CN108367022A - 具有高活性和降低脱靶的sirna结构 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于使用RNA干扰来调节靶基因表达的化合物、组合物和方法。本发明的RNAi结构和分子可用于以高水平的RNAi活性和降低的脱靶作用来调节基因表达或使基因表达沉默。有利的结构包括靶向任意基因的、在种子区中含有一个或多个2’‑脱氧核苷酸的siRNA。所述RNA干扰分子可用于预防或治疗疾病的方法中。
Description
技术领域
本发明涉及由基于核酸的分子构成的生物药物和治疗剂的领域。更具体而言，本发明涉及利用RNA干扰(RNAi)来调节基因表达的化合物结构及其用途。
序列表
本申请包括作为ASCII文件以电子形式提交的序列表，该文件创建于2016年1月2日，文件名为ND6122770WO_SL.txt，大小为170,872字节，其全部内容通过引用并入本说明书中。
背景技术
RNA干扰(RNAi)已被用于通过短干扰RNA(siRNA)介导而在动物中进行的序列特异性转录后基因沉默。参见例如Zamore等人，Cell，2000，第101卷，第25-33页；Fire等人，Nature，1998，第391卷，第806811页；Sharp，Genes&Development，1999，第13卷，第139-141页。
细胞中的RNAi应答可由双链RNA(dsRNA)引发，但机制尚未完全理解。一般而言，siRNA可为约21至约23个核苷酸长，并且，包含长度为约19个核苷酸的碱基对双链体(duplex)区。
RNAi涉及被称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物。siRNA具有反义链或引导链，该反义链或引导链进入RISC复合物，并介导对具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链靶RNA的切割。siRNA的另一条链是随从链(passenger strand)。对靶RNA的切割在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中部发生。参见例如Elbashir等人，Genes&Development，2001，第15卷，第188-200页。
为改善用作药剂的siRNA化合物的性质，已以各种方式对siRNA化合物的结构进行修饰，以求改善稳定性并降低脱靶(off target)效应。siRNA的脱靶活性与对除靶RNA外的细胞核酸的调节有关，其可能是通过多种机制发生的。
对siRNA化合物的修饰包括改变任意的核苷酸的碱基、糖和/或主链的结构。修饰siRNA核苷酸的一种方式是使用脱氧核苷酸代替siRNA中的某些核糖核苷酸。具体而言，脱氧核苷酸通常被利用于siRNA结构的悬挂(overhang)或末端核苷酸中。
然而，在siRNA结构中使用脱氧核苷酸的缺点在于，脱氧核苷酸不能用于siRNA的种子区中。这是因为，这种siRNA修饰会降低基因沉默活性，因此是不利的。
人们迫切需要能够在不使活性损失的情况下降低脱靶作用的、用于调节基因表达的RNAi结构。
特别地，基于对致癌基因(oncogenes)和癌症相关基因的RNAi抑制的治疗剂需要高效且稳定的siRNA序列和结构。
需要具有高活性结构的siRNA化合物来调节基因表达。
发明内容
本发明涉及利用RNA干扰来调节靶基因表达的化合物、组合物和方法。本文公开的siRNA化合物和结构可高效地调节基因表达。
本发明的RNAi结构可用于调节基因表达，其具有令人惊讶的高水平活性和降低的脱靶作用。
在一些实施方式中，本发明提供通过RNA干扰实现基因沉默的分子，其降低脱靶作用且不损失活性。
在其他一些实施方式中，本发明提供通过RNA干扰实现基因沉默的分子，其降低脱靶作用且具有出乎意料的高基因沉默活性。
本发明的RNAi分子可提供高效且稳定的siRNA结构，其可用于基于对基因进行RNAi抑制的治疗剂。
在其他一些实施方式中，本发明的结构、分子和组合物可用于预防或治疗与一种或多种基因相关的疾病、或者减轻与一种或多种基因相关的病症或紊乱的症状的方法。
本发明包括以下实施方式：
一种核酸分子，其中：
a)该分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；
b)该分子的每条链长度为15至30个核苷酸；
c)该反义链中的15至30个核苷酸的连续区域与mRNA的序列互补；
d)该有义链的至少一部分与该反义链的至少一部分互补，且该分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区，其中，双链体区中反义链的自5’端起第3至8位的核苷酸中的一个或多个是脱氧核苷酸。该mRNA可为人类mRNA。
在一些实施方式中，该核酸分子反义链可在多个位置具有脱氧核苷酸，该多个位置为以下中的一者：
反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处；
反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处；
反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处；
反义链的自5’端起第3-8位中的每一处；和
反义链的自5’端起第5-8位中的每一处。
该核酸分子可为具有调节mRNA表达的活性的RNAi分子。
在某些实施方式中，该核酸分子可具有抑制选自蛋白质编码基因、原癌基因(proto-oncogenes)、致癌基因、肿瘤抑制基因(tumor suppressor genes)和细胞信号传导基因(cell signaling genes)中的基因的表达的活性。
在其他一些实施方式中，该mRNA可以是表达下述人类蛋白质家族的任意成员或亚成员(sub-member)的人类mRNA，所述人类蛋白质家族包括：SRY、β-球蛋白、RAS、胞质GST、线粒体GST、MAPEG GST、GST-π、p16、p21、p53、血清白蛋白、VII型胶原、补体C3、载脂蛋白B、苯丙氨酸羟化酶、VIII因子、亨廷顿蛋白(Huntingtin)、RB1视网膜母细胞瘤蛋白、CFTR、肌联蛋白(Titin)、肌营养相关蛋白(Utrophin)和抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)。
该核酸分子敲低(knockdown)该mRNA的IC50可以小于100pM、或小于50pM、或小于10pM。在某些实施方式中，单次给予该分子后，该核酸分子可在体内将该mRNA抑制至少25％。
在一些实施方式中，该分子的每条链的长度为18至22个核苷酸。该双链体区的长度可为19个核苷酸。在某些实施方式中，该多核苷酸有义链和该多核苷酸反义链可以单链形式连接，且形成在一端以环(loop)连接的双链体区。
该核酸分子可具有平末端(blunt end)。在某些实施方式中，该核酸分子可具有一个或多个3’悬挂。
本发明的实施方式包含在双链体区中具有一个或多个经修饰或经化学修饰的核苷酸的核酸分子。该经修饰或经化学修饰的核苷酸可以是2’-O-烷基取代核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、锁核苷酸(locked nucleotides)或它们的任意组合。
本发明还涵盖含有该核酸分子和药学上允许的担体(carrier)的药物组合物。该担体可为脂质分子或脂质体。
本发明的实施方式还包括含有该核酸分子的载体或细胞。
本发明还涵盖通过基因沉默来预防、治疗或减轻有需要的受试者的疾病的方法，所述方法通过向受试者给予含有该核酸分子的组合物来进行。该疾病可为恶性肿瘤、癌症、肉瘤或癌瘤(carcinoma)。
本发明的实施方式包括核酸分子组合物用于预防、减轻或治疗有需要的受试者的疾病或病症的用途。
在某些实施方式中，本发明的组合物可用于医学疗法中。
在其他实施方式中，本发明的组合物可用于对人体或动物体的治疗中。
在其他实施方式中，本发明的组合物可用于制备或制造用于预防、减轻或治疗有需要的受试者的疾病或病症的药物。
附图说明
图1：图1显示靶向GST-π的本发明的siRNA使体内原位肺癌肿瘤显著缩小。将GST-πsiRNA以脂质体制剂形式、以2mg/kg的剂量给予患有A549原位肺癌肿瘤的无胸腺裸小鼠。在对治疗组和介质(vehicle)对照组剖检时测量最终原发性肿瘤重量。GST-π siRNA在该为期6周的研究中显示了显著的抑制肺癌肿瘤的效能。如图1中所示，在43天之后，GST-π siRNA显示了明显有利的肿瘤抑制效果，与对照相比，最终原发性肿瘤平均重量显著减轻了2.8倍。
图2：图2显示GST-π siRNA的体内肿瘤抑制效能。利用了使用A549细胞的癌异种移植模型(cancer xenograft model)以及相对较低的siRNA剂量(0.75mg/kg)。GST-π siRNA在数天内显示了有利的肿瘤抑制。在36天之后，GST-π siRNA显示了明显有利的肿瘤抑制，与对照相比，最终肿瘤平均体积显著缩小了约2倍。
图3：图3显示GST-π siRNA在图2的终点时的体内肿瘤抑制效能。GST-π siRNA显示了有利的肿瘤抑制，并且平均肿瘤重量减轻了超过2倍。
图4：图4显示本发明的GST-π siRNA在体外经由细胞凋亡而使癌细胞死亡大幅度上升。GST-π siRNA使得PUMA(细胞凋亡的生物标记物)上调，这与细胞活力(cellviability)的损失有关。在图4中，自转染GST-π siRNA之后2-6天，PUMA的表达大幅度升高。
图5：图5显示本发明的GST-π siRNA在体内针对A549异种移植瘤发挥了敲低效能。在给予靶向GST-π的siRNA的无胸腺裸(nu/nu)雌性小鼠(查尔斯河(Charles River)中观察到GST-π mRNA的剂量依赖性敲低。如图5中所示，在以4mg/kg的剂量注射之后24小时，检测到GST-π mRNA显著下降约40％。
图6：图6显示本发明的GST-π siRNA在体内抑制了胰腺癌异种移植瘤。以脂质体制剂形式向6至8周龄的无胸腺裸雌性小鼠中的胰腺癌异种移植瘤给予GST-π siRNA时，GST-πsiRNA在体内发挥了基因沉默功效。如图6中所示，使用剂量范围为0.375mg/kg至3mg/kg的靶向GST-π的siRNA，可获得剂量响应。GST-π siRNA在给予之后数天内显示了有利的肿瘤抑制，肿瘤体积在终点时缩小了约2倍。
图7：图7显示本发明的GST-π siRNA表现出增强的血清稳定性。如图7中所示，GST-π siRNA的有义链(图7，上图)和反义链(图7，下图)在血清中的半衰期(t1/2)均为约100分钟。
图8：图8显示本发明的GST-π siRNA的制剂在血浆中表现出增强的稳定性。图8显示在含有50％人血清的PBS中孵育GST-π siRNA的脂质体制剂，并在各时间点下检测残留的siRNA。如图8中所示，GST-π siRNA的制剂在血浆中的半衰期(t1/2)明显长于100小时。
图9：图9显示GST-π siRNA的引导链的体外敲低。如图9中所示，与未表现出效应的随机序列(scrambled sequence)对照相比，GST-π siRNA的引导链敲低大致呈指数形式。
图10：图10显示图9的GST-π siRNA的随从链的体外敲低。如图10中所示，GST-πsiRNA的随从链脱靶敲低大大减少，基本上无效应。
图11：图11显示若干高活性GST-π siRNA的引导链的体外敲低。如图11中所示，GST-π siRNA的引导链敲低活性大致呈指数形式。
图12：图12显示图11的GST-π siRNA的随从链的体外敲低。如图12中所示，GST-πsiRNA的随从链脱靶敲低活性显著降低至低于约500pM。
图13：图13显示高活性GST-π siRNA的引导链的体外敲低。如图13中所示，GST-πsiRNA的引导链敲低活性大致呈指数形式。
图14：图14显示图13的GST-π siRNA的随从链的体外敲低。如图14中所示，GST-πsiRNA的随从链脱靶敲低活性显著降低。
图15：图15显示p21siRNA的体内肿瘤抑制效能。利用了使用A549细胞的癌异种移植模型以及相对较低的siRNA剂量(0.75mg/kg)。p21siRNA在数天内显示了有利的肿瘤抑制。在30天之后，GST-π siRNA显示了明显有利的肿瘤抑制，与对照相比，最终肿瘤平均体积显著缩小超过2倍。
具体实施方式
本发明涉及用于基于核酸的治疗剂的化合物、组合物和方法，所述治疗剂对基因表达进行调节。
在一些实施方式中，本发明提供具有RNA干扰活性的分子以及可使基因表达沉默的结构和组合物。
本发明公开的结构和组合物可用于预防或治疗各种疾病。
在其他一些实施方式中，本发明提供用于递送和摄取本发明的一种或多种治疗性RNAi分子的组合物以及其使用方法。本发明的基于RNA的组合物可用于预防或治疗恶性肿瘤(例如癌症)的方法中。
本发明的治疗组合物包括具有RNA干扰活性的核酸分子。该治疗性核酸分子可靶向各种基因以实现基因沉默。
