KR20110079529A - ｃ-Ｍｅｔ의 발현을 저해하는 ｓｉＲＮＡ 및 이를 포함하는 항암 조성물 - Google Patents
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Abstract
c-Met 전사체 (mRNA transcript) 염기서열에 상보적으로 결합하여 세포 내에서 c-Met의 발현을 억제함과 동시에 면역반응을 유발하지 않는(optionally) 작은 간섭 리보핵산 (small interfering RNA, siRNA) 및 상기 siRNA의 암의 예방 및/또는 치료에 있어서의 용도가 제공된다. 상기 c-Met을 암호화하는 mRNA와 상보 결합할 수 있는 siRNA는 리보핵산 매개 간섭현상 (RNA interference, RNAi)에 의해 거의 모든 암세포에 공통적으로 과발현되는 c-Met의 발현을 억제하여 암세포의 증식 및 전이를 저해 할 수 있으므로, 항암제로서 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 c-Met 전사체 (mRNA transcript) 염기서열에 상보적으로 결합하여 세포내에서 c-Met의 발현을 억제함과 동시에 면역반응을 유발하지 않는 작은 간섭 리보핵산 (small interfering RNA, siRNA) 및 상기 siRNA의 암의 예방 및/또는 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다.
c-Met는 HGF (hepatocyte growth factor)의 수용체이기 때문에 HGFR라고도 명명되며, 1984년 화학적 암유발제(carcinogene)을 처리한 사람의 골육종에서 처음으로 발견된 후, 1986년 tpr(translocated promoter region)과의 유전적 결합(genetic fusion) 현상으로 잠재적 암유발유전자(proto-oncogene)임이 밝혀졌다(Cooper et al., Nature, 311, 29-33, 1984; Dean et al., Mol cell Biol., 7, 921-924, 1987 ; Park et al., Cell, 45, 895-904, 1986).
세포막단백질로서 수용체 티로신 키나제 (receptor tyrosine kinase, RTK)의 일종인 c-Met 수용체가 간엽간세포(mesenchymal cell)에서 생산된 간세포 성장인자 혹은 분산인자 (hepatocyte growth factor/scatter factor)라 불리는 리간드와 결합하면 정상세포에서는 세포의 성장 및 분화를 유발하고 올바른 개체 발생 및 상처 치유, 신생혈관 형성에 관여하며, 암세포의 경우에는 암세포의 증식, 전이 등을 촉진시킨다(Nakamura et al., J Clin Invest., 106, 1511-9,2000; Comoglio et al., Semin Cancer Biol, 11, 153-65, 2001; Boccaccio, Nat Rev Cancer, 6, 637-45, 2006; Huh CF et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101, 4477-82, 2004).
HGF/c-Met의 비정상적인 신호전달은 대부분 HGF 혹은 c-Met이 과발현되거나 돌연변이가 일어나 활성이 증가된 결과이며, 여러 암환자의 좋지 않은 예후와 밀접하게 관련되어 있다고 알려져 있다.
이처럼, c-Met 단백질의 활성과 암 발생과 전이 사이에 밀접한 상호관계가 밝혀지고 다른 수용체 tyrosine kinase 저해제들의 임상적 성공에 힘 입어, c-Met을 타겟으로 한 항암제 개발연구가 활발히 진행되고 있으나, 현재 임상 단계에 진입한 후보물질들은 c-Met 수용체에 길항하는 항체 또는 c-Met 신호전달을 저해하는 티로신 키나제 억제제와 같은 단백질들의 3차 구조를 기반으로 설계된 화학적 합성 억제제가 대부분이다. 저분자 키나제 저해제는 광범위 키나제 저해제에 비해 c-Met에 대한 선택성이 향상되었지만 여전히 약물이 c-Met 이외의 유사한 단백질의 활성을 저해함으로 인한 부작용의 우려가 있고, 항체 약물은 비교적 선택성이 우수하지만 복잡한 제조공정으로 인한 생산의 어려움과 보관상의 안정성 문제를 가지고 있다. 따라서, c-Met의 기능을 효과적으로 저해하는 약물 개발 필요성이 끊임없이 요구되어 왔다.
한편, 최근 리보핵산 매개 간섭현상이, 기존의 방법으로는 의약적으로 불가능(non-druggable)한 타겟에 대해서도 정밀한 유전자 선택성을 보이는 선도물질을 신속히 도출함에 따라 합성 의약 개발 시 발생되는 제한된 타겟 및 비선택성에 대한 해결책을 제시하고 화학합성 의약품의 한계를 극복할 수 있는 기술로 여겨지면서 기존의 방식으로는 치료가 어려운 각종 질병, 특히 종양 치료제 개발에 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, siRNA(small interfering RNA)가 초기 면역반응을 유도하며, 예상했던 것보다 비특이적인 RNAi효과를 빈번하게 유도한다는 것을 발견하게 되었다.
포유 동물 세포에서 길이가 긴 이중가닥의 siRNA는 유해한 인터페론 반응을 유도할 수 있고, 길이가 짧은 이중가닥 siRNA 역시 인체나 세포에 유해한 초기 인터페론 면역 반응을 일으키는 것으로 보고되고 있으며, 예상했던 것보다 높은 비특이적인 RNAi효과를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Kleirman et al. Nature, 452:591-7, 2008).
한편, 암의 진행에 중요한 역할을 하는 c-Met을 타겟으로 한 siRNA 항암제 개발이 시도되고 있으나 현재까지 그 성과는 미미한 수준이다. siRNA의 개별 시퀀스의 유전자 억제 효능에 대해 제시된 바 없고, 특히 면역활성에 대한 고려가 전혀 되어 있지 않은 실정이다.
이처럼, 기존의 방법으로는 의약화가 불가능한 타겟을 포함한 모든 질환 타겟 유전자의 발현을 저해할 수 있는 siRNA 약물은 높은 활성과 뛰어난 타겟 선택성 등의 장점으로 새로운 치료제로서의 무한한 가능성을 보여주고 있지만, 치료제 개발이 성공하기 위해서는 혈액 중의 낮은 안정성, 제한적 약물 분포, 타겟 이외의 효과 (off-target effect), 면역반응 유발의 문제점을 해결하는 것이 필요하다.
최근 이러한 약점을 개선하고 임상 적용을 가능토록 하기 위해 siRNA에 화학적 변형을 도입하는 연구가 진행되고 있기도 하다(Davidson, Nat. Biotechnol., 24:951-952,2006; Sioud and Furset, J. Biomed. Biotechnol., 2006:23429,2006).
이에, 본 발명자들은 본 발명의 서열 특이성이 높아 표적 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하여 RNAi 효율성을 증가시키며, 면역 독성을 유발하지 않는 siRNA를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일례는 c-Met 전사체 염기서열에 상보적으로 결합하여 c-Met의 합성 및/또는 발현을 특이적으로 저해하는 siRNA를 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 c-Met의 합성 및/또는 발현 저해용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 c-Met을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, c-Met의 합성 및/또는 발현을 억제하는 방법 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터의 c-Met을 발현하는 세포에서의 c-Met의 합성 및/또는 발현 억제를 위한 용도를 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 c-Met을 발현하는 암세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 암세포의 성장을 억제하는 방법 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터의 c-Met을 발현하는 암세포에서의 암세포의 성장 억제를 위한 용도를 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터를 치료적 유효량으로 투여하여 암을 예방 및/또는 치료하는 방법 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 벡터의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 c-Met 전사체 염기서열에 상보적으로 결합하여 세포 내에서 c-Met의 합성 및/또는 발현을 억제하는 siRNA, 이를 포함하는 의약 조성물, 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 c-Met의 합성 및/또는 발현을 특이적으로 저해하는 siRNA를 제공한다. 또 다른 예에서, 본 발명은 상기 c-Met의 합성 및/또는 발현을 특이적으로 저해하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 c-Met 합성 및/또는 발현 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 발명은 상기 c-Met의 합성 및/또는 발현을 특이적으로 저해하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 암세포 성장 저해제 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물(항암 조성물)을 제공한다.
본 발명은 사람을 포함하는 포유 동물의 c-Met mRNA, 이의 선택적 스플라이싱 형태(alternative splice form), 돌연변이 형태, 또는 같은 계통의 c-Met 유전자의 발현을 저해하는 기술과 관련된 것이며, 이는 본 발명에서 제공되는 siRNA의 특정 용량을 환자에게 투여했을 때 타겟 mRNA가 감소함으로써 성취되는 것일 수 있다.
이하, 이를 보다 상세히 설명한다.
상기 c-Met는 포유동물 유래, 바람직하게는 사람 또는 사람과 동일한 계통의 c-Met 및 그의 돌연변이체일 수 있다. 사람과 같은 계통이라 함은 유전자 또는 mRNA가 사람의 c-Met 유전자 또는 이로부터 유래하는 mRNA와 80% 이상의 서열 유사성을 가진 다른 포유동물을 말하는 것으로, 구체적으로, 사람, 영장류, 설치류 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, c-Met을 코딩하는 mRNA에 해당하는 센스 가닥의 cDNA 서열은 서열번호 1 일 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA는 상기 c-Met의 mRNA 또는 cDNA 내부의 연속하는 15 내지 25 bp, 바람직하게는 18 내지 22 bp로 이루어진 영역, 바람직하게는 서열번호 2 내지 21로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열에 해당되는 mRNA 또는 cDNA 영역을 표적으로 하는 것일 수 있다. 상기 바람직한 cDNA 상의 표적 영역을 아래의 표 1에 정리하였다. 따라서, 본 발명의 일실시예에서, 서열번호 1의 c-Met cDNA 영역 중 서열번호 2 내지 21로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열에 해당되는 mRNA 또는 cDNA 영역을 표적으로 하는 siRNA을 제공한다. 구체적으로, 서열번호 3, 18 및 21로 이루어진 군에서 선택된 염기서열에 해당되는 mRNA 영역을 표적으로 하는 siRNA을 제공한다.
| 서열번호 | 서열 (5' -> 3') | c-Met 유전자 내의 시작 뉴클레오타이드 |
| 2 | GTAAAGAGGCACTAGCAAA | 77 |
| 3 | GCACTAGCAAAGTCCGAGA | 86 |
| 4 | CAGCAAAGCCAATTTATCA | 306 |
| 5 | CTATGATGATCAACTCATT | 375 |
| 6 | CAATCATACTGCTGACATA | 444 |
| 7 | CTCTAGATGCTCAGACTTT | 803 |
| 8 | TCTGGATTGCATTCCTACA | 856 |
| 9 | CTGGATTGCATTCCTACAT | 857 |
| 10 | GCACAAAGCAAGCCAGATT | 1039 |
| 11 | CTGCTTTAATAGGACACTT | 1188 |
| 12 | CAGGTTGTGGTTTCTCGAT | 1390 |
| 13 | CTGGTTATCACTGGGAAGA | 1507 |
| 14 | TTGGTCCTGCCATGAATAA | 1877 |
| 15 | AGACAAGCATCTTCAGTTA | 2195 |
| 16 | TCGCTCTAATTCAGAGATA | 2376 |
| 17 | TCAGAGATAATCTGTTGTA | 2386 |
| 18 | GTGAGAATATACACTTACA | 2645 |
| 19 | GGTGTTGTCTCAATATCAA | 2809 |
| 20 | CATTTGGATAGGCTTGTAA | 2935 |
| 21 | CCAAAGGCATGAAATATCT | 3566 |
본 명세서에서 사용된 '표적 mRNA'라 함은 사람의 c-Met mRNA, 사람과 같은 계통의 c-Met mRNA, 이의 돌연변이체, 또는 선택적 스플라이싱 구조체를 지칭한다. 구체적으로, NM_000245, Mus musculus: NM_008591, Macaca mulatta: NM_001168629, NM_001127500: 염기서열 2262~2317가 삭제된 스플라이싱 형태, Y1230C/A3689G, D1228H/G3682C, V1092I/G3274A, M1268T/T3795C 등의 아미노산 또는 염기서열의 돌연변이체 등이 포함된다. 따라서, 본 발명의 siRNA은 사람 또는 사람과 같은 계통의 c-Met mRNA나 이의 선택적 스플라이싱 형태, 돌연변이 형태를 표적으로 하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 'mRNA (또는 cDNA)영역을 표적으로 한다'고 함은 siRNA가 상기 mRNA (또는 cDNA) 영역 염기서열 중의 전부 또는 일부, 예컨대 염기서열의 85-100%와 상보적인 염기서열을 가져서, 상기 mRNA (또는 cDNA) 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 '상보적'이라 함은 폴리뉴클레오타이드의 양 가닥이 염기쌍을 형성할 수 있음을 의미한다. 상보적 폴리뉴클레오타이드의 양 가닥은 왓슨-크릭 방식으로 염기쌍을 형성하여 이중가닥을 형성한다. 본 발명에서 염기 U가 언급되는 경우, 별다른 언급이 없는 한 염기 T로 치환가능하다.
