TWI651093B - 細胞凋亡誘導劑 - Google Patents
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Abstract
本發明是有關於一種GST-π及其抑制劑的新穎用途,並且是關於:一種細胞凋亡誘導劑,是用以誘導細胞凋亡的製劑,其含有抑制GST-π之藥物與抑制細胞自噬之藥物來作為活性成分;一種包含該製劑之醫藥組成物;及一種因細胞凋亡異常而伴隨發生之疾病的處置方法,其使用該製劑。
Description
本發明是有關於一種GST-π(Glutathione S-Transferase-π,穀胱甘肽-s-轉移酶-π)及其抑制劑的新穎用途、一種新穎的細胞凋亡誘導劑、一種包含該細胞凋亡誘導劑的醫藥組成物及一種因細胞凋亡異常而伴隨發生之疾病的新穎治療方法。
癌症是人類所面對的最重要且麻煩的疾病之一,為了癌症的治療,已投注了龐大的研究努力。癌症,是由於基因的突變或表基因(epigenetic)異常等,以致於細胞無限制地增殖的疾病。關於癌症中的基因異常,已經有許多報告(例如,Futreal et al.,Nat Rev Cancer. 2004;4(3):177-83等),其中的大多數,被認為是與有關細胞的增殖、分化、生存之訊息傳導有所關連。而且,由於該些基因異常,使得由正常分子所構成之細胞內的訊息傳導發生異常,此造成特定的訊息級聯反應(signal cascade)之活化或失活,最終成為引起細胞異常增殖的原因之一。初期的癌症治療,主要是著眼於抑制細胞增殖本身,但由於該治療也會抑制生理上正常增殖之細胞的增殖,所以會伴隨著脫毛、消化器官障礙、骨髓抑制等副作用。因此,為了抑制該些副作用,基於以癌症特有的基因異常、或訊息傳導之異常為目標的分子標靶藥物(molecular target drug)等新穎發想而成的癌症治療藥物,其開發正逐漸推展。
癌症所特有的基因異常,習知的有KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)的異常。KRAS是位於EGFR(epidermal growth factor receptor,表皮生長因子受體)、PDGFR(platelet-derived growth factor receptor,血小板衍生生長因子受體)等酪胺酸激酶型受體之下游的低分子量GTP結合蛋白質(又稱為低分子量G蛋白質),負責將來自這些受體的有關增殖或分化的訊息,傳遞至下游的MAPK(mitogen-activated protein kinase,絲裂原活化蛋白激酶)級聯。正常的KRAS,會藉由因配體(ligand)之結合而活化的受體之酪胺酸激酶活性,並透過Grb2(growth factor receptor binding protein-2)及SOS(son of sevenless protein)而被活化,將Raf等MAPK加以磷酸化而驅動MAPK級聯,但是變異型的KRAS,則是即便沒有來自受體的刺激也會一直活化,持續地傳達增殖訊息。一般認為是因此而發生異常的細胞增殖。
另一方面,穀胱甘肽-s-轉移酶(GST),也就是內含穀胱甘肽而作為觸媒的酵素之一,且特別是GST-π(glutathione S-transferase pi,又稱為GSTP1),其表現在各種癌細胞中均增強,而被認為有可能是對於部分抗癌劑之抗性的原因之一。實際上,已知若使針對GST-π的反義DNA或GST-π抑制劑作用於GST-π過度表現(overexpression)且顯示藥物抗性的癌細胞系,則可使藥劑抗性受到抑制(Takahashi and Niitsu,Gan To Kagaku Ryoho. 1994;21(7):945-51、Ban et al.,Cancer Res. 1996;56(15):3577-82、Nakajima et al.,J Pharmacol Exp Ther. 2003;306(3):861-9)。進而,最近的報告中也有報告指出,若使針對GST-π的siRNA作用於GST-π過度表現的雄性素非依賴型前列腺癌細胞系,則可抑制其增殖,而增強細胞凋亡(Hokaiwado et al.,Carcinogenesis. 2008;29(6):1134-8)。而且,也有報告暗示,在人類大腸癌中,KRAS的變異可能是透過AP-1的活化而誘發GST-π的過度表現(Miyanishi et al.,Gastroenterology. 2001;121(4):865-74)。
然而,關於GST-π與細胞增殖或細胞凋亡之間的關係、GST-π的分子機轉、GST-π在各種細胞內之訊息傳導中的功能等,目前幾乎仍不清楚。細胞內的訊息傳導極為複雜,一個分子會對複數個分子的作用發生影響,反之,一個分子也會受到複數個分子的影響,而且即便抑制了某個分子的作用,也常常會因其他訊息級聯受到活化,而無法獲得所期待的效果。因此,在更加優異的分子標靶藥物的開發上,必須將複雜地牽連的細胞訊息傳導機制加以闡明,但即便經過長年的研究,也只不過闡明了其中極少數的一部份,而謀求更進一步的研究努力。
本發明之目的在於提供一種GST-π或其抑制劑的新穎用途,以及一種用以在細胞中有效地誘導細胞凋亡的組成物及使用其之方法。
本發明人為了闡明GST-π的分子機轉而持續專心研究,結果發現,若阻礙GST-π的表現,則Raf-1、MEK及ERK的活化會顯著地受到阻礙,並且在藉由G蛋白耦合受體(G protein-coupled receptor)和酪胺酸激酶型受體之活化而被活化的PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)訊息級聯中也會同樣地發生訊息傳導的抑制,同時也清楚瞭解到,雖然會藉由阻礙GST-π的表現而發生細胞凋亡,但細胞自噬(autophagy,自體吞噬)會更迅速地被誘導。因而,進而持續研究,結果進而發現到,藉由在阻礙GST-π的同時也抑制細胞自噬,則能夠高效率地誘導細胞走向細胞凋亡,而完成了本發明。
亦即,本發明是關於下述。
(1)一種細胞凋亡誘導劑,是用以誘導細胞凋亡的製劑,其含有抑制GST-π之藥物與抑制細胞自噬之藥物來作為活性成分。
(2)一種細胞凋亡誘導劑,是用以在GST-π受到抑制之細胞中誘導細胞凋亡的製劑,其含有抑制細胞自噬之藥物來作為活性成分。
(3)如上述(1)或(2)所述之細胞凋亡誘導劑,其是用以在具有變異型KRAS的細胞中誘導細胞凋亡。
(4)如上述(1)~(3)中任一項所述之細胞凋亡誘導劑,其中該活性成分,是選自由下述所組成之群組:RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸(DNA/RNA chimeric polynucleotide)及表現此等的載體(vector)。
(5)一種醫藥組成物,其含有如上述(1)~(4)中任一項所述之細胞凋亡誘導劑。
(6)如上述(5)所述之醫藥組成物,其是用以治療起因於細胞之異常增殖的疾病。
(7)如上述(5)所述之醫藥組成物,其是用以治療起因於KRAS之變異的疾病。
(8)如上述(5)所述之醫藥組成物,其是用以治療癌症。
(9)一種製劑,是用以促進PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的製劑,其含有GST-π及/或其功能性突變體(functional mutant)來作為活性成分。
(10)一種製劑,是用以抑制PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的製劑,其含有抑制GST-π之藥物來作為活性成分。
(11)一種製劑,是用以抑制泛素化(ubiquitination)的製劑,其含有GST-π及/或其功能性突變體來作為活性成分。
(12)一種製劑,是用以促進泛素化的製劑,其含有抑制GST-π之藥物來作為活性成分。
(13)一種製劑,是用以抑制細胞自噬的製劑,其含有GST-π及/或其功能性突變體來作為活性成分。
(14)一種製劑,是用以促進細胞自噬的製劑,其含有抑制GST-π之藥物來作為活性成分。
本發明的細胞凋亡誘導劑,相較於習知誘導劑,由於能夠更有效地誘導細胞凋亡,所以作為醫藥組成物而言效果很高。特別是在癌症的治療中,能夠藉由使細胞凋亡而使癌細胞死亡,因此不僅可以阻止癌症的惡化,也可以期待使癌症消退的效果。而且,因為能夠以低於習知製劑的用量而發揮與以往相同的效果,所以也能夠減輕副作用。
又,藉由本發明,而使GST-π的分子機轉較為清楚,並發現GST-π或其抑制劑的新穎用途。此提供了對於病患之處置或實驗手法等的新穎選項,不僅在醫療、動物醫療上,在生物學、生化學、分子生物學等領域中也能夠期待有莫大的貢獻。
本發明是關於一種用以誘導細胞凋亡的製劑或組成物(以下又稱為「細胞凋亡誘導劑」或「細胞凋亡誘導組成物」),其中含有抑制GST-π之藥物、與抑制細胞自噬之藥物來作為活性成分。
在本說明書中使用的情形中,GST-π是指由GSTP1基因所編碼(coding)的催化穀胱甘肽結合反應(glutathione conjugation)的酵素。GST-π存在於包括人類在內的各種動物中,其序列資訊亦已為習知(例如,人類:NP_000843(NM_000852)、大鼠:NP_036709(NM_012577)、小鼠:NP_038569(NM_013541)等。編號是表示NCBI資料庫的登錄編號,括弧外為胺基酸序列,括弧內為鹼基序列的編號。)。
由於生物個體之間,有可能發生無損於蛋白質生理學功能的基因序列或胺基酸序列的變異,所以本發明中的GST-π或GSTP1基因,並不限定於具有與上述習知序列相同序列的蛋白質或核酸,而也可以包括雖然相對於該序列而具有1個或2個以上的胺基酸或鹼基相異的序列,典型而言為1個或數個,例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸或鹼基相異的序列,但與上述的習知GST-π具有相同功能之物。關於GST-π的具體功能,是如同後述。
另外,本說明書中,「在本說明書中使用的情形中」、「在本說明書中所使用的」、「在本說明書中」、「本說明書中所記載的」等語句,只要沒有特別記載,則之後的記載可適用於本說明書中所記載的全部發明。又,只要沒有另外定義,則本說明書中所使用的全部的技術用語及科學用語,是具有與發明所屬技術領域中具有通常知識者所能通常理解之用語具有相同的意思。在本說明書中所參照的全部的專利、公報及其他出版物,於本說明書中是引用其全體。
本說明書中所使用的「抑制GST-π的藥物」,並無限定,例如包含抑制GST-π之生成及/或活性的藥物、或者促進GST-π之分解及/或失活的藥物等。作為抑制GST-π之生成的藥物,例如可舉出:針對編碼有GST-π之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸、及表現此等的載體等,但並不限定於此等。
作為抑制GST-π之活性的藥物,例如可舉出結合於GST-π的物質,例如:穀胱甘肽、穀胱甘肽類似物(glutathione analog)(例如WO 95/08563、WO 96/40205、WO 99/54346、上述Nakajima et al.,2003等所記載之物)、酮洛芬(上述Takahashi and Niitsu,1994)、吲哚美洒辛(Indomethacin)(Hall et al.,Cancer Res.1989;49(22):6265-8)、依他尼酸(ethacrynic acid)、吡前列素(piriprost)(Tew et al.,Cancer Res.1988;48(13):3622-5)、抗GST-π抗體、GST-π的顯性抑制突變體(dominant negative mutant)等,但並不限定於此等。這些藥物可以是市售物,或者可以基於習知技術而適當地製造。
作為抑制GST-π之生成及/或活性的藥物,由專一性高和副作用可能性低的方面而言,以下述為佳:針對編碼有GST-π之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸、及表現此等的載體。