在各种实施方式中，本发明提供多种可作为小干扰RNA(siRNA)发挥作用的分子，这些分子可调控基因表达或使基因表达沉默。
本发明的实施方式还提供用于将本发明siRNA递送至需要预防或治疗疾病的受试者的介质、制剂或脂质纳米颗粒制剂。本发明进一步涵盖向哺乳动物给予作为治疗剂的siRNA的方法。
本发明的治疗性分子和组合物可用于RNA干扰介导的疾病预防或治疗，其通过向有需要的受试者给予化合物或组合物来进行。
本发明提供多种RNAi分子，所述分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；所述分子的每条链的长度为15至30个核苷酸；反义链中的15至30个核苷酸的连续区域至少部分地与mRNA的序列互补；并且，有义链的至少一部分与反义链的至少一部分互补，并且，该分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区。
本发明的RNAi分子可在反义链具有与人类mRNA的序列互补的15至30个核苷酸的连续区域，该连续区域位于分子的双链体区中。
在一些实施方式中，RNAi分子可在反义链具有与人类mRNA的序列互补的15至30个核苷酸的连续区域。
本发明实施方式可进一步提供下述方法：在有需要的哺乳动物中，预防、治疗或减轻疾病或病症的一种或多种症状的方法、或减小发生疾病或病症的风险的方法、或延迟疾病或病症的发病的方法。
用于通用基因组沉默的RNAi结构
本发明实施方式可提供靶向任意基因的RNAi分子，其表现出高度的基因表达沉默活性。
本发明公开的RNAi分子可针对基因表达沉默表现出令人惊讶的高活性，同时提供降低的脱靶效应。
在一些实施方式中，本发明的RNAi分子含有一个或多个2’-脱氧核苷酸。在这些实施方式中，一个或多个2’-脱氧核苷酸可位于siRNA的种子区中。
一个或多个2’-脱氧核苷酸可为单脱氧核苷酸。
在本文中使用时，脱氧核苷酸表示单2’-脱氧核苷酸。
2’-脱氧核苷酸可在2’位被卤素取代。
在某些实施方式中，本发明的RNAi分子在siRNA的反义或引导链中含有一个或多个2’-脱氧核苷酸。更具体而言，一个或多个脱氧核苷酸可位于siRNA的反义链的自5’端起第1至8位。在某些实施方式中，一个或多个脱氧核苷酸可位于siRNA的反义链的自5’端起第2至8位。在其他实施方式中，一个或多个脱氧核苷酸可位于siRNA的反义链的自5’端起第3至8位。
本发明涵盖可具有在多个位置含有脱氧核苷酸的反义链的siRNA结构。
在一些实施方式中，siRNA结构可具有在反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处含有脱氧核苷酸的反义链。
在其他实施方式中，siRNA结构可具有在反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处含有脱氧核苷酸的反义链。
在其他实施方式中，siRNA结构可具有在反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处含有脱氧核苷酸的反义链。
在某些实施方式中，siRNA结构可具有在反义链的自5’端起第3至8位中的每一处含有脱氧核苷酸的反义链。
在一些实施方式中，siRNA结构可具有在反义链的自5’端起第5至8位中的每一处含有脱氧核苷酸的反义链。
这些结构中的任一者可在其他位置与一个或多个经修饰或化学修饰的核苷酸组合。
本发明的RNAi分子可以以小于约200pM的有利的IC50抑制基因的mRNA表达。在某些实施方式中，本发明的RNAi分子可以以小于约100pM、或小于约50pM、或小于约30pM、或小于约20pM、或小于约10pM、或小于约5pM、或小于约1pM的有利的IC50抑制基因的mRNA表达。
在其他一些实施方式中，单次给予的情况下，本发明的RNAi分子可在体内将基因的mRNA表达水平抑制至少25％。
本发明siRNA可靶向任意的基因。
本发明siRNA可靶向的基因的实例包括HUGO基因命名委员会(HUGO GeneNomenclature Committee)的基因家族索引(Gene Families Index)中所列的基因。
本发明siRNA可靶向的基因的实例包括核基因、线粒体基因、蛋白质编码基因、原癌基因、致癌基因、肿瘤抑制基因和细胞信号传导基因。
本发明siRNA可靶向的基因的实例包括表达下述人类蛋白质家族的任意成员或亚成员的基因，所述人类蛋白质家族包括：SRY、β-球蛋白、RAS、胞质GST、线粒体GST、MAPEGGST、GST-π、p16、p21、p53、血清白蛋白、VII型胶原、补体C3、载脂蛋白B、苯丙氨酸羟化酶、VIII因子、亨廷顿蛋白、RB1视网膜母细胞瘤蛋白、CFTR、肌联蛋白、肌营养相关蛋白和抗肌萎缩蛋白。
经修饰和经化学修饰的siRNA
本发明的实施方式涵盖基于针对治疗用途提供增强的性质(例如增强的基因沉默活性和功效)的目的而进行修饰或化学修饰的siRNA分子。本发明提供可具有增强的血清稳定性以及降低的脱靶效应的经修饰或化学修饰的siRNA分子，其不损失siRNA分子与基因调节和基因沉默相关的活性和功效。在一些方面，本发明提供以各种组合的形式进行修饰或化学修饰的siRNA，所述siRNA具有增强的稳定性和效能。
本文中，用语“修饰”和“化学修饰”是指对siRNA的天然存在的核苷酸结构或核酸结构进行的改变，其涵盖具有一个或多个核苷酸类似物、改变的核苷酸、非标准核苷酸、非天然存在的核苷酸、以及它们的组合的siRNA。
在一些实施方式中，siRNA中经修饰或经化学修饰的结构的数量可包括siRNA分子的全部结构组分、和/或全部核苷酸。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有以下修饰的siRNA：核苷酸的糖基的修饰、核苷酸的核碱基的修饰、核酸主链或接头的修饰、对siRNA链末端的一个或多个核苷酸的结构的修饰、及它们的组合。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括在糖的2’碳处具有取代基修饰的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括在链的5’端、3’端或两端具有修饰的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有导致链间互补错配的修饰的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有5’-丙胺末端基团、5’-磷酸化末端基团、3’-嘌呤霉素末端基团或3’-生物素末端基团的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有2’-氟代核糖核苷酸、2’-OMe取代核糖核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、2’-氨基取代核糖核苷酸、2’-硫代核糖核苷酸的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有一个或多个5-卤代尿苷、5-卤代胞苷、5-甲基胞苷、核糖胸苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、4-硫代尿苷或5-氨基烯丙基尿苷的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有一个或多个硫代磷酸酯基团的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有一个或多个2’-氟代核糖核苷酸、2’-氟尿苷、2’-氟胞苷、2’-脱氧核糖核苷酸、2’-脱氧腺苷或2’-脱氧鸟苷的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有一个或多个硫代磷酸酯键的siRNA。
经修饰和化学修饰的siRNA的实例包括具有一个或多个亚烷基二醇键、氧基-烷硫基键或氧基羰基氧基键的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有一个或多个脱氧无碱基基团、肌苷、N3-甲基-尿苷、N6,N6-二甲基-腺苷、假尿苷、嘌呤核糖核苷和三氮唑核苷(ribavirin)的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有一个或多个3’或5’反转末端基团的siRNA。
经修饰和经化学修饰的siRNA的实例包括具有一个或多个5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷、腺苷、8-溴鸟苷、7-脱氮-腺苷或N6-甲基腺苷的siRNA。
GST-π和RNAi分子
多种人癌症组织已被发现与突变KRAS基因的出现相关。在一些情形下，组织也表现出升高的谷胱甘肽S-转移酶Pi(GST-π)表达水平(Miyanishi等人，Gastroenterology，2001，第121卷：865-874，摘要)。例如，在患有各种胃肠道恶性肿瘤的患者中观察到升高的血清GST-π水平(Niitsu等人，Cancer，1989，第63卷，第2期，第317-323页，摘要)。
GST-π是GST家族的酶(通过催化疏水性和亲电性的化合物与还原型谷胱甘肽缀合而在解毒中发挥作用)之一。可在体外使用siRNA来降低GST-π表达(Niitsu等人，US 2014/0315975 A1)。然而，现有siRNA药剂存在许多缺点，例如活性不足、脱靶效应、缺乏血清稳定性和缺乏体内功效或效能。
作为示例性靶标的人谷胱甘肽S-转移酶pi(人GST-π)mRNA的核酸序列公开于GenBank登录号NM_000852.3(hGSTP1)中，其长度为986个核苷酸。
本领域普通技术人员应理解，已被报道的序列有可能随时间而有所变化，因此其可改变以涵盖本文核酸分子所需的任何变化。
本发明的实施方式可提供使用小核酸分子使GST-π表达基因沉默的组合物和方法。核酸分子的实例包括具有RNA干扰活性的分子(RNAi分子)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子以及DNA指导的RNA(ddRNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)和重复相关siRNA(rasiRNA)。这些分子能够介导针对GST-π基因表达的RNA干扰。
本文所公开的组合物和方法也可用于治疗受试者的各种恶性肿瘤。
本发明的核酸分子和方法可用于下调编码GST-π的基因的表达。
本发明的组合物和方法可包含一种或多种核酸分子，这种核酸分子可(独立地或组合地)调节或调控GST-π蛋白和/或编码GST-π蛋白的基因、和与GST-π相关疾病、病症或病症(例如恶性肿瘤)的维持和/或发展有关的蛋白质和/或编码GST-π的基因的表达。
参照GST-π的示例性序列来描述本发明的组合物和方法。本领域普通技术人员应理解，本发明的各个方面和实施方式可对应任何相关的GST-π基因、序列或变体(例如同源基因和转录变体)和多态性(包括与任何GST-π基因相关的单核苷酸多态性(SNP)。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法可提供下调GST-π基因(例如人GST-π)的表达的双链短干扰核酸(siRNA)分子。
本发明的RNAi分子可靶向GST-π和任何同源序列，例如使用互补序列或通过并入非典型碱基对(non-canonical base pairs)(例如错配和/或摆动(wobble)碱基对)(其可提供额外的靶序列)。
在鉴别错配的情况下，可使用非典型碱基对(例如错配和/或摆动碱基)生成靶向多于一种基因序列的核酸分子。
例如，可使用非典型碱基对(例如UU和CC碱基对)生成能够靶向具有序列同源性的不同GST-π靶序列的核酸分子。因此，RNAi分子可靶向同源基因之间的保守核苷酸序列，从而可使用单一RNAi分子来抑制多于一种基因的表达。
在一些方面，本发明的组合物和方法包括针对GST-π mRNA有活性的RNAi分子，其中RNAi分子含有与任意的编码GST-π序列的mRNA互补的序列。
在一些实施方式中，本发明的RNAi分子可具有针对GST-πRNA的活性，其中RNAi分子含有与具有变体GST-π编码序列(例如本领域已知与恶性肿瘤有关的突变GST-π基因)的RNA互补的序列。
在其他一些实施方式中，本发明的RNAi分子可含有可与GST-π基因的核苷酸序列相互作用、且介导GST-π基因表达的沉默的核苷酸序列。
抑制GST-π表达的核酸分子可具有有义链和反义链，其中，这些链形成双链体区。核酸分子可在双链体区中具有一个或多个经修饰或化学修饰(包括本领域已知的修饰)的核苷酸。siRNA的悬挂中的任意核苷酸也可经修饰或经化学修饰。
在一些实施方式中，优选的经修饰或经化学修饰的核苷酸是2’-脱氧核苷酸。在其他实施方式中，经修饰或经化学修饰的核苷酸可包括2’-O-烷基取代核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、锁核苷酸或它们的任意组合。
