JP6457704B2 - 高活性及びオフターゲット削減のためのｓｉＲＮＡ構造 - Google Patents
高活性及びオフターゲット削減のためのｓｉＲＮＡ構造 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6457704B2 JP6457704B2 JP2018530704A JP2018530704A JP6457704B2 JP 6457704 B2 JP6457704 B2 JP 6457704B2 JP 2018530704 A JP2018530704 A JP 2018530704A JP 2018530704 A JP2018530704 A JP 2018530704A JP 6457704 B2 JP6457704 B2 JP 6457704B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- gst
- sirna
- acid molecule
- antisense strand
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 73
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 title description 27
- 230000009467 reduction Effects 0.000 title description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 148
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 143
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 135
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 132
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 126
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 120
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 117
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 117
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 78
- 101000891649 Homo sapiens Transcription elongation factor A protein-like 1 Proteins 0.000 claims description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 69
- 101000596402 Mus musculus Neuronal vesicle trafficking-associated protein 1 Proteins 0.000 claims description 68
- 101000800539 Mus musculus Translationally-controlled tumor protein Proteins 0.000 claims description 68
- 101000781972 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) Protein wos2 Proteins 0.000 claims description 68
- 101001009610 Toxoplasma gondii Dense granule protein 5 Proteins 0.000 claims description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 67
- 102100040250 Transcription elongation factor A protein-like 1 Human genes 0.000 claims description 62
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 57
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 49
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 37
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 36
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 8
- -1 huntingtin Proteins 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 6
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 claims description 5
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 4
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 claims description 4
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 claims description 4
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 claims description 4
- 125000001921 locked nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 101710095342 Apolipoprotein B Proteins 0.000 claims description 3
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004510 Collagen Type VII Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017377 Collagen Type VII Proteins 0.000 claims description 3
- 108010028780 Complement C3 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016918 Complement C3 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010002947 Connectin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004726 Connectin Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 claims description 3
- 102000012605 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Human genes 0.000 claims description 3
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 3
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 claims description 3
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims description 3
- 108010069013 Phenylalanine Hydroxylase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038223 Phenylalanine-4-hydroxylase Human genes 0.000 claims description 3
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 claims description 3
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022978 Sex-determining region Y protein Human genes 0.000 claims description 3
- 102000011856 Utrophin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010075653 Utrophin Proteins 0.000 claims description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 claims description 3
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 claims 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 131
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 80
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 78
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 description 46
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 40
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 35
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 33
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 30
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 28
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 description 28
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 28
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 26
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 24
- 239000002585 base Substances 0.000 description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 20
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 20
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 20
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 20
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 19
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 19
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 18
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 18
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 17
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 16
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 15
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 14
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 14
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 13
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 12
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 12
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101150018337 Serpinh1 gene Proteins 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 101001056180 Homo sapiens Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Proteins 0.000 description 10
- 102100026539 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Human genes 0.000 description 10
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 10
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 10
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 9
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 9
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 9
- 102100021573 Bcl-2-binding component 3, isoforms 3/4 Human genes 0.000 description 8
- 101000971203 Homo sapiens Bcl-2-binding component 3, isoforms 1/2 Proteins 0.000 description 8
- 101000971209 Homo sapiens Bcl-2-binding component 3, isoforms 3/4 Proteins 0.000 description 8
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 8
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 7
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 7
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 7
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000037440 gene silencing effect Effects 0.000 description 5
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 108091060570 RasiRNA Proteins 0.000 description 4
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000003076 Angiosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 206010061825 Duodenal neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000001258 Hemangiosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 208000006644 Malignant Fibrous Histiocytoma Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 206010054184 Small intestine carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000000312 duodenum cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 208000012804 lymphangiosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000000779 thoracic wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000002100 tumorsuppressive effect Effects 0.000 description 3
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010073360 Appendix cancer Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102100033270 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 2
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 2
- 101000944380 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 208000015778 Undifferentiated pleomorphic sarcoma Diseases 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000021780 appendiceal neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000011717 athymic nude mouse Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000004611 cancer cell death Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000892 gravimetry Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 102000049765 human CDKN1A Human genes 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N (+)-propylene glycol Chemical compound C[C@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 1,3-propanediol Substances OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTQUILVPBZEHTK-ZOQUXTDFSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1N(C)C(=O)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UTQUILVPBZEHTK-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- QPHRQMAYYMYWFW-FJGDRVTGSA-N 1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@]1(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 QPHRQMAYYMYWFW-FJGDRVTGSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 4-Thiouridine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJWBTAIPBFWVHX-FJGDRVTGSA-N 4-amino-1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@](F)(O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PJWBTAIPBFWVHX-FJGDRVTGSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZXFLCMHBSA-N 5-[(3ar,4r,6as)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid Chemical group N1C(=O)N[C@H]2[C@@H](CCCCC(=O)O)SC[C@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZXFLCMHBSA-N 0.000 description 1
- AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 5-bromouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASUCSHXLTWZYBA-UMMCILCDSA-N 8-Bromoguanosine Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=C(Br)N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O ASUCSHXLTWZYBA-UMMCILCDSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 9beta-Ribofuranosyl-7-deazaadenin Natural products C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150019464 ARAF gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061692 Benign muscle neoplasm Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101150113634 CDKN1A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100005878 Caenorhabditis elegans fmi-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000000578 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p21 Human genes 0.000 description 1