GST-π的抑制,可以藉由相較於未使GST-π抑制劑發揮作用的情形時,細胞中GST-π的表現或活性受到抑制的情形來決定。GST-π的表現,可以藉由已知的任意手法來評價,並無限定,例如可藉由:利用抗GST-π抗體的免疫
沈澱法、EIA、ELISA、IRA、IRMA、西方墨點法、免疫組織化學法、免疫細胞化學法、流式細胞儀(flow cytometry),或者藉由利用針對編碼有GST-π的核酸或其獨特片段或該核酸的轉錄產物(例如mRNA)或者剪接(splicing)產物而具有專一性之雜交核酸的各種雜交技術、北方墨點法、南方墨點法、各種PCR方法等。
又,GST-π的活性,可以藉由下述來評價,亦即,藉由已知的任意方法,例如:免疫沈澱法、西方墨點法、質量分析法、沈澱法(pull-down assay)、表面電漿共振(SPR)法等,來分析GST-π的已知活性,其並無限定,例如可以是與Raf-1(特別是磷酸化Raf-1)或EGFR(特別是磷酸化EGFR)等蛋白質的結合性等。
在本說明書中使用的情形中,RNAi分子是指造成RNA干擾的任意分子,並無限定,包含:siRNA(small interfering RNA,小干擾RNA)、miRNA(micro RNA,微RNA)、shRNA(short hairpin RNA,小髮夾RNA)、ddRNA(DNA-directed RNA,DNA介導之RNA)、piRNA(Piwi-interacting RNA,Piwi交互RNA)、rasiRNA(repeat associated siRNA,重複相關小干擾RNA)等雙股RNA及該等之變體等。這些RNAi分子可以是市售物,或者可以基於習知的序列資訊而設計、製作。
又,在本說明書中使用的情形中,反義核酸包含了RNA、DNA、PNA、或該等的複合物。
在本說明書中使用的情形中,DNA/RNA嵌合聚核苷酸並無限定,例如可以包含如日本專利特開2003-219893所記載之阻礙標的基因表現的由DNA與RNA所構成的雙股聚核苷酸。
在本說明書中使用的情形中,細胞自噬雖然可以包含:巨大細胞自噬(macroautophagy)、微小細胞自噬(microautophagy)、分子伴侶介導自噬(Chaperone-mediated autophagy)等,但典型而言意思是巨大細胞自噬。因此,本發明中的「細胞自噬」用語,只要無特別記載,則是指「巨大細胞自噬」。
細胞自噬又稱為「自體吞噬」,是細胞內蛋白質分解機轉之一,負責細胞內蛋白質的分解、回收。細胞自噬可以在酵母菌或包括哺乳動物在內的廣泛生物種類中看到,大致上伴隨著包含下述在內的一連串過程:(a)形成PAS(phagophore assembly site)之形成;(b)包圍應分解之蛋白質的吞噬泡(隔離膜)之伸長及擴大、並因此形成將應分解之蛋白質包圍在內的自噬小體(autophagosome);(c)因自噬小體與溶酶體(lysosome)之融合所致的自噬性溶酶體(autolysosome)之形成;(d)自噬性溶酶體內的蛋白質之分解。
上述(a)~(c)的過程中,牽涉到特有的細胞自噬相關因子。細胞自噬相關因子,起初是在酵母菌中進行研究,目前已鑑別出以Atg 1~27為首的許多因子(Klionsky et al.,Dev Cell. 2003;5(4):539-45),在哺乳動物中的研究也逐漸推展,鑑別出數種同源物(homolog),細胞自噬的核內分子機轉也逐漸明朗(Yang and Klionsky,Curr Opin Cell Biol. 2010;22(2):124-31)。
作為牽涉到哺乳動物中細胞自噬的核內分子機轉的細胞自噬相關因子,例如可舉出:牽涉到PAS之形成的VMP1、TP53INP2、mAtg9、ULK複合體(由ULK1、ULK2、mAtg13、FIP200所構成)、PI3K複合體(由Beclin1、hVps34、p150、Ambra1、Atg14L所構成的Atg14L複合體,以及由Beclin1、hVps34、p150、Bif-1、UVRAG所構成的UVRAG複合體)、牽涉到吞噬泡之伸長的LC3-II、Atg12-Atg5-Atg16L複合體等。
因此,作為抑制細胞自噬的藥物,並無限定,例如可舉出:抑制包括上述物質在內的細胞自噬相關因子之生成及/或活性的藥物、或促進細胞自噬相關因子之分解及/或失活的藥物等。作為抑制細胞自噬相關因子之生成的藥物,例如可舉出:針對編碼有細胞自噬相關因子之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸、及表現此等的載體等。
作為抑制細胞自噬相關因子之活性的藥物,例如可舉出:PI3K的抑制劑(例如沃曼青黴素(wortmannin)等),且特別是Class III PI3K的抑制劑(例如3-MA(3-甲基腺嘌呤)等);阻礙自噬小體與溶酶體之融合的物質(例如巴佛洛黴素A1(bafilomycin A1)等);阻礙自噬性溶酶體中之蛋白質分解的物質(例如磷酸氯喹、亮抑酶肽(leupeptin)等);結合於細胞自噬相關因子的物質(例如針對細胞自噬相關因子的抗體等);細胞自噬相關因子的顯性抑制突變體等,但並不限定於此等。這些藥物可以是市售物,或者可以基於習知技術而適當地製造。在本發明的一個態樣中,抑制細胞自噬的藥物,並不包含GST-π及/或其功能性突變體。
作為抑制細胞自噬的藥物,由專一性高和副作用可能性低的方面而言,以下述為佳:針對編碼有細胞自噬相關因子之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸、及表現此等的載體。
細胞自噬的抑制,可以藉由相較於未使本發明之細胞自噬抑制劑發揮作用時,細胞中的細胞自噬受到抑制的情形來決定。細胞自噬的抑制,可以藉由已知的任意手法來評價,並無限定,例如可基於藉由電子顯微鏡進行的自噬小體之檢測、細胞自噬標定劑(marker)(例如Atg5、Atg12、LC3且特別是LC3-II等)之檢測等來評價。LC3-II並無限定,例如可以用對於LC3-II具專一性的抗體來檢測,也可以在以電泳將試料分離之後,將與LC3-I分離為不同泳帶(band)的LC3-II,使用與LC3-II、或與LC3-I和LC3-II之兩者進行反應的抗體並藉由西方墨點法等來檢測。而且,因為LC3-I分散存在於細胞質內,而LC3-II則局部存在於隔離膜、自噬小體、自噬性溶酶體等的細胞自噬之特有構造中,所以,以藉由與LC3-II反應之抗體(包括與LC3-I和LC3-II之兩者進行反應的抗體)的免疫染色等來凸顯而顯示出這些構造的點狀訊號,其存在或數量也可以作為細胞自噬的指標。
抑制GST-π的藥物與抑制細胞自噬的藥物,可以是含於單一製劑中,也可以分別含於2個以上的製劑中。後者的情形中,各製劑可以同時投予,也可以間隔一段時間而投予。間隔一段時間而投予的情形中,含有抑制GST-π之藥物的製劑可以在含有抑制細胞自噬之藥物的製劑之前投予,也可以在之後投予。
本發明,又關於一種用以在GST-π受到抑制之細胞中誘導細胞凋亡的製劑或組成物(以下又稱為「細胞凋亡誘導劑」或「細胞凋亡誘導組成物」),其中含有抑制細胞自噬之藥物來作為活性成分。
在本說明書中使用的情形中,所謂的「GST-π受到抑制」,例如包含了在表現有GST-π的細胞中,GST-π受到抑制的狀態。作為該狀態,例如可以舉出在表現有GST-π的細胞中,投予了抑制GST-π之藥物(例如上述之物質等)的狀態等。
在某個細胞中是否有GST-π表現,可以由文獻上得知,或者也可以藉由實際檢測到細胞中的GST-π之表現而決定。GST-π的表現,包括已於上述說明者,也可以是使用既有的任意手法而檢測。
本發明的製劑或組成物,也可以是用以在具有變異型KRAS的細胞中誘導細胞凋亡的製劑或組成物。
在本說明書中使用的情形中,變異型KRAS並無限定,例如可以舉出具有導致KRAS持續活化的變異者,例如具有抑制內源性GTPase的變異、或增加鳥糞嘌呤核苷酸交換速度的變異者。作為該些變異的具體例,並無限定,例如可舉出:在人類KRAS中第12、13及/或61個胺基酸中的變異(抑制內源性GTPase)、或在人類KRAS中第116及/或119個胺基酸中的變異(增加鳥糞嘌呤核苷酸交換速度)等(Bos,Cancer Res. 1989;49(17):4682-9、Levi et al.,Cancer Res. 1991;51(13):3497-502)。因此,在本發明的一個態樣中,變異型KRAS,可舉出在人類KRAS中第12、13、61、116、119個胺基酸中至少1個胺基酸上具有變異的KRAS。在本發明的一個態樣中,變異型KRAS是在人類KRAS中第12個胺基酸上具有變異。又,在本發明的一個態樣中,變異型KRAS也可以是誘導GST-π之過度表現者。因此,具有變異型KRAS的細胞,亦可顯示出GST-π之過度表現。
變異型KRAS的檢測,可以使用既有的任意手法來進行。作為該手法,並無限定,例如可舉出:對於既有的變異序列藉由具專一性的核酸探針來進行的選擇性雜交、酵素錯誤配對切割法(enzyme mismatch cleavage method)、定序(上述Bos,1989)、PCR-RFLP法(上述Miyanishi et al.,2001)等。
又,GST-π之表現的檢測,包括上述方法在內,可以使用既有的任意手法來進行。GST-π是否過度表現,例如可以藉由比較具有變異型KRAS之細胞中的GST-π之表現程度、與具有正常KRAS之同種細胞中的GST-π之表現程度來進行評價。此時,若具有變異型KRAS之細胞中的GST-π之表現程度,高於具有正常KRAS之同種細胞中的GST-π之表現程度,則稱為GST-π過度表現。
本發明的製劑或組成物中之活性成分的調配量,在投予製劑或組成物的情形中,可以是誘導出細胞凋亡的量。而且,以不發生超過由投予所得利益的不良影響的量為佳。該量為習知的量,或是可藉由使用培養細胞等的活體外(in vitro)試驗、或者在小鼠、大鼠、狗或豬等模式動物中進行的試驗來適當地決定,這些試驗方法為發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。細胞凋亡之誘導,可以藉由各種既有的手法來評價,例如可藉由下述來評價:DNA斷裂(DNA fragmentation)、鈣磷脂結合蛋白V(annexin V)與細胞膜之結合、粒線體膜電位之變化、半胱天冬酶(caspase)之活化等的細胞凋亡特有現象之檢測:或是TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end labeling,末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP-生物素切口末端標記法)染色等。活性成分的調配量,可以根據製劑或組成物的投藥態樣而變化。例如,在1次投予中使用複數單位組成物的情形中,每1單位組成物中所調配的有效成分量,可以設為在1次投予中所必須的有效成分量的數分之一。該調配量的調整,可由發明所屬技術領域中具有通常知識者適當地進行。
本發明,又關於下述:一種用以誘導細胞凋亡的製劑或組成物的製造方法,其中包含調配抑制GST-π之藥物與抑制細胞自噬之藥物來作為活性成分;一種抑制GST-π之藥物及抑制細胞自噬之藥物的用途,是用以製造誘導細胞凋亡的製劑或組成物;一種抑制GST-π之藥物及抑制細胞自噬之藥物的組合,是用以誘導細胞凋亡;以及一種誘導細胞凋亡的方法,其中包含投予有效量的抑制GST-π之藥物及抑制細胞自噬之藥物。
本發明,又關於下述:一種用以在GST-π受到抑制之細胞中誘導細胞凋亡的製劑或組成物的製造方法,其中包含調配抑制細胞自噬之藥物來作為活性成分;一種抑制細胞自噬之藥物的用途,是用以製造在GST-π受到抑制之細胞中誘導細胞凋亡的製劑或組成物;一種抑制細胞自噬之藥物,是用以在GST-π受到抑制之細胞中誘導細胞凋亡;以及一種在GST-π受到抑制之細胞中誘導細胞凋亡的方法,其中包含投予有效量的抑制細胞自噬之藥物。
