基序列之單股寡核苷酸：當以5′至3′方向書寫時，包括特定核酸之靶向片段之反向互補序列，且經適當修飾(
例如作為間隙子)以誘導細胞中RNaseH介導之其目標RNA裂解或(
例如作為混合子)，以抑制細胞中目標mRNA的轉譯。供本文中所用之ASO可以此項技術中已知之任何適合方式進行修飾，包括例如如美國專利案第9,567,587號中所示(包括
例如長度、核鹼基(嘧啶、嘌呤)之糖部分及核鹼基之雜環部分的改變)。此外，已使用ASO來降低特定目標基因之表現數十年(參見例如，Bennett等人(2017) Annu. Rev. Pharmacol. 57:81-105)。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸與
TMPRSS6mRNA共享一個互補區。在一些實施例中，反義寡核苷酸靶向鑑別為NM_001289000.2之人類
TMPRSS6基因之多個區域。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為15-50個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為15-25個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為22個核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸與SEQ ID NO: 661-852中之任一者互補。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為至少19個連續核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸之長度為至少20個連續核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸與標靶序列相差1、2或3個核苷酸。
雙股寡核苷酸
在一些態樣中，本揭示提供用於靶向
TMPRSS6mRNA並抑制
TMPRSS6表現(例如，藉由RNAi途徑)的雙股(ds)RNAi寡核苷酸，其包括有義股(在本文中也稱為隨從股)和反義股(在本文中也稱為引導股)。在一些實施例中，有義股及反義股為單獨股且不共價連接。在一些實施例中，有義股及反義股為共價連接的。在一些實施例中，有義股及反義股形成雙螺旋區，其中有義股及反義股或其部分以互補方式(例如藉由沃森-克里克鹼基配對)彼此結合。
在一些實施例中，有義股與反義股之第一區域(R1)形成第一雙螺旋(D1)。在一些實施例中，D1之長度為至少約15 (
例如、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)個核苷酸。在一些實施例中，D1之長度在約12至30個核苷酸範圍內(
例如長度為12至30、12至27、15至22、18至22、18至25、18至27、18至30或21至30個核苷酸)。在一些實施例中，D1之長度為至少12個核苷酸(
例如長度為至少12、至少15、至少20、至少25或至少30個核苷酸)。在一些實施例中，D1之長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，D1之長度為20個核苷酸。在一些實施例中，包括有義股及反義股之D1不跨越有義股及/或反義股之全長。在一些實施例中，包括有義股及反義股之D1跨越有義股或反義股二者中之一者或兩者之全長。在某些實施例中，包括有義股及反義股之D1跨越有義股及反義股兩者之全長。
在一些實施例中，有義股具有及第二區(R2)，其中R2包括第一子區(S1)、環例(Lp)如四環(tetraLp)或三環(triLp)及第二子區(S2)，其中Lp位於S1與S2之間，且其中S1及S2形成第二雙螺旋(D2)。D2可具有各種長度。在一些實施例中，D2之長度為約1-6 bp。在一些實施例中，D2之長度為2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5或4-5 bp。在一些實施例中，D2之長度為1、2、3、4、5或6 bp。在一些實施例中，D2之長度為6 bp。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括SEQ ID NO: 193-384中之任一者之序列的有義股及包括SEQ ID NO: 385-576中之任一者之序列的反義股。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括SEQ ID NO: 661-852中之任一者之序列的有義股及包括SEQ ID NO: 1-192中之任一者之序列的反義股。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括具有SEQ ID NO: 577-597中之任一者之序列的有義股及包括選自SEQ ID NO: 598-618中之任一者之序列的反義股，如
表 4所佈置。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括了包括有選自以下之核苷酸序列的有義股及反義股：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括了包括有選自以下之核苷酸序列的有義股及反義股：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607。
在一些實施例中，有義股包括SEQ ID NO: 579之序列，且反義股包括SEQ ID NO: 600之序列。在一些實施例中，有義股包括SEQ ID NO: 580之序列，且反義股包括SEQ ID NO: 601之序列。在一些實施例中，有義股包括SEQ ID NO: 590之序列，且反義股包括SEQ ID NO: 611之序列。在一些實施例中，有義股包括SEQ ID NO: 597之序列，且反義股包括SEQ ID NO: 618之序列。在一些實施例中，有義股包括SEQ ID NO: 586之序列，且反義股包括SEQ ID NO: 607之序列
應瞭解,在一些實施例中，序列表中呈現之序列可在描述寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)或其他核酸之結構時提及。在此類實施例中，當相較於指定序列時，實際寡核苷酸或其他核酸可具有一或多個替代核苷酸(
例如DNA核苷酸之RNA對應體或RNA核苷酸之DNA對應體)及/或一或多個經修飾之核苷酸及/或一或多個經修飾之核苷酸間鍵及/或一或多個其他修飾，同時保留與指定序列基本上相同或類似的互補特性。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括有義股及反義股，當其被Dicer酶作用時導致併入成熟RISC中的反義股。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包含括25-核苷酸有義股及27-核苷酸反義股，當其被Dicer酶作用時導致併入成熟RISC中的反義股。在一些實施例中，該25-核苷酸有義股包括選自SEQ ID NO: 193-384之序列。在一些實施例中，該27-核苷酸反義股包括選自SEQ ID NO: 385-576之序列。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股長於27個核苷酸(
例如28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股長於25個核苷酸(
例如26、27、28、29或30個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股包括選自SEQ ID NO: 577-597之核苷酸序列，其中核苷酸序列長於27個核苷酸(
例如28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股包括選自SEQ ID NO: 577-597之核苷酸序列，其中核苷酸序列長於25個核苷酸(
例如26、27、28、29或30個核苷酸)。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)具有一個當相較於其他5'端熱力學上較不穩定的5'端。在一些實施例中，提供一種不對稱寡核苷酸，其在有義股之3'端處包含平端及在反義股之3'端處包含3′-突出端。在一些實施例中，反義股上之3′-突出端之長度為約1-8個核苷酸(
例如長度為1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸具有包含反義(引導)股之3'端上之兩個(2)核苷酸的突出端。然而，其他突出端係可能的。在一些實施例中，突出端為3′-突出端，其包含1至6個核苷酸之間的長度，視情況1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6個核苷酸，或1、2、3、4、5或6個核苷酸。然而，在一些實施例中，突出端為5′-突出端，其包括在1至6個核苷酸之間的長度，視情況1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6個核苷酸，或1、2、3、4、5或6個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之連續核苷酸序列互補之標靶序列或互補區；及長度在1至6個核苷酸之間的5′-突出端。在一些實施例中，寡核苷酸包括了包括有選自SEQ ID NO: 577-597之核苷酸序列之有義股，其中寡核苷酸包括長度在1至6個核苷酸之間的5′-突出端。在一些實施例中，寡核苷酸包括了包括有選自SEQ ID NO: 598-618之核苷酸序列之反義股，其中寡核苷酸包括長度在1至6個核苷酸之間的5′-突出端。在一些實施例中，寡核苷酸包括了包括有選自SEQ ID NO: 577-597之核苷酸序列之有義股，以及含有選自SEQ ID NO: 598-618之核苷酸序列的反義股，其中寡核苷酸包括長度在1至6個核苷酸之間的5′-突出端。
在一些實施例中，反義股之3'端上之兩個(2)末端核苷酸經修飾。在一些實施例中，反義股之3'端上之兩個(2)末端核苷酸與目標mRNA (例如
TMPRSS6mRNA)互補。在一些實施例中，反義股之3'端上之兩個(2)末端核苷酸不與目標mRNA互補。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸之反義股之3'端上之兩個(2)末端核苷酸不成對。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸之反義股之3'端上之兩個(2)末端核苷酸包括不成對的鳥嘌呤(例如5’-GG-3’)。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸之反義股之3'端上之兩個(2)末端核苷酸不與目標mRNA互補。在一些實施例中，寡核苷酸之每一個3'端上之兩個(2)末端核苷酸為鳥嘌呤(GG)。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸之每一個3'端上之兩個(2)末端GG核苷酸中之一者或兩者不與目標mRNA互補。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之連續核苷酸序列互補之標靶序列或互補區，其中本文中之寡核苷酸之反義股之3'端上的兩個(2)末端核苷酸包括不成對的GG。在一些實施例中，寡核苷酸包括了包括有選自SEQ ID NO: 1-192之核苷酸序列之反義股，其中寡核苷酸之反義股之3'端上的兩個(2)末端核苷酸包括不成對的GG。在一些實施例中，寡核苷酸包括了包括有選自SEQ ID NO: 577-597之核苷酸序列的有義股以及包括有選自SEQ ID NO: 598-618之核苷酸序列的反義股，其中寡核苷酸之反義股之3'端上的兩個(2)末端核苷酸包括不成對的GG。
在一些實施例中，在有義股與反義股(包括本文中之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸))之間存在一或多個(
例如1、2、3、4或5個)錯配。若有義股與反義股之間存在超過一個錯配，則其可連續地(
例如，連續2、3或更多個)置放或穿插於整個互補區中。在一些實施例中，有義股之3'端包含一或多個錯配。在一些實施例中，將兩個(2)錯配併入有義股之3'端處。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸之有義股之3'端處之區段的鹼基錯配或不穩定提高或增加寡核苷酸之效能。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
其中在有義股與反義股之間存在一或多個(
例如1、2、3、4或5)錯配。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括了包括有選自以下所組成之群組之核苷酸序列的有義股及反義股：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
其中在有義股與反義股之間存在一或多個(
例如1、2、3、4或5)錯配。
反義股
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)之反義股稱為「引導股」。舉例而言，與RNA誘導型靜默複合體(RISC)接合且與阿爾古蛋白質(
Argonauteprotein) (諸如Ago2)結合、或與一或多種類似因子接合或結合、且導引目標基因靜默之反義股，作為反義股，稱為引導股。在一些實施例中，包括引導股之互補區之有義股在本文中稱為「隨從股」。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括長度為至多約50個核苷酸之反義股(
例如長度為至多50、至多40、至多35、至多30、至多27、至多25、至多21、至多19、至多17或至多12個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸包括長度為至少約12個核苷酸之反義股(
例如長度為至少12、至少15、至少19、至少21、至少22、至少25、至少27、至少30、至少35或至少38個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸包括長度在約12至約40 (
例如12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至22、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)個核苷酸範圍內之反義股。在一些實施例中，寡核苷酸包括長度為15至30個核苷酸之反義股。在一些實施例中，本文揭示之寡核苷酸中之任一者之反義股之長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括長度為22個核苷酸之反義股。
在一些實施例中，用於靶向
TMPRSS6之本文揭示之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括反義股，該反義股包括有如SEQ ID NO: 385-576中之任一者中所示之序列或由其組成的。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括反義股，該反義股包括有如SEQ ID NO: 385-576中之任一者中所示之序列之至少約12 (
例如至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23)個連續核苷酸。在一些實施例中，本文公開之用於靶向
TMPRSS6的寡核苷酸包括一反義股，其包括或由如下列所示之任一序列組成：SEQ ID NO: 598-618。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括反義股，該反義股包括有如SEQ ID NO: 598-618中之任一者中所示之序列之至少約12 (
例如至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23)個連續核苷酸。在一些實施例中，本文公開之用於靶向
TMPRSS6的寡核苷酸包括一反義股，該反義股包括有如SEQ ID NO: 598-618中之任一者中所示之序列或由其組成。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括反義股，該反義股包括有如SEQ ID NO: 600、601、611、618及607中之任一者中所示之序列之至少約12 (
例如至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23)個連續核苷酸。在一些實施例中，本文公開之用於靶向
TMPRSS6的寡核苷酸包括一反義股，該反義股包括有如SEQ ID NO: 600、601、611、618及607中之任一者中所示之序列或由其組成。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括了包括有選自SEQ ID NO: 1-192之核苷酸序列的反義股。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括了包括選自SEQ ID NO: 184、181、158、134及102之核苷酸序列的反義股。
有義股
在一些實施例中，本文公開之用於靶向
TMPRSS6mRNA及抑制
TMPRSS6表現之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括如SEQ ID NO: 661-852中之任一者中所示之有義股序列。在一些實施例中，本文公開之用於靶向
TMPRSS6mRNA及抑制
TMPRSS6表現之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括如SEQ ID NO: 193-384中之任一者中所示之有義股序列。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸具有有義股，該有義股包括如SEQ ID NO: 193-384中之任一者中所示之序列之至少約12 (
例如至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23)個連續核苷酸。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸具有有義股，該有義股包括如SEQ ID NO: SEQ ID NO: 661-852中之任一者中所示之序列之至少約12 (
例如至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19)個連續核苷酸。在一些實施例中，本文公開之用於靶向
TMPRSS6mRNA及抑制
TMPRSS6表現之寡核苷酸包括如SEQ ID NO: 577-597中之任一者中所示之有義股序列。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸具有有義股，該有義股包括如SEQ ID NO: 577-597中之任一者中所示之序列之至少約12 (
例如至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23)個連續核苷酸。在一些實施例中，本文公開之用於靶向
TMPRSS6mRNA及抑制
TMPRSS6表現之寡核苷酸包括如SEQ ID NO: 579、580、590、597及586中之任一者中所示之有義股序列。在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID 579、580、590、597及586中之任一者中所示之序列之至少約12(例如，至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23)個連續核苷酸。在一些實施例中，本文公開之用於靶向
TMPRSS6mRNA及抑制
TMPRSS6表現之寡核苷酸包括如SEQ ID NO: 844、841、818、794及762中之任一者中所示之有義股序列。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸具有有義股，該有義股包括如SEQ ID NO: 844、841、818、794及762中之任一者中所示之序列之至少約12 (
例如至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19)個連續核苷酸。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括長度為多達約50個核苷酸之有義股(或隨從股) (
例如長度為至多50、至多40、至多36、至多30、至多27、至多25、至多21、至多19、至多17或至多12個核苷酸)。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括長度為至少約12個核苷酸之有義股(
例如長度為至少12、至少15、至少19、至少21、至少25、至少27、至少30、至少36或至少38個核苷酸)。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括長度在約12至約50 (
例如12至50、12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)個核苷酸範圍內之有義股。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括長度為15至50個核苷酸之有義股。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括長度為18至36個核苷酸之有義股。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸之有義股。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括長度為36個核苷酸之有義股。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸
( 例如RNAi寡核苷酸)包括在接近有義股之3'端處包括有莖-環結構之有義股。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸
( 例如RNAi寡核苷酸)包括在有義股之3'端處的第一區域(R1)包括有莖-環結構之有義股。在一些實施例中，莖-環係藉由股內鹼基配對形成。在一些實施例中，有義股在其5'端處包括莖-環結構。在一些實施例中，有義股在第一區域(R1)的5'端處包括莖-環結構。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為2個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為3個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為4個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為5個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為6個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為7個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為8個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為9個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為10個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為11個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為12個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為13個核苷酸之雙螺旋。在一些實施例中，莖-環之莖包括長度為14個核苷酸之雙螺旋。
在一些實施例中，莖-環提供針對降解(
例如酶促降解)之寡核苷酸保護，有助於或改良對於目標細胞、組織或器官(
例如肝)之靶向及/或遞送，或兩者。例如，在一些實施例中，該莖-環之環包括核苷酸，其包括有一或多種可促進、改善、或增加對標靶mRNA (例如
TMPRSS6mRNA)的靶向、抑制標靶基因表現(例如
TMPRSS6表現)、及/或遞送、攝取、及/或穿透至標靶細胞、組織、或器官(例如，肝臟)、或其組合之修飾。在一些實施例中，莖-環自身或莖-環之修飾並不影響或並不實質上影響寡核苷酸之固有基因表現抑制活性，但有助於、改良或增加穩定性(
例如提供針對降解之保護)及/或寡核苷酸至目標細胞、組織或器官(
例如肝)之遞送、其吸收及/或穿透。在特定實施例中，本文之寡核苷酸包括有義股，其包括有(例如在其3′端，接近其3′端及/或在有義股的第一區域(R1)的3′端)如下所示之莖-環: S1-Lp-S2，其中S1與S2互補，且其中Lp在S1與S2之間形成長度為至多約10個核苷酸(
例如長度為3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)之連接的核苷酸的單股環。在一些實施例中，環(Lp)之長度為3個核苷酸(稱為"三環")。在一些實施例中，環(Lp)之長度為4個核苷酸(稱為"四環")。在一些實施例中，環(Lp)之長度為5個核苷酸。在一些實施例中，環(Lp)之長度為6個核苷酸。在一些實施例中，環(Lp)之長度為7個核苷酸。在一些實施例中，環(Lp)之長度為8個核苷酸。在一些實施例中，環(Lp)之長度為9個核苷酸。在一些實施例中，環(Lp)之長度為10個核苷酸。
在一些實施例中，四環包括序列5’-GAAA-3’。在一些實施例中，莖環包括序列5’-GCAGCCGAAAGGCUGC-3’ (SEQ ID NO: 856)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之核苷酸之連續序列互補的標靶序列或互補區，且該寡核苷酸包括了包括有(
例如在其3'端處、在接近其3'端處及/或在有義股的第一區域(R1)之3'端處)示為以下之莖-環的有義股：S1-Lp-S2，其中S1與S2互補，且其中Lp在S1與S2之間形成長度為至多約10個核苷酸(
例如長度為3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)之單股環。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之連續核苷酸序列互補之靶向序列或互補區，且該寡核苷酸包括了包括有(
例如在其3'端處、在接近其3'端處及/或在有義股的第一區域(R1)之3'端處)示為以下之莖-環的有義股：S1-Lp-S2，其中S1與S2互補，且其中Lp在S1與S2之間形成長度為4個核苷酸之單股環。
在一些實施例中，具有如本文所描述之結構S1-Lp-S2之莖-環之環(Lp)為三環(triLp)。在一些實施例中，寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之連續核苷酸序列及三環互補的標靶序列或互補區。在一些實施例中，三環包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、經修飾之核苷酸、配體(例如遞送配體)及其組合。
在一些實施例中，具有如上文所描述之結構S1-Lp-S2之莖-環之環(Lp)為四環(tetraLp)，如美國專利案第10,131,912號中所描述，以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括與SEQ ID NO: 661-852中之任一者之連續核苷酸序列及四環互補的標靶序列或互補區。在一些實施例中，四環包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、經修飾之核苷酸、配體(例如遞送配體)及其組合。
雙螺旋長度
在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為至少12 (