본 발명의 약학적 조성물의 c-Met 합성 및/또는 발현 억제 효과와 암 치료 효과는 c-Met의 효과적인 합성 및/또는 발현 억제에 의하여 성취되는 것이므로, 상기 약학 조성물에 유효성분으로 함유되는 siRNA는 상기 특정 mRNA 영역들 중 하나 이상을 표적으로 하는 15-30 bp의 이중가닥 siRNA일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 siRNA는 서열번호 22 내지 98의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 siRNA는 아래의 표 2에 나타낸 siRNA 1 내지 siRNA 40으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
| 서열번호 | 서열 (5' -> 3') | 가닥 | siRNA 표시 | 화학적 구조 변형 | |
| 2가닥 대칭 siRNA (20개) |
22 | GUAAAGAGGCACUAGCAAAdTdT | Sense | siRNA 1 | |
| 23 | UUUGCUAGUGCCUCUUUACdTdT | Antisense | |||
| 24 | GCACUAGCAAAGUCCGAGAdTdT | Sense | siRNA 2 | ||
| 25 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdTdT | Antisense | |||
| 26 | CAGCAAAGCCAAUUUAUCAdTdT | Sense | siRNA 3 | ||
| 27 | UGAUAAAUUGGCUUUGCUGdTdT | Antisense | |||
| 28 | CUAUGAUGAUCAACUCAUUdTdT | Sense | siRNA 4 | ||
| 29 | AAUGAGUUGAUCAUCAUAGdTdT | Antisense | |||
| 30 | CAAUCAUACUGCUGACAUAdTdT | Sense | siRNA 5 | ||
| 31 | UAUGUCAGCAGUAUGAUUGdTdT | Antisense | |||
| 32 | CUCUAGAUGCUCAGACUUUdTdT | Sense | siRNA 6 | ||
| 33 | AAAGUCUGAGCAUCUAGAGdTdT | Antisense | |||
| 34 | UCUGGAUUGCAUUCCUACAdTdT | Sense | siRNA 7 | ||
| 35 | UGUAGGAAUGCAAUCCAGAdTdT | Antisense | |||
| 36 | CUGGAUUGCAUUCCUACAUdTdT | Sense | siRNA 8 | ||
| 37 | AUGUAGGAAUGCAAUCCAGdTdT | Antisense | |||
| 38 | GCACAAAGCAAGCCAGAUUdTdT | Sense | siRNA 9 | ||
| 39 | AAUCUGGCUUGCUUUGUGCdTdT | Antisense | |||
| 40 | CUGCUUUAAUAGGACACUUdTdT | Sense | siRNA 10 | ||
| 41 | AAGUGUCCUAUUAAAGCAGdTdT | Antisense | |||
| 42 | CAGGUUGUGGUUUCUCGAUdTdT | Sense | siRNA 11 | ||
| 43 | AUCGAGAAACCACAACCUGdTdT | Antisense | |||
| 44 | CUGGUUAUCACUGGGAAGAdTdT | Sense | siRNA 12 | ||
| 45 | UCUUCCCAGUGAUAACCAGdTdT | Antisense | |||
| 46 | UUGGUCCUGCCAUGAAUAAdTdT | Sense | siRNA 13 | ||
| 47 | UUAUUCAUGGCAGGACCAAdTdT | Antisense | |||
| 48 | AGACAAGCAUCUUCAGUUAdTdT | Sense | siRNA 14 | ||
| 49 | UAACUGAAGAUGCUUGUCUdTdT | Antisense | |||
| 50 | UCGCUCUAAUUCAGAGAUAdTdT | Sense | siRNA 15 | ||
| 51 | UAUCUCUGAAUUAGAGCGAdTdT | Antisense | |||
| 52 | UCAGAGAUAAUCUGUUGUAdTdT | Sense | siRNA 16 | ||
| 53 | UACAACAGAUUAUCUCUGAdTdT | Antisense | |||
| 54 | GUGAGAAUAUACACUUACAdTdT | Sense | siRNA 17 | ||
| 55 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdTdT | Antisense | |||
| 56 | GGUGUUGUCUCAAUAUCAAdTdT | Sense | siRNA 18 | ||
| 57 | UUGAUAUUGAGACAACACCdTdT | Antisense | |||
| 58 | CAUUUGGAUAGGCUUGUAAdTdT | Sense | siRNA 19 | ||
| 59 | UUACAAGCCUAUCCAAAUGdTdT | Antisense | |||
| 60 | CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdTdT | Sense | siRNA 20 | ||
| 61 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdTdT | Antisense | |||
| 2 가닥 비대칭 siRNA (3개) |
62 | CUAGCAAAGUCCGAGA | Sense | siRNA 21 | |
| 25 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdTdT | Antisense | |||
| 63 | AGAAUAUACACUUACA | Sense | siRNA 22 | ||
| 55 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdTdT | Antisense | |||
| 64 | GAUUGCAUUCCUACAU | Sense | siRNA 23 | ||
| 61 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdTdT | Antisense | |||
| 화학적변형 siRNA (17개) |
65 | GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT*dT | Sense | siRNA24 | siRNA2 -mod1 |
| 66 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT | Antisense | |||
| 67 | GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT*dT | Sense | siRNA25 | siRNA2 -mod2 |
|
| 68 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT | Antisense | |||
| 69 | GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT*dT | Sense | siRNA26 | siRNA2 -mod3 |
|
| 70 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT | Antisense | |||
| 71 | GCACuAGCAAAGuCCGAGAdT*dT | Sense | siRNA27 | siRNA2 -mod4 |
|
| 72 | UCuCGGACuUUGCuAGuGCdT*dT | Antisense | |||
| 73 | G CACUAGCAAAGUCCGAGAdT*dT | Sense | siRNA28 | siRNA2 -mod5 |
|
| 74 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT | Antisense | |||
| 75 | GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT | Sense | siRNA29 | siRNA17 -mod1 |
|
| 76 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT | Antisense | |||
| 77 | GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT | Sense | siRNA30 | siRNA17 -mod2 |
|
| 78 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT | Antisense | |||
| 79 | GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT | Sense | siRNA31 | siRNA17 -mod3 |
|
| 80 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT | Antisense | |||
| 81 | GuGAGAAuAuACACuuACAdT*dT | Sense | siRNA32 | siRNA17 -mod4 |
|
| 82 | UGuAAGuGuAUAuuCuCACdT*dT | Antisense | |||
| 83 | G UGAGAAUAUACACUUACAdT*dT | Sense | siRNA33 | siRNA17 -mod5 |
|
| 84 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT | Antisense | |||
| 85 | GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT | Sense | siRNA34 | siRNA17 -mod6 |
|
| 86 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT | Antisense | |||
| 87 | CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT | Sense | siRNA35 | siRNA20 -mod1 |
|
| 88 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT | Antisense | |||
| 89 | CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT | Sense | siRNA36 | siRNA20 -mod2 |
|
| 90 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT | Antisense | |||
| 91 | CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT | Sense | siRNA37 | siRNA20 -mod3 |
|
| 92 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT | Antisense | |||
| 93 | CCAAAGGCAuGAAAuAuCudT*dT | Sense | siRNA38 | siRNA20 -mod4 |
|
| 94 | AGAuAuuuCAUGCCuuuGGdT*dT | Antisense | |||
| 95 | C CAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT | Sense | siRNA39 | siRNA20 -mod5 |
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| 96 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT | Antisense | |||
| 97 | CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT | Sense | siRNA40 | siRNA20 -mod6 |
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| 98 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT | Antisense |
상기 표 2에서, 화학적 변형 siRNA(서열번호 65 내지 98)의 화학적 변형 표기법 및 화학적 구조 변형에 관한 내용을 각각 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.
| 표기법 | 도입된 화학적 변형 |
| * | 포스포디에스테르(Phosphodiester)결합을 포스포로티오에이트(Phosphorothioate) 결합으로 치환 |
| 밑줄 | 리보스 환의 2‘-OH를 2'-O-Me로 치환 |
| 소문자 | 리보스 환의 2‘-OH를 2'-F로 치환 |
| 굵은글씨체 | ENA(ethylene bridge nucleic acid)를 도입 |
| 구조 이름 | siRNA 화학적 구조 변형 |
| mod1 | 안티센스 가닥의 1,2번 핵산의 리보스 환의 2’-OH를 2'-O-Me로 치환하고, 센스 및 안티센스 가닥의 3‘ 말단 dTdT(포스포디에스테르 결합)를 포스포로티오에이트 결합으로 치환. (3’-dT*dT, *:포스포로티오에이트 결합) |
| mod2 | Mod1의 구조변형과 함께 센스 가닥의 1,2번 핵산의 리보스 환의 2’-OH를 2'-O-Me로 치환 |
| mod3 | Mod2의 구조변형과 함께 센스 가닥에서 염기 U를 가진 핵산의 리보스 환의 2’-OH를 모두 2'-O-Me로 치환 |
| mod4 | Mod1의 구조변형과 함께 센스 및 안티센스 가닥에서 염기 G를 가진 핵산의 리보스 환의 2’-OH를 모두 2'-O-Me로 치환하고, 염기 U를 가진 핵산의 리보스 환의 2’-OH를 모두 2'-F로 치환. 단, 안티센스 가닥의 10번, 11번 염기는 치환하지 않음. |
| mod5 | Mod2의 구조변형과 함께 센스 가닥의 5’ 말단에 있는 핵산 하나에 ENA(2’-O, 4’-C ethylene bridged nucleotide)를 도입 |
| mod6 | 안티센스 가닥의 2번 핵산의 리보스 환의 2’-OH를 2'-O-Me로 치환하고, 센스 및 안티센스 가닥의 3‘ 말단 dTdT(포스포디에스테르 결합)을 포스포로티오에이트 결합으로 치환. (3’-dT*dT, *:포스포로티오에이트 결합) |
상기 siRNA는 c-Met 전사체 (mRNA transcript) 염기서열의 특정 표적 영역에 대한 서열 특이성이 높아서, 표적 유전자의 전사체에 특이적으로 상보적 결합하여 RNA 간섭 효율성을 증가되어 세포내에서 c-Met의 발현 및/또는 합성 억제 효율이 우수하다. 또한, 면역 유발 활성이 최소화된 것을 특징으로 한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 siRNA는 서열번호 1의 c-Met cDNA 영역 중 서열번호 2 내지 21로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 영역에 대한 mRNA를 표적으로 하는 siRNA, 바람직하게는 서열번호 22 내지 98의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 siRNA, 더 바람직하게는 서열번호 22 내지 98로 이루어진 40종의 siRNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 siRNA는 리보핵산 서열 자체, 또는 이를 발현하는 재조합 벡터 (발현 벡터) 형태를 모두 포함하는 개념이다. 상기 발현 벡터는 플라즈미드 또는 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스, 백시니아바이러스, 암세포 용해성 바이러스(oncolytic adenovirus) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분으로서 siRNA와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 경우를 포함한다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 이 분야에 통상적으로 사용되는 모든 담체를 포함하며, 예컨대, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 siRNA 또는 약학적 조성물의 투여 대상 환자는 포유 동물, 바람직하게는 사람, 원숭이, 설치류 (마우스, 래트)일 수 있으며, 특히 c-Met의 발현과 관련되는 질병이나 증상을 가지거나, c-Met 발현 억제를 필요로 하는 모두 포유 동물, 예컨대, 사람일 수 있다.
c-Met억제에 유효한 효과를 얻으면서 면역 반응 등의 바람직하지 않은 부반응을 최소화하기 위하여, 조성물 내의 siRNA의 농도, 또는 사용 또는 처리 농도는, 0.001 내지 1000nM, 바람직하게는 0.01 내지 100nM, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10nM로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물에 의하여 치료 가능한 암은 폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 갑성선암, 식도암, 전립선암 등의 고형암 및 골육종, 연부조직육종, 신경교종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
이하 siRNA의 구조, 설계 과정 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 siRNA는 RNAi 기전에 의해 c-Met mRNA의 분해를 일으켜 c-Met 단백질의 발현을 유발하지 않거나 감소시키는 기능을 한다.
일실시예에서, siRNA는 RNA interference (RNAi) 경로를 유발하는 작은 저해 RNA 이중가닥 (small inhibitory RNA duplexes)을 의미한다. 구체적으로, siRNA는 센스 RNA 가닥과 그에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하며, 양 가닥이 15-30bp, 구체적으로는 19-25bp 또는 27bp, 더 구체적으로는 19-21bp 를 포함하는 RNA 이중 가닥이다. siRNA는 이중가닥 영역을 포함하며 단일 가닥이 헤어핀(hairpin) 또는 stem-loop 구조를 형성하는 구조이거나, 2개의 분리된 가닥의 이중가닥일 수 있다. 센스 RNA 가닥은 표적 유전자의 mRNA 서열의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 서열을 가지며, 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥이 서로 왓슨과 크릭의 상보적인 염기서열 결합에 의해서 이중 가닥을 이루고 있다. siRNA의 안티센스 가닥은 RISC(RNA-Induced Silencing Complex)에 포집되어 RISC가 안티센스 가닥과 상보적인 목표 mRNA를 확인한 후 절단 또는 번역(translational) 저해를 유도하게 한다. 일실시예에서, 이중가닥 siRNA는 3' 말단, 5' 말단 또는 양쪽 말단에 1 내지 5 뉴클레오타이드의 돌출부(overhang)를 가질 수 있다. 또는, 양 말단이 평활 말단(blunt end)으로 절단된 형태를 갖는 것일 수 있다. 구체적으로는 US20020086356, 및 US7056704에 개시된 siRNA일 수 있다 (상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다).
본 발명의 일실시예에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 15-30 bp의 이중가닥이고, 돌출부가 없는 평활 말단(blunt end)을 갖는 대칭 구조, 또는 적어도 하나, 예컨대 1-5개의 뉴클레오타이드의 돌출부를 가지는 비대칭 구조일 수 있다. 돌출부 뉴클레오타이드는 어떠한 서열이어도 상관이 없으나 dT(deoxythymidine, 디옥시티미딘) 2개를 붙일 수 있다.