關於上述製造方法或用途中的藥物或其調配量,是如同已於上述說明者。各藥物的調配,可以依照既有的任意手法來進行。
上述細胞凋亡誘導方法,均可以是活體外的方法、也可以是活體內(in vivo)的方法。又,關於該方法中的藥物,也如同已於上述所說明,藥物的有效量可以是在所投予的細胞中誘導細胞凋亡的量。而且,以不發生超過由投予所得利益的不良影響的量為佳。該量為習知的量,或是可藉由使用培養細胞等的活體外試驗等而適當地決定,這些試驗方法為發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。細胞凋亡之誘導,可以藉由包括上述方法在內的各種已知手法來評價。上述有效量,在將藥物投予至某個細胞群(cell population)時,並不一定要對該細胞群的全部細胞均誘導出細胞凋亡。例如,上述有效量可以是對細胞群中之細胞的1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、15%以上、20%以上、甚至25%以上等誘導出細胞凋亡的量。
本發明的細胞凋亡誘導劑,在細胞增殖上有異常的細胞等之中,也能有效地誘導細胞凋亡,作為醫藥組成物的成分而言很有效。因此,本發明的另一面,也包含一種含有本發明之細胞凋亡誘導劑的醫藥組成物。
本發明的醫藥組成物,於處置在細胞凋亡上有異常之疾病上特別有效。因此,本發明的一個態樣,是關於一種用以處置在細胞凋亡上有異常之疾病的醫藥組成物,其中含有上述細胞凋亡誘導劑。在本說明書中使用的情形中,在細胞凋亡上有異常之疾病,例如包含了:起因於細胞之異常增殖的疾病、起因於KRAS之變異的疾病、起因於GST-π過度表現的疾病等,但並不限定於這些疾病。作為起因於細胞之異常增殖的疾病,並無限定,例如包含了:良性或惡性腫瘤、增生(hyperplasia)、瘢瘤、庫欣氏症候群(Cushing's syndrome)、原發性皮質醛酮症(primary aldosteronism)、紅斑(erythroplakia)、真性多血症、白斑症(leukoplakia)、增生性疤痕、扁平苔癬及著色斑(lentigines)等。作為起因於KRAS之變異的疾病,並無限定,例如包含了:良性或惡性腫瘤(又稱為癌、惡性新生物)等。作為起因於GST-π過度表現的疾病,並無限定,例如包含了良性或惡性腫瘤,且特別是具有藥物抗性(例如,對於下述的抗性:美法侖(melphalan)、環磷醯胺等的烷化劑;阿黴素(adriamycin)等的蒽環黴素(anthracycline)類抗腫瘤性抗生物質;順鉑(cisplatin)等的鉑錯合物;以及,依妥普賽(etoposide)等)的惡性腫瘤等。在本發明的一個態樣中,在細胞凋亡上有異常之疾病為癌症。
作為在本發明中的癌症,並無限定,例如可以舉出:纖維肉瘤、惡性纖維性組織細胞瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤等肉瘤;腦腫瘤、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、闌尾癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胰臟癌、膽囊癌、膽管癌、肛門癌、腎癌、輸尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、睪丸癌、子宮癌、卵巢癌、外陰癌、陰道癌、皮膚癌等的癌瘤;甚至可舉出白血病或惡性淋巴瘤等。另外,本發明中,「癌症」包括了上皮性惡性腫瘤及非上皮性惡性腫瘤。在本發明中的癌症,可以存在於身體的任意部位,例如:腦、頭頸部、胸部、四肢、肺、心臟、胸腺、食道、胃、小腸(十二指腸、空腸、迴腸)、大腸(結腸、盲腸、闌尾、直腸)、肝臟、胰臟、膽囊、肛門、腎、輸尿管、膀胱、前列腺、陰莖、睪丸、子宮、卵巢、外陰、陰道、皮膚、橫紋肌、平滑肌、滑膜、軟骨、骨骼、甲狀腺、腎上腺、腹膜、腸繫膜、骨髓、血液、血管系統、淋巴結等淋巴系統、淋巴液等。
在本發明的一個態樣中,癌症是包含具有上述定義之變異型KRAS的癌細胞。在本發明的一個態樣中,癌症是包含顯示出內泌素或成長因子非依賴性增殖的癌細胞。在本發明的一個態樣中,癌症是包含顯示出GST-π過度表現的癌細胞。在本發明的一個態樣中,癌症有藥劑抗性。在本發明的一個態樣中,癌症對於選自由下述所組成之群組中的藥劑具有抗性:美法侖、環磷醯胺等的烷化劑;阿黴素等的蒽環黴素類抗腫瘤性抗生物質;順鉑等的鉑錯合物;以及,依妥普賽。在本發明的一個態樣中,癌症對於選自由下述所組成之群組中的藥劑具有抗性:美法侖、環磷醯胺、阿黴素、順鉑、依妥普賽。
本發明,又關於下述:一種處置在細胞凋亡上有異常之疾病的醫藥組成物,其中含有抑制GST-π之藥物與抑制細胞自噬之藥物來作為活性成分;一種處置在細胞凋亡上有異常之疾病的醫藥組成物的製造方法,其中包含調配抑制GST-π之藥物與抑制細胞自噬之藥物來作為活性成分;一種抑制GST-π之藥物及抑制細胞自噬之藥物的用途,是用以製造處置在細胞凋亡上有異常之疾病的醫藥組成物;一種抑制GST-π之藥物及抑制細胞自噬之藥物的組合,是用以處置在細胞凋亡上有異常之疾病;以及一種處置在細胞凋亡上有異常之疾病的方法,其中包含將有效量的前述醫藥組成物投予至需要的對象。
關於上述製造方法或用途中的藥物或調配量、在細胞凋亡上有異常之疾病,是如同已於上述說明者。而且,各藥物的調配,可以依照既有的任意手法來進行。
本發明人於本發明中闡明,GST-π會與位於PI3K/Akt/mTOR訊息級聯之上游的酪胺酸激酶型受體且特別是其磷酸化形態、以及與Raf也就是RAS/Raf/MAPK訊息級聯之構成分子且特別是其磷酸化形態分別結合,藉由阻止這些分子的泛素化,而促進這些訊息級聯。因此,本發明,又關於一種用以促進PI3K/Akt/mTOR訊息級聯及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的製劑或組成物(又稱為「訊息級聯促進劑」或「訊息級聯促進組成物」),其中含有GST-π及/或其功能性突變體來作為活性成分。本發明的製劑或組成物,特別能夠同時促進PI3K/Akt/mTOR訊息級聯及RAS/Raf/MAPK訊息級聯之兩者。
本說明書中所使用的「GST-π之功能性突變體」,並無限定,例如可舉出:(i)在GST-π的胺基酸序列上具有1個或2個以上、典型而言為1個或數個變異,但仍與GST-π具有相同功能的突變體;(ii)由一具有編碼GST-π之基因的鹼基序列的核酸所編碼,或者由一在與該核酸編碼同一多肽的核酸的鹼基序列上具有1個或2個以上、典型而言為1個或數個變異的核酸所編碼,並且與GST-π具有相同功能的突變體;(iii)由一具有編碼GST-π之基因的鹼基序列的核酸、一與該核酸編碼同一多肽的核酸或編碼(ii)之突變體的核酸的互補鏈、或者一以嚴格條件對於其片段進行雜交的核酸所編碼,並且與GST-π具有相同功能的突變體;(iv)與GST-π具有60%以上、以70%以上為佳、較佳為80%以上、更佳為90%以上、特佳為95%以上之相同性的胺基酸序列,並且與GST-π具有相同功能的突變體;(v)由與編碼GST-π之基因的鹼基序列具有60%以上、以70%以上為佳、較佳為80%以上、更佳為90%以上、特佳為95%以上之相同性的核酸所編碼,並且與GST-π具有相同功能的突變體等。
GST-π的胺基酸序列及編碼GST-π的基因的鹼基序列是如同上述,在各種動物中為已知,發明所屬技術領域中具有通常知識者可以基於這些序列資訊,藉由既有的任意手法,例如藉由化學合成、藉限制酶進行之核酸的截切或插入、定位突變法(site-directed mutagenesis)、放射線或紫外線之照射等,而適當地製作上述功能性突變體。
某個突變體是否與GST-π具有相同的功能,可以藉由下述來評價,亦即,藉由已知的任意方法,例如:免疫沈澱法、西方墨點法、質量分析法、沈澱法(pull-down assay)、表面電漿共振(SPR)法等,並藉由與適當的陰性對照、或與作為陽性對照的GST-π比較,來分析GST-π的已知功能,其並無限定,例如可以是與Raf-1(特別是磷酸化Raf-1)或EGFR(特別是磷酸化EGFR)等蛋白質的結合性等。例如,在某個突變體中,上述功能比陰性對照優異時,例如優異10%以上、25%以上、50%以上、75%以上、進而為100%以上時,及/或該機能為GST-π的1/100以上、1/50以上、1/25以上、1/10以上、1/5以上、進而為1/2以上時,該突變體包含於GST-π的功能性突變體。
本說明書中所使用的所謂「嚴格條件」的用語,是該技術領域中習知的參數,已記載於標準的實驗程序之中,例如:Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press(2001);或Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)等。
本發明中的嚴格條件,例如是指藉由65℃的特定雜交緩衝液所進行的雜交反應,該雜交緩衝液是由3.5×SSC(saline sodium citrate,檸檬酸鈉緩衝溶液)(0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉、pH 7)、0.02%聚蔗糖(Ficoll)、0.02%聚乙烯吡咯啶酮、0.02%牛血清球蛋白、25mM之NaH2PO4(pH 7)、0.05%之SDS、2mM之EDTA所構成。雜交之後,轉移有DNA的膜,是以2×SSC在室溫中清洗,接著以0.1~0.5×SSC/0.1×SDS在至68℃為止的溫度中清洗。或者,嚴格的雜交反應,也可以是藉由ExpressHyb(R)Hybridization Solution(Clontech公司製)等的市售雜交緩衝液,依照製造商所記載的雜交及清洗條件來進行。
另外雖然也存在有能夠產生相同程度的嚴格度(stringency)之可使用的其他條件、試藥等,但發明所屬技術領域中具有通常知識者應已瞭解該些條件,因此關於該些條件,在本說明書中並未特別記載。然而,可以是操作該條件,以便能夠明確地鑑別到編碼有GST-π之突變體的核酸。
本發明中的GST-π及/或其功能性突變體,除了作為蛋白質的GST-π或其功能性突變體之外,也包含編碼GST-π的核酸、或編碼GST-π之功能性突變體的核酸。
在本說明書中使用的情形中,「訊息級聯」的意思是複數個訊息傳導分子依序傳遞訊息的訊息傳導。例如「PI3K/Akt/mTOR訊息級聯」的情形中,首先是PI3K被活化,此導致Akt接著被活化,此又導致mTOR進而被活化,訊息就是以這樣的狀況被傳導。這在其他訊息級聯的標記中也是相同。在訊息的上游與下游的關係中,活化的連鎖反應可以是直接發生,也可以是間接發生。例如,起因於PI3K的Akt之活化中,已知有PIP3(Phosphatidylinositol(3,4,5)trisphosphate)或PDK1(Phosphoinositide dependent protein kinase 1,又稱為PDPK1)之類的分子介於其間。
PI3K/Akt/mTOR訊息級聯,是藉由PI3K之活化而驅動的訊息級聯,已知是關於細胞之生存等的訊息。PI3K之活化,例如是藉由配體結合於G蛋白耦合受體或酪胺酸激酶型受體而發生,被活化的PI3K則藉由將肌醇磷脂(inositol phospholipid)進行磷酸化而例如生成PIP3等磷脂醯肌醇(phosphatidylinositol),但不限定於此。這是藉由在PH結構域(pleckstrin homology domain,普列克底物蛋白同源結構域)中與PDK1或Akt結合,而促進這些蛋白質於細胞膜的定位(localization)。PDK1,是藉由與PIP3結合而在膜中活化,被活化的PDK1,則將Akt的第308個T加以磷酸化。Akt的第473個絲胺酸,藉由mTORC2也就是mTOR的複合體之一而被磷酸化,Akt即藉由此2處的的胺基酸之磷酸化而被完全地活化。