在某些实施方式中，优选的结构可具有在多个位置含有脱氧核苷酸的反义链，该多个位置是下列中的一者：反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处；反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第3-8位中的每一处；和反义链的自5’端起第5-8位中的每一处。这些结构中的任一者可在双链体区中与一个或多个2’-脱氧-2’-氟代核苷酸组合。
本发明的核酸分子可以以小于约200pM的有利的IC50抑制GST-π mRNA的表达。另外，单次给予的情况下，核酸分子可在体内将GST-π mRNA表达水平抑制至少25％。
本发明涵盖药物组合物，其可含有一种或多种本文中记载的siRNA、和药学上允许的担体。可使用任意合适的担体(包括本领域已知的那些担体)以及脂质分子、纳米颗粒或脂质体，这些担体中的任一种可包封siRNA分子。
本发明公开了治疗与GST-π表达有关的疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予含有一种或多种siRNA的组合物。待治疗的疾病可尤其包括恶性肿瘤、癌症、由表达突变KRAS的细胞引起的癌症、肉瘤和癌瘤。
本发明的靶向GST-π mRNA的RNAi分子的实例显示于表1中。
表1：GST-π的RNAi分子序列
表1备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写字母a、u、g、c、t分别是指2’-脱氧-A、2’-脱氧-U、2’-脱氧-G、2’-脱氧-C和脱氧胸苷。
本发明的靶向GST-π mRNA的RNAi分子的实例显示于表2中。
表2：GST-π的RNAi分子序列
表2备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写字母a、u、g、c、t分别是指2’-脱氧-A、2’-脱氧-U、2’-脱氧-G、2’-脱氧-C和脱氧胸苷(dT＝T＝t)。下划线是指2’-OMe取代(例如U)。小写字母f是指2’-脱氧-2’-氟代，例如，fU是2’-脱氧-2’-氟-U。N是A、C、G、U、U、a、c、g、u、t或经修饰、反转或经化学修饰的核苷酸。
本发明的靶向GST-π mRNA的RNAi分子的实例显示于表3中。
表3：GST-π的RNAi分子序列
表3备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写字母a、u、g、c、t分别是指2’-脱氧-A、2’-脱氧-U、2’-脱氧-G、2’-脱氧-C和脱氧胸苷(dT＝T＝t)。下划线是指2’-OMe取代(例如U)。小写字母f是指2’-脱氧-2’-氟代，例如，fU是2’-脱氧-2’-氟-U。N是A、C、G、U、U、a、c、g、u、t或经修饰、反转或经化学修饰的核苷酸。
本发明的靶向GST-π mRNA的RNAi分子的实例显示于表4中。
表4：GST-π的RNAi分子序列
表4备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写字母a、u、g、c、t分别是指2’-脱氧-A、2’-脱氧-U、2’-脱氧-G、2’-脱氧-C和脱氧胸苷(dT＝T＝t)。下划线是指2’-OMe取代(例如U)。小写字母f是指2’-脱氧-2’-氟代，例如，fU是2’-脱氧-2’-氟-U。N是A、C、G、U、U、a、c、g、u、t或经修饰、反转或经化学修饰的核苷酸。
本发明的靶向GST-π mRNA的RNAi分子的实例显示于表5中。
表5：GST-π的RNAi分子序列
表5备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写字母a、u、g、c、t分别是指2’-脱氧-A、2’-脱氧-U、2’-脱氧-G、2’-脱氧-C和脱氧胸苷(dT＝T＝t)。下划线是指2’-OMe取代(例如U)。小写字母f是指2’-脱氧-2’-氟代，例如，fU是2’-脱氧-2’-氟-U。N是A、C、G、U、U、a、c、g、u、t或经修饰、反转或经化学修饰的核苷酸。
本发明的靶向GST-π mRNA的RNAi分子的实例显示于表6中。
表6：GST-π的RNAi分子序列
表6备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写字母a、u、g、c、t分别是指2’-脱氧-A、2’-脱氧-U、2’-脱氧-G、2’-脱氧-C和脱氧胸苷(dT＝T＝t)。下划线是指2’-OMe取代(例如U)。小写字母f是指2’-脱氧-2’-氟代，例如，fU是2’-脱氧-2’-氟-U。N是A、C、G、U、U、a、c、g、u、t或经修饰、反转或经化学修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供多种核酸分子，其中：a)该分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；b)分子的每条链长度为15至30个核苷酸；c)反义链中的15至30个核苷酸的连续区域与编码GST-π的mRNA的序列互补；d)有义链的至少一部分与反义链的至少一部分互补，且该分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区。
在一些实施方式中，核酸分子可在反义链中具有与编码GST-π的mRNA的序列互补的15至30个核苷酸的连续区域，该连续区域位于分子的双链体区中。
在其他实施方式中，核酸分子可在反义链中具有与编码GST-π的mRNA的序列互补的15至30个核苷酸的连续区域。
在某些实施方式中，核酸分子的每条链的长度可为18至22个核苷酸。核酸分子的双链体区长度可为19个核苷酸。
在替代形式中，核酸分子可具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链，所述有义链和反义链以单链形式连接，并且形成一端以环连接的双链体区。
本发明的一些实施方式中，核酸分子可具有平末端。在某些实施方式中，核酸分子可具有一个或多个3’悬挂。
本发明提供多种核酸分子，其是具有基因沉默活性的RNAi分子。本发明核酸分子可为具有基因沉默活性的dsRNA、siRNA、微小RNA、或shRNA，和DNA指导的RNA(ddRNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)或重复相关siRNA(rasiRNA)。该核酸分子可具有抑制GST-π表达的活性。
本发明实施方式进一步提供对GST-π进行敲低的IC50小于100pM的核酸分子。
本发明的其他一些实施方式提供对GST-π进行敲低的IC50小于50pM的核酸分子。
本发明进一步涵盖含有一种或多种本发明核酸分子、以及药学上允许的担体的组合物。在某些实施方式中，担体可为脂质分子或脂质体。
对于本发明的化合物和组合物而言，通过向有需要的受试者给予所述化合物或组合物，可用于预防或治疗GST-π相关疾病的方法。
本发明的方法可利用本发明的化合物来预防或治疗恶性肿瘤。恶性肿瘤可呈现于各种疾病中，例如与GST-π表达相关的癌症、由表达突变KRAS的细胞引起的癌症、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、癌瘤、脑瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、阑尾癌、结肠直肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、肛门癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、白血病、恶性淋巴瘤、上皮性恶性肿瘤和非上皮性恶性肿瘤。
P21和RNAi分子
p21是由CDKN1A基因编码的细胞周期调控蛋白，其隶属CIP/KIP家族。该蛋白质通过与细胞周期蛋白-CDK复合物结合而抑制该复合物的作用，从而具有抑制G1期和G2/M期的细胞周期进展的功能。具体而言，p21基因被p53(肿瘤阻遏基因之一)激活。已有报道，在p53因DNA损伤等而被激活时，p53激活p21，使细胞周期停滞于G1期和G2/M期。
p21在各种人类癌症(包括前列腺癌、宫颈癌、乳癌和鳞状细胞癌)中过度表达，在许多情形下，p21的上调与肿瘤等级、侵袭性和侵犯性呈正相关。参见例如Chang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，第97卷，第8期，第4291-96页。同样，已有报道，p21的上调与多种形式的癌症(包括脑癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和食道细胞癌)中的致瘤性和较差预后有关。参见例如Winters等人，Breast Cancer Research，2003，第5卷，第6期，第R242-R249页。另外，所述疾病可为年龄相关疾病，包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、淀粉样变性和关节炎。参见例如Chang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，第97卷，第8期，第4291-96页。
p21存在于包括人类在内的各种动物中。关于人CDKN1A(p21)的序列信息参见：NM_000389.4、NM_078467.2、NM_001291549.1、NM_001220778.1、NM_001220777.1(NP_001207707.1、NP_001278478.1、NP_001207706.1、NP_510867.1、NP_000380.1)。
作为靶标的人p21mRNA公开于GenBank登录号NM_000389.4(CDKN1A)中，其长度为2175个碱基对。
本领域普通技术人员应理解，已被报道的序列有可能随时间而有所改变，因此可改变以涵盖本文的核酸分子所需的任何变化。
本发明的实施方式可提供使用小核酸分子使p21基因表达沉默的组合物和方法。核酸分子的实例包括具有RNA干扰活性的分子(RNAi分子)、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子以及DNA指导的RNA(ddRNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)和重复相关siRNA(rasiRNA)。这些分子能够介导针对p21基因表达的RNA干扰。
本文所公开的组合物和方法也可用于治疗受试者的各种恶性肿瘤。
本发明的核酸分子和方法可用于下调编码p21的基因的表达。
本发明的组合物和方法可包含一种或多种核酸分子，这种核酸分子可(独立地或组合地)调节或调控p21蛋白和/或编码p21蛋白的基因、和与p21相关疾病、病症或病症(例如恶性肿瘤)的维持和/或发展有关的蛋白质和/或编码p21的基因的表达。
参照p21的示例性序列来描述本发明的组合物和方法。本领域普通技术人员应理解，本发明的各个方面和实施方式可对应任何相关的p21基因、序列或变体(例如同源基因和转录变体)和多态性(包括与任何p21基因相关的单核苷酸多态性(SNP)。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法可提供下调p21基因(例如人CDKN1A)的表达的双链短干扰核酸(siRNA)分子。
本发明的RNAi分子可靶向p21和任何能够提供其他靶序列的同源序列，例如使用互补序列或通过并入非典型碱基对(例如错配和/或摆动碱基对)(其可提供额外的靶序列)。
在鉴别错配的情况下，可使用非典型碱基对(例如错配和/或摆动碱基)生成靶向多于一种基因序列的核酸分子。
例如，可使用非典型碱基对(例如UU和CC碱基对)生成能够靶向具有序列同源性的不同p21靶序列的核酸分子。因此，RNAi分子可靶向同源基因之间的保守核苷酸序列，从而可使用单一RNAi分子来抑制多于一种基因的表达。
在一些方面，本发明的组合物和方法包括针对p21mRNA具有活性的RNAi分子，其中RNAi分子含有与任意的编码p21序列的mRNA互补的序列。
在一些实施方式中，本发明的RNAi分子可具有针对p21RNA的活性，其中RNAi分子含有与具有变体p21编码序列(例如本领域已知与恶性肿瘤有关的突变p21基因)的RNA互补的序列。
在其他实施方式中，本发明的RNAi分子可含有可与p21基因的核苷酸序列相互作用、且介导p21基因表达的沉默的核苷酸序列。
抑制p21表达的核酸分子可具有有义链和反义链，其中，这些链形成双链体区。核酸分子可在双链体区中具有一个或多个经修饰或化学修饰(包括本领域已知的修饰)的核苷酸。siRNA的悬挂中的任意核苷酸也可经修饰或化学修饰。
在一些实施方式中，优选的经修饰或化学修饰的核苷酸是2’-脱氧核苷酸。在其他实施方式中，经修饰或化学修饰的核苷酸可包括2’-O-烷基取代核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、锁核苷酸或它们的任意组合。
