WO2011074652A1 - HIF-2αの発現を抑制する核酸 - Google Patents

HIF-2αの発現を抑制する核酸 Download PDF

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WO2011074652A1
WO2011074652A1 PCT/JP2010/072716 JP2010072716W WO2011074652A1 WO 2011074652 A1 WO2011074652 A1 WO 2011074652A1 JP 2010072716 W JP2010072716 W JP 2010072716W WO 2011074652 A1 WO2011074652 A1 WO 2011074652A1
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WO
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nucleic acid
hif
base sequence
double
pharmaceutical composition
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PCT/JP2010/072716
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隼人 藪内
史一 篠原
哲郎 吉田
史朗 曽我
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協和発酵キリン株式会社
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • Angiogenesis is an in vivo phenomenon that usually occurs during wound healing and inflammation repair, but is involved in the establishment and malignancy of many diseases such as solid cancer, diabetic retinopathy, rheumatism, atherosclerosis, and psoriasis It is known (see Non-Patent Document 1). In particular, angiogenesis plays a major role in cancer development and tumor growth.
  • HIF hyperoxia-inducible factor
  • HIF is a transcription factor that functions in a hypoxic environment and promotes angiogenesis, glucose metabolism, and cell growth. Although it normally functions only in a hypoxic environment, it is constantly expressed in many tumors and is considered to be one of the causes of tumor growth (see Non-Patent Document 2).
  • HIF is a heterodimeric transcription factor, and consists of a constitutively expressed HIF-1 ⁇ subunit and a regulatory factor HIF- ⁇ subunit.
  • Three types of HIF- ⁇ subunits, HIF-1 ⁇ , HIF-2 ⁇ , and HIF-3 ⁇ , are known and each function in a redundant or tissue-specific manner.
  • the tumor suppressor gene VHL (von Hippel-Lindau tumor suppressor) is responsible for the degradation of the HIF- ⁇ subunit, thereby suppressing the constant expression of HIF.
  • VHL is mutated in most sporadic clear cell kidney cancer and VHL disease, which contributes to the constant expression of HIF in tumors. Inhibition of HIF that is constantly expressed in tumors controls tumor angiogenesis, so inhibition of HIF is effective as an anti-angiogenesis method based on the mechanism of action (see Non-Patent Document 3).
  • HIF-1 ⁇ is a target of antitumor action among HIF- ⁇ subunits (see Non-patent Document 4).
  • HIF-2 ⁇ is also constitutively expressed in many cancer types, and is involved in tumor progression more specifically than HIF-1 ⁇ in specific cancer types (see Non-Patent Documents 5 to 6), and VHL is mutated. It is known that inhibition of HIF-2 ⁇ is sufficiently effective in such tumors (see Non-Patent Documents 7 to 9).
  • Antisense nucleotides and siRNAs for hif-2 ⁇ mRNA are known (see Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Documents 5, 8, and 10-12), but all differ from the double-stranded RNA of the present invention. Has a sequence or no specific sequence is shown.
  • the present invention relates to the following (1) to (27).
  • a nucleic acid comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 22 to 40 or a nucleic acid from which at least one end of at least one end of the nucleic acid has been deleted, A nucleic acid comprising a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid and having an activity of suppressing the expression of HIF-2 ⁇ ; or a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 22 to 40 Or a nucleic acid from which at least one end of the nucleic acid has been deleted by 1 to 4 bases, A nucleic acid comprising at least one of the nucleic acids having a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid contains a nucleic acid in which 1 to 3 bases are substituted, deleted or added, and has an activity to suppress the expression of HIF-2 ⁇
  • a nucleic acid having (2) The nucleic acid according to (1), which has a double-stranded forming
  • nucleic acid according to (2) wherein the nucleic acid has a double-stranded part consisting of 15 to 19 base pairs.
  • a nucleic acid comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 22 to 40.
  • nucleic acid according to (6) wherein 1 to 3 bases are substituted, deleted or added, and has an activity of suppressing expression of HIF-2 ⁇ .
  • nucleic acid in which part or all of the nucleotides constituting the nucleic acid according to any one of (1) to (9) are deoxyribonucleotides or modified nucleotides and have an activity to suppress the expression of HIF-2 ⁇ .
  • (12) The nucleic acid according to (10), wherein at least one of the 1 to 4 bases added to the 3 ′ end or 5 ′ end is deoxyribonucleotide.
  • a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid or vector according to any one of (1) to (13) as an active ingredient.
  • the carrier effective for transferring the nucleic acid into the cell is a cationic carrier.
  • the carrier effective for transferring the nucleic acid into the cell is a liposome.
  • (23) A method for suppressing the expression of HIF-2 ⁇ , comprising administering the nucleic acid, vector or pharmaceutical composition according to any one of (1) to (22) to a subject.
  • (24) A method for suppressing angiogenesis, comprising administering the nucleic acid, vector or pharmaceutical composition according to any one of (1) to (22) to a subject.
  • (25) A method for treating or preventing cancer, diabetic retinopathy or rheumatism, comprising administering the nucleic acid, vector or pharmaceutical composition according to any one of (1) to (22) to a subject .
  • nucleic acid or vector according to any one of (1) to (13) for the production of a pharmaceutical composition.
  • nucleic acid or vector according to any one of (1) to (13) for use in the treatment or prevention of cancer, diabetic retinopathy or rheumatism.
  • Angiogenesis can be suppressed by providing a nucleic acid having the activity of suppressing the expression of HIF-2 ⁇ of the present invention, a vector encoding the nucleic acid, the nucleic acid or a pharmaceutical composition containing the vector.
  • a nucleic acid having the activity of suppressing the expression of HIF-2 ⁇ of the present invention a vector encoding the nucleic acid, the nucleic acid or a pharmaceutical composition containing the vector.
  • it is useful for the treatment and prevention of diseases such as cancer, diabetic retinopathy, and rheumatism, which are diseases involving angiogenesis.
  • FIG. 1 shows that HIF-2 siRNA # 1 to # 19, which is a double-stranded nucleic acid of the present invention (SEQ ID NO: N, N + 21: N is an integer of 43 to 61), is transfected into A-498 cells at a final concentration of 200 pM.
  • the results of quantification and evaluation of the expression of hif-2 ⁇ mRNA after 48 hours of incubation by RT-PCR are shown.
  • the amount of mRNA of hif-2 ⁇ was calculated as a semi-quantitative value using the amount of mRNA of gapdh (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) of the corresponding sample as an internal control.
  • FIG. 1 shows that HIF-2 siRNA # 1 to # 19, which is a double-stranded nucleic acid of the present invention (SEQ ID NO: N, N + 21: N is an integer of 43 to 61), is transfected into A-498 cells at a final concentration of 200 pM.
  • FIG. 2 shows transfection of A-498 cells with HIF-2 siRNA # 1 to # 19, which is a double-stranded nucleic acid of the present invention (SEQ ID NO: N, N + 21: N is an integer of 43 to 61) at a final concentration of 200 pM.
  • SEQ ID NO: N, N + 21: N is an integer of 43 to 61
  • the results of quantification and evaluation of vegfa mRNA expression by RT-PCR after 48 hours of incubation are shown.
  • the vegfa mRNA amount was calculated as a semi-quantitative value using the gapdh mRNA amount of the corresponding sample as an internal control.
  • HIF-2 siRNA # 1 to # 19 which is a double-stranded nucleic acid of the present invention (SEQ ID NO: N, N + 21: N is an integer of 43 to 61), by measuring the number of cells. The evaluation results are shown. A-498 cells were transfected with double-stranded nucleic acid at 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0.003, and 0.001 nM, respectively, and the number of viable cells after culturing for 7 days was measured.
  • FIG. 4 shows the inhibitory effect on cell proliferation of HIF-2 siRNA # 1 to # 19, which is a double-stranded nucleic acid of the present invention (SEQ ID NO: N, N + 21: N is an integer of 43 to 61), by measuring the number of cells. The evaluation results are shown.
  • A-498 cells were transfected with double-stranded nucleic acid at 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0.003, and 0.001 nM, respectively, and the number of viable cells after culturing for 7 days was measured.
  • the ratio of the number of living cells when each double-stranded nucleic acid is transfected is shown on the vertical axis when the number of living cells of A-498 cells not transfected with double-stranded nucleic acid is 100%.
  • FIG. 5 shows HIF-2 siRNA # 1, # 4, # 6, # 9, #, which are modified double-stranded nucleic acids of the present invention (SEQ ID NO: N ′, N ′ + 6: N ′ is an integer of 85 to 90). 11.
  • a portion of 2′-OH group of ribose of # 15 substituted with 2′-methoxy group was transfected into A-498 cells at a final concentration of 200 pM and cultured for 48 hours.
  • the results of quantification and evaluation of mRNA expression by RT-PCR are shown.
  • the right side of the graph shows the result of the corresponding unmodified double-stranded nucleic acid (SEQ ID NO: N ′′, N ′′ +21: N ′′ is 43, 46, 48, 51, 53 or 57).