- 108010016788 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p21 Proteins 0.000 description 1
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000003718 Dual-Luciferase Reporter Assay System Methods 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000040718 GST family Human genes 0.000 description 1
- 108091071249 GST family Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000007648 Glutathione S-Transferase pi Human genes 0.000 description 1
- 108010007355 Glutathione S-Transferase pi Proteins 0.000 description 1
- 102000001214 HSP47 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010055039 HSP47 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001010139 Homo sapiens Glutathione S-transferase P Proteins 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 201000004458 Myoma Diseases 0.000 description 1
- WVGPGNPCZPYCLK-WOUKDFQISA-N N(6),N(6)-dimethyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(N(C)C)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WVGPGNPCZPYCLK-WOUKDFQISA-N 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N N(6)-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- WVGPGNPCZPYCLK-UHFFFAOYSA-N N-Dimethyladenosine Natural products C1=NC=2C(N(C)C)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O WVGPGNPCZPYCLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N NSC 29409 Natural products C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 101710150974 Regulator of chromosome condensation Proteins 0.000 description 1
- 102100039977 Regulator of chromosome condensation Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000000488 breast squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000036576 dermal application Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000053366 human GSTP1 Human genes 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003601 intercostal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000003961 penetration enhancing agent Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 1
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 208000013274 squamous cell breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N tubercidin Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01018—Glutathione transferase (2.5.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
- C12N2310/3521—Methyl
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
- C12N2310/3533—Halogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
- C12N2320/53—Methods for regulating/modulating their activity reducing unwanted side-effects
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明は、核酸を基礎とする分子からなる生物医薬品及び治療剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子発現を調節するためのRNA干渉（RNAi）を利用した化合物の構造及びその利用に関する。
ND6122770WO_SL.txtと名付けられた2016年1月2日に作成された170,872バイトのサイズであるASCIIファイルとして電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
RNA干渉（RNAi）は、短い干渉RNA（siRNA）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを意味する。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Fireら、Nature、1998、Vol. 391、806811頁; Sharp、Genes＆Development、1999、Vol. 13、pp. 139-141参照。
細胞内のRNAi応答は、二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発することができるが、メカニズムはまだ完全には理解されていない。一般的に、siRNAは約21〜約23ヌクレオチドの長さとすることができ、約19ヌクレオチド長の塩基対二本鎖領域を含むことができる。
RNAiは、RNA誘発サイレンシング複合体（RISC）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体に関与する。siRNAは、RISC複合体に入るアンチセンス又はガイド鎖であって、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNA標的の切断を媒介するアンチセンス又はガイド鎖を有する。siRNAの他方の鎖はパッセンジャー鎖である。標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（例えば、Elbashirら、Genes＆Development、2001、Vol. 15、188〜200頁参照）。
医薬品として使用されるsiRNA化合物の特性を改善するため、siRNA化合物の構造を様々な方法で改変することで、安定性を改善し、オフターゲット効果を削減している。siRNAのオフターゲット活性には、様々な機序を介して起こり得る標的RNA以外の細胞核酸の調節が関与している。
siRNA化合物の修飾には、いずれかのヌクレオチドにおける塩基、糖及び/又は骨格の構造的変異が含まれる。siRNAヌクレオチドを改変する1つの方法として、siRNA中の特定のリボヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置き換えることがある。特に、デオキシヌクレオチドは、siRNA構造のオーバーハング又は末端ヌクレオチドにおいてしばしば利用される。
しかしながら、siRNA構造にデオキシヌクレオチドを使用することの難点としては、デオキシヌクレオチドをsiRNAのシード領域に使用できないことが挙げられる。これは、遺伝子サイレンシング活性が低下するため、このようなsiRNAの改変が好ましくないという理由である。
活性を失うことなくオフターゲット作用を低減できる、遺伝子発現を調節するためのRNAi構造について、緊急の必要性が存在する。
特に、癌遺伝子及び癌関連遺伝子のRNAi抑制に基づく治療薬には、高度に強力且つ安定なsiRNA配列及び構造が必要とされる。
遺伝子発現を調節するための高活性な構造を有するsiRNA化合物が必要とされている。
本発明は、RNA干渉を用いて標的遺伝子の発現を調節するための化合物、組成物及び方法に関する。本開示に係るsiRNA化合物及び構造は、遺伝子発現を調節するために高活性とすることができる。
本発明に係るRNAi構造は、驚くほど高いレベルの活性を有し、且つオフターゲット作用が低下し、遺伝子発現を調節するために使用することができる。
ある実施形態において、本発明は、活性を失うことなくオフターゲット作用を低減した、RNA干渉による遺伝子サイレンシングのための分子を提供する。
更なる実施形態において、本発明は、予測できないほど高い遺伝子サイレンシング活性を有し、オフターゲット作用を低減したRNA干渉による遺伝子サイレンシングのための分子を提供する。
本発明のRNAi分子は、遺伝子のRNAi抑制に基づく治療に使用することができる非常に強力で安定なsiRNA構造を提供することができる。
更なる実施形態において、本発明の構造、分子及び組成物は、疾患を予防又は治療する方法、若しくは1つ又は複数の遺伝子に関連する状態又は障害の症状を改善する方法に使用することができる。
本発明の実施形態は以下を包含する。
核酸分子であって、
a) 当該分子はポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、
b) 当該分子のそれぞれの鎖は15〜30ヌクレオチド長であり、
c) 当該アンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域はmRNAの配列に対して相補的であり、
d) 当該センス鎖における少なくとも一部は当該アンチセンス鎖の少なくとも一部に対して相補的であり、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有し、ここで当該アンチセンス鎖の5’末端から3〜8位の当該二本鎖領域における1以上のヌクレオチドがデオキシヌクレオチドである。当該mRNAはヒトmRNAとすることができる。
a) 当該分子はポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、
b) 当該分子のそれぞれの鎖は15〜30ヌクレオチド長であり、
c) 当該アンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域はmRNAの配列に対して相補的であり、
d) 当該センス鎖における少なくとも一部は当該アンチセンス鎖の少なくとも一部に対して相補的であり、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有し、ここで当該アンチセンス鎖の5’末端から3〜8位の当該二本鎖領域における1以上のヌクレオチドがデオキシヌクレオチドである。当該mRNAはヒトmRNAとすることができる。
ある実施形態において、当該核酸分子アンチセンス鎖は、複数の位置にデオキシヌクレオチドを有することができ、当該複数の位置としては、以下から選ばれる1つである：
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置4、6及び8のそれぞれ；
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置3、5及び7のそれぞれ；
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置1、3、5及び7のそれぞれ；
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置3〜8のそれぞれ；及び
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置5〜8のそれぞれ
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置4、6及び8のそれぞれ；
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置3、5及び7のそれぞれ；
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置1、3、5及び7のそれぞれ；
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置3〜8のそれぞれ；及び
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置5〜8のそれぞれ
当該核酸分子は、mRNAの発現を調節するために活性であるRNAi分子とすることができる。
ある実施形態において、核酸分子は、タンパク質コード遺伝子、癌原遺伝子、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子及び細胞シグナル伝達遺伝子から選択される遺伝子の発現を阻害するために活性とすることができる。
さらなる実施形態において、当該mRNAは、SRY、β-グロビン、RAS、細胞質ゾルGST、ミトコンドリアGST、MAPEG GST、GST-π、p16、p21、p53、血清アルブミン、VII型コラーゲン、補体C3、アポリポタンパク質B、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、第VIII因子、ハンチンチン、RB1網膜芽細胞腫タンパク質、CFTR、タイチン、ウトロフィン及びジストロフィンを含むヒトタンパク質ファミリーに含まれる任意のメンバー又はサブメンバーを発現するヒトmRNAとすることができる。
核酸分子は、mRNAのノックダウンについて、100pM未満、又は50pM未満、又は10pM未満のIC50を有することができる。特定の実施形態では、核酸分子は、当該分子の単回投与後においてインビボでmRNAを少なくとも25％阻害することができる。
ある実施形態において、当該分子のそれぞれの鎖は18〜22ヌクレオチド長とする。二本鎖は19ヌクレオチド長とすることができる。ある実施形態において、ポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖は１つの鎖として連結していても良く、ループによって一方の末端で結合して二本鎖を形成していても良い。
核酸分子は平滑末端を有していても良い。ある実施形態において、核酸分子は１以上の3’オーバーハングを有していても良い。
本発明の実施形態は、二重鎖領域内に修飾又は化学修飾された1つ以上のヌクレオチドを有する核酸分子を含んでいる。修飾ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドは、2'-O-アルキル置換ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ロックドヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせとすることができる。
本発明はさらに、当該核酸分子及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を企図している。当該担体としては、脂質分子又はリポソームとすることができる。
本発明の実施形態は更に、当該核酸分子を含むベクター又は細胞を含んでいる。
本発明はまた、当該核酸分子を含む組成物を被験体に投与することによって、遺伝子サイレンシングにより必要とする被験体における疾患を予防、治療又は改善する方法を企図している。疾患は、悪性腫瘍、癌、肉腫又は上皮性悪性腫瘍とすることができる。
本発明の実施形態は、必要とする被験体における疾患又は状態を予防、改善又は治療するための核酸分子の組成物の使用を含んでいる。
ある実施形態において、本発明の組成物は、医学的治療に使用するためのものとすることができる。
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ヒト又は動物の体の治療に使用するためのものとすることができる。
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、必要とする被験体における疾患又は状態を予防、改善又は治療するための医薬を調製又は製造するためのものとすることができる。
本発明は遺伝子発現を調節するための核酸を基礎とする治療薬のための化合物、組成物及び方法に関する。
ある実施形態において、本発明は、RNA干渉において活性な分子、ならびに遺伝子の発現をサイレンシングできる構造及び組成物を提供する。
本開示に係る当該構造及び組成物は、様々な疾患を予防又は治療する際に使用することができる。
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の1つ以上の治療用RNAi分子の送達及び摂取のための組成物、ならびにその使用方法を提供する。本発明のRNAに基づく組成物は、悪性腫瘍、例えば癌を予防又は治療するための方法において使用することができる。
本発明の治療組成物は、RNA干渉において活性である核酸分子を含んでいる。治療用核酸分子は、遺伝子サイレンシングのための種々の遺伝子を標的とすることができる。
様々な実施形態において、本発明は、低分子干渉RNA（siRNA）として活性であり、遺伝子発現を調節又はサイレンシングすることができる分子の範囲を提供する。
本発明の実施形態はさらに、疾患の予防又は治療を必要とする被験体に本発明のsiRNAを送達するためのビヒクル、製剤又は脂質ナノ粒子製剤を提供する。本発明はさらに、siRNAを治療剤として哺乳動物に投与するための方法を企図している。
本発明の治療用分子及び組成物は、必要とする被験体に化合物又は組成物を投与することによって、疾患の予防又は治療を目的とするRNA干渉に使用することができる。
本発明は一定の範囲のRNAi分子を提供する。ここで、それぞれの分子はポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し；当該分子の各鎖は15〜30ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域はmRNAの配列に対して少なくとも一部が相補的であり；及び、センス鎖の少なくとも一部がアンチセンス鎖の少なくとも一部と相補的であり、且つ、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する。
本発明のRNAi分子は、ヒトmRNAの配列に対して相補的である、アンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができ、これは当該分子における二本鎖領域に位置する。
ある実施形態において、RNAi分子は、ヒトmRNAの配列に対して相補的である、アンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
本発明の実施形態は、更に、疾患又は状態の1つ以上の症状を予防、治療又は緩和する方法、疾患又は状態を発症するリスクを低下させる方法、若しくは、それを必要とする哺乳動物において疾患又は状態の発症を遅延させる方法を提供する。
ユニバーサルゲノムサイレンシグのためのRNAi構造
本発明の実施形態は、任意の遺伝子を標的とし、当該遺伝子の発現をサイレンシグする活性に優れたRNAi分子を提供する。
本発明の実施形態は、任意の遺伝子を標的とし、当該遺伝子の発現をサイレンシグする活性に優れたRNAi分子を提供する。
本開示のRNAi分子は、遺伝子の発現をサイレンシングする活性が驚くほど高く、オフターゲット効果を低減することができる。
ある実施形態において、本発明のRNAi分子は１以上の2'-デオキシヌクレオチドを含んでいる。これらの実施形態において、１以上の2'-デオキシヌクレオチドは、siRNAのシード領域に位置することができる。
１以上の2'-デオキシヌクレオチドはモノデオキシヌクレオチドとすることができる。
本明細書中で使用される場合、デオキシヌクレオチドは、モノ-2'-デオキシヌクレオチドを指す。
2'-デオキシヌクレオチドは、2’位をハロゲンで置換したものであってもよい。
ある実施形態において、本発明のRNAi分子は、siRNAのアンチセンス又はガイド鎖に１以上の2'-デオキシヌクレオチドを含んでいる。より具体的に、１以上のデオキシヌクレオチドは、siRNAのアンチセンス鎖の5’末端から位置1〜8に位置することができる。ある実施形態において、１以上のデオキシヌクレオチドは、siRNAのアンチセンス鎖の5’末端から位置2〜8に位置することができる。更なる実施形態において、１以上のデオキシヌクレオチドは、siRNAのアンチセンス鎖の5’末端から位置3〜8に位置することができる。
本発明は、複数の位置にデオキシヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を有することができるsiRNA構造を企図している。
ある実施形態において、siRNA構造は、アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6、及び8のそれぞれにデオキシヌクレオチドを含んでいるアンチセンス鎖を有することができる。
さらなる実施形態において、siRNA構造は、アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5、及び7のそれぞれにデオキシヌクレオチドを含んでいるアンチセンス鎖を有することができる。
さらなる実施形態において、siRNA構造は、アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5、及び7のそれぞれにデオキシヌクレオチドを含んでいるアンチセンス鎖を有することができる。
ある実施形態において、siRNA構造は、アンチセンス鎖の5’末端から位置3〜8のそれぞれにデオキシヌクレオチドを含んでいるアンチセンス鎖を有することができる。
ある実施形態において、siRNA構造は、アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれにデオキシヌクレオチドを含んでいるアンチセンス鎖を有することができる。