在某些实施方式中，优选的结构可具有在多个位置含有脱氧核苷酸的反义链，该多个位置是下列中的一者：反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处；反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第3-8位中的每一处；和反义链的自5’端起第5-8位中的每一处。这些结构中的任一者可在双链体区中与一个或多个2’-脱氧-2’-氟代核苷酸组合。
本发明的核酸分子可以以小于约200pM的有利的IC50抑制p21mRNA的表达。另外，单次给予的情况下，核酸分子可在体内将p21mRNA表达水平抑制至少25％。
本发明涵盖药物组合物，其可含有一种或多种本文中记载的siRNA、和药学上允许的担体。可使用任意合适的担体，(包括本领域已知的那些担体)以及脂质分子、纳米颗粒或脂质体，这些担体中的任一种可包封siRNA分子。
本发明公开了治疗可能与p21表达有关的疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予含有一种或多种siRNA的组合物。待治疗的疾病可尤其包括恶性肿瘤、癌症、由表达突变KRAS的细胞引起的癌症、肉瘤和癌瘤。
本发明的靶向p21mRNA的RNAi分子的实例显示于表7中。
表7：p21的RNAi分子序列
表7备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写字母a、g、c、t分别代表2’-脱氧-A、2’-脱氧-G、2’-脱氧-C和胸苷。mU是2’-甲氧基-U。
本发明的靶向p21mRNA的RNAi分子的实例显示于表8中。
表8：p21的RNAi分子序列
表8备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写字母a、u、g、c、t分别是指2’-脱氧-A、2’-脱氧-U、2’-脱氧-G、2’-脱氧-C和脱氧胸苷(dT＝T＝t)。下划线是指2’-OMe取代(例如U)。N是A、C、G、U、U、a、c、g、u、t或经修饰、反转或经化学修饰的核苷酸。
本发明的实施方式涵盖表1-8中的siRNA分子，这些siRNA分子按照上文中的实例经修饰或经化学修饰。
在一些实施方式中，本发明提供多种核酸分子，其中：a)该分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；b)分子的每条链长度为15至30个核苷酸；c)反义链中的15至30个核苷酸的连续区域与编码p21的mRNA的序列互补；和d)有义链的至少一部分与反义链的至少一部分互补，且该分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区。
在一些实施方式中，核酸分子可在反义链中具有与编码p21的mRNA的序列互补的15至30个核苷酸的连续区域，且该连续区域位于分子的双链体区中。
在其他实施方式中，核酸分子可在反义链中具有与编码p21的mRNA的序列互补的15至30个核苷酸的连续区域。
在其他方面，本发明的核酸分子的每条链的长度可为18至22个核苷酸。核酸分子可具有长度为19个核苷酸的双链体区。
在某些实施方式中，核酸分子可具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链，所述有义链和反义链以单链形式连接，并且形成一端以环连接的双链体区。
本发明的核酸分子可具有平末端，且可具有一个或多个3’悬挂。
本发明的核酸分子可为具有基因沉默活性的RNAi分子(例如具有基因沉默活性的dsRNA)、siRNA、微小RNA或具有基因沉默活性的shRNA、以及DNA指导的RNA(ddRNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)和重复相关siRNA(rasiRNA)。
本发明提供多种具有抑制p21表达的活性的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子可针对p21敲低具有小于100pM的IC50。
在其他实施方式中，核酸分子可针对p21敲低具有小于50pM的IC50。
本发明进一步涵盖含有一种或多种本发明的核酸分子、和药学上允许的担体的组合物。担体可为脂质分子或脂质体。
对于本发明的化合物和组合物而言，通过向有需要的受试者给予所述化合物或组合物，可用于预防或治疗GST-π相关疾病的方法。
在其他方面，本发明包括治疗与p21表达相关的疾病的方法，其是通过向有需要的受试者给予含有一种或多种本发明核酸分子的组合物来进行。疾病可为恶性肿瘤，其可尤其呈现于与p21表达有关的疾病(例如癌症)中。
本发明的方法可利用本发明的化合物来预防或治疗恶性肿瘤。恶性肿瘤可呈现于各种疾病中，例如与p21表达相关的癌症、由表达突变KRAS的细胞引起的癌症、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、癌瘤、脑瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、阑尾癌、结肠直肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、白血病、恶性淋巴瘤、上皮性恶性肿瘤和非上皮性恶性肿瘤。
本发明实施方式可提供可用于下调或抑制基因和/或蛋白质的表达的RNAi分子。
本发明的RNAi分子可单独地使用，或与其他siRNA组合使用来调节一种或多种基因的表达。
本发明的RNAi分子可单独地使用，或与其他已知药物组合或缀合使用来预防或治疗疾病、或者改善病症或紊乱的症状。
本发明的RNAi分子可用于以序列特异性方式调节或抑制基因表达。
本发明公开的RNAi分子可包含引导链，其是一系列连续的核苷酸，且至少部分地与人mRNA互补。
本发明的实施方式可包括预防、治疗或减轻有需要的受试者的疾病或病症的症状的方法。
在一些实施方式中，预防、治疗或改善受试者的恶性肿瘤症状的方法可包括向受试者给予本发明的RNAi分子以调节受试者或生物体中的基因表达。
在一些实施方式中，本发明涵盖通过使细胞或生物体与本发明的RNAi分子接触来下调细胞或生物体中的基因表达的方法。
靶向Hsp47的RNAi分子
在一些实施方式中，本发明可提供多种用于调节热休克蛋白47(Hsp47)(其是作用于胞内运输和成熟的胶原特异性分子伴侣蛋白)的表达的RNAi分子和组合物。
US 8,710,209中给出了一些用于Hsp47的siRNA的实例，其全部内容出于所有目的通过参考并入本说明书中。
Hsp47或其同源基因序列公开于例如GenBank登录号AB010273(人)、X60676(小鼠)或M69246(大鼠，gp46)中。
已公开了用于抑制纤维化的Hsp47阻遏剂。参见例如US 8,173,170 B2，其全部内容出于所有目的通过参考并入本说明书中。然而，关于Hsp47的抑制在恶性肿瘤发展、进展和生长中效果的信息是有限的。
在一些实施方式中，本发明的siRNA分子的每条链的长度可为15至60个核苷酸，或长度为15至40个核苷酸，或长度为19至25个核苷酸。
在某些实施方式中，本发明提供用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，其含有靶向Hsp47的RNAi分子。
本发明的靶向Hsp47mRNA的RNAi分子的实例显示于表9中。
表9：Hsp47的RNAi分子序列
表9备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写d代表“脱氧”。
在表9中，任意靶向Hsp47的RNAi分子的反义链可在多个位置替代地具有脱氧核苷酸，该多个位置是下列中的一者：反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处；反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第3-8位中的每一处；和反义链的自5’端起第5-8位中的每一处。
本发明的靶向Hsp47mRNA的RNAi分子的其他实例显示于表10中。
表10：Hsp47的RNAi分子序列和对照
表10备注：名称：rX代表核糖核苷酸，mX代表2’-O-甲基核糖核苷酸，25rX代表具有2’-5’键的核糖核苷酸，C3代表1,3-丙二醇间隔基团(spacer)，idAB代表反转1,2-二脱氧-D-核糖，P代表3’-末端上的磷酸基团(phosphate group)。
在表10中，任意靶向Hsp47RNAi分子的反义链可在多个位置替代地具有脱氧核苷酸，该多个位置是下列中的一者：反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处；反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第3-8位中的每一处；和反义链的自5’端起第5-8位中的每一处。
靶向MCL1的RNAi分子
在一些实施方式中，本发明可提供多种用于调节人髓样细胞白血病1(MCL1)基因转录变体2mRNA的表达的RNAi分子和组合物。
MCL1公开于例如登录号NM_182763.2(人)。
本发明公开的靶向MCL1 mRNA的RNAi分子的实例显示于表11中。
表11：MCL1的RNAi分子序列
表11备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写d代表“脱氧”。
在表11中，任意靶向MCL1的RNAi分子的反义链可在多个位置替代地具有脱氧核苷酸，该多个位置是下列中的一者：反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处；反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第3-8位中的每一处；和反义链的自5’端起第5-8位中的每一处。
靶向ARAF的RNAi分子
在一些实施方式中，本发明可提供多种用于调节作为人A-Raf原癌基因的丝氨酸/苏氨酸激酶(ARAF)基因转录变体1mRNA的表达的RNAi分子和组合物。
ARAF公开于例如登录号NM_001654.4(人)。
本发明的靶向ARAF mRNA的RNAi分子的实例显示于表12中。
表12：ARAF的RNAi分子序列
表12备注：大写A、G、C和U分别是指核糖-A、核糖-G、核糖-C和核糖-U。小写d代表“脱氧”。
在表12中，任意靶向ARAF的RNAi分子的反义链可在多个位置替代地具有脱氧核苷酸，该多个位置是下列中的一者：反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处；反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第3-8位中的每一处；和反义链的自5’端起第5-8位中的每一处。
RNA干扰
一般而言，siRNA长度可为约21至约23个核苷酸，并且包含长度为约19个核苷酸的碱基对双链体区。
RNAi涉及被称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物。siRNA具有的反义链或引导链进入RISC复合物，并且介导单链靶RNA的切割，所述单链靶RNA含有与siRNA双链体的反义链互补的序列。siRNA的另一条链是随从链。靶RNA切割在与siRNA双链体的反义链互补的区域中部发生。参见例如Elbashir等人，Genes&Development，2001，第15卷，第188-200页。
本文中，用语“有义链”是指siRNA分子的下述核苷酸序列，所述序列与该siRNA分子的反义链的至少一部分完全互补或部分互补。siRNA分子的有义链可含有与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。
本文中，用语“反义链”是指与靶核酸序列的至少一部分部分互补或完全互补的siRNA分子的核苷酸序列。siRNA分子的反义链可含有与siRNA分子的相应有义链的至少一部分互补的核酸序列。
RNAi分子可通过以序列特异性方式介导RNA干扰来下调或敲低基因表达。参见例如Zamore等人，Cell，2000，第101卷，第25-33页；Elbashir等人，Nature，2001，第411卷，第494-498页；Kreutzer等人，WO2000/044895；Zernicka-Goetz等人，WO2001/36646；Fire等人，WO1999/032619；Plaetinck等人，WO2000/01846；Mello等人，WO2001/029058。
本文中，关于基因表达的术语“抑制”、“下调”或“降低”意指基因表达、或编码一种或多种蛋白质的mRNA分子的水平、或者一种或多种所编码蛋白质的活性降低至低于不存在本发明的RNAi分子或siRNA时观察到的结果。例如，与不存在本发明的RNAi分子或siRNA时所观察到的结果相比，表达水平、mRNA水平或所编码蛋白质的活性水平可降低至少1％、或至少10％、或至少20％、或至少50％、或至少90％或更多。