例如至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度在12-30個核苷酸範圍內(例如長度為12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30個核苷酸)。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為12、13、14、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為12個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為13個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為14個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為15個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為16個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為17個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為18個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為19個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為20個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為21個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為22個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為23個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為24個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為25個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為26個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為27個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為28個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為29個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度為30個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋不跨越有義股及/或反義股之全長。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋跨越有義股或反義股二者中之一者之全長。在一些實施例中，有義股與反義股之間形成的雙螺旋跨越有義股及反義股兩者之全長。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
其中有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度在12-30個核苷酸範圍內(
例如長度為12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30個核苷酸)
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
其中有義股與反義股之間形成的雙螺旋之長度在12-30個核苷酸範圍內(
例如長度為12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30個核苷酸)
寡核苷酸末端
在一些實施例中，本文揭示之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括有義股及反義股，其中任一股或兩條股之末端包括平端。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括呈單獨股之有義股及反義股，其形成在反義股之3’端處具有突出端之不對稱雙螺旋區。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其中任一股或兩股之末端包括了包括有一或多個核苷酸之突出端。在一些實施例中，包括有突出端之一或多個核苷酸為不成對的核苷酸。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其中有義股之3’端及反義股之5’端包括平端。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其中有義股之5’端及反義股之3’端包括平端。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其中任一股或兩股之3’端包括了包括有一或多個核苷酸之3’-突出端。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其中有義股包括了包括有一或多個核苷酸之3’-突出端。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其中反義股包括了包括有一或多個核苷酸之3’-突出端。在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸包括有義股和反義股，其中該有義股和反義股二者皆包括了包括有一或多個核苷酸之3’-突出端。
在一些實施例中，該3’-突出端長度為約一(1)至二十(20)個核苷酸(如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或約20個核苷酸長度)。在一些實施例中，該3'-突出端長度約為一(1)至十九(19)、一(1)至十八(18)、一(1)至十七(17)、一(1)至十六(16)、一(1)至十五(15)、一(1)至十四(14)、一(1)至十三(13)、一(1)至十二(12)、一(1)至十一(11)、一(1)至十(10)、一(1)至九(9)、一(1)至八(8)、一(1)至七(7)、一(1)至六(6)、一(1)至五(5)、一(1)至四(4)、一(1)至三(3)或約一(1)至二(2)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為(1)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為兩(2)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為三(3)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為四(4)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為五(5)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為六(6)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為七(7)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為八(8)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為九(9)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為十(10)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為十一(11)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為十二(12)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為十三(13)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為十四(14)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為十五(15)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為十六(16)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為十七(17)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為十八(18)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為十九(19)個核苷酸。在一些實施例中，3’-突出端之長度為二十(20)個核苷酸。
在一些實施例中，本文公開之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括有義股及反義股，其中寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
且其中反義股包括長度為約一(1)至二十(20)個核苷酸之3’-突出端(例如長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或約20個核苷酸)，視情況其中3’-突出端之長度為兩(2)個核苷酸。
在一些實施例中，本文公開之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括有義股及反義股，其中寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
且其中反義股包括長度為約一(1)至二十(20)個核苷酸之3’-突出端(
例如長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或約20個核苷酸)，視情況其中3’-突出端之長度為兩(2)個核苷酸。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其中任一股或兩股之5’端包括了包括有一或多個核苷酸之5'-突出端。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其中有義股包括了包括有一或多個核苷酸之5'-突出端。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其中反義股包括了包括有一或多個核苷酸之5'-突出端。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括有義股及反義股，其中有義股及反義股兩者包括了包括有一或多個核苷酸之5'-突出端。
在一些實施例中，5'-突出端之長度為約一(1)至二十(20)個核苷酸(
例如長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或約20個核苷酸)。在一些實施例中，5’突出端之長度為約一(1)至十九(19)、一(1)至十八(18)、一(1)至十七(17)、一(1)至十六(16)、一(1)至十五(15)、一(1)至十四(14)、一(1)至十三(13)、一(1)至十二(12)、一(1)至十一(11)、一(1)至十(10)、一(1)至九(9)、一(1)至八(8)、一(1)至七(7)、一(1)至六(6)、一(1)至五(5)、一(1)至四(4)、一(1)至三(3)或約一(1)至二(2)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為(1)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為兩(2)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為三(3)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為四(4)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為五(5)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為六(6)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為七(7)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為八(8)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為九(9)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為十(10)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為十一(11)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為十二(12)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為十三(13)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為十四(14)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為十五(15)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為十六(16)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為十七(17)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為十八(18)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為十九(19)個核苷酸。在一些實施例中，5'-突出端之長度為二十(20)個核苷酸。
在一些實施例中，本文公開之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括有義股及反義股，其中寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
且其中反義股包括長度為約一(1)至二十(20)個核苷酸之5'-突出端(例如長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或約20個核苷酸)，視情況其中5'-突出端之長度為兩(2)個核苷酸。
在一些實施例中，本文公開之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括有義股及反義股，其中寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
且其中反義股包括長度為約一(1)至二十(20)個核苷酸之5'-突出端(
例如長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或約20個核苷酸)，視情況其中5'-突出端之長度為兩(2)個核苷酸。
在一些實施例中，包括有義股及/或反義股之3’端或5'端之一或多個(
例如2、3、4、5或更多個)核苷酸經修飾。舉例而言，在一些實施例中，反義股之3’端之一或兩個末端核苷酸經修飾。在一些實施例中，反義股之3’端處之最後一個核苷酸經修飾，以使得其包括2’修飾，或其包括2’-O-甲氧基乙基。在一些實施例中，反義股之3’端處之最後一或兩個末端核苷酸與目標互補。在一些實施例中，反義股之3’端處之最後一或兩個核苷酸不與目標互補。
在一些實施例中，本文公開之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括有義股及反義股，其中有義股之3’端包括本文所描述之莖-環，且反義股之3’端包括本文所描述之3’-突出端。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括形成本文所描述之帶切口的四環結構之有義股及反義股，其中有義股之3’端包括莖-環，其中該環為本文所描述之四環，且其中反義股之3’端包括本文所描述之3’-突出端。在一些實施例中，3’-突出端之長度為兩(2)個核苷酸。在一些實施例中，包括有3’-突出端之兩(2)個核苷酸兩者均包括鳥嘌呤(G)核鹼基。通常，包括有反義股之3’-突出端之核苷酸中之一者或兩者不與目標mRNA互補。通常，包括有該反義股之3'-突出端的一或二個核苷酸與該目標mRNA不互補。
寡核苷酸修飾
在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括修飾。寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)可以各種方式修飾，以改良或控制特異性、穩定性、遞送、生物可用性、對核酸酶降解之抗性、免疫原性、鹼基配對特性、RNA分佈及細胞吸收及關於治療或研究用途之其他特徵。
在一些實施例中，修飾為經修飾之糖。在一些實施例中，修飾為5'-端磷酸酯基。在一些實施例中，修飾為經修飾之核苷酸間鍵。在一些實施例中，修飾為經修飾之鹼基。在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸可包括本文所描述之修飾中之任一者或其任何組合。舉例而言，在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸包括至少一個經修飾之糖、5'-端磷酸酯基、至少一個經修飾之核苷酸間鍵及至少一個經修飾之鹼基。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
其中寡核苷酸包括至少一個經修飾之糖、5'-端磷酸酯基、至少一個經修飾之核苷酸間鍵及至少一個經修飾之鹼基。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
其中寡核苷酸包括至少一個經修飾之糖、5'-端磷酸酯基、至少一個經修飾之核苷酸間鍵及至少一個經修飾之鹼基。
寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)上之修飾數目及彼等核苷酸修飾之位置可能影響寡核苷酸之特性。舉例而言，寡核苷酸可藉由使其與脂質奈米粒子(LNP)或類似載劑共軛或將其包含於脂質奈米粒子或類似載劑中而進行
活體內遞送。然而，當寡核苷酸未受LNP或類似載劑保護時，至少一些核苷酸經修飾可能係有利的。因此，在一些實施例中，寡核苷酸之所有或實質上所有核苷酸經修飾。在一些實施例中，超過一半核苷酸經修飾。在一些實施例中，小於一半核苷酸經修飾。在一些實施例中，包括有寡核苷酸之所有核苷酸之糖部分在2’位置處經修飾。修飾可為可逆的或不可逆的。在一些實施例中，如本文所公開之寡核苷酸具有足以產生所要特徵(
例如保護免於酶促降解、在
活體內投與後能夠靶向所要細胞及/或熱力學穩定性)之經修飾之核苷酸數目及類型。
糖修飾
在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括經修飾之糖。在一些實施例中，經修飾之糖(本文中亦稱為糖類似物)包含經修飾之去氧核糖或核糖部分，其中例如在糖之2′、3′、4′及/或5′碳位置處存在一或多個修飾。在一些實施例中，經修飾之糖亦可包含非天然替代性碳結構，諸如以下中存在之彼等：鎖核酸(「LNA」；參見例如Koshkin等人(1998) Tetrahedon 54:3607-30)、解鎖核酸(「UNA」; 參見例如Snead等人(2013) Mol. Ther-Nucl. Acids 2:e103)及橋聯核酸(「BNA」；參見例如Imanishi & Obika (2002) Chem Commun. (Camb) 21:1653-59)。
在一些實施例中，糖中之核苷酸修飾包括2'-修飾。在一些實施例中，2'-修飾可為2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-氟(2'-F)、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)或2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。在一些實施例中，修飾為2'-F、2'-OMe或2'-MOE。在一些實施例中，糖中之修飾包括糖環之修飾，其可包括糖環之一或多個碳之修飾。舉例而言，核苷酸之糖之修飾可包括連接至糖之1'-碳或4'-碳的糖之2'-氧或
經由伸乙基或亞甲基橋鍵連接至1'-碳或4'-碳的2'-氧。在一些實施例中，經修飾之核苷酸具有缺乏2'-碳與3'-碳鍵之非環糖。在一些實施例中，經修飾之核苷酸
例如在糖之4'位置中具有硫醇基。
在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括至少約1個經修飾之核苷酸(
例如至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60個或更多)。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股包括至少約1個經修飾之核苷酸(
例如至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35個或更多)。在一些實施例中，寡核苷酸之反義股包括至少約1個經修飾之核苷酸(
例如、至少1、至少5、至少10、至少15、至少20個或更多)。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股之所有核苷酸經修飾。在一些實施例中，寡核苷酸之反義股之所有核苷酸經修飾。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸(
亦即，有義股及反義股兩者)經修飾。在一些實施例中，該經修飾的核苷酸包括2'-修飾(例如，2'-F或2'-OMe、2'-MOE和2'-去氧基-2'-氟-β-d-阿拉伯核酸)。
在一些實施例中，本發明提供具有不同修飾模式的寡核苷酸。在一些實施例中，本文所述的寡核苷酸包括一有義股，其具有如實例和序列表中所示之修飾模式，以及一反義股，其具有如實例和序列表所示之修飾模式。
在一些實施例中，本文揭示的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括反義股，其具有經2'-F修飾的核苷酸。在一些實施例中，本文所述的寡核苷酸包括反義股，其包括經2'-F和2'-OMe修飾的核苷酸。在一些實施例中，本文揭示的寡核苷酸包括有義股，其具有經2'-F修飾的核苷酸。在一些實施例中，本文揭示的寡核苷酸包括有義股，其包括經2'-F和2'-OMe修飾的核苷酸。
在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸包括有義股，其中有義股之約10-15%、10%、11%、12%、13%、14%或15%之核苷酸包括2’-氟修飾。在一些實施例中，有義股之約11%之核苷酸包括2-氟修飾。在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸包括反義股，其中反義股之約25-35%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%或35%之核苷酸包括2’-氟修飾。在一些實施例中，反義股之約32%之核苷酸包括2’-氟修飾。在一些實施例中，寡核苷酸之約15-25%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%或25%之其核苷酸包括2’-氟修飾。在一些實施例中，寡核苷酸中約19%之核苷酸包括2’-氟修飾。
如本文所用，有義股及反義股之寡核苷酸分別從5'端開始編號，從“位置1”開始。
在一些實施例中，有義股之位置8、9、10或11中之一或多者經2'-F基團修飾。在一些實施例中，有義股之位置3、8、9、10、12、13及17中之一或多者經2'-F基團修飾。在一些實施例中，反義股之位置2、3、4、5、7、10及14中之一或多者經2'-F基團修飾。在一些實施例中，位置2、3、4、5、7、8、10、14、16及19中之一或多者經2'-F基團修飾。在一些實施例中，有義股中之位置1-7及12-20處之每一核苷酸處的糖部分經2'-OMe修飾。在一些實施例中，有義股中之位置1-7、12-27及31-36處之每一核苷酸處的糖部分經2'-OMe修飾。在一些實施例中，有義股中之位置6、9、11-13、15、17、18及20-22處之每一核苷酸處的糖部分經2'-OMe修飾。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
其中有義股之位置8、9、10或11中之一或多者經2'-F基團修飾。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
其中有義股之位置8、9、10或11中之一或多者經2'-F基團修飾。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括反義股之位置2、5及14處之每一核苷酸中之每一者之糖部分經2'-F修飾及反義股之剩餘核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2’-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括反義股之位置1、2、5及14處之核苷酸中之每一者之糖部分經2'-F修飾及反義股之剩餘核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括反義股之位置2、4、5及14處之核苷酸中之每一者之糖部分經2'-F修飾及反義股之剩餘核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2’-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括反義股之位置1、2、3、5、7及14處之核苷酸中之每一者之糖部分經2'-F修飾及反義股之剩餘核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括反義股之位置2、3、4、5、7及14處之核苷酸中之每一者之糖部分經2'-F修飾及反義股之剩餘核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括反義股之位置1、2、3、5、10及14處之核苷酸中之每一者之糖部分經2'-F修飾及反義股之剩餘核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括反義股之位置2、3、4、5、10及14處之核苷酸中之每一者之糖部分經2'-F修飾及反義股之剩餘核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2’-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括反義股之位置2、3、5、7、10及14處之核苷酸中之每一者之糖部分經2'-F修飾及反義股之剩餘核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括反義股之位置2、3、4、5、7、10及14處之核苷酸中之每一者之糖部分經2'-F修飾及反義股之剩餘核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2’-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括反義股之位置2、3、4、5、7、8、10、14、16及19處之核苷酸中之每一者之糖部分經2'-F修飾及反義股之剩餘核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2’-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22處之糖部分經2'-F修飾的反義股。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22處之糖部分經2'-OMe修飾的反義股。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22處之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2’-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22處之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的反義股：2′-氟(2′-F)、2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2’-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2′-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置8-11處之糖部分經2'-F修飾的有義股。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置3、8、9、10、12、13及17處之糖部分經2'-F修飾的有義股。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1-7及12-17或12-20處之糖部分經2’OMe修飾的有義股。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1-7、12-27及31-36處之糖部分經2’OMe修飾的有義股。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在有義股之位置1-7及12-17或12-20處之核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾修飾的有義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2’-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1-2、4-7、11、14-16及18-20處之糖部分經2’OMe修飾的有義股。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在有義股之位置1-2、4-7、11、14-16及18-20處之核苷酸中之每一者之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾修飾的有義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2’-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36處之糖部分經2'-F修飾的有義股。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36處之糖部分經2'-OMe修飾的有義股。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36處之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的有義股：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2’-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36處之糖部分經選自由以下所組成之群組之修飾所修飾的有義股：2′-氟(2′-F)、2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-胺基、2'-乙基、2’-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸(2'-FANA)。