關於Akt將mTOR活化的路徑,雖然尚未完全地闡明,但被認為與PRAS40(proline-rich Akt/PKB substrate,40 kDa)有關。PRAS40是如同其名稱,為Akt的基質,被認為是結合於mTOR複合體而抑制其活化的分子,一般認為,若Akt被活化,則PRAS40被磷酸化,藉此,PRAS40從mTOR複合體脫離而將mTOR活化。然後,當mTOR活化,則會將ULK1及ULK2(unc-51-like kinase)以及mAtg13(mammalian autophagy-related 13)加以磷酸化,而阻礙細胞自噬訊息的啟動,藉此抑制細胞自噬。
另一方面,RAS/Raf/MAPK訊息級聯,則是關係著細胞增殖等的訊息級聯。在G蛋白耦合受體或酪胺酸激酶型受體上,若結合了例如成長因子等的配體,則KRAS也就是低分子G蛋白會被活化,而被活化的KRAS則將Raf(MAPKKK的一種)加以磷酸化而活化。被活化的Raf,將MEK(MAPK/ERK kinase,MAP2K的一種)活化,被活化的MEK則將ERK(Extracellular signal-regulated kinase,MAPK的一種)活化。被活化的ERK會移動至核內而促進各種mRNA的轉錄,因此而成為細胞增殖的觸發物。
在本發明中,所謂的促進訊息級聯,不僅意味著提高訊息級聯的活化,也是意味著抑制訊息級聯的失活。訊息級聯是否已被促進,可以藉由相較於未使本發明的製劑或組成物作用的情形時,訊息級聯受到活化的情形來決定。訊息級聯的活化,並無限定,例如可以藉由檢測到訊息級聯構成分子之活化(例如磷酸化等)、或因訊息級聯之活化而造成的細胞現象來評價,例如,若為PI3K/Akt/mTOR訊息級聯則藉由檢測細胞自噬之抑制等,若為RAS/Raf/MAPK訊息級聯則藉由檢測細胞之增殖等,來進行評價。
本發明,又關於下述:一種用以促進PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的製劑或組成物的製造方法,其中含有調配GST-π及/或其功能性突變體的步驟;一種GST-π及/或其功能性突變體的用途,是用以製造促進PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的製劑或組成物;一種GST-π及/或其功能性突變體,是用以促進PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯;以及一種促進PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的方法,其中包含投予有效量的GST-π及/或其功能性突變體。
本發明的用以促進訊息級聯的製劑或組成物,於處置在PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的異常上,且特別在處置因這些訊息級聯之抑制而伴隨發生的疾病上很有用。作為這些疾病,並無限定,例如可以舉出:因這些訊息級聯之構成分子的表現和活性之抑制及/或分解和失活之增強而伴隨發生的疾病(例如,因這些分子的基因異常、或是GST-π的表現和活性之抑制等所致的疾病)等。
因此,本發明,又關於下述:一種用以處置因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯之抑制而伴隨發生之疾病的醫藥組成物,其中含有GST-π及/或其功能性突變體來作為活性成分;一種用以處置因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯之抑制而伴隨發生之疾病的醫藥組成物的製造方法,其中含有調配GST-π及/或其功能性突變體的步驟;一種GST-π及/或其功能性突變體的用途,是用以製造用以處置因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯之抑制而伴隨發生之疾病的醫藥組成物;一種GST-π及/或其功能性突變體,是用以處置因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯之抑制而伴隨發生的疾病;以及一種因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯之抑制而伴隨發生的疾病的處置方法,其中包含投予有效量的GST-π及/或其功能性突變體。
本發明,又關於一種用以抑制PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的製劑或組成物(又稱為「訊息級聯抑制劑」或「訊息級聯抑制組成物」),其中含有抑制GST-π的藥物來作為活性成分。
本發明中,所謂的抑制訊息級聯,不僅意味著誘導訊息級聯之失活,也意味著抑制訊息級聯之活化。訊息級聯是否受到抑制,可以藉由相較於未使本發明的製劑或組成物作用的情形時,訊息級聯受到抑制的情形來決定。訊息級聯的抑制,並無限定,例如可以藉由檢測到訊息級聯構成分子之活化(例如磷酸化等)的減低、或因訊息級聯之抑制而造成的細胞現象來評價,例如,若為PI3K/Akt/mTOR訊息級聯則藉由檢測細胞自噬之增強等,若為RAS/Raf/MAPK訊息級聯則藉由檢測細胞增殖之抑制等,來進行評價。
本發明,又關於下述:一種用以抑制PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的製劑或組成物的製造方法,其中含有調配抑制GST-π之藥物的步驟;一種抑制GST-π之藥物的用途,是用以製造用以抑制PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的製劑或組成物;一種抑制GST-π之藥物,是用以抑制PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯;以及一種抑制PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的方法,其中包含投予有效量的抑制GST-π之藥物。
本發明的用以抑制訊息級聯的製劑或組成物,在處置因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯的異常,且特別是因這些訊息級聯之活化而伴隨發生的疾病上很有用。作為這些疾病,並無限定,例如可以舉出:因這些訊息級聯之構成分子的表現和活性之增強及/或分解和失活之抑制而伴隨發生的疾病(例如,因這些分子的基因異常、或是GST-π的表現和活性之增強所致的疾病)、因這些訊息級聯之構成分子以外的因子(例如,受體型酪胺酸激酶之活化等)所致的訊息級聯之活化而伴隨發生的疾病等。
因此,本發明也進而關於下述:一種用以處置因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯之活化而伴隨發生的疾病的醫藥組成物,其中含有抑制GST-π之藥物來作為活性成分;一種用以處置因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯之活化而伴隨發生的疾病的醫藥組成物的製造方法,其中含有調配抑制GST-π之藥物的步驟;一種抑制GST-π之藥物的用途,是用以製造用以處置因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯之活化而伴隨發生的疾病的醫藥組成物;一種抑制GST-π之藥物,是用以處置因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯之活化而伴隨發生的疾病;以及一種因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯、及/或RAS/Raf/MAPK訊息級聯之活化而伴隨發生的疾病的處置方法,其中包含投予有效量的抑制GST-π之藥物。
本發明,又關於一種用以抑制泛素化的製劑或組成物(又稱為「泛素化抑制劑」或「泛素化抑制組成物」),其中含有GST-π及/或其功能性突變體來作為活性成分。
泛素化,是指在蛋白質上結合泛素的現象,此與處理細胞內不需要的蛋白質的過程有關。被泛素化的蛋白質,會被蛋白酶體(proteasome)分解。
在本發明的一個態樣中,泛素化受到抑制的蛋白質,是GST-π能夠結合的蛋白質。又,在本發明的一個態樣中,泛素化受到抑制的蛋白質,是選自由下述所構成之群組:構成RAS/Raf/MAPK訊息級聯的蛋白質、構成PI3K/Akt/mTOR訊息級聯的蛋白質、及酪胺酸激酶型受體。在本發明的較佳態樣中,泛素化受到抑制的蛋白質,是選自由下述所構成的群組:EGFR及Raf-1,且特別是EGFR及Raf-1之磷酸化形態。
在本發明中,泛素化的抑制,可以藉由相較於未使本發明的製劑或組成物作用的情形時,泛素化受到抑制的情形來決定。泛素化的抑制,可以藉由既有的任意手法來評價,並無限定,例如可藉由:免疫沈澱法、西方墨點法、質量分析法、沈澱法等來評價。
本發明,又關於下述:一種用以抑制泛素化的製劑或組成物的製造方法,其中含有調配GST-π及/或其功能性突變體的步驟;一種GST-π及/或其功能性突變體的用途,是用以製造用以抑制泛素化的製劑或組成物;一種GST-π及/或其功能性突變體,是用以抑制泛素化;以及一種抑制泛素化的方法,其中包含投予有效量的GST-π及/或其功能性突變體。
本發明的用以抑制泛素化的製劑或組成物,在處置因泛素化亢進而伴隨發生的疾病上很有用。作為這些疾病,並無限定,例如可以舉出:因泛素連接酶(ubiquitin ligase)的表現和活性之增強及/或分解和失活之抑制而伴隨發生的疾病(例如,因泛素連接酶的基因異常、或是GST-π的表現和活性之抑制等所致的疾病)等。
因此,本發明也進而關於下述:一種用以處置因泛素化亢進而伴隨發生的疾病的醫藥組成物,其中含有GST-π及/或其功能性突變體來作為活性成分;一種用以處置因泛素化亢進而伴隨發生的疾病的醫藥組成物的製造方法,其中含有調配GST-π及/或其功能性突變體的步驟;一種GST-π及/或其功能性突變體的用途,是用以製造用以處置因泛素化亢進而伴隨發生的疾病的醫藥組成物;一種GST-π及/或其功能性突變體,是用以處置因泛素化亢進而伴隨發生的疾病;以及一種因泛素化亢進而伴隨發生的疾病的處置方法,其中包含投予有效量的GST-π及/或其功能性突變體。
本發明,又關於一種用以促進泛素化的製劑或組成物(又稱為「泛素化促進劑」或「泛素化促進組成物」),其中含有抑制GST-π之藥物來作為活性成分。
在本發明的一個態樣中,泛素化受到促進的蛋白質,是GST-π能夠結合的蛋白質。又,在本發明的一個態樣中,泛素化受到促進的蛋白質,是選自由下述所構成之群組:構成RAS/Raf/MAPK訊息級聯的蛋白質、構成PI3K/Akt/mTOR訊息級聯的蛋白質、及酪胺酸激酶型受體。在本發明的較佳態樣中,泛素化受到促進的蛋白質,是選自由下述所構成的群組:EGFR及Raf-1,且特別是EGFR及Raf-1之磷酸化形態。
在本發明中,泛素化的促進,可以藉由相較於未使本發明的製劑或組成物作用的情形時,泛素化受到促進的情形來決定。泛素化的促進,可以藉由既有的任意手法來評價,並無限定,例如可藉由:免疫沈澱法、西方墨點法、質量分析法、沈澱法等來評價。
本發明,又關於下述:一種用以促進泛素化的製劑或組成物的製造方法,其中含有調配抑制GST-π之藥物的步驟;一種抑制GST-π之藥物的用途,是用以製造用以促進泛素化的製劑或組成物;一種抑制GST-π之藥物,是用以促進泛素化;以及一種促進泛素化的方法,其中包含投予有效量的抑制GST-π之藥物。
本發明的用以促進泛素化的製劑或組成物,在處置因泛素化受抑制而伴隨發生的疾病上很有用。作為這些疾病,並無限定,例如可以舉出:因泛素連接酶的表現和活性之抑制及/或分解和失活之增強而伴隨發生的疾病(例如,因泛素連接酶的基因異常、或是GST-π的表現和活性之增強等所致的疾病)等。