상기 안티센스 가닥은 생리학적 조건에서 서열번호 1의 mRNA의 표적 영역에 혼성화한다. '생리학적 조건에서의 혼성화'라 함은 siRNA의 안티센스 가닥이 in vivo에서 mRNA의 특정 표적 영역과 혼성화하는 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 안티센스 가닥은 mRNA의 표적 영역, 바람직하게는 상기 표 1의 서열번호 2 내지 21의 염기서열과 85% 이상의 서열 상보성을 가질 수 있으며, 더 구체적으로 상기 안티센스 가닥은 서열번호 1의 염기서열 내의 연속하는 15 내지 25 bp, 바람직하게는 18 내지 22 bp의 염기서열, 바람직하게는 상기 표 1의 서열번호 2 내지 21의 염기서열에 완전 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
또한, 일실시예에서, siRNA는 한 가닥이 다른 가닥보다 짧은 비대칭적인 이중가닥 구조일 수 있다. 구체적으로, 19~21 뉴클레오타이드(nucleotide, nt)의 안티센스 가닥; 및 상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15~19nt의 센스 가닥으로 구성되는 이중가닥(double strand)의 siRNA 분자(small interfering RNA molecule)로서, 상기 siRNA는 안티센스의 5' 방향의 말단이 평활 말단(blunt end)이고 안티센스의 3' 말단에 1-5 뉴클레오타이드 돌출부(overhang)를 갖는 비대칭 siRNA일 수 있다. 구체적으로 WO09/078685에 개시된 siRNA일 수 있다.
siRNA를 이용한 치료에서 가장 먼저 고려되어야 할 점은 표적화된 유전자의 염기서열에서 가장 큰 활성을 가지는 최적의 염기서열을 선정하는 것이 필요하다. 구체적으로, 일실시예에서, 전임상 시험과 임상 시험간의 관련성을 높이기 위하여 종간 보존된 서열을 포함하는 c-Met siRNA를 디자인하는 것이 바람직하다. 또한, 일실시예에서, RISC에 결합하는 안티센스 가닥이 RISC와 결합력이 높도록 디자인하는 것이 바람직하다. 따라서, 센스 가닥과 안티센스 가닥의 열역학적 안정성에 차이가 나도록 디자인 되어 센스 가닥은 RISC와 결합하지 않고 가이드 서열인 안티센스 가닥이 RISC와 결합력을 높이도록 한다. 구체적으로, 센스 가닥의 GC 서열이 60%가 넘지 않으며, 센스 가닥의 5' 말단에서부터 15번째 및 19번째 사이에는 아데닌/구아닌 염기가 3개 이상 있고 1~7번째 사이에는 G/C 염기가 많은 것일 수 있다. 또한 반복 염기 서열로 인해 siRNA 자체 내부 염기 서열끼리 결합하여 mRNA에 상보적으로 결합하는 능력을 떨어뜨릴 수 있으므로, 4개 이상의 반복 염기 서열이 있도록 디자인하는 것은 피하는 것이 바람직하다. 또한, 19개 염기로 이루어진 센스 서열의 경우, 표적 유전자의 mRNA에 결합하여 전사체 분해를 잘 일으키기 위해서는 센스가닥의 5' 말단에서부터 3번째, 10번째, 및 19번째 염기서열이 아데닌일 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에서, siRNA는 비특이적 결합 및 면역 유발 활성이 최소화된 것을 특징으로 한다. siRNA에 의한 인터페론 등의 면역반응 유도는 주로 항원을 제시하는 면역세포의 엔도솜(endosome)에 존재하는 TLR7(Toll-like receptor-7)을 통해 일어나며, siRNA의 TLR7과의 결합(binding)은 GU가 풍부한 서열과 같이 서열 특이적으로 일어나므로 TLR7에 의해 인지되지 않는 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 5'-GUCCUUCAA-3'와 5'-UGUGU-3' 와 같은 면역유발 서열을 가지지 않으며, c-Met 이외의 다른 유전자와의 상보성이 최소 70% 이하일 수 있다.
본 발명의 일실시예의 c-Met cDNA 표적 서열의 예는 상기 표 1에 기재한 서열의 뉴클레오타이드를 포함한다. 표 1의 표적 서열을 기초로 siRNA의 길이를 표적 서열의 길이보다 더 길거나 짧게 디자인하거나, 상기 DNA 서열에 상보적인 뉴클레오타이드를 더하거나 빼고 siRNA 서열을 디자인할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 15-30 bp의 이중가닥이고, 돌출부가 없거나, 적어도 하나의 말단이 1-5 뉴클레오타이드의 돌출부를 가지며, 상기 안티센스 가닥은 생리학적 조건에서 서열번호 2 내지 21, 바람직하게는 서열번호 3, 18, 21에 대응하는 mRNA 영역에 혼성화한다. 즉, 상기 안티센스 가닥이 서열번호 2 내지 21, 바람직하게는 서열번호 3, 18, 21의 상보적인 서열을 포함한다. 즉, 본 발명의 c-Met siRNA 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 유해한 인터페론 반응을 유도하지 않으면서 c-Met 유전자의 발현을 저해시키는 특징을 가진다.
본 발명은 서열번호 3 (5'-GCACTAGCAAAGTCCGAGA-3'), 서열번호 18 (5'-GTGAGAATATACACTTACA-3'), 및 서열번호 21 (5'-CCAAAGGCATGAAATATCT-3')로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열에 대응하는 mRNA 영역에 상보적으로 결합하여 세포 내에서 c-Met의 발현을 억제한다.
본 발명에 구체예에 따른 c-Met siRNA는 상기 표 2에 기재한 바와 같다.
일실시예에서, 상기 c-Met siRNA는 서열번호 24의 센스 서열 및 서열번호 25의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 2, 서열번호 54의 센스 서열 및 서열번호 55의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 17, 서열번호 60의 센스 서열 및 서열번호 61의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 20, 서열번호 62의 센스 서열 및 서열번호 25의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 21, 서열번호 63의 센스 서열 및 서열번호 55의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 22, 서열번호 64의 센스 서열 및 서열번호 61의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 23으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
넉다운(c-Met 발현 억제)은 정량 PCR(qPCR) 증폭, bDNA (branched DNA) assay, 웨스턴 블롯, ELISA 등의 방법으로 mRNA 또는 단백질 수준의 변화를 측정하여 확인할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 리포좀 복합체를 제조하여 종양 세포주에 처리한 다음 리보핵산 매개에 의한 발현 간섭현상을 mRNA 단계에서 bDNA 측정법을 사용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 siRNA서열은 c-Met의 합성 또는 발현을 효과적으로 저해할 뿐만 아니라 면역 유발 활성이 낮다는 특징을 가진다.
본 발명의 일실시예에서, 면역독성은 사람의 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)에 siRNA-DOTAP(N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylammonium metylsulfate), 복합체(complex)를 처리한 후 배양액 중에 유리된 사이토카인인 인터페론 알파 및 감마 (INF-a 및 INF-γ), 종양괴사인자(Tumor necrosis factor-a: TNF-a), 인터류킨-12(Interleukin-12, IL-12) 등의 증가 여부를 측정하여 확인할 수 있다.
상기 siRNA는 변형되지 않고 자연에 존재하는 리보핵산 단위구조를 가지고 있는 것이거나, 또는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조나 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것일 수 있다.
상기 화학적 변형을 통해, RNAi 능력에 영향을 미치지 않고 예컨대 뉴클레아제(nuclease)에 대한 저항성 증진, 세포내 흡수(uptake) 증가, 세포 표적화 향상, 안정성 증가, 인터페론 활성 감소, 면역 반응 및 센스(sense) 효과와 같은 타겟 이외의(off-target) 효과 감소 등, siRNA의 다양한 특성을 변형되지 않은 siRNA 보다 향상시킬 수 있다.
siRNA의 화학적 변형 방법은 특별히 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다(Andreas Henschel, Frank Buchholz1 and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a webbased tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue):W113-W120).
siRNA의 화학적 변형의 일례로, siRNA 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 가닥의 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합으로 치환하는 방법이 있으며, 이를 통해 뉴클레아제(nuclease)의 핵산 분해에 대한 저항성을 높일 수 있다. 일례로, siRNA 센스(sense)와 안티센스(antisense) 양쪽 가닥의 3’-말단 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 변경할 수 있다.
다른 일례로, siRNA 센스(sense) 또는 안티센스 가닥의 5' 말단, 3’말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid) 또는 LNA(Locked nucleic acid)를 도입하는 방법이 있으며, 바람직하게는 siRNA 센스(sense) 가닥의 5' 말단에 도입한다. 이를 통해 RNAi 능력에 영향을 미치지 않고 siRNA 안정성을 증가시키고 면역 반응 및 비특이적 억제 효과를 줄일 수 있다.
또 다른 일례로, 리보스 환(ribose ring)의 2'-위치에 있는 -OH(히드록시기)를 -NH2(아미노기), -C-allyl(알릴기), -F(플루오로기), 또는 -O-Me(또는 CH3, 메틸기)로 치환하는 화학적 변형을 가할 수 있다. 예컨대, 센스 가닥의 1번 및 2번 핵산의 리보스 환에서 2‘-OH를 2’-O-Me로 치환하거나, 안티센스 가닥의 2번 핵산의 리보스 환에서 2‘-OH를 2’-O-Me로 치환, 또는 구아닌(G) 또는 유리딘(U)을 포함하는 일부 뉴클레오타이드에서 리보스 환의 2‘-OH를 2‘-O-Me(메틸기) 또는 2‘-F(플루오로기)로 치환할 수 있다.
상술한 화학적 변형 외에도 다양한 화학적 변형을 가할 수 있으며, 이러한 화학적 변형은 어느 한 가지 형태의 변형만 이루어질 수도 있고, 여러 가지 화학적 변형이 함께 이루어질 수도 있다.
다만 상기 변형에 있어서, siRNA 이중 가닥구조를 안정화시키는 동시에 유전자 발현 저해활성을 감소시키지 않도록, 바람직하게는 최소한의 변형이 이루어지도록 하는 것이 좋다.
또한, siRNA에 콜레스테롤, 비오틴, 세포 침투 성질을 가지는 펩타이드(cell penetrating peptide)와 같은 리간드(ligand)를 센스가닥의 5' 또는 3'- 말단에 붙이는 것도 가능하다.
본 발명의 siRNA는 화학적 합성, in vitro 전사 또는 다이서(Dicer)나 기타 유사한 활성을 가지는 뉴클리에이즈로 긴 이중 가닥 RNA를 절단하여 제조할 수 있다. 또는, 상기한 바와 같이, siRNA를 플라즈미드나 바이러스성 발현 벡터 등을 통하여 발현시켜 사용할 수 있다.
siRNA 특정 서열이 인터페론을 유도하는지 여부를 수지상 세포를 포함하는 사람의 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)에서 실험적으로 확인한 후 면역반응을 유발하지 않는 서열을 선별하여 후보 siRNA 서열로 선정할 수 있다.
이하, 상기 siRNA의 전달을 위한 약물전달시스템(DDS)을 설명한다.
siRNA의 세포 내 전달 효율을 높이기 위해서는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)이 활용될 수 있다.
세포 내로 핵산 물질을 전달하기 위한 핵산 전달체에는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등이 있다. 바이러스 벡터 (viral vector)로 전달 효율이 높고 지속 시간이 긴 이점이 있다. 상기 바이러스 벡터에는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 백시니아바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector), 암세포 용해성 바이러스 벡터 등이 포함된다. 비바이러스 벡터(nonviral vector)는 플라즈미드를 포함할 수 있다. 그 외에도 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 핵산 전달을 위한 양이온성 고분자에는 키토산, 아텔로콜라겐(atelocollagen), 양이온성 폴리펩타이드(cationic polypeptide) 등과 같은 천연고분자와 poly(L-lysin), 선형 또는 분지형 PEI(polyethylene imine), 사이클로덱스트린계열 다가양이온(cyclodextrin-based polycation), 덴드리머(dendrimer) 등과 같은 합성고분자가 포함된다.
본 발명의 siRNA 또는 siRNA와 핵산 전달체와의 복합체(약학적 조성물)는 암의 치료를 위해 in vivo 또는 ex vivo 상에서 세포 내로 도입될 수 있다. 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 siRNA 또는 siRNA와 핵산 전달체와의 복합체를 세포 내에 도입하게 되면 표적 단백질인 c-Met의 발현을 선택적으로 감소시키거나 표적 유전자에 생긴 변이를 수정하는 역할을 하여 암의 생성에 관여하는 c-Met의 발현이 억제되어 암세포가 사멸하고 암의 치료가 가능하게 된다.
본 발명의 siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 국소, 경구 또는 비경구적 등으로 투여하기 위해서 제제화할 수 있다. 구체적으로, siRNA의 투여는 눈의 점막, 질, 또는 항문 내 투여 포함을 하는 국소 투여, 또는 폐, 기관지, 비강, 외피, 내피 투여, 정맥, 동맥, 피하, 복강, 근육, 두개 (뇌경막 또는 뇌실) 등의 비경구 투여, 또는 경구 투여 등의 경로를 통할 수 있다. 국소 투여를 위하여, siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 패치와 연고, 로션, 크림, 젤, 적제, 좌약, 스프레이, 용액, 파우더 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비경구적 투여, 뇌경막 혹은 뇌실 내 투여를 위하여, siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 버퍼, 희석제, 투과 촉진제, 기타 통상적으로 약제학적으로 사용 가능한 전달체 혹은 부형제와 같은 적절한 첨가제을 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 siRNA를 주사용 조성물과 혼합하여 종양이 발생한 부위에 주사형태로 투여하거나, 겔 조성물 또는 경피흡수용 점착 조성물과 혼합하여, 직접 환부에 바르거나 붙여서 경피 경로로 투여할 수 있도록 구현함이 바람직하다. 상기 주사용 조성물은 특별한 제한은 없지만 등장성 수용액 또는 현탁액 형태인 것이 바람직하고, 멸균처리, 및/또는 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 및/또는 리포좀 제제)를 함유할 수 있다. 상기 겔 조성물은 카르복시메틸 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 아크릴산 중합체, 카르보폴(carbopol) 등의 통상적인 겔 제제와 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유하며, 상기 경피흡수용 점착 조성물은 유효성분층이 점착제층, 피지흡수를 위한 흡착층 및 치료약물층을 포함하고, 치료약물층은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 리포좀 제제를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 c-Met siRNA와 함께 항암 화학요법제를 추가로 포함하거나, 또는 성장인자, 성장 인자 수용체, 하위 신호전달 단백질, 바이러스성 종양유발인자, 및 항암제 내성 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것의 발현을 저해하는 siRNA를 추가로 포함할 수 있다.