5'- 端磷酸酯
在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括有義股及反義股，其中反義股包括5'-端磷酸酯。在一些實施例中，RNAi寡核苷酸之5′-端磷酸酯基團增強與Ago2之相互作用。然而，包括有5′-磷酸酯基之寡核苷酸可能易受
經由磷酸酶或其他酶之降解影響，此可限制其
活體內效能及 / 或生物可用性。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含對此類降解具有抗性之5′磷酸酯之類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物為氧甲基磷酸酯、乙烯基磷酸酯或丙二醯基磷酸酯或其組合。在某些實施例中，寡核苷酸股之5′端與模擬天然5′-磷酸酯基之靜電及空間特性之化學部分(「磷酸酯模擬物」)連接。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
其中寡核苷酸包括5'-端磷酸酯，視情況為5'-端磷酸酯類似物。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
其中寡核苷酸包括5'-端磷酸酯，視情況為5'-端磷酸酯類似物。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)在糖之4'-碳位置處具有磷酸酯類似物(稱為「4'-磷酸酯類似物」)。
參見例如國際專利申請公開案第WO 2018/045317號。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸在5′-端核苷酸處包含4'-磷酸酯類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物為氧甲基磷酸酯，其中氧甲基之氧原子與糖部分(
例如在其4'-碳處)或其類似物結合。在其他實施例中，4'-磷酸根類似物為硫代甲基磷酸酯或胺甲基磷酸酯，其中該硫代甲基的硫原子或胺基甲基基團的氮原子結合至該醣類部分或其類似物的4'-碳。在某些實施例中，4'-磷酸酯類似物為氧甲基磷酸酯。在一些實施例中，氧甲基磷酸酯由下式表示–O–CH
2–PO(OH)
2、–O–CH
2–PO(OR)
2、或-O-CH2-PO(OH)(R)，其中R獨立地選自於H、CH
3、烷基、CH
2CH
2CN、CH
2OCOC(CH
3)
3、CH
2OCH
2CH
2Si(CH
3)
3或一保護基。在某些實施例中，該烷基為CH
2CH
3。更常見地，R獨立地選自於H、CH
3或CH
2CH
3。在一些實施例中，R為CH3。在一些實施例中，4’-磷酸酯類似物為4’-氧甲基磷酸酯。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在5′-端核苷酸處包括有4'-磷酸酯類似物之反義股，其中5'-端核苷酸包括以下結構：
(化學式1)
4’-O-單甲基磷酸酯-2’-O-甲基尿苷硫代磷酸酯[Me磷酸酯-4O-mUs]。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包括在5′-端核苷酸處包括有4'-磷酸酯類似物之反義股，其中5'-端核苷酸包括以下結構：
(化學式1a)
4’-O-單甲基磷酸酯-2’-O-甲基尿苷[Me磷酸酯-4O-mU]。
當提供硫代磷酸酯的核苷酸間鍵時，化學式1a可稱作4’-O-單甲基磷酸酯-2’-O-甲基尿苷硫代磷酸酯[Me磷酸酯-4O-mUs]。
經修飾之核苷酸間鍵
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括經修飾之核苷酸間鍵。在一些實施例中，磷酸酯修飾或取代產生導致至少約1 (
例如至少1、至少2、至少3或至少5)個包括經修飾之核苷酸間鍵的寡核苷酸。在一些實施例中，本文公開之寡核苷酸中之任一者包括約1至約10 (
例如1至10、2至8、4至6、3至10、5至10、1至5、1至3或1至2)個經修飾之核苷酸間鍵。在一些實施例中，本文公開之寡核苷酸中之任一者包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾之核苷酸間鍵。
經修飾之核苷酸間鍵可為二硫代磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵、硫代烷基膦酸酯鍵、硫代烷基膦酸三酯鍵、胺基亞磷酸酯鍵、膦酸酯鍵或硼烷磷酸酯鍵。在一些實施例中，如本文所公開之寡核苷酸中之任一者之至少一個經修飾之核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)在有義股之位置1及2、反義股之位置1及2、反義股之位置2及3、反義股之位置3及4、反義股之位置20及21及反義股之位置21及22中之一或多者之間具有硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸在有義股之位置1及2、反義股之位置1及2、反義股之位置2及3、反義股之位置20及21及反義股之位置21及22中之每一者之間具有硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
其中寡核苷酸包括經修飾之核苷酸間鍵。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
其中寡核苷酸包括經修飾之核苷酸間鍵。
鹼基修飾
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括一或多個經修飾之核鹼基。在一些實施例中，經修飾之核鹼基(在本文中亦被稱作鹼基類似物)連接於核苷酸糖部分之1'位置處。在某些實施例中，經修飾之核鹼基為含氮鹼基。在一些實施例中，經修飾之核鹼基不含氮原子。
參見例如美國專利申請公開案第2008/0274462號。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包括通用鹼基。在一些實施例中，經修飾之核苷酸不含核鹼基(無鹼基)。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
其中寡核苷酸包括一或多個經修飾之核鹼基。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
其中寡核苷酸包括一或多個經修飾之核鹼基。
在一些實施例中，通用鹼基為位於經修飾之核苷酸中之核苷酸糖部分之1'位置處或在存在於雙螺旋中時可與超過一個類型之鹼基相反的定位而實質上不更改雙螺旋之結構的核苷酸糖部分取代中之等效位置處的雜環部分。在一些實施例中，與完全互補於標靶核酸(例如，
TMPRSS6mRNA)的參考單股核酸(例如，寡核苷酸)相較，含有通用鹼基的單股核酸會與該標靶核酸形成雙螺旋，其T
m低於與該互補核酸形成的雙螺旋。在一些實施例中，當相較於其中通用鹼基已經一鹼基置換以產生單一錯配的參考單股核酸時，含有通用鹼基之單股核酸與標靶核酸形成雙螺旋，該雙螺旋的T
m比與包括有錯配鹼基之核酸形成之雙螺旋高。
通用結合核苷酸之非限制性實例包含但不限於肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚及/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(參見美國專利申請公開案第2007/0254362號；Van Aerschot等人(1995) Nucleic Acids Res. 23:4363-4370；Loakes等人(1995) Nucleic Acids Res. 23:2361-66；及Loakes及Brown (1994) Nucleic Acids Res.22:4039-43)。
靶向配體
在一些實施例中，期望使本文提供之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)靶向一或多種細胞或細胞類型、組織、器官或結構區或隔室。此類策略可幫助避免所治療生物體之非期望效果及/或避免將不會受益於寡核苷酸或其效果(
例如抑制或降低
TMPRSS6表現)之細胞、組織、器官或結構區或隔室過度損失寡核苷酸。因此，在一些實施例中，本文公開之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)經修飾以有助於靶向及/或遞送至特定細胞或細胞類型、組織、器官或結構區或隔室(
例如以有助於遞送寡核苷酸至肝中)。在一些實施例中，寡核苷酸包含與一或多個靶向配體結合之至少一個核苷酸(
例如1、2、3、4、5、6或更多個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
其中寡核苷酸包括與至少一個核苷酸共軛之靶向配體。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
其中寡核苷酸包括與至少一個核苷酸共軛之靶向配體。
在一些實施例中，靶向配體包括碳水化合物、胺糖、膽固醇、肽、多肽、蛋白質或蛋白質之一部分(
例如抗體或抗體片段)、或脂質。在某些實施例中，靶向配體為包括至少一個GalNAc部分之碳水化合物。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)之1或多個(
例如1、2、3、4、5或6)核苷酸各自與單獨靶向配體(
例如GalNAc部分)結合。在一些實施例中，寡核苷酸之2至4個核苷酸各自與單獨靶向配體共軛。在一些實施例中，靶向配體與有義股或反義股之任一端處之2至4個核苷酸共軛(
例如靶向配體與有義股或反義股之5'或3'端上之2至4個核苷酸突出端或延伸部分共軛)以使得靶向配體類似於牙刷之刷毛且寡核苷酸類似於牙刷。例如，寡核苷酸可在有義股的5'或3'端包括莖-環，且該莖之環上的1、2、3或4個核苷酸可各自共軛至靶向配體。在一些實施例中，本發明提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在該有義股的3'端包括莖-環，其中該莖-環的環包括三環或四環，且其中該三環或四環中所包括之3或4個核苷酸分別各自共軛至靶向配體。在一些實施例中，本發明提供的寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)在有義股的3'端包括一莖-環，其中莖-環的環包括四環，且其中該四環中所包括之3個核苷酸各自共軛至靶向配體。
GalNAc為去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)的高親和力醣類配位基，主要在肝細胞表面表現，在結合、內化和隨後清除含有末端半乳醣或GalNAc鹼基(去唾液酸醣蛋白)的循環醣蛋白中發揮主要作用。GalNAc部分與本發明之寡核苷酸的共軛(間接或直接)可用於使此等寡核苷酸靶向細胞上表現之ASGPR。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)與至少一或多個GalNAc部分共軛，其中GalNAc部分使寡核苷酸靶向人類肝細胞(
例如人類肝細胞(human hepatocyte))上表現之ASGPR。在一些實施例中，GalNAc部分使寡核苷酸靶向肝。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)直接或間接地與單價GalNAc部分結合。在一些實施例中，寡核苷酸直接或間接地與超過一個單價GalNAc共軛(
亦即，與2、3或4個單價GalNAc部分共軛，且通常與3或4個單價GalNAc部分共軛)。在一些實施例中，寡核苷酸與一或多個二價GalNAc、三價GalNAc或四價GalNAc部分共軛。在一些實施例中，二價、三價或四價GalNAc部分
經由分支鏈連接子與寡核苷酸共軛。在一些實施例中，單價GalNAc部分與第一核苷酸共軛，且二價、三價或四價GalNAc部分
經由分支鏈連接子與第二核苷酸共軛。
在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)之一(1)或多個(
例如1、2、3、4、5或6個)核苷酸各自與GalNAc部分結合。在一些實施例中，四環之兩個(2)至四個(4)核苷酸各自與單獨GalNAc部分共軛。在一些實施例中，三環之一個(1)至三個(3)核苷酸各自與單獨GalNAc部分共軛。在一些實施例中，靶向配體在有義股或反義股之任一端處與兩個(2)至四個(4)核苷酸共軛(
例如配體與有義股或反義股之5′或3′端上之兩個(2)至四個(4)核苷酸突出端或延伸部分共軛)以使得GalNAc部分類似於牙刷之刷毛且寡核苷酸類似於牙刷。在一些實施例中，GalNAc部分與有義股之核苷酸結合。舉例而言，三個(3)或四個(4) GalNAc部分可與有義股之四環中之核苷酸共軛，其中每個GalNAc部分與一個(1)核苷酸共軛。
在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括四環，其中四環(tetraLp)為腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)核苷酸之任何組合。在一些實施例中，四環(tetraLp)包括
經由本文所描述之任何連接子與四環之任何一或多個鳥嘌呤(G)核苷酸連接的單價GalNAc部分，如下方化學式 2 (X =雜原子)所描繪：
(化學式2)
據了解，當包括於寡核苷酸中時，化學式2可以與相鄰的核苷酸進行共價連接。在一些實施例中，四環(tetraLp)包括
經由本文所描述之任何連接子與四環之任何一或多個鳥嘌呤(G)核苷酸連接的單價GalNAc部分，如下方化學式2a (X =雜原子)所描繪：
(化學式2a)
在一些實施例中，四環(tetraLp)具有
經由本文所描述之任何連接子與四環之任何一或多個腺嘌呤(A)核苷酸連接的單價GalNAc，如下方化學式 3 (X=雜原子)所描繪：
(化學式3)
據了解，當包括於寡核苷酸中時，化學式3可以與相鄰的核苷酸進行共價連接。在一些實施例中，四環(tetraLp)具有
經由本文所描述之任何連接子與四環之任何一或多個腺嘌呤(A)核苷酸連接的單價GalNAc，如下方化學式3a (X=雜原子)所描繪：
(化學式3a)
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)包括與鳥嘌呤(G)核苷酸連接之單價GalNAc部分，稱為[ademG-GalNAc]或2'-胺基二乙氧基甲醇-鳥嘌呤-GalNAc，如下所示(化學式4)：
(化學式4)
據了解，當包括於寡核苷酸中時，化學式4可以與相鄰的核苷酸進行連接，例如示於下方化學式4a者：
(化學式4a)
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括與腺嘌呤核苷酸連接之單價GalNAc部分，稱為[ademA-GalNAc]或2'-胺基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所示(化學式5)：
(化學式5)
據理解，當化學式5包括在寡核苷酸中時，可以與相鄰的核苷酸連接，諸如例如下方所示的化學示5a：
(化學式5a)
下文顯示(化學式6)自5′至3′包括有核苷酸序列GAAA (L =連接子，X =雜原子)之環的此類共軛實例。此類環可存在於例如本文提供之有義股之位置27-30處。在該化學式中，
用於描述與寡核苷酸股(化學式6)之連接點。
(化學式6)。
下文顯示(化學式6a)自5′至3′包括有核苷酸序列GAAA (L =連接子，X =雜原子)之環的此類共軛實例。此類環可存在於例如本文提供之有義股之位置27-30處。在該化學式中，
用於描述與寡核苷酸股之附接點。
(化學式6a)
適當的方法或化學(
例如點擊化學)可用於將靶向配體與核苷酸連接。在一些實施例中，使用點擊連接子，靶向配體與包括有本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)之核苷酸共軛。在一些實施例中，基於縮醛之連接子用於將靶向配體與本文所描述之寡核苷酸中之任一者之核苷酸共軛。舉例而言，基於縮醛之連接子揭示於國際專利申請公開案第WO2016/100401號中。在一些實施例中，連接子為不穩定的連接子。然而，在其他實施例中，連接子為穩定的。下方顯示針對包括有自5'至3'核苷酸GAAA的環之實例，其中GalNAc部分使用縮醛連接子連接至環之核苷酸(化學式7及化學式8)。此類環可例如存在於有義股中之任一者之位置27-30處。在化學式中，
為與寡核苷酸股之附接點(化學式7及化學式8)。
(化學式7)，或
(化學式8)
下方顯示包括有自5'至3'核苷酸GAAA的環之實例，其中GalNAc部分使用縮醛連接子連接至環之核苷酸(化學式7a及化學式8a)。此類環可例如存在於有義股中之任一者之位置27-30處。在化學式中，
為與寡核苷酸股(化學式7a及化學式8a之附接點)：
(化學式7a)，或
(化學式8a)
如所提及，各種適當方法或化學合成技術(
例如點擊化學)可用於將靶向配體與核苷酸連接。在一些實施例中，靶向配體使用點擊連接子與核苷酸結合。在一些實施例中，基於縮醛之連接子用於將靶向配體與本文所描述之寡核苷酸中之任一者之核苷酸共軛。舉例而言，基於縮醛之連接子揭示於國際專利申請公開案第WO 2016/100401號中。在一些實施例中，連接子為不穩定的連接子。然而，在其他實施例中，連接子為穩定的連接子。
在一些實施例中，本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)不具有與其共軛的GalNAc。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608，
其中寡核苷酸包括至少一個與核苷酸共軛之GalNAc部分。
在一些實施例中，寡核苷酸之有義股及反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607，
其中寡核苷酸包括至少一個與核苷酸共軛之GalNAc部分。
用於降低
TMPRSS6 表現的示例性寡核苷酸
在一些實施例中，本發明提供之用於降低
TMPRSS6表現之
TMPRSS6-靶向寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括一有義股和一反義股，其中包括有義股和反義股的核苷酸皆經修飾，其中該反義股包括與SEQ ID NO: 661-852中任一者的
TMPRSS6mRNA標靶序列互補區，且其中該互補區的長度為至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，反義股之5'-端核苷酸包括4’-O-單甲基磷酸酯-2’-O-甲基尿苷[Me磷酸酯-4O-mU]，如本文所描述。在一些實施例中，反義股之5'-端核苷酸包括硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，反義股及有義股包括一或多個2'-氟(2'-F)及2'-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸及至少一個硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，反義股包括四個(4)硫代磷酸酯鍵，且有義股包括一個(1)硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，反義股包括五個(5)硫代磷酸酯鍵，且有義股包括一個(1)硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(如RNAi寡核苷酸)包括一有義股，其具有如SEQ ID NO: 193-384任一者之序列，以及一反義股，其包括選自於以下之互補序列：SEQ ID NO: 385-576。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(如RNAi寡核苷酸)包括一有義股，其具有如SEQ ID NO: 577-597任一者之序列，以及一反義股，其包括選自於以下之互補序列：SEQ ID NO: 598-618。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(如RNAi寡核苷酸)包括一有義股，其具有如SEQ ID NO: 619-639任一者之序列，以及一反義股，其包括選自於以下之互補序列：SEQ ID NO: 640-660。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之本文提供之寡核苷酸(
例如及RNAi寡核苷酸)包括：
36個核苷酸之有義股，其在位置8-11處包括2'-F修飾之核苷酸，在位置1-7、12-27及31-36處包括2'-OMe修飾之核苷酸，在位置28、29及30處包括GalNAc共軛的核苷酸，及在位置1與2之間包含硫代磷酸酯鍵；
22個核苷酸之反義股，其在位置2、3、4、5、7、10及14處包括2'-F修飾之核苷酸，在位置1、6、8、9、11-13及15-22處包括2'-OMe，在位置1與2、位置2與3、位置3與4、位置20與21及位置21與22之間包括硫代磷酸酯鍵，及在位置1處包括有4’-磷酸酯類似物之5'-端核苷酸，視情況其中5'-端核苷酸包括4’-O-單甲基磷酸酯-2’-O-甲基尿苷[Me磷酸酯-4O-mU]；其中反義股之位置1-20與有義股之位置1-20形成雙螺旋區，其中有義股之位置21-36形成莖-環，其中位置27-30形成莖-環之環，視情況其中位置27-30包括四環，其中反義股之位置21及22包括突出端，且其中有義股及反義股包括選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 595及616；
(d)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(e)分別為SEQ ID NO: 596及617；
(f)分別為SEQ ID NO: 597及618；
(g)分別為SEQ ID NO: 585及606；
(h)分別為SEQ ID NO: 586及607；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 587及608。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸(
例如及RNAi寡核苷酸)包括：
36個核苷酸之有義股，其在位置8-11處包括2'-F修飾之核苷酸，在位置1-7、12-27及31-36處包括2'-OMe修飾之核苷酸，在位置28、29及30處包括GalNAc共軛的核苷酸，及在位置1與2之間包含硫代磷酸酯鍵；
22個核苷酸之反義股，其在位置2、3、4、5、7、10及14處包括2'-F修飾之核苷酸，在位置1、6、8、9、11-13及15-22處包括2'-OMe，在位置1與2、位置2與3、位置3與4、位置20與21及位置21與22之間包括硫代磷酸酯鍵，及在位置1處包括有4’-磷酸酯類似物之5'-端核苷酸，視情況其中5'-端核苷酸包括4’-O-單甲基磷酸酯-2’-O-甲基尿苷[Me磷酸酯-4O-mU]；其中反義股之位置1-20與有義股之位置1-20形成雙螺旋區，其中有義股之位置21-36形成莖-環，其中位置27-30形成莖-環之環，視情況其中位置27-30包括四環，其中反義股之位置21及22包括突出端，且其中有義股及反義股包括選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 579及600；
(b)分別為SEQ ID NO: 580及601；
(c)分別為SEQ ID NO: 590及611；
(d)分別為SEQ ID NO: 597及618；及，
(e)分別為SEQ ID NO: 586及607。
在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之
TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括有如SEQ ID NO: 579所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括有如SEQ ID NO: 600所示之核苷酸序列。在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之
TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括有如SEQ ID NO: 580所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括有如SEQ ID NO: 601所示之核苷酸序列。在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之
TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括有如SEQ ID NO: 590所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括有如SEQ ID NO: 611所示之核苷酸序列。在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之
TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括有如SEQ ID NO: 597所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括有如SEQ ID NO: 618所示之核苷酸序列。在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之
TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括有如SEQ ID NO: 586所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括有如SEQ ID NO: 607所示之核苷酸序列。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 184中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括反義股之互補區，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 181中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括反義股之互補區，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 158中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括反義股之互補區，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 134中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括反義股之互補區，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 102中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括反義股之互補區，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 184中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區和在3'端的莖-環，其中莖-環示為S1-Lp-S2，其中S1與S2互補且其中Lp在S1和S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 181中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區和在3'端的莖-環，其中莖-環示為S1-Lp-S2，其中S1與S2互補且其中Lp在S1和S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 158中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區和在3'端的莖-環，其中莖-環示為S1-Lp-S2，其中S1與S2互補且其中Lp在S1和S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 134中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區和在3'端的莖-環，其中莖-環示為S1-Lp-S2，其中S1與S2互補且其中Lp在S1和S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 102中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區和在3'端的莖-環，其中莖-環示為S1-Lp-S2，其中S1與S2互補且其中Lp在S1和S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 184中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區，其中該反義股的互補區示於SEQ ID NO: 844，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 181中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區，其中該反義股的互補區示於SEQ ID NO: 841，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 158中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區，其中該反義股的互補區示於SEQ ID NO: 818，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 134中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區，其中該反義股的互補區示於SEQ ID NO: 794，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 102中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區，其中該反義股的互補區示於SEQ ID NO: 762，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 184中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區及在3’端的莖-環，其中該反義股的互補區示於SEQ ID NO: 844，其中莖-環示為S1-Lp-S2，其中S1與S2互補且其中Lp在S1和S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 181中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區及在3’端的莖-環，其中該反義股的互補區示於SEQ ID NO: 841，其中莖-環示為S1-Lp-S2，其中S1與S2互補且其中Lp在S1和S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 158中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區及在3’端的莖-環，其中該反義股的互補區示於SEQ ID NO: 818，其中莖-環示為S1-Lp-S2，其中S1與S2互補且其中Lp在S1和S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 134中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區及在3’端的莖-環，其中該反義股的互補區示於SEQ ID NO: 794，其中莖-環示為S1-Lp-S2，其中S1與S2互補且其中Lp在S1和S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，用於降低
TMPRSS6表現之靶向
TMPRSS6之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括：(i)長度為19-30個核苷酸之反義股，其中反義股包括了包括有
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的核苷酸序列，其中互補區示於SEQ ID NO: 102中；及(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括與反義股互補區及在3’端的莖-環，其中該反義股的互補區示於SEQ ID NO: 762，其中莖-環示為S1-Lp-S2，其中S1與S2互補且其中Lp在S1和S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環，其中反義股及有義股為單獨股，其形成在反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
在一些實施例中，本發明提供一種用於降低
TMPRSS6表現的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中該寡核苷酸包括一有義股和一反義股，如下所示：
有義股：5’-mX-
S-mX-mX-mX-mX-mX-mX-fX-fX-fX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX- 3’；
雜交於：
反義股：5’-[Me磷酸酯-4O-mX]-
S-fX-
S-fX-
S-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-
S-mX-
S-mX-3’;
其中mX = 2’-
O-甲基修飾之核苷酸，
fX = 2’-氟修飾之核苷酸，
-
S-= 硫代磷酸酯鍵，
- = 磷酸二酯鍵，
[Me磷酸酯-4O-mX] = 4’-O-單甲基磷酸酯-2’-O-甲基修飾的核苷酸，以及
ademX-GalNAc = 将GalNAc连接到核苷酸上。
在一些實施例中，本發明提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括一有義股和一反義股，其中有義股包括下列序列以及全部修飾：5′ -[mGs][mG][mU][mG][mC][mU][mA][fC][fU][fC][fU][mG][mG][mU][mA][mU][mU][mU][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 621),且其中反義股包括下列序列以及全部修飾：5′ [Me磷酸酯-4O-mUs][fGs][fAs][fA][fA][mU][fA][mC][mC][fA][mG][mA][mG][fU][mA][mG][mC][mA][mC][mCs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 642)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，及其中ademA-GalNAc = GalNAc修飾的腺嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，本發明提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括一有義股和一反義股，其中有義股包括下列序列以及全部修飾：5′ [mGs][mC][mU][mA][mC][mU][mC][fU][fG][fG][fU][mA][mU][mU][mU][mC][mC][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 622),且其中反義股包括下列序列以及全部修飾：5′ [Me磷酸酯-4O-mUs][fUs][fAs][fG][fG][mA][fA][mA][mU][fA][mC][mC][mA][fG][mA][mG][mU][mA][mG][mCs][mGs][mG]- 3′ (SEQ ID NO: 643)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，及其中ademA-GalNAc = GalNAc修飾的腺嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，本發明提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括一有義股和一反義股，其中有義股包括下列序列以及全部修飾：5′ - [mCs][mU][mC][mA][mC][mC][mU][fG][fC][fU][fU][mC][mU][mU][mC][mU][mG][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 632),且其中反義股包括下列序列以及全部修飾：5′ -[Me磷酸酯-4O-mUs][fAs][fCs][fC][fA][mG][fA][mA][mG][fA][mA][mG][mC][fA][mG][mG][mU][mG][mA][mGs][mGs][mG] -3′ (SEQ ID NO: 653)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，及其中ademA-GalNAc = GalNAc修飾的腺嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，本發明提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括一有義股和一反義股，其中有義股包括下列序列以及全部修飾：5′ -[mAs][mG][mU][mG][mU][mG][mA][fA][fA][fG][fA][mC][mA][mU][mA][mG][mC][mU][mG][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]3’ (SEQ ID NO: 639),且其中反義股包括下列序列以及全部修飾：5′- [Me磷酸酯-4O-mUs][fCs][fAs][fG][fC][mU][fA][mU][mG][fU][mC][mU][mU][fU][mC][mA][mC][mA][mC][mUs][mGs][mG] -3′ (SEQ ID NO: 660)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，及其中ademA-GalNAc = GalNAc修飾的腺嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，本發明提供一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括一有義股和一反義股，其中有義股包括下列序列以及全部修飾：5′ -[mGs][mG][mG][mU][mG][mC][mA][fC][fU][fA][fU][mG][mG][mC][mU][mU][mG][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]3’ (SEQ ID NO: 628),且其中反義股包括下列序列以及全部修飾：5′- [Me磷酸酯-4O-mUs][fUs][fAs][fC][fA][mA][fG][mC][mC][fA][mU][mA][mG][fU][mG][mC][mA][mC][mC][mCs][mGs][mG] -3′ (SEQ ID NO: 649)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，及其中ademA-GalNAc = GalNAc修飾的腺嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，本發明提供一用於降低
TMPRSS6表現之寡核苷酸(如RNAi寡核苷酸)，其中該寡核苷酸包括一有義股和一反義股，其包括有選自由以下所組成之群組之核苷酸序列：
(a)分別為SEQ ID NO: 621及642；
(b)分別為SEQ ID NO: 622及643；
(c)分別為SEQ ID NO: 637及658；
(d)分別為SEQ ID NO: 632及653；
(e)分別為SEQ ID NO: 638及659；
(f)分別為SEQ ID NO: 639及660；
(g)分別為SEQ ID NO: 627及648；
(h)分別為SEQ ID NO: 628及649；及，
(i)分別為SEQ ID NO: 629及650。
在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 621所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 642中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 622所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 643中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 632所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 653中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 639所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 660中所示之核苷酸序列。在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 628所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 649中所示之核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 621所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 642所示之核苷酸序列，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中所述RNAi係以具有如圖14A所示結構的共軛形式存在。
在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 621所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 642所示之核苷酸序列，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中所述RNAi係以具有如圖10A-B所示結構的共軛形式存在。
在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 632所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 653所示之核苷酸序列，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中所述RNAi係以具有如圖14B所示結構的共軛形式存在。
在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 632所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 653所示之核苷酸序列，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中所述RNAi係以具有如圖11A-B所示結構的共軛形式存在。
在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 639所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 660所示之核苷酸序列，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中所述RNAi係以具有如圖14C所示結構的共軛形式存在。
在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 639所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 660所示之核苷酸序列，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中所述RNAi係以具有如圖12A-B所示結構的共軛形式存在。
在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 628所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 649所示之核苷酸序列，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中所述RNAi係以具有如圖14D所示結構的共軛形式存在。
在一些實施例中，本發明所提供用於降低
TMPRSS6表現之TMPRSS6-靶向寡核苷酸包括一有義股，其包括如SEQ ID NO: 628所示之核苷酸序列，以及一反義股，其包括如SEQ ID NO: 649所示之核苷酸序列，該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中所述RNAi係以具有如圖13A-B所示結構的共軛形式存在。
調配物
已研發出各種調配物(例如醫藥調配物)用於寡核苷酸用途。舉例而言，可使用調配物將寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)遞送至個體或細胞環境，該調配物使降解最小化，促進遞送及/或吸收，或為調配物中之寡核苷酸提供另一有益特性。在一些實施例中，本文提供組合物，其包括降低
TMPRSS6表現之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)。此類組成物可經適當地調配，使得當向個體投與時，無論是進入標靶細胞的直接環境中或是全身性，都有足夠部分的寡核苷酸進入細胞，以降低
TMPRSS6表現。任何各種合適的寡核苷酸調配物可用於遞送寡核苷酸，以降低如本文所揭示的
TMPRSS6。在一些實施例中，寡核苷酸係配製於緩衝溶液如磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、脂質體、微胞結構和殼體中。本文所述的任一寡核苷酸不僅可作為核酸提供，亦可以醫藥學上可接受的鹽類形式提供。
寡核苷酸與陽離子型脂質之調配物可用於促進將寡核苷酸轉染至細胞中。舉例而言，可使用陽離子型脂質(諸如陽離子脂質體)、陽離子甘油衍生物及多陽離子分子(
例如聚離胺酸)。合適的脂質包括寡非他命(Oligofectamine)、脂染胺(Lipofectamine) (Life Technologies)、NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.)或FuGene 6 (Roche)，以上所有皆可根據製造商的說明書使用。
因此，在一些實施例中，調配物包括脂質奈米粒子。在一些實施例中，賦形劑包括脂質體、脂質、脂質複合物、微球體、微粒、奈米球或奈米粒子，或可另外調配以供投與至有需要之個體之細胞、組織、器官或身體(參見例如Remington: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 第22版, Pharmaceutical Press, 2013)。
在一些實施例中，本文中之調配物包括賦形劑。在一些實施例中，賦形劑賦予組合物改良的穩定性、改良的吸收、改良的溶解性及/或活性成分之治療性增強。在一些實施例中，賦形劑為緩衝劑(
例如檸檬酸鈉、磷酸鈉、tris鹼或氫氧化鈉)或媒劑(
例如緩衝溶液、凡士林、二甲亞碸或礦物油)。在一些實施例中，寡核苷酸經凍乾以供延長其儲存期限且接著在使用前製成溶液(
例如投與至個體)。因此，包括有本文所描述之任一寡核苷酸之組合物中之賦形劑可為凍乾保護劑(
例如甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯啶酮)或塌陷溫度調節劑(
例如聚葡萄糖、Ficoll™或明膠)。
在一些實施例中，醫藥組合物經調配可與其預期投藥途徑相容。投與途徑之實例包含非經腸(
例如靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮內、皮下)、經口(
例如吸入)、經皮(
例如體表)、經黏膜及直腸投與。
適用於可注射用途的醫藥組成物包含無菌水溶液(水溶性)或分散液，以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。用於靜脈內投藥，合適的載體包含生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。載體可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇及類似物)，以及其合適混合物。在許多情況下，較佳組合物中包含等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)、氯化鈉。可藉由將寡核苷酸以所需量與上文所列舉之一種成分或成分組合併入於所選溶劑中，(視需要)隨後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。
在一些實施例中，組成物可包含至少約0.1%的治療試劑(例如，用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸)或更多，儘管該活性成分的百分比可介於約1%至約80%或更多之總組成物的重量或體積。製備此類醫藥調配物之熟習此項技術者應考慮諸如溶解性、生物可用性、生物半衰期、投與途徑、產物存放期以及其他藥理學考慮因素之因素，且因此，各種劑量及治療方案可為可取的。
使用方法 降低 TMPRSS6 表現
在一些實施例中，本發明提供用於接觸或遞送有效量之本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)至細胞或細胞群中以降低
TMPRSS6表現的方法。在一些實施例中，藉由測量細胞中的
TMPRSS6mRNA、matriptase-2蛋白質或matriptase-2活性的量或含量的降低，來確認
TMPRSS6表現的降低。該等方法包含本文所描述及一般熟習此項技術者已知之方法。
本文提供之方法適用於任何適當細胞類型。在一些實施例中，細胞為表現
TMPRSS6mRNA的任何細胞(例如，肝細胞)。在一些實施例中，細胞為獲自個體之初代細胞。在一些實施例中，初代細胞已進行有限數目之傳代，以使得細胞實質上維持其天然表型特性。在一些實施例中，將寡核苷酸遞送至其中之細胞為
離體或
活體外的(
亦即可遞送至培養細胞中或細胞所存在之生物體中)。
在一些實施例中，使用此項技術中已知之核酸遞送方法，將本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)遞送至細胞或細胞群體中，該核酸遞送方法包含但不限於注射含有寡核苷酸之溶液、藉由寡核苷酸覆蓋之粒子轟擊、將細胞或細胞群體暴露於含有寡核苷酸之溶液或在寡核苷酸存在下電穿孔細胞膜。可使用此項技術中已知之其他用於將寡核苷酸遞送至細胞之方法，諸如脂質介導之載劑運輸、化學介導之運輸及陽離子型脂質體轉染(諸如磷酸鈣)等等。
在一些實施例中，藉由評估細胞或細胞群體之與
TMPRSS6表現相關之一或多種分子、特性或特徵的測定法或技術，或藉由評估直接指示細胞或細胞群體中之
TMPRSS6表現之分子(
例如 TMPRSS6mRNA或matriptase-2蛋白質)的測定法或技術，來測定
TMPRSS6表現的降低。在一些實施例中，本文提供的寡核苷酸降低
TMPRSS6表現的程度，係藉由比較與寡核苷酸接觸的細胞或細胞群與合適的對照組(例如，未與該寡核苷酸接觸或未與對照寡核苷酸接觸的合適細胞或細胞群)中的
TMPRSS6表現而評估。在一些實施例中，對照細胞或細胞群中
TMPRSS6表現的對照量或含量為預定的，不需要在進行測定或技術的每一實例中測量對照量或含量。預先測定之含量或值可呈多種形式。在一些實施例中，預先測定之含量或值可為單一截止值，諸如中位數或平均值。
在一些實施例中，使本文所描述之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)與細胞或細胞群體接觸或將其遞送至細胞或細胞群體中導致未與寡核苷酸接觸或與對照寡核苷酸接觸之細胞或細胞群體中之
TMPRSS6表現降低。在一些實施例中，相較於
TMPRSS6表現的對照量或含量，
TMPRSS6表現的降低為約1%或更低、約5%或更低、約10%或更低、約15%或更低、約20%或更低、約25%或更低、約30%或更低、約35%或更低、約40%或更低、約45%或更低、約50%或更低、約55%或更低、約60%或更低、約70%或更低、約80%或更低、或約90%或更低。在一些實施例中，
TMPRSS6表現的對照量或含量為未與本文所述之寡核苷酸接觸的細胞或細胞群中的
TMPRSS6mRNA及/或matriptase-2蛋白質的量或含量。在一些實施例中，使用本領域已知方法量測
TMPRSS6mRNA表現。在一些實施例中，使用qPCR量測
TMPRSS6mRNA表現。在一些實施例中，使用本領域已知方法量測
TMPRSS6蛋白表現。在一些實施例中，使用ELISA量測
TMPRSS6蛋白表現。在一些實施例中，使用西方墨點法量測
TMPRSS6蛋白表現。在一些實施例中，在任何有限時段或時間量(例如數分鐘、數小時、數天、數週、數月)之後，評定根據本文中之方法將本文中之寡核苷酸遞送至細胞或細胞群體之效果。例如，在一些實施例中，在細胞或細胞群中的
TMPRSS6表現量係在將該寡核苷酸接觸或遞送至細胞或細胞群之後至少約4小時、約8小時、約12小時、約18小時、約24小時；或至少約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約21天、約28天、約35天、約42天、約49天、約56天、約63天、約70天、約77天或約84天或更長時間測定。在一些實施例中，在細胞或細胞群中的
TMPRSS6表現量係在將該寡核苷酸接觸或遞送至細胞或細胞群之後至少約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月或約6個月或更長時間測定。
在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)係以呈經工程改造以在細胞中表現寡核苷酸或包括有寡核苷酸之股(
例如其有義股及反義股)之轉殖基因形式遞送。在一些實施例中，使用經工程改造以表現本文揭示之任何寡核苷酸之轉殖基因來遞送本文中之寡核苷酸。轉殖基因可使用病毒載體(
例如腺病毒、反轉錄病毒、痘瘡病毒、痘病毒、腺相關病毒或單純疱疹病毒)或非病毒載體(
例如質體或合成mRNA)來遞送。在一些實施例中，轉殖基因可直接注射至個體。
治療方法
本發明提供使用作為藥物的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，特別是用於治療與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症和症狀的方法中。本發明亦提供用於或適用於治療將從降低