  • the amount of mRNA was calculated semi-quantitatively using the amount of gapdh mRNA in the corresponding sample as an internal control.
  • N ′, N ′ + 6: N ′ is an integer of 85 to 90.
  • Vegfa mRNA after transfection of A-498 cells with 2'-OH group of 2'-OH group of ribose of # 15 with 2'-methoxy group at a final concentration of 200pM and culturing for 48 hours The results of quantification and evaluation of the expression of RT by RT-PCR are shown.
  • the right side of the graph shows the results of the corresponding unmodified double-stranded nucleic acid (SEQ ID NO: N ′′, N ′′ +21: N ′′ is 43, 46, 48, 51, 53 or 57). Used the amount of gapdh mRNA in the corresponding sample as an internal control to calculate a semi-quantitative value.
  • the nucleic acid of the present invention includes a nucleic acid comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 22 to 40, a nucleic acid from which at least one end of the nucleic acid has been deleted by 1 to 4 bases, and a base sequence of the nucleic acid.
  • a nucleic acid comprising a nucleic acid comprising a complementary base sequence and having an activity to suppress the expression of HIF-2 ⁇ , or a nucleic acid comprising a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 22 to 40 or the nucleic acid 1 to 3 bases are substituted, deleted or added in at least one nucleic acid consisting of a nucleic acid from which at least one to 4 bases have been deleted and a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid And a nucleic acid containing the HIF-2 ⁇ expression-suppressing activity.
  • the nucleic acid of the present invention may be any molecule as long as it is a molecule obtained by polymerizing nucleotides or molecules having functions equivalent to the nucleotides.
  • it is a polymer of RNA or deoxyribonucleotide that is a polymer of ribonucleotides.
  • examples thereof include DNA, chimeric nucleic acids composed of RNA and DNA, and nucleotide polymers in which at least one nucleotide of these nucleic acids is substituted with a molecule having a function equivalent to that of the nucleotide.
  • siRNA, sh (short hairpin) RNA, and derivatives containing at least one molecule having a function equivalent to nucleotide in these nucleic acids are also included in the nucleic acid of the present invention.
  • Uridine U in RNA can be uniquely read as thymine T in DNA.
  • nucleotide derivatives examples include nucleotide derivatives.
  • the nucleotide derivative may be any molecule as long as it is a modified nucleotide.
  • the affinity with a complementary strand nucleic acid is increased in order to improve or stabilize nuclease resistance. Therefore, in order to increase cell permeability or to make it visible, a molecule in which ribonucleotides or deoxyribonucleotides are modified is preferably used.
  • nucleotide derivatives include sugar-modified nucleotides, phosphodiester bond-modified nucleotides, base-modified nucleotides, and nucleotides in which at least one of the sugar moiety, phosphodiester bond and base is modified.
  • the sugar moiety-modified nucleotide may be any nucleotide as long as it is a part or all of the chemical structure of the sugar of the nucleotide, modified or substituted with any substituent, or substituted with any atom.
  • '-Modified nucleotides are preferably used.
  • 2′-modified nucleotides include, for example, those in which the 2′-OH group of ribose is H, OR, R, R′OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 , CN, F, Cl, Br and Substituted with a substituent selected from the group consisting of I (R is alkyl or aryl, preferably alkyl having 1 to 6 carbon atoms and R ′ is alkylene, preferably alkylene having 1 to 6 carbon atoms)
  • a 2′-modified nucleotide, preferably a 2′-OH group is F or a methoxy group.
  • the phosphodiester bond-modified nucleotide is any nucleotide that has been modified or substituted with an arbitrary substituent for a part or all of the chemical structure of the phosphodiester bond of the nucleotide, or with any atom.
  • a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorothioate bond a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorodithioate bond
  • a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with an alkylphosphonate bond a phosphate
  • Examples thereof include nucleotides in which a diester bond is substituted with a phosphoramidate bond.
  • any or all of the nucleotide base chemical structure modified or substituted with an arbitrary substituent or substituted with an arbitrary atom may be used.
  • oxygen atoms are substituted by sulfur atoms
  • hydrogen atoms are substituted by alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms
  • methyl groups are substituted by hydrogen or alkyl groups having 2 to 6 carbon atoms
  • amino Examples thereof include those in which the group is protected with a protecting group such as an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • nucleotide derivative examples include a peptide, protein, sugar, lipid, phospholipid, phenazine, folate, phenanthridine, anthraquinone, acridine, a nucleotide derivative in which at least one of nucleotide or sugar moiety, phosphodiester bond or base is modified.
  • examples include those obtained by adding another chemical substance such as fluorescein, rhodamine, coumarin, and dye, directly or via a linker.
  • 5′-polyamine-added nucleotide derivatives, cholesterol-added nucleotide derivatives, and steroid-added nucleotide derivatives examples include a peptide, protein, sugar, lipid, phospholipid, phenazine, folate, phenanthridine, anthraquinone, acridine, a nucleotide derivative in which at least one of nucleotide or sugar moiety, phosphodiester bond or base
  • Bile acid addition nucleotide derivatives vitamin addition nucleotide derivatives, Cy5 addition nucleotide derivatives, Cy3 addition nucleotide derivatives, 6-FAM addition nucleotide derivatives, biotin addition nucleotide derivatives, etc. I can get lost.
  • the nucleotide derivative may form a crosslinked structure such as an alkylene structure, a peptide structure, a nucleotide structure, an ether structure, an ester structure, and a structure obtained by combining at least one of these with other nucleotides or nucleotide derivatives in the nucleic acid.
  • the nucleic acid of the present invention may be any nucleotide as long as it is a nucleic acid having a function equivalent to a nucleic acid consisting of a partial base sequence of the hif-2 ⁇ gene or a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid. Or you may be comprised from the derivative (s).
  • the nucleic acid of the present invention has any length as long as a nucleic acid consisting of a partial base sequence of the hif-2 ⁇ gene and a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid can form a duplex.
  • the length of the sequence capable of forming a double chain is usually 15 to 27 bases, preferably 15 to 25 bases, more preferably 15 to 23 bases, still more preferably 15 to 21 bases, 19 bases are particularly preferred.
  • nucleic acid of the present invention a nucleic acid consisting of a partial base sequence of the hif-2 ⁇ gene is used.
  • nucleic acids 1 to 3 bases, preferably 1 to 2 bases, more preferably 1 base is deleted. A substituted or added one may be used.
  • the nucleic acid that suppresses the expression of HIF-2 ⁇ includes a part of the base sequence of the hif-2 ⁇ gene and a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid, and the expression of HIF-2 ⁇ Any nucleic acid such as a single-stranded nucleic acid and a double-stranded nucleic acid can be used as long as the nucleic acid is suppressed, but a double-stranded nucleic acid is preferably used.
  • the single-stranded nucleic acid constituting the double-stranded nucleic acid usually consists of 15 to 30 bases, preferably 15 to 29 bases, more preferably 15 to 27 bases, and more preferably 15 to 25 bases. More preferably, it consists of 17 to 23 bases, most preferably 19 to 21 bases.
  • the double-stranded nucleic acid of the present invention has an additional nucleotide or nucleotide derivative that does not form a duplex on the 3 ′ side or the 5 ′ side following the duplex forming portion, this is referred to as an overhang. Call it.
  • the nucleotide constituting the overhang may be ribonucleotide, deoxyribonucleotide or a derivative thereof.
  • the double-stranded nucleic acid having a protruding portion one having a protruding portion consisting of 1 to 4 bases, usually 1 to 3 bases at the 3 ′ end or 5 ′ end of at least one strand is used. What has the protrusion part which becomes is preferably used, and what has the protrusion part which consists of dTdT or UU is used more preferably.
  • the overhang can have only the antisense strand, only the sense strand, and both the antisense strand and the sense strand, but a double-stranded nucleic acid having an overhang on both the antisense strand and the sense strand is preferably used. .
  • the double-stranded nucleic acid of the present invention has, for example, a nucleic acid molecule (WO2005 / 089287) that generates the above-mentioned double-stranded nucleic acid by the action of a ribonuclease such as Dicer, or a protruding portion at the 3 ′ end or 5 ′ end.
  • a ribonuclease such as Dicer
  • a double-stranded nucleic acid or the like that has not been used can also be used.
  • double-stranded nucleic acid of the present invention a nucleic acid having the same sequence as the base sequence of the target gene or its complementary strand may be used, but the 5 ′ end or 3 ′ of at least one strand of the nucleic acid may be used.
  • a double-stranded nucleic acid comprising a nucleic acid from which one to four bases have been deleted and a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid may be used.
  • nucleic acid of the present invention can also be used as the nucleic acid of the present invention.
  • nucleic acids include nucleic acids consisting of the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 22 to 40, and 1 to 3 bases, preferably 1 to 2 bases, more preferably 1 base in these nucleic acids.
  • nucleic acid containing these nucleic acids include 30 bases or less, preferably 29 bases or less, more preferably 27 bases or less, still more preferably 25 bases or less, and particularly preferably 23 bases or less.