因此,本發明也進而關於下述:一種用以處置因泛素化受抑制而伴隨發生的疾病的醫藥組成物,其中含有抑制GST-π之藥物來作為活性成分;一種用以處置因泛素化受抑制而伴隨發生的疾病的醫藥組成物的製造方法,其中含有調配抑制GST-π之藥物的步驟;一種抑制GST-π之藥物的用途,是用以製造用以處置因泛素化受抑制而伴隨發生的疾病的醫藥組成物;一種抑制GST-π之藥物,是用以處置因泛素化受抑制而伴隨發生的疾病;以及一種因泛素化受抑制而伴隨發生的疾病的處置方法,其中包含投予有效量的抑制GST-π之藥物。
本發明,又關於一種用以抑制細胞自噬的製劑或組成物(又稱為「細胞自噬抑制劑」或「細胞自噬抑制組成物」),其中含有GST-π及/或其功能性突變體來作為活性成分。本發明人於本發明中闡明,GST-π會與位於PI3K/Akt/mTOR訊息級聯之上游的酪胺酸激酶型受體且特別是其磷酸化形態結合,藉由阻止其泛素化而促進該訊息級聯,但是,已知PI3K/Akt/mTOR訊息級聯之活化會抑制細胞自噬(例如上述Yang and Klionsky,2010)。
在本發明中,細胞自噬的抑制,可以藉由相較於未使本發明之細胞自噬抑制劑發揮作用時,細胞中的細胞自噬受到抑制的情形來決定。關於細胞自噬的評價手法,是如同已於上述說明者。
本發明,也進而關於下述:一種用以抑制細胞自噬的製劑或組成物的製造方法,其中含有調配GST-π及/或其功能性突變體的步驟;一種GST-π及/或其功能性突變體的用途,是用以製造用以抑制細胞自噬的製劑或組成物;一種GST-π及/或其功能性突變體,是用以抑制細胞自噬;以及一種抑制細胞自噬的方法,其中包含投予有效量的GST-π及/或其功能性突變體。
本發明的用以抑制細胞自噬的製劑或組成物,在處置因細胞自噬之亢進而伴隨發生的疾病上很有用。作為這些疾病,並無限定,例如可以舉出:因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯之抑制而伴隨發生的疾病(例如,因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯構成分子及/或位於其上游之分子的基因異常、或是GST-π的表現和活性之抑制等所致的疾病)、肌肉病變(myopathy)、肝功能障礙、再灌注損傷(reperfusion damage)等。
因此,本發明,又關於下述:一種用以處置因細胞自噬之亢進而伴隨發生的疾病的醫藥組成物,其中含有GST-π及/或其功能性突變體來作為活性成分;一種用以處置因細胞自噬之亢進而伴隨發生的疾病的醫藥組成物的製造方法,其中含有調配GST-π及/或其功能性突變體的步驟;一種GST-π及/或其功能性突變體的用途,是用以製造用以處置因細胞自噬之亢進而伴隨發生的疾病的醫藥組成物;一種GST-π及/或其功能性突變體,是用以處置因細胞自噬之亢進而伴隨發生的疾病;以及一種因細胞自噬之亢進而伴隨發生的疾病的處置方法,其中包含投予有效量的GST-π及/或其功能性突變體。
本發明人也於本發明中闡明,藉由抑制GST-π,而會促進細胞自噬。因此,本發明,又關於一種用以促進細胞自噬的製劑或組成物(又稱為「細胞自噬促進劑」或「細胞自噬促進組成物」),其中含有抑制GST-π之藥物來作為活性成分。本發明也進而關於下述:一種用以促進細胞自噬的製劑或組成物的製造方法,其中含有調配抑制GST-π之藥物的步驟;一種抑制GST-π之藥物的用途,是用以製造用以促進細胞自噬的製劑或組成物;一種抑制GST-π之藥物,是用以促進細胞自噬;以及一種促進細胞自噬的方法,其中包含投予有效量的抑制GST-π之藥物。
本發明的用以促進細胞自噬的製劑或組成物,在處置因細胞自噬之抑制而伴隨發生的疾病上很有用。作為這些疾病,並無限定,例如可以舉出:因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯之活化而伴隨發生的疾病(例如,因PI3K/Akt/mTOR訊息級聯構成分子及/或位於其上游之分子的基因異常、或是GST-π的表現和活性之增強等所致的疾病)、老化(aging)、缺血性疾病(ischemic disease)等。
因此,本發明,又關於下述:一種用以處置因細胞自噬之抑制而伴隨發生的疾病的醫藥組成物,其中含有抑制GST-π之藥物來作為活性成分;一種用以處置因細胞自噬之抑制而伴隨發生的疾病的醫藥組成物的製造方法,其中含有調配抑制GST-π之藥物的步驟;一種抑制GST-π之藥物的用途,是用以製造用以處置因細胞自噬之抑制而伴隨發生的疾病的醫藥組成物;一種抑制GST-π之藥物,是用以處置因細胞自噬之抑制而伴隨發生的疾病;以及一種因細胞自噬之抑制而伴隨發生的疾病的處置方法,其中包含投予有效量的抑制GST-π之藥物。
有關於訊息級聯、泛素化或細胞自噬之抑制/促進的本發明上述各種製劑或組成物中,活性成分的調配量,在投予該製劑或組成物的情形中,可以是達成所期望之效果(亦即,訊息級聯、泛素化或細胞自噬之抑制/促進)的量。而且,以不發生超過由投予所得利益的不良影響的量為佳。該量為習知的量,或是可藉由使用培養細胞等的活體外試驗、或者在小鼠、大鼠、狗或豬等模式動物中進行的試驗來適當地決定,這些試驗方法為發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。訊息級聯、泛素化或細胞自噬之抑制/促進,可以藉由包含上述手法在內的各種已知手法來評價。活性成分的調配量,可以根據製劑或組成物的投藥態樣而變化。例如,在1次投予中使用複數單位組成物的情形中,每1單位組成物中所調配的有效成分量,可以設為在1次投予中所必須的有效成分量的數分之一。該調配量的調整,可由發明所屬技術領域中具有通常知識者適當地進行。
關於訊息級聯、泛素化或細胞自噬之抑制/促進的上述各種製劑或組成物,其製造方法或用途中的藥物或其調配量,是如同已於上述說明者。各藥物的調配,可以依照既有的任意手法來進行。
關於訊息級聯、泛素化或細胞自噬之抑制/促進的上述各種方法,均可以是活體外的方法、也可以是活體內的方法。又,關於上述方法中的藥物的有效量,可以是在所投予的細胞中達成所期望之效果(亦即,訊息級聯、泛素化或細胞自噬之抑制/促進)的量。而且,以不發生超過由投予所得利益的不良影響的量為佳。該量為習知的量,或是可藉由使用培養細胞等的活體外試驗等而適當地決定,這些試驗方法為發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。所期望之效果的達成,可以藉由包括上述方法在內的各種已知手法來評價。上述有效量,在將藥物投予至某個細胞群時,並不一定要對該細胞群的全部細胞均誘導出所期望之效果。例如,上述有效量可以是對細胞群中之細胞的1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、15%以上、20%以上、甚至25%以上等誘導出所期望之效果的量。
本說明書中所記載的本發明之各種製劑或組成物、處置方法等之中,活性成分為核酸的情形中,例如活性成分為RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸等的情形中,可以直接利用核酸本身,亦可使用將核酸連接於各種載體上者。
作為載體,例如可利用下述習知的任意物質:質體載體、噬菌體載體、噬菌質體(phagemid)載體、黏接質體(cosmid)載體、病毒載體等。載體較佳為至少含有增強所連接之核酸的表現的啟動子(promoter),此時,該核酸較佳為與該啟動子以能夠操作的方式連接。所謂的與該啟動子以能夠操作的方式連接,是意味著使該核酸與啟動子配置為能夠藉由啟動子的作用而適當地生成該核酸所編碼的蛋白質。載體可以是能夠在宿主細胞內複製、或不能在宿主細胞內複製,又,基因的轉錄可以在宿主細胞的核外進行,也可以在核內進行。後者的情形中,核酸亦可嵌入於宿主細胞的基因體(genome)之中。
又,有效成分也可以承載於各種非病毒性脂質或蛋白質攜帶體上。作為該攜帶體,並無限定,例如可以舉出:膽固醇、微脂體、抗體原體(protomer)、環狀糊精奈米粒子、融合肽、適體(aptamer)、生物可分解性聚乳酸共聚物、聚合物等,可以提高被攝入細胞內的效率(例如參照Pirollo and Chang,Cancer Res. 2008;68(5):1247-50等)。其中以陽離子性微脂體或聚合物(例如聚乙烯亞胺等)特別有用。作為該攜帶體而言有用的聚合物,其進一步的例示則例如可以舉出如美國專利US 2008/0207553號、US 2008/0312174號申請案等所記載者。
在本說明書所記載之本發明的各種醫藥組成物中,只要不妨礙活性成分的效果,則亦可將活性成分與其他任意成分組合。作為此種任意成分,例如可舉出:其他化學治療劑、藥理學上可容許的攜帶體、賦形劑、稀釋劑等。而且,視投予路徑或藥物釋放形式等而定,亦可將上述組成物以適當的材料被覆,例如以腸溶性的塗覆物、經時分解性的材料來被覆,或者亦可組合於適當的藥物釋放系統。
在本說明書所記載之本發明的各種製劑及組成物(包含各種醫藥組成物)中,可以藉包括經口及非經口之兩者在內的各種路徑來投予,例如,並不受限定而可舉出:經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸內、動脈內、門脈內、心室內、經黏膜、經皮膚、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑,並且可以製劑為適合於各投予路徑的劑型。該劑型及製劑方法,可適當採用任意的習知者(例如參照由渡邊喜照等人編輯並由南江堂於2003年出版的標準藥劑學)。
例如,作為適合於經口投予的劑型,並不受限定而可舉出:散劑、顆粒劑、錠劑、膠囊、液劑、懸濁劑、乳劑、膠劑、糖漿等,又,作為適合於非經口投予的劑型,則可舉出溶液性注射劑、懸濁性注射劑、乳濁性注射劑、用時調製型注射劑等注射劑。非經口投予用製劑,可以是水性或非水性之等張性無菌溶液或懸濁液的形態。
本說明書所記載之本發明的各種製劑及組成物(包含各種醫藥組成物),亦可將特定組織或細胞作為標靶(targeting,標靶化)。標靶化可以藉由既有的任意手法來達成。在企圖輸送至罹癌處的情形中,並無限定,例如可使用下述手法:藉由將製劑作成適合於表現EPR(enhanced permeability and retention,滲透及滯留增強效應)效應的直徑50~200 μm且特別是75~150 μm等尺寸而進行的被動標靶(passive targeting);或是藉由利用CD19、HER2、運鐵蛋白受體、葉酸受體、VIP受體、EGFR(Torchilin,AAPS J. 2007;9(2):E128-47)、RAAG10(日本專利特表2005-532050號)、PIPA(日本專利特表2006-506071)、KID3(日本專利特表2007-529197)等的配體、或具有RGD功能區(motif)和NGR功能區之胜肽、F3、LyP-1(Ruoslahti et al.,J Cell Biol. 2010;188(6):759-68)等作為標靶藥物而進行的主動標靶(active targeting)等。又,因為已知類視色素(retinoid)在作為對癌細胞之標靶藥物而言很有用(WO 2008/120815),所以也可以利用含有類視色素作為標靶藥物的攜帶體。該攜帶體,除了上述文獻以外,也記載於WO 2009/036368、WO 2010/014117等。
本說明書所記載之本發明的各種製劑及組成物(包含各種醫藥組成物),雖然可以用任一形態來給予,但從保存安定性的觀點而言,較佳為能夠於使用時調製的形態,例如能夠在醫療現場或附近,由醫師及/或藥師、護士、或其他醫務人員等進行調製的形態來提供。該形態,在本發明含有脂質或蛋白質、核酸等難以安定保存的成分時特別有用。此時,本發明之製劑或組成物,是以1個或2個以上的容器來提供,該容器含有本發明之製劑或組成物之必須構成要素的至少一個,並且本發明之製劑或組成物是在使用之前,例如24小時前以內、較佳為3小時前以內、以及更佳為正要使用前進行調製。於調製之際,可適當地使用在調製場所中通常可獲得的試藥、溶劑、調劑器具等。