TMPRSS6表現而受益的個體(例如，患有與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或症狀的人)之寡核苷酸。在一些態樣中，本發明提供用於或適合用於治療患有與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或症狀的個體之寡核苷酸。在一些實施例中，需要降低TMPRSS6的個體具有鐵堆積疾病、病症或症狀風險，或處於鐵堆積疾病、病症或症狀風險中。在一些實施例中，本文所描述的組成物、化合物及方法係提供用於降低個體體內鐵含量。在一些實施例中，鐵堆積係由於個體中的疾病、病症或症狀。在一些實施例中，疾病、病症或症狀為血色素沉著症如遺傳性血色素沉著症。在一些實施例中，疾病、病症或症狀為β地中海貧血。在一些實施例中，疾病、病症或症狀為真性紅血球增多症。本發明亦提供用於或適用於製造用於治療與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或症狀之藥物或醫藥組成物之寡核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸係用於或適用於靶向
TMPRSS6mRNA並降低
TMPRSS6表現(例如，經由RNAi途徑)。在一些實施例中，該寡核苷酸係用於或適用於靶向
TMPRSS6mRNA並降低
TMPRSS6mRNA、matriptase-2蛋白質及/或TMPRSS6活性的量或含量。
本發明亦提供以本文提供的寡核苷酸治療患有、懷疑患有或有風險發生與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或症狀的個體之方法。在一些態樣中，本發明提供使用本文所述之寡核苷酸治療或減輕與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或症狀的發作或進展的方法。在其他態樣中，本發明提供使用本文提供之寡核苷酸在患有與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或症狀的個體中，達成一或多種治療益處的方法。在本文中之方法之一些實施例中，藉由投與治療有效量之本文提供之寡核苷酸中之任一者或多者來治療個體。在一些實施例中，治療包括降低
TMPRSS6的表現。在一些實施例中，治療性治療個體。在一些實施例中，預防性治療個體。
在本文中之方法之一些實施例中，向患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀之個體投與本文中之一或多種寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)或包括有一或多種寡核苷酸之醫藥組合物，以使得個體中之
TMPRSS6表現降低，從而治療個體。在一些實施例中，該個體之
TMPRSS6mRNA的量或含量降低。在一些實施例中，個體中之matriptase-2蛋白質之量或含量降低。在一些實施例中，個體中之matriptase-2活性之量或含量降低。
在本文中之方法之一些實施例中，向患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀之個體投與本文提供之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)或包括有寡核苷酸之醫藥組合物，以使得當相較於在投與一或多種寡核苷酸或醫藥組合物前之
TMPRSS6表現時，個體中之
TMPRSS6表現降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或高於99%。在一些實施例中，當與未接受寡核苷酸或寡核苷酸群或醫藥組成物、或接受對照寡核苷酸或寡核苷酸群、醫藥組成物或治療的個體(例如，參考或對照個體)中的
TMPRSS6表現相較時，該個體中的
TMPRSS6表現降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。
在本文中之方法之一些實施例中，向患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀之個體投與本文中之一或多種寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)或包括有一或多種寡核苷酸之醫藥組合物，以使得當相較於在投與寡核苷酸或醫藥組合物前之
TMPRSS6mRNA之量或含量時，降低個體中的
TMPRSS6mRNA的量或含量至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或高於99%。在一些實施例中，當與未接受寡核苷酸或寡核苷酸群或醫藥組成物、或接受對照寡核苷酸或寡核苷酸群、醫藥組成物或治療的個體(例如，參考或對照個體)中的
TMPRSS6mRNA的量或含量相較時，該個體中的
TMPRSS6mRNA的量或含量降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。
在本文中之方法之一些實施例中，向患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀之個體投與本文中之一或多種寡核苷酸或包括有一或多種寡核苷酸之醫藥組合物，以使得當相較於在投與寡核苷酸或醫藥組合物前之matriptase-2蛋白質之量或含量時，個體中的matriptase-2蛋白質的量或含量降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或高於99%。在一些實施例中，當與未接受寡核苷酸或寡核苷酸群或醫藥組成物或接受對照寡核苷酸或寡核苷酸群、醫藥組成物或治療的個體(例如，參考或對照個體)中的matriptase-2蛋白質的量或含量相較時，該個體中的matriptase-2蛋白質的量或含量降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。
在本文中之方法之一些實施例中，向患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀之個體投與本文中之一或多種寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)或包括有一或多種寡核苷酸之醫藥組合物，以使得當相較於在投與寡核苷酸或醫藥組合物前之
TMPRSS6活性之量或含量時，個體中的
TMPRSS6基因活性/表現的量或含量降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或高於99%。在一些實施例中，當與未接受寡核苷酸或寡核苷酸群或醫藥組成物或接受對照寡核苷酸或寡核苷酸群、醫藥組成物或治療的個體(例如，參考或對照個體)中的
TMPRSS6活性的量或含量相較時，該個體中的
TMPRSS6 活性的量或含量降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。
在本文中之方法之一些實施例中，向患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀之個體投與本文提供之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)或包括有寡核苷酸之醫藥組合物，以使得當相較於在投與一或多種寡核苷酸或醫藥組合物前之鐵調素生成時，個體中之鐵調素生成降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或高於99%。在一些實施例中，當相較於未接受一或多種寡核苷酸或醫藥組合物或接受一或多種對照寡核苷酸、醫藥組合物或治療之個體(例如參考或對照個體)中之鐵調素生成時，個體中之鐵調素生成降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或高於99%。
在本文中之方法之一些實施例中，向患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀之個體投與本文提供之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)或包括有寡核苷酸之醫藥組合物，以使得當相較於在投與一或多種寡核苷酸或醫藥組合物前之血清鐵時，個體中之血清鐵降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或高於99%。在一些實施例中，當相較於未接受一或多種寡核苷酸或醫藥組合物或接受一或多種對照寡核苷酸、醫藥組合物或治療之個體(例如參考或對照個體)中之血清鐵時，個體中之血清鐵生成降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或高於99%。
在本文中之方法之一些實施例中，向患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀之個體投與本文提供之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)或包括有寡核苷酸之醫藥組合物，以使得當相較於在投與一或多種寡核苷酸或醫藥組合物前之血清鐵飽和度時，個體中之血清鐵飽和度降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或高於99%。在一些實施例中，當相較於未接受一或多種寡核苷酸或醫藥組合物或接受一或多種對照寡核苷酸、醫藥組合物或治療之個體(例如參考或對照個體)中之血清鐵飽和度時，個體中之血清鐵飽和度降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或高於99%。
適用於測定個體或來自該個體之樣本中的
TMPRSS6表現、
TMPRSS6mRNA、matriptase-2蛋白、matriptase-2活性、與
TMPRSS6表現相關或受其影響的生物標誌物(如血漿中的生物標誌物)的量或含量之合適方法，為此領域已知。此外，本文所述的實例說明用於測定
TMPRSS6表現的方法。
在一些實施例中，
TMPRSS6表現、
TMPRSS6mRNA、matriptase-2蛋白質、matriptase-2活性、或與
TMPRSS6表現相關或受其調節的生物標誌物、或其任意組合的量或含量，係於細胞(例如，肝細胞)、細胞群或細胞組(例如，類器官)、器官(例如，肝臟)、血液或其部分(例如，血漿)、組織(例如，肝組織)、樣本(例如，肝切片樣本)、或從個體獲得或分離的任何其他合適的生物材料中降低。在一些實施例中，
TMPRSS6表現、
TMPRSS6mRNA、matriptase-2蛋白質、matriptase-2活性、與
TMPRSS6表現相關或受其調節的生物標誌物、或其任意組合的量或含量，係於大於一種類型之細胞(例如，肝細胞或一或多種其他類型之細胞)、大於一種之細胞組、大於一種器官(例如，肝臟與一或多種其他器官)、大於一種血液之部分(例如，血漿與一或多種其他血液部分)、大於一種組織(例如，肝組織與一或多種其他種類之組織)、大於一種之樣本(例如，肝切片樣本與一或多種其他類型之生物切片樣本)中降低。
由於其高特異性，本文提供之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)特異性地靶向細胞及組織或器官(
例如肝臟中)之目標基因的mRNA (例如
TMPRSS6mRNA)。在預防疾病中，目標基因可為引發或維持疾病所需的基因或已鑑別為與感染疾病之高風險相關的基因。在治療疾病中，可使寡核苷酸與呈現或負責介導疾病之細胞、組織或器官(
例如肝)接觸。例如，可將與鐵調素缺乏或抑制相關的病症或症狀之野生型(即天然)或突變基因之全部或部分實質上相同之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，與感興趣的細胞或組織類型(例如肝細胞或其他肝臟細胞)接觸或引入。
與鐵調素缺乏或抑制相關的病症、疾病或病狀的實例包含但不限於血色素沉著症(例如，遺傳性血色素沉著症)、β地中海貧血、真性紅血球增多症、鐵難治性、缺鐵性貧血。
在一些實施例中，目標基因可為來自任何哺乳動物之目標基因，諸如人類目標。任何目標基因可根據本文所描述之方法靜默。
本文所描述之方法通常涉及向個體投與有效量之本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)，亦即製造或產生所需治療結果之量。治療可接受量可為治療性治療疾病或病症之量。任一個體之合適劑量將視某些因素而定，包含個體之身材、體表面積、年齡、待投與之組合物、組合物中之活性成分、投與之時間及途徑、一般健康狀況及待同時投與之其他藥物。
在一些實施例中，向個體經腸(
例如經口，藉由胃飼管、藉由十二指腸飼管、
經由胃造口術或經直腸)、非經腸(
例如皮下注射、靜脈內注射或輸注、動脈內注射或輸注、骨內輸注、肌肉內注射、腦內注射、腦室內注射、鞘內)、局部(
例如上表皮、吸入性、
經由滴眼劑或經由黏膜)或藉由直接注射至目標器官(
例如個體之肝)中來投與本文中之組合物中之任一者(
例如包括本文所描述之RNAi寡核苷酸之組合物)。通常，本文中之寡核苷酸係經靜脈內或皮下投與。
在一些實施例中，單獨或組合投與本文中之寡核苷酸(
例如RNAi寡核苷酸)或包括有寡核苷酸之醫藥組合物。在一些實施例中，以同時、依序(按任何次序)或間歇地組合投與本文中之寡核苷酸。舉例而言，可同時共投與兩種寡核苷酸。替代地，可投與一種寡核苷酸，且之後任何時間量(
例如一小時、一天、一週或一個月)投與第二寡核苷酸。
在一些實施例中，待治療的個體為人類或非人類靈長類或其他哺乳動物個體。其他例示性個體包括家養動物，諸如狗及貓；家畜，諸如馬、牛、豬、綿羊、山羊及雞；及諸如小鼠、大鼠、天竺鼠及倉鼠之動物。
套組
在一些實施例中，本發明提供一種套組，其包括本文所述之寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)和使用說明。在一些實施例中，該套組包括本文所述的寡核苷酸、以及該套組及/或其任何組件的使用說明的藥品仿單。在一些實施例中，套組在合適的容器中包括本文之寡核苷酸、一或多種對照及各種緩衝劑、試劑、酶及此項技術中熟知之其他標準成分。在一些實施例中，容器包括至少一個小瓶、孔、試管、燒瓶、瓶子、注射器或置放寡核苷酸且在一些情況下經適當等分的其他容器構件。在提供額外組分之一些實施例中，套組含有置放此組分之額外容器。套組亦可包含用於含有將寡核苷酸及任何其他試劑嚴密封閉以供商業銷售之構件。此類容器可包含其中保留所需小瓶之注射模製或吹塑模製塑膠容器。容器及/或套組可包含帶有使用說明及/或警告之標記。
在一些實施例中，套組包括本文之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)及醫藥學上可接受之載劑，或包括有寡核苷酸之醫藥組合物及治療有需要之個體之與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀或延遲其進展的說明書。
定義
如本文所用，術語「反義寡核苷酸」涵蓋基於核酸之分子，其具有與目標mRNA之全部或一部分互補的序列，特定言之種子序列，從而能夠與mRNA形成雙螺旋。因此，如本文所用，術語「反義寡核苷酸」可被稱為「基於互補核酸之抑制劑」或「引導股」。
如本文所用，如應用於所關注之一或多個值之「大致」或「約」係指類似於所陳述參考值之值。在某些實施例中，除非另有說明或另外自上下文顯而易見，否則「約」係指在任一方向(大於或小於)上處於所陳述參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小百分比之內的一系列值(但此類數字將超出可能值之100%的情況除外)。
如本文所用，「投與(administer/administering/administration)」及其類似者係指以藥理學上適用之方式(例如以治療個體之病症、疾病或病狀)向個體提供物質(例如寡核苷酸)。
如本文所用，「緩解(attenuate)」、「緩解attenuating)」、「緩解(attenuation)」及其類似者係指降低或有效地停止。如非限制性實例，本文之一種或多種治療可能降低或有效阻止個體內出現或發展為鐵難治性、缺鐵性貧血、血色素沉著症或β地中海貧血。這種減緩可以通過以下例子來說明，例如，對於鐵難治性、缺鐵性貧血、血色素沉著症或β地中海貧血的一個或多個態樣（例如症狀、組織特徵、細胞、炎症或免疫活性等）的減少、沒有檢測到血色素沉著症或β地中海貧血的一個或多個態樣的進展（惡化）、或在個體中沒有檢測到鐵難治性、缺鐵性貧血、血色素沉著症或β地中海貧血的一個或多個態樣，當可能會預期的情況下。
如本文所用，「互補」係指兩個核苷酸(例如兩個相對核酸上或單一核酸股之相對區域上)之間、准許兩個核苷酸彼此形成鹼基對的結構關係。舉例而言，與相對核酸之嘧啶核苷酸互補的一個核酸之嘌呤核苷酸可藉由彼此形成氫鍵而鹼基配對在一起。在一些實施例中，互補核苷酸可以沃森-克里克方式(Watson-Crick manner)或以允許形成穩定雙螺旋之任何其他方式鹼基配對。在一些實施例中，兩個核酸可具有彼此互補以形成互補區之多核苷酸區，如本文所描述。
如本文所用，「去氧核糖核苷酸」係指當相較於核糖核苷酸時，其戊糖之2′位置處之羥基經氫替代的核苷酸。經修飾之去氧核糖核苷酸為除在2'位置處外具有一或多個修飾或原子取代(包含糖、磷酸酯基或鹼基中之修飾或取代，或糖、磷酸酯基或鹼基之修飾或取代)的去氧核糖核苷酸。
如本文所用，「雙股寡核苷酸」或「ds寡核苷酸」係指實質上呈雙螺旋形式之寡核苷酸。在一些實施例中，雙股寡核苷酸之雙螺旋區之互補鹼基配對係形成於具有共價分離的核酸股之反平行核苷酸序列之間。在一些實施例中，雙股寡核苷酸之雙螺旋區之互補鹼基配對係形成於具有共價連接之核酸股之反平行核苷酸序列之間。在一些實施例中，雙股寡核苷酸之雙螺旋區之互補鹼基配對係由經摺疊(
例如經由髮夾)以提供鹼基配對在一起之互補反平行核苷酸序列的單一核酸股形成。在一些實施例中，雙股寡核苷酸包括兩個彼此充分雙螺旋之共價分離的核酸股。然而，在一些實施例中，雙股寡核苷酸包括部分地雙螺旋(
例如在一或兩端處具有突出端)之兩個共價分離的核酸股。在一些實施例中，雙股寡核苷酸包括部分互補的反向平行核苷酸序列，因此可能具有一個或多個錯配，其可包含內部錯配或端點錯配。
如本文所用，關於核酸(例如寡核苷酸)的「雙股螺旋」是指通過兩個反向平行核苷酸序列的互補鹼基配對形成的結構。
如本文所用，「賦形劑」係指可包含於組合物中例如以提供或貢獻所需稠度或穩定效果之非治療劑。
如本文所用，「肝細胞(hepatocyte)」或「肝細胞(hepatocytes)」係指肝之實質組織之細胞。此等細胞構成約70%-85%之肝質量且製造血清白蛋白、FBN及凝血因子之凝血酶原組(除了因子3及4以外)。肝細胞譜系細胞之標記包含但不限於甲狀腺素轉運蛋白(transthyretin；Ttr)、麩胺合成酶(Glul)、肝細胞核因子1a (Hnf1a)及肝細胞核因子4a (Hnf4a)。成熟肝細胞之標記可包含但不限於細胞色素P450 (Cyp3a11)、細胞色素P450 3A4 (CYP3A4)、延胡索醯乙醯乙酸酯羥化酶(fumarylacetoacetate hydrolase；Fah)、葡萄糖6-磷酸酯(G6p)、白蛋白(Alb)及OC2-2F8。
參見例如Huch
等人(2013) Nature 494:247-50。
如本文所用，「肝毒性劑」係指自身為肝毒性或可經處理以形成肝毒性代謝物之化合物、病毒或其他物質。肝毒性劑可包含但不限於四氯化碳(CCl
4)、乙醯胺苯酚(撲熱息痛(paracetamol))、氯乙烯、砷、氯仿、非類固醇抗炎藥(諸如阿司匹林及苯基丁氮酮)。
如本文所用，術語「
TMPRSS6」係指跨膜絲胺酸蛋白酶6。TMPRSS6基因編碼的matriptase-2蛋白質與鐵調素一起參與訊號傳遞路徑調控體內的鐵平衡。matriptase-2
如本文所用，「不穩定連接子」係指可裂解(
例如藉由酸性pH)之連接子。「極其穩定的連接子」係指不可裂解之連接子。
如本文所用，「經修飾之核苷酸間鍵」係指當相較於包括有磷酸二酯鍵之參考核苷酸間鍵時，具有一或多個化學修飾之核苷酸間鍵。在一些實施例中，經修飾之核苷酸為非天然存在之鍵。通常，經修飾之核苷酸間鍵賦予核酸一或多種所需特性，在該核酸中存在經修飾之核苷酸間鍵。舉例而言，經修飾之核苷酸間鍵可改良熱穩定性、對降解之抗性、核酸酶抗性、溶解性、生物可用性、生物活性、降低免疫原性
等。
如本文所用，「經修飾之核苷酸」係指當相較於對應參考核苷酸時具有一或多個化學修飾之核苷酸，該對應參考核苷酸係選自：腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤去氧核糖核苷酸、鳥嘌呤去氧核糖核苷酸、胞嘧啶去氧核糖核苷酸及胸苷去氧核糖核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸為非天然存在之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸在其糖、核鹼基及/或磷酸酯基中具有一或多個化學修飾。在一些實施例中，經修飾之核苷酸具有一或多個與對應參考核苷酸共軛之化學部分。通常，經修飾之核苷酸賦予核酸一或多種所需特性，在該核酸中存在經修飾之核苷酸。舉例而言，經修飾之核苷酸可改良熱穩定性、對降解之抗性、核酸酶抗性、溶解性、生物可用性、生物活性、降低免疫原性
等。當提及修飾的寡核苷酸時，可能理解指的是包括至少一個修飾核苷酸的寡核苷酸。當提及完全修飾的寡核苷酸時，可能理解指的是其中所有核苷酸都是修飾核苷酸的寡核苷酸。所述經修飾的核苷酸不需要包括相同的修飾。
如本文所用，「帶切口的四環結構」係指其特徵在於單獨的有義(乘客)股及反義(引導)股之RNAi寡核苷酸之結構，其中有義股具有反義股之互補區，且其中該股中之至少一者(一般有義股)具有經組態以使形成於至少一股內之相鄰莖區穩定的四環。該結構被稱為切口，由有義股和反義股的骨架之間存在不連續性引起，通常是由有義股和反義股相鄰核苷酸的戊糖之間的不連續性引起的。當環可能是四環迴圈或不是四環迴圈時，「切口結構」通常可係指相同的定義（例如，如本文所公開，當有義股形成三環、四環或其他類型的環時，可以稱之為切口結構）。
如本文所用，「寡核苷酸」係指短核酸(例如長度小於約100個核苷酸)。寡核苷酸可為單股(ss)或雙股(ds)。寡核苷酸可以包含去氧核苷酸、核醣核苷或兩者的組合。在一些實施例中，包括有核糖核苷的雙股寡核苷酸係指「dsRNA」。寡核苷酸可具有或可不具有雙螺旋區。作為非限制性實例之集合，寡核苷酸可為但不限於小干擾RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、dicer受質干擾RNA (DsiRNA)、反義寡核苷酸、短siRNA或ss siRNA。
如本文所用，「突出端」係指由一個股或區域延伸超出互補股之末端(一個股或區域藉以形成雙螺旋)產生的末端非鹼基配對的核苷酸。在一些實施例中，突出端包括自(或接近)寡核苷酸之5'端或3'端處之雙螺旋區延伸的一或多個未配對的核苷酸。在某些實施例中，突出端為寡核苷酸之反義股或有義股上的3'或5'突出端。
如本文所用，特徵可以被描述為在股的3'端或5'端提供的"在"、"上"或"於"。描述在給定股的核苷酸特徵，諸如例如糖修飾、核苷酸間的修飾、核苷酸錯配和突出部分等，被理解為指的是接近定義的股的核苷酸（例如，在有義股的3'端）。
如本文所用，「磷酸酯類似物」係指模擬磷酸酯基之靜電及/或空間特性的化學部分。在一些實施例中，磷酸酯類似物模擬生物系統中磷酸酯基之靜電及/或空間特性。在一些實施例中，磷酸酯類似物位於寡核苷酸之5'端核苷酸，而非5'磷酸酯，後者通常易受酶移除影響。在一些實施例中，5'磷酸根類似物含有一個去磷酸酶抗性聯結。磷酸根類似物的實例包含但不限於：5'磷酸酯，例如5'亞甲基磷酸酯(5'-MP)和5'-(E)-乙烯基磷酸酯(5'-VP)。在一些實施例中，寡核苷酸在5'端核苷酸處之糖之4'-碳位置處具有磷酸酯類似物(稱為「4'-磷酸酯類似物」)。4'-磷酸酯類似物之實例為氧甲基磷酸酯，其中氧甲基之氧原子與糖部分(
例如在其4'-碳處)或其類似物結合。
參見例如美國專利公開案第2019-0177729號。已研發出針對寡核苷酸之5'端之其他修飾(
參見例如國際專利申請案第WO 2011/133871號；美國專利案第8,927,513號；及Prakash
等人(2015) NUCLEIC ACIDS RES
.43:2993-3011)。
如本文所用，基因(例如，
TMPRSS6)的「降低表現」是指當與適當的參考物(例如，參考細胞、細胞群、樣本或個體)進行比較時，由該基因編碼的RNA轉錄體(例如，
TMPRSS6mRNA)或蛋白質的量或含量的降低、及/或在細胞、細胞群、樣本或個體中的基因活性量或含量降低。舉例而言，當相較於未用寡核苷酸治療之細胞時，使細胞與本文中之寡核苷酸(
例如包括具有與包括有
TMPRSS6mRNA之核苷酸序列互補之核苷酸序列的反義股的寡核苷酸)接觸的動作可導致
TMPRSS6mRNA、matriptase-2蛋白質及/或活性之量或含量降低(
例如經由藉由RNAi路徑降解
TMPRSS6mRNA)。類似地，且如本文所使用，「降低表現」是指導致基因(例如，
TMPRSS6)表現降低的動作。
如本文所用，「
TMPRSS6表現的降低」是指當與合適的參考物(例如，參考細胞、細胞群、樣本或個體)相較時，細胞、細胞群、樣本或個體中的
TMPRSS6mRNA、matriptase-2蛋白及/或matriptase-2活性的量或含量降低。
如本文所用，「互補區」係指與反平行核苷酸序列充分互補以准許在適當雜交條件(例如在磷酸鹽緩衝液中、在細胞中等)下兩個核苷酸序列之間雜交之核酸(例如寡核苷酸)的核苷酸序列。在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包括具有mRNA標靶序列之互補區之靶向序列。互補區可為給定的長度且可以由一系列連續的核苷酸（例如，長度至少15個連續的核苷酸）來標識，係指一系列核苷酸通過核苷酸間鍵連續連接在一起。
如本文所用，「核糖核苷酸」係指具有一核糖作為其戊糖之核苷酸，該戊糖在其2'位置處含有羥基。經修飾之核糖核苷為除在2'位置處外具有一或多個修飾或原子取代(包含核糖、磷酸酯基或鹼基中之修飾或取代，或核糖、磷酸酯基或鹼基之修飾或取代)的核糖核苷。
如本文所用，「RNAi寡核苷酸」是指(a)具有義股(過客)和反義股(引導)的雙股寡核苷酸，其中該反義股或反義股的一部分被Argonaute 2 (Ago2)核酸內切酶用來切割目標mRNA (例如，
TMPRSS6mRNA)，或(b)具有單一反義股之單股寡核苷酸，其中該反義股(或該反義股的一部分)被Ago2核酸內切酶用來切割目標mRNA (例如，
TMPRSS6mRNA)。
如本文所用，「股」係指經由核苷酸間鍵(
例如磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵)連接在一起之單一連續核苷酸序列。在一些實施例中，股具有兩個自由端(
例如5'端及3'端)。
如本文所用，「個體」意謂任何哺乳動物，包括小鼠、兔、非人類靈長類(NHP)及人類。在一個實施例中，個體為人類或NHP。此外，「個體(individual)」或「患者(patient)」可與「個體(subject)」互換使用。
如本文所用，「合成」係指核酸或其他分子係經人工合成(
例如使用機器(
例如固態核酸合成器))或抑或不來源於正常產生分子之天然來源(
例如細胞或生物體)。
如本文所用，「靶向配體」係指選擇性地與所關注組織或細胞之同源分子(
例如受體)結合且出於將其他物質靶向所關注組織或細胞的目的，可與另一物質結合的分子(
例如碳水化合物、胺糖、膽固醇、多肽或脂質，諸如例如GalNAc部分)。舉例而言，在一些實施例中，出於將寡核苷酸靶向所關注之特定組織或細胞的目的，靶向配體可與寡核苷酸共軛。在一些實施例中，靶向配體選擇性地與細胞表面受體結合。因此，在一些實施例中，在與寡核苷酸共軛時，靶向配體有助於經由選擇性與細胞表面上表現之受體結合及細胞將包括有寡核苷酸、靶向配體及受體之複合物進行核內體內化，而將寡核苷酸遞送至特定細胞中。在一些實施例中，靶向配體
經由連接子與寡核苷酸共軛，該連接子在細胞內化之後或期間裂解以使得寡核苷酸自細胞中之靶向配體釋放。
如本文所用，「標靶序列」係指在轉錄
TMPRSS6基因（例如，SEQ ID NO: 853、854和855）時形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續部分，包含由初級轉錄產物的RNA處理產生的mRNA。在一些實施例中，序列的靶向部分將至少足夠長，以在或接近
TMPRSS6基因轉錄期間形成的mRNA分子的該部分作為RNAi導向切割的底物。在一些實施例中，標靶序列係位於
TMPRSS6基因的蛋白質編碼區域中。在一些實施例中，標靶序列係位於
TMPRSS6基因的3’ UTR中。
如本文所用，「標靶序列」係指與標靶序列完全或部分互補的核苷酸序列。
如本文所用，「環」、「三環」、或「四環」係指核酸（例如寡核苷酸）的一個未配對區域，該區域被兩個反平行的核酸區域包圍，彼此之間具有足夠的互補性，以便在適當的雜交條件下（例如在磷酸緩衝液中、在細胞中），包圍未配對區域的兩個反平行區域會進行雜交形成一個雙螺旋（稱為「莖」）。一個環增加由雜交核苷酸之側接序列形成的相鄰雙螺旋之穩定性。穩定性之增加可偵測為相鄰莖雙螺旋之熔化溫度(T
m)的增加，其高於自一組由隨機選擇之核苷酸序列組成的相當長度之環平均預期的相鄰莖雙螺旋之T