これらの構造のいずれも、１以上の修飾又は化学修飾ヌクレオチドを他の位置に組み合わせることができる。
本発明のRNAi分子は、約200pM未満の有利なIC50で遺伝子のmRNAの発現を阻害することができる。ある実施形態において、本発明のRNAi分子は、約100pM未満又は約50pM未満又は約30pM未満又は約20pM未満又は約10pM未満又は約5pM未満又は約1pM未満の有利なIC50で遺伝子のmRNAの発現を阻害することができる。
さらなる実施形態において、本発明のRNAi分子は、単回投与で、インビボで少なくとも25％の遺伝子のmRNAレベルの発現を阻害することができる。
本発明のsiRNAは、任意の遺伝子を標的とすることができる。
本発明のsiRNAが標的とすることができる遺伝子としては、HUGO Gene Nomenclature CommitteeのGene Families Indexに記載されている遺伝子を挙げることができる。
本発明のsiRNAが標的とすることができる遺伝子としては、核遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、タンパク質コード遺伝子、癌原遺伝子、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子及び細胞シグナル伝達遺伝子を挙げることができる。
本発明のsiRNAが標的とすることができる遺伝子としては、SRY、β-グロビン、RAS、細胞質ゾルGST、ミトコンドリアGST、MAPEG GST、GST-π、p16、p21、p53、血清アルブミン、VII型コラーゲン、補体C3、アポリポタンパク質B、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、第VIII因子、ハンチンチン、RB1網膜芽細胞腫タンパク質、CFTR、タイチン、ウトロフィン及びジストロフィンを含むヒトタンパク質ファミリーに含まれる任意のメンバー又はサブメンバーを発現する遺伝子を挙げることができる。
修飾及び化学修飾siRNAs
本発明の実施形態は、遺伝子サイレンシングに対する活性及び効力の増加といった治療用途に則った特性を強化するように、修飾又は化学修飾されたsiRNA分子を包含する。本発明は、遺伝子調節及び遺伝子サイレンシングに関するsiRNA分子の活性及び効力を失うことなく、血清安定性が増大し、さらにオフターゲット活性効果が減少した、修飾又は化学的に修飾されたsiRNA分子を提供する。いくつかの局面では、本発明は、siRNAの安定性及び効力を増強する様々な組み合わせの修飾又は化学修飾を有するsiRNAを提供する。
本発明の実施形態は、遺伝子サイレンシングに対する活性及び効力の増加といった治療用途に則った特性を強化するように、修飾又は化学修飾されたsiRNA分子を包含する。本発明は、遺伝子調節及び遺伝子サイレンシングに関するsiRNA分子の活性及び効力を失うことなく、血清安定性が増大し、さらにオフターゲット活性効果が減少した、修飾又は化学的に修飾されたsiRNA分子を提供する。いくつかの局面では、本発明は、siRNAの安定性及び効力を増強する様々な組み合わせの修飾又は化学修飾を有するsiRNAを提供する。
本明細書で使用される、修飾及び化学修飾されたという用語は、1つ又は複数のヌクレオチド類似体、改変ヌクレオチド、非標準的ヌクレオチド天然に存在しないヌクレオチド及びこれらの組み合わせを有するsiRNAにおける天然に存在する核酸の構造又は核酸構造に対してなされる改変を意味する。
ある実施形態においてsiRNA中の修飾又は化学修飾構造の数は、siRNA分子のすべての構造要素及び/又は全てのヌクレオチドを含むことができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、ヌクレオチドの糖基の修飾、ヌクレオチドの核酸塩基の修飾、核酸骨格又は結合部分の修飾、siRNA鎖の末端におけるヌクレオチド構造又はヌクレオチドの修飾及びそれらの組み合わせを有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、上記糖の2’炭素位における置換修飾を有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、鎖の5’末端、3’末端又は両端部における修飾を有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、鎖間の相補的ミスマッチを形成する修飾を有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、5'-プロピルアミン末端、5'-リン酸化末端、3'-ピューロマイシン末端又は3'-ビオチン末端基を有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、2'-フルオロ置換リボヌクレオチド、2'-OMe置換リボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、2'-アミノ置換リボヌクレオチド、2'-チオ置換リボヌクレオチドを有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上の5-ハロウリジン、5-ハロシチジン、5-メチルシチジン、リボチミジン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、4-チオウリジン又は5-アミノアリルウリジンを有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上のホスホロチオエート基を有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上の2'-フルオロ置換リボヌクレオチド、2'-フルオロウリジン、2'-フルオロシチジン、2'-デオキシリボヌクレオチド、2'-デオキシアデノシン又は2'-デオキシグアノシンを有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上のホスホロチオエート結合を有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上のアルキレンジオール結合、オキシ-アルキルチオ結合又はオキシカルボニルオキシ結合を有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上のデオキシ脱塩基、イノシン、N3-メチル-ウリジン、N6,N6-ジメチル-アデノシン、シュードウリジン、プリン-リボヌクレオチド及びリバビリンを有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上の3’又は5’逆方向末端基を有するsiRNAを挙げることができる。
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上の5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン、アデノシン、8-ブロモグアノシン、7-デアザ-アデノシン又はN6-メチルアデノシンを有するsiRNAを挙げることができる。
GST-π及びRNAi分子
様々なヒト癌組織が突然変異KRAS遺伝子の出現と相関することが見出されている。いくつかの場合において、当該組織においては、グルタチオンS-トランスフェラーゼPi（GST-π）の発現レベルが上昇する(Miyanishi et al., Gastroenterology, 2001, Vol. 121:865-874, Abstract)。例えば、種々の消化器系悪性腫瘍を有する患者において、血清GST-πレベルの上昇が観察されている(Niitsu et al., Cancer, 1989, Vol.63, No. 2, pp. 317-323, Abstract)。
様々なヒト癌組織が突然変異KRAS遺伝子の出現と相関することが見出されている。いくつかの場合において、当該組織においては、グルタチオンS-トランスフェラーゼPi（GST-π）の発現レベルが上昇する(Miyanishi et al., Gastroenterology, 2001, Vol. 121:865-874, Abstract)。例えば、種々の消化器系悪性腫瘍を有する患者において、血清GST-πレベルの上昇が観察されている(Niitsu et al., Cancer, 1989, Vol.63, No. 2, pp. 317-323, Abstract)。
GST-πは、疎水性化合物と還元型グルタチオンを有する求電子性化合物との結合を触媒することによって解毒に役割を果たす酵素のGSTファミリーのメンバーである。GST-π発現は、インビトロにおいてsiRNAで減少させることができる(Niitsu et al., US 2014/0315975 A1)。しかしながら、既存のsiRNA剤には、不十分な活性、オフターゲット効果、血清安定性の欠如及びインビボにおける効力又は有効性の欠如といった多くの欠点がある。
例示する標的ヒトグルタチオンS-トランスフェラーゼpi（ヒトGST-π）mRNAの核酸配列はGenBank アクセッション番号NM_000852.3 (hGSTP1)に開示され、 986ヌクレオチド長である。
当業者は、報告された配列が経時的に変化することがあり、それに応じて本明細書中の核酸分子に必要な変化を組み込むことができることを理解するであろう。
本発明の実施形態は、小核酸分子を用いたGST-π発現の遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。核酸分子としては、例えば、RNA干渉（RNAi分子）、短鎖干渉RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、マイクロRNA（miRNA）及び短鎖ヘアピンRNA（shRNA）分子、並びにDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）及び反復関連RNA（rasiRNA）を挙げることができる。そのような分子は、GST-π遺伝子発現に対するRNA干渉を媒介することができる。
本明細書に開示される組成物及び方法はまた、被験体における様々な種類の悪性腫瘍の治療において使用することができる。
本発明の核酸分子及び方法は、GST-πをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートするために使用される。
本発明の組成物及び方法は、１以上の核酸分子を含むことができ、単独で或いは組み合わせて、GST-πタンパク質及び/又はGST-πタンパク質をコードする遺伝子、例えば、悪性腫瘍等の疾患、並びにGST-πに関連する状態又は疾病の維持及び/又は発症に関与するタンパク質及び/又はGST-πをコードする遺伝子の発現を調節又は制御することができる。
本発明の組成物及び方法は、GST-πの例示的な配列を参照して記載される。当業者は、本発明の様々な態様及び実施形態が、関連するGST-π遺伝子、配列、又はホモログ遺伝子及び転写変異体といった変異体、並びにGST-π遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）を含む多型を対象とすることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、GST-π遺伝子、例えばヒトGST-πの発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（siRNA）分子を提供することができる。
本発明のRNAi分子は、GST-πを標的とすることができ、及び、例えば相補的配列を用いて、又は非標準塩基対、例えばミスマッチ及び/又はウォブル塩基対を組み込むことによって更なる標的配列を提供できる任意の相同配列を標的とすることができる。
ミスマッチが同定される場合、非標準的な塩基対、例えば、ミスマッチ及び/又はウォブル塩基を用いて、2つ以上の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。
例えば、UU及びCC塩基対などの非標準塩基対を使用して、配列相同性を有する異なるGST-π標的のための配列を標的にできる核酸分子を生成できる。したがって、RNAi分子は、相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列を標的とすることができ、単一のRNAi分子を用いて2つ以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
いくつかの態様では、本発明の組成物及び方法は、GST-πmRNAに対して活性であるRNAi分子を含み、RNAi分子はGST-π配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のRNAi分子は、GST-πRNAに対して活性を有することができ、RNAi分子は、変異体GST-πをコードする配列を有するRNA、例えば、悪性腫瘍に関連することが当該分野で公知の突然変異GST-π遺伝子のRNAに相補的な配列を含んでいる。
さらなる実施形態では、本発明のRNAi分子は、GST-π遺伝子に相互作用することができ、GST-π遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含むことができる。
GST-πの発現を阻害するための核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有することができ、ここで鎖は二本鎖領域を形成する。核酸分子は、当技術分野で知られているような修飾を含む、二本鎖領域内において修飾又は化学修飾された1以上のヌクレオチドを有することができる。siRNAのオーバーハング内の任意のヌクレオチドも修飾又は化学修飾されていてもよい。
ある実施形態において、修飾又は化学修飾ヌクレオチドは、好ましくは、2'-デオキシヌクレオチドである。さらなる実施形態において、修飾又は化学修飾されたヌクレオチドとしては、2'-O-アルキル置換ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ロックドヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせとすることができる。
ある実施形態において、アンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを有する構造が好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。これらの構造のいずれも二本鎖領域において、1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドと組み合わせることができる。
本発明の核酸分子は、約200pM未満の有利なIC50でGST-π mRNAの発現を阻害することができる。さらに、核酸分子は、単回投与にてインビボにおいて少なくとも25％GST-π mRNAレベルの発現を阻害することができる。
本発明においては、薬学的に許容される担体と組み合わせて、本明細書に記載の1つ以上のsiRNAを含有することができる医薬組成物を意図している。当技術分野で公知のものを含む任意の適切な担体、並びに脂質分子、ナノ粒子、又はリポソーム（いずれもsiRNA分子をカプセル化できる）を使用してもよい。
本発明は、GST-π発現に関連する疾患を治療する方法を開示し、この方法は、1以上のsiRNAを含有する組成物を必要とする被験者に投与することを含む。治療される疾患には、悪性腫瘍、癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫及び上皮性悪性腫瘍を含むことができる。
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表1に示す。
表1の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジンを意味する。
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表2に示す。
表2の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表3に示す。
表3の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表4に示す。
表4の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表5に示す。
表5の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表6に示す。
表6の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
ある実施形態において、本発明は、ある範囲の核酸分子を提供し、ここで、a）当該分子は、ポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し；b）当該分子の各鎖は15〜30ヌクレオチド長であり；c）アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、GST-πをコードするmRNAの配列に相補的であり；d）センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有している。
ある実施形態において、核酸分子は、当該分子の二本鎖領域に位置する、GST-πをコードするmRNAの配列に相補的なアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
更なる実施形態において、核酸分子は、GST-πをコードするmRNAの配列に相補的なアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
特定の実施形態において、核酸分子の各鎖は、18〜22ヌクレオチド長とすることができる。核酸分子における二本鎖領域は、19ヌクレオチド長とすることができる。
代替の形態において、核酸分子は、単一の鎖として連結されたポリヌクレオチドセンス鎖とポリヌクレオチドアンチセンス鎖とを有することができ、ループによって一端部において結合した二本鎖領域を形成することができる。
本開示に係る核酸分子のある実施形態としては、平滑末端を有することができる。特定の実施形態において、核酸分子は、1以上の3’オーバーハングを有することができる。
本発明は、遺伝子サイレンシグに活性なRNAi分子である所定の範囲の核酸分子を提供する。本発明に係る核酸分子は、遺伝子サイレンシグに活性なdsRNA、siRNA、マイクロRNA又はshRNAとすることができ、同様にDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）又は反復関連RNA（rasiRNA）とすることができる。当該核酸分子は、GST-π発現を阻害する活性を有することができる。
本発明に係る実施形態は、更にGST-πノックダウンに対するIC50が100pM未満の核酸分子を提供する。
本発明の更なる実施形態は、更にGST-πノックダウンに対するIC50が50pM未満の核酸分子を提供する。
本発明は、更に、1以上の本発明の核酸分子、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を企図している。特定の実施形態において、当該担体としては、脂質分子又はリポソームとすることができる。
本発明の化合物及び組成物は、必要とする被験者に化合物又は組成物を投与することによって、GST-πに関連する疾患を予防又は治療する方法に使用可能である。
本発明の方法は、悪性腫瘍を予防又は治療するための本発明の化合物を利用することができる。悪性腫瘍は、種々の疾患、例えば、GST-π発現に関連する癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、上皮性悪性腫瘍、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、結腸直腸癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎臓癌、尿道癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、上皮悪性腫瘍および非上皮悪性腫瘍に提示される。
P21及びRNAi分子
p21は、CDKN1A遺伝子によってコードされ、CIP/KIPファミリーに属する細胞周期調節タンパク質である。このタンパク質は、サイクリン-CDK複合体の効果を当該複合体へ結合することにより阻害することで、G1期及びG2/M期における細胞周期の進行を阻害する機能を有する。具体的には、p21遺伝子は腫瘍抑制遺伝子の1つであるp53によって活性化される。DNA損傷等によるp53の活性化により、p53がp21を活性化し、細胞周期がG1期及びG2/M期に停止することが報告されている。
p21は、CDKN1A遺伝子によってコードされ、CIP/KIPファミリーに属する細胞周期調節タンパク質である。このタンパク質は、サイクリン-CDK複合体の効果を当該複合体へ結合することにより阻害することで、G1期及びG2/M期における細胞周期の進行を阻害する機能を有する。具体的には、p21遺伝子は腫瘍抑制遺伝子の1つであるp53によって活性化される。DNA損傷等によるp53の活性化により、p53がp21を活性化し、細胞周期がG1期及びG2/M期に停止することが報告されている。
p21は、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌及び扁平上皮癌を含む様々なヒト癌において過剰発現されており、多くの場合、p21のアップレギュレートは腫瘍等級、侵襲性及び攻撃性に対して正に相関する。例えば、Changら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2000、Vol. 97、8号、4291〜96頁参照。また、p21のアップレギュレーションは、脳、前立腺、卵巣、乳癌及び食道細胞癌を含む多くの形態の癌において、腫瘍原性及び予後不良と関連することが報告されている。例えば、Wintersら、Breast Cancer Research、2003、Vol. 5、No.6、pp. R242-R249参照。また、疾患は、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、アミロイドーシス及び関節炎を含む加齢性疾患であっても良い。例えば、Changら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2000、Vol. 97、8号、4291〜96頁参照。
p21はヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報は、NM_000389.4、NM_078467.2、NM_001291549.1、NM_001220778.1、NM_001220777.1（NP_001207707.1、NP_001278478 NP_001207706.1、NP_510867.1、NP_000380.1）で見つけられる。
標的ヒトp21 mRNAは、GenBankアクセッション番号NM_000389.4（CDKN1A）に開示され、2175ヌクレオチド長である。
当業者は、報告された配列が経時的に変化することがあり、それに応じて本明細書中の核酸分子に必要な変化を組み込むことができることを理解するであろう。