因此,本發明,又關於一種組成物的調製套組,其中包含1個或2個以上的容器,該容器是單獨或組合地含有能夠含於本發明之各種製劑或組成物中的活性成分,本發明亦有關於以此種套組之形態來提供的各種製劑或組成物的必要構成要素。本發明之套組,除了上述之外,亦可含有記載了關於本發明之各種製劑及組成物之調製方法或投予方法等的指示,例如說明書、或CD、DVD等電子記錄媒體等。又,本發明之套組雖然亦可包含用以完成本發明之各種製劑或組成物的全部構成要素,但並不一定需含有全部的構成要素。因此,本發明之套組中,亦可不含有在醫療現場或實驗設施等通常可取得的試藥或溶劑,例如無菌水、生理食鹽水、或葡萄糖溶液等。
本說明書所記載之本發明的各種處置方法中,所謂的有效量,例如是能夠減輕疾病症狀、或者能延遲或停止疾病惡化的量,以抑制疾病或治癒的量為佳。又,以不發生超過由投予所得利益的不良影響的量為佳。該量可藉由使用培養細胞等的活體外試驗、或者在小鼠、大鼠、狗或豬等的模式動物中進行的試驗來適當地決定,這些試驗方法為發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。又,本發明的處置方法中所使用的藥物的用量,為發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知,或者可以藉由上述試驗當地決定。
本說明書所記載之本發明的處置方法中所投予的活性成分之具體用量,可以是考慮關於需要處置之對象的各種條件來決定,該條件是例如症狀的嚴重度、對象的一般健康狀態、年齡、體重、對象的性別、飲食、投予的時期及頻率、所併用的醫藥、對治療的反應性、劑型、及對治療的遵從性等。
作為投予路徑,可以藉包括經口及非經口之兩者在內的各種路徑來投予,例如包括:經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸內、動脈內、門脈內、心室內、經黏膜、經皮膚、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑投予頻率是依照所使用之製劑或組成物的性狀、或者包括上述在內的對象的條件而異,例如可以是1日多次(亦即1日2、3、4次或5次以上)、1日1次、每數日(亦即每2、3、4、5、6、7日等)1次、每週1次、每隔數週(亦即每2、3、4週等)1次。
在本說明書中使用的情形中,用語「對象」的意思是任意的生物個體,較佳為動物、更佳為哺乳動物、且更佳為人之個體。在本發明中,雖然對象可以是健康或罹患某種疾病者,但在目的為處置特定疾病的情形中,典型而言意思是已罹患該疾病、或是具有罹患風險的對象。
又,用語「處置」,在本說明書中使用的情形中,是以疾病之治癒、暫時緩解或預防等為目的,而包含了醫學上所容許之全部種類的預防性及/或治療性之介入。例如,「處置」之用語,包含了各種目的之醫學上可容許之介入,其中包含了疾病之惡化的延緩或停止、病變之消退或消失、發病之預防或復發之防止等。
以下述實施例進而說明本發明,但這些實施例僅為本發明的例示,本發明並不受其限定。
K-RAS變異陽性大腸癌細胞株M7609,是用含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基,以37℃在含有5%CO2的大氣下進行培養。而且,在培養基中,添加100 U/mL盤尼西林、100 μg/mL鏈黴素作為抗生物質。
於轉染的前一日,使用不含抗生物質之含有10%FBS的RPMI-1640培養基,將M7609細胞接種於100 mm塑膠製組織培養皿中,使其成為1×106個/10 mL。在1 mL的Opti-MEM I Reduced Serum Medium(GIBCO公司)中添加600 pmol的GST-π siRNA(序列編號1:GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT,siRNA ID#2385,Ambion公司)並穩定地混合。接著,將Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司)稀釋為於1 mL的Opti-MEM I Reduced Serum Medium中含有35 μL的Lipofectamine RNAiMAX,並穩定地混合。將稀釋後的GST-π siRNA與稀釋後的Lipofectamine RNAiMAX合併,穩定地混合之後,在室溫中培養(incubate) 10分鐘。其間,將培養基更換為10 mL的Opti-MEM I Reduced Serum Medium。培養10分鐘之後,將GST-π siRNA與Lipofectamine RNAiMAX的複合體添加至細胞中,以37℃在含有5% CO2的大氣下進行培養。培養5小時之後,更換為10 mL的不含抗生物質之含有10%FBS的RPMI-1640培養基。又,作為對照實驗,則是使用Scramble siRNA(序列編號2:CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG,北海道System Science公司)並進行同樣的操作。在GST-π轉染後,分別於第1、2、3、4日測量細胞數並觀察GST-π的基因抑制(knockdown)。GST-π的基因抑制,是如同下述般藉由西方墨點法來分析。
使用在GST-π轉染後於上述各時間點採集的細胞,來進行GST-π基因抑制的西方墨點分析。將所採集的細胞於不含血清的培養基中培養16小時。將細胞以冷的PBS清洗後,添加冷的Lysis buffer(1% NP-40、50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、complete Mini EDTA-free(Roche公司)、PhosSTOP(Roche公司),pH 7.5),冰浴冷卻,培養30分鐘使其可溶。於4℃以15000 rpm離心15分鐘,獲得細胞抽出液。對於所獲得的細胞抽出液,使用Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo SCIENTIFIC公司)進行蛋白質定量(GST-π siRNA轉染物:4.35 μg/μL,Scramble siRNA轉染物:4.56 μg/μL)。接著,使20 μg的細胞抽出液在還原條件下變性,使用Multigel II Mini 4/20(13W)(COSMO BIO公司)進行SDS-PAGE電泳,將蛋白質分離。SDS-PAGE電泳結束後,使用槽式轉漬裝置,通電轉印於PVDF膜上。在添加5%脫脂奶粉/0.05% Tween 20的PBS(以下簡略記為PBS-T)中,將轉印膜以4℃培養16小時,而進行轉漬。接著,再使轉印膜與以PBS-T稀釋的抗GST-π抗體(MBL公司)在4℃反應16小時。二次抗體反應,是使用經山葵過氧化酶(HRP,horseradish peroxidase)標記的兔抗體,在室溫進行1小時。然後,使轉印膜與化學發光基質在室溫反應1分鐘之後,使用X射線膠片來檢測化學發光。在各操作之間的清洗,是使用PBS-T來進行3次且每次5分鐘的振盪。又,轉染siRNA之後,將細胞接種於60 mm塑膠製組織培養皿且使其成為1.0×105個/5 mL,使用血球計(hemocytometer)來計算培養皿中的總細胞數直到第4日為止。
使用轉染GST-π siRNA後之第2日所採集的細胞,針對關於RAS/Raf/MAPK訊息級聯的主要蛋白質,進行與上述(3)同樣的西方墨點分析。添加抗GST-π抗體來作為抗體,其使用:抗p-Raf-1(Ser338)抗體(MILLIPORE公司)、抗Raf-1抗體(Santa Cruz公司)、抗p-MEK1/2(Ser217/221)抗體(Cell Signaling公司)、抗MEK1/2抗體(Cell Signaling公司)、抗p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)抗體(Cell Signaling公司)、抗ERK抗體(Cell Signaling公司)、抗GAPDH抗體(Abcam公司)。
結果顯示於第1圖及第2圖。第1圖之a)中可以觀察到,GST-π的表現受到GST-π siRNA所抑制,但Scramble siRNA則未受到抑制。於第1圖之b)中則可知道,即使在轉染後經過4日的時間點上,GST-π的表現仍然受到GST-π siRNA安定地抑制,進而,相較於未抑制的情形,可知抑制GST-π的表現的情形中,培養4日之後的細胞數顯著較少。又,由第2圖可清楚得知,在GST-π siRNA處理組中,與RAS/Raf/MAPK訊息級聯有關的蛋白質之磷酸化,均相較於Scramble siRNA處理組而較為降低。因此可知道,藉由抑制GST-π的表現,則可使RAS/Raf/MAPK訊息級聯及細胞增殖異常受到抑制。
依照實施例1之(1)~(2)的程序,進行M7609細胞的培養及GST-π siRNA的轉染。
與實施例1之(3)同樣地,於轉染siRNA之後第2日起,以不含血清的培養基培養16小時,並回收細胞抽出液。對於所獲得的細胞抽出液,使用Micro BCA Protein Assay Kit進行蛋白質定量(Scramble siRNA轉染物:8.88 μg/μL,GST-π siRNA轉染物:7.18 μg/mL)。將0.5 μg的細胞抽出液與結合Dynabeads Protein G(Invitrogen公司)的抗Raf-1抗體混合,一面以振盪機穩定地混合、一面於4℃培養2小時而將Raf-1蛋白質單離之後,使用抗泛素抗體(Santa Cruz公司),與實施例1之(3)同樣地進行西方墨點分析。與抑制Raf-1蛋白酶體分解有關的Ser621之磷酸化修飾,是使用抗p-Raf-1(Ser621)抗體(MILLIPORE公司)而同樣地進行。
依照實施例1之(1)~(2)的程序,進行M7609細胞的培養及GST-π siRNA的轉染。於轉染GST-π siRNA之後第2日起,將細胞以不含血清的培養基培養16小時。以5 μM的MG132(蛋白酶體抑制劑)處理4小時之後,回收細胞抽出液。作為MG132處理的對照組,而同樣地進行0.05%DMSO處理。對於所獲得的細胞抽出液,使用Micro BCA Protein Assay Kit進行蛋白質定量(Scramble siRNA-DMSO處理組:3.36 μg/μL,Scramble siRNA-MG132處理組:3.16 μg/μL,GST-π siRNA-DMSO處理組:3.12 μg/μL,GST-π siRNA-MG132處理組:3.16 μg/μL)。將20 μg的細胞抽出液供給至SDS-PAGE之後,使用抗p-Raf-1(Ser338)抗體及抗Raf-1抗體,與實施例1之(3)同樣地進行西方墨點分析。
依照實施例1之(1)的程序,進行M7609細胞的培養。接著,將依照實施例1之(2)的程序而獲得的GST-π基因抑制細胞,以冷的PBS清洗之後,添加冷的共同免疫沈澱緩衝液(0.5%的NP-40、50 mM的HEPES、150 mM的NaCl、1 mM的EGTA、1.5 mM的MgCl2、complete Mini EDTA-free、PhosSTOP,pH 7.5),冰浴冷卻,培養30分鐘使其可溶。於4℃以15000 rpm離心15分鐘,獲得細胞抽出液。對於所獲得的細胞抽出液,使用Micro BCA Protein Assay Kit進行蛋白質定量(12.1 μg/μL)。將1 mg的細胞抽出液與結合Dynabeads Protein G的抗p-Raf-1(Ser338)抗體(US Biological公司)混合,一面以振盪機穩定地混合、一面於4℃培養16小時而進行共同免疫沈澱。接著,使用抗GST-π抗體進行西方墨點分析。