m。舉例而言，環(例如四環或三環)可賦予在10 mM Na
2HPO
4中，包括有長度至少2個鹼基對(bp)之雙螺旋的髮夾段之Tm值至少約50℃、至少約55℃、至少約56℃、至少約58℃、至少約60℃、至少約65℃或至少約75℃。例如，在10 mM Na
2HPO
4溶液中，四環可賦予包括有長度至少2個鹼基對(bp)之雙螺旋的髮夾段之Tm值至少約50°C、至少約55°C、至少約56°C、至少約58°C、至少約60°C、至少約65°C，或至少約75°C。在一些實施例中，環可藉由堆疊相互作用使相鄰莖雙螺旋中之bp穩定。另外，環中之核苷酸中之相互作用包含但不限於非沃森-克里克鹼基配對、堆疊相互作用、氫鍵結及接觸相互作用(Cheong等人(1990) Nature 346:680-82; Heus & Pardi (1991) Science 253:191-94)。在一些實施例中，環包括3至6個核苷酸或由其組成，且通常為4至5個核苷酸。在某些實施例中，環包括以下或由以下組成：3、4、5或6個核苷酸，該等核苷酸可經修飾或可未經修飾(
例如其可與靶向部分/靶向配體共軛或可不與靶向部分/靶向配體共軛)。在一個實施例中，由3個核苷酸組成的環為三環。在一個實施例中，由4個核苷酸組成的環為四環。四環中可使用任何核苷酸，且可使用此類核苷酸之標準IUPAC-IUB符號，如Cornish-Bowden (1985) Nucleic Acids Res. 13:3021-30中所描述。舉例而言，字母「N」可用於意指可能處於彼位置之任何鹼基，字母「R」可用於顯示可能處於彼位置之A (腺嘌呤)或G (鳥嘌呤)，且「B」可用於顯示可能處於彼位置之C (胞嘧啶)、G (鳥嘌呤)或T (胸腺嘧啶)。四環之實例包含：四環之UNCG家族(例如UUCG)、四環之GNRA家族(例如GAAA)及CUUG四環(Woese等人(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8467-71；Antao 等人(1991) Nucleic Acids Res. 19:5901-05)。DNA四環之實例包含四環之d(GNNA)家族(
例如d(GTTA)、d(GNRA))家族、四環之d(GNAB)家族、四環之d(CNNG)家族及四環之d(TNCG)家族(
例如d(TTCG))。
參見例如, Nakano
等人(2002) Biochem. 41:14281-92；Shinji
等人(2000) Nippon Kagakkai Koen Yokoshu 78:731。在一些實施例中，四環包含於帶切口的四環結構內。
如本文所用，「治療(treat/treating)」係指出於改善個體之關於現有病狀(
例如疾病、病症)的健康及/或幸福之目的或為了預防或降低出現病狀之可能性，向有需要之個體提供照護之動作，例如藉由向個體投與治療劑(
例如本文中之寡核苷酸)。在一些實施例中，治療包括降低個體罹患之病狀(
例如疾病、病症)之至少一種跡象、症狀或促成因素之頻率或嚴重性。
「醫藥學上可接受的」表示該物質或組成物必須在化學上和/或毒理學上適合於哺乳動物的治療。
如本文所用，符號
用於描述連接點。
本發明進一步的實施例列表1. 一種用於降低跨膜絲胺酸蛋白酶6 (
TMPRSS6)表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括一有義股和一反義股，其中該有義股和反義股形成雙螺旋區，其中該反義股包括與SEQ ID NO: 661-852之任一者的
TMPRSS6mRNA標靶序列互補區，且其中該互補區的長度為至少15個連續核苷酸。
2. 一種用於降低跨膜絲胺酸蛋白酶6 (
TMPRSS6)表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括形成雙螺旋區之一有義股和一反義股，其中該反義股包括與SEQ ID NO: 661-852之任一者所示之
TMPRSS6mRNA標靶序列互補區，且其中該互補區的長度為至少15個連續核苷酸。
3. 如實施例1或2之RNAi寡核苷酸，其中該有義股之長度為15至50個核苷酸。
4. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股之長度為18至36個核苷酸。
5. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股之長度為15至30個核苷酸。
6. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股之長度為22個核苷酸，且其中反義股及有義股形成長度為至少19個核苷酸之雙螺旋區，視情況長度為至少20個核苷酸。
7. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股之長度為22個核苷酸，且其中反義股及有義股形成長度為至少20個核苷酸之雙螺旋區。
8. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該互補區之長度為至少18個連續核苷酸，視情況該互補區之長度為至少19個連續核苷酸。
9. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該互補區之長度為至少19個連續核苷酸。
10. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該互補區之長度為至少19個連續核苷酸。
11. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該互補區之長度為至少20個連續核苷酸。
12. 一種用於降低
TMPRSS6表現之雙股RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括：
(i)長度為19-30個核苷酸的反義股，其中該反義股包括一核苷酸序列，其包括有與
TMPRSS6mRNA標靶序列互補區，其中該互補區選自於SEQ ID NO: 1-192，以及
(ii)長度為19-50個核苷酸之有義股，其包括該反義股之互補區，其中該反義股及該有義股為單獨股，其形成在該反義股之3’端處具有1-4個核苷酸之突出端的不對稱雙螺旋區。
13. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股之3'端包括示為S1-Lp-S2之莖-環，其中S1與S2互補，且其中Lp在S1與S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環。
14. 如實施例1-12中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股接近之3'端包括如為S1-Lp-S2所示之莖-環，其中S1與S2互補，且其中Lp在S1與S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環。
15. 如實施例1-12中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股接近3'端包括如為S1-Lp-S2所示之莖-環，其中S1與S2互補，且其中Lp在S1與S2之間形成長度為3-5個核苷酸之環。
16. 如實施例13-15中任一者之RNAi寡核苷酸，其中Lp為三環或四環。
17. 如實施例13-16中任一者之RNAi寡核苷酸，其中Lp為四環。
18. 如實施例17所述之RNAi寡核苷酸，其中該四環包括序列5’-GAAA-3’。
19. 如實施例13-18中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該環為包括有序列5’-GAAA-3’的四環。
20. 如實施例13-19中任一者之RNAi寡核苷酸，其中S1及S2之長度為1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸或10個核苷酸。
21. 如實施例13-19中任一者之RNAi寡核苷酸，其中S1及S2各自之長度為1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸或10個核苷酸。
22. 如實施例13-21中任一者之RNAi寡核苷酸，其中S1及S2之長度為1至10個核苷酸，且具有相同長度。
23. 如實施例13-22中任一者之RNAi寡核苷酸，其中S1及S2之長度為6個核苷酸。
24. 如實施例13-23中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該莖-環包括序列5’-GCAGCCGAAAGGCUGC-3’ (SEQ ID NO: 856)。
25. 如實施例13-24中任一者之RNAi寡核苷酸，其中有一股和反義股之間形成不連續性，形成一切口結構。
26. 如實施例13-25中任一者之RNAi寡核苷酸，其中有義股和反義股之間形成不連續性，形成一切口四環結構。
27. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括長度為一或多個核苷酸的3'突出序列。
28. 如實施例27之RNAi寡核苷酸，其中該突出端包括嘌呤核苷酸。
29. 如實施例27-28任一者之RNAi寡核苷酸，其中該3’突出端序列之長度為2個核苷酸。
30. 如實施例27-29任一者之RNAi寡核苷酸，其中該3’突出端係選自AA、GG、AG及GA。
31. 如實施例30之RNAi寡核苷酸，其中該突出端為GG或AA。
32. 如實施例30-31任一者之RNAi寡核苷酸，其中該突出端為GG。
33. 如實施例27-29任一者之RNAi寡核苷酸，其中該3’突出端係選自5’-AA-3’、5’-GG-3’、5’-AG-3’、及5’-GA-3’。
34. 如實施例33之RNAi寡核苷酸，其中該突出端為5’-GG-3’或5’-AA-3’。
35. 如實施例33-34任一者之RNAi寡核苷酸，其中該突出端為5’-GG-3’。
36. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個經修飾之核苷酸。
37. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸為經完全修飾。
38. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸的全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
39. 如實施例1-36中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸為經部分修飾。
40. 如實施例36-39中任一者之RNAi寡核苷酸，其中經修飾的寡核苷酸包括靶向配體共軛的核苷酸。
41. 如實施例36-40中任一者之RNAi寡核苷酸，其中經修飾的寡核苷酸包括靶向配體共軛的核苷酸。
42. 如實施例36-41中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括2'-修飾。
43. 如實施例36-42中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該經修飾之核苷酸包括2'-修飾。
44. 如實施例42-43中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該2'-修飾為選自以下之修飾：2'-胺基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸。
45. 如實施例42-44中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該2'-修飾係選自2'-氟(2’-F)及2'-O-甲基(2’-OMe)。
46. 如實施例36-45中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該修飾為選自2'-氟(2’-F)及2'-O-甲基(2’-OMe)的2'-修飾。
47. 如實施例36-46中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股之約10-15%、10%、11%、12%、13%、14%或15%之核苷酸包括2’-氟(2’-F)修飾。
48. 如實施例36-47中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股之約25-35%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%或35%之核苷酸包括2’-氟(2’-F)修飾。
49. 如實施例36-48中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸之約25-35%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%或35%之核苷酸包括2’-氟(2’-F)修飾。
50. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包含36個核苷酸，自5’至3’位置為1-36，其中位置8-11包括2’-氟(2’-F)修飾。
51. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
有義股包括36個核苷酸，自5’至3’編號；以及
有義股之全部位置8-11包括2’-氟(2’-F)修飾。
52. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
有義股長度為36個核苷酸，自5’至3’編號；以及
有義股之全部位置8-11包括2’-氟(2’-F)修飾。
53. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括22個核苷酸，其中自5'至3'位置為1-22，且其中位置2、3、4、5、7、10及14包括2’-氟(2’-F)修飾。
54. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
反義股包括22個核苷酸，自5’至3’編號；以及
反義股之全部位置2、3、4、5、7、10及14包括2’-氟(2’-F)修飾。
55. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
反義股長度為22個核苷酸，自5’至3’編號；以及
反義股之全部位置2、3、4、5、7、10及14包括2’-氟(2’-F)修飾。
56. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包含36個核苷酸，其中自5'至3'位置為1-36，且其中位置1-7、12-27及31-36包括2’-O-甲基修飾。
57. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
有義股包括36個核苷酸，自5’至3’編號；以及
有義股之全部位置1-7、12-27及31-36包括2’-O-甲基修飾。
58. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
有義股長度為36個核苷酸，自5’至3’編號；以及
有義股之全部位置1-7、12-27及31-36包括2’-O-甲基修飾。
59. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括22個核苷酸，其中自5'至3'位置為1-22，且其中位置1、6、8、9、11-13及15-22包括2’-O-甲基修飾。
60. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
反義股包括22個核苷酸，自5’至3’編號；以及
反義股之全部位置1、6、8、9、11-13及15-22包括2’-O-甲基修飾。
61. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
反義股長度為22個核苷酸，自5’至3’編號；以及
反義股之全部位置1、6、8、9、11-13及15-22包括2’-O-甲基修飾。
62. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
該有義股包括36個核苷酸以及該反義股包括22個核苷酸，每一股的核苷酸係由5’至3’編號；
有義股之全部位置1-7、12-27及31-36以及反義股的全部位置1、6、8、9、11-13及15-22包括2’-O-甲基修飾；以及
有義股之全部位置8-11以及反義股的全部位置2、3、4、5、7、10及14包括2’-氟修飾。
63. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個經修飾之核苷酸間鍵。
64. 如實施例63之RNAi寡核苷酸，其中該至少一個經修飾之核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。
65. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯鍵。
66. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括(i)位置1與2之間及位置2與3之間；或(ii)位置1與2之間、位置2與3之間及位置3與4之間的硫代磷酸酯鍵，其中自5'至3'編號為位置1-4。
67. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股之長度為22個核苷酸，且其中該反義股包括位置20與21之間及位置21與22之間的硫代磷酸酯鍵，其中位置自5'至3'編號位置為1-22。
68. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
反義股包括22個核苷酸，自5’至3’編號；以及
反義股的位置1與2之間、位置2與3之間、及位置3與4之間、位置20與21之間及位置21與22之間提供硫代磷酸酯鍵。
69. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中有義股包括位置1與2之間的硫代磷酸酯鍵，其中位置自5'至3'編號。
70. 如前述實施例之任一者之RNAi寡核苷酸，其中
該反義股包括22個核苷酸；
每一股的核苷酸係由5’至3’編號；
有義股的位置1與2之間以及反義股的位置1與2之間、位置2與3之間、及位置3與4之間、位置20與21之間及位置21與22之間提供硫代磷酸酯鍵。
71. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股之5′-核苷酸之糖之4'-碳包括磷酸酯類似物。
72. 如實施例71之RNAi寡核苷酸，其中該磷酸酯類似物為氧甲基磷酸酯、乙烯基磷酸酯或丙二醯基磷酸酯，視情況其中該磷酸酯類似物為包括有4'-氧甲基膦酸酯之4’-磷酸酯類似物。
73. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中反義股的5’端核苷酸包括如化學式1a(Me磷酸酯-4O-mU)的結構。
74. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸之至少一個核苷酸與一或多個靶向配體共軛。
75. 如實施例74所述之RNAi寡核苷酸，其中每一靶向配體包括醣類、胺基醣、膽固醇或多肽。
76. 如實施例13-75中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該莖環包括與該莖環之一或多個核苷酸共軛之一或多個靶向配體。
77. 如實施例74-76中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該一或多個靶向配體與該環之一或多個核苷酸共軛。
78. 如實施例13-77中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該環(Lp)包括自5'至3'編號為1-4之4個核苷酸，其中在位置2、3及4處之核苷酸各自包括一或多個靶向配體，其中該等靶向配體相同或不同。
79. 如實施例74-78中任一者之RNAi寡核苷酸，其中各靶向配體包括N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分。
80. 如實施例79之RNAi寡核苷酸，其中該GalNAc部分為單價GalNAc部分、二價GalNAc部分、三價GalNAc部分或四價GalNAc部分。
81. 如實施例79-80中任一者之RNAi寡核苷酸，其中GalNAc部分為單價GalNAc部分。
82. 如實施例13-81中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該莖-環之Lp之至多4個核苷酸各自與單價GalNAc部分共軛。
83. 如實施例13-82中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該Lp環之長度為4個核苷酸，自5’至3’編號為1-4，其中在位置2、3及4的該Lp環核苷酸各自與單價的N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）部分共軛。
84. 如實施例13-82中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該Lp環之長度為4個核苷酸，且其中該Lp環從5’至3’的第二、第三及第四核苷酸係各自與單價的N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）部分共軛。
85. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，互補區與mRNA標靶序列完全互補。
86. 如實施例1-84中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該互補區與mRNA標靶序列部分互補。
87. 如實施例1-84及86中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該互補區包括與mRNA標靶序列不超過四個錯配。
88. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該互補區與在該反義股之核苷酸位置2-8處之該
TMPRSS6mRNA標靶序列完全互補，其中核苷酸位置係自5’至3’編號。
89. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該互補區與在該反義股之核苷酸位置2-11處之該
TMPRSS6mRNA標靶序列完全互補，其中核苷酸位置係自5’至3’編號。
90. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中
TMPRSS6mRNA標靶序列如SEQ ID NO: 844中所示。
91. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 184中所示之核苷酸序列，且視情況該有義股包括如SEQ ID NO: 844中所示之核苷酸序列。
92. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括SEQ ID NO: 579-580、585-587、590及595-597中之任一者之核苷酸序列。
93. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括選自SEQ ID NO: 579-580、585-587、590及595-597之核苷酸序列。
94. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括SEQ ID NO: 600-601、606-608、611及616-618中之任一者之核苷酸序列。
95. 如前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括選自SEQ ID NO: 600-601、606-608、611及616-618之核苷酸序列。
96. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股及該反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
a) 分別為SEQ ID NO: 579和600；
b) 分別為SEQ ID NO: 580和601；
c) 分別為SEQ ID NO: 595和616；
d) 分別為SEQ ID NO: 590和611；
e) 分別為SEQ ID NO: 596和617；
f) 分別為SEQ ID NO: 597和618；
g) 分別為SEQ ID NO: 585和606；
h) 分別為SEQ ID NO: 586和607；及，
i) 分別為SEQ ID NO: 587和608。
97. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股及該反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
a) 分別為SEQ ID NO: 579和600；
b) 分別為SEQ ID NO: 580和601；
c) 分別為SEQ ID NO: 590和611；
d) 分別為SEQ ID NO: 597和618；及，
e) 分別為SEQ ID NO: 586和607。
98. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 600中所示之核苷酸序列，且視情況其中該有義股包括如SEQ ID NO: 579中所示之核苷酸序列。
99. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 579中所示之核苷酸序列，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 600中所示之核苷酸序列。
100. 如實施例1-97中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 580中所示之核苷酸序列，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 601中所示之核苷酸序列。
101. 如實施例1-97中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 590中所示之核苷酸序列，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 611中所示之核苷酸序列。
102. 如實施例1-97中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 597中所示之核苷酸序列，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 618中所示之核苷酸序列。
103. 如實施例1-97中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 586中所示之核苷酸序列，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 607中所示之核苷酸序列。
104. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該反義股之長度為22個核苷酸。
105. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股之長度為36個核苷酸。
106. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股及該反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
a) 分別為SEQ ID NO: 621和642；
b) 分別為SEQ ID NO: 622和643；
c) 分別為SEQ ID NO: 637和658；
d) 分別為SEQ ID NO: 632和653；
e) 分別為SEQ ID NO: 638和659；
f) 分別為SEQ ID NO: 639和660；
g) 分別為SEQ ID NO: 627和648；
h) 分別為SEQ ID NO: 628和649；及，
i) 分別為SEQ ID NO: 629和650。
107. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股及該反義股包括選自由以下組成之群的核苷酸序列：
a) 分別為SEQ ID NO: 621和642；
b) 分別為SEQ ID NO: 622和643；
c) 分別為SEQ ID NO: 632和653；
d) 分別為SEQ ID NO: 639和660；及，
e) 分別為SEQ ID NO: 628和649。
108. 如前述實施例中任一者所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 621中所示之核苷酸序列，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 642中所示之核苷酸序列。