이와 같이, c-Met siRNA와 함께 화학요법을 병용하여 화학요법제에 대한 민감도를 높임으로써 치료효과를 극대화하고 부작용을 감소시킬 수 있을 뿐 아니라, 각종 성장인자 (예컨대 VEGF, EGF, PDGF 등), 성장 인자 수용체 및 하위 신호전달 단백질, 바이러스성 종양유발인자, 항암제 내성 유전자의 발현을 저해하는 siRNA와 병용하여 암의 여러 경로를 동시에 차단함으로 항암효과를 극대화 할 수 있다.
본 발명의 c-Met의 발현을 억제하는 siRNA와 병용투여가 가능한 항암 화학요법제는 예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신 (idarubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 발루비신(valubicin), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예는 c-Met의 합성 및/또는 발현 억제를 위한 유효량의 상기 c-Met siRNA를 준비하는 단계; 및 상기 siRNA를 c-Met을 발현하는 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, c-Met 발현 및/또는 합성을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 c-Met의 합성 및/또는 발현 억제를 위한 유효량의 상기 c-Met siRNA를 준비하는 단계; 및 상기 siRNA를 c-Met을 발현하는 암세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 암세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 c-Met siRNA를 준비하는 단계; 및 상기 siRNA를 치료학적 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 암을 예방 및/또는 치료하는 방법은, 바람직하게는 상기 투여 단계 이전에 상기 siRNA의 투여 대상인 암의 예방 및/또는 치료가 요구되는 환자를 특정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서 치료 가능한 암은 대부분의 고형암 (폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 갑성선암, 식도암, 전립선암), 골육종, 연부조직육종, 신경교종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 환자는 포유 동물, 바람직하게는 사람, 원숭이, 설치류 (마우스, 래트 등) 등일 수 있으며, 특히 c-Met의 발현과 관련되는 질병이나 증상 (예컨대, 암)을 가지거나, c-Met 발현 억제를 필요로 하는 모두 포유 동물, 예컨대, 사람일 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA의 유효량은 c-Met 발현 또는 합성 억제 또는 이로 인한 암세포 성장 저해 및 암 치료 효과를 얻기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 증상의 정도, 투여되는 siRNA의 종류, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 치료 기간, 동시 사용되는 화학 항암제 등의 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 예컨대, 1일 투여 용량은 0.001 mg/kg ~ 100 ㎎/kg인 것이 좋고, 상기 용량은 한 번에 모두 투여되거나 수회에 걸쳐서 분량하여 투여될 수 있다.
본 발명의 c-Met 전사체(mRNA)의 염기서열에 상보적인 siRNA 또는 이의 화학적 변형된 구조는 리보핵산 매개 간섭현상(RNA-mediated interference, RNAi)에 의해 암세포에 공통적으로 발현되는 c-Met의 발현을 억제하여 암세포를 사멸시키므로, 우수한 항암 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 면역 반응을 최소한으로 유발할 수 있는 장점이 있다.
기존의 대부분의 약물이 이미 발현된 단백질의 기능을 억제하는 데 반하여, 본 발명의 RNAi 기전은 특정 질병 유발 단백질의 발현을 선택적 및 높은 활성으로 저해할 수 있을 뿐 아니라, 단백질이 합성되기 전 단계인 mRNA를 분해하므로 부작용을 유발하지 않고 암의 성장과 전이를 억제하여 보다 근원적인 암 치료 기술이 될 것으로 기대한다.
또한, c-Met siRNA와 함께 화학요법과 병용하여 화학요법제에 대한 민감도를 높임으로써 치료효과를 극대화하고 부작용을 감소시킬 수 있을 뿐 아니라, 각종 성장인자 (VEGF, EGF, PDGF 등), 성장 인자 수용체 및 하위 신호전달 단백질, 바이러스성 종양유발인자, 항암제 내성 유전자의 발현을 저해하는 siRNA와 병용하여 암의 여러 경로를 동시에 차단함으로 항암효과를 극대화 할 수 있는 부가적인 이점이 있다.
도 1a 내지 1d는 siRNA 처리에 따른 사이토카인 농도 변화를 보여주는 것으로, 1a는 인터페론 알파, 1b는 인터페론 감마, 1c는 인터류킨-12, 1d는 종양괴사인자의 농도를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하도록 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 대표적으로 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. c-
Met
발현 억제용
siRNA
가 결합할 수 있는
타겟
염기서열의 디자인
siDesign Center (Dharmacon), BLOCK-iTTM RNAi Designer (Invitrogen), AsiDesigner (KRIBB), siDirect (University of Tokyo) 및 siRNA Target Finder (Ambion)의 siRNA 디자인 프로그램을 사용하여 c-Met mRNA 서열(NM_000245) 가운데 siRNA가 결합할 수 있는 표적 염기서열을 도출하였다.
| 서열번호 | 서열 (5' -> 3') |
| 2 | GTAAAGAGGCACTAGCAAA |
| 3 | GCACTAGCAAAGTCCGAGA |
| 4 | CAGCAAAGCCAATTTATCA |
| 5 | CTATGATGATCAACTCATT |
| 6 | CAATCATACTGCTGACATA |
| 7 | CTCTAGATGCTCAGACTTT |
| 8 | TCTGGATTGCATTCCTACA |
| 9 | CTGGATTGCATTCCTACAT |
| 10 | GCACAAAGCAAGCCAGATT |
| 11 | CTGCTTTAATAGGACACTT |
| 12 | CAGGTTGTGGTTTCTCGAT |
| 13 | CTGGTTATCACTGGGAAGA |
| 14 | TTGGTCCTGCCATGAATAA |
| 15 | AGACAAGCATCTTCAGTTA |
| 16 | TCGCTCTAATTCAGAGATA |
| 17 | TCAGAGATAATCTGTTGTA |
| 18 | GTGAGAATATACACTTACA |
| 19 | GGTGTTGTCTCAATATCAA |
| 20 | CATTTGGATAGGCTTGTAA |
| 21 | CCAAAGGCATGAAATATCT |
실시예
2. c-
Met
발현 억제용
siRNA
의 제조
실시예 1에서 디자인한 표적 염기서열에 결합할 수 있는 siRNA 23종을 삼천리제약(한국)에 합성 의뢰하여 사용하였다. 23종의 siRNA의 서열은 표 6과 같이 양 가닥의 3' 말단에 dTdT를 포함하도록 하였다.
| 서열번호 | 서열 (5' -> 3') | 가닥 | siRNA 표시 |
| 22 | GUAAAGAGGCACUAGCAAAdTdT | Sense | siRNA 1 |
| 23 | UUUGCUAGUGCCUCUUUACdTdT | Antisense | |
| 24 | GCACUAGCAAAGUCCGAGAdTdT | Sense | siRNA 2 |
| 25 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdTdT | Antisense | |
| 26 | CAGCAAAGCCAAUUUAUCAdTdT | Sense | siRNA 3 |
| 27 | UGAUAAAUUGGCUUUGCUGdTdT | Antisense | |
| 28 | CUAUGAUGAUCAACUCAUUdTdT | Sense | siRNA 4 |
| 29 | AAUGAGUUGAUCAUCAUAGdTdT | Antisense | |
| 30 | CAAUCAUACUGCUGACAUAdTdT | Sense | siRNA 5 |
| 31 | UAUGUCAGCAGUAUGAUUGdTdT | Antisense | |
| 32 | CUCUAGAUGCUCAGACUUUdTdT | Sense | siRNA 6 |
| 33 | AAAGUCUGAGCAUCUAGAGdTdT | Antisense | |
| 34 | UCUGGAUUGCAUUCCUACAdTdT | Sense | siRNA 7 |
| 35 | UGUAGGAAUGCAAUCCAGAdTdT | Antisense | |
| 36 | CUGGAUUGCAUUCCUACAUdTdT | Sense | siRNA 8 |
| 37 | AUGUAGGAAUGCAAUCCAGdTdT | Antisense | |
| 38 | GCACAAAGCAAGCCAGAUUdTdT | Sense | siRNA 9 |
| 39 | AAUCUGGCUUGCUUUGUGCdTdT | Antisense | |
| 40 | CUGCUUUAAUAGGACACUUdTdT | Sense | siRNA 10 |
| 41 | AAGUGUCCUAUUAAAGCAGdTdT | Antisense | |
| 42 | CAGGUUGUGGUUUCUCGAUdTdT | Sense | siRNA 11 |
| 43 | AUCGAGAAACCACAACCUGdTdT | Antisense | |
| 44 | CUGGUUAUCACUGGGAAGAdTdT | Sense | siRNA 12 |
| 45 | UCUUCCCAGUGAUAACCAGdTdT | Antisense | |
| 46 | UUGGUCCUGCCAUGAAUAAdTdT | Sense | siRNA 13 |
| 47 | UUAUUCAUGGCAGGACCAAdTdT | Antisense | |
| 48 | AGACAAGCAUCUUCAGUUAdTdT | Sense | siRNA 14 |
| 49 | UAACUGAAGAUGCUUGUCUdTdT | Antisense | |
| 50 | UCGCUCUAAUUCAGAGAUAdTdT | Sense | siRNA 15 |
| 51 | UAUCUCUGAAUUAGAGCGAdTdT | Antisense | |
| 52 | UCAGAGAUAAUCUGUUGUAdTdT | Sense | siRNA 16 |
| 53 | UACAACAGAUUAUCUCUGAdTdT | Antisense | |
| 54 | GUGAGAAUAUACACUUACAdTdT | Sense | siRNA 17 |
| 55 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdTdT | Antisense | |
| 56 | GGUGUUGUCUCAAUAUCAAdTdT | Sense | siRNA 18 |
| 57 | UUGAUAUUGAGACAACACCdTdT | Antisense | |
| 58 | CAUUUGGAUAGGCUUGUAAdTdT | Sense | siRNA 19 |
| 59 | UUACAAGCCUAUCCAAAUGdTdT | Antisense | |
| 60 | CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdTdT | Sense | siRNA 20 |
| 61 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdTdT | Antisense | |
| 62 | CUAGCAAAGUCCGAGA | Sense | siRNA 21 |
| 25 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdTdT | Antisense | |
| 63 | AGAAUAUACACUUACA | Sense | siRNA 22 |
| 55 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdTdT | Antisense | |
| 64 | GAUUGCAUUCCUACAU | Sense | siRNA 23 |
| 61 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdTdT | Antisense |
실시예
3:
siRNA
를 이용한 종양 세포주에서의 c-
Met
의 발현억제 시험
상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA를 이용하여, 종양 세포주인 인간 폐암 세포주(A549, ATCC)와 인간 간암 세포주(SK-Hep-1, ATCC)를 형질전환시키고, 형질전환된 종양 세포주에서 c-Met의 발현양상을 측정하였다.
실시예
3-1. 종양 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암 세포주(A549), 인간 간암 세포주(SK-Hep-1)를 10% 우태아 혈청, 페니실린(100units/ml) 및 스트렙토마이신(100ug/ml)을 포함한 RPMI 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA)에서 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예
3-2. c-
Met
발현 억제용
siRNA
와
리포좀의
복합체 제조
실시예 2의 siRNA 1 내지 23의 23개 siRNA 10nM을 각각 포함한 Opti-MEM 배지 (Gibco) 25ul와 웰(well)당 0.4ul의 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen)을 포함한 Opti-MEM 배지를 같은 부피로 혼합하여 상온에서 20분간 반응시켜 siRNA와 리포좀과의 복합체를 각각 제조하였다.
실시예
3-3. c-
Met
타겟
siRNA
를 이용한 종양 세포주에서의 c-
Met
mRNA
발현 억제
상기 실시예 3-1에서 배양한 폐암 세포주와 간암 세포주를 96웰-플레이트에 각각 웰당 세포를 104 세포수 씩 분주(seeding)하였다. 24시간 후에 배지를 제거하고 Opti-MEM 배지를 웰(well)당 50μl씩 첨가하였다. 상기 실시예 3-2에서 제조한 siRNA와 리포좀의 복합체 조성물 50μl를 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소가 유지되는 세포 배양기에 배양하였다.
c-Met mRNA 발현이 50% 저해되는 약물농도인 IC50 수치의 계산을 위해서 폐암 세포주(A-549)에 각각의 siRNA를 0.0064nM 내지 100nM 사이의 7개의 농도 범위로 처리하였다.
실시예
3-4. c-
Met
mRNA
의 정량 분석_폐암세포
siRNA 리포좀 복합체에 의해 발현 억제된 c-Met mRNA의 발현 정도는 Quantigene 2.0 system(Panomics 사)를 이용한 bDNA 측정법으로 측정하였다.