結果顯示於第3圖~第5圖。由第3圖可清楚得知,相較於Scramble siRNA處理組,在GST-π siRNA處理組中,與Raf-1共同沈澱的泛素量較多,Raf-1的泛素化被增強。又,第4圖顯示出蛋白酶體與由GST-π siRNA所造成的p-Raf-1的表現低下有關,第5圖則顯示出GST-π與p-Raf-1互相結合。以上的結果暗示,GST-π會與p-Raf-1結合而阻礙其泛素化,藉由抑制GST-π,則會促進p-Raf-1的泛素化而減少p-Raf-1的存在量。
藉由LC3也就是對於細胞自噬具專一性之標記蛋白質(marker protein)的免疫螢光染色,來分析由GST-π基因抑制所致之細胞自噬的誘導。將依照實施例1之(2)的程序而獲得的GST-π基因抑制細胞,接種於置入35 mm塑膠製組織培養皿中的蓋玻片(cover slip)且使其成為1×105個/2 mL。將培養基吸去(aspirate)後,加入添加有4%三聚甲醛的PBS,在室溫培養10分鐘,而將細胞固定。細胞的通透化(permeabilization),是使用添加0.5%TritonX-100的PBS,在冰上進行5分鐘。以冷的PBS清洗10分鐘之後,將細胞與經以添加1%BSA的PBS稀釋而成的抗LC3B抗體(Invitrogen公司)在恆濕機(humid chamber)內以37℃反應1小時。二次抗體反應,是使用經以Alexa Fluor 488標記的兔抗體(Invitrogen公司),於37℃進行1小時。使用ProlongGold antifade reagent with DAPI在載玻片上固定(mount),以4℃培養16小時。抗體反應之後的清洗,是使用PBS以37℃、5分鐘進行3次。在螢光顯微鏡觀察時的細胞自噬陽性細胞,是設為具有存在於細胞質中之點狀LC3訊息的細胞。
進而藉由LC3的西方墨點分析,來分析GST-π基因抑制細胞中之細胞自噬的誘導。將依照實施例1之(2)的程序而獲得的GST-π基因抑制細胞,接種於置入35 mm塑膠製組織培養皿中的蓋玻片(cover slip)且使其成為1×105個/2 mL。培養一段規定時間之後,回收細胞抽出液,提供於西方墨點分析。使用抗LC3B抗體(SIGMA公司)作為一次抗體,於4℃與轉印膜反應16小時。LC3分子的檢測,是與HRP標記抗體反應之後,使用化學發光試劑來進行。細胞自噬是否被誘導,是以LC3往I型(18kDa)與II型(16kDa)的轉移來評價。
將實施例1之(2)中轉染siRNA後第1日的細胞,接種於8孔的組織培養用培養玻片(culture slide)中且使其成為0.4×105個/0.5 mL。以含有2.5%戊二醛的0.1 M二甲胂酸(cacodylic acid)緩衝液(pH 7.4)固定1小時,以0.1 M二甲胂酸緩衝液沖洗之後,以1%OsO4與1.5%亞鐵氰化鉀(potassium ferrocyanide)進行2小時的後固定。以乙醇脫水10分鐘、3次之後,以環氧樹脂(TAAB Laboratories Equipment公司)進行包埋。超薄切片是以鑽石刀來製作,以醋酸鈾醯與檸檬酸鉛進行電子染色,再以電子顯微鏡(日立穿透式電子顯微鏡H-7500,日立High-Technologies公司)觀察切片。
TUNEL法,是使用過氧化物酶標記的原位細胞凋亡檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit,POD(Roche))而如下述般地進行。將依照實施例1之(2)的程序而獲得的GST-π基因抑制細胞,接種於置入35 mm塑膠製組織培養皿中的蓋玻片(cover slip)且使其成為1×105個/2 mL。將培養基吸去後,加入添加有4%三聚甲醛的PBS,在室溫培養60分鐘,而將細胞固定。為了進行內源性過氧化酶的阻斷(blocking),以添加3%H2O2的甲醇在室溫培養10分鐘。接著,以添加0.1%TritonX-100的0.1%檸檬酸鈉在冰上處理2分鐘,而進行細胞的通透化。TUNEL反應,是在恆濕機內以37℃反應60分鐘。TUNEL陽性細胞的檢測,是使過氧化酶標記之抗螢光素抗體在37℃反應30分鐘之後,藉由使用DAB基質的呈色反應來進行。以蘇木素(hematoxylin)進行對比染色(counter stain),在光學顯微鏡下觀察染色細胞,將TUNEL陽性細胞評價為細胞凋亡細胞。各操作之間的清洗,是藉由以PBS沖洗來進行。
結果顯示於第6圖~第10圖。第6圖是以抗LC3抗體進行的免疫螢光染色影像,在箭頭所指的細胞中,可觀察到顯示LC3的點狀訊號。此LC3的點狀訊號被推測為是自噬小體,則結果可知,在GST-π基因抑制細胞中誘導出細胞自噬。
第7圖是轉染GST-πsiRNA之後經過2日時,GST-π KD細胞的電子顯微鏡觀察影像。在左圖中以方形圍起的A部分,其放大影像為右圖。在右圖中,箭頭所指的部分中,可確認到有自噬小體形成且包圍粒線體。
第8圖顯示LC3的西方墨點分析結果。藉由抗LC3抗體所辨識的LC3蛋白質存在有2種類型。若發生細胞自噬而LC3被攝入脂質雙層膜中,則LC3會從I型轉變成II型。因此,藉由LC3-II型之檢測量的變化,可以確認是否已誘導細胞自噬。由第8圖的結果可知,在GST-π siRNA處理組中,LC3的I型及II型均被誘導表現,且特別可確認到II型顯著增加,另一方面,在Scramble siRNA處理組中,I型及II型的表現均低,且I型的表現低於II型。
由這些結果可知,藉由抑制GST-π的表現,而可誘導出細胞自噬。
第9圖顯示TUNEL染色的結果。上排是Scramble siRNA處理組的影像,下排是GST-π siRNA處理組的影像,在將GST-π進行了細胞抑制的細胞中,被觀察到TUNEL陽性細胞,亦即被觀察到細胞凋亡。
第10圖是顯示在GST-π siRNA處理組與Scramble siRNA處理組中的細胞自噬陽性細胞與細胞凋亡陽性細胞之比例的經時性變化的圖表。另外,第10圖也分別顯示出:細胞自噬陽性細胞的比例,是在上述(1)之藉由抗LC3抗體所進行之免疫螢光染色實驗中,相對於500個細胞而具有點狀LC3訊息之細胞的比例;以及,細胞凋亡陽性細胞的比例,是在上述(4)之TUNEL染色實驗中,相對於100個細胞之TUNEL陽性細胞的比例。由第10圖可知,細胞自噬陽性細胞的比例會在處理後急遽地增加,在第2日到達頂點之後下降,相對於此,細胞凋亡陽性細胞的比例則會緩慢但持續地增加至第4日。
除了使用下述抗體來作為一次抗體以外,與實施例(1)、(2)、(4)同樣地進行,以分析構成EGFR/PI3K/Akt/mTOR訊息級聯的各蛋白質之表現,上述抗體為:抗p-EGFR(Tyr1068)抗體(Cell Signaling公司)、抗EGFR抗體(Santa Cruz公司)、抗p-PI3K p85(Tyr458)/p55(Tyr199)抗體(Cell Signaling公司)、抗PI3K、p85抗體(MILLIPORE公司)、抗p-Akt(Ser473)抗體(Cell Signaling公司)、抗Akt抗體(Cell Signaling公司)、抗p-p70S6K(Thr389)抗體(Cell Signaling公司)、抗p-p70S6K(Thr421/Ser424)抗體(Cell Signaling公司)、抗p70S6K抗體(Cell Signaling公司)。
依照實施例1之(1)~(2)的程序,進行M7609細胞的培養及GST-π siRNA的轉染。於轉染GST-π siRNA之後第2日起,將細胞以不含血清的培養基培養16小時。以5 μM的MG132處理2小時之後,回收細胞抽出液。作為MG132處理的對照組,而同樣地進行0.05%DMSO處理。對於所獲得的細胞抽出液,使用Micro BCA Protein Assay Kit進行蛋白質定量(Scramble siRNA-DMSO處理組:11.98 μg/μL,Scramble siRNA-MG132處理組:12.29 μg/μL,GST-π siRNA-DMSO處理組:8.91 μg/μL,GST-π siRNA-MG132處理組:9.24 μg/μL)。將80 μg的細胞抽出液供給至SDS-PAGE之後,使用抗p-EGFR(Tyr1068)抗體及抗EGFR抗體,進行西方墨點分析。
依照實施例1之(1)的程序,進行M7609細胞的培養。接著,以冷的PBS清洗細胞之後,添加冷的共同免疫沈澱緩衝液(1.0%的TritonX-100、50 mM的Tris-HCl、150 mM的NaCl、complete Mini EDTA-free、PhosSTOP,pH 7.5),冰浴冷卻,培養30分鐘使其可溶。於4℃以12000 rpm離心10分鐘,獲得細胞抽出液。對於所獲得的細胞抽出液,使用Micro BCA Protein Assay Kit進行蛋白質定量(9.08 μg/μL)。將1 mg的細胞抽出液與結合Dynabeads Protein G的抗p-EGFR(Tyr1068)抗體(Calbiochem公司)混合,一面以振盪機穩定地混合、一面於4℃培養16小時,而進行共同免疫沈澱。接著,使用抗GST-π抗體進行西方墨點分析。
結果顯示於第11圖~第13圖。第11圖顯示出,相較於Scramble siRNA處理組,在GST-π siRNA處理組中,構成EGFR/PI3K/Akt/mTOR訊息級聯的各蛋白質之磷酸化較為減少;第12圖顯示出蛋白酶體與由GST-π siRNA所造成的p-EGFR表現低下有關連;第13圖則顯示出GST-π與p-EGFR互相結合。以上的結果暗示,GST-π會與p-EGFR結合而幫助其安定,藉由抑制GST-π,則會促進p-EGFR的泛素化而減少p-EGFR的存在量。
依照實施例1之(1)的程序,進行M7609細胞的培養。將細胞接種於60 mm塑膠製組織培養皿且使其成為4.0×105個/5 mL。添加GST-π抑制劑C16C2(委託帝人製藥(Teijin Pharma)公司製作)使其分別成為10、50、100 μM,於24小時之後回收細胞抽出液。對於所獲得的細胞抽出液,使用Micro BCA Protein Assay Kit進行蛋白質定量(未處理:8.5 μg/μL,10 μM:8.49 μg/μL,50 μM:7.68 μg/μL,100 μM:6.4 μg/μL)。將50 μg的細胞抽出液供給至SDS-PAGE之後,藉由西方墨點法來分析各蛋白質的表現。
依照實施例1之(1)的程序,進行M7609細胞的培養。將細胞接種於60 mm塑膠製組織培養皿且使其成為1.0×105個/5 mL。16小時之後,添加GST-π抑制劑,使其成為50 μM。使用血球計來計算培養皿中的總細胞數直到第2日為止。作為GST-π抑制劑對照組,而進行0.05%DMSO處理。
結果顯示於第14圖及第15圖。由這些結果可明確得知,藉由GST-π抑制劑,EGFR及Raf-1之磷酸化也會與進行GST-π基因抑制時同樣地受到抑制(第14圖)以及細胞增殖(第15圖)。
依照實施例1之(2)的程序而進行GST-π siRNA的轉染之後,更換至不含抗生物質的培養基,培養3小時。將細胞接種於置入35 mm塑膠製組織培養皿中的蓋玻片,並細胞自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA,SIGMA公司)加入培養基而成為1及5 mM之後,培養一規定時間。
與實施例3之(1)同樣地,以抗LC3抗體將(1)所培養的細胞進行免疫螢光染色。
與實施例3之(4)同樣地,將(1)所培養的細胞進行TUNEL染色。
結果顯示於第16圖~第18圖,第16圖是顯示各組中相對於1000個細胞之細胞自噬陽性細胞的比例,藉由細胞自噬抑制劑而會顯著地減少細胞自噬陽性細胞的比例。第17圖中,上排是顯示GST-π siRNA+1 mM的3-MA處理組,下排是顯示GST-π siRNA+5 mM的3-MA處理組。由第9圖及第17圖可知,藉由併用細胞自噬抑制劑,會顯著地增加細胞凋亡陽性細胞。第18圖是顯示細胞凋亡會隨細胞自噬抑制劑的用量而進一步受到誘導的圖表。細胞凋亡雖然會藉由GST-π siRNA的添加而被誘導,但進而追加3-MA也就是細胞自噬抑制劑時,則細胞凋亡會隨3-MA的追加用量而更進一步地被誘導。因此可明確得知,藉由組合抑制GST-π的藥物與抑制細胞自噬的藥物,能夠較有效率地誘導細胞凋亡。