109. 如實施例1-107中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 642中所示之核苷酸序列，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 621中所示之核苷酸序列。
110. 如實施例1-107中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 622中所示之核苷酸序列，其中該反義股包含如SEQ ID NO: 643中所示之核苷酸序列。
111. 如實施例1-107中任一項者RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 632中所示之核苷酸序列，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 653中所示之核苷酸序列。
112. 如實施例1-107中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 639中所示之核苷酸序列，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 660中所示之核苷酸序列。
113. 如實施例1-107中任一者之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 628中所示之核苷酸序列，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 649中所示之核苷酸序列。
114. 一種用於降低跨膜絲胺酸蛋白酶6 (
TMPRSS6)表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股形成的雙螺旋區域，其中
反義股包括22個核苷酸且包括如SEQ ID NO: 600中所示之核苷酸序列，以及有義股包括36個核苷酸且包括如SEQ ID NO: 579中所示之核苷酸序列，每股的核苷酸在以5'至3'的方式進行編號；
有義股之全部位置1-7、12-27及31-36及反義股之全部位置1、6、8、9、11-13及15-22包括2’-O-甲基(2'-OMe)修飾，且有義股之全部位置8-11及反義股之全部位置2、3、4、5、7、10及14包括2’-氟(2'-F)修飾；
有義股的位置1與2之間以及反義股的位置1與2之間、位置2與3之間、及位置3與4之間、位置20與21之間及位置21與22之間提供硫代磷酸酯鍵；
該有義股接近3'端包括如為S1-Lp-S2所示之莖-環，S1與S2互補，且其中Lp在S1與S2之間形成長度為4個核苷酸之環，且其中該Lp環從5’至3’的第二、第三及第四核苷酸係各與與單價的N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）部分共軛；及
該反義股之5'-端核苷酸包括如化學式1a (Me磷酸酯-4O-mU)結構：
。
115. 根據實施例114所述的RNAi寡核苷酸，其中反義股包括一個或多個嘌呤核苷酸長度的3’突出端，且視情況該3’突出端為5’-GG-3’。
116. 根據實施例114-115任一者所述的RNAi寡核苷酸，其中該Lp環與單價的N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）部分共軛，每一者包括如化學式5a的結構：
。
117. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中該有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mGs][mG][mU][mG][mC][mU][mA][fC][fU][fC][fU][mG][mG][mU][mA][mU][mU][mU][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 621)，及其中該反義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[Me磷酸酯-4O-mUs][fGs][fAs][fA][fA][mU][fA][mC][mC][fA][mG][mA][mG][fU][mA][mG][mC][mA][mC][mCs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 642)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核醣核苷；fA、fC、fG、fU = 2'F核醣核苷；s =硫代磷酸酯，以及其中ademA-GalNAc =
。
(化學式5)
118. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中
有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mGs][mG][mU][mG][mC][mU][mA][fC][fU][fC][fU][mG][mG][mU][mA][mU][mU][mU][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 621)；
反義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[Me磷酸酯-4O-mUs][fGs][fAs][fA][fA][mU][fA][mC][mC][fA][mG][mA][mG][fU][mA][mG][mC][mA][mC][mCs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 642)；
mC、mA、mG、mU表示2'-O-甲基（2'-OMe）修飾的核苷酸；
fA、fC、fG、fU表示2’-氟(2'-F)修飾的核苷酸；
s表示硫代磷酸酯的核苷酸間鍵；及
ademA-GalNAc包括如化學式5a的結構：
。
119. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中
有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mGs][mG][mU][mG][mC][mU][mA][fC][fU][fC][fU][mG][mG][mU][mA][mU][mU][mU][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 621)；
反義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[Me磷酸酯-4O-mUs][fGs][fAs][fA][fA][mU][fA][mC][mC][fA][mG][mA][mG][fU][mA][mG][mC][mA][mC][mCs][mGs][mG]-3’ (SEQ ID NO: 642)；
mC、mA、mG、mU表示2'-O-甲基（2'-OMe）修飾的核苷酸；
fA、fC、fG、fU表示2’-氟(2'-F)修飾的核苷酸；
s表示硫代磷酸酯的核苷酸間鍵；
ademA-GalNAc包括如化學式5a的結構：
；及
Me磷酸酯-4O-mU包括如化學式1a的結構：
。
120. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中該有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mGs][mC][mU][mA][mC][mU][mC][fU][fG][fG][fU][mA][mU][mU][mU][mC][mC][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 622)，且其中反義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[Me磷酸酯-4O-mUs][fUs][fAs][fG][fG][mA][fA][mA][mU][fA][mC][mC][mA][fG][mA][mG][mU][mA][mG][mCs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 643)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA, fC, fG, fU = 2'-F核醣核苷；s =硫代磷酸酯，且其中ademA-GalNAc =
。
(化學式5)
121. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中
有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mGs][mC][mU][mA][mC][mU][mC][fU][fG][fG][fU][mA][mU][mU][mU][mC][mC][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 622)；
反義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[Me磷酸酯-4O-mUs][fUs][fAs][fG][fG][mA][fA][mA][mU][fA][mC][mC][mA][fG][mA][mG][mU][mA][mG][mCs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 643)
mC、mA、mG、mU表示2'-O-甲基（2'-OMe）修飾的核苷酸；
fA、fC、fG、fU表示2’-氟(2'-F)修飾的核苷酸；
s表示硫代磷酸酯的核苷酸間鍵；及
ademA-GalNAc包括如化學式5a的結構：
。
122. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中該有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mCs][mU][mC][mA][mC][mC][mU][fG][fC][fU][fU][mC][mU][mU][mC][mU][mG][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 632)，且其中反義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[Me磷酸酯-4O-mUs][fAs][fCs][fC][fA][mG][fA][mA][mG][fA][mA][mG][mC][fA][mG][mG][mU][mG][mA][mGs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 653)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核醣核苷；fA、fC、fG、fU = 2'F核醣核苷；s =硫代磷酸酯，且其中ademA-GalNAc =
。
(化學式5)
123. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中
有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mCs][mU][mC][mA][mC][mC][mU][fG][fC][fU][fU][mC][mU][mU][mC][mU][mG][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 632)；
反義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[Me磷酸酯-4O-mUs][fAs][fCs][fC][fA][mG][fA][mA][mG][fA][mA][mG][mC][fA][mG][mG][mU][mG][mA][mGs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 653)；
mC、mA、mG、mU表示2'-O-甲基（2'-OMe）修飾的核苷酸；
fA、fC、fG、fU表示2’-氟(2'-F)修飾的核苷酸；
s表示硫代磷酸酯的核苷酸間鍵；及
ademA-GalNAc包括如化學式5a的結構：
。
124. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中該有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mAs][mG][mU][mG][mU][mG][mA][fA][fA][fG][fA][mC][mA][mU][mA][mG][mC][mU][mG][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 639)，且其中反義股包括下列序列以及全部修飾：5′- [Me磷酸酯-4O-mUs][fCs][fAs][fG][fC][mU][fA][mU][mG][fU][mC][mU][mU][fU][mC][mA][mC][mA][mC][mUs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 660)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核醣核苷；fA、fC、fG、fU = 2'F核醣核苷；s =硫代磷酸酯，且其中ademA-GalNAc =
。
(化學式5)
125. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中
有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mAs][mG][mU][mG][mU][mG][mA][fA][fA][fG][fA][mC][mA][mU][mA][mG][mC][mU][mG][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 639)；
反義股包括下列序列以及全部修飾：5′- [Me磷酸酯-4O-mUs][fCs][fAs][fG][fC][mU][fA][mU][mG][fU][mC][mU][mU][fU][mC][mA][mC][mA][mC][mUs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 660)；
mC、mA、mG、mU表示2'-O-甲基（2'-OMe）修飾的核苷酸；
fA、fC、fG、fU表示2’-氟(2'-F)修飾的核苷酸；
s表示硫代磷酸酯的核苷酸間鍵；及
ademA-GalNAc包括如化學式5a的結構：
。
126. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mGs][mG][mG][mU][mG][mC][mA][fC][fU][fA][fU][mG][mG][mC][mU][mU][mG][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 628)，且其中反義股包括下列序列以及全部修飾：5′- [Me磷酸酯-4O-mUs][fUs][fAs][fC][fA][mA][fG][mC][mC][fA][mU][mA][mG][fU][mG][mC][mA][mC][mC][mCs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 649)，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'-F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，且其中ademA-GalNAc =
。
(化學式5)
127. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中
有義股包括下列序列以及全部修飾：5′-[mGs][mG][mG][mU][mG][mC][mA][fC][fU][fA][fU][mG][mG][mC][mU][mU][mG][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3’ (SEQ ID NO: 628)；
反義股包括下列序列以及全部修飾：5′- [Me磷酸酯-4O-mUs][fUs][fAs][fC][fA][mA][fG][mC][mC][fA][mU][mA][mG][fU][mG][mC][mA][mC][mC][mCs][mGs][mG]-3′ (SEQ ID NO: 649)；
mC、mA、mG、mU表示2'-O-甲基（2'-OMe）修飾的核苷酸；
fA、fC、fG、fU表示2’-氟(2'-F)修飾的核苷酸；
s表示硫代磷酸酯的核苷酸間鍵；及
ademA-GalNAc包括如化學式5a的結構：
。
128. 根據實施例116-127任一者所述的RNAi寡核苷酸，其中Me磷酸酯-4O-mUs包括根據化學式 1的結構：
。
129. 根據實施例116-127任一者所述的RNAi寡核苷酸，其中Me磷酸酯-4O-mU包括如化學式1a的結構：
。
130. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中有義股包括SEQ ID NO: 621以及反義股包括SEQ ID NO: 642，其中該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中寡核苷酸係以具有如圖10A-B所示結構的共軛形式存在。
131. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中有義股包括SEQ ID NO: 621以及反義股包括SEQ ID NO: 642，其中該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中寡核苷酸係以具有如圖14A所示結構的共軛形式存在。
132. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中有義股包括SEQ ID NO: 632以及反義股包括SEQ ID NO: 653，其中該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中寡核苷酸係以具有如圖11A-B所示結構的共軛形式存在。
133. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中有義股包括SEQ ID NO: 632以及反義股包括SEQ ID NO: 653，其中該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中寡核苷酸係以具有如圖14B所示結構的共軛形式存在。
134. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中有義股包括SEQ ID NO: 639以及反義股包括SEQ ID NO: 660，其中該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中寡核苷酸係以具有如圖12A-B所示結構的共軛形式存在。
135. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中有義股包括SEQ ID NO: 639以及反義股包括SEQ ID NO: 660，其中該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中寡核苷酸係以具有如圖14C所示結構的共軛形式存在。
136. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中有義股包括SEQ ID NO: 628以及反義股包括SEQ ID NO: 649，其中該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中寡核苷酸係以具有如圖13A-B所示結構的共軛形式存在。
137. 一種用於降低
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中有義股包括SEQ ID NO: 628以及反義股包括SEQ ID NO: 649，其中該反義股包括與TMPRSS6 RNA轉錄體互補區，且其中寡核苷酸係以具有如圖14D所示結構的共軛形式存在。
138. 一種醫藥組合物，其包括前述實施例中任一者之RNAi寡核苷酸及醫藥學上可接受之載劑、遞送劑或賦形劑。
139. 一種用於治療患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀之個體之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如前述實施例1-137中任一項之RNAi寡核苷酸或如實施例138之醫藥組合物，從而治療該個體。
140. 如實施例139之方法，其中投與RNAi寡核苷酸後，(i)增加鐵調素表現；(ii)降低血清鐵含量；(iii)降低血清鐵飽和度；或(iv) (i)-(iii)的任意組合。
141. 一種將寡核苷酸遞送至個體之方法，該方法包括向該個體投予如實施例138之醫藥組合物。
142. 一種用於降低細胞、細胞群或個體中的
TMPRSS6表現的方法，該方法包括以下步驟：
i) 使該細胞或該細胞群體與如實施例1-137中任一者之RNAi寡核苷酸或如實施例138之醫藥組合物接觸；或
ii) 向該個體投與如實施例1-137中任一者之RNAi寡核苷酸或如實施例138之醫藥組合物。
143. 如實施例142所述之方法，其中降低
TMPRSS6表現包括降低
TMPRSS6mRNA的量或水平、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(matriptase-2)的量或水平或兩者皆是。
144. 如實施例142或143之方法，其中降低
TMPRSS6表現會導致(i)增加鐵調素生成；(ii)降低血清鐵飽和度；(iii)降低血清鐵；或(iv) (i)-(iii)的任意組合。
145. 如實施例142-144中任一者之方法，其中該個體患有與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀。
146. 如實施例139-140及145中任一者之方法，其中該與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀為血色素沉著症或β地中海貧血。
147. 如實施例139-140及145中任一者之方法，其中該與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀為β地中海貧血。
148. 如實施例139-140及145中任一者之方法，其中該與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀為真性紅血球增多症。
149. 如實施例139-148中任一者之方法，其中該RNAi寡核苷酸或該醫藥組合物係與第二組合物或治療劑組合投與。
150. 一種如實施例1-137中任一者所述之RNAi寡核苷酸或如實施例138所述之醫藥組合物，其係用作在製造治療與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀的藥物，視情況為治療血色素沉著症(例如，遺傳性血色素沉著症)、真性紅血球增多症或β地中海貧血。
151. 如實施例1-137任一者所述的RNAi寡核苷酸，或如實施例138所述之醫藥組成物，其係用作藥物。
152. 如實施例1-137任一者所述的RNAi寡核苷酸，或如實施例138所述之醫藥組成物，其係用作藥物。
153. 如實施例1-137任一者所述的RNAi寡核苷酸，或如實施例138所述之醫藥組成物，其係用作治療或適用於治療與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀，視情況為治療血色素沉著症(例如，遺傳性血色素沉著症)、真性紅血球增多症或β地中海貧血。
154. 如實施例1-137任一者所述的RNAi寡核苷酸，或如實施例138所述之醫藥組成物，其係用作治療血色素沉著症(例如，遺傳性血色素沉著症)。
155. 如實施例1-137任一者所述的RNAi寡核苷酸，或如實施例138所述之醫藥組成物，其係用作治療真性紅血球增多症。
156. 如實施例1-137任一者所述的RNAi寡核苷酸，或如實施例138所述之醫藥組成物，其係用作治療β地中海貧血。
157. 如實施例1-137任一者所述的RNAi寡核苷酸，或如實施例138所述之醫藥組成物，其係用作治療血色素沉著症(例如，遺傳性血色素沉著症)或β地中海貧血。
158. 一種套組，其包括如實施例1-137中任一項之RNAi寡核苷酸、視情況選用之醫藥學上可接受之載劑及藥品仿單，該藥品仿單包括用於向患有與鐵調素缺乏或抑制相關之病症、疾病或病狀的個體投與的說明書。
159. 一種套組，其包括如實施例1-137中任一者所述之RNAi寡核苷酸、或實施例138的醫藥組成物、及藥品仿單，該藥品仿單包括用於向患有與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或症狀的個體投與的說明書。
160. 如實施例150之用途、如實施例151-157任一者之RNAi寡核苷酸或醫藥組成物之用途或適用用途、或如實施例158-159中任一者之套組，其中與鐵調素缺乏或抑制相關的疾病、病症或病狀為血色素沉著症(例如，遺傳性血色素沉著症)、真性紅血球增多症或β地中海貧血。
實例 實例 1 ： RNAi 寡核苷酸之製備 寡核苷酸合成及純化
前述實例中所描述的寡核苷酸(RNAi寡核苷酸)是使用本文描述的方法進行化學合成的。一般而言，除使用已知的胺基亞磷酸酯合成(參見例如Hughes及Ellington (2017) Cold Spring Harb Perspect Biol. 9(1):a023812；Beaucage S.L., Caruthers M.H. Studies on Nucleotide Chemistry V: Deoxynucleoside Phosphoramidites-A New Class of Key Intermediates for Deoxypolynucleotide Synthesis. Tetrahedron Lett. 1981;22:1859–62. 數位物件識別碼：10.1016/S0040-4039(01)90461-7)以外，使用如對於19-23聚體siRNA所描述之固相寡核苷酸合成方法合成dsRNAi寡核苷酸(參見例如Scaringe等人(1990) Nucleic Acids Res. 18:5433-5441，及Usman等人(1987) J. Am. Chem. Soc. 109:7845-45；亦參見美國專利第5,804,683號、第5,831,071號、第5,998,203號、第6,008,400號、第6,111,086號、第6,117,657號、第6,353,098號、第6,362,323號、第6,437,117號及第6,469,158號)。將具有19聚體核心序列之dsRNAi寡核苷酸格式化為具有25聚體有義股及27聚體反義股的構築體以允許藉由RNAi機械設備處理。19聚體核心序列與
TMPRSS6mRNA中之一區域互補。
根據標準方法(Integrated DNA Technologies；Coralville，IA)合成各RNA股並進行HPLC純化。例如，RNA寡核苷酸係使用固相亞磷醯胺化學合成，在NAP-5管柱上進行去保護和脫鹽(Amersham Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ)，使用標準技術(Damha & Olgivie (1993) Methods Mol. Biol. 20:81-114; Wincott等人(1995) Nucleic Acids Res. 23:2677-84)。在Amersham Source 15Q管柱(1.0 cm×25 cm；Amersham Pharmacia Biotech)上使用離子交換高效液相層析(IE-HPLC)，使用15分鐘步長-線性梯度來純化寡聚物。梯度在90:10緩衝液A:B至52:48緩衝液A:B之間變化，其中緩衝液A為100 mM Tris pH 8.5，且緩衝液B為100 mM Tris pH 8.5，1 M NaCl。在260 nm處監測樣本並收集對應於全長寡核苷酸種類的尖峰、匯集、在NAP-5管柱上脫鹽，並凍乾。