10nM의 siRNA 리포좀 복합체를 인간 폐암 세포주에 24시간 처리한 후, mRNA를 정량하였다. 제조사의 프로토콜 대로 96-웰 플레이트 한 웰(well)당 100μl의 Lysis mixture(Panomics, Quantigene 2.0 bDNA kit)를 처리하여 50℃에서 1시간 동안 세포를 용해시켰다. Panomics 사에서 c-Met의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브(Panomics, Cat.# SA-10157)를 구매하여, 얻어진 세포 샘플 중 80μl와 함께 96웰 플레이트에 혼합하였다. mRNA가 웰에 고정되고 프로브와 결합할 수 있도록 55℃에서 16시간 내지 20시간 동안 반응을 시켰다. 이어 각 웰에 키트의 증폭 작용 시약 100μl를 넣고 55℃에서 반응을 시키고 세척하는 과정을 두 단계 수행하였다. 세 번째 증폭 작용 시약 100μl를 넣고 50℃에서 반응을 시킨 후 발광을 유도하는 시약을 100μl 넣고 5분 후에 형광 및 발광 측정기(Bio-Tek, Synergy-HT)에 넣고 발광값을 측정하여 lipofectamine만 처리한 대조군의 발광값(100%)에 대한 백분율 값을 산출하고 표 7에 나타내었다. 이 백분율은 대조군과 각 siRNA를 처리한 시험군에서의 c-Met mRNA의 발현율을 나타낸다.
표 7에서 보듯이, 20종 siRNA 가운데, c-Met 발현을 40% 이하로 억제시키는 siRNA가 16종, 40% 이상 70% 이하로 억제 효과를 보이는 siRNA가 1종, 70% 이상 억제 효과를 보이는 siRNA가 3종임을 확인하였다.
| 서열번호 | 서열 (5' -> 3') | siRNA번호 | c-Met mRNA발현율 (%) |
| 2 | GAAAGAGGCACTAGCAAA | 1 | 66.7 |
| 3 | GCACTAGCAAAGTCCGAGA | 2 | 22.7 |
| 4 | CAGCAAAGCCAATTTATCA | 3 | 69.2 |
| 5 | CTATGATGATCAACTCATT | 4 | 81.4 |
| 6 | CAATCATACTGCTGACATA | 5 | 68.5 |
| 7 | CTCTAGATGCTCAGACTTT | 6 | 71.5 |
| 8 | TCTGGATTGCATTCCTACA | 7 | 81.8 |
| 9 | CTGGATTGCATTCCTACAT | 8 | 99.8 |
| 10 | GCACAAAGCAAGCCAGATT | 9 | 84.6 |
| 11 | CTGCTTTAATAGGACACTT | 10 | 68.0 |
| 12 | CAGGTTGTGGTTTCTCGAT | 11 | 68.8 |
| 13 | CTGGTTATCACTGGGAAGA | 12 | 67.1 |
| 14 | TTGGTCCTGCCATGAATAA | 13 | 71.7 |
| 15 | AGACAAGCATCTTCAGTTA | 14 | 55.5 |
| 16 | TCGCTCTAATTCAGAGATA | 15 | 68.1 |
| 17 | TCAGAGATAATCTGTTGTA | 16 | 99.9 |
| 18 | GTGAGAATATACACTTACA | 17 | 12.8 |
| 19 | GGTGTTGTCTCAATATCAA | 18 | 60.5 |
| 20 | CATTTGGATAGGCTTGTAA | 19 | 115.4 |
| 21 | CCAAAGGCATGAAATATCT | 20 | 26.6 |
상기 표 7에서 우수한 유전자 발현 억제 효과를 가지는 3종의 siRNA 2, 17, 및 20번에 대해 A549 세포주를 사용하여 100nM에서 0.0064nM 범위로 c-Met mRNA 발현감소효과를 조사하여 IC50을 구하여 아래의 표 8에 나타내었다. IC50 수치는 Spectra Max 190 (ELISA 기기) 모델에서 지원되는 SofrMax pro software를 이용하여 계산하였다. siRNA 2, 17 및 20의 IC50 수치를 siRNA 14 및 15와 비교하였을 때, 5 내지 100배 가량 우수함을 알 수 있다.
| siRNA 서열번호 | siRNA 번호 | 대응 mRNA 서열번호 | A549 (IC50 : nM) |
| 24, 25 | 2 | 3 | 0.29 |
| 54, 55 | 17 | 18 | 0.87 |
| 60, 61 | 20 | 21 | 0.75 |
| 48, 49 | 14 | 15 | 4.35 |
| 50, 51 | 15 | 16 | 29 |
실시예
3-5. c-
Met
mRNA
의 정량 분석_간암세포
서열번호 3, 18, 21을 표적으로 하는, 대칭 구조의 siRNA 2, 17, 및 20과 센스가닥이 안티센스 가닥보다 짧은 비대칭구조의 siRNA인 siRNA 21, 22, 23을 4nM 농도로 간암 세포주인 SK-Hep-1에 처리하고 c-Met mRNA 억제효능을 조사하여 아래의 표 9에 나타내었다. 실험 방법은 실시예 3-4에서와 같은 방식으로 하였다.
| siRNA 서열번호 | siRNA 번호 | 구조적 특징 | c-Met 발현율(%) |
| 24, 25 | 2 | 대칭 | 35.7 |
| 62, 25 | 21 | 비대칭 | 31.3 |
| 54, 55 | 17 | 대칭 | 32.3 |
| 64, 55 | 22 | 비대칭 | 43.8 |
| 60, 61 | 20 | 대칭 | 40.8 |
| 66, 61 | 23 | 비대칭 | 60.8 |
표 9에 나타난 바와 같이, 서열번호 3, 18, 및 21을 표적으로 하는 경우, 비대칭 구조 siRNA에서도 대칭구조 siRNA와 유사한 정도로 c-Met 발현을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
실시예
4.
siRNA
에 의한 세포 증식 억제 시험
siRNA 2, 14 및 15에 의한 세포 증식 억제 효과를 측정하였다. 인간 폐암 세포주 A549를 96웰-플레이트에 웰(well)당 2.5 X 103 세포수를 분주(seeding)한 24시간 후에 웰(well)당 0.4μl에 실시예 3-2의 방법으로 제조한 siRNA 리포좀 복합체를 siRNA 농도별로 Opti-MEM 배지에서 실시예 3-3의 방법과 같이 첨가하였다. 첨가한 후 24시간째에 신선한 세포 배양 배지 200μl로 교체해 주고 5일 동안 37℃, 5% 이산화탄소가 유지되는 세포 배양기에 유지시켰다. 이후, TCA(Trichloroacetic acid)로 30분간 고정(fixation)시켜 SRB(Sulforhodamine B, Sigma)로 30분간 실온에서 염색하였다. 10%(v/v) 아세트산으로 웰(well)을 4~5회 세척한 후에 자연 건조시키며 하루를 둔 후에 10mM짜리 unbuffered tris 용액 (Sigma) 200μl를 넣고 흡광도 측정기(Bio-Tek, Synergy-HT)를 사용하여 540nm에서의 흡광도를 측정하여 Lipofectamine만 처리한 대조군(100%)의 흡광도에 대한 백분율 값을 산출하였다.
이 백분율은 대조군과 비교한 siRNA 2, 14, 15의 siRNA를 처리한 시험군에서의 세포 증식율을 의미한다. siRNA 처리 농도별로 산정된 백분율 수치를 이용하여 IC50 값을 구하여 아래의 표 10에 나타내었다. 표 10에 나타낸 바와 같이 siRNA 2의 IC50치가 siRNA 14 및 15보다 20~50배의 낮은 수치를 보여, siRNA 2의 세포증식 저해 효능이 20~50배의 월등히 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 siRNA 2는 c-Met mRNA 발현을 감소시킬 뿐 아니라, c-Met 발현감소에 따른 암세포의 증식억제를 직접적으로 유발시켜 월등히 우수한 항암효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
| 서열 번호 | siRNA 번호 | IC50 (nM) |
| 48, 49 | 14 | 116 |
| 50, 51 | 15 | 50.8 |
| 24, 25 | 2 | 2.44 |
실시예
5.
siRNA
에 의한 면역 활성 사이토카인 유리 억제 효과
본 발명의 siRNA가 면역독성이 있는지를 평가하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다.
실시예
5-1.
말초혈액단핵세포
준비
사람의 말초혈액단핵세포 (PBMC)는 시험 당일 건강한 지원자로부터 공급받은 혈액에서 히스토페이크 1077 시약(Histopaque 1077)(Sigma, St Louis, MO, USA)을 사용하여 밀도기울기원심분리법(density gradient centrifugation)을 이용하여 분리하였다(Boyum A. Seperation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Invest 21(Suppl97):77,1968). 혈액은 1:1 비율로 서로 섞이지 않도록 15ml 튜브에 분주된 히스토페이크 1077(Histopaque 1077) 시약 위에 조심스럽게 넣었다. 400 x g, 상온에서 30분간 원심분리한 후, 멸균 파이펫으로 PBMC가 포함된 층만을 분리하였다. 분리된 PBMC가 담긴 튜브에 10ml의 인산염 완충액 (Phosphate buffered saline: PBS)를 넣은 다음 250 x g에서 10분간 원심분리하고, 5ml의 PBS로 두 번 더 PBMC를 씻어 주었다. 분리된 PBMC는 혈청이 포함되지 않은 배지인 x-vivo 15(Lonza, Walkersville, MD, USA)배지로 4 x 106 세포/ml가 되도록 부유시킨 다음 96-웰 플레이트에 웰(well)당 100ul씩 분주하였다.
실시예
5-2.
siRNA
-
DOTPA
복합체 제조
상기 실시예 5-1에서 준비된 PBMC 세포에 분주하기 위한 siRNA-DOTPA 복합체를 다음과 같은 방법으로 제조하였다. DOTAP 트랜스펙션(transfection) 시약(ROCHE, Germany) 5ul와 x-vivo 15배지 45ul 및 siRNA 1ul(50uM)과 x-vivo 15배지 49ul를 각각 혼합하여 제조한 다음 10분간 실온에서 반응시켰다. 10분 후 DOTAP이 포함된 용액과 siRNA가 포함된 용액을 혼합한 후 20분간 20~25℃에서 반응시켰다.
실시예
5-3. 세포의 배양
분주된 PBMC 배양액 100uL에 실시예 5-2의 방법에 따라 제조된 siRNA 2, 14 및 15의 siRNA-DOTAP 복합체를 웰당 100ul씩 첨가한 후(siRNA 최종 농도 250nM), 37℃의 CO2 세포배양기에서 18시간 배양하였다. 대조군으로 siRNA-DOTAP 복합체를 처리하지 않은 세포 배양군 및 siRNA를 포함하지 않은 채 DOTAP만이 처리된 세포 배양군을 사용하였으며, 양성대조군으로는 siRNA 대신 면역반응을 유발한다고 알려진 물질인 Poly I:C (Polyinosinic-polycytidylic acid postassium salt, Sigma, USA) 및 APOB-1 siRNA (sense GUC AUC ACA CUG AAU ACC AAU (서열번호 99), antisense : *AUU GGU AUU CAG UGU GAU GAC AC (서열번호 100), *: 5' phosphates, 삼천리제약)을 상기 실시예 5-2와 동일한 방법으로 DOTAP과 복합체를 만들어 처리한 세포 배양군을 사용하였다. 배양 후 세포 상층액만을 분리하였다.
실시예
5-4. 면역활성의 측정
상층액 내에 포함되어 있는 인터페론 알파 및 감마 (INF-a, 및 INF-γ), 종양괴사인자(TNF-a), 인터류킨-12(IL-12)의 함량은 Procarta Cytokine assay kit (Affimetrix, USA)를 사용하여 측정하였다. 즉, 각 cytokine에 대한 항체가 부착된 bead (antibody bead) 50ul를 필터 플레이트 (filter plate)에 옮겨 세정 완충액 (wash buffer)으로 1회 세척한 후 50ul의 PBMC 배양액의 상층액 및 cytokine 표준액을 분주하여 상온에서 60분간 500rpm에서 흔들면서 배양하였다.
이후, 세정 완충액으로 1회 세척하고, 키트내 포함된 검출용(detection) 항체 25ul를 분주하여 500rpm에서 흔들면서 30분간 상온에서 반응시켰다. 다시 감압 하에 반응액을 제거하고 세정한 후 키트내 포함된 streptavidin-PE(streptavidin phycoerythrin) 50ul를 분주하여 500rpm에서 흔들면서 상온에서 30분간 반응시킨 후 감압 하에 반응액을 제거하고 3회 세정을 하는 단계를 거쳤다. 120ul의 측정 완충액(reading buffer)을 분주하여 500rpm에서 5분간 흔들어 준 후에 Luminex 기기(Bioplex luminex system, Biorad, USA)를 사용하여 각 cytokine bead별 PE 형광 정도를 측정하여 그 결과를 도 1a-1d에 표시하였다. 시료중의 Cytokine 농도는 1.22~20,000 pg/ml 범위의 표준검량곡선으로부터 계산하였다.
도 1a-1d에서 'Medium'은 아무 것도 처리하지 않은 대조군, 'DOTAP'은 DOTAP 단독처리군, 'POLY I:C' 또는 'APOB-1'는 양성대조물질 처리군, 'siRNA 2'는 서열번호 24 및 25의 siRNA를 처리한 시험군, 'siRNA 14'는 서열번호 48 및 49의 siRNA 및 'siRNA 15'는 서열번호 50 및 51의 siRNA를 처리한 시험군을 나타낸다. 도 1a-1d를 통해 PBMC에서 분비되는 사이토카인의 수준을 알 수 있는데, 1a는 인터페론 알파, 1b는 인터페론 감마, 1c는 인터류킨-12, 1d는 종양괴사인자를 나타낸 것이다.
siRNA 2는 대조군 및 DOTAP 단독 처리군에 비해 모든 사이토카인에서 매우 약한 수준의 증가만을 나타내었으며, 양성대조물질로 사용된 POLY I:C 및 APOB-1에 의해 유도된 사이토카인의 증가량에 비하면 거의 미미한 수준의 증가이다. 또한 siRNA 14 및 siRNA 15과 비교하면 인터페론 알파와 인터페론 감마, 특히 인터페론 알파의 증가가 현저히 낮음을 알 수 있다. 따라서 siRNA 2는 사람의 PBMC에서 거의 면역활성을 유발하지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예
6. 화학적 변형된 c-
Met
발현 억제용
siRNA
의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 siRNA 2, 17 및 20를, 상술한 표 4에 나타난 바와 같이 6가지 형태(mod1~6)로 화학적 구조가 변형되도록 디자인하고, 디자인한 화학적 변형 siRNA는 삼천리 제약(한국)에 합성 의뢰하여 사용하였다. 화학적으로 변형된 17종의 siRNA를 하기 표 11에 나타냈으며, 화학적 변형의 표기법은 상술한 표 3과 같다.
| 서열번호 | 서열 (5'→ 3') | siRNA 표시 | |
| 65 | GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT*dT | siRNA24 | siRNA 2 -mod1 |
| 66 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT | ||
| 67 | GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT*dT | siRNA25 | siRNA 2 -mod2 |
| 68 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT | ||
| 69 | GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT*dT | siRNA26 | siRNA 2 -mod3 |
| 70 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT | ||
| 71 | GCACuAGCAAAGuCCGAGAdT*dT | siRNA27 | siRNA 2 -mod4 |
| 72 | UCuCGGACuUUGCuAGuGCdT*dT | ||
| 73 | G CACUAGCAAAGUCCGAGAdT*dT | siRNA28 | siRNA 2 -mod5 |
| 74 | UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT | ||
| 75 | GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT | siRNA29 | siRNA 17 -mod1 |
| 76 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT | ||
| 77 | GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT | siRNA30 | siRNA 17 -mod2 |
| 78 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT | ||
| 79 | GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT | siRNA31 | siRNA 17 -mod3 |
| 80 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT | ||
| 81 | GuGAGAAuAuACACuuACAdT*dT | siRNA32 | siRNA 17 -mod4 |
| 82 | UGuAAGuGuAUAuuCuCACdT*dT | ||
| 83 | G UGAGAAUAUACACUUACAdT*dT | siRNA33 | siRNA 17 -mod5 |
| 84 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT | ||
| 85 | GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT | siRNA34 | siRNA 17 -mod6 |
| 86 | UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT | ||
| 87 | CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT | siRNA35 | siRNA 20 -mod1 |
| 88 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT | ||
| 89 | CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT | siRNA36 | siRNA 20 -mod2 |
| 90 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT | ||
| 91 | CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT | siRNA37 | siRNA 20 -mod3 |
| 92 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT | ||
| 93 | CCAAAGGCAuGAAAuAuCudT*dT | siRNA38 | siRNA 20 -mod4 |
| 94 | AGAuAuuuCAUGCCuuuGGdT*dT | ||
| 95 | C CAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT | siRNA39 | siRNA 20 -mod5 |
| 96 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT | ||
| 97 | CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT | siRNA40 | siRNA 20 -mod6 |
| 98 | AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT | ||
실시예
7. 화학적 변형
siRNA
를 이용한 종양 세포주에서의 c-
Met
mRNA
발현 억제 시험
siRNA를 화학적 구조 변형을 시켰을 때에도 종양 세포주에서 mRNA 억제 효능이 유지되는지를 확인하고자, 화학적 구조변형 하지 않은 상기 실시예 2의 siRNA (siRNA 2, 17 및 20)와, 화학적 구조변형을 한 상기 실시예 6의 siRNA 24 내지 40의 총 17개 siRNA를 사용한 것 외에는 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 리포좀 복합체를 제조하여 인간 폐암 세포주(A549, ATCC)를 형질전환 시키고 (10nM siRNA), 형질전환된 종양 세포주에서 c-Met의 발현양상을 실시예 3-4와 동일하게 정량분석하고, 그 결과를 아래의 표 12에 나타내었다. 표 12에서, mod0은 화학적 구조 변형을 하지 않은 상태의 siRNA를 나타내며, ND는 측정되지 않음을 나타낸다.
| siRNA 2 | siRNA 17 | siRNA 20 | |
| mod0 | 20.28 | 13.00 | 12.23 |
| mod1 | 18.04 | 38.90 | 44.91 |
| mod2 | 18.74 | 20.70 | 24.61 |
| mod3 | 19.67 | 16.10 | 25.71 |
| mod4 | 34.06 | 22.00 | 60.02 |
| mod5 | 18.76 | 16.60 | 23.06 |
| mod6 | ND | 15.50 | 20.00 |
상기 표 12에서 보듯이. siRNA 2, 17 및 20을 화학적 구조 변형을 시켰을 때에도 종양 세포주에서 mRNA 억제 효능이 유지됨을 알 수 있었다. 특히, mod2, mod3, mod5 그리고 mod6의 경우 화학적 구조 변형을 하지 않은 siRNA와 비교할 때 동등 또는 유사한 효능을 보였다.
실시예
8. 화학적 변형
siRNA
의 면역 활성 사이토카인 유리 억제 시험
화학적 구조 변형에 의한 siRNA의 면역독성 감소 정도를 확인하기 위하여 siRNA 번호 2, 17 및 20번을 각각 mod1 - mod6까지 구조 변형시킨 후 사람의 말초혈액단핵세포(PBMC)에 처리하여 유리되는 사이토카인을 정량하였다. 시험은 상기 실시예 5의 방법과 동일하게 실시하였고, PBMC에서 유리된 사이토카인(인터페론 알파, 인터페론 감마, 인터류킨-12, 종양괴사인자)의 배양액 중의 농도를 정량하여 아래 표 13에 나타내었다. 표 13 에서 ‘Medium'은 아무것도 처리하지 않은 대조군, ‘DOTAP'은 DOTAP 단독처리군, 'POLY I:C' 또는 'APOB-1'은 양성대조물질 처리군, 'siRNA2’는 siRNA 2에 mod0~5을 처리한 시험군, ‘siRNA17’은 siRNA 17에 mod0~6을 처리한 시험군, ‘siRNA20’은 siRNA 20에 mod0~6을 처리한 시험군을 나타낸다. mod0은 화학적 구조 변형을 하지 않은 상태의 siRNA를 나타내며, mod1~6은 표 4에서 설명한 바와 같다.
| INF-alpha | INF-gamma | IL-12p 40 | TNF-alpha | ||
| MEDIUM | <1.2 | 10.9 | 15 | 32.6 | |
| DOTAP | 9.1 | 18.3 | 43.4 | 131.0 | |
| siApoB-1 | 690.7 | - | - | - | |
| POLY I:C | - | 46.9 | 398.3 | 2691.5 | |
| siRNA 2 | mod0 | 6.0 | 6.3 | 45.3 | 96.8 |
| mod1 | 11.1 | 6.3 | 65.8 | 128.2 | |
| mod2 | 21.4 | 50.5 | 75.2 | 154.1 | |
| mod3 | 8.7 | 7.3 | 67.3 | 124.9 | |
| mod4 | 7.8 | 11.8 | 54.6 | 94.2 | |
| mod5 | 7.8 | 8.3 | 73.6 | 147.4 | |
| siRNA 17 | mod0 | 1091.3 | 21.5 | 29.8 | 146.0 |
| mod1 | 413.2 | 16.3 | 30.0 | 136.9 | |
| mod2 | 23.9 | 11.8 | 88.8 | 181.0 | |
| mod3 | 4.0 | 10.1 | 78.0 | 140.1 | |
| mod4 | 7.0 | 8.3 | 59.1 | 93.9 | |
| mod5 | 60.3 | 10.1 | 59.1 | 147.4 | |
| mod6 | 10.1 | 1.9 | 20.1 | 84.9 | |
| siRNA 20 | mod0 | 597.7 | 16.6 | 37.5 | 136.3 |
| mod1 | 6.0 | 10.1 | 57.4 | 153.6 | |
| mod2 | 6.5 | 14.9 | 61.0 | 108.5 | |
| mod3 | 8.7 | 8.3 | 60.5 | 115.6 | |
| mod4 | 6.5 | 10.1 | 53.8 | 87.0 | |
| mod5 | 23.9 | 13.4 | 73.1 | 161.6 | |
| mod6 | 21.4 | 1.9 | 27.9 | 103.9 |
상기 표 13에서 보듯이, siRNA 2의 경우 구조 변형에 상관없이 대조군 및 DOTAP 단독처리군에 비해 모든 사이토카인에서 변화가 없거나 매우 낮은 수준의 증가만을 나타내었다.
반면 siRNA 17 및 20의 경우, 화학적 구조변형에 의해 인터페론 알파의 수준이 급격하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 그 외 나머지 사이토카인들은 큰 변화가 없거나 매우 낮은 수준의 증가만을 나타내었다. 따라서 siRNA 17 및 20의 경우에서 화학적 구조변형을 함으로써 면역활성을 현저히 감소시킬 수 있음을 확인 할 수 있었다.
실시예
9. 화학적 변형
siRNA
의 센스(
sense
) 가닥에 의한
타겟
이외의(
off
-target) 효과의 억제 시험
본 발명의 siRNA의 화학적 구조 변형을 통해 센스 가닥에 의한 타겟 이외의 효과를 제거할 수 있는지를 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다.
실시예
9-1. 반딧불이
루시페라제
벡터(
firefly
luciferase
vector
) 준비
반딧불이 루시페라제를 발현하는 pMIR-REPORT(Ambion) 벡터에 각각의 siRNA에 대해, 안티센스 가닥에 상보적인 서열 및 센스 가닥에 상보적인 서열을 각각 클로닝해 넣어 두 개의 다른 플라즈미드를 각각 준비하였다. 상기 상보적인 서열은 코스모진텍에 의뢰하여 양쪽 끝에 SpeI과 HindIII의 제한효소 자리 돌출(overhang)을 가지도록 디자인하여 합성한 후에 pMIR-REPORT 벡터의 SpeI과 HindIII 제한효소 자리를 이용하여 클로닝해 넣었다.
실시예
9-2.
siRNA
의 화학적 구조변형을 통한
타겟
이외의(
off
-
target
) 효과의 억제 측정
상기 실시예 9-1에서 준비된, siRNA의 센스와 안티센스 각 가닥의 상보적인 서열이 포함된 플라즈미드를 이용하여 siRNA의 안티센스와 센스 가닥의 효능 정도를 측정하였다. 센스 가닥에 의한 타겟 이외의(off-target) 효과가 일어나는 정도는, 센스 가닥이 RISC 와 결합하여 센스 가닥과 상보적인 염기서열을 가진 서열에 작용할 경우에, 센스 가닥의 상보적인 서열을 가진 반딧불이 루시페라제 플라즈미드에 의해 발현되는 루시페라제 양이 siRNA를 처리하지 않은 세포에 비해서 감소함을 확인함으로써 알 수 있다. 또한 안티센스의 상보적인 서열을 가진 반딧불이 루시페라제 플라즈미드를 처리한 세포에 대해서는 siRNA에 의해서 나타나는 루시페라제의 감소 정도로 안티센스에 의한 siRNA의 효능이 화학적 구조변형을 한 후에 어느 정도 유지되는지를 확인할 수 있다.
구체적으로, 반딧불이 루시페라제 벡터(firefly luciferase vector)를 siRNA와 함께 HeLa와 A549 세포(ATCC) 내에 트랜스팩션(transfection) 시킨 후에 발현되는 반딧불이 루시페라제의 양을 루시페라제 어세이(luciferase assay)로 측정하였다. 트랜스펙션(transfection) 하루 전에 HeLa와 A549 세포주를 24well plate에 6*10^4 cells/well로 준비하였다. 상보적인 염기서열이 클로닝된 루시페라제 벡터 (100ng)를 siRNA (10nM)와 보정 벡터인 레닐라 루시페라제(renilla luciferase)를 발현하는 pRL-SV40벡터(2ng, Promega)와 함께 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)(Invitrogen)을 이용하여 Opti-MEM 배지(Gibco)에서 트랜스펙션시켰다. 세포들은 트랜스펙션 24시간 후에 자연형 용해 버퍼(Passive lysis buffer, Promega)를 이용하여 용해(lysis)시킨 후 듀얼 루시페라제 어세이 키트(Dual luciferase assay kit, Promega)로 루시페라제 활성(luciferase activity)을 측정하였다.