也可使用RNAi分子来敲低病毒基因表达，由此影响病毒复制。
RNAi分子可由单独的多核苷酸链(有义链或随从链、和反义链或引导链)制得。引导链与随从链至少部分地互补。引导链和随从链可形成具有约15至约49个碱基对的双链体区。
在一些实施方式中，siRNA的双链体区可具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个碱基对。
在某些实施方式中，RNAi分子的长度包括针对RISC的活性的双链体区，由此可在RISC复合物中发挥作用。
在其他实施方式中，RNAi分子可作为Dicer底物而发挥作用，由此转化成能够在RISC复合物中发挥作用的RNAi分子。
在一些方面，RNAi分子可在长链分子的相反的两端具有互补的引导序列部分和随从序列部分，由此，该分子可介由互补序列部分而形成双链体区，在双链体区的一端，由核苷酸接头或非核苷酸接头将链连接。例如，发夹结构或茎环(stem and loop)结构。接头与链的相互作用可为共价键或非共价相互作用。
本发明的RNAi分子可包含将核酸的有义区接合至核酸的反义区的核苷酸接头、非核苷酸接头或核苷酸/非核苷酸混合接头。核苷酸接头可为长度≥2个核苷酸(例如长度为约3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的接头。核苷酸接头可为核酸适体。本文中，用语“适体”或“核酸适体”是指特异性结合至靶分子的核酸分子，其中核酸分子所具有的序列包含天然能够被靶分子识别的序列。或者，适体可为结合至靶分子的核酸分子，其中靶分子不与核酸天然结合。例如，可使用适体结合至蛋白质的配体结合结构域，由此阻碍天然存在的配体与蛋白质的相互作用。参见例如Gold等人，Annu Rev Biochem，1995，第64卷，第763-797页；Brody等人，J.Biotechnol.，2000，第74卷，第5-13页；Hermann等人，Science，2000，第287卷，第820-825页。
非核苷酸接头的实例包括无碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃或其他聚合化合物(例如具有2至100个乙二醇单元的聚乙二醇)。一些实例记载于Seela等人，Nucleic Acids Research，1987，第15卷，第3113-3129页；Cload等人，J.Am.Chem.Soc.，1991，第113卷，第6324-6326页；Jaeschke等人，Tetrahedron Lett.，1993，第34卷，第301页；Arnold等人，WO1989/002439；Usman等人，WO1995/006731；Dudycz等人，WO1995/011910；和Ferentz等人，J.Am.Chem.Soc.，1991，第113卷，第4000-4002页。
RNAi分子可在双链体区具有一个或多个的悬挂。悬挂(其是碱基未配对的单链区域)长度可为1至8个核苷酸或更长。悬挂可为3’-端悬挂，其中链的3’端具有1至8个核苷酸的单链区域。悬挂可为5’-端悬挂，其中链的5’端具有1至8个核苷酸的单链区域。
RNAi分子的悬挂可具有相同的长度，或可为不同长度。
RNAi分子可具有一个或多个平末端，其中双链体区的末端无悬挂，两条链的碱基配对直到双链体区的末端。
本发明的RNAi分子可具有一个或多个平末端，或可具有一个或多个悬挂，或可具有平末端和悬挂的组合。
RNAi分子的链的5’端可以是平末端，或可以是悬挂。RNAi分子的链的3’端可以是平末端，或可以是悬挂。
RNAi分子的链的5’端可以是平末端，同时3’端为悬挂。RNAi分子的链的3’端可以是平末端，同时5’-端为悬挂。
在一些实施方式中，RNAi分子的两端皆是平末端。
在其他实施方式中，RNAi分子的两端皆具有悬挂。
5’端和3’端的悬挂可具有不同长度。
在某些实施方式中，RNAi分子可具有平末端，其中，反义链的5’端和有义链的3’端不具有任何悬挂的核苷酸。
在其他实施方式中，RNAi分子可具有平末端，其中反义链的3’端和有义链的5’端不具有任何悬挂的核苷酸。
RNAi分子可在双链体区中具有碱基对错配。
RNAi分子的悬挂中的任意核苷酸可为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
一个或多个脱氧核糖核苷酸可位于RNAi分子的5’端，其中RNAi分子的另一条链的3’端可不具有悬挂、或可不具有脱氧核糖核苷酸悬挂。
一个或多个脱氧核糖核苷酸可位于RNAi分子的3’端，其中RNAi分子的另一条链的5’端可不具有悬挂，或可不具有脱氧核糖核苷酸悬挂。
在一些实施方式中，RNAi分子的一个或多个、或所有悬挂核苷酸可为2’-脱氧核糖核苷酸。
Dicer底物RNAi分子
在一些方面，RNAi分子可具有适合作为Dicer底物的长度，其能够被加工成RISC活性RNAi分子。参见例如Rossi等人，US2005/0244858。
作为Dicer底物的双链RNA(dsRNA)可具有足够的长度，使被Dicer加工成活性RNAi分子，且可进一步具有下列性质中的一个或多个：(i)Dicer底物dsRNA可不对称，例如在反义链上具有3’悬挂，和(ii)Dicer底物dsRNA可在有义链上具有经修饰的3’端以引导dsRNA的Dicer结合和加工的方向，从而将dsRNA加工成活性RNAi分子。
在某些实施方式中，Dicer底物dsRNA中的最长链的长度可为24-30个核苷酸。
Dicer底物dsRNA可为对称或不对称。
在一些实施方式中，Dicer底物dsRNA可具有22-28个核苷酸的有义链、和24-30个核苷酸的反义链。
在某些实施方式中，Dicer底物dsRNA可在反义链的3’端具有悬挂。
在其他实施方式中，Dicer底物dsRNA可具有长度为25个核苷酸的有义链、和长度为27个核苷酸的反义链，且具有2个碱基的3’悬挂。悬挂的长度可为1、2或3个核苷酸。有义链也可具有5’磷酸基团。
不对称的Dicer底物dsRNA可在有义链的3’端具有两个脱氧核糖核苷酸以代替两个核糖核苷酸。
Dicer底物dsRNA的有义链长度可为约22至约30个核苷酸，或约22至约28个核苷酸；或约24至约30个核苷酸；或约25至约30个核苷酸；或约26至约30个核苷酸；或约26至29个核苷酸；或约27至约28个核苷酸。
Dicer底物dsRNA的有义链长度可为22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在某些实施方式中，Dicer底物dsRNA可具有长度至少为约25个核苷酸且不多于约30个核苷酸的有义链和反义链。
在某些实施方式中，Dicer底物dsRNA可具有长度为26至29个核苷酸的有义链和反义链。
在某些实施方式中，Dicer底物dsRNA可具有长度为27个核苷酸的有义链和反义链。
Dicer底物dsRNA的有义链和反义链可具有相同的长度(具有平末端的情况)或不同长度(具有悬挂的情况)，或可具有平末端和悬挂。
Dicer底物dsRNA可具有长度为19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的双链体区。
Dicer底物dsRNA的反义链可具有在生物环境中(例如在真核细胞的细胞质内)与有义链序列的至少一部分退火(anneal)的任意序列。
具有有义链和反义链的Dicer底物可由其他结构(例如接头基团或接头寡核苷酸)连接。例如，接头连接dsRNA的两条链，从而在退火时形成发夹结构。
Dicer底物的有义链和反义链通常互补，但可在碱基配对时含有错配。
在一些实施方式中，Dicer底物dsRNA可不对称，例如，有义链具有22-28个核苷酸，反义链具有24-30个核苷酸。
Dicer底物dsRNA的一条链、尤其是反义链的区域可具有至少19个核苷酸的序列长度，其中这些核苷酸位于邻近反义链3’端的21个核苷酸的区域，并且与自靶基因产生的RNA的核苷酸序列充分互补。
Dicer底物dsRNA的反义链可在5’端具有1至9个核糖核苷酸以得到22-28个核苷酸的长度。反义链长度为21个核苷酸时，则可在3’端添加1-7个核糖核苷酸、或2-5个核糖核苷酸、或4个核糖核苷酸。所添加的核糖核苷酸可具有任意的序列。
Dicer底物dsRNA的有义链可具有24-30个核苷酸。为了在生物环境下与反义链退火，有义链可与反义链实质上互补。
使用RNAi分子的方法
本发明的核酸分子和RNAi分子可通过直接应用分子而递送至细胞或组织，或将分子与担体或稀释剂组合。
可使用担体或稀释剂、或者任何其他发挥辅助、促使或加快进入细胞中的作用的递送介质(例如病毒序列、病毒物质、或者脂质或脂质体制剂)，从而将本发明的核酸分子和RNAi分子直接递送至或给予细胞、组织、器官或受试者。
本发明的核酸分子和RNAi分子可与阳离子性脂质复合、包封于脂质体内、或以其他方式递送至靶细胞或靶组织。核酸或核酸复合物可经由直接经皮施用、透皮施用或注射来局部给予离体(ex vivo)或体内的相关组织。
递送体系可包括例如水性和非水性凝胶、乳膏(cream)、乳剂(emulsion)、微乳剂、脂质体、软膏、水性和非水性溶液、乳液(lotion)、气溶胶、烃类基剂和粉末，且可含有赋形剂(例如助溶剂和渗透促进剂)。
本发明公开的组合物和方法可包含表达载体，其以允许表达核酸分子的方式而含有编码至少一种本发明的RNAi分子的核酸序列。
本发明的核酸分子和RNAi分子可利用插入DNA或RNA载体中的转录单元表达。重组载体可为DNA质粒或病毒载体。可使用短暂表达核酸分子的病毒载体。
例如，载体可含有编码RNAi分子双链体的2条链、或自我互补从而形成RNAi分子的单个核酸分子的序列。表达载体可包含编码两个或更多个核酸分子的核酸序列。
核酸分子可利用真核启动子在细胞内表达。本领域普通技术人员应认识到，利用合适的DNA/RNA载体，任意核酸均可在真核细胞中表达。
在一些方面，可使用病毒构建体来将表达构建体引入细胞中以用于转录由表达构建体编码的dsRNA构建体。
可通过静脉内注射、肌内注射、腹腔注射、口服、吸入或本领域已知的其他方法将脂质制剂给予动物。
已知且可使用用于给予寡核苷酸的药学上允许的制剂。
治疗疾病的方法
疾病的实例包括癌症、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和癌瘤。
在某些方面，本发明的方法可利用本发明的化合物来预防或治疗任意器官或组织中的恶性肿瘤和癌症，包括例如脑瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、白血病、恶性淋巴瘤、上皮性恶性肿瘤和非上皮性恶性肿瘤。
体外敲低的示例性方案
在转染前一天，使用100μl含有10％FBS的DMEM(HyClone目录号SH30243.01)将细胞以2×103个细胞/孔注入于96孔板中且在含有5％CO2(于空气中)湿润气氛的37℃孵育器中培养。在转染之前，将培养基更换为90μl含有2％的FBS的Opti-MEM I减血清培养基(LifeTechnologies目录号31985-070)。然后，将0.2μl的Lipofectamine RNAiMax(LifeTechnologies目录号13778-100)与4.8μl的Opti-MEM I于室温混合5分钟。接下来，将1μl的siRNA与4μl的Opti-MEM I混合且与LF2000溶液组合，轻轻混合，无需振荡(votrex)。于室温反应5分钟之后，将混合物于室温进一步孵育10分钟以形成RNA-RNAiMax复合物。另外，向每个孔中添加10μl的RNA-RNAiMax复合物，且手动轻微振荡培养板。将细胞在含有5％CO2(于空气中)的湿润气氛的37℃孵育器中培育2小时。将培养基更换为新鲜的含有2％的FBS的Opti-MEM I减血清培养基。在转染之后24小时，使用冰冷PBS将细胞洗涤一次。使用50μl的Cell-to-Ct裂解缓冲液(Life Technologies目录号4391851C)于室温将细胞裂解5-30分钟。添加5μl终止溶液，且将其于室温孵育2分钟。立即使用TAQMAN的RT-qPCR测量mRNA水平。也可在-80℃冷冻样品，稍后进行分析。
血清稳定性的示例性方案
将0.2mg/ml siRNA与10％人血清一同于37℃孵育。在特定时间点(0、5、15和30分钟)，用200μl提取溶剂(氯仿：苯酚：异戊醇＝24:25:1)等份地提取200μl样品。振荡样品，并以13,000rpm于室温离心10分钟，然后转移上层溶液并用0.45μm过滤器过滤。将滤液转移至300μl的HPLC注射瓶中。对于LCMS而言，流动相为MPA：100mM HFIP+7mM TEA水溶液，MPB：50％甲醇+50％乙腈。柱：Waters Acquity OST 2.1×50mm，1.7μm。
实施例
实施例1：
发现本发明的靶向GST-π的siRNA在体外具有基因沉默活性。GST-π siRNA基因敲低的剂量依赖性活性表现出低于约250皮摩尔(pM)的IC50，且IC50低至1pM。
在A549细胞系中实施体外转染以测定siRNA敲低效能。如表13中所示，对于表1的siRNA观察到GST-π mRNA的剂量依赖性敲低。