本発明の実施形態は、小核酸分子を用いたp21発現の遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。核酸分子としては、例えば、RNA干渉（RNAi分子）、短鎖干渉RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、マイクロRNA（miRNA）及び短鎖ヘアピンRNA（shRNA）分子、並びにDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）及び反復関連RNA（rasiRNA）を挙げることができる。そのような分子は、p21遺伝子発現に対するRNA干渉を媒介することができる。
本明細書に開示される組成物及び方法はまた、被験体における様々な種類の悪性腫瘍の治療において使用することができる。
本発明の核酸分子及び方法は、p21をコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートするために使用される。
本発明の組成物及び方法は、１以上の核酸分子を含むことができ、単独で或いは組み合わせて、p21タンパク質及び/又はp21タンパク質をコードする遺伝子、例えば、悪性腫瘍等の疾患、並びにp21に関連する状態又は疾病の維持及び/又は発症に関与するタンパク質及び/又はp21をコードする遺伝子の発現を調節又は制御することができる。
本発明の組成物及び方法は、p21の例示的な配列を参照して記載される。当業者は、本発明の様々な態様及び実施形態が、関連するp21遺伝子、配列、又はホモログ遺伝子及び転写変異体といった変異体、並びにp21遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）を含む多型を対象とすることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、p21遺伝子、例えばヒトCDKN1Aの発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（siRNA）分子を提供することができる。
本発明のRNAi分子は、p21を標的とすることができ、及び、例えば相補的配列を用いて、又は非標準塩基対、例えばミスマッチ及び/又はウォブル塩基対を組み込むことによって更なる標的配列を提供できる任意の相同配列を標的とすることができる。
ミスマッチが同定される場合、非標準的な塩基対、例えば、ミスマッチ及び/又はウォブル塩基を用いて、2つ以上の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。
例えば、UU及びCC塩基対などの非標準塩基対を使用して、配列相同性を有する異なるp21標的のための配列を標的にできる核酸分子を生成できる。したがって、RNAi分子は、相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列を標的とすることができ、単一のRNAi分子を用いて2つ以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
いくつかの態様では、本発明の組成物及び方法は、p21mRNAに対して活性であるRNAi分子を含み、RNAi分子はp21配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のRNAi分子は、p21RNAに対して活性を有することができ、RNAi分子は、変異体p21をコードする配列を有するRNA、例えば、悪性腫瘍に関連することが当該分野で公知の突然変異p21遺伝子のRNAに相補的な配列を含んでいる。
さらなる実施形態では、本発明のRNAi分子は、p21遺伝子に相互作用することができ、p21遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含むことができる。
p21の発現を阻害するための核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有することができ、ここで鎖は二本鎖領域を形成する。核酸分子は、当技術分野で知られているような修飾を含む、二本鎖領域内において修飾又は化学修飾された1以上のヌクレオチドを有することができる。siRNAのオーバーハング内の任意のヌクレオチドも修飾又は化学修飾されていてもよい。
ある実施形態において、修飾又は化学修飾ヌクレオチドは、好ましくは、2'-デオキシヌクレオチドである。さらなる実施形態において、修飾又は化学修飾されたヌクレオチドとしては、2'-O-アルキル置換ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ロックドヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせとすることができる。
ある実施形態において、アンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを有する構造が好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。これらの構造のいずれも二本鎖領域において、1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドと組み合わせることができる。
本発明の核酸分子は、約200pM未満の有利なIC50でp21 mRNAの発現を阻害することができる。さらに、核酸分子は、単回投与にてインビボにおいて少なくとも25％p21 mRNAレベルの発現を阻害することができる。
本発明においては、薬学的に許容される担体と組み合わせて、本明細書に記載の1つ以上のsiRNAを含有することができる医薬組成物を意図している。当技術分野で公知のものを含む任意の適切な担体、並びに脂質分子、ナノ粒子、又はリポソーム（いずれもsiRNA分子をカプセル化できる）を使用してもよい。
本発明は、p21発現に関連する疾患を治療する方法を開示し、この方法は、1以上のsiRNAを含有する組成物を必要とする被験者に投与することを含む。治療される疾患には、悪性腫瘍、癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫及び上皮性悪性腫瘍を含むことができる。
P21 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表7に示す。
表7の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジンを意味する。mUは2’-メトキシUである。
p21 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表8に示す。
表8の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
本発明の実施形態として、上記例示に従って修飾又は化学修飾された、表1〜8のsiRNA分子が包含される。
ある実施形態において、本発明は、ある範囲の核酸分子を提供し、ここで、a）当該分子は、ポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し；b）当該分子の各鎖は15〜30ヌクレオチド長であり；c）アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、p21をコードするmRNAの配列に相補的であり；d）センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有している。
ある実施形態において、核酸分子は、当該分子の二本鎖領域に位置する、p21をコードするmRNAの配列に相補的なアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
更なる実施形態において、核酸分子は、p21をコードするmRNAの配列に相補的なアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
特定の実施形態において、核酸分子の各鎖は、18〜22ヌクレオチド長とすることができる。核酸分子における二本鎖領域は、19ヌクレオチド長とすることができる。
ある実施形態において、核酸分子は、単一の鎖として連結されたポリヌクレオチドセンス鎖とポリヌクレオチドアンチセンス鎖とを有することができ、ループによって一端部において結合した二本鎖領域を形成することができる。
本発明の核酸分子は、平滑末端を有することができ、及び1以上の3’オーバーハングを有することができる。
本発明の核酸分子は、遺伝子サイレンシグに活性なRNAi分子、例えば、遺伝子サイレンシグに活性なdsRNA、siRNA、マイクロRNA又は遺伝子サイレンシグに活性なshRNAとすることができ、同様にDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）及び反復関連RNA（rasiRNA）とすることができる。
本発明は、p21の発現を抑制する活性を有する一定の範囲の核酸分子を提供する。ある実施形態において、核酸分子は、p21ノックダウンに対する100pM未満のIC50を有することができる。
更なる実施形態において、核酸分子は、p21ノックダウンに対する50pM未満のIC50を有することができる。
本発明は、更に、1以上の本発明の核酸分子、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を企図している。特定の実施形態において、当該担体としては、脂質分子又はリポソームとすることができる。
本発明の化合物及び組成物は、必要とする被験者に化合物又は組成物を投与することによって、p21に関連する疾患を予防又は治療する方法に使用可能である。
更なる態様において、本発明は、1つ以上の本発明の核酸分子を含む組成物を必要とする被験者に投与することによって、p21発現に関連する疾患を治療するための方法を含む。疾患は、とりわけ、p21発現に関連する癌などの疾患に提示され得る悪性腫瘍とすることができる。
本発明の方法は、悪性腫瘍を予防又は治療するための本発明の化合物を利用することができる。悪性腫瘍は、種々の疾患、例えば、p21発現に関連する癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、上皮性悪性腫瘍、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、結腸直腸癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎臓癌、尿道癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、上皮悪性腫瘍および非上皮悪性腫瘍に提示される。
本発明の実施形態は、遺伝子及び/又はタンパク質の発現をダウンレギュレート又は抑制するのに使用できるRNAi分子を提供することができる。
本開示のRNAi分子は、単独で又は他のsiRNAと組み合わせて、1以上の遺伝子の発現を調節するために使用できる。
本開示のRNAi分子は、単独で又は組み合わせて若しくは他の公知の薬剤と併用して、疾患を予防又は治療するため、若しくは状態又は障害の症状を改善するために使用することができる。
本発明のRNAi分子は、配列特異的な方法によって遺伝子の発現を調節又は抑制するために使用することができる。
本開示のRNAi分子は、一連の連続したヌクレオチドがヒトmRNAに少なくとも部分的に相補的であるガイド鎖を含むことができる。
本発明の実施形態は、それを必要とする被験者における疾患又は状態の症状を予防、治療又は改善するための方法を含むことができる。
ある実施形態において、被験体における悪性腫瘍の症状を予防、治療又は改善するための方法は、被験体に、本発明のRNAi分子を投与して、被験体又は生物における遺伝子の発現を調節することを含むことができる。
ある実施形態において、本発明は、細胞又は生物を本発明のRNAi分子と接触させることによって、細胞又は生物における遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を企図している。
Hsp47を標的とするRNAi分子
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞内輸送及び成熟のためのコラーゲン特異的分子シャペロンである熱ショックタンパク質47（Hsp47）の発現を調節するための一連のRNAi分子及び組成物を提供することができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞内輸送及び成熟のためのコラーゲン特異的分子シャペロンである熱ショックタンパク質47（Hsp47）の発現を調節するための一連のRNAi分子及び組成物を提供することができる。
Hsp47のsiRNAのいくつかの例は、米国特許第8,710,209号に記載されており、これは、参照によりその全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
Hsp47又はその相同遺伝子配列は、例えば、GenBankアクセッション番号AB010273（ヒト）、X60676（マウス）又はM69246（ラット、gp46）として開示されている。
Hsp47を抑制する薬剤は、線維症を阻害するためのもとして開示されている。例えば、米国特許第8,173,170 B2号参照。これは、その全体が参照により全ての目的のために本明細書に組み込まれる。しかし、悪性腫瘍の発症、進行、及び増殖におけるHsp47の阻害効果に関する情報は限られている。
いくつかの実施形態において、本発明のsiRNA分子の各鎖は、15〜60ヌクレオチド長、又は15〜40ヌクレオチド長、又は19〜25ヌクレオチド長とすることができる。
特定の実施形態では、本発明は、Hsp47を標的とするRNAi分子である悪性腫瘍を治療するためのRNAi分子を含有する医薬組成物を提供する。
Hsp47 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表9に示す。
表9の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字のdは「デオキシ」を表す。
表9において、Hsp47を標的とする任意のRNAi分子のアンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを代替的に有することが好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。
Hsp47 mRNAを標的とする、本開示のRNAi分子の更なる例示を表10に示す。
表10の要点：記号：rXはリボヌクレオチドを表し、mXは2'-O-メチルリボヌクレオチドを表し、25rXは2’-5’結合を有するリボヌクレオチドを表し、C3は1,3-プロパンジオールスペーサーを表し、idABは逆位1,2-ジデオキシ-D-リボースを表し、Pは、3’末端のリン酸基を表す。
表10において、Hsp47を標的とする任意のRNAi分子のアンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを代替的に有することが好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。
MCL1を標的とするRNAi分子
ある実施形態において、本発明は、ヒト骨髄細胞白血病１（MCL1）遺伝子、転写変異体２、mRNAの発現を調節する、一定の範囲のRNAi分子及び組成物を提供することができる。
ある実施形態において、本発明は、ヒト骨髄細胞白血病１（MCL1）遺伝子、転写変異体２、mRNAの発現を調節する、一定の範囲のRNAi分子及び組成物を提供することができる。
例えば、MCL1はアクセッション番号NM_182763.2（ヒト）に開示されている。
MCL1 mRNAを標的とする、本開示のRNAi分子の例示を表11に示す。
表11の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字のdは「デオキシ」を表す。
表11において、MCL1を標的とする任意のRNAi分子のアンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを代替的に有することが好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。
ARAFを標的とするRNAi分子
ある実施形態において、本発明は、A-Raf癌原遺伝子、セリン/スレオニンキナーゼ（ARAF）、転写変異体１、mRNAの発現を調節する、一定の範囲のRNAi分子及び組成物を提供することができる。
ある実施形態において、本発明は、A-Raf癌原遺伝子、セリン/スレオニンキナーゼ（ARAF）、転写変異体１、mRNAの発現を調節する、一定の範囲のRNAi分子及び組成物を提供することができる。
ARAFは、例えば、アクセッション番号NM_001654.4（ヒト）に開示されている。
ARAF mRNAを標的とする、本開示のRNAi分子の例示を表12に示す。
表12の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字のdは「デオキシ」を表す。
表12において、ARAFを標的とする任意のRNAi分子のアンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを代替的に有することが好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。
RNA干渉
一般に、siRNAは、約21〜約23ヌクレオチドの長さとすることができ、約19ヌクレオチド長の塩基対二本鎖領域を含むことができる。
一般に、siRNAは、約21〜約23ヌクレオチドの長さとすることができ、約19ヌクレオチド長の塩基対二本鎖領域を含むことができる。
RNAiは、RNA誘発サイレンシング複合体（RISC）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体に関与する。siRNAは、RISC複合体に入るアンチセンス又はガイド鎖であって、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNA標的の切断を媒介するアンチセンス又はガイド鎖を有する。siRNAの他方の鎖はパッセンジャー鎖である。標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（例えば、Elbashirら、Genes＆Development、2001、Vol. 15、188〜200頁参照）。
本明細書で使用する「センス鎖」という用語は、siRNA分子の対応するアンチセンス鎖の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のセンス鎖は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」という用語は、標的核酸配列の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のアンチセンス鎖は、siRNA分子の対応するセンス鎖の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含むことができる。
RNAi分子は、配列特異的様式でRNA干渉を媒介することによって遺伝子発現をダウンレギュレート又はノックダウンすることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Elbashirら、Nature、2001、Vol. 411、494〜498頁; Kreutzerら、WO2000/044895; Zernicka-Goetzら、WO2001/36646; Fireら、WO1999/032619; Plaetinckら、WO2000/01846; Melloら、WO2001/029058参照。
本明細書中で使用される場合、遺伝子発現に関して「阻害する」、「ダウンレギュレートする」又は「縮小する」という用語は、遺伝子の発現又は1つ以上のタンパク質をコードするmRNA分子のレベル、若しくは1つ又は複数のコードされたタンパク質の活性が、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも低下することを意味している。例えば、発現のレベル、mRNAのレベル又はコードされたタンパク質活性のレベルが、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも、少なくとも1％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも50％、又は少なくとも90％、又はそれ以上で低下すれば良い。
RNAi分子はまた、ウイルス遺伝子発現をノックダウンするために使用することができ、よってウイルス複製に影響を及ぼす。
RNAi分子は、別個のポリヌクレオチド鎖：センス鎖又はパッセンジャー鎖と、アンチセンス鎖又はガイド鎖とから作製することができる。ガイド鎖とパッセンジャー鎖とは、少なくとも部分的に相補的である。ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、約15〜約49塩基対を有する二本鎖領域を形成することができる。
いくつかの実施形態では、siRNAの二重鎖領域は、17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,又は49個の塩基対を含むことができる。
特定の実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であり、RISCに対して活性な二本鎖領域の長さを有することができる。
さらなる実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であるRNAi分子に変換されるダイサー基質として活性とすることができる。
いくつかの態様では、RNAi分子は、長い分子の対向する末端に相補的なガイドとパッセンジャー配列部分とを有することができ、その結果、分子は相補配列部分において二本鎖領域を形成することができ、各鎖はヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのいずれかによって当該二本鎖領域の一端で結合する。例えば、ヘアピン配列ステム及びループ配列である。各鎖とリンカー相互作用は、共有結合又は非共有相互作用とすることができる。
本開示のRNAi分子は、核酸のセンス領域を核酸のアンチセンス領域に結合するヌクレオチド、非ヌクレオチド又はヌクレオチド/非ヌクレオチド混合リンカーを含んでいてもよい。ヌクレオチドリンカーは、長さが2ヌクレオチド以上、例えば約3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10ヌクレオチドのリンカーとすることができる。ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーとしても良い。本明細書で使用する「アプタマー」又は「核酸アプタマー」は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、ここで核酸分子はその天然の状況において標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子に結合する核酸分子であってもよく、ここで標的分子は核酸に天然に結合しなくてよい。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合し、それにより天然に存在するリガンドとタンパク質との相互作用を防止するために使用することができる。例えば、Goldら、Annu Rev Biochem、1995、Vol. 64、763-797頁; Brodyら、J.Biotechnol., 2000、Vol. 74、5〜13頁; Hermannら、Science、2000、Vol. 287、pp. 820-825参照。