<110> 日東電工股份有限公司
<120> 細胞凋亡誘導劑
<130> PCT2512ND
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
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<213> 人工序列
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<223> GSTpi siRNA
<400> 1
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Scramble siRNA
<400> 2
第1圖的a),是表示GST-π的表現藉由GST-π siRNA而被專一地抑制之狀況的西方墨點分析結果;第1圖的b),是表示轉染GST-π siRNA後第1~4日的細胞數及GST-π表現量之變化的圖。
第2圖是表示轉染GST-π siRNA後第2日時,與RAS/Raf/MAPK訊息級聯有關之蛋白質的表現狀況的西方墨點分析結果;由圖中可知,隨著GST-π的表現被抑制,Raf蛋白質的表現量也減少,進而使MEK或ERK等的MAPK的磷酸化受到抑制。
第3圖是顯示Raf蛋白質的免疫沈澱實驗結果;由圖中可知,在GST-π siRNA處理組中,Raf蛋白質及Ser621磷酸化Raf蛋白質(p-Raf-1(S621))的表現稍微減少,相反地,被泛素化的Raf蛋白質則增加。
第4圖,是以蛋白酶體抑制劑MG132及DMSO也就是陰性對照組來處理GST-π siRNA轉染物及Scramble siRNA轉染物時,比較Raf蛋白質之存在量的圖;在GST-π siRNA轉染物中,藉由以蛋白酶體抑制劑進行處理,而觀察到磷酸化Raf蛋白質(p-Raf-1(S338))之存在量增加,但在Scramble siRNA轉染物中則未見到變化,這也就是暗示了藉由抑制GST-π表現,磷酸化Raf蛋白質會受到由蛋白酶體所進行的分解,並且也與第3圖中泛素化Raf蛋白質之增加相符合。
第5圖是表示Raf蛋白質與GST-π的共同免疫沈澱實驗結果;因為以抗p-Raf-1抗體沈澱的蛋白質中,顯示了針對抗GST-π抗體的反應,所以暗示p-Raf-1與GST-π形成複合體。
第6圖是表示GST-π基因抑制細胞的免疫螢光染色影像;上排是藉由抗LC3抗體所得的染色影像,下排是DAPI染色影像;上排左起分別為轉染後第1日、第2日、第3日的染色影像,下排左起分別為轉染後第4日、第5日的染色影像;圖中以箭頭標示的細胞中,觀察到被認為是自噬小體的點狀訊號,而推測已誘導出細胞自噬。
第7圖是在轉染GST-π siRNA後經過2日的時間點上,GST-π基因抑制細胞的電子顯微鏡影像;在左圖中,N是表示細胞核,以方形圍起的A部分的放大影像為右圖;在右圖中,M表示粒線體,L表示溶酶體;在以箭頭標示的部分中,觀察到有自噬小體形成且包圍粒線體。
第8圖是表示使用了抗LC3抗體之GST-π基因抑制(KD)細胞抽出液的西方墨點分析結果;相較於對照組(Scramble siRNA),GST-π KD細胞(GST-π siRNA)中,顯著地觀察到LC3之表現增強;特別是,因為II型的LC3(LC3-II)大幅增強,所以推測有誘導出自噬小體。
第9圖是表示TUNEL染色的結果;上排是對照組的影像,下排是GST-π KD細胞組的影像;左起分別表示轉染後第3日、第4日、第5日的染色影像;GST-π KD細胞組中,觀察到TUNEL陽性細胞。
第10圖,是顯示在GST-π KD細胞組與對照細胞組中轉染siRNA後經過第1~4日的時間點上,細胞自噬陽性細胞及細胞凋亡陽性細胞之比例的經時變化的圖表(上),以及顯示在GST-π KD細胞中之GST-π表現量的圖(下);在對照組中,幾乎均未觀察到細胞自噬及細胞凋亡,相對於此,在GST-π KD組中,細胞自噬陽性細胞先是急遽增加,在第2日達到高峰,之後則誘導出細胞凋亡。
第11圖是表示在GST-π KD細胞中與EGFR/PI3K/Akt/mTOR訊息級聯有關之蛋白質的西方墨點分析結果;由圖中可知,在GST-π KD細胞組中,EGFR、PI3K及Akt的磷酸化顯著地受到抑制。
第12圖是表示以蛋白酶體抑制劑MG132來處理GST-π KD細胞時,顯示磷酸化EGFR(p-EGFR)之表現量變化的西方墨點分析結果;因為在GST-π KD細胞中的p-EGFR表現量降低,會藉蛋白酶體抑制劑處理而恢復,所以推測p-EGFR的表現量降低是起因於由蛋白酶體所致之分解。
第13圖是將使用抗p-EGFR而共同免疫沈澱的蛋白質進行西方墨點分析的結果;在抗GST-π抗體中有觀察到訊息,所以推測p-EGFR與GST-π有相互作用。
第14圖,是隨抑制劑濃度而觀察在使用GST-π抑制劑C16C2時的Raf蛋白質及EGFR表現程度之變化的結果;由圖中可觀察到,使用GST-π抑制劑時,EGFR及Raf-1之磷酸化也會與進行GST-π基因抑制時同樣地受到抑制。
第15圖是顯示在添加GST-π抑制劑C16C2時之細胞數變化的圖表;由圖中可知,添加GST-π抑制劑時,細胞數幾乎未增加。
第16圖是顯示在Scramble siRNA處理組、GST-π KD組及GST-π KD+3MA組中之細胞自噬陽性細胞比例的圖表;由圖中可知,藉由GST-π基因抑制而增強的細胞自噬,會藉由3-MA而被抑制。
第17圖是表示在GST-π KD細胞中添加3-MA時的TUNEL染色影像;上排是添加1 mM的3-MA的情形,下排是添加5 mM的3-MA的情形;左起分別表示轉染後第2日、第3日、第4日的染色影像,3-MA之添加量較多時,可觀察到較多的細胞凋亡細胞。
第18圖是顯示隨時間變化而觀察在對照細胞組(Scramble siRNA)、GST-π KD細胞組(GST-π siRNA)、GST-π KD細胞+1 mM 3-MA組(GST-π siRNA+1 mM 3-MA)及GST-π KD細胞+5 mM 3-MA組(GST-π siRNA+5 mM 3-MA)中之細胞凋亡比例結果的圖表;由圖中可知,細胞凋亡會隨3-MA的用量而進一步受到誘導。
Claims (10)
- 一種細胞凋亡誘導劑,是用於誘導具有變異型KRAS並顯示出GST-π過度表現的細胞的細胞凋亡的製劑,其含有抑制GST-π之藥物與抑制細胞自噬之藥物來作為活性成分,其中,前述抑制GST-π之藥物,是選自由下述所組成之群組:針對編碼有GST-π之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸;表現前述RNAi分子、核糖酶、反義核酸或DNA/RNA嵌合聚核苷酸的載體;穀胱甘肽;以及穀胱甘肽類似物;前述抑制細胞自噬之藥物,是選自由下述所組成之群組:針對編碼有細胞自噬相關因子之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸;表現前述RNAi分子、核糖酶、反義核酸或DNA/RNA嵌合聚核苷酸的載體;以及PI3K的抑制劑。
- 如請求項1所述之細胞凋亡誘導劑,其中該活性成分,是選自由下述所組成之群組:RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸;以及表現前述RNAi分子、核糖酶、反義核酸或DNA/RNA嵌合聚核苷酸的載體。
- 一種醫藥組成物,其含有如請求項1或2所述之細胞 凋亡誘導劑。
- 一種抑制GST-π之藥物與抑制細胞自噬之藥物的用途,其是用來製造醫藥組成物,該醫藥組成物是用於治療起因於KRAS之變異及GST-π過度表現的疾病,其中,前述抑制GST-π之藥物,是選自由下述所組成之群組:針對編碼有GST-π之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸;表現前述RNAi分子、核糖酶、反義核酸或DNA/RNA嵌合聚核苷酸的載體;穀胱甘肽;以及穀胱甘肽類似物;前述抑制細胞自噬之藥物,是選自由下述所組成之群組:針對編碼有細胞自噬相關因子之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸;表現前述RNAi分子、核糖酶、反義核酸或DNA/RNA嵌合聚核苷酸的載體;以及PI3K的抑制劑。
- 一種抑制GST-π之藥物與抑制細胞自噬之藥物的用途,其是用來製造醫藥組成物,該醫藥組成物是用於治療包含具有變異型KRAS並顯示出GST-π過度表現的癌細胞之癌症,其中,前述抑制GST-π之藥物,是選自由下述所組成之群組:針對編碼有GST-π之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸;表現前述RNAi分子、核糖酶、反義核酸或DNA/RNA嵌合聚核苷酸的載 體;穀胱甘肽;以及穀胱甘肽類似物;前述抑制細胞自噬之藥物,是選自由下述所組成之群組:針對編碼有細胞自噬相關因子之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸;表現前述RNAi分子、核糖酶、反義核酸或DNA/RNA嵌合聚核苷酸的載體;以及PI3K的抑制劑。
- 一種GST-π及/或其功能性突變體的用途,是用來製造製劑,該製劑是用於抑制具有變異型KRAS並顯示出GST-π過度表現的細胞的細胞自噬,其中,功能性突變體是選自由下述所組成的族群:(i)在GST-π的胺基酸序列上具有1個或2個以上的變異,但仍與GST-π具有相同功能的突變體;(ii)由一具有編碼GST-π之基因的鹼基序列的核酸所編碼,或者由一在與該核酸編碼同一多肽的核酸的鹼基序列上具有1個或2個以上的變異的核酸所編碼,並且與GST-π具有相同功能的突變體;(iii)由一具有編碼GST-π之基因的鹼基序列的核酸、一與該核酸編碼同一多肽的核酸或編碼(ii)之突變體的核酸的互補鏈、或者一以嚴格條件對於其片段進行雜交的核酸所編碼,並且與GST-π具有相同功能的突變體;(iv)與GST-π具有60%以上之相同性的胺基酸序列,並且與GST-π具有相同功能的突變體;(v)由與編碼GST-π之基因的鹼基序列具有60%以上之相同性的核酸所編碼,並且與GST-π具有相同功能的突變體。
- 一種抑制GST-π之藥物的用途,是用來製造製劑,該製劑是用於促進具有變異型KRAS並顯示出GST-π過度表現的細胞的細胞自噬,其中,前述抑制GST-π之藥物,是選自由下述所組成之群組:針對編碼有GST-π之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸;表現前述RNAi分子、核糖酶、反義核酸或DNA/RNA嵌合聚核苷酸的載體;穀胱甘肽;以及穀胱甘肽類似物。
- 一種抑制細胞自噬之藥物的用途,是用來製造製劑,該製劑是用於在GST-π受到抑制之細胞中誘導細胞凋亡,該細胞是具有變異型KRAS之GST-π過度表現的細胞,前述抑制細胞自噬之藥物,是選自由下述所組成之群組:針對編碼有細胞自噬相關因子之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸;表現前述RNAi分子、核糖酶、反義核酸或DNA/RNA嵌合聚核苷酸的載體;以及PI3K的抑制劑。
- 如請求項8所述之用途,其中,該製劑是用於治療起因於KRAS之變異及GST-π過度表現的疾病或包含具有變異型KRAS並顯示出GST-π過度表現的癌細胞之癌症。
- 如請求項8或9所述之用途,其中,抑制細胞自噬之 藥物是選自由下述所組成之群組:RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸;以及表現前述RNAi分子、核糖酶、反義核酸或DNA/RNA嵌合聚核苷酸的載體。
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