表13：GST-π mRNA在A549细胞系中的剂量依赖性敲低
如表13中所示，表1的GST-π siRNA的活性在17-235pM范围内，这适用于许多用途，包括作为用于体内的药剂。
实施例2：
本发明的GST-π siRNA的结构(其含有位于siRNA反义链的种子区中的脱氧核苷酸)在体外发挥出人意料且有利地增强的基因敲低活性。
在A549细胞系中实施体外转染以测定基于BU2’(序列号131和序列号157)结构的GST-π siRNA的敲低效能。对于基于如表14中所示BU2’结构的GST-π siRNA，观察到GST-πmRNA的剂量依赖性敲低。
表14：基于BU2’结构的GST-π siRNA在A549细胞系中针对GST-π
mRNA的剂量依赖
性敲低
如表14中所示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的GST-πsiRNA相比，基于BU2’结构(其在反义链的种子区中含有三个脱氧核苷酸)的GST-π siRNA的活性令人惊讶且出人意料地增强了至6倍。
这些数据显示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，具有在反义链种子区中的第3、5和7为、或第4、6和8位含有三个脱氧核苷酸的结构的GST-π siRNA发挥令人惊讶地增强的基因敲低活性。
如表14中所示，针对在反义链的种子区中含有三个脱氧核苷酸的GST-π siRNA所显示的活性在5pM至8pM的范围内，其格外适用于许多用途，包括作为用于体内的药剂。
实施例3：
在siRNA反义链的种子区中含有脱氧核苷酸的本发明的GST-πsiRNA结构在体外发挥出人意料且有利地增强的基因敲低活性。
在A549细胞系中实施体外转染以测定基于A9’结构(序列号183和序列号195)的GST-π siRNA的敲低效能。对于基于表15中所示A9’结构的GST-π siRNA，观察到GST-π mRNA的剂量依赖性敲低。
表15：基于A9’结构的GST-π siRNA在A549细胞系中针对GST-π
mRNA的剂量依赖性
敲低
如表15中所示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，基于A9’结构(其在反义链的种子区中具有三至六个脱氧核苷酸)的GST-π siRNA的活性令人惊讶地增强至24倍。
这些数据显示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，具有在位于反义链种子区中的第4、6和8位、或第1、3、5和7位、或第3-8位、或第5-8位、或第3、5和7位含有三至六个脱氧核苷酸的结构的GST-π siRNA发挥出人意料地增强的基因敲低活性。
如表15中所示，在反义链的种子区中含有三至六个脱氧核苷酸的GST-π siRNA所显示的活性在1pM至15pM的范围内，其格外适用于许多用途，包括作为用于体内的药剂。
实施例4：
在siRNA反义链的种子区中含有脱氧核苷酸的GST-π siRNA结构在体外发挥出人意料且有利地增强的基因敲低活性。
在A549细胞系中实施体外转染以测定基于B13’结构(序列号207和序列号222)的GST-π siRNA的敲低效能。如表16中所示，对于基于B13’结构的GST-π siRNA，观察到GST-πmRNA的剂量依赖性敲低。
表16：基于B13’结构的GST-π siRNA在A549细胞系中针对GST-π
mRNA的剂量依赖
性敲低
如表16中所示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，基于B13’结构(其在反义链的种子区中具有三个脱氧核苷酸)的GST-π siRNA的活性出人意料地增强。
这些数据显示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，在反义链种子区中第4、6和8位含有三个脱氧核苷酸的GST-π siRNA结构发挥出人意料地增强的基因敲低活性。
如表16中所示，在反义链的种子区中含有三个脱氧核苷酸的GST-π siRNA所显示的活性在皮摩尔范围内(11pM)，其格外适用于许多用途，包括作为用于体内的药剂。
实施例5：
在siRNA反义链的种子区含有脱氧核苷酸的GST-π siRNA结构在体外发挥出人意料且有利地增强的基因敲低活性。
在A549细胞系中实施体外转染以测定基于B4’结构(序列号261和序列号273)的GST-π siRNA的敲低效能。如表17中所示，对于基于B4’结构的GST-π siRNA，观察到GST-πmRNA的剂量依赖性敲低。
表17：基于B4’结构的GST-π siRNA在A549细胞系中针对GST-π mRNA的剂量依赖性
敲低
如表17中所示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的GST-πsiRNA相比，基于B4’结构(其在反义链的种子区中含有六个脱氧核苷酸)的GST-π siRNA的活性出人意料地增强超过两倍。
这些数据显示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，在反义链种子区中第3-8位含有六个脱氧核苷酸的GST-πsiRNA结构发挥令人惊讶地增强的基因敲低活性。
如表17中所示，在反义链的种子区中含有六个脱氧核苷酸的GST-π siRNA所显示的活性在皮摩尔范围内(113pM)，其格外适用于许多用途，包括作为用于体内的药剂。
实施例6：
在siRNA反义链的种子区中含有脱氧核苷酸的GST-π siRNA结构在体外发挥出人意料且有利地增强的基因敲低活性。
在A549细胞系中实施体外转染以测定基于B2’结构(序列号237和序列号249)的GST-π siRNA的敲低效能。如表18中所示，对于基于B2’结构的GST-π siRNA，观察到GST-πmRNA的剂量依赖性敲低。
表18：基于B2’结构的GST-π siRNA在A549细胞系中针对GST-π mRNA的剂量依赖性
敲低
如表18中所示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，基于B2’结构(其在反义链的种子区中含有三至四个脱氧核苷酸)的GST-π siRNA的活性令人惊讶地增强至4倍。
这些数据显示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，在反义链种子区中第5-8位、第1、3、5和7位或第3、5和7位含有三至四个脱氧核苷酸的GST-π siRNA结构发挥出人意料地增强的基因敲低活性。
如表18中所示，在反义链的种子区中含有三至四个脱氧核苷酸的GST-π siRNA所显示的活性在30-100pM的范围内，其格外适用于许多用途，包括作为用于体内的药剂。
实施例7：
含有一个或多个2’-脱氧-2’-氟代核苷酸的GST-π siRNA结构在体外发挥出人意料地增强的基因敲低活性。
在A549细胞系中实施体外转染以测定基于BU2’结构(序列号131和序列号157)的GST-π siRNA的敲低效能。如表19中所示，对于基于BU2’结构的GST-π siRNA，观察到GST-πmRNA的剂量依赖性敲低。
表19：基于BU2’结构的GST-π siRNA在A549细胞系中针对GST-π mRNA的剂量依赖
性敲低
如表19中所示，与不含2’-F脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，基于BU2’结构(其含有一个或多个2’-F脱氧核苷酸)的GST-π siRNA的活性令人惊讶地增强至10倍。
这些数据显示，与不含2’-F脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，具有含有一个或多个2’-F脱氧核苷酸的结构的GST-π siRNA发挥出人意料地增强的基因敲低活性。
如表19中所示，含有一个或多个2’-F脱氧核苷酸的GST-π siRNA的活性在3pM至13pM的范围内，其格外适用于许多用途，包括作为用于体内的药剂。
实施例8：
含有一个或多个2’-脱氧-2’-氟代核苷酸的GST-π siRNA结构在体外发挥出人意料地增强的基因敲低活性。
在A549细胞系中实施体外转染以测定基于B13’结构(序列号207和序列号222)的GST-π siRNA的敲低效能。如表20中所示，对于基于B13’结构的GST-π siRNA，观察到GST-πmRNA的剂量依赖性敲低。
表20：基于B13’结构的GST-π siRNA在A549细胞系中针对GST-π mRNA的剂量依赖
性敲低
如表20中所示，与不含2’-F脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，基于B13’结构(其含有三个位于非悬挂部位的2’-F脱氧核苷酸)的GST-π siRNA的活性令人惊讶地增强约3倍。
这些数据显示，与不含2’-F脱氧核苷酸的GST-π siRNA相比，具有含有一个或多个2’-F脱氧核苷酸的结构的GST-π siRNA发挥出人意料地增强的基因敲低活性。
如表20中所示，含有一个或多个2’-F脱氧核苷酸的GST-π siRNA的活性在皮摩尔的范围内(6pM)，其格外适用于许多用途，包括作为用于体内的药剂。
实施例9：
原位A549肺癌小鼠模型。本发明的GST-π siRNA可在体内使原位肺癌肿瘤显著缩小。在该实施例中，在以脂质体制剂形式给予无胸腺裸小鼠的原位肺癌肿瘤时，GST-πsiRNA在体内发挥基因敲低功效。
一般而言，原位肿瘤模型可表现出药物效能、功效以及改善的预估性能的直观临床意义。在原位肿瘤模型中，将肿瘤细胞直接移植至与细胞来源种类相同的器官。
通过比较在剖检时针对治疗组和介质对照组所测量的最终原发性肿瘤重量来评估siRNA制剂针对人类肺癌A549的抗肿瘤效能。
图1显示基于BU2结构(序列号61和序列号126)的GST-πsiRNA的体内原位肺癌肿瘤抑制。利用的原位A549肺癌小鼠模型被给予了相对较低剂量的靶向GST-π的siRNA(2mg/kg)。
在该为期6周的研究中，GST-π siRNA显示显著和出人意料地有利的肺肿瘤抑制效能。如图1中所示，在43天之后，GST-π siRNA显示明显有利的肿瘤抑制效能，与对照相比，最终肿瘤平均重量显著减轻了2.8倍。
对于该研究而言，使用5-6周龄雄性NCr nu/nu小鼠。在实验期间，将实验动物饲育在HEPA过滤环境中。将siRNA制剂在使用之前储存于4℃，且在注射至小鼠中10分钟之前使其升温至室温。
对于该A549人类肺癌原位模型而言，在手术原位移植(SOI)当天，自接受A549肿瘤异种移植的动物的皮下位点采集肿瘤原料(stock tumor)并置于RPMI-1640培养基中。摘除坏死组织，将活组织切割成1.5-2mm3的切片。通过异氟烷吸入将动物麻醉，使用碘和酒精将手术区域灭菌。使用一对手术剪在小鼠的左胸壁切开大约1.5cm长的横向切口。在第三肋骨与第四肋骨之间切开肋间切口，暴露左肺。使用8-0手术缝合线(尼龙)将一片A549肿瘤移植至肺表面。使用6-0手术缝合线(丝)缝合胸壁。使用具有25G X 11/2针的3cc注射器，通过胸腔内穿刺使肺重新膨胀以驱除胸腔中的剩余空气。使用6-0手术缝合线(丝)缝合胸壁。上述操作的所有步骤在HEPA过滤的层流罩下用7×放大倍数的显微镜实施。
在肿瘤移植三天后，将荷瘤模型小鼠随机分成10只小鼠/组的组。对于处理组(group of interest)，在肿瘤移植之后三天开始处理10只小鼠。
对于处理组而言，制剂是脂质体组合物(可电离脂质：胆固醇：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K：DSPE-PEG-2K)。脂质体包封GST-π siRNA。
对于研究终点，在开始处理42天之后将实验小鼠处死。切下原发性肿瘤，在电子天平上称重以用于后续分析。
为估测化合物毒性，在整个实验期间，将处理组和对照组的小鼠的平均体重维持在正常范围内。在小鼠中未观察到其他毒性症状。
实施例10：
本发明的GST-π siRNA在体内使癌异种移植肿瘤显著减小。在以脂质体制剂形式给予癌异种移植肿瘤时，GST-π siRNA在体内发挥基因敲低功效。
图2显示GST-π siRNA(序列号156和序列号182)的肿瘤抑制效能。利用的癌异种移植模型被给予了相对较低剂量的靶向GST-π的siRNA(0.75mg/kg)。
在给予之后数天内，GST-π siRNA显示显著和格外有利的肿瘤抑制效能。在36天之后，GST-π siRNA显示明显有利的肿瘤抑制效能，与对照相比，肿瘤体积缩小了2倍。
如图3中所示，GST-π siRNA在终点日显示显著和格外有利的肿瘤抑制效能。具体而言，肿瘤重量减轻了超过2倍。
GST-π siRNA以包含组合物(可电离脂质：胆固醇：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K)(25:30:20:20:5)的脂质体制剂的形式注射给予了两次(第1天和第15天)。