반딧불이 루시페라제 측정치는 레닐라 루시페라제(renilla luciferase) 측정치로 트랜스펙션 효율을 보정한 후, siRNA 없이 각 가닥의 상보적인 서열을 클로닝해 넣은 반딧불이 루시페라제 벡터와 레닐라 루시페라제 벡터만 트랜스펙션시킨 대조군의 보정된 루시페라제 수치(100%)에 대한 백분율 값을 산출하여 하기 표 14에 나타냈다. 표 14에서 mod0은 화학적 구조 변형을 하지 않은 상태의 siRNA를 나타내며, mod1~6은 표 4에서 설명한 바와 같다.
| siRNA 번호 |
화학적 변형 구조 이름 |
루시페라제 활성(Luciferase activity(%)) | |||
| HeLa | A549 | ||||
| 센스가닥에 상보적인 서열 포함 플라즈미드 | 안티센스가닥에 상보적인 서열 포함 플라즈미드 | 센스가닥에 상보적인 서열 포함 플라즈미드 | 안티센스가닥에 상보적인 서열 포함 플라즈미드 | ||
| 2 | mod0 | 118.4 | 9.1 | 139.3 | 5.9 |
| 20 | mod0 | 21.08 | 7.68 | 17.56 | 7.08 |
| mod1 | 8.19 | 30.29 | 9.6 | 65.01 | |
| mod2 | 48.38 | 12.45 | 80.91 | 26.14 | |
| mod3 | 31.34 | 19.03 | 38.23 | 15.81 | |
| mod4 | 12.23 | 47.58 | 16.27 | 56.91 | |
| mod5 | 56.73 | 8.14 | 63.49 | 17.64 | |
상기 표 14에서 보듯이, 사람의 폐암세포주 A549와 자궁경부암세포주 Hela 모두 siRNA 2의 경우 화학적 구조 변형을 하지 않은 siRNA(mod0) 그 자체로도 센스 가닥에 의한 타겟 이외의 효과가 없었다. 그러나 siRNA 20은 센스가닥에 상보적인 서열을 가지는 반딧불이 루시페라제의 활성이 감소하는 것을 통해 센스 가닥에 의한 off-target 효과를 보였으나, 화학적 구조변형 시킨 경우 특히, mod 2 및 5에서 센스 가닥의 효과가 확연히 감소하였다. 즉, 안티센스의 효과는 그대로 유지되면서 센스 가닥의 효과는 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
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factor receptor)(MET), transcript variant 2, mRNA
<400> 1
gccctcgccg cccgcggcgc cccgagcgct ttgtgagcag atgcggagcc gagtggaggg 60
cgcgagccag atgcggggcg acagctgact tgctgagagg aggcggggag gcgcggagcg 120
cgcgtgtggt ccttgcgccg ctgacttctc cactggttcc tgggcaccga aagataaacc 180
tctcataatg aaggcccccg ctgtgcttgc acctggcatc ctcgtgctcc tgtttacctt 240
ggtgcagagg agcaatgggg agtgtaaaga ggcactagca aagtccgaga tgaatgtgaa 300
tatgaagtat cagcttccca acttcaccgc ggaaacaccc atccagaatg tcattctaca 360
tgagcatcac attttccttg gtgccactaa ctacatttat gttttaaatg aggaagacct 420
tcagaaggtt gctgagtaca agactgggcc tgtgctggaa cacccagatt gtttcccatg 480
tcaggactgc agcagcaaag ccaatttatc aggaggtgtt tggaaagata acatcaacat 540
ggctctagtt gtcgacacct actatgatga tcaactcatt agctgtggca gcgtcaacag 600
agggacctgc cagcgacatg tctttcccca caatcatact gctgacatac agtcggaggt 660
tcactgcata ttctccccac agatagaaga gcccagccag tgtcctgact gtgtggtgag 720
cgccctggga gccaaagtcc tttcatctgt aaaggaccgg ttcatcaact tctttgtagg 780
caataccata aattcttctt atttcccaga tcatccattg cattcgatat cagtgagaag 840
gctaaaggaa acgaaagatg gttttatgtt tttgacggac cagtcctaca ttgatgtttt 900
acctgagttc agagattctt accccattaa gtatgtccat gcctttgaaa gcaacaattt 960
tatttacttc ttgacggtcc aaagggaaac tctagatgct cagacttttc acacaagaat 1020
aatcaggttc tgttccataa actctggatt gcattcctac atggaaatgc ctctggagtg 1080
tattctcaca gaaaagagaa aaaagagatc cacaaagaag gaagtgttta atatacttca 1140
ggctgcgtat gtcagcaagc ctggggccca gcttgctaga caaataggag ccagcctgaa 1200
tgatgacatt cttttcgggg tgttcgcaca aagcaagcca gattctgccg aaccaatgga 1260
tcgatctgcc atgtgtgcat tccctatcaa atatgtcaac gacttcttca acaagatcgt 1320
caacaaaaac aatgtgagat gtctccagca tttttacgga cccaatcatg agcactgctt 1380
taataggaca cttctgagaa attcatcagg ctgtgaagcg cgccgtgatg aatatcgaac 1440
agagtttacc acagctttgc agcgcgttga cttattcatg ggtcaattca gcgaagtcct 1500
cttaacatct atatccacct tcattaaagg agacctcacc atagctaatc ttgggacatc 1560
agagggtcgc ttcatgcagg ttgtggtttc tcgatcagga ccatcaaccc ctcatgtgaa 1620
ttttctcctg gactcccatc cagtgtctcc agaagtgatt gtggagcata cattaaacca 1680
aaatggctac acactggtta tcactgggaa gaagatcacg aagatcccat tgaatggctt 1740
gggctgcaga catttccagt cctgcagtca atgcctctct gccccaccct ttgttcagtg 1800
tggctggtgc cacgacaaat gtgtgcgatc ggaggaatgc ctgagcggga catggactca 1860
acagatctgt ctgcctgcaa tctacaaggt tttcccaaat agtgcacccc ttgaaggagg 1920
gacaaggctg accatatgtg gctgggactt tggatttcgg aggaataata aatttgattt 1980
aaagaaaact agagttctcc ttggaaatga gagctgcacc ttgactttaa gtgagagcac 2040
gatgaataca ttgaaatgca cagttggtcc tgccatgaat aagcatttca atatgtccat 2100
aattatttca aatggccacg ggacaacaca atacagtaca ttctcctatg tggatcctgt 2160
aataacaagt atttcgccga aatacggtcc tatggctggt ggcactttac ttactttaac 2220
tggaaattac ctaaacagtg ggaattctag acacatttca attggtggaa aaacatgtac 2280
tttaaaaagt gtgtcaaaca gtattcttga atgttatacc ccagcccaaa ccatttcaac 2340
tgagtttgct gttaaattga aaattgactt agccaaccga gagacaagca tcttcagtta 2400
ccgtgaagat cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa tcttttatta gtggtgggag 2460
cacaataaca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt gtcccgagaa tggtcataaa 2520
tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa catcgctcta attcagagat 2580
aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg caactccccc tgaaaaccaa 2640
agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt gatctcattt atgtacataa 2700
tcctgtgttt aagccttttg aaaagccagt gatgatctca atgggcaatg aaaatgtact 2760
ggaaattaag ggaaatgata ttgaccctga agcagttaaa ggtgaagtgt taaaagttgg 2820
aaataagagc tgtgagaata tacacttaca ttctgaagcc gttttatgca cggtccccaa 2880
tgacctgctg aaattgaaca gcgagctaaa tatagagtgg aagcaagcaa tttcttcaac 2940
cgtccttgga aaagtaatag ttcaaccaga tcagaatttc acaggattga ttgctggtgt 3000
tgtctcaata tcaacagcac tgttattact acttgggttt ttcctgtggc tgaaaaagag 3060
aaagcaaatt aaagatctgg gcagtgaatt agttcgctac gatgcaagag tacacactcc 3120
tcatttggat aggcttgtaa gtgcccgaag tgtaagccca actacagaaa tggtttcaaa 3180
tgaatctgta gactaccgag ctacttttcc agaagatcag tttcctaatt catctcagaa 3240
cggttcatgc cgacaagtgc agtatcctct gacagacatg tcccccatcc taactagtgg 3300
ggactctgat atatccagtc cattactgca aaatactgtc cacattgacc tcagtgctct 3360
aaatccagag ctggtccagg cagtgcagca tgtagtgatt gggcccagta gcctgattgt 3420
gcatttcaat gaagtcatag gaagagggca ttttggttgt gtatatcatg ggactttgtt 3480
ggacaatgat ggcaagaaaa ttcactgtgc tgtgaaatcc ttgaacagaa tcactgacat 3540
aggagaagtt tcccaatttc tgaccgaggg aatcatcatg aaagatttta gtcatcccaa 3600
tgtcctctcg ctcctgggaa tctgcctgcg aagtgaaggg tctccgctgg tggtcctacc 3660
atacatgaaa catggagatc ttcgaaattt cattcgaaat gagactcata atccaactgt 3720
aaaagatctt attggctttg gtcttcaagt agccaaaggc atgaaatatc ttgcaagcaa 3780
aaagtttgtc cacagagact tggctgcaag aaactgtatg ctggatgaaa aattcacagt 3840
caaggttgct gattttggtc ttgccagaga catgtatgat aaagaatact atagtgtaca 3900
caacaaaaca ggtgcaaagc tgccagtgaa gtggatggct ttggaaagtc tgcaaactca 3960
aaagtttacc accaagtcag atgtgtggtc ctttggcgtg ctcctctggg agctgatgac 4020
aagaggagcc ccaccttatc ctgacgtaaa cacctttgat ataactgttt acttgttgca 4080
agggagaaga ctcctacaac ccgaatactg cccagacccc ttatatgaag taatgctaaa 4140
atgctggcac cctaaagccg aaatgcgccc atccttttct gaactggtgt cccggatatc 4200
agcgatcttc tctactttca ttggggagca ctatgtccat gtgaacgcta cttatgtgaa 4260
cgtaaaatgt gtcgctccgt atccttctct gttgtcatca gaagataacg ctgatgatga 4320
ggtggacaca cgaccagcct ccttctggga gacatcatag tgctagtact atgtcaaagc 4380
aacagtccac actttgtcca atggtttttt cactgcctga cctttaaaag gccatcgata 4440
ttctttgctc ttgccaaaat tgcactatta taggacttgt attgttattt aaattactgg 4500
attctaagga atttcttatc tgacagagca tcagaaccag aggcttggtc ccacaggcca 4560
cggaccaatg gcctgcagcc gtgacaacac tcctgtcata ttggagtcca aaacttgaat 4620
tctgggttga attttttaaa aatcaggtac cacttgattt catatgggaa attgaagcag 4680
gaaatattga gggcttcttg atcacagaaa actcagaaga gatagtaatg ctcaggacag 4740
gagcggcagc cccagaacag gccactcatt tagaattcta gtgtttcaaa acacttttgt 4800
gtgttgtatg gtcaataaca tttttcatta ctgatggtgt cattcaccca ttaggtaaac 4860
attccctttt aaatgtttgt ttgttttttg agacaggatc tcactctgtt gccagggctg 4920
tagtgcagtg gtgtgatcat agctcactgc aacctccacc tcccaggctc aagcctcccg 4980
aatagctggg actacaggcg cacaccacca tccccggcta atttttgtat tttttgtaga 5040
gacggggttt tgccatgttg ccaaggctgg tttcaaactc ctggactcaa gaaatccacc 5100
cacctcagcc tcccaaagtg ctaggattac aggcatgagc cactgcgccc agcccttata 5160
aatttttgta tagacattcc tttggttgga agaatattta taggcaatac agtcaaagtt 5220
tcaaaatagc atcacacaaa acatgtttat aaatgaacag gatgtaatgt acatagatga 5280
cattaagaaa atttgtatga aataatttag tcatcatgaa atatttagtt gtcatataaa 5340
aacccactgt ttgagaatga tgctactctg atctaatgaa tgtgaacatg tagatgtttt 5400
gtgtgtattt ttttaaatga aaactcaaaa taagacaagt aatttgttga taaatatttt 5460
taaagataac tcagcatgtt tgtaaagcag gatacatttt actaaaaggt tcattggttc 5520
caatcacagc tcataggtag agcaaagaaa gggtggatgg attgaaaaga ttagcctctg 5580
tctcggtggc aggttcccac ctcgcaagca attggaaaca aaacttttgg ggagttttat 5640
tttgcattag ggtgtgtttt atgttaagca aaacatactt tagaaacaaa tgaaaaaggc 5700
aattgaaaat cccagctatt tcacctagat ggaatagcca ccctgagcag aactttgtga 5760
tgcttcattc tgtggaattt tgtgcttgct actgtatagt gcatgtggtg taggttactc 5820
taactggttt tgtcgacgta aacatttaaa gtgttatatt ttttataaaa atgtttattt 5880
ttaatgatat gagaaaaatt ttgttaggcc acaaaaacac tgcactgtga acattttaga 5940
aaaggtatgt cagactggga ttaatgacag catgattttc aatgactgta aattgcgata 6000
aggaaatgta ctgattgcca atacacccca ccctcattac atcatcagga cttgaagcca 6060
agggttaacc cagcaagcta caaagagggt gtgtcacact gaaactcaat agttgagttt 6120
ggctgttgtt gcaggaaaat gattataact aaaagctctc tgatagtgca gagacttacc 6180
agaagacaca aggaattgta ctgaagagct attacaatcc aaatattgcc gtttcataaa 6240
tgtaataagt aatactaatt cacagagtat tgtaaatggt ggatgacaaa agaaaatctg 6300
ctctgtggaa agaaagaact gtctctacca gggtcaagag catgaacgca tcaatagaaa 6360
gaactcgggg aaacatccca tcaacaggac tacacacttg tatatacatt cttgagaaca 6420
ctgcaatgtg aaaatcacgt ttgctattta taaacttgtc cttagattaa tgtgtctgga 6480
cagattgtgg gagtaagtga ttcttctaag aattagatac ttgtcactgc ctatacctgc 6540
agctgaactg aatggtactt cgtatgttaa tagttgttct gataaatcat gcaattaaag 6600
taaagtgatg caacatcttg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 6641
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 77th nucleotide in c-Met gene
<400> 2
gtaaagaggc actagcaaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 86th nucleotide in c-Met gene
<400> 3
gcactagcaa agtccgaga 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 306th nucleotide in c-Met gene
<400> 4
cagcaaagcc aatttatca 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 375th nucleotide in c-Met gene
<400> 5
ctatgatgat caactcatt 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 444th nucleotide in c-Met gene
<400> 6
caatcatact gctgacata 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 803rd nucleotide in c-Met gene
<400> 7
ctctagatgc tcagacttt 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 856th nucleotide in c-Met gene
<400> 8
tctggattgc attcctaca 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 857th nucleotide in c-Met gene
<400> 9
ctggattgca ttcctacat 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 1039th nucleotide in c-Met gene
<400> 10
gcacaaagca agccagatt 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 1188th nucleotide in c-Met gene
<400> 11
ctgctttaat aggacactt 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 1390th nucleotide in c-Met gene
<400> 12
caggttgtgg tttctcgat 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 1507th nucleotide in c-Met gene
<400> 13
ctggttatca ctgggaaga 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 1877th nucleotide in c-Met gene
<400> 14
ttggtcctgc catgaataa 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 2195th nucleotide in c-Met gene
<400> 15
agacaagcat cttcagtta 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 2376th nucleotide in c-Met gene
<400> 16
tcgctctaat tcagagata 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 2386th nucleotide in c-Met gene
<400> 17
tcagagataa tctgttgta 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 2645th nucleotide in c-Met gene
<400> 18
gtgagaatat acacttaca 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 2809th nucleotide in c-Met gene
<400> 19
ggtgttgtct caatatcaa 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 2935th nucleotide in c-Met gene
<400> 20
catttggata ggcttgtaa 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-Met cDNA sequence started from 3566th nucleotide in c-Met gene
<400> 21
ccaaaggcat gaaatatct 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 1 with dTdT attached to the 3' end
<400> 22
guaaagaggc acuagcaaa 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 1 with dTdT attached to the 3' end
<400> 23
uuugcuagug ccucuuuac 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 2 with dTdT attached to the 3' end
<400> 24
gcacuagcaa aguccgaga 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNAs 2 and 21 with dTdT attached to the
3' end
<400> 25
ucucggacuu ugcuagugc 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 3 with dTdT attached to the 3' end
<400> 26
cagcaaagcc aauuuauca 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 3 with dTdT attached to the 3' end
<400> 27
ugauaaauug gcuuugcug 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 4 with dTdT attached to the 3' end
<400> 28
cuaugaugau caacucauu 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 4 with dTdT attached to the 3' end
<400> 29
aaugaguuga ucaucauag 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 5 with dTdT attached to the 3' end
<400> 30
caaucauacu gcugacaua 19
<210> 31
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 5 with dTdT attached to the 3' end
<400> 31
uaugucagca guaugauug 19
<210> 32
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 6 with dTdT attached to the 3' end
<400> 32
cucuagaugc ucagacuuu 19
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 6 with dTdT attached to the 3' end
<400> 33
aaagucugag caucuagag 19
<210> 34
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 7 with dTdT attached to the 3' end
<400> 34
ucuggauugc auuccuaca 19
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 7 with dTdT attached to the 3' end
<400> 35
uguaggaaug caauccaga 19
<210> 36
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 8 with dTdT attached to the 3' end