非ヌクレオチドリンカーの例は、無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素又は他の高分子化合物、例えば2〜100個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールなどの高分子化合物を挙げることができる。いくつかの例は、Seelaら、Nucleic Acids Research、1987、Vol. 15、3113〜3129頁; Cloadら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、6324-6326頁; Jaeschkeら、Tetrahedron Lett.,1993、Vol. 34、301頁; Arnoldら、WO1989/002439; Usmanら、WO1995/006731; Dudyczら、WO1995/011910; 及びFerentzら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、pp. 4000-4002に記載されている。
RNAi分子は、二重鎖領域から1つ以上のオーバーハングを有することができる。オーバーハングは、塩基対形成されていない一本鎖領域であり、長さが1〜8ヌクレオチド又はそれ以上としても良い。オーバーハングは、鎖の3'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する3'末端オーバーハングとしても良い。オーバーハングは、鎖の5'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する5'末端オーバーハングとしても良い。
RNAi分子のオーバーハングは、同じ長さを有していても良いし、異なる長さとしても良い。
RNAi分子は、二本鎖領域がオーバーハングなしで終わり、鎖が二本鎖領域の末端と塩基対合する、一つ以上の平滑末端を有するものとすることができる。
本開示のRNAi分子は、1つ以上の平滑末端を有することができ、又は1つ以上のオーバーハングを有することができ、若しくは平滑末端とオーバーハングとの組み合わせを有することができる。
RNAi分子の鎖の5'末端は、平滑末端にあってもよく、オーバーハングにあってもよい。RNAi分子の鎖の3'末端は、平滑末端にあってもよく、オーバーハングにあってもよい。
RNAi分子の鎖の5'末端は平滑末端にあり、3'末端はオーバーハングにあってもよい。RNAi分子鎖の3'末端は平滑末端にあり、5'末端はオーバーハングにあってもよい。
いくつかの実施形態では、RNAi分子の両端は平滑末端である。
さらなる実施形態において、RNAi分子の両端はオーバーハングを有する。
5'-及び3'-末端のオーバーハングは、異なる長さであってもよい。
特定の実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の5'末端及びセンス鎖の3'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
さらなる実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の3'末端及びセンス鎖の5'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
RNAi分子は、二本鎖領域における塩基対合においてミスマッチを有していてもよい。
RNAi分子のオーバーハングにおける任意のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドとすることができる。
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは5'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他方の鎖の3'末端がオーバーハングを有さなくてもよいし、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは3'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他の鎖の5'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。
いくつかの実施形態において、RNAi分子のオーバーハングヌクレオチドの1つ以上又は全てを2'-デオキシリボヌクレオチドとしてもよい。
ダイサー基質RNAi分子
いくつかの態様において、RNAi分子は、RISC活性RNAi分子を生成するようにプロセシングされるダイサー基質として適した長さにすることができる。例えば、Rossiら、US2005/0244858参照。
いくつかの態様において、RNAi分子は、RISC活性RNAi分子を生成するようにプロセシングされるダイサー基質として適した長さにすることができる。例えば、Rossiら、US2005/0244858参照。
ダイサー基質dsRNAは、活性RNAi分子を生成するためにダイサーによって処理されるのに十分な長さとすることができ、さらに以下の特性の1つ以上を含んでいてもよい：（i）ダイサー基質dsRNAは、例えば、アンチセンス鎖上に3'オーバーハングを有するような非対称とすることができ、（ii）ダイサー基質dsRNAはダイサー結合の配向を指示し、dsRNAを処理して活性なRNAi分子とするためにセンス鎖上に改変された3'末端を有していてもよい。
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNA中の最も長い鎖を24〜30ヌクレオチドの長さとすることができる。
ダイサー基質dsRNAは、対称又は非対称とすることができる。
いくつかの実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、22〜28ヌクレオチドのセンス鎖及び24〜30ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有することができる。
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有していてもよい。
さらなる実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが25ヌクレオチドのセンス鎖及び2塩基の3’-オーバーハングを含む長さが27ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有することができる。オーバーハングは、1、2又は3ヌクレオチドの長さとすることができる。センス鎖はまた5’リン酸を有していてもよい。
非対称ダイサー基質dsRNAは、2つのリボヌクレオチドの代わりにセンス鎖の3’末端に2つのデオキシリボヌクレオチドを有することができる。
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、約22〜約30、又は約22〜約28、又は約24〜約30、又は約25〜約30、又は約26〜約30、又は約26及び29、又は約27〜約28ヌクレオチドの長さとすることができる。
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチドの長さとすることができる。
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが少なくとも約25ヌクレオチドであり、長さが約30ヌクレオチドを超えないセンス及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、26〜29ヌクレオチドの長さのセンス及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが27ヌクレオチドであるセンス鎖及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
ダイサー基質dsRNAのセンス及びアンチセンス鎖は、平滑末端であって同じ長さとすることができ、又はオーバーハングを有するように異なる長さであってもよく、又は平滑末端と突出とを有していてもよい。
ダイサー基質dsRNAは、長さが19、20、21、22、23、24、25、26又は27ヌクレオチドの二本鎖領域を有していてもよい。
ダイサー基質dsRNAのアンチセンス鎖は、真核細胞の細胞質内などの生物学的条件下でセンス鎖の配列の少なくとも一部にアニールする任意の配列を有することができる。
センス鎖及びアンチセンス鎖を有するダイサー基質は、リンカー基又はリンカーオリゴヌクレオチドのような第3の構造によって連結することができる。リンカーは、例えばdsRNAの2つの鎖を連結し、アニーリングの際にヘアピンを形成することができる。
ダイサー基質のセンス及びアンチセンス鎖は一般に相補的であるが、塩基対形成においてミスマッチを有していてもよい。
いくつかの実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、センス鎖が22〜28ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が24〜30ヌクレオチドを有するように非対称であってもよい。
ダイサー基質dsRNAの鎖の1つ、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも19ヌクレオチドの配列長を有してもよく、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’末端に隣接している21塩基領域内であり、標的遺伝子から産生されたRNAのヌクレオチド配列と十分に相補的となる。
ダイサー基質dsRNAのアンチセンス鎖は、22〜28ヌクレオチドの長さとなるように、5’末端に1〜9個のリボヌクレオチドを有することができる。アンチセンス鎖の長さが21ヌクレオチドである場合、1〜7個のリボヌクレオチド、又は2〜5個のリボヌクレオチド、又は4個のリボヌクレオチドを3’末端に付加することができる。付加されるリボヌクレオチドは、任意の配列とすることができる。
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、24〜30ヌクレオチドを有していてもよい。センス鎖は、アンチセンス鎖と実質的に相補的であってもよく、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニールする。
RNAi分子の使用方法
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、分子の直接的な適用によって、又は担体若しくは希釈剤と組み合わせた分子を用いて、細胞又は組織に送達することができる。
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、分子の直接的な適用によって、又は担体若しくは希釈剤と組み合わせた分子を用いて、細胞又は組織に送達することができる。
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、担体又は希釈剤若しくは、ウイルス配列、ウイルス物質又は脂質若しくはリポソーム製剤などの細胞への侵入を補助又は促進するように機能する他の送達ビヒクルを用いた分子の直接的な適用によって、細胞、組織、器官又は被験体に送達又は投与することができる。
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、カチオン性脂質と複合体を形成するか、リポソーム内にパッケージするか、或いは標的細胞又は組織に送達することができる。核酸又は核酸複合体は、直接皮膚適用、経皮適用又は注射によって生体外又は生体内の関連する組織に局所投与することができる。
送達系は、例えば、水性及び非水性ゲル、クリーム、エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性及び非水性溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベース及び粉末を含んでいても良く、そして可溶化剤及び浸透増強剤等の添加物を含んでいても良い。
本開示の組成物及び方法は、核酸分子の発現を可能にするように、少なくとも1つの本発明のRNAi分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、DNA又はRNAベクターに挿入された転写単位から発現させることができる。組換えベクターは、DNAプラスミド又はウイルスベクターとすることができる。核酸分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。
例えば、ベクターは、二重鎖のRNAi分子の両方の鎖をコードする配列、又は自己相補的であってRNAi分子を形成する単一の核酸分子を含んでいても良い。発現ベクターは、2つ以上の核酸分子をコードする核酸配列を含んでいても良い。
核酸分子は、真核生物のプロモーターから細胞内で発現することができる。当業者は、任意の核酸が、適切なDNA/RNAベクターから真核細胞において発現できることを理解している。
いくつかの態様では、発現コンストラクトを細胞に導入するためにウイルスコンストラクトを使用することができ、これは当該発現コンストラクトによりコードされるdsRNA構築物の転写のためである。
脂質製剤は、静脈内、筋肉内又は腹腔内注射によって、若しくは経口的に又は吸入によって、若しくは当該分野で公知の他の方法によって動物に投与することができる。
オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は公知であり、使用することができる。
疾患治療方法
疾患としては、例えば、癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫及び上皮性悪性腫瘍を挙げることができる。
疾患としては、例えば、癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫及び上皮性悪性腫瘍を挙げることができる。
ある態様において、本発明の方法は、任意の臓器又は組織における悪性腫瘍及び癌を予防又は治療するため、本発明の化合物を利用することができる。悪性腫瘍及び癌としては、例えば、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、腎臓癌、尿道癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、上皮悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍を挙げることができる。
インビトロノックダウンのためのプロトコル例
トランスフェクションの1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプレートに2×103細胞/ウェルでプレートし、5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュベーターで培養する。トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μlのOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に変更する。0.2μlのLipofectamine RNAiMax（Life Technologies Cat。＃13778-100）を4.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合する。1μlのsiRNAと4μlのOpti-MEM Iを混合し、LF2000溶液と混合し、ボルテックスせずに静かに混合する。室温で5分間待ち、混合物を室温で10分間インキュベートし、RNA-RNAiMax複合体を形成させる。さらに、10μlのRNA-RNAiMax複合体をウェルに添加し、プレートを手で静かに振盪する。細胞を5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃のインキュベーター中で2時間インキュベートする。2％FBSを含む培地を新鮮な-MEM I Reduced Serum Medium（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に交換する。トランスフェクションの24時間後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄する。室温で5〜30分間、50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液（Life Technologiesカタログ番号4391851C）で細胞を溶解する。停止液5μlを加え、室温で2分間インキュベートする。直ちにTAQMANを用いてRT-qPCRによりmRNAレベルを測定する。あるいは、サンプルを-80℃で凍結させ、後でアッセイすることもできる。
トランスフェクションの1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプレートに2×103細胞/ウェルでプレートし、5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュベーターで培養する。トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μlのOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に変更する。0.2μlのLipofectamine RNAiMax（Life Technologies Cat。＃13778-100）を4.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合する。1μlのsiRNAと4μlのOpti-MEM Iを混合し、LF2000溶液と混合し、ボルテックスせずに静かに混合する。室温で5分間待ち、混合物を室温で10分間インキュベートし、RNA-RNAiMax複合体を形成させる。さらに、10μlのRNA-RNAiMax複合体をウェルに添加し、プレートを手で静かに振盪する。細胞を5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃のインキュベーター中で2時間インキュベートする。2％FBSを含む培地を新鮮な-MEM I Reduced Serum Medium（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に交換する。トランスフェクションの24時間後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄する。室温で5〜30分間、50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液（Life Technologiesカタログ番号4391851C）で細胞を溶解する。停止液5μlを加え、室温で2分間インキュベートする。直ちにTAQMANを用いてRT-qPCRによりmRNAレベルを測定する。あるいは、サンプルを-80℃で凍結させ、後でアッセイすることもできる。
血清安定性のためのプロトコル例
0.2mg/mlのsiRNAを37℃で10％ヒト血清とともにインキュベートした。特定の時点（0、5、15及び30分）で、200μlの試料を等分し、抽出溶媒（クロロホルム：フェノール：イソアミルアルコール=24：25：1）200μlで抽出した。サンプルをボルテックスし、室温で10分間、13,000rpmで遠心分離し、次いで、上層溶液を移し、0.45μmのフィルターで濾過した。濾液を300μlのHPLC注入バイアルに移した。LCMSの場合、移動相はMPA：H2O中100mM HFIP＋7mM TEA、MPB：50％メタノール＋50％アセトニトリルとした。カラム：Waters Acquity OST 2.1×50mm、1.7μmを使用した。
0.2mg/mlのsiRNAを37℃で10％ヒト血清とともにインキュベートした。特定の時点（0、5、15及び30分）で、200μlの試料を等分し、抽出溶媒（クロロホルム：フェノール：イソアミルアルコール=24：25：1）200μlで抽出した。サンプルをボルテックスし、室温で10分間、13,000rpmで遠心分離し、次いで、上層溶液を移し、0.45μmのフィルターで濾過した。濾液を300μlのHPLC注入バイアルに移した。LCMSの場合、移動相はMPA：H2O中100mM HFIP＋7mM TEA、MPB：50％メタノール＋50％アセトニトリルとした。カラム：Waters Acquity OST 2.1×50mm、1.7μmを使用した。
実施例１：GST-πを標的とする本発明のsiRNAは、インビトロで遺伝子サイレンシングに活性であることが見出された。遺伝子ノックダウンのためのGST-πsiRNAの用量依存的活性は、約250ピコモル（pM）未満のIC50、及び1pM程度の低いIC50を示すことが判明した。
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、siRNAノックダウン効率を決定した。表13に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが、表1のsiRNAで観察された。
表13に示すように、表1のGST-πsiRNAの活性は、17〜235pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に適している。
実施例２：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有する本発明のGST-πsiRNAの構造は、インビトロにおける遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に増加させることが示された。
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造BU2’（配列番号131及び157）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表14に示すように、構造BU2’に基づくGST-πsiRNAを用いて、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが観察された。
表14に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造BU2’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域のデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して、驚くべきことに予想外に6倍まで増加した。
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域の位置3、5及び7、又は位置4、6及び8に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域のデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して驚くほど高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表14に示される活性は、5〜8pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
実施例３：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有する本発明のGST-πsiRNAの構造は、インビトロで遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に増加させることが示された。