对于癌异种移植模型而言，自ATCC获得了A549细胞系。将细胞维持于添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml链霉素(streptomycin)的培养基中。在接种之前48小时稀释细胞，从而使细胞在收集时处于对数生长期。使用胰蛋白酶-EDTA轻度消化细胞后，从组织培养液中收集细胞。在台盼蓝存在下，用血细胞计数器计数并测定活细胞的数量(仅对活细胞进行计数)。将细胞在不含血清的培养基中重新悬浮至5×107/ml的浓度。然后，将细胞悬浮液与冰上融化的BD matrigel以1:1比率充分混合以用于注射。
小鼠是经过免疫妥协的6-8周龄查尔斯河实验室无胸腺裸(nu/nu)雌性小鼠，每组7-8只小鼠。
对于肿瘤模型制备而言，使用25G针和注射器在每只小鼠的右侧腹经皮下接种0.1ml含有2.5×106个A549细胞的接种液，每只小鼠接种一次。接种时不对小鼠进行麻醉。
对于肿瘤体积测量和随机化而言，肿瘤大小的测量结果取至0.1mm。使用下式来计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长度×宽度2/2。在培养的肿瘤达到大约120-175mm3、平均肿瘤体积为约150mm3时，将小鼠分配至各个介质对照组和处理组中，结果，处理组中的平均肿瘤体积为介质对照组中的平均肿瘤体积的10％以内，符合理想地，肿瘤体积的CV％小于25％。同一天，根据给药方案给予试验制剂和对照介质。在第1周监测三次肿瘤体积，在其余周(包括研究终止当天)每周监测两次。
对于给予剂量而言，在给药当天，自-80℃冰箱取出试验制剂，在冰上解冻。在装入注射器中之前，将装有制剂的瓶手动倒转数次。所有试验制剂均以0.75mg/kg通过静脉内给药，每2周1次(q2w X2)，10ml/kg。
对于体重而言，将小鼠称重，精确至0.1g。在第一次给药后7天内，每天监测并记录体重。对于其余周(包括研究终止当天)，每周监测并记录体重两次。
对于肿瘤收集而言，在第一次给药后28天，测量肿瘤体积，且切除肿瘤以用于重量测量，且将其储存用于PD生物标记物研究。记录肿瘤重量。
实施例11：
本发明的GST-π siRNA在体外显示由癌细胞的细胞凋亡导致的上升的癌细胞死亡。GST-π siRNA发挥了GST-π敲低，这使得PUMA(与细胞活力的损失有关的细胞凋亡生物标记物)上调。
GST-π siRNA序列号156和序列号182(其在种子区中含有脱氧核苷酸、2’-F代脱氧核苷酸和2’-OMe取代核糖核苷酸的组合)出人意料地使癌细胞的细胞凋亡上升。
如图4中所示，对GST-π siRNA序列号156和序列号182的PUMA表达水平进行了别测定。图4中，PUMA的表达自转染GST-π siRNA之后2-4天大幅度增加。
这些数据显示，在种子区中含有脱氧核苷酸、2’-F代脱氧核苷酸和2’-OMe取代核糖核苷酸的组合的GST-π siRNA结构出人意料地使癌细胞的细胞凋亡上升。
PUMA生物标记物的方案如下。在转染之前一天，使用100μl含有10％的FBS的DMEM(HyClone目录号SH30243.01)将细胞以2×103个细胞/孔注入96孔板中，在含有5％CO2(于空气中)湿润气氛的37℃孵育器中培养。第二天，在转染之前，将培养基更换为90μl含有2％FBS的Opti-MEM I减血清培养基(Life Technologies目录号31985-070)。然后，将0.2μl的Lipofectamine RNAiMax(Life Technologies目录号13778-100)与4.8μl的Opti-MEM I于室温混合5分钟。将1μl的GST-π siRNA(储备液浓度为1μM)与4μl的Opti-MEM I混合，加入RNAiMAX溶液，轻轻混合。将混合物于室温孵育10分钟以形成RNA-RNAiMAX复合物。向每孔中添加10μl的RNA-RNAiMAX复合物，使siRNA最终浓度为10nM。将细胞孵育2小时，将培养基更换为新鲜的含有2％的FBS的Opti-MEM I减血清培养基。在转染后1、2、3、4和6天，使用冰冷PBS将细胞洗涤一次，然后使用50μl Cell-to-Ct裂解缓冲液(Life Technologies目录号4391851C)于室温裂解5-30分钟。添加5μl终止溶液，于室温培育2分钟。通过使用TAQMAN的qPCR测定PUMA(BBC3，目录号Hs00248075,Life Technologies)mRNA水平。
实施例12：
本发明的GST-π siRNA可在体内使癌异种移植肿瘤显著缩小。在以脂质体制剂形式给予至癌异种移植肿瘤时，GST-π siRNA可在体内发挥基因敲低功效。
图5显示GST-π siRNA(序列号61和序列号126)的肿瘤抑制效能。在体内观察到靶向GST-π的siRNA针对GST-π mRNA的剂量依赖性敲低。利用的癌异种移植模型被给予了相对较低剂量的靶向GST-π的siRNA(0.75mg/kg)。
在给予之后数天内，GST-π siRNA显示显著和格外有利的肿瘤抑制效能。如图5中所示，在以脂质制剂形式注射4天之后，使用GST-π siRNA进行的处理使得GST-π mRNA表达显著降低。以更高的剂量(4mg/kg注射之后24小时，检测到显著降低约40％。
以包含组合物(可电离脂质：胆固醇：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K)(25:30:20:20:5)的脂质体制剂的形式单次注射给予GST-π siRNA，剂量为10mL/kg。
对于癌异种移植模型而言，自ATCC获得了A549细胞系。将细胞维持于添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640中。在接种之前48小时稀释细胞，从而细胞在收集时处于对数生长期。使用胰蛋白酶-EDTA轻度消化细胞后，从组织培养液中收集细胞。在台盼蓝的存在下，用血细胞计数器计数并测定活细胞的数量(仅计数活细胞)。将细胞在不含血清的RPMI培养基中重新悬浮至4×107/ml的浓度。然后，将细胞悬浮液与冰上融化的BD matrigel以1:1比率充分混合以用于注射。
小鼠是经过免疫妥协的6-8周龄查尔斯河实验室雌性无胸腺裸(nu/nu)小鼠，每组3只小鼠。
对于肿瘤模型制备而言，使用25G针和注射器在每只小鼠的右侧腹经皮下接种0.1ml含有2×106个A549细胞的接种液，每只小鼠接种一次。接种时不对小鼠进行麻醉。
对于肿瘤体积测量和随机化而言，肿瘤大小的测量结果取至0.1mm。使用下式来计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长度×宽度2/2。每周两次监测肿瘤体积。在培养的肿瘤达到大约350-600mm3时，将小鼠按照各时间点分组。同一天，根据给药方案给予试验制剂。
对于给予剂量而言，在培养的肿瘤达到大约350-600mm3当天，自4℃冰箱取出试验制剂。在装入注射器中之前，将装有制剂的瓶手动倒转数次以制备均质溶液。
对于体重而言，将小鼠称重，精确至0.1g。对于其余周(包含研究终止当天)，每周监测并记录体重两次。
对于肿瘤收集而言，在给药后0、24、48、72、96(任选)和168小时通过过量CO2将动物处死，切除肿瘤。首先称取肿瘤的湿重，然后分离成三个部分以用于分析KD、分布和生物标记物。将样品在液氮中快速冷冻且储存于-80℃直至准备处理为止。
实施例13：
本发明的GST-π siRNA在体内抑制胰腺癌异种移植肿瘤。在以脂质体制剂形式给予胰腺癌异种移植肿瘤时，GST-π siRNA发挥了体内基因敲低功效。
在该异种移植物模型中，在每只小鼠的右侧腹经皮下接种0.1ml含有2.5×106个PANC-1细胞的接种液。使用6至8周的查尔斯河雌性无胸腺裸小鼠。肿瘤大小的测量结果精确至0.1mm。在培养的肿瘤达到大约150-250mm3(平均肿瘤体积约为200mm3)时，将小鼠分配至各个介质对照组和处理组中，结果，处理组中的平均肿瘤体积在介质对照组中的平均肿瘤体积的10％以内。同一天，根据给药方案给予试验制剂和对照介质。在第1周监测三次肿瘤体积，在其余周(包含研究终止当天)每周监测两次。
图6显示GST-π siRNA(序列号61和序列号126)的肿瘤抑制效能。如图6中所示，使用剂量范围为0.375mg/kg至3mg/kg的靶向GST-π的siRNA获得剂量响应。GST-π siRNA在给予之后数天内显示显著和出人意料地有利的肿瘤抑制效能。因此，GST-π siRNA在终点时显示显著和出人意料地有利的肿瘤抑制效能。
以包含组合物(可电离脂质：胆固醇：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K)(25:30:20:20:5)的脂质体制剂的形式给予GST-π siRNA。
实施例14：
本发明的GST-π siRNA表现出增强的血清稳定性。
图7显示在人血清中的孵育和在各时间点通过HPLS/LCMS对残留siRNA进行的检测。如图7中所示，GST-π siRNA(序列号61和序列号126)的有义链(图7，上图)和反义链(图7，下图)在血清中的半衰期(t1/2)均约为100分钟。
实施例15：
本发明的GST-π siRNA在血浆中表现出增强的制剂稳定性。
图8显示制剂在血浆中的孵育和在各时间点对残留siRNA的检测。如图8中所示，GST-π siRNA(序列号61和序列号126)制剂在血浆中的半衰期(t1/2)明显长于100小时。
以包含组合物(电离脂质：胆固醇：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K)(25:30:20:20:5)的脂质体制剂来制备GST-π siRNA。脂质体纳米颗粒的z-平均大小为40.0nm，且包封有91％的siRNA。
将制剂在含有50％人血清的PBS中中孵育40分钟、1.5小时、3小时、24小时和96小时。通过基于ELISA的分析来测定GST-π siRNA的量。
实施例16：
本发明的GST-π siRNA经由随从链表使脱靶效应降低。
对于GST-π siRNA(序列号156和序列号182)而言，图9显示，与未表现出效应的随机序列对照相比，引导链的体外敲低大致呈指数形式。该siRNA的IC50经测量为5pM。图10显示同一GST-π siRNA的随从链的体外敲低。如图10中所示，GST-π siRNA的随从链脱靶敲低大大降低超过100倍。
对于GST-π siRNA(序列号187和199)、(序列号189和序列号201)和(序列号190和序列号202)而言，图11显示，引导链的体外敲低大致呈指数形式。这些siRNA的IC50经测量分别为6pM、7pM和5pM。如图12中所示，这些GST-π siRNA的随从链的体外敲低显著降低至少10倍。上述所有GST-π siRNA在双链体区的种子区中含有脱氧核苷酸，且在双链体区中无其他修饰。
对于GST-π siRNA(序列号217和序列号232)，图13显示，该高活性GST-π siRNA的引导链的体外敲低大致呈指数形式。该siRNA的IC50经测量为11pM。如图14中所示，该GST-πsiRNA的随从链的体外敲低显著降低超过100倍。该GST-π siRNA在双链体区的种子区中含有脱氧核苷酸，且在双链体区中无其他修饰。
使用编码海肾(Renilla)萤光素酶基因的表达报告基因质粒psiCHECK-2(Dual-Luciferase Reporter Assay System，Promega，目录号：E1960)测定脱靶效应。siRNA浓度通常为50pM。方案：第1天，以5-7.5×103/100ul/孔接种HeLa细胞。第2天，对约80％汇合(confluence)的细胞进行共转染。第3天，收集细胞用于萤光素酶活性测定。使用Promega萤光素酶分析系统(E4550)根据制造商提供的方案测定萤光素酶活性。
PsiCHECK-2载体能够对与海肾萤光素酶的报告基因融合的靶基因的表达变化进行监测。将siRNA构建体克隆至多个克隆区中，将载体与siRNA共转染至HeLa细胞中。如果特定的siRNA结合至靶mRNA且引发RNAi进程，则融合的海肾萤光素酶:构建体mRNA将被切割并分解，从而使海肾萤光素酶信号减弱。
例如，具有BU2’结构的siRNA的质粒插入序列(insert)如下：
PsiCHECK-2(F)质粒插入序列：
序列号451
PsiCHECK-2(R)质粒插入序列：
序列号452
实施例17：
本发明的GST-π siRNA表现出有利性降低的miRNA样脱靶效应，这种效应是种子区依赖性的非预期脱靶基因沉默。
对于GST-π siRNA(序列号156和序列号182)、(序列号187和序列号199)、(序列号189和序列号201)、(序列号190和序列号202)和(序列号217和序列号232)而言，发现模拟miRNA的脱靶活性基本上可忽略不计。这些GST-π siRNA的种子区依赖性的非预期脱靶基因沉默小于引导链的靶向活性至少10倍至100倍。
为测试miRNA相关的脱靶效应，将一至四个种子匹配靶序列(其与整个种子区域即反义链的5’端第1-8位互补、但不与剩余非种子区域即第9-21位互补)的重复引入与萤光素酶mRNA的3’UTR对应的区域，由此测定种子区依赖性的非预期脱靶效应的效率。使用质粒插入序列对种子区中完全匹配且在非种子区中错配(凸起)的miRNA进行模拟。
例如，具有BU2’结构的siRNA的质粒插入序列如下：
PsiCHECK-2(Fmi1)质粒插入序列：
序列号453
PsiCHECK-2(Fmi2)质粒插入序列：
序列号454
PsiCHECK-2(Fmi3)质粒插入序列：
序列号455
PsiCHECK-2(Fmi4)质粒插入序列：
序列号456
本文所述的实施方式不是限制性的，并且本领域普通技术人员可容易地认识到，可以在不进行过度实验的情况下测试本文描述的修饰的特定组合，以鉴定具有改进的RNAi活性的核酸分子。
实施例18：
发现本发明的靶向p21的siRNA可在体外具有基因沉默活性。发现p21siRNA于基因敲低的剂量依赖性活性表现出低于约3皮摩尔(pM)的IC50，且IC50低至1pM。
在A549细胞系中实施体外转染以测定siRNA敲低效能。如表21中所示，对于表7的siRNA观察到p21 mRNA的剂量依赖性敲低。
表21：p21 mRNA在A549细胞系中的剂量依赖性敲低
| P21 siRNA结构 | IC50(pM) |
| 1735(序列号296和序列号324) | 0.3 |
| 2042(序列号312和序列号340) | 10 |
如表21中所示，表7的p21siRNA的活性在0.3-10pM的范围内，其适用于许多用途，包括作为用于体内的药剂。
实施例19：
本发明的GST-π siRNA的结构(其含有位于siRNA反义链的种子区中的脱氧核苷酸)在体外发挥出人意料且有利地增强的基因敲低活性。
在A549细胞系中实施体外转染以测定基于1735’结构(序列号341和序列号355)的p21siRNA的敲低效能。对于基于如表22中所示1735’结构的p21siRNA，观察到p21mRNA的剂量依赖性敲低。
表22：基于1735’结构的p21 siRNA在A549细胞系中针对p21 mRNA的剂量依赖性敲
低
如表22中所示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的p21 siRNA相比，基于1735’结构(其在反义链的种子区中含有三个脱氧核苷酸)的p21siRNA的活性令人惊讶且出人意料地增强多达300倍。
这些数据显示，与在双链体区中不含脱氧核苷酸的p21siRNA相比，在反义链种子区中含有脱氧核苷酸的p21siRNA结构发挥了令人惊讶地增强的基因敲低活性。
如表22中所示，在反义链的种子区中含有三个脱氧核苷酸的p21siRNA所显示的活性在0.001pM至0.1pM的范围内，其格外适用于许多用途，包括作为用于体内的药剂。
实施例20：
本发明的p21siRNA可在体内使癌异种移植肿瘤显著缩小。在以脂质体制剂形式给予至癌异种移植肿瘤时，p21siRNA可在体内发挥基因敲低功效。
图15显示p21siRNA(序列号341和序列号355，其中N＝U)的肿瘤抑制效能。利用的癌异种移植模型被给予了相对较低剂量的靶向p21的siRNA(0.75mg/kg)。
在给予之后数天内，p21siRNA显示显著和格外有利的肿瘤抑制效能。在30天之后，p21siRNA显示明显有利的肿瘤抑制效能，与对照相比，肿瘤体积缩小超过2倍。
以包含组合物(可电离脂质：胆固醇：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K)(25:30:20:20:5)的脂质体制剂形式来给予p21 siRNA，以0.75mg/kg的剂量、10mL/kg注射4次(第1天、第8天、第15天和第22天)。
对于癌异种移植模型而言，自ATCC获得了A549细胞系。将细胞维持于添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中。在接种之前48小时稀释细胞，以使得细胞在收集时处于对数生长期。使用胰蛋白酶-EDTA将轻度消化细胞后，从组织培养液中收集细胞。在台盼蓝存在下，用血细胞计数器计数并测定活细胞的数量(仅对活细胞进行计数)。将细胞在不含血清的培养基中重新悬浮至5×107/ml的浓度。然后，将细胞悬浮液与冰上融化的BD matrigel以1:1比率充分混合以用于注射。
小鼠是经过免疫妥协的6-8周龄查尔斯河实验室雌性无胸腺裸(nu/nu)小鼠，每组7-8只小鼠。
对于肿瘤模型制备而言，使用25G针和注射器在每只小鼠的右侧腹经皮下接种0.1ml含有2.5×106个A549细胞的接种液，每只小鼠接种一次。接种时不对小鼠进行麻醉。
对于肿瘤体积测量和随机化而言，肿瘤大小测量结果取至0.1mm。使用下式来计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长度×宽度2/2。在培养的肿瘤达到大约120-175mm3、平均肿瘤体积约为150mm3时，将小鼠分配至各个介质对照组和处理组中，结果，处理组中的平均肿瘤体积为介质对照组中的平均肿瘤体积的10％以内，符合理想地，肿瘤体积的CV％小于25％。同一天，根据给药方案给予试验制剂和对照介质。在第1周监测三次肿瘤体积，在其余周(包含研究终止当天)每周监测两次。
对于给予剂量而言，在给药当天，自-80℃冰箱取出试验制剂，在冰上解冻。在装入注射器中之前，将装有制剂的瓶手动倒转数次。所有试验制剂均以0.75mg/kg通过静脉内途径给药。
对于体重而言，将小鼠称重，精确至0.1g。在第一次给药后7天内，每天监测体重并进行记录。对于其余周(包含研究终止当天)，每周监测并记录体重两次。
对于肿瘤收集而言，在第一次给药后28天测量肿瘤体积，且切除肿瘤以用于重量测量，且将其储存用于PD生物标记物研究。记录肿瘤重量。
本文所述的实施方式不是限制性的，且本领域普通技术人员可容易理解，可以在不进行过度实验的情况下测试本文描述的修饰的特定组合，以鉴定具有改进的RNAi活性的核酸分子。
实施例21：
制备本发明的靶向MCL1的siRNA，并发现其在体外具有基因沉默活性。发现MCL1siRNA的基因敲低的剂量依赖性活性表现出低于约100皮摩尔(pM)的IC50。
在A549细胞系中实施体外转染以测定siRNA敲低效能。对于表11的siRNA观察到MCL1 mRNA的剂量依赖性敲低。
实施例22：
制备本发明的靶向ARAF的siRNA，并发现其在体外具有基因沉默活性。发现ARAFsiRNA的基因敲低的剂量依赖性活性表现出低于约100皮摩尔(pM)的IC50。
在A549细胞系中实施体外转染以测定siRNA敲低效能。对于表12的siRNA观察到ARAF mRNA的剂量依赖性敲低。
出于所有目的，本文特别提及的所有出版物、专利和文献的全部内容通过引用并入本文中。
应理解，本发明并不限于所述的特定方法、方案、材料和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而并不意欲限制本发明范围。本领域普通技术人员而言显而易见的是，在不背离本说明书的范围和精神的情况下，可对本文所公开的描述作出各种替换和修饰，并且那些实施方式落在本说明书和所附权利要求书的范围内。
必须指出，除非上下文另有明确说明，本文中及随附的权利要求书中所使用的单数形式包括复数指称。此外，术语“一个”或“一种”、“一个或多个(一种或多种)”和“至少一个/种”可在本文中互换使用。还应注意，术语“包含(comprises、comprising)”、“含有”、“包括”和“具有”可互换使用，并且应被广义且无限制地解释。
除非本文另外指出，否则本文所列举的数值范围仅意欲作为个别提及该范围内的每一单独值的速记法，且每一单独值如同在本文中个别列举一般并入本说明书中。对于马库什组而言，本领域普通技术人员应认识到，该阐述包括个别成员以及马库什组的成员的亚组。
无需赘述，本领域普通技术人员可基于上述描述最大程度地利用本发明。因此，所附具体实施方式仅应视为说明性的，且无论如何不应视为以任何方式限制本发明公开的其余部分。
本说明书中所公开的所有特征可以以任何组合而联用。本说明书中所公开的每个特征可由服务于相同、等同或类似目的的替代特征来代替。
Claims (32)
1.一种核酸分子，其中：
a)所述分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；
b)所述分子的每条链的长度为15至30个核苷酸；
c)所述反义链中的15至30个核苷酸的连续区域与mRNA的序列互补；
d)所述有义链的至少一部分与所述反义链的至少一部分互补，且所述分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区，其中，所述双链体区中所述反义链的自5’端起第3至8位中的一个或多个核苷酸是脱氧核苷酸。
2.权利要求1的分子，其中，所述反义链在多个位置具有脱氧核苷酸，所述多个位置为以下中的一者：
反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处；
反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处；
反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处；
反义链的自5’端起第3-8位中的每一处；和
反义链的自5’端起第5-8位中的每一处。
3.权利要求1的分子，其中，所述分子是具有调节mRNA表达的活性的RNAi分子。
4.权利要求1的分子，其中，所述分子具有抑制选自蛋白质编码基因、原癌基因、致癌基因、肿瘤抑制基因和细胞信号传导基因中的基因的表达的活性。
5.权利要求1的分子，其中，所述mRNA是人类mRNA。
6.权利要求1的分子，其中，所述mRNA是表达下述人类蛋白质家族的任意成员或亚成员的人类mRNA，所述人类蛋白质家族包括：SRY、β-球蛋白、RAS、胞质GST、线粒体GST、MAPEGGST、GST-π、p16、p21、p53、血清白蛋白、VII型胶原、补体C3、载脂蛋白B、苯丙氨酸羟化酶、VIII因子、亨廷顿蛋白、RB1视网膜母细胞瘤蛋白、CFTR、肌联蛋白、肌营养相关蛋白和抗肌萎缩蛋白。
7.权利要求1的分子，其中，所述分子对所述mRNA进行敲低的IC50小于100pM。
8.权利要求1的分子，其中，所述分子对所述mRNA进行敲低的IC50小于50pM。
9.权利要求1的分子，其中，所述分子对所述mRNA进行敲低的IC50小于10pM。
10.权利要求1的分子，其中，单次给予所述分子在体内将所述mRNA抑制至少25％。
11.权利要求1的分子，其中，所述分子的每条链的长度为18至22个核苷酸。
12.权利要求1的分子，其中，所述双链体区的长度为19个核苷酸。
13.权利要求1的分子，其中，所述多核苷酸有义链和所述多核苷酸反义链以单链形式连接，且形成一端以环连接的双链体区。
14.权利要求1的分子，其中，所述分子具有平末端。
15.权利要求1的分子，其中，所述分子具有一个或多个3’悬挂。
16.权利要求1的分子，其中，所述双链体区中的一个或多个核苷酸经修饰或经化学修饰。
17.权利要求16的分子，其中所述经修饰或经化学修饰的核苷酸是2’-O-烷基取代的核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、锁核苷酸或它们的任意组合。
18.权利要求1的分子，其中，所述反义链的碱基序列为序列号157，并且，所述有义链的碱基序列为序列号131。
19.权利要求1的分子，其中，所述反义链为序列号182，并且，所述有义链为序列号156。
20.权利要求1的分子，其中，所述反义链的碱基序列为序列号195，并且，所述有义链的碱基序列为序列号183。
21.权利要求1的分子，其中，所述反义链为序列号205，并且，所述有义链为序列号193。
22.权利要求1的分子，其中，所述反义链为序列号357，并且，所述有义链为序列号343。
23.权利要求1的分子，其中，所述反义链为序列号356，并且，所述有义链为序列号342。
24.一种药物组合物，其包含权利要求1-23中任一项的分子、和药学上允许的担体。
25.权利要求24的药物组合物，其中，所述担体包含脂质分子或脂质体。
26.一种载体或细胞，其包含权利要求1-23中任一项的分子。
27.一种通过基因沉默来预防、治疗或减轻有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给予权利要求24的组合物。
28.权利要求27的方法，其中，所述疾病是恶性肿瘤、癌症、肉瘤或癌瘤。
29.权利要求24的组合物用于预防、改善或治疗有需要的受试者的疾病或病症的用途。
30.权利要求24的组合物，其用于医学疗法中。
31.权利要求24的组合物，其用于对人体或动物体的治疗中。
32.权利要求24的组合物在制备或制造用于预防、减轻或治疗有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途。
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