<400> 36
cuggauugca uuccuacau 19
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 8 with dTdT attached to the 3' end
<400> 37
auguaggaau gcaauccag 19
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 9 with dTdT attached to the 3' end
<400> 38
gcacaaagca agccagauu 19
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 9 with dTdT attached to the 3' end
<400> 39
aaucuggcuu gcuuugugc 19
<210> 40
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 10 with dTdT attached to the 3' end
<400> 40
cugcuuuaau aggacacuu 19
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 10 with dTdT attached to the 3' end
<400> 41
aaguguccua uuaaagcag 19
<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 11 with dTdT attached to the 3' end
<400> 42
cagguugugg uuucucgau 19
<210> 43
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 11 with dTdT attached to the 3' end
<400> 43
aucgagaaac cacaaccug 19
<210> 44
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 12 with dTdT attached to the 3' end
<400> 44
cugguuauca cugggaaga 19
<210> 45
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 12 with dTdT attached to the 3' end
<400> 45
ucuucccagu gauaaccag 19
<210> 46
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 13 with dTdT attached to the 3' end
<400> 46
uugguccugc caugaauaa 19
<210> 47
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 13 with dTdT attached to the 3' end
<400> 47
uuauucaugg caggaccaa 19
<210> 48
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 14 with dTdT attached to the 3' end
<400> 48
agacaagcau cuucaguua 19
<210> 49
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 14 with dTdT attached to the 3' end
<400> 49
uaacugaaga ugcuugucu 19
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 15 with dTdT attached to the 3' end
<400> 50
ucgcucuaau ucagagaua 19
<210> 51
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 15 with dTdT attached to the 3' end
<400> 51
uaucucugaa uuagagcga 19
<210> 52
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 16 with dTdT attached to the 3' end
<400> 52
ucagagauaa ucuguugua 19
<210> 53
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 16 with dTdT attached to the 3' end
<400> 53
uacaacagau uaucucuga 19
<210> 54
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 17 with dTdT attached to the 3' end
<400> 54
gugagaauau acacuuaca 19
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNAs 17 and 22 with dTdT attached to the
3' end
<400> 55
uguaagugua uauucucac 19
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 18 with dTdT attached to the 3' end
<400> 56
gguguugucu caauaucaa 19
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 18 with dTdT attached to the 3' end
<400> 57
uugauauuga gacaacacc 19
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 19 with dTdT attached to the 3' end
<400> 58
cauuuggaua ggcuuguaa 19
<210> 59
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 19 with dTdT attached to the 3' end
<400> 59
uuacaagccu auccaaaug 19
<210> 60
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 20 with dTdT attached to the 3' end
<400> 60
ccaaaggcau gaaauaucu 19
<210> 61
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNAs 20 and 23 with dTdT attached to the
3' end
<400> 61
agauauuuca ugccuuugg 19
<210> 62
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 21
<400> 62
cuagcaaagu ccgaga 16
<210> 63
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 22
<400> 63
agaauauaca cuuaca 16
<210> 64
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 23
<400> 64
gauugcauuc cuacau 16
<210> 65
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 24, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end
<400> 65
gcacuagcaa aguccgaga 19
<210> 66
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 24,having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 66
ucucggacuu ugcuagugc 19
<210> 67
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 25, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 67
gcacuagcaa aguccgaga 19
<210> 68
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 25, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 68
ucucggacuu ugcuagugc 19
<210> 69
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 26, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
1st, 2nd nucleic acids, and the nucleic acids having U base are
substituted with 2'-O-Me
<400> 69
gcacuagcaa aguccgaga 19
<210> 70
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 26, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 70
ucucggacuu ugcuagugc 19
<210> 71
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 27, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
nucleic acids having G base are substituted with 2'-O-Me, and the
nucleic acids having U base are with 2'-F
<400> 71
gcacuagcaa aguccgaga 19
<210> 72
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA27, phosphorothioate bonded dTdT to
the 3'end, and 2'-OH of the riboserings in the 1st, 2nd, and the
nucleic acids having G base are substituted with 2'-O-Me, and
having U base are with 2'-F, but the 10, 11th nucleic acids are
not
<400> 72
ucucggacuu ugcuagugc 19
<210> 73
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 28, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me, and ENA
is inserted in the nucleic acid of the 5' end
<400> 73
gcacuagcaa aguccgaga 19
<210> 74
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 28, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 74
ucucggacuu ugcuagugc 19
<210> 75
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 29, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end
<400> 75
gugagaauau acacuuaca 19
<210> 76
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 29, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 76
uguaagugua uauucucac 19
<210> 77
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 30, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 77
gugagaauau acacuuaca 19
<210> 78
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 30, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 78
uguaagugua uauucucac 19
<210> 79
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 31, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
1st, 2nd nucleic acids, and the nucleic acids having U base are
substituted with 2'-O-Me
<400> 79
gugagaauau acacuuaca 19
<210> 80
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 31, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 80
uguaagugua uauucucac 19
<210> 81
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 32, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
nucleic acids having G base are substituted with 2'-O-Me, and the
nucleic acids having U base are with 2'-F
<400> 81
gugagaauau acacuuaca 19
<210> 82
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA32, phosphorothioate bonded dTdT to
the 3'end, and 2'-OH of the riboserings in the 1st, 2nd, and the
nucleic acids having G base are substituted with 2'-O-Me, and
having U base are with 2'-F, but the 10, 11th nucleic acids are
not
<400> 82
uguaagugua uauucucac 19
<210> 83
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 33, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me, and ENA
is inserted in the nucleic acid of the 5' end
<400> 83
gugagaauau acacuuaca 19
<210> 84
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 33, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 84
uguaagugua uauucucac 19
<210> 85
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 34, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end
<400> 85
gugagaauau acacuuaca 19
<210> 86
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 34, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose ring within
the 2nd nucleic acid are substituted with 2'-O-Me
<400> 86
uguaagugua uauucucac 19
<210> 87
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 35, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end
<400> 87
ccaaaggcau gaaauaucu 19
<210> 88
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 35, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 88
agauauuuca ugccuuugg 19
<210> 89
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 36, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 89
ccaaaggcau gaaauaucu 19
<210> 90
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 36, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 90
agauauuuca ugccuuugg 19
<210> 91
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 37, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
1st, 2nd nucleic acids, and the nucleic acids having U base are
substituted with 2'-O-Me
<400> 91
ccaaaggcau gaaauaucu 19
<210> 92
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 37, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 92
agauauuuca ugccuuugg 19
<210> 93
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 38, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
nucleic acids having G base are substituted with 2'-O-Me, and the
nucleic acids having U base are with 2'-F
<400> 93
ccaaaggcau gaaauaucu 19
<210> 94
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA38, phosphorothioate bonded dTdT to
the 3'end, and 2'-OH of the riboserings in the 1st, 2nd, and the
nucleic acids having G base are substituted with 2'-O-Me, and
having U base are with 2'-F, but the 10, 11th nucleic acids are
not
<400> 94
agauauuuca ugccuuugg 19
<210> 95
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 39, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within the
1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me, and ENA
is inserted in the nucleic acid of the 5' end
<400> 95
ccaaaggcau gaaauaucu 19
<210> 96
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 39, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose rings within
the 1st and 2nd nucleic acids are substituted with 2'-O-Me
<400> 96
agauauuuca ugccuuugg 19
<210> 97
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of siRNA 40, having phosphorothioate bonded dTdT
attached to the 3' end
<400> 97
ccaaaggcau gaaauaucu 19
<210> 98
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of siRNA 40, having phosphorothioate bonded
dTdT attached to the 3' end, and 2'-OH of the ribose ring within
the 2nd nucleic acid are substituted with 2'-O-Me
<400> 98
agauauuuca ugccuuugg 19
<210> 99
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense sequence of APOB-1 siRNA
<400> 99
gucaucacac ugaauaccaa u 21
<210> 100
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense sequence of APOB-1 siRNA
<400> 100
auugguauuc agugugauga cac 23
Claims (16)
- 다음의 표 1-1에 기재된 c-Met cDNA 영역에서 선택된 어느 하나에 해당하는 mRNA 영역을 표적으로 하는 15-30 bp의 이중가닥 siRNA (small interfering RNA).
[표 1-1]
- 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 3, 18 및 21로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열에 해당되는 mRNA 영역을 표적으로 하는 것인, siRNA.
- 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 상기 3' 말단 또는 5' 말단 또는 양 말단에 1-5 뉴클레오타이드로 이루어진 돌출부가 도입되는 것인, siRNA.
- 제2항에 있어서, 상기 siRNA는 다음의 표 6에 기재된 siRNA 1 내지 23으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, siRNA.
[표 6]
- 제4항에 있어서, 상기 siRNA는
서열번호 24의 센스 서열 및 서열번호 25의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 2;
서열번호 54의 센스 서열 및 서열번호 55의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 17;
서열번호 60의 센스 서열 및 서열번호 61의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 20;
서열번호 62의 센스 서열 및 서열번호 25의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 21;
서열번호 63의 센스 서열 및 서열번호 55의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 22; 및
서열번호 64의 센스 서열 및 서열번호 61의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 23
으로 이루어진 군에서 선택된 것인, siRNA. - 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조, 또는 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것인, siRNA.
- 제6항에 있어서, 상기 화학적 변형(modification)은
3' 말단, 5' 말단, 또는 양 말단의 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합을 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로 변형하는 것인, siRNA. - 제6항에 있어서, 상기 화학적 변형(modification)은
3' 말단, 5' 말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid)를 도입하는 것인, siRNA. - 제6항에 있어서, 상기 화학적 변형(modification)은
리보스 환(ribose ring)의 2'-위치에 있는 -OH(히드록시기)를 -NH2(아미노기), -C-알릴기, -F(플루오로기), 및 -O-Me(메틸기)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 치환하는 것인, siRNA. - 제6항에 있어서, 상기 화학적으로 변형된 siRNA는 다음의 표 11-1에 기재된 siRNA 24 내지 40으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, siRNA.
[표 11-1]
상기 표 11-1에서, 화학적 변형의 표기법은 다음의 표 3에 기재된 바와 같다.
[표 3]
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 포함하는 발현 벡터.
- 제11항에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라즈미드, 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 및 암세포 용해성 바이러스(oncolytic adenovirus) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 것인, 발현 벡터.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 siRNA를 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)와의 복합체 형태로 포함하는, 항암 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 핵산 전달체는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼, 및 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 항암 조성물.
- 제13항에 있어서,
항암 화학요법제, 또는
성장인자, 성장 인자 수용체, 하위 신호전달 단백질, 바이러스성 종양유발인자, 및 항암제 내성 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것의 발현을 저해하는 siRNA
를 추가로 포함하는, 항암 조성물.
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