在Beckman PACE 5000(Beckman Coulter, Inc.; Fullerton, CA)上藉由毛細管電泳(CE)測定每一寡聚物的純度。CE毛細管具有100 μm內徑且含有ssDNA 100R Gel (Beckman-Coulter)。通常，將約0.6 nmole寡核苷酸注射至毛細管中，在444 V/cm之電場中運行，且藉由在260 nm下之UV吸光度偵測。變性Tris-硼酸-7 M-尿素電泳緩衝液係購自Beckman-Coulter。獲得如藉由CE評定至少90%純之寡核糖核苷酸，用於下文描述之實驗。依據製造商建議的流程，在Voyager DE™生物光譜工作站(Applied Biosystems; Foster City, CA)上，經基質輔助雷射脫附飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀驗證識別化合物。獲得所有寡聚物之相對分子質量，通常在預期分子量之0.2%內。
雙螺旋之製備
將單股RNA寡聚物再懸浮(例如以100 μM濃度)於由100 mM乙酸鉀、30 mM HEPES組成之具有pH 7.5之雙螺旋緩衝液中。將互補有義股及反義股以等莫耳量混合以得到例如50 μM雙螺旋之最終溶液。將樣品在RNA緩衝液(IDT)中加熱至100℃持續5分鐘，且使其在使用之前冷卻至室溫。RNAi寡核苷酸儲存在−20° C。單股RNA寡聚物以凍乾儲存或在−80° C之無核酸酶的水中儲存。
實例 2 ：生成靶向 TMPRSS6 的 GalNAc 共軛的 RNAi 寡核苷酸
跨膜絲胺酸蛋白酶6 (TMPRSS6)係發現位於細胞表面的第二型跨膜絲胺酸蛋白酶。蛋白質在訊號路徑中與鐵調素一起發揮功用調節體內鐵平衡。
辨識 TMPRSS6 mRNA 標靶序列
為了產生
TMPRSS6RNAi寡核苷酸，使用基於電腦演算法以電腦化識別
TMPRSS6mRNA標靶序列，該標靶序列適用於測定RNAi途徑對
TMPRSS6表現的抑制。該演算法提供RNAi寡核苷酸引導(反義)股序列，其各自具有人類(Hs)或小鼠(Mm) mRNA (例如分別為SEQ ID NO: 853及854；表1)之合適的
TMPRSS6mRNA標靶序列的互補區。由於序列在不同物種間具有保守性，一些識別人類
TMPRSS6mRNA的
TMPRSS6標靶序列與相應的小鼠（Mm）
TMPRSS6mRNA（SEQ ID NO: 854；表1）的標靶序列及/或食蟹獼猴（Mf）TMPRSS6 mRNA（SEQ ID NO: 855；表1）的標靶序列具有同源性。包括有具有核苷酸序列相似性之同源
TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區的
TMPRSS6RNAi寡核苷酸被預測具有靶向同源
TMPRSS6mRNA (例如人類
TMPRSS6 mRNA及猴子
TMPRSS6mRNA)的能力。
表 1.示例性人類
TMPRSS6、猴子
TMPRSS6、及小鼠
TMPRSS6 mRNA序列
| 物種 | GenBank 參考序列 # | SEQ ID NO |
| 人類(Hs) | NM_001289000.2 | 853 |
| 小鼠(Mm) | NM_001355601.1 | 854 |
| 石蟹獼猴(Mf) | XM_005567384.2 | 855 |
具體來說，如實例1中描述所合成的寡核苷酸用於產生包括有帶切口的四環GalNAc共軛結構的雙股RNAi寡核苷酸(在本文中稱為「GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸」或「GalNAc-
TMPRSS6寡核苷酸」)，其具有36聚體隨從股及22聚體引導股。此外，包括有隨從股及引導股之核苷酸序列具有獨特的經修飾之核苷酸及硫代磷酸酯鍵之模式。包括有四環之核苷酸中之三者各自與GalNAc部分(CAS號14131-60-3)共軛。各股之修飾模式在下文說明：
有義股： 5’-[mXs][mX][mX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][fX][mX][mX][mX][mX] [mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][ademX-GalNAc][ademX-GalNAc][ademX-GalNAc][mX][mX][mX][mX][mX][mX]- 3’
雜交於：
反義股：5’-[Me磷酸酯-4O-mXs][fXs][fXs][fX][fX][mX][fX][mX][mX] [fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][mX][mX][mXs][mXs][mX]- 3’
表 2.修飾關鍵
據理解，上述修飾模式及修飾關鍵中的[X]係指核鹼基。
基於體外細胞的測定法
| 符號 | 修飾 / 鍵 |
| [Me磷酸酯-4O-mXs] | 與相鄰核苷酸具有硫代磷酸酯鍵之4’-O-單甲基磷酸酯-2’-O-甲基修飾之核苷酸 |
| [ademX-GalNAc] | 與核苷酸附接之GalNAc |
| [mXs] | 與相鄰核苷酸具有硫代磷酸酯鍵之2’- O-甲基修飾之核苷酸 |
| [fXs] | 與相鄰核苷酸具有硫代磷酸酯鍵之2’-氟修飾之核苷酸 |
| [mX] | 與相鄰核苷酸具有磷酸二酯鍵之2’- O-甲基修飾之核苷酸 |
| [fX] | 與相鄰核苷酸具有磷酸二酯鍵之2’-氟修飾之核苷酸 |
使用基於活體外细胞測定法，量測GalNAc共軛的TMPRSS6寡核苷酸降低
TMPRSS6mRNA的能力。簡而言之，在多孔細胞培養板的不同孔中以1 nM的濃度將GalNAc共軛的TMPRSS6寡核苷酸轉染至表現內源性人類
TMPRSS6基因的人類Hep3B細胞。在用經修飾之GalNAc共軛TMPRSS6寡核苷酸轉染之後保持細胞24小時，且接著使用基於TAQMAN®之qPCR分析測定來自經轉染細胞之剩餘
TMPRSS6mRNA的量。使用兩個qPCR測定方法，即3'測定和5'測定，使用與PCR探針共軛的6-羧基螢光素（FAM）來測定
TMPRSS6mRNA含量。此等測定法在下方表3中識別。測定引子對以得到剩餘mRNA的百分比(%)。
表 3.qPCR測定法
| 3’ 測定法 | 正向-1652 (F1652) | AGCCTGATTGTCTCAACGG | SEQ ID NO: 857 |
| 逆向-1725 | CTGGAAGGTGAATGTCCCAC | SEQ ID NO: 858 | |
| 探針-1676 | ACGAAGAGCAGTGCCAGGAAGG | SEQ ID NO: 859 | |
| 5’ 測定法 | 正向-394 (F394) | GTACTCAATCGCCACTTCTCC | SEQ ID NO: 860 |
| 逆向-539 | GAATAGACGGAGCTGGAGTTG | SEQ ID NO: 861 | |
| 探針-450 | CAGTGAAACCGCCAAAGCCCAG | SEQ ID NO: 862 |
結果表明針對
TMPRSS6mRNA設計的GalNAc共軛的TMPRSS6寡核苷酸抑制細胞中
TMPRSS6表現，這是相比於對照細胞，轉染了GalNAc共軛的TMPRSS6寡核苷酸的細胞中
TMPRSS6mRNA的量降低來確定的，結果還表明，包括有GalXC共軛的寡核苷酸的核苷酸序列對於生成抑制
TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸是有用的。
實例 3 ： GalNAc 共軛的 TMPRSS6 RNAi 寡核苷酸於體內抑制人類及小鼠 TMPRSS6 表現
為了評估RNAi寡核苷酸在
體內降低
TMPRSS6表現的能力，使用了HDI小鼠模型。
評估示於表4中的九個GalNAc共軛的TMPRSS6寡核苷酸。所選寡核苷酸基於在實例2中篩選用於生成抑制
TMPRSS6表現之RNAi寡核苷酸的核苷酸序列。
在經工程改造以在小鼠肝之肝細胞中短暫表現人類
TMPRSS6mRNA之小鼠中評估寡核苷酸。簡而言之，將6-8週齡雌性CD-1小鼠(n = 5)皮下投與在PBS中調配濃度為1 mg/kg或2 mg/kg之所指示的GalNAc-共軛
TMPRSS6寡核苷酸。向對照組小鼠(n = 5隻)僅投與PBS。三天後(72小時)，在普遍存在的巨細胞病毒(CMV)啟動子序列的控制下，以25 µg之編碼開放閱讀框架(ORF)人類
TMPRSS6基因(含有NM_153609之pCMV6_TMPRSS6 (Cat #: SC306623, Origene))的DNA質體對小鼠進行流體動力學注射(HDI)。在引入DNA質體一天之後，自HDI小鼠收集肝樣品。衍生自這些HDI小鼠的總RNA經受qRT-PCR分析以確定
TMPRSS6mRNA含量。具體而言，從肝臟組織中提取RNA，利用qPCR（相對於neoR基因進行標準化）測定人類及內源性小鼠的
TMPRSS6mRNA含量。使用5’及3’ PrimeTime™ qPCR Probe Assay（IDT）測定人類
TMPRSS6mRNA的含量，該測試由引子對和特定於人類
TMPRSS6mRNA的之螢光標記探針組成。同樣地，測量了小鼠
TMPRSS6的含量。使用2
-ΔΔCt(“Δ-Δ Ct”)方法(Livak及Schmittgen (2001) Methods 25:402–408)確定自治療的小鼠的樣本中剩餘的人類及內源性小鼠鐵調素之
TMPRSS6mRNA百分比。使用包含在DNA質體中的NeoR基因，針對轉染效率將該等值標準化。
表 4.用於HDI篩選之GalNAc-共軛人類
TMPRSS6RNAi寡核苷酸
| 物種目標 | 未經修飾之有義股 (SEQ ID NO) | 未經修飾之反義股 (SEQ ID NO) | 經修飾之有義股 (SEQ ID NO) | 經修飾之反義股 (SEQ ID NO) | |
| TMPRSS6-416 | Hs/Mf | 579 | 600 | 621 | 642 |
| TMPRSS6-0419 | Hs/Mf | 580 | 601 | 622 | 643 |
| TMPRSS6-0615 | Hs/Mf | 595 | 616 | 637 | 658 |
| TMPRSS6-0651 | Hs/Mf/Mm | 590 | 611 | 632 | 653 |
| TMPRSS6-0654 | Hs/Mf | 596 | 617 | 638 | 659 |
| TMPRSS6-0831 | Hs/Mf | 597 | 618 | 639 | 660 |
| TMPRSS6-1375 | Hs/Mf | 585 | 606 | 627 | 648 |
| TMPRSS6-1546 | Hs/Mf | 586 | 607 | 628 | 649 |
| TMPRSS6-1550 | Hs/Mf | 587 | 608 | 629 | 650 |
如圖1A及1B之5'和3' qPCR測定法以及表5中所示，每個寡核苷酸在2 mg/kg下降低TMPRSS6表現至少50%。TMPRSS6-0416、-0831和-1546是最有潛力的寡核苷酸，且在較低的1 mg/kg濃度下將TMPRSS6表現降低超過50%。此數據表明，GalNAc修飾的寡核苷酸成功地在體內降低了人類
TMPRSS6的表現。
表 5.自圖1A及1B總結5’和3’測定法
| Hs TMPRSS6-5'/F394 | Hs TMPRSS6-3'/F1652 | |||||||
| 1 mg/kg | 2 mg/kg | 1 mg/kg | 2 mg/kg | |||||
| 構築 | 剩餘百分比 | SEM | 剩餘百分比 | SEM | 剩餘百分比 | SEM | 剩餘百分比 | SEM |
| TMPRSS6-416 | 36.1 | 5.7 | 19.7 | 3.6 | 34.9 | 5.0 | 18.9 | 3.6 |
| TMPRSS6-0419 | 44.0 | 5.5 | 19.0 | 3.0 | 46.6 | 7.2 | 22.0 | 2.5 |
| TMPRSS6-0615 | 51.7 | 3.5 | 20.5 | 3.4 | 53.4 | 3.8 | 23.0 | 4.1 |
| TMPRSS6-0651 | 46.0 | 4.0 | 31.7 | 3.5 | 53.9 | 5.3 | 31.5 | 3.7 |
| TMPRSS6-0654 | 53.1 | 8.5 | 32.0 | 4.7 | 59.4 | 8.7 | 31.2 | 8.2 |
| TMPRSS6-0831 | 33.8 | 2.7 | 29.1 | 4.5 | 33.4 | 1.8 | 34.5 | 5.0 |
| TMPRSS6-1375 | 61.9 | 4.2 | 46.0 | 6.1 | 61.2 | 3.3 | 46.8 | 3.2 |
| TMPRSS6-1546 | 26.4 | 1.5 | 26.1 | 3.9 | 30.6 | 1.7 | 23.5 | 4.1 |
| TMPRSS6-1550 | 35.0 | 10.7 | 40.8 | 5.7 | 34.2 | 9.2 | 39.0 | 4.9 |
如圖2所示，除了人類
TMPRSS6之外對小鼠
TMPRSS6具有特異性之GalNAc共軛的
TMPRSS6RNAi寡核苷酸
TMPRSS6-0651，在2 mg/kg下將內源性小鼠
TMPRSS6表現降低至少50%。此數據表明，GalNAc修飾的寡核苷酸成功地在體內降低了小鼠
TMPRSS6的表現。
實例 4 ： GalNAc 共軛的 TMPRSS6 RNAi 寡核苷酸於體內抑制猴子 TMPRSS6 表現
為評估RNAi寡核苷酸於體內降低
TMPRSS6表現的能力，使用猴模型(食蟹獼猴)。
評估表6中及圖3A-3D中所顯示的四種經修飾的GalNAc共軛
TMPRSS6寡核苷酸。所選的寡核苷酸式基於實例2的篩選及實例3的結果。簡而言之，食蟹獼猴通常於本文中稱為猴子，在第0、28、56、84及112天經皮下投與在PBS中調配濃度為1 mg/kg或4 mg/kg之所指示的GalNAc-共軛
TMPRSS6寡核苷酸。向對照組猴子(n = 5隻)僅投與PBS。衍生自這些猴子的總RNA經受qRT-PCR分析以確定
TMPRSS6mRNA含量。具體而言，從肝臟組織中提取RNA，利用qPCR（相對於B2M基因進行標準化）在第-7、28、56、84、112和168天測定猴子的
TMPRSS6mRNA含量。使用PrimeTime™ qPCR Probe Assay（IDT）測定猴子
TMPRSS6mRNA的含量，該測試由引子對和特定於猴子
TMPRSS6mRNA的之螢光標記探針組成。使用2
-ΔΔCt(“Δ-Δ Ct”)方法(Livak and Schmittgen (2001) Methods 25:402–408)確定自治療的猴子的樣本中剩餘的猴子
TMPRSS6mRNA百分比。
表 6.用於NHP篩選之GalNAc共軛的猴子
TMPRSS6RNAi寡核苷酸
| 物種目標 | 未經修飾之有義股 (SEQ ID NO) | 未經修飾之反義股 (SEQ ID NO) | 經修飾之有義股 (SEQ ID NO) | 經修飾之反義股 (SEQ ID NO) | |
| TMPRSS6-416 | Hs/Mf | 579 | 600 | 621 | 642 |
| TMPRSS6-0651 | Hs/Mf/Mm | 590 | 611 | 632 | 653 |
| TMPRSS6-0831 | Hs/Mf | 597 | 618 | 639 | 660 |
| TMPRSS6-1546 | Hs/Mf | 586 | 607 | 628 | 649 |
如圖4A-4F所示，在整個研究過程中(即至第168天)，每種寡核苷酸在1 mg/kg和4 mg/kg下，分別對應於每個樣本在天數為-7、28、56、84、112和168天時，每個寡核苷酸將
TMPRSS6表現降低至少50%。此數據表明GalNAc修飾的寡核苷酸成功地在
體內降低猴子
TMPRSS6的表現
。 實例 5 ： GalNAc 共軛的 TMPRSS6 RNAi 寡核苷酸於體內調節鐵平衡
TMPRSS6的功能缺失突變導致鐵調素血漿水平升高，且導致嚴重病症，包含鐵難治性、缺鐵性貧血。鐵調素蛋白質是鐵平衡的調節子且使鐵直接進入循環。當鐵調素水平高時，血清鐵含量降低可導致貧血。當鐵調素含量低時，在諸如血色素沉著症疾病狀態下，可發生鐵含量升高及過載。已知
TMPRSS6抑制鐵調素的表現，因此抑制
TMPRSS6可能調節鐵調素的表達，並改變血清鐵含量和飽和度。
評估抑制
TMPRSS6後對鐵平衡的變化，測量了鐵調素、血清鐵和血清鐵飽和度的水平。向如實例4中所描述之食蟹獼猴投與示於表6和描繪於圖3A-3D的四種經修飾的GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸。自這些猴子中提取的總RNA經受qRT-PCR分析，以確定鐵調素mRNA水平。具體而言，從肝臟組織中提取RNA，利用qPCR（相對於B2M基因進行標準化）在第-7、28、56、84、112和168天測定猴子的鐵調素mRNA水平。使用PrimeTime™ qPCR Probe Assay（IDT）測定猴子鐵調素mRNA的含量，該測試由引子對和特定於猴子
TMPRSS6mRNA的之螢光標記探針組成。使用2
-ΔΔCt(“Δ-Δ Ct”)方法(Livak及Schmittgen (2001) Methods 25:402–408)確定自治療的猴子的樣本中剩餘的猴子鐵調素mRNA百分比。
如圖5A-5F所示，分別對應於每個樣本在天數為-7、28、56、84、112和168天時，至第56天(圖5C)，所有寡核苷酸都觀察到鐵調素顯著上調。在整個研究期間直到第168天，觀察到鐵調素上調。此數據表明，GalNAc修飾的寡核苷酸成功地在體內抑制
TMPRSS6並增加了鐵調素的表現。
為了測量血清鐵和血清鐵飽和度，在天數為-7、28、56、84、112和168天時從動物體內採集血清樣本。使用康奈爾獸醫診斷實驗室(Cornell Veterinary Diagnostic Lab)進行的鐵面板分析測量鐵含量。
如圖6A-6F及圖7A-7B所示，在第28天後以及整個168天的研究中，觀察到每個寡核苷酸的血清鐵劑量依賴性降低。類似地，在第28後以及整個168天的研究中，觀察到每個寡核苷酸的血清鐵飽和度劑量依賴性降低，如圖8A-8F和圖9A-9B所示。綜合而言，這些數據顯示用於抑制
TMPRSS6的GalNAc修飾寡核苷酸成功地在
體內降低了血清鐵和血清鐵飽和度。隨後，降低游離鐵可能對於患有鐵過載疾病的患者有益，例如遺傳性血色素沉積症（原發性鐵過載）和β地中海貧血（次發性鐵過載），並且將限制在中觀察到的錯調節和增加真性紅血球增多症中的紅血球生成。
儘管本發明之某些特徵在本文中已說明及描述，但本領域普通技術人員現將聯想到許多修飾、取代、變化及等效物。因此，應當理解，所附申請專利範圍旨在涵蓋落入本發明真正精神之所有此類修飾及改變。
[ 圖 1A及
1B]提供描繪在用GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸治療後，在外源表現人類
TMPRSS6之小鼠肝臟(流體動力學注射模型)中剩餘人類
TMPRSS6mRNA的百分比(%)的圖。以皮下注射方式向CD-1小鼠投藥所指示的在PBS中調配的1 mg/kg或2 mg/kg的GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸。投藥後四天，對小鼠流體動力學注射(HDI)編碼
TMPRSS6之DNA質體。18小時後，使用3' qPCR測定法(
圖 1A)和5' qPCR測定法(
圖 1B)確定所收集的肝臟之人類
TMPRSS6mRNA含量。Hs/Mf=構築為人類及猴子
TMPRSS6特異性的；Hs-Mf-Mm =構築為人類、猴子及小鼠
TMPRSS6特異性的。
[ 圖 2]提供描繪在
圖 1A 至 1B的小鼠肝臟中剩餘小鼠
TMPRSS6mRNA百分比(%)的圖。
[ 圖 3A 至 3D]提供描繪GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸-0416 (
圖 3A)、-0651 (
圖 3B)、-0831 (
圖 3C)及-1546 (
圖 3D)的修飾模式的示意圖。有義股包含36個核苷酸股中第27至30個核苷酸的四環結構。反義股為互補的且包含2-核苷酸突出端。
[ 圖 4A 至 4F]提供描繪在用GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸治療後，在NHP (非人類靈長類)肝臟中剩餘之內源性猴子
TMPRSS6mRNA的百分比(%)的圖。在第0、28、56、84及112天，以皮下注射方式向食蟹猴投藥所指示的在PBS中調配的1 mg/kg或4 mg/kg的GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸。在第7天(投予一星期前) (
圖 4A)；第28天(
圖 4B)；第56天(
圖 4C)；第84天(
圖 4D)；第112天(
圖 4E)；及第168天(
圖 4F)收集肝臟樣品，且使用qPCR測定法確定猴子相對於PBS處理的動物之
TMPRSS6mRNA的水平。
[ 圖 5A 至 5F]提供描繪在用GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸治療後，在NHP (非人類靈長類)肝臟中剩餘之猴子內源性鐵調素mRNA的百分比(%)的圖。在第0、28、56、84及112天，以皮下注射方式向食蟹猴投藥所指示的在PBS中調配的1 mg/kg或4 mg/kg的GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸。在第7天(投予一星期前) (
圖 5A)；第28天(
圖 5B)；第56天(
圖 5C)；第84天(
圖 5D)；第112天(
圖 5E)；及第168天(
圖 5F)收集肝臟樣品，且使用qPCR測定法確定猴子相對於PBS處理的動物之鐵調素mRNA的水平。
[ 圖 6A 至 6F]提供描繪在用GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸治療後，猴子內血清鐵含量的圖。在第0、28、56、84及112天，以皮下注射方式向食蟹猴投藥所指示的在PBS中調配的1 mg/kg或4 mg/kg的GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸。在第7天(投予一星期前)(
圖 6A)；第28天(
圖 6B)；第56天(
圖 6C)；第84天(
圖 6D)；第112天(
圖 6E)；及第168天(
圖 6F)收集血清樣品，且確定血清鐵含量的水平。
[ 圖 7A 至 7B]提供描繪在
圖 6F中相對於PBS治療動物對照組量測的血清鐵含量的圖，劑量分別為1 mg/kg及4 mg/kg。
[ 圖 8A 至 8F]提供描繪在用GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸治療後，猴子中血清鐵飽和度水平的圖。在第0、28、56、84及112天，以皮下注射方式向食蟹猴投藥所指示的在PBS中調配的1 mg/kg或4 mg/kg的GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸。在第7天(投予一星期前)(
圖 8A)；第28天(
圖 8B)；第56天(
圖 8C)；第84天(
圖 8D)；第112天(
圖 8E)；及第168天(
圖 8F)收集血清樣品，且確定血清鐵飽和度。
[ 圖 9A 至 9B]提供描繪在
圖 8A 至 8F中相對於PBS治療動物對照組量測的血清鐵飽和度的圖，劑量分別為1 mg/kg及4 mg/kg。
[ 圖 10A 至 10B]提供GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸-0416的化學圖，其中A及B標識了圖10A和10B之間的鍵。
[ 圖 11A 至 11B]提供GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸-0651的化學圖，其中A及B標識了圖11A和11B之間的鍵。
[ 圖 12A 至 12B]提供GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸-0831的化學圖，其中A及B標識了圖12A和12B之間的鍵。
[ 圖 13A 至 13B]提供GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸-1546的化學圖，其中A及B標識了圖13A和13B之間的鍵。
[ 圖 14A 至 14D]提供GalNAc共軛的
TMPRSS6寡核苷酸-0416 （
圖 14A）、-0651 （
圖 14B）、-0831 （
圖 14C）和-1546 （
圖 14D）的化學圖。
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Claims (17)
- 一種用於降低跨膜絲胺酸蛋白酶6 ( TMPRSS6)表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中該有義股和該反義股形成一雙螺旋區，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 600中所示之至少20個連續核苷酸的核苷酸序列，且其中該反義股包括 TMPRSS6mRNA標靶序列之互補區，該互補區長度為至少18個連續核苷酸。
- 如請求項1所述之RNAi寡核苷酸，其中該互補區之長度為至少19個連續核苷酸。
- 如請求項1至2中任一項所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股包括如SEQ ID NO: 844中所示之核苷酸序列，視情況其中該有義股包括如SEQ ID NO: 579中所示之核苷酸序列。
- 如請求項1至2中任一項所述之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括如SEQ ID NO: 600中所示之包括至少21個連續核苷酸的核苷酸序列，視情況其中該反義股包括如SEQ ID NO: 600中所示之核苷酸序列。
- 如請求項1至2中任一項所述之RNAi寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個經修飾之核苷酸，述情況其中該寡核苷酸的所有核苷酸為經修飾之核苷酸。
- 如請求項1至2中任一項所述之RNAi寡核苷酸，其中 該有義股包括36個核苷酸以及該反義股包括22個核苷酸，每一股的核苷酸係由5’至3’編號； 有義股位置1-7、12-27及31-36以及反義股的位置1、6、8、9、11-13及15-22皆包括2’-O-甲基(2'-OMe)修飾；以及 有義股位置8-11以及反義股的位置2、3、4、5、7、10及14皆包括2’-氟(2'-F)修飾。
- 如請求項1至2中任一項所述之RNAi寡核苷酸，其中 該反義股包括22個核苷酸； 每一股的核苷酸係由5’至3’編號；以及 在有義股位置1及2之間、以及反義股位置1及2之間、位置2及3之間、位置3及4之間、位置20及21之間及位置21及22之間提供硫代磷酸酯鍵。
- 如請求項1至2中任一項所述之RNAi寡核苷酸，其中該反義股之5'-端核苷酸包括如化學式1a (Me磷酸酯-4O-mU)結構： 。
- 如請求項1至2中任一項所述之RNAi寡核苷酸，其中該有義股接近3'端包括如為S1-Lp-S2所示之莖-環，其中S1與S2互補，且其中Lp在S1與S2之間形成長度為3至5個核苷酸之環。
- 如請求項9所述之RNAi寡核苷酸，其中該Lp環之長度為4個核苷酸，且其中該Lp環從5’至3’的第二、第三及第四核苷酸係各與與單價的N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）部分共軛。
- 如請求項1至2中任一項所述之RNAi寡核苷酸，其中該反義股包括長度為一或多個嘌呤核苷酸的3'突出序列，且視情況其中該3'突出序列為5’-GG-3’。
- 一種用於降低TMPRSS6表現的RNAi寡核苷酸，該寡核苷酸包括有義股和反義股，其中 該有義股包括5′ -[mGs][mG][mU][mG][mC][mU][mA][fC][fU][fC][fU][mG][mG][mU][mA][mU][mU][mU][mC][mA][mG][mC] [mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC] - 3’ (SEQ ID NO: 621)的序列以及全部修飾，且 其中該反義股包括5′ - [Me磷酸酯-4O-mUs][fGs][fAs][fA][fA][mU][fA][mC][mC][fA][mG][mA][mG][fU][mA][mG][mC][mA][mC][mCs][mGs][mG] - 3’ (SEQ ID NO: 642)的序列以及全部修飾，其中mC、mA、mG、mU = 2'-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU = 2'F核糖核苷；s =硫代磷酸酯，以及其中ademA-GalNAc = 。
- 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至12中任一項所述之RNAi寡核苷酸，及醫藥學上可接受之載劑、遞送劑或賦形劑。
- 一種如請求項1至12中任一項所述之RNAi寡核苷酸，其係用作藥物。
- 一種如請求項13所述之醫藥組合物，其係用作藥物。
- 一種如請求項1至12中任一項所述之RNAi寡核苷酸，其係用作治療諸如遺傳性血鐵沉著症或β-地中海貧血之血色素沉著症。
- 一種如請求項13所述之醫藥組合物，其係用作治療諸如遺傳性血鐵沉著症或β-地中海貧血之血色素沉著症。
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