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造A9’（配列番号183及び195）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表15に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが、構造A9’に基づくGST-πsiRNAで観察された。
表15に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に3〜6個のデオキシヌクレオチドを有する構造A9’に基づくGST-πsiRNAの活性は、驚くべきことに、二重鎖領域にデオキシリボヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して24倍まで増加した。
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域における位置4、6及び8、又は位置1、3、5及び7、又は位置3〜8、又は位置5〜8位、又は位置3、5及び7に3〜6個のデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
アンチセンス鎖のシード領域に3〜6個のデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表15に示す活性は、1〜15pMの範囲であり、これは、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
実施例４：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAの構造は、インビトロにおける遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に増加させることが示された。
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B13’（配列番号207及び222）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表16に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが、構造B13’に基づくGST-πsiRNAで観察された。
表16に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造B13’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域のデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に増加した。
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域の位置4、6及び8に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを含まないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表16に示す活性は、11pMのピコモルの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
実施例５：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAの構造は、インビトロで遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に増加させた。
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B4’（配列番号261及び273）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表17に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが構造B4’に基づくGST-πsiRNAで観察された。
表17に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に6個のデオキシヌクレオチドを有する構造B4’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に2倍以上増加した。
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域内の位置3〜8に位置する6個のデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して驚くほど高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
アンチセンス鎖のシード領域に6個のデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAの表17に示す活性は、113pMのピコモルの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
実施例６：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAの構造は、インビトロで遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に増加させた。
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B2’（配列番号237及び249）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表18に示すように、構造B2’に基づくGST-πsiRNAを用いて、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが観察された。
表18に示すように、アンチセンス鎖のシード領域内に3〜4個のデオキシヌクレオチドを有する構造B2’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域にデオキシリボヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して驚くべきことに4倍まで増加した。
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域の位置5〜8、又は位置1、3、5及び7、又は位置3、5及び7に位置する3〜4個のデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを含まないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
アンチセンス鎖のシード領域に3〜4個のデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表18に示す活性は、30〜100pMの範囲であり、これは、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適している。
実施例７：1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドを含むGST-πsiRNAの構造は、インビトロで予想外に増加した遺伝子ノックダウン活性を示した。
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造BU2’（配列番号131及び157）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表19に示すように、構造BU2’に基づくGST-πsiRNAを用いて、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが観察された。
表19に示すように、1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造BU2’に基づくGST-πsiRNAの活性は、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して、驚くべきことに10倍まで増加した。
これらのデータは、1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表19に示す活性は、3〜13pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
実施例８：1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドを含むGST-πsiRNAの構造は、インビトロで意外にも増加した遺伝子ノックダウン活性を示した。
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B13’（配列番号207及び222）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表20に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが構造B13'に基づくGST-πsiRNAで観察された。
表20に示すように、非オーバーハング位置に3つの2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造B13’に基づくGST-πsiRNAの活性は、驚くべきことに、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して約3倍増加した。
これらのデータは、1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表20に示される活性は、6pMのピコモルの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
実施例９：同所性A549肺癌マウスモデル。本発明のGST-πsiRNAは、インビボで同所性肺癌腫瘍の顕著な減少を示すことができる。この実施例において、GST-πsiRNAは、無胸腺ヌードマウスの同所性肺癌腫瘍にリポソーム製剤で投与された場合、in vivoで遺伝子ノックダウン効力をもたらした。
一般に、同所性腫瘍モデルは、薬効及び効力、ならびに改善された予測能力に関して直接の臨床的関連性を示すことができる。同所性腫瘍モデルにおいて、腫瘍細胞は、細胞が由来する同種の器官に直接移植される。
ヒト肺癌A549に対するsiRNA製剤の抗腫瘍有効性を、処置群及びビヒクル対照群の剖検時に測定した最終原発腫瘍重量を比較することによって評価した。
図1は、構造BU2（配列番号61及び126）に基づくGST-πsiRNAのインビボでの同所性肺癌腫瘍阻害を示している。同所性A549肺癌マウスモデルを、GST-πを標的とするsiRNAの2mg/kgで比較的低用量で使用した。
GST-πsiRNAは、この6週間の研究において有意で予想外に有利な肺腫瘍阻害効力を示した。図1に示すように、43日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、最終腫瘍平均重量は対照と比較して2.8倍有意に減少した。
この研究のために、5〜6週齢の雄NCr nu/nuマウスを使用した。実験期間中、実験動物をHEPA濾過環境に維持した。使用前にsiRNA製剤を4℃で保存し、マウスに注射する10分前に室温に温めた。
外科的同所移植（SOI）の日に、このA549ヒト肺癌同所性モデルについて、ストック腫瘍を、A549腫瘍異種移植片を有する動物の皮下部位から採取し、RPMI-1640培地に入れた。壊死組織を除去し、生存組織を1.5〜2mm3に切断した。動物をイソフルラン吸入で麻酔し、手術領域をヨウ素及びアルコールで滅菌した。約1.5cmの横断切開を、マウスの左胸壁に、一対の外科用ハサミを用いて行った。3番目と4番目の肋間に肋間切開を行い、左肺を露出させた。1つのA549腫瘍断片を8-0の外科的縫合糸（ナイロン）で肺の表面に移植した。胸壁は6-0の外科用縫合糸（シルク）で閉じられた。肺は、胸腔内の残りの空気を引き出すために、25G×1 1/2針の3ccシリンジを使用して胸腔内穿刺により再膨張させた。胸壁は6-0の外科用絹縫合糸で閉じられた。上記操作の全ての手順は、HEPA濾過層流フードの下で7倍の倍率顕微鏡を用いて行った。
腫瘍移植の3日後、モデル担癌マウスを、群当たり10匹のマウスの群に無作為に分けた。目的の群については、腫瘍移植の3日後に10匹のマウスの治療を開始した。
目的の群について、処方物は、（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K：DSPE-PEG-2K）のリポソーム組成物とした。リポソームはGST-πsiRNAをカプセル化した。
試験エンドポイントについては、処置開始後42日で実験マウスを屠殺した。原発腫瘍を切除し、その後の分析のために電子天秤で秤量した。
化合物の毒性の評価について、処置群及び対照群におけるマウスの平均体重は、実験期間全体にわたって正常範囲内に維持された。毒性の他の症状はマウスにおいて観察されなかった。
実施例１０：本発明のGST-πsiRNAは、インビボで癌異種移植片腫瘍の顕著な減少を示した。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植片腫瘍に投与された場合、インビボで遺伝子ノックダウン効力をもたらした。
図2は、GST-πsiRNA（配列番号156及び182）の腫瘍阻害効力を示す。癌異種移植モデルを、GST-πを標的とするsiRNAの0.75mg/kgで比較的低用量で使用した。
GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。36日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、腫瘍体積は対照と比較して2倍減少した。
図3に示すように、GST-πsiRNAは、最終日に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。特に、腫瘍重量は2倍以上減少した。
組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤としてGST-πsiRNAを2回の注射（1日目及び15日目）で投与した。
癌異種移植モデルのため、A549細胞株をATCCから得た。10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充した培養培地中で細胞を維持した。接種の48時間前に細胞を分割して、回収時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプシン-EDTAで軽くトリプシン処理し、組織培養から回収した。生存細胞の数を計数し、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。細胞を、血清を含まない培地中で5×107/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用した。
マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーの胸腺ヌードマウス（nu/nu）雌マウス、免疫不全、6〜8週齢、1群当たり7〜8匹のマウスとした。
腫瘍モデル調製のために、マウス1匹につき1接種量の25G針及びシリンジを用いて、2.5×106個のA549細胞の接種物0.1mlを右脇腹に皮下接種した。マウスは接種のために麻酔をかけられなかった。
腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmまで測定した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積=長さ×幅2/2を用いて計算した。確立された腫瘍が約120〜175mm3に達すると、平均腫瘍体積は約150mm3であり、処置群の平均腫瘍体積がビヒクル対照群の平均腫瘍体積の10％以内になるように、マウスを様々なビヒクル対照及び処置群に割り当てた。理想的には、腫瘍体積のCV％を25％未満とした。同じ日に、試験品及び対照ビヒクルを投薬レジメンに従って投与した。腫瘍体積を第1週に3回、研究終了の日を含む残りの週に2回モニターした。
投薬投与のために、投与日に、試験品を-80℃の冷凍庫から取り出し、氷上で解凍した。注射器にアプライする前に、処方剤を含むボトルを手で数回反転した。全ての試験品は、IVにより0.75mg/kg、q2wX2、10ml/kgで投与した。
体重については、マウスを最も近い0.1gまで秤量した。体重をモニターし、初回投与の7日以内に毎日記録した。研究の終了日を含む残りの数週間、体重を数週間監視し、週に２回記録した。
最初の投薬の28日後に腫瘍を採取するために、腫瘍体積を測定し、重量測定のために腫瘍を切開し、PDバイオマーカー研究のために保存した。腫瘍重量を記録した。
実施例１１：本発明のGST-πsiRNAは、in vitroで癌細胞のアポトーシスにより癌細胞死の増加を示した。GST-πsiRNAはGST-πノックダウンをもたらし、アポトーシスのバイオマーカーであるPUMAのアップレギュレーションをもたらし、細胞生存率の低下を伴った。
シード領域におけるデオキシヌクレオチド、2'-F置換デオキシヌクレオチド及び2'-OMe置換リボヌクレオチドの組合せを含むGST-πsiRNA配列番号156及び182は、予期せず癌細胞のアポトーシスを増加させた。
GST-πsiRNA配列番号156及び182に対するPUMAの発現レベルを図4に示した。図4に示すように、PUMAの発現は、GST-πsiRNAのトランスフェクションの2〜4日後に大きく増加した。
これらのデータは、シード領域におけるデオキシヌクレオチド、2'-F置換デオキシヌクレオチド及び2'-OMe置換リボヌクレオチドの組み合わせを含むGST-πsiRNAの構造が、予想外に癌細胞のアポトーシスを増加させることを示している。
PUMAバイオマーカーに関するプロトコルは以下の通りとした。トランスフェクションの1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプレートに2×103細胞/ウェルで播種し、5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュベーターで培養した。翌日、トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μlのOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）と交換した。次いで、0.2μlのLipofectamine RNAiMAX（Life Technologiesカタログ番号13778-100）を4.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合した。1μlのsiRNA（ストック濃度1μM）を4μlのOpti-MEM Iと混合し、RNAiMAX溶液と混合し、次いで穏やかに混合した。混合物を室温で10分間インキュベートし、RNA-RNAiMAX複合体を形成させた。10μlのRNA-RNAiMAX複合体をウェル当たりに添加し、siRNAの最終濃度を10nMとした。細胞を2時間インキュベートし、培地を2％FBSを含む新鮮なOpti-MEM I還元血清培地に交換した。トランスフェクションの1、2、3、4及び6日後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄し、次いで50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液（Life Technologiesカタログ番号4391851C）を用いて室温で約5〜30分溶解した。5μlの停止溶液を添加し、室温で2分間インキュベートした。PUMA（BBC3、Cat＃Hs00248075、Life Technologies）のmRNAレベルをTAQMANを用いてqPCRにより測定した。
実施例１２：本発明のGST-πsiRNAは、インビボで癌異種移植片腫瘍の顕著な減少を示すことができた。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植腫瘍に投与された場合、インビボで遺伝子ノックダウン効力を提供することができる。
図5は、GST-πsiRNA（配列番号61及び126）の腫瘍阻害効力を示している。GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンは、GST-πを標的とするsiRNAでインビボで観察された。癌異種移植片モデルを、GST-πを標的とするsiRNAの0.75mg/kgで比較的低用量と共に使用した。
GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。図5に示すように、GST-πsiRNAで処理すると、脂質製剤に注射してから4日後にGST-πmRNA発現が有意に減少した。4mg/kgの高用量では、注入後24時間で約40％の有意な減少が検出された。
GST-πsiRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有する10mL/kgのリポソーム製剤として単回注射で投与した。
癌異種移植片モデルのため、A549細胞株をATCCから得た。細胞を、10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI-1640中で維持した。接種の48時間前に細胞を分割して、回収時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプシン-EDTAで軽くトリプシン処理し、組織培養から回収した。生存細胞の数を計数し、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。血清を含まないRPMI培地中で細胞を4×107/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用した。
マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリー胸腺ヌード（nu/nu）雌マウス、免疫不全、6〜8週齢、1群当たり3匹のマウスであった。
腫瘍モデル調製のために、マウス1匹につき1接種量の25G針及び注射器を用いて、2×106のA549細胞の接種材料0.1mlを右脇腹に皮下接種した。マウスは接種のために麻酔をかけられなかった。
腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmまで測定した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積=長さ×幅2/2を用いて計算した。腫瘍容積を週2回モニターした。確立された腫瘍が約350〜600mm3に達すると、マウスを様々な時点で群に割り当てた。同じ日に、試験品を投与レジメンに従って投与した。
投薬投与のために、確立された腫瘍が約350〜600mm3に達した日に、試験品を4℃の冷蔵庫から取り出した。シリンジにアプライする前に、処方剤を含むボトルを手で数回反転して均一な溶液を作製した。
体重については、マウスを最も近い0.1gまで秤量した。研究の終了日を含む残りの数週間、体重を数週間監視し、週2回記録した。
腫瘍の収集のために、動物を過量のCO2で犠牲にし、投与後0、24、48、72及び96（任意）及び168時間で腫瘍を解剖した。腫瘍を最初に湿潤し、KD、分布及びバイオマーカー分析のために3つの部分に分けた。試料を液体窒素中で急速冷凍し、処理する準備が整うまで-80℃で保存した。
実施例１３：本発明のGST-πsiRNAは、インビボで膵臓癌異種移植片腫瘍を阻害した。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で膵臓癌異種移植片腫瘍に投与された場合、インビボで遺伝子ノックダウン効力をもたらした。