  • the nucleic acid of the present invention may be a single-stranded nucleic acid obtained by linking the sense strand and the antisense strand of the double-stranded nucleic acid described above via a spacer sequence.
  • the single-stranded nucleic acid is preferably a single-stranded nucleic acid such as shRNA having a double-strand formation portion with a stem-loop structure.
  • a single-stranded nucleic acid having a stem-loop structure is usually 50 to 70 bases in length.
  • the nucleic acid of the present invention is designed to produce the above-mentioned single-stranded nucleic acid or double-stranded nucleic acid by the action of ribonuclease or the like, 70 base length or less, preferably 50 base length or less, more preferably 30 base length or less. It may be a nucleic acid.
  • the method for producing the nucleic acid of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method using known chemical synthesis or an enzymatic transcription method.
  • methods using known chemical synthesis include phosphoramidite method, phosphorothioate method, phosphotriester method, CEM method [Nucleic® Acid® Research, 35, 20073287 (2007)].
  • ABI3900 high-throughput nucleic acid synthesis Can be synthesized by a machine (Applied Biosystems). After the synthesis is completed, elimination from the solid phase, deprotection of the protecting group, purification of the target product, and the like are performed. It is desirable to obtain a nucleic acid having a purity of 90% or more, preferably 95% or more by purification.
  • the synthesized and purified sense strand and antisense strand are used in an appropriate ratio, for example, 0.1 to 10 equivalents, preferably 0.5 to 10 sense strands per equivalent of the antisense strand.
  • Two equivalents, more preferably 0.9 to 1.1 equivalents, and even more preferably equimolar amounts may be mixed and then annealed, or used directly without the step of annealing the mixture. May be. Annealing may be performed under any conditions as long as double-stranded nucleic acid can be formed.
  • the sense strand and the antisense strand are mixed in approximately equimolar amounts, and then heated at about 94 ° C. for about 5 minutes.
  • a transcription method using a phage RNA polymerase for example, T7, T3, or SP6 RNA polymerase, using a plasmid or DNA having a target base sequence as a template can be mentioned.
  • the nucleic acid of the present invention can be introduced into cells using a transfection carrier, preferably a cationic carrier such as a cationic liposome. It can also be directly introduced into cells by the calcium phosphate method, electroporation method or microinjection method.
  • a vector that is introduced into a cell and expressed therein may be used. Specifically, the nucleic acid or the like can be expressed by inserting the sequence encoding the nucleic acid of the present invention downstream of the promoter in the expression vector, constructing the expression vector, and introducing it into a cell.
  • Expression vectors include pCDNA6.2-GW / miR (Invitrogen), pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pSINsi-hH1 DNA (Takara Bio), pSINsi-hU6 DNA (Takara Bio), pENTR / U6 (Invitrogen) etc. can be mentioned.
  • a recombinant viral vector produced by inserting a sequence encoding the nucleic acid of the present invention downstream of a promoter in a viral vector and introducing the vector into a packaging cell can also be used.
  • virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, and the like. 2.
  • nucleic acid having HIF-2 ⁇ expression-inhibiting activity As a first selection criterion for a double-stranded nucleic acid having HIF-2 ⁇ expression-inhibiting activity, a nucleic acid comprising a partial base sequence of the hif-2 ⁇ gene, It is a double-stranded nucleic acid composed of a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence.
  • the nucleic acid comprising the partial base sequence may be selected as a second selection criterion that (a) there is no sequence in which G or C continues for 4 or more bases, and (b) the GC content is 20 to 80%. preferable.
  • the double-stranded nucleic acid include the following (a) to (f).
  • B two strands consisting of an antisense strand nucleic acid comprising a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 22 to 40 and a sense strand nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid Strand nucleic acid.
  • nucleic acid having the activity of suppressing the expression of HIF-2 ⁇ a nucleic acid consisting of a partial base sequence of the hif-2 ⁇ gene and a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid, the following (A) (G) single-stranded nucleic acids are also included.
  • A) An antisense strand nucleic acid comprising a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 22 to 40 corresponding to a complementary sequence of hif-2 ⁇ mRNA, and a sense strand complementary to the base sequence
  • a single-stranded nucleic acid obtained by linking nucleic acid via a spacer sequence.
  • a sense strand nucleic acid comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 and an antisense strand nucleic acid comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 22 to 40 1 to 3 bases, preferably 1 to 2 bases, more preferably 1 base is substituted in at least one of the sense strand and the antisense strand contained in the single-stranded nucleic acid linked through the spacer sequence.
  • a double-stranded nucleic acid that is deleted or added and has the activity of suppressing the expression of HIF-2 ⁇ .
  • HIF-2 ⁇ By introducing these single-stranded nucleic acids or double-stranded nucleic acids into cells, the expression of HIF-2 ⁇ can be suppressed.
  • the double strand of the present invention Nucleic acids can suppress the expression of hif-2 ⁇ mRNA even at a concentration of several hundreds pM to several nM even after culturing for 24 hours or more, for example 48 hours after introduction into cells.
  • Cationic liposomes include 2-O- (2-diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol-containing liposomes (hereinafter also referred to as liposome A), oligofectamine (Invitrogen), lipofectin ( Invitrogen), Lipofectamine (Invitrogen), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), DMRIE-C (Invitrogen), GeneSilencer (Gene Therapy Systems), TransMessenger (QIAGEN Mus, TransIA, TransIA, T Etc. are preferably used.
  • the composition can be made into a uniform composition by carrying out a dispersion treatment using an ultrasonic dispersing device or a high-pressure emulsifying device.
  • a person skilled in the art uses an optimal method and conditions for preparing a composition comprising a carrier and a single-stranded nucleic acid, a double-stranded nucleic acid or a vector, without depending on the above-mentioned method, because it depends on the carrier used.
  • the optimum method for the carrier can be selected.
  • the lipid membrane that coats the composite particles include neutral lipids and polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine as constituent components.
  • the liposome can be prepared according to the method described in WO2006 / 080118, for example.
  • the compounding ratio of the single-stranded nucleic acid, double-stranded nucleic acid or vector and carrier contained in the pharmaceutical composition of the present invention is 1 to 200 carriers per 1 part by weight of the single-stranded nucleic acid, double-stranded nucleic acid or vector. Part by weight is appropriate.
  • the amount is 2.5 to 100 parts by weight, more preferably 10 to 20 parts by weight, based on 1 part by weight of the single-stranded nucleic acid, double-stranded nucleic acid or vector.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or diluent in addition to the above carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers or diluents and the like are essentially chemically inert and harmless compositions that do not affect the biological activity of the pharmaceutical composition of the present invention at all. Examples of such carriers or diluents include but are not limited to salt solutions, sugar solutions, glycerol solutions, ethanol and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain an appropriate amount of any pharmaceutically acceptable additive, for example, an emulsification aid, a stabilizer, an isotonic agent, a pH adjuster and the like. Any pharmaceutically acceptable additive can be added in an appropriate step before or after dispersion of the complex.
  • any pharmaceutically acceptable additive for example, an emulsification aid, a stabilizer, an isotonic agent, a pH adjuster and the like.
  • Any pharmaceutically acceptable additive can be added in an appropriate step before or after dispersion of the complex.
  • the lyophilized preparation can be prepared by subjecting a single-stranded nucleic acid, a double-stranded nucleic acid, or a vector and a carrier to a dispersion treatment and then a freeze-drying treatment.
  • the lyophilization treatment can be performed by a conventional method. For example, a predetermined amount of the complex solution after the dispersion treatment is aseptically dispensed into a vial and pre-dried for about 2 hours under the condition of about ⁇ 40 to ⁇ 20 ° C. and about 0 to 10 ° C. Primary drying under reduced pressure, followed by secondary drying under reduced pressure at about 15-25 ° C. and lyophilization. Then, for example, by replacing the inside of the vial with nitrogen gas and stoppering, a freeze-dried preparation of the pharmaceutical composition of the present invention can be obtained.
  • nucleic acid that suppresses expression of hif-2 ⁇ gene design and evaluation of nucleic acid that suppresses expression of hif-2 ⁇ gene (1) Preparation of double-stranded nucleic acid
  • mRNA sequence of hif-2 ⁇ (GenBank accession number: NM_001430) .3, SEQ ID NO: 97): (a) no sequence with 4 or more bases of G or C, (b) GC content is 20-80%, (c) more preferably 5 'or 3' side
  • SEQ ID NO: N the base sequence of SEQ ID NO: n + 21 as its complementary sequence.
  • n is an integer from 1 to 19.
  • Cells introduced with double-stranded nucleic acid are cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 48 hours, washed with ice-cold PBS, and total RNA is recovered using Cells-to-Ct Kit (ABI) Then, reverse transcription was performed according to the method described in the instructions attached to the product to prepare cDNA.
  • the results regarding the amount of hif-2 ⁇ mRNA are shown in FIG.
  • the amount of mRNA in the specimen was expressed as a relative ratio when the amount of mRNA for hif-2 ⁇ and the amount of mRNA for gapdh were 1 in the group treated with carrier alone (mock group).
  • A-498 cells into which the double-stranded nucleic acid of the present invention targeting the hif-2 ⁇ gene was introduced had a decreased amount of hif-2 ⁇ mRNA compared to the negative control.
  • modified nucleotides of modified double-stranded nucleic acids refer to Oligonucleotides, 18 (2), 187-200 (2008), and replace the 2'-OH group of ribose ribose with a 2'-methoxy group.
  • a nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: N ′ and a nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: N ′ + 6 are used, and the corresponding unmodified double-stranded nucleic acid is used.
  • N ′ represents an integer from 85 to 90.

Abstract

本発明は、HIF-2αの発現抑制活性を有する核酸、該核酸を含む医薬組成物ならびに該核酸を含む血管新生抑制剤、特に癌、糖尿病性網膜症、リウマチなどの予防または治療薬を提供する。

Description

HIF-2αの発現を抑制する核酸
　本発明は、血管新生因子として働くHIF-2αの発現抑制に用いるための核酸またはその誘導体、該核酸またはその誘導体を含む医薬組成物に関する。
　既存の血管から新しい血管が形成されることを血管新生という。血管新生は、通常創傷治癒や炎症の修復の際に起こる生体内現象であるが、固形癌、糖尿病性網膜症、リウマチ、アテローム性動脈硬化症、乾せんなど多くの疾患の成立・悪性化に関与することが知られている（非特許文献１参照）。特に、癌の発生・腫瘍増殖には血管新生が大きな役割を果たしている。
　HIF(低酸素誘導性因子(hypoxia-inducible factor))は低酸素環境において機能する転写因子であり、血管新生や糖代謝、細胞増殖を促進する。通常低酸素環境においてのみ機能するが、多くの腫瘍で恒常的に発現しており、腫瘍増殖の原因の一つと考えられている（非特許文献２参照）。HIFはヘテロ二量体の転写因子であり、恒常的に発現しているHIF-1βサブユニットと、制御因子HIF-αサブユニットからなる。HIF-αサブユニットにはHIF-1α、 HIF-2α、HIF-3αの３種類が知られており、それぞれが重複的、あるいは組織特異的に機能している。
　腫瘍抑制因子遺伝子VHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor)はHIF-αサブユニットの分解を担っており、これによりHIFの恒常発現が抑えられる。VHLはほとんどの散発性明細胞腎臓癌およびVHL疾患で突然変異しており、このことが腫瘍におけるHIFの恒常発現に寄与している。腫瘍において恒常的に発現しているHIFを抑制することは腫瘍の血管新生を制御するので、HIFの抑制は作用機序に基づいた抗血管新生方法として有効である（非特許文献３参照）。
　これまで、HIF-αサブユニットの中でもHIF-1αが抗腫瘍作用の標的となることが知られている（非特許文献４参照）。一方HIF-2αも多数の癌種において恒常的に発現しており、また特定の癌種においてHIF-１αより特異的に腫瘍進行に関わること（非特許文献５～６参照）、またVHLが変異した腫瘍においてはHIF-2αの阻害が十分に有効であることが知られている（非特許文献７～９参照）。
　癌などの疾患の原因となる蛋白質をコードする核酸に結合することにより、その発現を阻害するように構成した抑制性オリゴヌクレオチド化合物は、それらの疾患の治療に有用である可能性がある。そのような例として例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが考えられる。
　標的遺伝子の発現を抑制する方法として、ＲＮＡ干渉（RNA interference、以下、ＲＮＡｉともいう）を利用した方法等が知られている。例えば、２１～２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡを細胞に導入することにより、標的遺伝子の発現が抑制されることが知られている。このようなＲＮＡは、small interfering RNA(siRNA)と名づけられている。
　hif-2αのｍＲＮＡに対するアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡは、知られているが（特許文献１、２、非特許文献５、８、１０～１２参照）、いずれも本発明の二本鎖RNAとは異なる配列を有しているか、または具体的な配列が示されていない。
国際公開第０４／０４８５２６号 国際公開第００／０９６５７号
Journal of Molecular Medicine, 73(7), 333-46 (1995) Nature, 441(25), 437-443 (2006) Nature Reviews Cancer, 3, 721-732 (2003) Nature Reviews Drug Discovery, 2, 4-9 (2003) Cancer Research, 63, 6130-6134 (2003) Cell Cycle, 6(8), 919-926 (2007) Molecular Cancer Research, 2, 89-95 (2004) PLoS Biology, 1(3), 439-444 (2003) Oncogene, 27(40), 5354-5358 (2008) Journal of Cellular Biochemistry, 92, 491-501 (2004) Cancer Biology & Therapy, 5(10), 1320-1326 (2006) Cancer Research, 66, 6264-6270 (2006)
　本発明は、血管新生因子として働くHIF-2αの発現を抑制することが可能な核酸を提供することを目的とする。また本発明は、その治癒において血管新生抑制が有効となる癌、糖尿病性網膜症、リウマチなどの疾患を治療または予防するための医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の（１）～（２７）に関する。
（１）配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸または該核酸の少なくとも一方の末端が１～４塩基削除された核酸と、
該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とを含有し、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸；または
配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸または該核酸の少なくとも一方の末端が１～４塩基削除された核酸と、
該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸の少なくとも一方の核酸において、１～３塩基が置換、欠失もしくは付加された核酸とを含有し、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸。
（２）２７塩基対以下の二重鎖形成部を有する、（１）に記載の核酸。
（３）１５～１９塩基対からなる二重鎖形成部を有する、（２）に記載の核酸。
（４）HIF-2αの発現抑制活性を有する核酸が二本鎖核酸である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の核酸。
（５）（４）に記載の二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖の３’末端または５’末端に１～４塩基付加した核酸。
（６）配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸。
（７）（６）に記載の核酸において、１～３塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸。
（８）（６）または（７）に記載の核酸を含む、３０塩基以下の核酸。
（９）（１）～（８）のいずれか１項に記載の核酸を構成するヌクレオチドの一部または全部がリボヌクレオチドであり、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸。
（１０）（１）～（９）のいずれか１項に記載の核酸を構成するヌクレオチドの一部または全部が、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであり、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸。
（１１）修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、リボヌクレオチドの２’－修飾ヌクレオチドである、（１０）に記載の核酸。
（１２）３’末端または５’末端に付加した１～４塩基の少なくとも１塩基がデオキシリボヌクレオチドである、（１０）に記載の核酸。
（１３）（１）～（１２）のいずれか１項に記載の核酸をコードするベクター。
（１４）（１）～（１３）のいずれか１項に記載の核酸またはベクターを有効成分とする、医薬組成物。
（１５）核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体をさらに含む、（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体がカチオン性担体である、（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体がリポソームである、（１６）に記載の医薬組成物。
（１８）リポソームがHIF-2αをコードする遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームである、（１７）に記載の医薬組成物。
（１９）核酸またはベクターとリード粒子とを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在するリポソームである、（１４）に記載の医薬組成物。
（２０）HIF-2αの発現を抑制することを特徴とする、（１４）～（１９）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（２１）血管新生抑制剤である、（２０）に記載の医薬組成物。
（２２）癌、糖尿病性網膜症またはリウマチの治療剤または予防剤である、（１４）～（２１）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（２３）（１）～（２２）のいずれか１項に記載の核酸、ベクターまたは医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、HIF-2αの発現を抑制する方法。
（２４）（１）～（２２）のいずれか１項に記載の核酸、ベクターまたは医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、血管新生を抑制する方法。
（２５）（１）～（２２）のいずれか１項に記載の核酸、ベクターまたは医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、癌、糖尿病性網膜症もしくはリウマチを治療または予防する方法。
（２６）医薬組成物の製造のための、（１）～（１３）のいずれか１項に記載の核酸またはベクターの使用。
（２７）癌、糖尿病性網膜症もしくはリウマチの治療または予防における使用のための、（１）～（１３）のいずれか１項に記載の核酸またはベクター。
　本発明のHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸、該核酸をコードするベクター、該核酸または該ベクターを含む医薬組成物を提供することによって、血管新生を抑制することが可能となる。特に、血管新生が関与する疾患である、癌、糖尿病性網膜症、リウマチなどの疾患の治療・予防に有用である。
図１は、本発明の二本鎖核酸（配列番号Ｎ、Ｎ＋２１：Ｎは４３～６１の整数）であるHIF-2 siRNA #1～#19を終濃度200pMでA-498細胞にトランスフェクションして４８時間培養した後の、hif-2αのｍＲＮＡの発現をＲＴ－ＰＣＲにより定量、評価した結果を示す。hif-2αのｍＲＮＡ量は、対応するサンプルのgapdh（D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）のｍＲＮＡ量を内部対照として用いて、準定量値を算出した。 図２は、本発明の二本鎖核酸（配列番号Ｎ、Ｎ＋２１：Ｎは４３～６１の整数）であるHIF-2 siRNA #1～#19を終濃度200pMでA-498細胞にトランスフェクションして４８時間培養した後の、vegfaのｍＲＮＡの発現をＲＴ－ＰＣＲにより定量、評価した結果を示す。vegfaのｍＲＮＡ量は、対応するサンプルのgapdhのｍＲＮＡ量を内部対照として用いて、準定量値を算出した。 図３は、本発明の二本鎖核酸（配列番号Ｎ、Ｎ＋２１：Ｎは４３～６１の整数）であるHIF-2 siRNA #1～#19の細胞増殖に対する抑制効果を、細胞数の計測により評価した結果を示す。A-498細胞に二本鎖核酸を、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001ｎＭで、それぞれトランスフェクションした後、７日間培養した後の生細胞数を測定した。二本鎖核酸をトランスフェクションしていないA-498細胞の生細胞数を１００％としたときの、それぞれの二本鎖核酸をトランスフェクションした場合の生細胞数の割合を縦軸に示す。 図４は、本発明の二本鎖核酸（配列番号Ｎ、Ｎ＋２１：Ｎは４３～６１の整数）であるHIF-2 siRNA #1～#19の細胞増殖に対する抑制効果を、細胞数の計測により評価した結果を示す。A-498細胞に二本鎖核酸を、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001ｎＭで、それぞれトランスフェクションした後、７日間培養した後の生細胞数を測定した。二本鎖核酸をトランスフェクションしていないA-498細胞の生細胞数を１００％としたときの、それぞれの二本鎖核酸をトランスフェクションした場合の生細胞数の割合を縦軸に示す。 図５は、本発明の修飾二本鎖核酸（配列番号Ｎ’、Ｎ’＋６：Ｎ’は８５～９０の整数）であるHIF-2 siRNA #1, #4, #6, #9, #11, #15のリボースの一部の２’－ＯＨ基を２’－メトキシ基で置換したものを、終濃度200pMでA-498細胞にトランスフェクションして４８時間培養した後の、hif-2αのｍＲＮＡの発現をＲＴ－ＰＣＲにより定量、評価した結果を示す。また、グラフの右側には対応する無修飾の二本鎖核酸（配列番号Ｎ”、Ｎ”＋２１：Ｎ”は４３、４６、４８、５１、５３または５７）の結果を示す。hif-2αのｍＲＮＡ量は、対応するサンプルのgapdhのｍＲＮＡ量を内部対照として用いて、準定量値を算出した。 図６は、本発明の修飾二本鎖核酸（配列番号Ｎ’、Ｎ’＋６：Ｎ’は８５～９０の整数）であるHIF-2 siRNA #1, #4, #6, #9, #11, #15のリボースの一部の２’－ＯＨ基を２’－メトキシ基で置換したものを、終濃度200pMでA-498細胞にトランスフェクションして４８時間培養した後の、vegfaのｍＲＮＡの発現をＲＴ－ＰＣＲにより定量、評価した結果を示す。また、グラフの右側には対応する無修飾の二本鎖核酸（配列番号Ｎ”、Ｎ”＋２１：Ｎ”は４３、４６、４８、５１、５３または５７）の結果を示す。vegfaのｍＲＮＡ量は、対応するサンプルのgapdhのｍＲＮＡ量を内部対照として用いて、準定量値を算出した。
　本発明の核酸が標的とするHIF-2αをコードする遺伝子（以下、hif-2α遺伝子ともいう）は、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．NM_001430.3として登録されている、hif-2αの完全長ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ塩基配列（配列番号９７）を含む遺伝子があげられる。本発明においては、配列番号９７で表される塩基配列からなるヌクレオチドを標的遺伝子とも称する。
１．本発明の核酸
　本発明において、hif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸に対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸と称し、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸とも称する。センス鎖核酸は、hif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸そのものであってもよい。
　本発明の核酸としては、配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸または該核酸の少なくとも一方の末端が１～４塩基削除された核酸と該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とを含有し、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸、または配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸または該核酸の少なくとも一方の末端が１～４塩基削除された核酸と該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸との少なくとも一方の核酸において、１～３塩基が置換、欠失もしくは付加された核酸を含有し、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸があげられる。
　本発明の核酸としては、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体があげられる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈ（short hairpin）ＲＮＡ、およびこれらの核酸内にヌクレオチドと同等の機能を有する分子を少なくとも一つ含む誘導体も、本発明の核酸に含まれる。またＲＮＡ中のウリジンＵは、ＤＮＡにおいてはチミンＴに一義的に読み替えることができる。
　ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等があげられる。
　ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子あってもよいが、例えばＲＮＡまたはＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
　ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等があげられる。
　糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、２’－修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
　２’－修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの２’－ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群（Ｒはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数１～６のアルキルであり、Ｒ’はアルキレン、好ましくは炭素数１～６のアルキレンである）から選択される置換基で置換された２’－修飾ヌクレオチド、好ましくは２’－ＯＨ基がＦまたはメトキシ基があげられる。また、2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基2-（N-methylcarbamoyl）etoxy 基および2-cyanoetoxy 基からなる群から選択される置換基で置換された２’－修飾ヌクレオチド等もあげられる。
　糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）(BNA)があげられ、具体的には、2'位の酸素原子と4'位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Locked Nucleic Acid）（LNA）、エチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid）（ENA）［Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)］等があげられ、さらにペプチド核酸（PNA）[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸（OPNA）[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸（PRNA）[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等もあげられる。
　リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等があげられる。
　塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数１～６のアルキル基で置換されたもの、メチル基が水素もしくは炭素数２～６のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルカノイル基等の保護基で保護されたものがあげられる。
　ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、ペプチド、蛋白質、糖、脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を、直接またはリンカーを介して付加したものもあげられ、具体的には、５’－ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6－FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
　ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
　本発明の核酸は、hif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と同等な機能を有する核酸であれば、いずれのヌクレオチドまたはその誘導体から構成されていてもよい。すなわち、hif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸は、その塩基配列を構成するヌクレオチドが、該ヌクレオチドと同等の機能を有するリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体に置換されたものであってもよい。
　本発明の核酸は、hif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸と該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とが二重鎖を形成することができればいずれの長さでもよいが、二重鎖を形成できる配列の長さは、通常１５～２７塩基であり、１５～２５塩基が好ましく、１５～２３塩基がより好ましく、１５～２１塩基がさらに好ましく、１５～１９塩基が特に好ましい。
　本発明の核酸としては、hif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸が用いられるが、該核酸のうち１～３塩基、好ましくは１～２塩基、より好ましくは１塩基が欠失、置換または付加したものを用いてもよい。
　HIF-2αの発現を抑制する核酸としては、hif-2α遺伝子の一部の塩基配列と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とを含み、かつHIF-2αの発現を抑制する核酸であれば、一本鎖核酸、二本鎖核酸等、いずれの核酸も用いられるが、二本鎖核酸が好適に用いられる。
　本発明において二本鎖核酸とは、二本の鎖が対合し二重鎖形成部を有する核酸をいう。二重鎖形成部とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖形成部は、通常１５～２７塩基対であり、１５～２５塩基対が好ましく、１５～２３塩基対がより好ましく、１５～２１塩基対がさらに好ましく、１５～１９塩基対が特に好ましい。
　二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常１５～３０塩基からなるが、１５～２９塩基からなることが好ましく、１５～２７塩基からなることがより好ましく、１５～２５塩基からなることがさらに好ましく、１７～２３塩基からなることが特に好ましく、１９～２1塩基からなることが最も好ましい。
　本発明の二本鎖核酸において、二重鎖形成部に続く３’側または５’側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有する場合には、これを突出部（オーバーハング）と呼ぶ。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの誘導体であってもよい。
　突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の３’末端または５’末端に１～４塩基、通常は１～３塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、２塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、ｄＴｄＴまたはＵＵからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。また、二重鎖形成部に続いて標的配列と一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的配列の相補鎖の塩基配列と一致する配列を用いることもできる。さらに、本発明の二本鎖核酸としては、例えばＤｉｃｅｒ等のリボヌクレアーゼの作用により上記の二本鎖核酸を生成する核酸分子（WO2005/089287）や、３’末端や５’末端の突出部を有していない二本鎖核酸などを用いることもできる。
　本発明の二本鎖核酸としては、標的遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列と同一の配列からなる核酸を用いてもよいが、該核酸の少なくとも一方の鎖の５’末端または３’末端が１～４塩基削除された核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を用いてもよい。
　また、本発明の核酸としては、一本鎖の核酸を用いることもできる。そのような核酸の例として、配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸や、これらの核酸において１～３塩基、好ましくは１～２塩基、より好ましくは１塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸もあげることができる。またこれらの核酸を含む、３０塩基以下、好ましくは２９塩基以下、より好ましくは２７塩基以下、さらに好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２３塩基以下の核酸をあげることができる。
　本発明の核酸としては、上記した二本鎖核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、スペーサー配列を介して連結して一本鎖核酸としたものであってもよい。該一本鎖核酸としては、ステムループ構造によって二重鎖形成部を有するｓｈＲＮＡ等の一本鎖核酸であることが好ましい。ステムループ構造を有する一本鎖核酸は、通常５０～７０塩基長である。
　本発明の核酸としては、リボヌクレアーゼ等の作用により上記の一本鎖核酸または二本鎖核酸を生成するように設計した、７０塩基長以下、好ましくは５０塩基長以下、さらに好ましくは３０塩基長以下の核酸であってもよい。
　本発明の核酸を製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等があげられる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、CEM法［Nucleic Acid Research, 35, 3287 (2007)］等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度９０％以上、好ましくは９５％以上の核酸を得るのが望ましい。二本鎖核酸の場合には、合成および精製したセンス鎖、アンチセンス鎖を適当な比率、例えば、アンチセンス鎖１当量に対して、センス鎖０．１～１０当量、好ましくは０．５～２当量、より好ましくは０．９～１．１当量、さらに好ましくは等モル量で混合した後、アニーリングを行って用いてもよいし、または、混合したものをアニーリングする工程を省いて直接用いてもよい。アニーリングは、二本鎖核酸を形成できる条件であればいかなる条件で行ってもよいが、通常、センス鎖、アンチセンス鎖をほぼ等モル量で混合した後、９４℃程度で５分程度加熱したのち、室温まで徐冷することにより行われる。本発明の核酸を製造する酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはＤＮＡを鋳型としてファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法があげられる。
　本発明の核酸は、トランスフェクション用の担体、好ましくはカチオン性リポソーム等のカチオン性担体を用いて細胞内に導入することができる。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法などにより、直接細胞内に導入することもできる。
　本発明の核酸の代わりに、細胞内に導入してこれらが発現されるようなベクターを用いてもよい。具体的には、本発明の核酸をコードする配列を発現ベクター内のプロモーター下流に挿入して発現ベクターを構築し、細胞に導入することにより該核酸等を発現させることができる。
　発現ベクターとしては、pCDNA6.2-GW/miR（Invitrogen社製）、pSilencer 4.1-CMV（Ambion社製）、pSINsi-hH1 DNA（タカラバイオ社製）、pSINsi-hU6 DNA（タカラバイオ社製）、pENTR/U6（Invitrogen社製）等をあげることができる。
　また、本発明の核酸をコードする配列をウイルスベクター内のプロモーター下流に挿入し、該ベクターをパッケージング細胞に導入して生産した組換えウイルスベクターを用いることもできる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどがあげられる。
２．HIF-2αの発現抑制活性を有する核酸
　HIF-2αの発現抑制活性を有する二本鎖核酸の第１の選択基準としては、hif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸であることである。該一部の塩基配列からなる核酸は、(a)ＧまたはＣが４塩基以上続く配列がない、(b)ＧＣ含量が２０～８０％であることを第２の選択基準として選択することが好ましい。
　hif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸は、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．NM_001430.3として登録されているhif-2αの完全長ｍＲＮＡのｃＤＮＡ塩基配列（配列番号９７）に基づいて設計することができる。
　hif-2α遺伝子の一部の塩基配列のうち、HIF-2αの発現抑制活性を有する核酸を設計するために用いられる塩基配列としては、例えば配列番号１～１９のいずれか１つで表される塩基配列が好ましく、配列番号１、６および１５のいずれか１つで表される塩基配列がさらに好ましく、配列番号１で表される塩基配列が特に好ましい。
　このようにして選択される核酸としては、例えばhif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とを含有し、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸とからなる二本鎖核酸があげられる。該二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常１５～３０塩基からなるが、１５～２９からなることが好ましく、１５～２７からなることがより好ましく、１５～２５からなることがさらに好ましく、１７～２３からなることが特に好ましく、１９～２1からなることが最も好ましい。該二本鎖核酸は通常１５～２７塩基対、好ましくは１５～２５塩基対、より好ましくは１５～２３塩基対、さらに好ましくは１５～２１塩基対、特に好ましくは１５～１９塩基対からなる二重鎖形成部を有している。
　該二本鎖核酸の具体例として、下記（ａ）～（ｆ）があげられる。
（ａ）hif-2のｍＲＮＡの相補配列に該当する、配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列を含むアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的なセンス鎖塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸。
（ｂ）配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸。
（ｃ）配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸の５’末端または３’末端のうち、少なくとも一方の末端が１～４塩基削除されたアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とからなる二本鎖核酸。
（ｄ）配列番号１～１９のいずれか１つで表される塩基配列からなるセンス鎖核酸と、配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸（ここで、センス鎖の配列番号ｎ（ｎは１～１９である）に対してアンチセンス鎖の配列番号はｎ＋２１である）とからなる二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖において、１～３塩基、好ましくは１～２塩基、より好ましくは１塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する二本鎖核酸。
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つに記載の二本鎖核酸において、二重鎖形成部が２７塩基対以下、好ましくは２５塩基対以下、より好ましくは２３塩基対以下、さらに好ましくは２１塩基対以下、特に好ましくは１９塩基対以下である二本鎖核酸。
（ｆ）（ａ）～（ｅ）のいずれか１つに記載の二本鎖核酸において、アンチセンス鎖核酸またはセンス鎖核酸の少なくとも一方の核酸の３’末端または５’末端に、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を１～４塩基、好ましくは１～３塩基、より好ましくは１～２塩基、さらに好ましくは２塩基付加した二本鎖核酸。
　上記（ｆ）の二本鎖核酸の具体的な例として、配列番号Ｎで表される塩基配列からなる核酸と、その相補鎖として配列番号Ｎ＋２１で表される塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸があげられる。ここで、Ｎは４３～６１のいずれか１つの整数を示す。
　HIF-2αの発現抑制活性を有する一本鎖核酸としては、hif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖核酸を用いることもできる。そのような核酸の例として、配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸や、これらの核酸において、１～３塩基、好ましくは１～２塩基、より好ましくは１塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸もあげることができる。またこれらの核酸を含む、３０塩基以下、好ましくは２９塩基以下、より好ましくは２７塩基以下、さらに好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２３塩基以下の核酸をあげることができる。
　HIF-2αの発現抑制活性を有する一本核酸としては、hif-2α遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる、下記（Ａ）～（Ｇ）の一本鎖核酸もあげられる。
（Ａ）hif-2αのｍＲＮＡの相補配列に該当する、配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列を含むアンチセンス鎖核酸と、該塩基配列に対して相補的なセンス鎖核酸とをスペーサー配列を介して連結してなる一本鎖核酸。
（Ｂ）配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸と、該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とをスペーサー配列を介して連結してなる一本鎖核酸。
（Ｃ）配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸の５’末端または３’末端のうち、少なくとも一方の末端が１～４塩基削除されたアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるセンス鎖核酸とをスペーサー配列を介して連結してなる一本鎖核酸。
（Ｄ）配列番号１～１９のいずれか１つで表される塩基配列からなるセンス鎖核酸と、配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなるアンチセンス鎖核酸とをスペーサー配列を介して連結してなる一本鎖核酸に含まれる、センス鎖またはアンチセンス鎖の少なくとも一方の鎖において、１～３塩基、好ましくは１～２塩基、より好ましくは１塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する二本鎖核酸。
（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つに記載の一本鎖核酸に含まれるセンス鎖とアンチセンス鎖とが２７塩基対以下、好ましくは２５塩基対以下、より好ましくは２３塩基対以下、さらに好ましくは２１塩基対以下、特に好ましくは１９塩基対以下の二重鎖を形成する一本鎖核酸。
（Ｆ）ステムループ構造によって二重鎖形成部を形成する（Ａ）～（Ｅ）のいずれか１つに記載の一本鎖核酸。
（Ｇ）５０～７０塩基長からなる（Ａ）～（Ｆ）のいずれか１つに記載の一本鎖核酸。
　これらの一本鎖核酸または二本鎖核酸を細胞に導入することにより、HIF-2αの発現を抑制することができる。アンチセンスＤＮＡを用いたhif-2αのｍＲＮＡの発現抑制においては、一般的にアンチセンスＤＮＡを数十ｎＭから数百ｎＭの濃度で必要とするのと比較して、例えば本発明の二本鎖核酸は、数百ｐＭ～数ｎＭの濃度でも、細胞に導入した後、２４時間以上、例えば４８時間培養した段階でもhif-2αのｍＲＮＡの発現を抑制することができる。
　また、本発明の一本鎖核酸または二本鎖核酸のhif-2αのｍＲＮＡの発現抑制活性の評価は、該核酸等を培養系癌細胞などにカチオン性リポソームなどを用いてトランスフェクションし、一定時間培養した後、当該癌細胞におけるhif-2αのｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ＰＣＲで定量することにより行うことができる。またその効果として血管新生因子の発現を抑制する効果については、本発明の一本鎖核酸または二本鎖核酸を導入した細胞が産生する血管新生因子VEGFの蛋白質量を定量することで、評価することができる。さらに細胞増殖を抑制する効果については、本発明の一本鎖核酸または二本鎖核酸を導入した細胞の生細胞数を算出することにより、評価することができる。
３．本発明の医薬組成物
　本発明は、一本鎖核酸、二本鎖核酸等の核酸またはベクターを有効成分として含有する医薬組成物に関する。当該医薬組成物は、核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体をさらに含むことができる。本発明の医薬組成物は、血管新生抑制剤として用いることができ、血管新生抑制が有効な癌、糖尿病性網膜症、リウマチなどの疾患、HIF-2αの過剰発現が原因となっている疾患、VHLが変異していることが原因となっている疾患の治療剤または予防剤としても用いることができる。癌としては、例えば腎癌、肝臓癌、皮膚癌、乳癌、肺癌、消化器癌、頭頚部癌、前立腺癌、子宮癌、膀胱癌などの固形癌をあげることができる。
　核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体としては、例えばカチオン性担体があげられる。カチオン性担体としては、カチオン性リポソームおよびカチオン性ポリマーなどがあげられる。また、核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体として、ウイルスエンベロープを利用した担体を用いてもよい。カチオン性リポソームとしては、２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールを含有するリポソーム（以下リポソームＡともいう）、オリゴフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、リポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社）、ＴｒａｎｓＩＴ ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ社）、などが好ましく用いられる。カチオン性ポリマーとしては、ＪｅｔＳＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社）、Ｊｅｔ－ＰＥＩ（ポリエチレンイミン；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社）などが好ましく用いられる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ（ＨＶＪ－Ｅリポソーム；石原産業社）などが好ましく用いられる。
　本発明の医薬組成物に含まれる一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターに上記担体を含む組成物は、当業者に既知の方法により調製することができる。例えば、適当な濃度の担体分散液と一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクター溶液とを混合して調製することができる。カチオン性担体を用いる場合、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターは水溶液中で負電荷を帯びているため、常法により水溶液中で混合することによって容易に調製することができる。該組成物を調製するために用いる水性溶媒としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、マルトース液などの糖液などがあげられる。また、該組成物を調製する際のｐＨおよび温度などの条件は当業者が適宜選択できる。例えば、リポソームＡの場合、１０％マルトース水溶液中の１６ｍｇ／ｍｌのリポソーム分散液に、１０％マルトース水溶液中のオリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液を、ｐＨ７．４、２５℃で撹拌しながら徐々に添加して調製することができる。
　該組成物は、必要ならば超音波分散装置や高圧乳化装置などを用いて分散処理を行うことにより、均一な組成物とすることもできる。当業者であれば、担体と一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターとを含む組成物の調製に最適な方法および条件は、用いる担体に依存するので、上記の方法にとらわれることなく、用いる担体に最適な方法を選択できる。
　本発明の医薬組成物としては、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターとリード粒子とを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在するリポソームも好適に用いられる。リード粒子としては、例えば、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を構成成分とする微粒子のことであり、好ましくはリポソームを構成成分とする微粒子があげられる。本発明におけるリード粒子は、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を2つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等と他の化合物(例えば糖、脂質、無機化合物等)とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよい。
　該複合粒子を被覆する脂質膜としては、例えば中性脂質およびポリエチレングリコール－ホスファチジルエタノールアミン等を構成成分とするものがあげられる。
　該リポソームは、例えばWO2006/080118等に記載の方法に従って調製することができる。
　本発明の医薬組成物に含まれる一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターと担体との配合比は、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターの１重量部に対して担体１～２００重量部が適当である。好ましくは、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターの１重量部に対して担体２．５～１００重量部、さらに好ましくは担体１０～２０重量部である。
　本発明の医薬組成物には、上記担体の他に、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などを含んでいてもよい。医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などは、本質的に化学的に不活性および無害な組成物であり、本発明の医薬組成物の生物学的活性に全く影響を与えないものである。そのようなキャリアーまたは希釈剤の例は、塩溶液、糖溶液、グリセロール溶液、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。
　本発明の医薬組成物は、疾患の治療または予防に有効な量の該複合体を含み、かつ、患者に適切に投与できるような形態で提供される。本発明の医薬組成物の製剤形態は、例えば注射剤、点眼剤、吸入用などの液剤、例えば軟膏、ローション剤などの外用剤等であってもよい。
　液剤の場合、本発明の医薬組成物の濃度範囲は通常、０．００１～２５％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．０１～５％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．１～２％（ｗ／ｖ）である。本発明の医薬組成物は医薬的に許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を適当量含有していてもよい。医薬的に許容される任意の添加剤は、該複合体の分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
　凍結乾燥製剤は、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターと担体とを分散処理した後、凍結乾燥処理することにより調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。例えば、上記の分散処理後の複合体溶液を無菌状態にて所定量をバイアル瓶に分注し、約－４０～－２０℃の条件で予備乾燥を約２時間程度行い、約０～１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５～２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、例えばバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓することにより、本発明の医薬組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
　本発明の医薬組成物は、任意の適当な溶液の添加によって再溶解し、使用することができる。このような溶液としては、注射用水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、その他一般輸液などをあげることができる。この溶液の液量は、用途などによって異なり、特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５～２倍量、または５００ｍｌ以下が好ましい。
　本発明の医薬組成物は、ヒトを含む動物に対し、例えば静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与または経直腸投与することができるが、患者の症状に合わせた適切な方法により投与することが好ましい。特に静脈投与、経皮投与、経粘膜投与が好ましく用いられる。また、癌内局所投与など、局所投与をすることもできる。これらの投与方法に適した剤型としては、例えば各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等があげられる。
　本発明の医薬組成物の用量は、薬物、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度などを考慮した上で決定することが望ましいが、通常は一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターの質量として、成人に対して１日当たり、０．１ｍｇ～１０ｇ／日、好ましくは１ｍｇ～５００ｍｇ／日である。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また１日１回～数回投与することもでき、１日～数日の間隔をおいて投与することもできる。
　以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
hif-2α遺伝子の発現を抑制する核酸の設計とその評価
（１）二本鎖核酸の調製
　hif-2α遺伝子の発現を抑制できる核酸の配列として、hif-2αのｍＲＮＡ配列(GenBank登録番号:NM_001430.3、配列番号９７)から、(a)ＧまたはＣが４塩基以上続く配列がない、(b)ＧＣ含量が20～80%である、(c)より好ましくは５’側もしくは３’側非翻訳領域に位置する、の３つの条件に当てはまる配列１９組を選択した。配列は配列番号Ｎ、およびその相補配列として配列番号ｎ＋２１の塩基配列で示す。ここでｎは１から１９までの整数である。配列番号１～１９で表される配列からなるＲＮＡのそれぞれの３’端に、適宜２塩基からなるＤＮＡ配列を付加し、配列番号Ｎで表される塩基配列からなる核酸と、その相補鎖として配列番号Ｎ＋２１で表される塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸である、ｓｉＲＮＡを設計した。ここでＮは４３から６１までの整数を示す。
　二本鎖核酸を構成する核酸の合成は、株式会社ジーンデザインに依頼した。
（２）スクリーニングにおける評価方法
　スクリーニングにおける評価は、二本鎖核酸を担体と共に各種癌細胞に導入し、hif-2αのｍＲＮＡ量をＲＴ－ＰＣＲ（Reverse transcription-polymerase chain reaction）を用いて定量することにより行った。
（３）二本鎖核酸と担体の複合体の調製
　担体として、市販のカチオニックリポソームであるハイパーフェクト（QIAGEN社製）を用い、添付の使用説明書に記載された方法に従って二本鎖核酸－ハイパーフェクトの複合体を調製した。
（４）二本鎖核酸によるhif-2αのｍＲＮＡの発現抑制
　二本鎖核酸のトランスフェクションによりhif-2αのｍＲＮＡの発現が抑制されるかどうかを調べるため、hif-2αのｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ＰＣＲによる準定量により評価した。
　二本鎖核酸としては、配列番号Ｎで表される塩基配列からなる核酸と配列番号Ｎ＋２１で表される塩基配列からなる核酸を用いた。ここでＮは４３～６１までの整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
   　 
　表１に示されるとおり、配列番号Ｎ（４３～６１）で表される塩基配列からなる核酸と配列番号Ｎ＋２１（６４～８２）で表される塩基配列からなる核酸で形成される二本鎖核酸は、それぞれHIF-2 siRNA #1～#19ともいう。表１中で大文字はリボヌクレオチド、小文字はデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ示す。
　ヒトのいずれの遺伝子とも交差しないｓｉＲＮＡであるNontargeting siRNA #1（以下、Nontargeting#1ともいう）（Dharmacon社製）を陰性対照として用いた。また、配列番号６２で表される塩基配列からなる核酸と配列番号８３で表される塩基配列からなる核酸（以下、Control#1ともいう。Journal of Cellular Biochemistry, 92, 491-501 (2004)）、および配列番号６３で表される塩基配列からなる核酸と配列番号８４で表される塩基配列からなる核酸（以下、Control# 2ともいう。PLoS Biology, 1(3), 439-444 (2003)）を、陽性対照として用いた。
　これらの二本鎖核酸を、以下の方法により、それぞれヒト腎臓細胞であるA-498細胞（1260933853765_1.htmlHTB 44）に導入した。
　96ウェルの培養プレートに、MEM（GIBCO社製、11095）で希釈した二本鎖核酸を10μLずつ分注した後、添付の使用説明書に記載された量となるようにMEMで希釈したハイパーフェクトを10μLずつ添加して、二本鎖核酸－ハイパーフェクト複合体を調製した。次に、1.11％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Non-Essential Amino-acids（NEAA）、Pyruvateを含むMEMに懸濁させたA-498細胞を、5000細胞数/180μL/ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養することで、二本鎖核酸をA-498細胞に導入した。二本鎖核酸の最終濃度は200pMとなるように調製した。
　二本鎖核酸を導入した細胞を３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養し、氷冷したＰＢＳで洗浄し、Cells-to-Ct Kit（ABI社製）を用いて全ＲＮＡを回収し、製品に添付された説明書に記載された方法に従い逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作製した。
　得られたｃＤＮＡを鋳型とし、Universal Probe Library（Roche Applied Science社製）をプローブとして、ABI7900HT Fast（ABI社製）を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってＰＣＲ反応させることにより、hif-2α遺伝子および構成的発現遺伝子であるgapdh（D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子をＰＣＲ反応させて得られた増幅量から、それぞれhif-2αのｍＲＮＡ量およびgapdhのｍＲＮＡ量の準定量値を算出した。hif-2αのｍＲＮＡ量を準定量するに際しては、対応するサンプルのgapdhのｍＲＮＡ量を内部対照とした上で算出した。
　hif-2αのｍＲＮＡ量についての結果を図１に示す。なお、検体のｍＲＮＡ量は、担体のみを処理した群（mock群）における、hif- 2αのｍＲＮＡ量およびgapdhのｍＲＮＡ量を、それぞれ１としたときの相対的な割合として表した。
　図１に示されるとおり、hif-2α遺伝子を標的とする本発明の二本鎖核酸を導入したA-498細胞は、陰性対照と比較してhif-2αのｍＲＮＡ量が低下した。
二本鎖核酸によるvegfaのｍＲＮＡの発現抑制
　HIF-2によりその転写が促進される血管新生因子であるVEGFの発現が、hif-2αのｍＲＮＡの発現抑制に伴って抑制されるかどうかを、実施例１（４）に記載されたＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ量の準定量と同様の方法で評価した。VEGFをコードする遺伝子であるvegfaのｍＲＮＡ量についての結果を図２に示す。
　図２に示されるとおり、hif-2α遺伝子を標的とする本発明の二本鎖核酸を導入したA-498細胞は、陰性対照と比較してvegfaのｍＲＮＡ量が低下した。
二本鎖核酸のin vitroにおける抗細胞増殖活性
　384ウェルの培養プレートに、MEM（GIBCO社製、11095）で希釈した二本鎖核酸を6μLずつ分注した後、添付の使用説明書に記載された量となるようにMEMで希釈したハイパーフェクトを10μLずつ添加して、二本鎖核酸－ハイパーフェクト複合体を調製した。次に、1.47％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Non-Essential Amino-acids (NEAA)、Pyruvateを含むMEMに懸濁させたA-498細胞を、2000細胞数/34μL/ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養することで、二本鎖核酸をA-498細胞に導入した。二本鎖核酸の最終濃度は、それぞれ1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001ｎＭとなるように調製した。
　なお、二本鎖核酸の濃度は、それぞれの鎖が完全に二本鎖を形成していると仮定したときのモル濃度で示している。
　二本鎖核酸を導入した細胞を３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で７日間培養し、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay（Promega社製）を用いて生細胞率を測定した。測定方法は製品に添付された説明書に記載された方法に従った。担体のみ処理した場合のA-498細胞の生細胞率を１００％として、それぞれの相対生細胞率を計算した。その結果を図３および図４に示す。
　図３および図４に示されるとおり、hif-2α遺伝子を標的とする二本鎖核酸の導入による生細胞率の減少は認められず、本発明の二本鎖核酸は細胞増殖を阻害しないことが示された。
修飾二本鎖核酸によるhif-2α、vegfaのｍＲＮＡの発現抑制
　二本鎖核酸を修飾することにより、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）耐性の向上や免疫原性の低下などの効果が見込まれる一方、RNAi効果が低下する場合もある。修飾により活性が変化するかを調べるため、hif-2αおよびvegfaのｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ＰＣＲによる準定量により評価した。
　修飾二本鎖核酸の修飾ヌクレオチドとしては、Oligonucleotides, 18(2), 187-200 (2008)を参考にして、リボヌクレオチドのリボースの２’－ＯＨ基を２’－メトキシ基で置換したものを用いた。修飾二本鎖核酸としては、配列番号Ｎ’で表される塩基配列からなる核酸と配列番号Ｎ’＋６で表される塩基配列からなる核酸を用い、それぞれ対応する無修飾の二本鎖核酸による結果と比較した。ここでＮ’は８５～９０までの整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　表２に示されるとおり、配列番号Ｎ’（８５～９０）で表される塩基配列からなる核酸と配列番号Ｎ’＋６（９１～９６）で表される塩基配列からなる核酸で形成される二本鎖核酸は、それぞれHIF-2 siRNA #1-OMe, #4-OMe, #6-OMe, #9-OMe, #11-OMe, #15-OMeともいう。これらに対応する無修飾の二本鎖核酸がそれぞれ表１に示されるHIF-2 siRNA #1, #4, #6, #9, #11, #15である。なお、表２中で大文字はリボヌクレオチド、小文字はデオキシリボヌクレオチド、斜体文字はリボースの２’-ＯＨ基が２’-メトキシ基に置換されたヌクレオチドを、それぞれ示す。 
　hif-2αおよびvegfaのｍＲＮＡ量について、実施例１（４）に記載されたＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ量の準定量と同様の方法で評価した結果を、それぞれ図５および図６に示す。
　図５および図６に示されるとおり、hif-2α遺伝子を標的とする本発明の修飾二本鎖核酸を導入したA-498細胞は、陰性対照と比較してhif-2α、vegfaのｍＲＮＡ量が低下した。中でも、HIF-2 siRNA #1-OMe, #6-OMe, #15-OMeは高い抑制活性を保持した。
　本発明により、HIF-2αの発現抑制活性を有する核酸、該核酸を有効成分とする医薬組成物などが提供される。本発明の核酸および、医薬組成物は、血管新生を抑制し、癌、糖尿病性網膜症、リウマチなどの疾患の治療に有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２００９－２８５２１５（出願日：２００９年１２月１６日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (27)

  1. 配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸または該核酸の少なくとも一方の末端が１～４塩基削除された核酸と、
    該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とを含有し、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸；または
    配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸または該核酸の少なくとも一方の末端が１～４塩基削除された核酸と、
    該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸の少なくとも一方の核酸において、１～３塩基が置換、欠失もしくは付加された核酸とを含有し、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸。
  2. ２７塩基対以下の二重鎖形成部を有する、請求項１に記載の核酸。
  3. １５～１９塩基対からなる二重鎖形成部を有する、請求項２に記載の核酸。
  4. HIF-2αの発現抑制活性を有する核酸が二本鎖核酸である、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸。
  5. 請求項４に記載の二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖の３’末端または５’末端に１～４塩基付加した核酸。
  6. 配列番号２２～４０のいずれか１つで表される塩基配列からなる核酸。
  7. 請求項６に記載の核酸において、１～３塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸。
  8. 請求項６または７に記載の核酸を含む、３０塩基以下の核酸。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸を構成するヌクレオチドの一部または全部がリボヌクレオチドであり、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸。
  10. 請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸を構成するヌクレオチドの一部または全部が、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであり、かつHIF-2αの発現抑制活性を有する核酸。
  11. 修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、リボヌクレオチドの２’－修飾ヌクレオチドである、請求項１０に記載の核酸。
  12. ３’末端または５’末端に付加した１～４塩基の少なくとも１塩基がデオキシリボヌクレオチドである、請求項１０に記載の核酸。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の核酸をコードするベクター。
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸またはベクターを有効成分とする、医薬組成物。
  15. 核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体をさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体がカチオン性担体である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体がリポソームである、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. リポソームがHIF-2αをコードする遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームである、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 核酸またはベクターとリード粒子とを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在するリポソームである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  20. HIF-2αの発現を抑制することを特徴とする、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  21. 血管新生抑制剤である、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 癌、糖尿病性網膜症またはリウマチの治療剤または予防剤である、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  23. 請求項１～２２のいずれか１項に記載の核酸、ベクターまたは医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、HIF-2αの発現を抑制する方法。
  24. 請求項１～２２のいずれか１項に記載の核酸、ベクターまたは医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、血管新生を抑制する方法。
  25. 請求項１～２２のいずれか１項に記載の核酸、ベクターまたは医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、癌、糖尿病性網膜症もしくはリウマチを治療または予防する方法。
  26. 医薬組成物の製造のための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸またはベクターの使用。
  27. 癌、糖尿病性網膜症もしくはリウマチの治療または予防における使用のための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸またはベクター。
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