この異種移植モデルでは、各マウスに、2.5×106のPANC-1細胞接種物0.1mlを右脇腹に皮下接種した。胸腺欠損ヌード雌マウス（6〜8週齢、Charles River）を用いた。腫瘍の大きさは、最も近い0.1mmまで測定した。確立された腫瘍が約150〜250mm3（平均腫瘍体積約200mm3）に達すると、マウスを、処置群の平均腫瘍体積がビヒクル対照群における平均腫瘍体積の10％以内になるように、様々なビヒクル対照及び処置群に割り当てた。同じ日に、試験品及び対照ビヒクルを投薬レジメンに従って投与した。腫瘍容積を第1週に3回、研究終了日を含めて残りの週では2回モニターした。
図6は、GST-πsiRNA（配列番号61及び126）の腫瘍阻害効力を示している。図6に示すように、用量応答は、GST-πを標的とするsiRNAの0.375mg/kg〜3mg/kgの範囲の用量で得られた。GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で、且つ予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。したがって、GST-πsiRNAは、エンドポイントで有意で、且つ予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。
GST-πsiRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤で投与した。
実施例１４：本発明のGST-πsiRNAは、増加した血清安定性を示した。
図7は、ヒト血清中でのインキュベーション及びHPLS/LCMSによる様々な時点での残りのsiRNAの検出を示している。図7に示すように、GST-πsiRNA（配列番号61及び126）のセンス鎖（図7、上段）及びアンチセンス鎖（図7、下段）の両方の血清中の半減期（t1/2）は約100分であった。
実施例１５：本発明のGST-πsiRNAは、血漿中での製剤中の安定性の向上を示した。
図8は、血漿中での製剤のインキュベーション及び様々な時点での残りのsiRNAの検出を示している。図8に示すように、GST-πsiRNA製剤（配列番号61及び126）の血漿中半減期（t1/2）は100時間よりも有意に長かった。
GST-πsiRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤で調製した。リポソームナノ粒子のz平均サイズは40.0nmであり、siRNAは91％カプセル化されていた。
製剤をPBS中の50％ヒト血清中で40分、1.5時間、3時間、24時間及び96時間インキュベートした。GST-πsiRNAの量は、ELISAベースのアッセイによって決定した。
実施例１６：本発明のGST-πsiRNAは、パッセンジャー鎖によるオフターゲット効果の低下を示した。
GST-πsiRNA（配列番号156及び182）について、図9は、効果を示さなかったスクランブル配列を有する対照と比較して、ガイド鎖についてのインビトロノックダウンがほぼ指数関数的であったことを示している。このsiRNAのIC50を5pMで測定した。図10は、同じGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖のインビトロノックダウンを示している。図10に示すように、GST-πsiRNAについてパッセンジャー鎖のオフターゲットノックダウンは100倍以上大きく減少した。
GST-πsiRNA（配列番号187及び199）、（配列番号189及び201）及び（配列番号190及び202）に関して、図11は、ガイド鎖のインビトロノックダウンはおよそ指数関数的であったことを示している。これらのsiRNAのIC50を、それぞれ6、7及び5pMで測定した。図12に示すように、これらのGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖のインビトロノックダウンは、少なくとも10倍まで有意に減少した。これらのGST-πsiRNAはすべて、二重鎖領域のシード領域にデオキシヌクレオチドを有し、当該二重鎖領域には他の修飾はなかった。
GST-πsiRNA（配列番号217及び232）について、図13は、この高活性なGST-πsiRNAのガイド鎖についてのインビトロノックダウンがほぼ指数関数的であったことを示している。このsiRNAのIC50を11pMで測定した。図14に示すように、このGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖に対するインビトロノックダウンは、100倍を超えて有意に減少した。このGST-πsiRNAは、二重鎖領域のシード領域にデオキシヌクレオチドを有し、当該二重鎖領域には他の修飾はなかった。
オフターゲット効果は、Renillaルシフェラーゼ遺伝子をコードする発現レポータープラスミドpsiCHECK-2を用いて決定した（二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム、Promega、カタログ番号：E1960）。siRNA濃度は典型的には50pMであった。プロトコル：1日目、HeLa細胞を5〜7.5×103/100μl/ウェルで播種した。2日目、約80％の細胞コンフルエンスでの同時トランスフェクション。3日目に、細胞を採取してルシフェラーゼ活性測定を行った。ルシフェラーゼ活性を、プロメガ社のルシフェラーゼアッセイシステム（E4550）を用いて、製造業者のプロトコルに従って測定した。
psiCHECK-2ベクターは、Renillaルシフェラーゼのレポーター遺伝子に融合した標的遺伝子の発現の変化をモニタリングすることができる。siRNA構築物を多重クローニング領域にクローニングし、ベクターをHeLa細胞にsiRNAとともに同時トランスフェクションした。特定のsiRNAが標的mRNAに結合し、RNAiプロセスを開始する場合、融合Renillaルシフェラーゼ：構築mRNAは切断され、続いて分解され、Renillaルシフェラーゼシグナルを減少させる。
例えば、BU2’構造を有するsiRNAのためのプラスミド挿入物は以下の通りとした：
PsiCHECK-2（F）プラスミド挿入物：
配列番号451
ctcgag gggcaacTGAAGCCTTTTGAGACCCTGcTgTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（R）プラスミド挿入物：
配列番号452
ctcgag cTgggacagCAGGGTCTCAAAAGGCTTCagTTgccc gcggccgc
PsiCHECK-2（F）プラスミド挿入物：
配列番号451
ctcgag gggcaacTGAAGCCTTTTGAGACCCTGcTgTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（R）プラスミド挿入物：
配列番号452
ctcgag cTgggacagCAGGGTCTCAAAAGGCTTCagTTgccc gcggccgc
実施例１７：本発明のGST-πsiRNAは、シード依存性の意図しないオフターゲット遺伝子サイレンシングである、miRNA様オフターゲット効果が有利に減少したことを示した。
GST-πsiRNA（配列番号156及び182）、（配列番号187及び199）、（配列番号189及び201）、（配列番号190及び202）及び（配列番号217及び232）に関して、miRNAを模倣するオフターゲット活性は、本質的に無視できることが判明した。これらのGST-πsiRNAのシード依存性の意図しないオフターゲット遺伝子サイレンシングは、ガイド鎖の標的活性よりも少なくとも10倍〜100倍小さかった。
miRNA関連オフターゲット効果を試験するために、アンチセンス鎖の5’末端の1〜8位の位置である、シード含有領域全体に相補的ではあるが残りの非シード領域（位置9〜21）相補的ではない、1〜4回反復のシード適合標的配列を、ルシフェラーゼmRNAの3'UTRに対応する領域に導入して、シード依存性の意図しないオフターゲット効果の効率を決定した。プラスミド挿入物を用いて、シード領域における完全なマッチング及び非シード領域におけるミスマッチ（バルジ）を有するmiRNAを模倣した。
例えば、BU2’構造を有するsiRNAについてのプラスミド挿入物は以下の通りとした：
PsiCHECK-2（Fmi1）プラスミド挿入物：
配列番号453
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcTgTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi2）プラスミド挿入物：
配列番号454
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi3）プラスミド挿入物：
配列番号455
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi4）プラスミド挿入物：
配列番号456
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi1）プラスミド挿入物：
配列番号453
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcTgTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi2）プラスミド挿入物：
配列番号454
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi3）プラスミド挿入物：
配列番号455
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi4）プラスミド挿入物：
配列番号456
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
本明細書に記載された実施形態は限定されず、当業者は、改良されたRNAi活性を有する核酸分子を同定するための過度の実験をすることなく、本明細書に記載の修飾の特定の組み合わせを試験できることを容易に理解できる。
実施例１８：p21を標的とする本発明のsiRNAは、インビトロで遺伝子サイレンシング活性を有することが見出された。遺伝子ノックダウンのためのp21 siRNAの用量依存的活性は、約3ピコモル（pM）未満のIC50、及び1pM程度の低いIC50を示すことが判明した。
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で実施し、siRNAノックダウン効果を決定した。表21に示すように、p21 mRNAに対する用量依存的ノックダウンが表7のsiRNAで観察された。
表21に示すように、表7のp21 siRNAの活性は0.3〜10pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に適している。
実施例１９：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有する本発明のp21 siRNAの構造は、予想外に且つ有利に遺伝子ノックダウン活性を増加させた。
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で実施し、構造1735’（配列番号341及び355）に基づくp21 siRNAのノックダウン効力を決定した。p21 mRNAの用量依存的ノックダウンは、表22に示すように、構造1735’に基づくp21 siRNAで観察された。
表22に示すように、デオキシヌクレオチドを含まないp21 siRNAと比較して、アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造1735’に基づくp21 siRNAの活性は、二重鎖領域にデオキシリボヌクレオチドを有しないp21 siRNAと比較して、驚くほどかつ予想外に300倍まで増加した。
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域にデオキシヌクレオチドを有する構造を有するp21 siRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有さないp21 siRNAと比較して驚くほど高い遺伝子ノックダウン活性を提供することを示している。
アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有するp21 siRNAについて、表22に示される活性は、0.001から0.1pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
実施例２０：本発明のp21 siRNAは、インビボにおいて、癌異種移植腫瘍を顕著に減少させることが示された。p21 siRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植片腫瘍に投与された場合、インビボでの遺伝子ノックダウン効力を示すことができる。
図１５は、p21 siRNA（配列番号341及び355、ここでNはU）の腫瘍抑制効果を示している。癌異種移植モデルに対して、p21を標的とするsiRNAを比較的低用量0.75mg/kgで利用した。
p21 siRNAは、有意で、且つ予測を上回る程に有利な腫瘍抑制効果を投与後数日以内に示した。30日後、p21 siRNA は、コントロールと比較して2倍以上に腫瘍体積が減少するといった著しく有利な腫瘍抑制効果を示した。
p21 siRNAを、組成物(イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K) (25：30：20：20：5)を含むリポソーム製剤（10mL/kg）を4回注射して0.75mg/kgの用量で投与した（1日目、8日目、15日目及び22日目）。
癌異種移植モデルについては、ATCCよりA549細胞ラインを入手した。細胞は10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを添加した培養培地で維持した。接種の48時間前に細胞を分割して、収穫時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプシン-EDTAを用いて軽くトリプシン処理し、組織培養から収穫した。生存細胞の数を計数し、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。細胞を、血清を含まない培地中で5×107/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射した。
マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーの無胸腺ヌード（nu/nu）・メスの免疫不全マウスであり、6〜8週齢で1群当たり7〜8匹としたた。
腫瘍モデル調製のために、25G針およびシリンジを用いて、2.5×106個のA549細胞の接種物0.1mlを右脇腹に皮下接種した（マウス1匹につき1接種量）。マウスは接種のために麻酔をかけられなかった。
腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmの位まで測定した。腫瘍体積は次式を用いて計算した：腫瘍体積＝長さ×深さ２/２。樹立した腫瘍が約120〜175mm3に達したら、平均腫瘍体積は約150mm3であり、マウスを様々なビヒクル対照群と処置群とに割り当て、処置群の平均腫瘍体積がビヒクル対照群における平均腫瘍体積の10％以内になるようにした。理想的には、腫瘍体積のCV％は25％未満であった。同じ日に、試験品及び対照ビヒクルを投薬レジメンに従って投与した。腫瘍体積を、第1週に3回、試験終了日を含めて残りの週は2回モニターした。
用量投与のために、投与日に、試験品を-80℃の冷凍庫から取り出し、氷上で解凍した。 注射器にアプライする前に、製剤を含むボトルを手で数回反転した。全ての試験品はIVにより0.75mg/kgで投与した。
体重について、マウスは0.1ｇの位まで測定された。体重をモニターし、初回投与から7日以内は毎日記録した。試験終了日を含む残りの数週間については週に2回、体重をモニターし、記録した。
腫瘍の採取のため、最初の投与の28日後に、腫瘍体積を測定し、腫瘍を重量測定のために切開し、PDバイオマーカー研究のために保存した。腫瘍重量を記録した。
明細書に記載された実施形態は限定されず、当業者は、改良されたRNAi活性を有する核酸分子を同定するための過度の実験をすることなく、本明細書に記載の修飾の特定の組み合わせを試験できることを容易に理解できる。
実施例２１：MCL1を標的とする本発明のsiRNAを調製し、インビトロにおいて遺伝子サイレンシグ活性を有することが見いだされた。遺伝子ノックダウンに対するMCL1 siRNAにおける用量依存的活性が、約100ピコモル（pM）以下のIC50を示すことがわかった。
A549細胞ラインを用いてインビトロトランスフェクションを実施し、siRNAノックダウン効果を決定した。 MCL1 mRNAに対する用量依存的ノックダウンは、表11に示したsiRNAにおいて観察された。
実施例２２：ARAFを標的とする本発明のsiRNAを調製し、インビトロにおいて遺伝子サイレンシグ活性を有することが見いだされた。遺伝子ノックダウンに対するARAF siRNAにおける用量依存的活性が、約100ピコモル（pM）以下のIC50を示すことがわかった。
A549細胞ラインを用いてインビトロトランスフェクションを実施し、siRNAノックダウン効果を決定した。 MCL1 mRNAに対する用量依存的ノックダウンは、表12に示したsiRNAにおいて観察された。
本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物、特許及び文献は、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、材料、及び試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。説明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示された説明に様々な置換及び変更を加えることができ、これらの実施形態はこの説明及び添付の特許請求の範囲内にあることは、当業者にとって極めて明らかである。
単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。同様に、用語「a」（又は「an」）、「1つ以上」及び「少なくとも1つの」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」及び「有する」は、互換的に使用することができ、広範かつ制限なしに読まれるべきである。
本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個々に参照する簡略方法として役立つことを意図しており、それぞれの個別値は個々に記載されているかのように組み入れられる。ここで、マーカッシュグループについては、当業者は、この説明が個々のメンバーならびにマーカッシュグループのメンバーのサブグループを含むことを認識するであろう。
それ以上の詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同じ、等価の目的、又は同様の目的を果たす代替の特徴と置き換えることができる。
Claims (26)
- 核酸分子であって、
a) 当該分子はポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、
b) 当該分子のそれぞれの鎖は15〜30ヌクレオチド長であり、
c) 当該アンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域はmRNAの配列に対して相補的であり、
d) 当該センス鎖における少なくとも一部は当該アンチセンス鎖の少なくとも一部に対して相補的であり、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有し、
e) 前記アンチセンス鎖は、以下(1)〜(5)に示すいずれかの位置のみがデオキシヌクレオチドであることを特徴とする核酸分子。
(1)前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置4、6及び8のそれぞれの位置
(2)前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置3、5及び7のそれぞれの位置
(3)前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置1、3、5及び7のそれぞれの位置
(4)前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置3〜8のそれぞれの位置
(5)前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置5〜8のそれぞれの位置 - mRNAの発現を調節する活性を有するRNAi分子であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- タンパク質コード遺伝子、癌原遺伝子、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子及び細胞シグナル伝達遺伝子から選択される遺伝子の発現を阻害する活性を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記mRNAはヒトmRNAであることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記mRNAは、SRY、β-グロビン、RAS、細胞質ゾルGST、ミトコンドリアGST、MAPEG GST、GST-π、p16、p21、p53、血清アルブミン、VII型コラーゲン、補体C3、アポリポタンパク質B、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、第VIII因子、ハンチンチン、RB1網膜芽細胞腫タンパク質、CFTR、タイチン、ウトロフィン及びジストロフィンから選ばれるタンパク質をコードするヒトmRNAであることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- mRNAノックダウンについて100pM未満のIC50を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- mRNAノックダウンについて50pM未満のIC50を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- mRNAノックダウンについて10pM未満のIC50を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記分子の単回投与はインビボにおいてmRNAを少なくとも25%阻害することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記各鎖は、18〜22ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記二本鎖領域は、19ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記ポリヌクレオチドセンス鎖及び前記ポリヌクレオチドアンチセンス鎖は、単一の鎖として連結されており、ループによって一端部で結合した二本鎖領域を形成していることを特徴とする請求項1記載の核酸分子。
- 平滑末端を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- １以上の3’オーバーハングを有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 二本鎖領域内の１以上のヌクレオチドが修飾又は化学修飾されていることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記修飾又は化学修飾ヌクレオチドは、2'-O-アルキル置換ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ロックドヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせであることを特徴とする請求項１５記載の核酸分子。
- 前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号１５７であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号１３１であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号１８２であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号１５６であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号１９５であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号１８３であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号２０５であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号１９３であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号３５７であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号３４３であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号３５６であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号３４２であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
- 請求項１〜２２のいずれか一項記載の核酸分子と薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
- 前記担体が脂質分子又はリポソームを含むことを特徴とする請求項２３記載の医薬組成物。
- 悪性腫瘍、癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫及び癌腫から選ばれる少なくとも一種に対する治療のための請求項２３記載の医薬組成物。
- 請求項１〜２２のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター又は細胞。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562266675P | 2015-12-13 | 2015-12-13 | |
| US62/266,675 | 2015-12-13 | ||
| PCT/US2016/066239 WO2017106111A1 (en) | 2015-12-13 | 2016-12-12 | Sirna structures for high activity and reduced off target |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018537104A JP2018537104A (ja) | 2018-12-20 |
| JP6457704B2 true JP6457704B2 (ja) | 2019-01-23 |
Family
ID=59018392
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018530704A Active JP6457704B2 (ja) | 2015-12-13 | 2016-12-12 | 高活性及びオフターゲット削減のためのｓｉＲＮＡ構造 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10358647B2 (ja) |
| EP (2) | EP3386519B1 (ja) |
| JP (1) | JP6457704B2 (ja) |
| KR (1) | KR20180086260A (ja) |
| CN (1) | CN108367022A (ja) |
| AU (1) | AU2016371624B2 (ja) |
| BR (1) | BR112018008344A2 (ja) |
| CA (1) | CA3005937C (ja) |
| ES (1) | ES2865030T3 (ja) |
| PT (1) | PT3386519T (ja) |
| TW (1) | TWI752927B (ja) |
| WO (1) | WO2017106111A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10264976B2 (en) * | 2014-12-26 | 2019-04-23 | The University Of Akron | Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging |
| US11045488B2 (en) | 2014-12-26 | 2021-06-29 | Nitto Denko Corporation | RNA interference agents for GST-π gene modulation |
| KR20180086260A (ko) | 2015-12-13 | 2018-07-30 | 닛토덴코 가부시키가이샤 | 높은 활성 및 감소한 오프 타겟을 위한 sirna 구조 |
| CN110714025A (zh) * | 2018-07-13 | 2020-01-21 | 中国农业大学 | 一种靶向猪ttn基因的打靶载体及其应用 |
| SG11202102164PA (en) | 2018-09-28 | 2021-04-29 | Nutcracker Therapeutics Inc | Tertiary amino lipidated cationic peptides for nucleic acid delivery |
| CN111354420B (zh) * | 2020-03-08 | 2020-12-22 | 吉林大学 | 一种用于COVID-19病毒药物治疗的siRNA研发方法 |
| WO2021236763A2 (en) * | 2020-05-20 | 2021-11-25 | Nitto Denko Corporation | dsRNA DIRECTED TO CORONAVIRUS PROTEINS |
| EP4194553A1 (en) * | 2020-08-04 | 2023-06-14 | Tuojie Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Modified sirna with reduced off-target activity |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR970005898B1 (ko) | 1987-09-21 | 1997-04-21 | 젠- 프로우브 인코퍼레이티드 | 뉴클레오티드 프로브에 대한 비-뉴클레오티드 연결시약 |
| DK0748382T3 (da) | 1993-09-02 | 2003-02-17 | Ribozyme Pharm Inc | Enzymatisk nukleinsyre indeholdende ikke-nukleotid |
| DE69415343T2 (de) | 1993-10-27 | 1999-08-26 | Ribozyme Pharmaceuticals | 2'-amido-und 2'-peptido-modifizierte oligonukleotide |
| US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
| GB9827152D0 (en) | 1998-07-03 | 1999-02-03 | Devgen Nv | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
| DE19956568A1 (de) | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
| WO2001029058A1 (en) | 1999-10-15 | 2001-04-26 | University Of Massachusetts | Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference |
| GB9927444D0 (en) | 1999-11-19 | 2000-01-19 | Cancer Res Campaign Tech | Inhibiting gene expression |
| JP3803318B2 (ja) | 2001-11-21 | 2006-08-02 | 株式会社ＲＮＡｉ | 遺伝子発現阻害方法 |
| EP2305813A3 (en) * | 2002-11-14 | 2012-03-28 | Dharmacon, Inc. | Fuctional and hyperfunctional sirna |
| US7947659B2 (en) * | 2004-03-12 | 2011-05-24 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | iRNA agents targeting VEGF |
| EP1742958B1 (en) | 2004-03-15 | 2017-05-17 | City of Hope | Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna |
| ES2784554T3 (es) | 2004-12-22 | 2020-09-28 | Nitto Denko Corp | Portador de fármacos y kit de portador de fármacos para inhibir la fibrosis |
| WO2006113679A2 (en) | 2005-04-15 | 2006-10-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Delivery of sirna by neutral lipid compositions |
| WO2007064857A2 (en) | 2005-12-01 | 2007-06-07 | Pronai Therapeutics, Inc. | Amphoteric liposome formulation |
| US8748405B2 (en) | 2007-01-26 | 2014-06-10 | City Of Hope | Methods and compositions for the treatment of cancer or other diseases |
| WO2008109432A2 (en) | 2007-03-02 | 2008-09-12 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Therapeutic targeting of interleukins using sirna in neutral liposomes |
| TWI407971B (zh) | 2007-03-30 | 2013-09-11 | Nitto Denko Corp | Cancer cells and tumor-related fibroblasts |
| US20090054366A1 (en) | 2007-06-15 | 2009-02-26 | Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. | RNAi MEDIATED KNOCKDOWN OF NUMA FOR CANCER THERAPY |
| US9328345B2 (en) * | 2007-08-27 | 2016-05-03 | 1 Globe Health Institute Llc | Compositions of asymmetric interfering RNA and uses thereof |
| US20100015708A1 (en) | 2008-06-18 | 2010-01-21 | Mdrna, Inc. | Ribonucleic acids with non-standard bases and uses thereof |
| US20110190380A1 (en) * | 2008-10-23 | 2011-08-04 | Elena Feinstein | Methods for delivery of sirna to bone marrow cells and uses thereof |
| EP2756845B1 (en) | 2009-04-03 | 2017-03-15 | Dicerna Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the specific inhibition of KRAS by asymmetric double-stranded RNA |
| US20110059187A1 (en) | 2009-06-03 | 2011-03-10 | Dicerna Pharmaceuticals, Inc. | Peptide dicer substrate agents and methods for their specific inhibition of gene expression |
| CN106701758B (zh) | 2009-12-09 | 2020-02-07 | 日东电工株式会社 | Hsp47表达的调节 |
| WO2011139842A2 (en) * | 2010-04-28 | 2011-11-10 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof |
| KR20140012943A (ko) | 2010-09-30 | 2014-02-04 | 닛토덴코 가부시키가이샤 | Timp1 및 timp2 발현의 조절 |
| TWI658830B (zh) | 2011-06-08 | 2019-05-11 | 日東電工股份有限公司 | Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體 |
| BR112013033072B1 (pt) | 2011-06-21 | 2021-04-13 | Nitto Denko Corporation | Uso de um agente |
| TWI651093B (zh) * | 2011-06-21 | 2019-02-21 | 日東電工股份有限公司 | 細胞凋亡誘導劑 |
| EP2764007A4 (en) | 2011-10-05 | 2015-05-06 | Protiva Biotherapeutics Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DISABLING ALDEHYDE DEHYDROGENASE |
| WO2013192364A1 (en) | 2012-06-22 | 2013-12-27 | The University Of Vermont And State Agricultural College | Treatments of oxidative stress conditions |
| WO2015093769A1 (ko) * | 2013-12-17 | 2015-06-25 | 성균관대학교산학협력단 | 오프-타겟을 막기 위해 변형된 ｒｎａ 간섭 유도 핵산 및 그 용도 |
| US10264976B2 (en) * | 2014-12-26 | 2019-04-23 | The University Of Akron | Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging |
| KR20180086260A (ko) * | 2015-12-13 | 2018-07-30 | 닛토덴코 가부시키가이샤 | 높은 활성 및 감소한 오프 타겟을 위한 sirna 구조 |
-
2016
- 2016-12-12 KR KR1020187019177A patent/KR20180086260A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-12-12 EP EP16876452.0A patent/EP3386519B1/en active Active
- 2016-12-12 CA CA3005937A patent/CA3005937C/en active Active
- 2016-12-12 BR BR112018008344A patent/BR112018008344A2/pt active Search and Examination
- 2016-12-12 ES ES16876452T patent/ES2865030T3/es active Active
- 2016-12-12 JP JP2018530704A patent/JP6457704B2/ja active Active
- 2016-12-12 US US15/376,633 patent/US10358647B2/en active Active
- 2016-12-12 EP EP20206399.6A patent/EP3816287A1/en active Pending
- 2016-12-12 WO PCT/US2016/066239 patent/WO2017106111A1/en active Application Filing
- 2016-12-12 PT PT168764520T patent/PT3386519T/pt unknown
- 2016-12-12 AU AU2016371624A patent/AU2016371624B2/en active Active
- 2016-12-12 CN CN201680072692.8A patent/CN108367022A/zh active Pending
- 2016-12-13 TW TW105141255A patent/TWI752927B/zh active
-
2019
- 2019-06-25 US US16/451,757 patent/US11390871B2/en active Active
-
2022
- 2022-05-03 US US17/661,803 patent/US11926831B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20170166898A1 (en) | 2017-06-15 |
| US20220267779A1 (en) | 2022-08-25 |
| TW201726920A (zh) | 2017-08-01 |
| CN108367022A (zh) | 2018-08-03 |
| WO2017106111A1 (en) | 2017-06-22 |
| CA3005937C (en) | 2021-11-09 |
| JP2018537104A (ja) | 2018-12-20 |
| RU2018125593A3 (ja) | 2020-04-06 |
| RU2018125593A (ru) | 2020-01-13 |
| EP3386519A1 (en) | 2018-10-17 |
| EP3386519B1 (en) | 2021-03-24 |
| BR112018008344A2 (pt) | 2018-10-30 |
| US10358647B2 (en) | 2019-07-23 |
| AU2016371624B2 (en) | 2020-08-27 |
| TWI752927B (zh) | 2022-01-21 |
| US11390871B2 (en) | 2022-07-19 |
| AU2016371624A1 (en) | 2018-07-12 |
| US11926831B2 (en) | 2024-03-12 |
| EP3386519A4 (en) | 2018-11-07 |
| EP3816287A1 (en) | 2021-05-05 |
| PT3386519T (pt) | 2021-04-27 |
| CA3005937A1 (en) | 2017-06-22 |
| ES2865030T3 (es) | 2021-10-14 |
| US20190323015A1 (en) | 2019-10-24 |
| KR20180086260A (ko) | 2018-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7307137B2 (ja) | ＧＳＴ－π遺伝子を調節するためのＲＮＡ干渉剤 | |
| JP6457704B2 (ja) | 高活性及びオフターゲット削減のためのｓｉＲＮＡ構造 | |
| JP6600389B2 (ja) | ＧＳＴ−π遺伝子を調節するためのＲＮＡ干渉剤 | |
| US20220047619A1 (en) | Rna interference agents for gst-pi gene modulation | |
| US11045488B2 (en) | RNA interference agents for GST-π gene modulation | |
| RU2788030C2 (ru) | Структуры мирнк с высокой активностью и сниженным воздействием вне мишени | |
| TWI715594B (zh) | 用於麩胱甘肽Ｓ轉移酶Ｐｉ（ＧＳＴ－π）基因調控之ＲＮＡ干擾劑 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180717 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180717 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20180801 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20181012 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181113 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181127 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181204 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181220 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6457704 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |